CN105358978A

CN105358978A - 用于查明确定疾病的指示物的方法

Info

Publication number: CN105358978A
Application number: CN201480036386.XA
Authority: CN
Inventors: D·威尔邦德; S·A·冯克; E·博尔克曼; K·卡尔夫申寇; O·班纳驰; C·寇斯; V·巴德; S·于宾格
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2013-06-26
Filing date: 2014-06-25
Publication date: 2016-02-24
Also published as: US20160161481A1; EP4180815A2; EP3014279A2; EP4180816A3; EP4180816A2; EP4180815A3; WO2014207049A2; EP3014279B1; JP6478987B2; WO2014207049A3; DK3014279T3; US11175288B2; DE102013106713A1; FI3014279T3; ES2935060T3; JP2016524151A

Abstract

本发明涉及用于查明确定疾病的指示物(疾病指示物)的方法，在所述疾病中错误折蛋白质的聚集体发挥着作用，以及涉及用于选择性地定量和/或表征这些疾病指示物的方法。

Description

用于查明确定疾病的指示物的方法

本发明涉及用于查明确定疾病的指示物(疾病指示物)的方法，在所述疾病中错误折叠蛋白质的聚集体发挥着作用，以及涉及用于选择性地定量和/或表征这些疾病指示物的方法。

由内生蛋白质形成的病理学聚集体，例如寡聚体或纤丝，出现于许多神经退行性疾病中。

淀粉样变性是一种以不溶的、错误折叠的蛋白质的细胞外沉积物为特征的疾病。这些聚集体通常以纤维，所谓β-纤丝存在。术语淀粉样的从经刚果红染色的纤丝和淀粉的分光光度共同性派生出。淀粉样变性的病因学既可以是遗传的，也可以是自发的。几种淀粉样变性也以继发性疾病出现。

在阿尔茨海默病(AD，阿尔茨海默病，拉丁语的＝MorbusAlzheimer)的情况下，出现Aβ-聚集体。除了帕金森病(MorbusParkinson)外，AD属于临床状态异质组，其共同标准在许多情况下(但不排除)是各自特异蛋白质(大多数以富于β-折叠的构象)为细胞外的全身或局部沉积。

然而，β-淀粉样蛋白-肽沉积物(或肽纤丝)仅代表过程的最后阶段。AD的病理学主特征为由Aβ-肽组成的老年斑或淀粉样斑的形成，和此外由Tau-蛋白形成的神经纤丝沉积物。Aβ-肽的前体蛋白，APP，位于神经元的细胞膜。通过蛋白水解降解和后来的修饰从其产生不同长度和类型的Aβ片段，例如Aβ1-40、Aβ1-42或pGluAβ3-42。单体Aβ-肽在整个生命期中也在健康机体中出现。

根据源于1990年代的淀粉样蛋白级联假设，以斑的形式的Aβ-沉积物是疾病症状的起因，然而，近年来不同的研究显示，特别是小的、自由扩散的Aβ-寡聚体在所有Aβ-种类中拥有最大的毒性并且对AD的出现和进展负责。因此Aβ-肽的聚集体与AD-发病机制直接相关联并且可能地作为对于AD的生物标记物使用(Wang-Dietrich等人，J.Alzheimer’sDisease34，2013，985-994)。然而，通过其他路线方法的诊断支持是有用的，特别是为了区分基于内生的错误折叠蛋白质的其他疾病。

进一步在WO2005/018424A1、WO2008/070229A2、DE102006010647A1、Bannach等人(Plosone，2012年5月，第7卷，第5期，e36620)、WO2010/003227A1、DE102011057021A1和WO2013/092952A2(27.06.2013出版的)中提到蛋白质聚集体。

AA-淀粉样变性是一种在慢性炎症性肠病，如溃疡性结肠炎(Colitisulcerosa)和克劳恩病(MorbusCrohn)情况下的很罕见的继发性疾病。在占优势地男性患者的情况下影响肾、胃肠道、脾脏、肝脏、胰脏和心脏(以下降的经常性)。AA-淀粉样变性在初次疾病显露后10至20年之内表现出来。临床症状包括肾病综合征、蛋白尿或心肌病。全身AA-淀粉样变性也影响神经细胞。对于AA-淀粉样变性的治疗，采用一系列药物，其中包括烷基化试剂、甲氨蝶呤、TNF-α-阻滞剂等。在终末肾衰竭的情况下，也可以进行透析或肾移植。但是治疗的主目标是抑制血清-淀粉样蛋白A前体蛋白的合成。

AL-淀粉样变性可以全身地或局部受限地表现出来。作为原因，显示出克隆浆细胞疾病。在这种情况下，产生生成淀粉样蛋白的轻链，其形成纤丝并沉积在各种不同器官的间质中。最经常影响肾、心脏、肠、肝脏和自主神经系统。多发性神经病的出现也是典型的。

AApoAI是高密度脂蛋白(HDL)的蛋白质组分，其天然功能是运输血液中的水不溶胆固醇和磷脂。N-末端区域中的突变给予AApoAI生成淀粉样蛋白的特性。遗传性AApoAI-淀粉样变性在足和手的多发性神经病中表现出来。以下降的经常性也影响肾、心脏、肝脏(增高的AP和γ-GT)、周围神经系统、皮肤、喉和睾丸。

AApoAII是高密度脂蛋白(HDL)的蛋白质组分，其天然功能是运输血液中的水不溶胆固醇和磷脂。ApoAII基因的终止密码子的突变给予AApoAII生成淀粉样蛋白的特性。遗传性AApoAII-淀粉样变性占优势地在肾和心脏中表现出来。

ATTR-淀粉样变性是最常见的遗传性淀粉样变性。它是常染色体显性遗传的。基因的突变显示对转甲状腺素蛋白(Transthyretin)，一种与血浆中的视黄醇结合蛋白和甲状腺素相联合的运输蛋白负责。最经常的突变Val30Met给予蛋白质生成淀粉样蛋白的和因此致病的特性。在ATTR-淀粉样变性的进程中，在外周和自主神经系统中发生淀粉样沉积物。主要症状包括勃起机能障碍、胃肠不适、吸收不良和限制性心肌病。如果未作治疗，ATTR-淀粉样变性的预后是差的。除了症状治疗，作为治疗选择，仅剩下肝脏移植。

在临床精神病学中，迄今所有的疾病包括精神分裂症或抑郁症以借助于问题集的面谈的形式和需要时通过运动试验或行为试验纯临床地进行诊断。由于关于精神性疾病的生物学基础的知识缺乏，提供不了基于血液或脑脊液的诊断试验以确证临床诊断，如它例如在神经性疾病的情况下被使用的那样。

该情况特别地被药物调查行业感到非常不令人满意，因为客观和明确可定量试验的缺乏毕竟阻碍潜在地有效的治疗的定量监控。

作为原因起作用的疾病基因例如DISC1的发现使发展生物学诊断法现在头一次是可能的。DISC1在慢性精神性疾病亚组，如精神分裂症和复发性抑郁症的情况下显示出脑中亚显微蛋白质聚集体。借助于特意发展的抗体，能够在死后的脑中检测到这些蛋白质聚集体。

ALS是一种中枢神经系统的慢性的、快速推进的疾病。首先骨骼肌的有意控制受影响。在疾病的进程中，发生对肌肉运动负责的运动神经元的变性。这导致身体运动和身体反射的巨大损害直至完全取消。最初症状开始后的平均预期寿命仅为三年。对于ALS，已描述了各种不同的病因学。ALS的最经常形式是散发性质的。但是，也存在家族遗传的ALS病例。在这种情况下最经常的是过氧化物歧化酶-1(SOD1)的突变。新近的数据建议，基因C9orf72的六核苷酸扩张不仅是ALS的原因，而且也是额颞痴呆的原因。

ALS的诊断晚在疾病的进程中才可以进行。诊断延迟通常在第一次症状开始后一年。ALS的诊断现在包括临床鉴定、电生理学检查(肌电图)和神经病理学分析(活组织检查)。此外，可以进行脑脊液穿刺和制成差异血象(Differentialblutbild)。最后，必须将ALS差异诊断地区分于其他疾病。

ALS的病理学特征包括FUS蛋白的胞质内含物。在细胞变性的情况下，这些聚集体被释放并可以因此到达外周，在那里它们可供用于诊断。其他神经退行性疾病也显示FUS-聚集体的沉积物，其中包括额颞叶变性(FTLD)，其主要症状为性格、社会行为和语言能力的改变。

ALS的另一个病理学特征是运动神经元中蛋白质SOD1的沉积物。在细胞变性的情况下，这些聚集体被释放并可以因此到达外周，在那里它们可供用于诊断。

ALS的另一个病理学特征是泛素化的蛋白质TDP-43的胞质内含物。在细胞变性的情况下，这些聚集体被释放并可以因此到达外周，在那里它们可供用于诊断。

其他的神经退行性疾病也伴随TDP-43-聚集体的沉积物而出现，其中包括额颞叶变性(FTLD)，其主要症状为性格、社会行为和语言能力的改变。新近的研究也看到了TDP-43-沉积物与慢性创伤性脑病(CTE)之间的联系。CTE首先影响反复遭受颅脑创伤的竞技运动员和士兵。

聚集的内生蛋白质也在2型糖尿病(DiabetesMellitus)(DMT2)的情况下发挥作用。因此，例如在DMT2-患者的胰腺中也发现了斑点，其占优势地由胰岛淀粉样多肽(IAPP)组成。IAPP是一种肽激素，其在胰腺的β-细胞中产生并与胰岛素一起被分泌。推测IAPP的聚集与胰岛-β-细胞的累进丢失相联系。

迄今还没有常规使用的对于组织或体液中的IAPP-寡聚体或聚集体的离体检测系统。

帕金森病是一种退行性神经系统疾病。主要症状包括肌强直、放慢的运动、肌震颤和姿势不稳定。此外，描述了任选的伴随症状，例如精神障碍。在疾病的进程中，发生黑质中产生多巴胺的神经元的坏死。从组织病理学上看，在帕金森患者的脑组织中显示胞质内含物，所谓的路易小体，其占优势地由α-突触核蛋白、泛素和其他蛋白质沉积物组成。

Tau病变是一组神经退行性疾病，其以脑中Tau-蛋白的富集为特征。通过超磷酸化，与微管相联系的Tau可以转变为不溶的聚集体，所谓的神经原纤维束。Tau病变包括各种不同病象例如阿尔茨海默病、皮质基底节变性、嗜银颗粒病、皮克氏病(MorbusPick)、FTLD-MAPT(以前的：FTDP-17，染色体17的额颞痴呆和帕金森综合征)、进行性核上眼肌麻痹、神经原纤维纠缠-痴呆、具有神经胶质内含物的Tau病变以及不可分类的Tau病变。新近的研究也将慢性创伤性脑病算作Tau病变。有些上面提到的疾病例如FTLD-MAPT，是遗传决定的。但大多数Tau病变的原因尚不知晓。

Tau病变的临床表现是非常多样的并且包括运动障碍(L-多巴敏感的或非典型性帕金森综合征、具有“冻结”的运动不能、核上眼肌麻痹直至皮质基底节综合征)、行为障碍和语言障碍和精神病学症状例如进攻性、精神状态和抑郁。

亨廷顿病是一种遗传性神经退行性疾病，其影响肌肉协调并导致认知能力的降低和精神问题。该疾病不仅影响男性而且影响女性并以取决于亨廷顿基因的常染色体显性突变。CAG–三联体重复的扩张导致成熟蛋白质中多聚谷氨酰胺通道的延长，由此强烈地导致错误折叠和聚集。

家族性内脏淀粉样变性以溶菌酶基因的突变为基础，其给予成熟蛋白质生成淀粉样蛋白的特性。淀粉样蛋白沉积物全身地存在于许多器官中。

总是考虑疾病指示物，即用于认识疾病的指示物，也称为生物标记，以用于疾病的诊断。已知的对于生物标记的实例为例如尿中葡萄糖的含量作为糖尿病的指示或妊娠试验中尿中HCG的含量。

为了给即将越来越多和年长的人口提供医疗服务，需要鉴别保证可靠诊断的新的、特异的生物标记。特别是在具有相似症状和病象的疾病的情况下，需要高的特异性，以能够在此进行有成功希望的治疗。进一步，疾病指示物应当尽可能快地鉴别已经在早期疾病阶段中的或在复发情况下的处于危险的人。生物标记应当存在于可容易地供使用的生物材料中并且是可鉴定的并使快速检测成为可能。因此，不仅可能的是，跟踪疾病的进程，而且跟踪治疗和预防的效果。

本发明的任务是提供这样的生物标记，特别是为了具有错误折叠蛋白质的聚集体的疾病。

其他任务是，提供用于其选择性定量和/或表征的快速和可靠的方法。特别地，所述疾病指示物应当适合于临床常规使用。这意味着，它在试验，优选地快速试验中和需要时借助于标准物可以被表征，从而测定可比较的和独立的值。

进一步，应当满足上面提到的对生物标记的要求并提供相应的、相比于现有技术经改善的可能性和工具。

AA-淀粉样变性的诊断包括临床表现的评定。但是，在这种情况下问题是相对于非常多的其他病象的差异诊断分界。前临床上，可能的是仅通过借助于刚果红染色的AA-淀粉样蛋白组织学检测的诊断。但是为此需要脂肪抽吸活组织检查。目前还未建立检测体液中作为生物标记的淀粉样蛋白聚集体的常规诊断法。

AA-淀粉样变性以血清-淀粉样蛋白-A-前体蛋白(AA)的错误折叠为特征。AA-聚集体可以因此是对于AA-淀粉样变性的直接生物标记。然而，诊断性检测是一项技术挑战，因为AA也在健康机体中到处产生。因此，方法必须是对正常折叠的、单体的AA的高度过量不敏感的。

AL-淀粉样变性的诊断包括临床表现的评定，但是其可以强烈可变地表现出。此外，问题是相比于非常多的其他病象的差异诊断分界。金标准是借助于刚果红染色的AL-淀粉样蛋白的组织学检测。此外，应当进行免疫组织化学。但是，为此需要昂贵的活组织检查。目前还未建立最小侵入性地检测体液中作为生物标记的淀粉样蛋白聚集体的常规诊断法。

AL-淀粉样变性以IgG轻链前体蛋白(AL)的错误折叠以特征。AL-聚集体因此是对于AL-淀粉样变性的直接生物标记。然而，诊断性检测是一项技术挑战，因为AL也在健康机体中到处产生。因此，方法必须是对正常折叠的、单体的AL的高度过量不敏感的。

AApoAI-淀粉样变性的诊断包括临床表现的评定。但是在这种情况下问题是相比于非常多的其他病象的差异诊断分界。金标准是借助于刚果红染色的AApoAI-淀粉样蛋白的组织学检测。但是，为此需要昂贵的活组织检查。目前还未建立最小侵入性地检测体液中作为生物标记的淀粉样蛋白聚集体的常规诊断法。

AApoAI-淀粉样变性以载脂蛋白-AI-前体(AApoAI)的错误折叠为特征。AApoAI-聚集体可以因此是对于AApoAI-淀粉样变性的直接生物标记。然而，诊断性检测是一项技术挑战，因为AApoAI也在健康机体中到处产生。因此，方法必须是对正常折叠的、单体的AApoAI的高度过量不敏感的。

AApoAII-淀粉样变性的诊断包括临床表现的评定。但是在这种情况下问题是相比于非常多的其他病象的差异诊断分界。金标准是借助于刚果红染色的AApoAII-淀粉样蛋白的组织学检测。但是，为此需要昂贵的活组织检查。目前还未建立最小侵入性地检测体液中作为生物标记的淀粉样蛋白聚集体的常规诊断法。

AApoAII-淀粉样变性以载脂蛋白AII-前体(AApoAII)的错误折叠为特征。AApoAII-聚集体可以因此是对于AApoAII-淀粉样变性的直接生物标记。然而，诊断性检测是一项技术挑战，因为AApoAII也在健康机体中到处产生。因此，方法必须是对正常折叠的、单体的AApoAII的高度过量不敏感的。

ATTR-淀粉样变性的诊断包括临床表现的评定。但是在这种情况下问题是相比于非常多的其他病象的差异诊断分界。此外，最初症状的时刻、疾病的进程和局部表型是不同的。金标准是借助于刚果红染色的ATTR-淀粉样蛋白的组织学检测。但是，为此需要昂贵的活组织检查。目前还未建立检测体液中作为生物标记的淀粉样蛋白聚集体的常规诊断法。

ATTR-淀粉样变性以转甲状腺素蛋白前体蛋白(TTR)的错误折叠为特征。ATTR-聚集体可以因此是对于ATTR-淀粉样变性的直接生物标记。然而，诊断性检测是一项技术挑战，因为ATTR也在健康机体中到处产生。因此，方法必须是对正常折叠的、单体的ATTR的高度过量不敏感的。

目前，精神分裂性精神病在首次症状出现后三至五年才可以得到诊断。基于生物标记检测的诊断法对于慢性精神性疾病例如精神分裂症迄今还未处于常规使用。在这种情况下，在早期甚至症状发生前的疾病进程中生物标记的鉴别和标准化对于治疗发展是极为和也许决定性地重要的。这也适用于遗传决定的情况，因为可以也在此跟踪疾病进程和治疗进程。

对于许多中枢神经系统疾病特征性的是，疾病进程中错误折叠的聚集的蛋白质的出现。新近的研究看到慢性精神性疾病，例如精神分裂症或复发性抑郁症与聚集的DISC1-蛋白(disrupted-in-schizophrenia-1)之间的联系。这些DISC1-聚集体可以是精神分裂症、复发性抑郁症和其他DISC1蛋白病变的直接生物标记。然而，诊断性检测是一项技术挑战，因为DISC1也在健康机体中到处产生。因此，方法必须所对正常折叠的、单体的DISC1的高度过量不敏感的。

基于生物标记检测的诊断不仅对于ALS而且对于FTLD目前还未处于常规使用。同样，到目前时刻还没有基于原因的治疗法。仅使用神经保护性的和症状的治疗。在这种情况下，在早期甚至症状发生前的疾病进程中生物标记的鉴别和标准化对于治疗发展是极为和也许决定性地重要的。这也适用于遗传决定的情况，因为可以也在此跟踪疾病进程和治疗进程。

对于许多中枢神经系统疾病特征性的是，疾病过程中错误折叠的聚集的蛋白质的出现。在肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞叶变性(FTLD)的情况下，描述了RNA-结合蛋白FUS(FusedinSarcoma)的胞质沉积物。这些FUS-聚集体可以是对于所描述的病象的直接生物标记。然而，诊断性检测是一项技术挑战，因为FUS也在健康机体中到处产生。因此，方法必须是对正常折叠的、单体的FUS的高度过量不敏感的。

目前认为血糖水平是对于DMT2的共同认可的生物标记，用其可以取得对患者的可靠诊断。如果血糖水平借助于胰岛素调节，那么DMT2的检测就不再是可能的。这对于用于输注的库存血的分析是特别有意义的，因为这可能意味着对于接受者的潜在危险。在早期甚至症状发生前的疾病进程中生物标记的鉴别和标准化对于DMT2的有原因的治疗发展也是极为和也许决定性地重要的。这也适用于遗传决定的情况，因为可以也在此跟踪疾病进程和治疗进程。

关于2型糖尿病(DMT2)和阿尔茨海默病(AD)之间的联系已报道了多年。依据研究，大约80％的AD患者患有DMT2或具有高的血液葡萄糖含量。此外，DMT2和AD小鼠显示相似的行为相关的、认知的和血管的异常。两种疾病具有相似的病理学特征：由于IAPP-肽或Aβ-肽的蛋白质折叠和接此而来的原纤维形成的胰腺中(DMT2)或脑中(AD)淀粉样蛋白斑的出现。特别地，认为小的聚集体是对于DMT2和AD的出现和进展的主要肇事者。ΙΑΡΡ-聚集体可以因此是对于DMT2的直接生物标记。然而，诊断性检测是一项技术挑战，因为ΙΑΡΡ也在健康机体中到处产生。因此，方法必须是对正常折叠的、单体的ΙΑΡΡ的高度过量不敏感的。

基于生物标记检测的诊断对于ALS目前还未处于常规使用。同样，到目前时刻还没有基于原因的治疗法。仅使用神经保护性的和症状的治疗。在这种情况下，在早期甚至症状发生前的疾病进程中生物标记的鉴别和标准化对于治疗发展是极为和也许决定性地重要的。这也适用于遗传决定的情况，因为可以也在此跟踪疾病进程和治疗进程。

对于许多中枢神经系统疾病特征性的是，疾病过程中错误折叠的聚集的蛋白质的出现。在肌萎缩侧索硬化(ALS)的情况下，描述了过氧化物歧化酶1(SOD1)的沉积物。这些SOD1-聚集体可以是对于ALS的直接生物标记。然而，诊断性检测是一项技术挑战，因为SOD1也在健康机体中到处产生。因此，方法必须是对正常折叠的、单体的SOD1的高度过量不敏感的。

帕金森病的诊断通过所谓的L-多巴试验来进行。在这种情况下，给患者与脱羧酶抑制剂相组合地施用L-多巴。该治疗导致症状的明确改善，可以以非常高的概率诊断帕金森病。

但是，基于体液中生物标记的最小侵入性检测的诊断对于帕金森病迄今还未处于常规使用。在这种情况下，在早期甚至症状发生前的疾病进程中生物标记的鉴别和标准化对于治疗发展是极为和也许决定性地重要的。这也适用于遗传决定的情况，因为可以也在此跟踪疾病进程和治疗进程。

对于许多中枢神经系统疾病特征性的是，疾病过程中错误折叠的聚集的蛋白质的出现。帕金森病以聚集的α-突触核蛋白的病理性积累为特征。该α-突触核蛋白聚集体可以是对于帕金森病和其他α-突触核蛋白病变的直接生物标记。然而，诊断性检测是一项技术挑战，因为α-突触核蛋白也在健康机体中产生。因此，方法必须是对正常折叠的、单体的α-突触核蛋白的高度过量不敏感的。

各种不同的Tau病变的神经病理学表型在死后得到鉴定。困难是各种不同的神经病理学改变的巨大重叠。此外，各种病理学状况经常相组合地存在，这强调了生物标记研究的必要性。但是，基于体液中生物标记检测的诊断对于Tau病变目前还未处于常规使用。同样，到目前时刻还没有基于原因的治疗法。仅使用神经保护性的和症状的治疗。在这种情况下，在早期甚至症状发生前的疾病进程中生物标记的鉴别和标准化对于治疗发展是极为和也许决定性地重要的。这也适用于遗传决定的情况，因为可以也在此跟踪疾病进程和治疗进程。

对于许多中枢神经系统疾病特征性的是，疾病过程中错误折叠的聚集的蛋白质的出现。Tau病变以Tau蛋白的病理性积累为特征。这些Tau-聚集体可以是对于各种不同病象的直接生物标记。然而，诊断性检测是一项技术挑战，因为Tau也在健康机体中到处产生。因此，方法必须是对正常折叠的、单体的Tau的高度过量不敏感的。

基于生物标记检测的诊断不仅对于ALS而且对于FTLD和CTE目前还未处于常规使用。同样，到目前时刻还没有基于原因的治疗法。仅使用神经保护性的和症状的治疗。在这种情况下，在早期甚至症状发生前的疾病进程中生物标记的鉴别和标准化对于治疗发展是极为和也许决定性地重要的。这也适用于遗传决定的情况，因为可以也在此跟踪疾病进程和治疗进程。

对于许多中枢神经系统疾病特征性的是，疾病过程中错误折叠的聚集的蛋白质的出现。在肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞叶变性(FTLD)的情况下，描述了TARDNA-结合蛋白43(TDP-43)的沉积物。这些TDP-43-聚集体可以是对于各种不同病象的直接生物标记。然而，诊断性检测是一项技术挑战，因为TDP-43也在健康机体中到处产生。因此，方法必须是对正常折叠的、单体的TDP-43的高度过量不敏感的。

在怀疑亨廷顿病的情况下，可以进行可以可靠地断定该疾病的基因测试。但是，基于体液中生物标记的最小侵入性检测的诊断对于亨廷顿病迄今还未处于常规使用。在这种情况下，在早期甚至症状发生前的疾病进程中生物标记的鉴别和标准化对于治疗发展是极为和也许决定性地重要的。这也适用于遗传决定的情况，因为可以也在此跟踪疾病进程和治疗进程。

对于许多中枢神经系统疾病特征性的是，疾病过程中错误折叠的聚集的蛋白质的出现。亨廷顿病以聚集的亨廷顿蛋白的病理性积累为特征。这些亨廷顿蛋白聚集体可以是对于亨廷顿病的直接生物标记。然而，诊断性检测是一项技术挑战，因为亨廷顿蛋白也在健康机体中产生。因此，方法必须是对正常折叠的、单体的亨廷顿蛋白蛋白的高度过量不敏感的。

ALys-淀粉样变性的诊断包括临床表现的评定。但是，在这种情况下问题是相对于非常多的其他病象的差异诊断分界。金标准是借助于刚果红染色和免疫组织化学的ALys-淀粉样蛋白的组织学检测。但是为此需要昂贵的活组织检查活组织检查。目前还未建立最小侵入性地检测体液中作为生物标记的淀粉样蛋白聚集体的常规诊断。

家族性内脏淀粉样变性以溶菌酶蛋白前体(ALys)的错误折叠为特征。ALys-聚集体可以因此是ALys-淀粉样变性的直接生物标记。然而，诊断性检测是一项技术挑战，因为溶菌酶也在健康机体中到处产生。因此，方法必须是对正常折叠的、单体的溶菌酶的高度过量不敏感的。

提供用于定量检测疾病指示物，特别是在相同样品中并存的多个疾病指示物的常规方法，也是本发明的任务。进一步，所述方法应该提供这样的可能性，以用仅少数的加工步骤或优选地没有加工步骤地分析样品。

许多神经退行性疾病和淀粉样变性以各种不同的聚集的蛋白质种类的同时出现为特征。作为实例，提及阿尔茨海默病，其中观察到不仅淀粉样蛋白β而且Tau的沉积物(Jucker和Walker，Annaisofneurology70，532-540，2011；SpillantiniandGoedert，Lancetneurology12，609-622，2013；其作为参考合并入本文)。在额颞叶变性(FTLD)的情况下，Tau和TDP-43作为病理学蛋白质聚集体共存(Mackenzie等人，Actaneuropathologica119，1-4，2010)。TDP-43-病理学状况在肌萎缩侧索硬化和慢性创伤性脑病中再次表现出来(Blennow等人，Neuron76，886-899，2012；Blokhuis等人，Actaneuropathologica125，777-794，2013；其作为参考合并入本文)。

所述方法必须确保足够的特异性，以并行地和/或同时地研究不同的聚集体类型。因此本发明的任务也是，提供对不同聚集体类型的研究同时具有的高度特异性的方法，和因此排除由于两种聚集体类型的聚集体类型研究的干扰。应当也可以研究由各种不同的蛋白质单体组成的聚集体混合形式。

上面提到的疾病的迄今所描述的蛋白质聚集体仅是各自病象的病理学主要特征。不确保其作为生物标记的应用。

该任务通过用于定性和/或定量测定疾病指示物的方法得到解决，其特征在于，就错误折叠蛋白质的至少一种聚集体类型，优选地至少两种聚集体类型研究样品，所述方法包括下列步骤：

a)将待研究的样品涂在基底上，

b)添加为检测而标记的探针，其通过与各自聚集体的特异结合标记它，和

c)检测经标记的聚集体，

其中，

-步骤b)可以在步骤a)之前进行，和

-所述疾病从由下列组成的组中选择：AA-淀粉样变性、AL-淀粉样变性、AApoAI-淀粉样变性、AApoAII-淀粉样变性、ATTR-淀粉样变性、精神分裂症和其他DISC1病变、肌萎缩侧索硬化、额颞叶变性和其他FUS-蛋白病变、2型糖尿病、帕金森病和其他突触核蛋白病变、Tau病变、慢性创伤性脑病变和其他TDP-43-蛋白病变、亨廷顿病、家族性内脏淀粉样变性和/或阿尔茨海默病，和

-如果在样品中检测到Aβ-聚集体，那么就内生错误折叠蛋白质的至少一种其他聚集体类型研究该样品。

在一个实施方案中，所述方法以此为特征，即无需其他加工和/或处理，在就第一种聚集体类型进行研究后，就至少一种其他的，例如内生错误折叠蛋白质的第二种不同的聚集体类型研究样品。

在另一个实施方案中，所述方法以此为特征，即在一个方法步骤中就至少两个不同的聚集体类型研究样品。

在另一个实施方案中，所述方法以此为特征，即在相同的基底上就至少两个不同的聚集体类型研究样品。

在另一个实施方案中，所述方法以此为特征，即内生错误折叠蛋白质的聚集体类型选自由下列组成的组：血清-淀粉样蛋白-A-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、IAPP-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在另一个实施方案中，所述方法以此为特征，即步骤c)中的检测借助于具有位置分辨信号的方法，优选地用sFIDA-方法来进行。

在另一个实施方案中，所述方法以此为特征，即在步骤a)之前，进行捕获分子在基底上的固定化。

在另一个实施方案中，所述方法以此为特征，将捕获分子和/或探针用荧光染料进行标记。

在另一个实施方案中，所述方法以此为特征，即捕获分子和/或探针具有针对形成聚集体的蛋白质的表位的特异抗体。

在另一个实施方案中，所述方法以此为特征，采用内标准和外标准物。

在另一个实施方案中，所述方法以此为特征，即捕获分子、探针和/或标准物包含由单体序列构成的聚合物，所述单体序列就其序列而言与内生蛋白质的部分区域是相同的或就相应的部分区域具有至少50％的同源性，其中这些聚合物不聚集而内生蛋白质是聚集的那些。

本发明的目标也是，使用包含由单体序列构成的聚合物的用于选择性地定量和/或表征上面提到的疾病指示物的标准物，蛋白质的分区是相同的或在相应分区内具有至少50％的同源性，其中这些聚合物不聚集而内生蛋白质是聚集的那些。

使用根据本发明的标准物分子以使各自蛋白质聚集体失活，例如通过结合或破坏蛋白质聚集体，或预防性地，以阻碍蛋白质聚集体的形成。因此为了在医学中使用，为了作为药物使用和/或为了在治疗性、诊断性和/或外科手术方法中使用的标准物是本发明的目标。

其他目标是包含具有对于上面提到的疾病指示物和/或聚集体的捕获分子的精确确定区域的基底。

进一步，本发明的目标是用于确定具有错误折叠蛋白质的聚集体的疾病的差异诊断，其包括下列步骤：

i)定量地测定在根据本发明的方法中测定的疾病指示物；

ii)将这些数据与标准值进行比较；

iii)确定在该比较中疾病指示物的显著不同的量；

iv)将偏差归因于选自由AA-淀粉样变性、AL-淀粉样变性、AApoAI-淀粉样变性、AApoAII-淀粉样变性、ATTR-淀粉样变性、精神分裂症和其他DISC1病变、肌萎缩侧索硬化、额颞叶变性和其他FUS-蛋白病变、2型糖尿病、帕金森病和其他突触核蛋白病变、Tau病变、慢性创伤性脑病变和其他TDP-43-蛋白病变、亨廷顿病、家族性内脏淀粉样变性和/或阿尔茨海默病组成的组的疾病。

术语“聚集体类型”，在本发明的范围内理解为内生错误折叠蛋白质的一定、确定的组成的聚集体。在一个备选方案中，聚集体类型由相同的肽(单体)组成(构成)，即由相同的氨基酸序列的肽或由一个和相同的肽的不同同源物组成。在另一个备选方案中，聚集体类型由不同的肽(单体)组成，即由不同氨基酸序列的肽或由不同肽的同源物构成。在一个样品中，也可以存在两种备选方案。

在本发明的一个实施方案中，“疾病指示物的定性测定”意味着新的特异性生物标记的鉴定。换言之，鉴定和新确定疾病指示物。根据本发明，疾病指示物通过内生错误折叠蛋白质的各自一个或多个聚集体的存在，需要时以一定的浓度的，和/或缺乏来确定。

在另一个实施方案中，“疾病指示物的定性测定”意味着这些生物疾病的存在和/或缺乏的复核或确定。

在本发明的范围内，“疾病指示物的定量测定”意味着在第一个选择中，生物标记的浓度的确定。在第二个选择中，测量生物标记的组成、大小和/或形状。也可以进行两个选择，优选地，同时在一个方法步骤中。

疾病指示物的定量测定等于作为生物标记的聚集体类型的选择性定量和/或表征。一旦确定了疾病指示物的特征，就进行其定量测定，即其选择性定量：即浓度测定，其包含关于存在和/或缺乏的信息；和/或其表征：即组成、大小和/或形状的测定。

在本发明的一个备选方案中，就内生错误折叠蛋白质的至少两个聚集体类型研究样品。在本发明的一个备选方案中，就内生错误折叠蛋白质的至少三个聚集体类型研究样品。在本发明的一个备选方案中，就内生错误折叠蛋白质的至少三四个聚集体类型研究样品。在本发明的一个备选方案中，就内生错误折叠蛋白质的至少五个聚集体类型研究样品。在本发明的一个备选方案中，就内生错误折叠蛋白质的至少六个聚集体类型研究样品。在本发明的一个备选方案中，就内生错误折叠蛋白质的至少七个聚集体类型研究样品。在本发明的一个备选方案中，就内生错误折叠蛋白质的至少八个聚集体类型研究样品。在本发明的一个备选方案中，就内生错误折叠蛋白质的至少九个聚集体类型研究样品。在本发明的一个备选方案中，就内生错误折叠蛋白质的至少十个聚集体类型研究样品。在本发明的一个备选方案中，就内生错误折叠蛋白质的至少11、12、13、14、15或更多个聚集体类型研究样品。

在本发明的一个实施方案中，所述聚集体由肽或SEQIDNO：1-15的单体和/或其同源物构成，具有下列分配：

血清-淀粉样蛋白-A-蛋白聚集体：SEQIDNO：1；IgG轻链聚集体：SEQIDNO：2；AApoAI-聚集体：SEQIDNO：3；AApoAII-聚集体：SEQIDNO：4；ATTR-聚集体：SEQIDNO：5；DISC1-聚集体：SEQIDNO：6；FUS-聚集体：SEQIDNO：7；ΙΑΡΡ-聚集体：SEQIDNO：8；SOD1-聚集体：SEQIDNO：9；α-突触核蛋白聚集体：SEQIDNO：10；Tau-聚集体：SEQIDNO：11；TDP-43-聚集体：SEQIDNO：12；亨廷顿蛋白聚集体：SEQIDNO：13；溶菌酶聚集体：SEQIDNO：14和Aβ-聚集体：SEQIDNO：15。

在一个实施方案中，至少就来自上面提到的组的聚集体类型和另外一个聚集体类型进行研究。

然而，也可以存在混合的聚集体，由至少两种不同的蛋白质，单体，所谓的聚集体混合物构成。

术语“研究内生错误折叠蛋白质的聚集体类型”或同义词例如其“研究”，在本发明的范围内，意味着各自聚集体类型的定性和/或定量测定(分析)。在定性测定的情况下，测定存在或缺乏，而在定量测定的情况下，测定浓度、组成、大小和/或形状。

术语没有样品的“其他加工和/或处理”以就两个聚集体类型进行研究，根据本发明意味着，在一个备选方案中，在就不同聚集体类型的两个研究之间不发生任何加工和/或处理。在另一个备选方案中，在第一或另一个聚集体类型的研究之后在样品中不发生化学反应。优选地，在一个样品等份中，进行第一和第二和需要时，任何进一步的研究。需要时，样品经历仅物理或机械的作用例如温度改变或移液。在另一个或另外的备选方案中，样品不经历物理或机械的作用。在另一个或另外的备选方案中，用于第二聚集体类型的研究的样品具有与用于第一聚集体类型的研究的样品相同的化学组成，需要时，相同的化合物然而以改变的浓度存在。此外，用于第二聚集体类型的研究的样品需要时包含用于研究第一种聚集体类型的研究的捕获分子、探针和/或标准物以及由聚集体、捕获分子和/或探针组成的相应化合物。在另一个或另外的备选方案中，用于就第二聚集体类型的研究的探针在就第一聚集体类型的研究之后才对此给予，从而作为唯一的化学反应，是对于第二聚集体类型的特异探针与这些聚集体的结合，如果这些聚集体包含在样品中。

类似地，上面所描述的事实情况也适用于第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和/或其他聚集体类型的研究。

在一个实施方案中，本发明涉及用于测定用于确定疾病的指示物的方法，所述疾病具有错误折叠蛋白质的聚集体，所述方法其包括下列步骤：

a)将待研究的样品涂在基底上，

c)检测经标记的聚集体，

其中，

-步骤b)可以在步骤a)之前进行，和

-从下列组成的组选自疾病：AA-淀粉样变性、AL-淀粉样变性、AApoAI-淀粉样变性、AApoAII-淀粉样变性、ATTR-淀粉样变性、精神分裂症和其他DISC1病变、肌萎缩侧索硬化、额颞叶变性和其他FUS-蛋白病变、2型糖尿病、帕金森病和其他突触核蛋白病变、Tau病变、慢性创伤性脑病变和其他TDP-43-蛋白病变、亨廷顿病、家族性内脏淀粉样变性。

生物标记，也被称为疾病指示物，根据本发明依照NIH的定义，是这样的参数，用其能够客观地测量一种特性，以考虑它作为对正常的生物致病过程或就治疗干预的药理学应答的指示物。根据本发明测定和使用的疾病指示物用物理和/或化学方法定性和定量地表征。

本发明范围内的聚集体是

·颗粒，其由多个，优选地相同的构件组成，其不是共价地相互结合的，和/或

·多个单体的非共价团聚体，以及

·异聚集体，“共聚集体”，即由不同单体组成的聚集体。

对于根据本发明的方法，从人或动物的身体取得样品并且不再把它们送回。

在方法的一个备选方案中，为了查明，特别是为了定性地测定疾病指示物，将具有潜在生物标记的疾病指示物样品与诊断为健康的和/或生病的个体的样品进行比较。该诊断基于例如临床表现的评定或其他诊断方法的评价。通过被检测的聚集体的量的比较，可能关于作为生物标记的资格说出意见。

在一个备选方案中，它是适合于临床常规使用的疾病指示物。根据本发明，生物标记是适合于临床使用的，如果存在科学地可检测的和可重现的证据，特别是基于物理和/或化学的方法。

用于选择性地定性和/或表征疾病指示物的方法也是本发明的目标，其包括下列步骤：

a)将待研究的样品涂在基底上，

c)检测经标记的聚集体，

其中，

-步骤b)可以在步骤a)之前进行，和

-所述疾病从由下列组成的组中选择：AA-淀粉样变性、AL-淀粉样变性、AApoAI-淀粉样变性、AApoAII-淀粉样变性、ATTR-淀粉样变性、精神分裂症和其他DISC1病变、肌萎缩侧索硬化、额颞叶变性和其他FUS-蛋白病变、2型糖尿病、帕金森病和其他突触核蛋白病变、Tau病变、慢性创伤性脑病变和其他TDP-43-蛋白病变、亨廷顿病、家族性内脏淀粉样变性。

因此，用于确定聚集体的组成、大小和/或形状的方法也是本发明的目标。在此使用上面提到的和描述的方法步骤。

在本发明的一个变化形式中，进行样品的预处理，优选地按照一个或多个下列方法：

-加热(至直至样品沸点的温度)

-一个或多个冷冻融化循环，

-用水或缓冲液稀释，

-用酶，例如蛋白酶、核酸酶、脂酶进行处理，

-离心，

-沉淀，

-与探针竞争，以排挤可能存在的抗体。

作为基底，根据本发明选择这样的材料，其拥有尽可能少的、非特异的结合能力，特别是关于错误折叠蛋白质的聚集体的。

在本发明的一个实施方案中，所述基底选自玻璃。

可以给基底涂覆亲水性物质，优选地多聚-D-赖氨酸、聚乙二醇(PEG)，优选地异双功能聚乙二醇(NHS-PEG-COOH)或葡聚糖，特别是葡萄糖，优选地羧甲基葡聚糖(CMD)。

在本发明的一个实施方案中，使玻璃表面羟基化然后用氨基基团活化。

为了准备对于涂覆的基底，进行下列的一个或多个步骤：

·在超声浴或等离子清洁器中洗涤玻璃基底或玻璃载体，备选地为此在5MNaOH中孵育至少3小时，

·用水冲洗，然后在氮气下干燥，

·浸没在由3:1比例的浓硫酸和过氧化氢组成的溶液中以活化羟基基团，

·用水冲洗直至中性pH，然后用乙醇冲洗并在氮气气氛下干燥，

·浸没在具有在干甲苯中的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(1-7％)的溶液中或乙胺溶液中，

·用丙酮或DMSO和水冲洗并在氮气气氛下干燥。

对于用葡聚糖，优选地羧甲基葡聚糖(CMD)涂覆，将基底用CMD(以10mg/ml或20mg/ml的浓度)和需要时，N-乙基-N-(3-二己基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(200mM)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(50mM)的水溶液一起孵育然后洗涤。

在一个变化形式中，羧甲基葡聚糖与玻璃表面共价结合，使后者首先羟基化后然后用氨基基团活化，如上面描述的那样。

作为基底，也可以使用微量滴定板，优选地具有玻璃底的。由于在应用聚苯乙烯框架的情况下，浓盐酸的使用是不可能的，因此类似于Janissen等人(ColloidsSurfBBiointerfaces，2009，71(2)，200-207)，在本发明的一个实施变化形式中进行玻璃表面的活化。

在本发明的一个实施方案中，将玻璃表面与氢氧化钠溶液(5M)在室温下孵育15分钟，用水冲洗三次，掺入盐酸并在室温下重又孵育15分钟。在用水洗涤三次和用乙醇洗涤两次后，将基底(玻璃表面)在氮气气氛下进行干燥。

为了在玻璃表面上产生氨基基团，将其与乙胺(5.6M)在室温下孵育过夜。然后将基底用DMSO冲洗三次，用乙醇两次并在氮气气氛下进行干燥。

将异双功能聚乙二醇(NHS-PEG-COOH，MW3400道尔顿)于70℃在DMSO中溶解1分钟至50mM，冷却至室温并用2％三乙胺调节。与该溶液在室温下孵育至少一个小时。从其除去溶液，并用水洗涤玻璃表面三次。

为了活化PEG–涂层，将NHS和EDC溶解在MES-缓冲液(0.1M，pH5)中各自至100mM并以与1:1比例混合至各自50mM的最终浓度。将基底与该溶液在室温下孵育30-60分钟。在除去溶液后，用MES-缓冲液(0.1M，pH5)洗涤三次。

将捕获抗体在PBS中稀释至30ng/μl并将基底与其在室温下孵育1-3小时。然后除去溶液并用PBST洗涤三次，然后用PBS洗涤三次。

将3％BSA首先在100000g下(1小时于4℃)离心。将基底与上清液在室温下孵育一个小时。除去BSA-溶液并用PBST洗涤三次。

将样品(例如由重组蛋白质和天然患者样品形成的聚集体)，如果需要，在PBS中稀释并涂抹。将具有样品的基底在1000g下于4℃在甩开转子中离心一个小时。除去上清液并用PBST洗涤三次和用PBS洗涤三次。

作为检测探针，使用荧光标记的抗体。将其在PBS中稀释至1-2ng/μl并掺入1.5％BSA。将反应批料在100000g下于4℃离心。在基底上涂抹上清液并在室温下孵育1-2小时。然后除去溶液并用PBST洗涤五次和用PBS洗涤五次。

在本发明的一个实施方案中，将样品直接涂抹在基底(未经涂覆的基底)上，需要时通过在需要时活化的基底表面上的共价结合。

在本发明的一个备选方案中，使捕获分子在基底上固定化，以捕获和固定错误折叠的内生蛋白质的聚集体。

优选地，作为捕获分子，使用聚集的内生蛋白质的抗体。抗体特异地结合聚集的内生蛋白质的表位。

在一个备选方案中，所述捕获分子与基底共价结合。

在另一个备选方案中，所述捕获分子与涂层，优选地葡聚糖层共价结合。

在本发明的一个实施方案中，将捕获分子(抗体)，需要时在涂覆有CMD的载体通过EDC/NHS(200或50mM)的混合物的活化后，固定化在基底上。

可以使剩下的不与捕获分子结合的羧酸根末端基团失活。

为了使CMD-间隔子上的这些羧酸根末端基团失活，使用在DMSO中的乙胺。在涂抹样品之前，用PBS冲洗基底或载体。

在经如此制备的基底上孵育待测量的样品。

在一个实施方案中，所述捕获分子和/或探针包含由单体序列构成的聚合物，所述单体序列就其序列而言与内生蛋白质的部分区域是相同的或就相应的部分区域具有至少50％的同源性，其中这些聚合物不聚集而内生蛋白质是聚集的那些。

在该意义下，在此术语“单体序列”描述形成错误折叠蛋白质的聚集体的单一蛋白质的分区。

优选地，单体序列是抗体与其结合的形成表位的区域，其特异地与形成聚集体的蛋白质结合。

在本发明的一个实施方案中，作为内生蛋白质，理解为具有SEQIDNr.1–15的序列的多肽以及其同源物，其特别地通过基因突变形成。在内生蛋白质的情况下，它也是这些肽的寡聚体或聚合物。SEQIDNO：1-15也被称为肽或多肽。

作为“同源物”或“同源序列”，在本发明的范围内，理解为这样的氨基酸序列，其与来自错误折叠蛋白质的内生致病聚集体或寡聚体的肽的氨基酸序列具有至少50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％的同一性。代替术语“同一性”，在本说明书中意义相同地使用术语“同源物”或“同源性”。两个核酸序列或多肽序列之间的同一性通过借助于基于Smith，T.F.和Waterman，M.S(Adv.Appl.Math.2：482-489(1981))的算法的BESTFIT程序的比较来计算，通过调整下列对于氨基酸的参数：缺口产生罚分：8和缺口延伸罚分：2；和对于核酸的下列参数：缺口产生罚分：50和缺口延伸罚分：3。优选地，两个核酸序列或多肽序列之间的同一性通过核酸序列/多肽序列在各自总序列长度上的同一性来确定，例如它通过借助于基于Needleman，S.B.和Wunsch，CD.(J.Mol.Biol.48：443-453)的算法的GAP程序的比较来计算，通过调整对于氨基酸的下列参数：缺口产生罚分：8和缺口延伸罚分：2；和对于核酸的下列参数：缺口产生罚分：50和缺口延伸罚分：3。

在本发明的范围内，两个氨基酸序列是相同的，如果它具有同样的氨基酸序列。

在一个进一步的步骤中，标记为后来的检测标记的探针的聚集体。

在一个实施方案中，用荧光染料标记捕获分子和/或探针。

在一个备选方案中，所述捕获分子和/或探针包含针对形成聚集体的蛋白质的表位的特异抗体。

在本发明的一个变化形式中，作为探针，使用抗体。捕获分子和探针是相同的。

在本发明的一个实施方案中，捕获分子和探针相区别。因此可以使用例如不同的抗体作为捕获分子和探针。

在本发明的另一个实施方案中，使用这样的捕获分子和探针，其除了可能的染料标记外，彼此是相同的。在本发明的一个备选方案中，使用各自不同的探针，其除了可能的染料标记外，彼此是相同的。在本发明的另一个备选方案中，使用至少2种或多种不同的捕获分子和/或探针，其包含不同的抗体或是不同的抗体和需要时，也具有不同的染料标记。

但是作为捕获分子，也可以使用不同的分子，例如包含抗体的不同抗体或分子。

同样地，作为探针，可以使用多个不同的分子，例如包含不同的抗体或是不同的抗体。

为了表面的后来的质量控制，例如具有捕获分子的涂层的均匀性，可以使用用荧光染料标记的捕获分子。为此优选地使用这样的染料，其不干扰检测。借此，结构的后来检查以及测量结果的标准化是可能的。

为了检测，如此标记探针，从而它发射光学可检测的信号，其选自由荧光、生物发光和化学发光发射以及吸收组成的组。

在一个备选方案中，用染料标记探针。优选地，在此它是荧光染料。

在本发明的一个实施方案中，使用1、2、3、4、5、6或更多不同的探针。探针可以相区别，不仅关于其与聚集体的特异结合而且关于其不同的标记，例如由于荧光染料。

也可以将这样的探针相互组合，其对于FRET(荧光共振能量转移)作为检测是合适的。

由不同的荧光染料标记的多个不同探针的使用提高了测量中获得的相关信号的特异性。此外，由此单体，即未聚合的分子的掩蔽也是可能的。单体的检测可以特别地被排除，如果探针和捕获分子是相同的，或两者识别重叠的表位。

因此利用或使用聚集体特异的或寡聚体特异的探针也是本发明的目标。它们特异地与一定的聚集体或寡聚体，优选地对于上面提到的错误折叠蛋白质的种类的，结合。通过与一定的聚集体或寡聚体的特异结合，可以测定聚集体或寡聚体的类型和/或大小以及组成。

因此本发明的其他目标也是聚集体特异或寡聚体特异的探针。

在本发明的范围内，术语“单体”指示肽分子，单一蛋白质，其形成错误折叠蛋白质的聚集体。视来源种类(人和/或动物)和加工，可以在长度和类型方面改变单体的精确氨基酸序列。优选的单体选自SEQIDNO：1-15以及其同源物。

在本发明的范围内，术语寡聚体不仅指示聚集体而且指示寡聚体和也指示小的、自由扩散的寡聚体。寡聚体在本发明的范围内是由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个单体或其多聚体形成的聚合物。在这种情况下，它可以但不必是，寡聚体中的所有单体彼此是相同的。

因此，聚集体，理解为不仅是寡聚体，而且是小的、自由的寡聚体。

在另一个备选方案中，可以使用用荧光染料标记的内生蛋白质作物探针。

作为待研究的样品，可以使用内生液体或组织。在本发明的一个实施方案中，所述样品选自脑脊液(CSF)、血液、血浆、尿、唾液、粘膜和/或活组织检查材料。可以使样品经历不同的、专业人员已知的准备步骤。

本发明的优点是测定未经处理的样品，优选地脑脊液中的聚集体的可能性。

在本发明的一个变化形式中，使用内或外标准物。

此类标准物包含或就是聚合物，其由单体序列，优选地根据SEQIDNO：1-15的序列或SEQIDNO：1-15的一部分构成，其关于其序列与内生蛋白质的分区是相同的或在相应分区内具有至少50％的同源性，其中这些聚合物不聚集而内生蛋白质是聚集的那些。

根据本发明，内生蛋白质的单体检测通过在试验系统中使用三个不同的或三个不同地标记的探针来排除，所述探针与相似的或相同的表位结合。备选地或另外地，单体的检测通过具有低强度的信号不被强度截断值评价来排除。由于较大的聚集体拥有多个对于两个用不同染料标记的探针的结合位点，单体检测可以备选地或另外地通过这些信号的交互关联来排除。

经标记的聚集体的检测通过扫描或其他类型的表面成像来进行。检测优选地用共聚焦荧光显微镜、荧光相关光谱(FCS)，特别地与交互关联和单个粒子免疫吸附、激光扫描分析和/或激光扫描显微镜(LSM)来进行。备选地，进行借助于全内反射荧光显微镜(TIRFM)的检测。

在本发明的一个备选方案中，检测用共聚焦激光扫描显微镜进行。

在本发明的一个实施方案中，为此使用例如它在激光扫描显微镜中被使用的激光焦距或FCS(荧光相关光谱系统)，以及其相应的超分辨变化形式例如STED或SIM。备选地，为此可以通过TIRF-显微镜，以及其相应的超分辨变化形式，例如STORM、dSTORM进行检测。

因此，在本发明的一个实施方案中，排除基于非位置分辨的信号的方法，例如ELISA或夹心ELISA。

在检测中，高的位置分辨率是有利的。在这种情况下，在根据本发明的方法的一个实施方案中，汇集如此多的数据点，从而使背景信号前的聚集体检测成为可能，背景信号例如由仪器特异的噪音、其他非特异信号或非特异结合的探针引起。通过该方法，读出如此多的值(读数值)，例如存在位置分辨的事件，例如像素。通过位置分辨，测定各自背景前的每个事件并且因此代表相比于具有仅一个读数值、几个读数值和/或没有位置分辨信号的ELISA-方法的优点。

在一个备选方案中，在根据本发明的方法使用多个探针。由此，使信息，即读出的值增加多倍，这是因为对于每个点，对于每个聚集体或对于每个检测事件，取决于各自的提供信号的探针，获得分离的信息。因此对于每个事件，增加了信号的特异性。由此可以对于每个检测的聚集体也确定其组成，即聚集体的类型，即由单体或其混合物的组成。

不同探针的数目在这种情况下仅通过待使用的荧光染料的干扰来限制。因此可以使用1、2、3、4或更多种不同的探针-染料组合。

位置分辨和时间分辨的信息对根据上面描述的方法，如果使用了多于一个探针，是基本的。在这种情况下，它例如是荧光的类型和/或强度。在充分利用对于所有所使用和检测的探针的这些数据的情况下，根据本发明测定聚集体的数目、其形状、大小和/或其组成。在这种情况下，关于寡聚体大小的信息可以直接或间接地获得，不取决于是否颗粒比所使用的成像方法的时间分辨率或位置分辨率小或大。在一个实施方案中，可以使用用于背景最小化算法和/或应用强度阈值。

作为荧光染料，可以使用专业人员已知的染料。备选地，可以使用GFP(绿色荧光蛋白)、其缀合物和/或融合蛋白，以及量子点。

通过使用内和外标准物，试验结果是客观地相互可比较的和因此有说服力的。

在本发明的一个备选方案中，使用一个内或外标准物以用于聚集体的定量。

依据荧光强度分布分析(FIDA-荧光强度分布分析)，根据本发明的方法是所谓的表面-FIDA(Surface-FIDA，sFIDA)。检测用共聚焦荧光显微镜、荧光相关光谱(FCS)、激光扫描显微镜(LSM)和/或全内反射荧光显微镜(TIRFM)，优选地LSM和/或全内反射荧光显微镜(TIRFM)来进行。

在本发明的一个实施方案中，用高敏感性CCD-照相机拍摄每孔直至50个单个图像(1000x1000像素，114nm/像素)/荧光通道。

图像数据中的背景信号通过强度阈值校正。测定具有在阈值以上的灰阶值的像素数(sFIDA-读数)。如果使用多个检测探针，那么仅评价在所有荧光通道中共定位的事件。

sFIDA-方法在Bannach等人(2012.Detectionofprionproteinparticlesinbloodplasmaofscrapieinfectedsheep.PloSone7，e36620)以及Wang-Dietrich等人(2013.Theamyloid-βoligomercountincerebrospinalfluidisabiomarkerforAlzheimer'sdisease.JournalofAlzheimer'sdisease34，985-994)中作了描述，其作为参考合并入本文中。

通过捕获分子和探针分子的选择，能够测定寡聚体必须具有的大小，以可以为检测(信号)做出贡献。因此可以例如检测单体、二聚体、三聚体等。但也可以使用这样的捕获分子和探针分子，从而作为例如二聚体或其他聚合物的最小可检测单元。

在一个实施方案中，使用这样的捕获分子和/或探针分子，其为这样的聚合物或包含这样的聚合物，其由单体序列，优选地根据SEQIDNO：1-15的序列或SEQIDNO：1-15之一的一部分，其关于其序列与内生蛋白质的分区是相同的或在相应分区内具有至少50％的同源性，其中这些聚合物不聚集而内生蛋白质是聚集的那些。

此外，用根据本发明的方法，小的、自由扩散的聚集体的精确分析也是可能的。由于其在其对于光学显微镜的分辨率以下的大小，小的寡聚体难以与背景荧光(例如由未结合的抗体引起的)相区别。

除了极其高的敏感度，根据本发明的方法也显示关于聚集体数目在大的范围内的直线性。

使用小的、自由扩散的Aβ-聚集体联合Tau-聚集体作为生物标记以检测和为了识别蛋白质聚集疾病，特别是AD，是本发明的另一个目标。本发明也涉及用于识别和/或检测蛋白质聚集疾病，特别是选自下列的疾病的方法：AA-淀粉样变性、AL-淀粉样变性、AApoAI-淀粉样变性、AApoAII-淀粉样变性、ATTR-淀粉样变性、精神分裂症和其他DISC1病变、肌萎缩侧索硬化、额颞叶变性和其他FUS-蛋白病变、2型糖尿病、帕金森病和其他突触核蛋白病变、Tau病变、慢性创伤性脑病变和其他TDP-43-蛋白病变、亨廷顿病、家族性内脏淀粉样变性和/或阿尔茨海默病，其特征在于，用根据本发明的、上面描述的方法分析患者体液样品，优选地CSF或血液，特别是CSF。

在一个实施方案中，通过下列方法，所谓的sFIDA-分析，解决该任务：

1.预处理表面(优选地，玻璃)，从而它拥有尽可能少的非特异结合能力(例如，通过化学修饰共价地盖上一个葡聚糖层)。其上结合(优选地，共价地)对于包含AA-的颗粒的捕获分子(例如，抗AA-抗体)。捕获分子可以全部是相同的或是各种不同捕获分子的混合物。

2.然后在经如此准备的表面上涂上待研究的样品(例如，脑脊液、血液、血浆、尿、唾液、粘膜和/或活组织检查材料)，具有或没有前面的加工步骤。非特异结合的物质可以通过洗涤步骤除去。

3.将潜在地包含在样品中的AA-颗粒(例如AA-聚集体)用对于其他检测有用的探针(例如，结合荧光染料的抗-AA-抗体)标记。优选的荧光染料尤其也可以包括量子点。优选地，用至少一种其他探针(例如结合荧光染料的抗-AA-抗体)标记包含AA-的颗粒。与不同荧光染料偶联的多个不同探针的使用，一方面提高了末端上获得的相关信号的特异性，另一方面这也使AA-单体的掩蔽成为可能。特别地，如果检测探针之一与捕获分子(来自步骤1)是相同的或两者识别重叠的表位，那么就可以排除AA-单体的检测。为了增加特异性，可以使用淀粉样蛋白特异的染料硫磺素T作为额外的检测探针。

在一个备选方案中，使用AA-抗体，优选地抗-血清淀粉样蛋白A抗体克隆115、mc1和/或291作为捕获分子和/或探针。在一个备选方案中，使用(AF488-标记的)EPR4134作为捕获分子和/或探针。

4.步骤2和3也可以交换。通过适当的洗涤步骤，除去过量的探针。

5.标记的聚集体的检测通过扫描(例如，通过激光焦距，如它在激光扫描显微镜中被使用的或例如TIRFM)或通过其他类型的表面成像(例如，通过TIRF-显微镜)来进行。在这种情况下，时间分辨率和位置分辨率越高，各自允许聚集体在背景信号(例如，由于仪器特异的噪音、非特异信号、非特异结合的探针)前的检测产生越多的数据点。通过该方法，不仅产生读数值(例如这是在ELISA下的情况)，而且存在如此多的读数值，如时间分辨和位置分辨事件(例如，像素)。通过多个不同探针的使用(参见步骤3)，这些信息甚至增加多倍并且对于在那里给探针提供信号的每个点、每个聚集体或每个检测事件可以分开地获得信息。因此对于每个事件，提高了信号的特异性。

6.为了评价，考虑所有所使用和检测的探针的时间分辨和位置分辨信息(例如，荧光强度)，以测定例如聚集体的数目、其大小和其组成。在这种情况下，可以使用背景最小化算法和/或对于其他的评价，也应用强度阈值。

7.为了使试验结果相互可比较(不管距离、时间和实验者)，可以使用标准物(内和/或外的)。

在一个实施方案中，通过下列方法，所谓的sFIDA-分析来解决该任务：

1.预处理表面(优选地，玻璃)，从而它拥有尽可能少的非特异结合能力(例如，通过化学修饰共价地盖上一个葡聚糖层或聚乙二醇)。其上结合(优选地，共价地)对于包含AL-的颗粒的捕获分子(例如，抗AL-抗体)。捕获分子可以全部是相同的或是各种不同捕获分子的混合物。

2.然后在经如此准备的表面上涂上待研究的样品(例如，脑脊液、血液、血浆、尿、唾液、粘膜、活组织检查材料)，具有或没有前面的加工步骤。非特异结合的物质可以通过洗涤步骤除去。

3.将潜在地包含在样品中的AL-颗粒(例如AL-聚集体)用对于其他检测有用的探针(例如，结合荧光染料的抗-AL-抗体)标记。优选的荧光染料尤其也可以包括量子点。优选地，用至少一种其他探针(例如结合荧光染料的抗-AL-抗体)标记包含AL-的颗粒。与不同荧光染料偶联的多个不同探针的使用，一方面提高了末端上获得的相关信号的特异性，另一方面这也使AL-单体的掩蔽成为可能。特别地，如果检测探针之一与捕获分子(来自步骤1)是相同的或两者识别重叠的表位，那么就可以排除AL-单体的检测。为了增加特异性，可以使用淀粉样蛋白特异的染料硫磺素T作为额外的检测探针。

在一个备选方案中，使用抗-λ轻链抗体克隆EPR5367、HP6054和/或2G9作为捕获分子和/或探针。在一个备选方案中，使用(AF488-标记的)EPR5367作为捕获分子和/或探针。

5.标记的聚集体的检测通过扫描(例如，通过激光焦距，如它在激光扫描显微镜中被使用的)或通过其他类型的表面成像(例如，通过TIRF-显微镜)来进行。在这种情况下，时间分辨率和位置分辨率越高，各自允许聚集体在背景信号(例如，由于仪器特异的噪音、非特异信号、非特异结合的探针)前的检测产生越多的数据点。通过该方法，不仅产生读数值(例如这是在ELISA下的情况)，而且存在如此多的读数值，如时间分辨和位置分辨事件(例如，像素)。通过多个不同探针的使用(参见步骤3)，这些信息甚至增加多倍并且对于在那里给探针提供信号的每个点、每个聚集体或每个检测事件可以分开地获得信息。因此对于每个事件，提高了信号的特异性。

1.预处理表面(优选地，玻璃)，从而它拥有尽可能少的非特异结合能力(例如，通过化学修饰共价地盖上一个葡聚糖层或聚乙二醇)。其上结合(优选地，共价地)对于包含AApoAI-的颗粒的捕获分子(例如，抗AApoAI-抗体)。捕获分子可以全部是相同的或是各种不同捕获分子的混合物。

3.将潜在地包含在样品中的AApoAI-颗粒(例如AApoAI-聚集体)用对于其他检测有用的探针(例如，结合荧光染料的抗-AApoAI-抗体)标记。优选的荧光染料尤其也可以包括量子点。优选地，用至少一种其他探针(例如结合荧光染料的抗-AApoAI-抗体)标记包含AApoAI-的颗粒。与不同荧光染料偶联的多个不同探针的使用，一方面提高了末端上获得的相关信号的特异性，另一方面这也使AApoAI-单体的掩蔽成为可能。特别地，如果检测探针之一与捕获分子(来自步骤1)是相同的或两者识别重叠的表位，那么就可以排除AApoAI-单体的检测。为了增加特异性，可以使用淀粉样蛋白特异的染料硫磺素T作为额外的检测探针。

在一个备选方案中，使用抗-载脂蛋白AI抗体克隆12C8、1409和/或G2作为捕获分子和/或探针。在一个备选方案中，使用(AF488-标记的)EPR1368Y作为捕获分子和/或探针。

1.预处理表面(优选地，玻璃)，从而它拥有尽可能少的非特异结合能力(例如，通过化学修饰共价地盖上一个葡聚糖层或聚乙二醇)。其上结合(优选地，共价地)对于包含AApoAII-的颗粒的捕获分子(例如，抗AApoAII-抗体)。捕获分子可以全部是相同的或是各种不同捕获分子的混合物。

3.将潜在地包含在样品中的AApoAII-颗粒(例如AApoAII-聚集体)用对于其他检测有用的探针(例如，结合荧光染料的抗-AApoAII-抗体)标记。优选的荧光染料尤其也可以包括量子点。优选地，用至少一种其他探针(例如结合荧光染料的抗-AApoAII-抗体)标记包含AApoAII-的颗粒。与不同荧光染料偶联的多个不同探针的使用，一方面提高了末端上获得的相关信号的特异性，另一方面这也使AApoAII-单体的掩蔽成为可能。特别地，如果检测探针之一与捕获分子(来自步骤1)是相同的或两者识别重叠的表位，那么就可以排除AApoAII-单体的检测。为了增加特异性，可以使用淀粉样蛋白特异的染料硫磺素T作为额外的检测探针。

在一个备选方案中，使用抗-载脂蛋白AII抗体克隆4F3、EPR2913和/或EP2912作为捕获分子和/或探针。

1.预处理表面(优选地，玻璃)，从而它拥有尽可能少的非特异结合能力(例如，通过化学修饰共价地盖上一个葡聚糖层或聚乙二醇)。其上结合(优选地，共价地)对于包含ATTR-的颗粒的捕获分子(例如，抗ATTR-抗体)。捕获分子可以全部是相同的或是各种不同捕获分子的混合物。

3.将潜在地包含在样品中的ATTR-颗粒(例如ATTR-聚集体)用对于其他检测有用的探针(例如，结合荧光染料的抗-ATTR-抗体)标记。优选的荧光染料尤其也可以包括量子点。优选地，用至少一种其他探针(例如结合荧光染料的抗-ATTR-抗体)标记包含ATTR-的颗粒。与不同荧光染料偶联的多个不同探针的使用，一方面提高了末端上获得的相关信号的特异性，另一方面这也使ATTR-单体的掩蔽成为可能。特别地，如果检测探针之一与捕获分子(来自步骤1)是相同的或两者识别重叠的表位，那么就可以排除ATTR-单体的检测。为了增加特异性，可以使用淀粉样蛋白特异的染料硫磺素T作为额外的检测探针。

在一个备选方案中，使用抗-前白蛋白抗体克隆EP2929Y，EPR3119和/或10E1作为捕获分子和/或探针。

1.预处理表面(优选地，玻璃)，从而它拥有尽可能少的非特异结合能力(例如，通过化学修饰共价地盖上一个葡聚糖层或聚乙二醇)。其上结合(优选地，共价地)对于包含DISC1-的颗粒的捕获分子(例如，抗DISC1-抗体)。捕获分子可以全部是相同的或是各种不同捕获分子的混合物。

3.将潜在地包含在样品中的DISC1-颗粒(例如DISC1-聚集体)用对于其他检测有用的探针(例如，结合荧光染料的抗-DISC1-抗体)标记。优选的荧光染料尤其也可以包括量子点。优选地，用至少一种其他探针(例如结合荧光染料的抗-DISC1-抗体)标记包含DISC1-的颗粒。与不同荧光染料偶联的多个不同探针的使用，一方面提高了末端上获得的相关信号的特异性，另一方面这也使DISC1-单体的掩蔽成为可能。特别地，如果检测探针之一与捕获分子(来自步骤1)是相同的或两者识别重叠的表位，那么就可以排除DISC1-单体的检测。为了增加特异性，可以使用淀粉样蛋白特异的染料硫磺素T作为额外的检测探针。

在一个备选方案中，使用抗-DISC1抗体克隆14F2、2C7和/或FFD5作为捕获分子和/或探针。在一个备选方案中，使用抗-DISC1-AK14F2作为捕获抗体和14F2-AF633作为检测探针。

1.预处理表面(优选地，玻璃)，从而它拥有尽可能少的非特异结合能力(例如，通过化学修饰共价地盖上一个葡聚糖层或聚乙二醇)。其上结合(优选地，共价地)对于包含FUS-的颗粒的捕获分子(例如，抗FUS-抗体)。捕获分子可以全部是相同的或是各种不同捕获分子的混合物。

3.将潜在地包含在样品中的FUS-颗粒(例如FUS-聚集体)用对于其他检测有用的探针(例如，结合荧光染料的抗-FUS-抗体)标记。优选的荧光染料尤其也可以包括量子点。优选地，用至少一种其他探针(例如结合荧光染料的抗-FUS-抗体)标记包含FUS-的颗粒。与不同荧光染料偶联的多个不同探针的使用，一方面提高了末端上获得的相关信号的特异性，另一方面这也使FUS-单体的掩蔽成为可能。特别地，如果检测探针之一与捕获分子(来自步骤1)是相同的或两者识别重叠的表位，那么就可以排除FUS-单体的检测。为了增加特异性，可以使用淀粉样蛋白特异的染料硫磺素T作为额外的检测探针。

在一个备选方案中，使用抗-TLS/FUS抗体克隆EPR5812、EPR5813和/或CL0190作为捕获分子和/或探针。

1.预处理表面(优选地，玻璃)，从而它拥有尽可能少的非特异结合能力(例如，通过化学修饰共价地盖上一个葡聚糖层或聚乙二醇)。其上结合(优选地，共价地)对于包含IAPP-的颗粒的捕获分子(例如，抗IAPP-抗体)。捕获分子可以全部是相同的或是各种不同捕获分子的混合物。

3.将潜在地包含在样品中的IAPP-颗粒(例如IAPP-聚集体)用对于其他检测有用的探针(例如，结合荧光染料的抗-IAPP-抗体)标记。优选的荧光染料尤其也可以包括量子点。优选地，用至少一种其他探针(例如结合荧光染料的抗-IAPP-抗体)标记包含IAPP-的颗粒。与不同荧光染料偶联的多个不同探针的使用，一方面提高了末端上获得的相关信号的特异性，另一方面这也使IAPP-单体的掩蔽成为可能。特别地，如果检测探针之一与捕获分子(来自步骤1)是相同的或两者识别重叠的表位，那么就可以排除IAPP-单体的检测。为了增加特异性，可以使用淀粉样蛋白特异的染料硫磺素T作为额外的检测探针。

在一个备选方案中，使用抗-淀粉不溶素(Amylin)抗体克隆R10/99作为捕获分子和/或探针。

1.预处理表面(优选地，玻璃)，从而它拥有尽可能少的非特异结合能力(例如，通过化学修饰共价地盖上一个葡聚糖层或聚乙二醇)。其上结合(优选地，共价地)对于包含SOD1-的颗粒的捕获分子(例如，抗SOD1-抗体)。捕获分子可以全部是相同的或是各种不同捕获分子的混合物。

3.将潜在地包含在样品中的SOD1-颗粒(例如SOD1-聚集体)用对于其他检测有用的探针(例如，结合荧光染料的抗-SOD1-抗体)标记。优选的荧光染料尤其也可以包括量子点。优选地，用至少一种其他探针(例如结合荧光染料的抗-SOD1-抗体)标记包含SOD1-的颗粒。与不同荧光染料偶联的多个不同探针的使用，一方面提高了末端上获得的相关信号的特异性，另一方面这也使SOD1-单体的掩蔽成为可能。特别地，如果检测探针之一与捕获分子(来自步骤1)是相同的或两者识别重叠的表位，那么就可以排除SOD1-单体的检测。为了增加特异性，可以使用淀粉样蛋白特异的染料硫磺素T作为额外的检测探针。

在一个备选方案中，使用抗-过氧化物歧化酶1抗体克隆2F5、71G8和/或EPR1726作为捕获分子和/或探针。在一个备选方案中，使用(AF488-标记的)：EPR1726作为捕获分子和/或探针。

1.预处理表面(优选地，玻璃)，从而它拥有尽可能少的非特异结合能力(例如，通过化学修饰共价地盖上一个葡聚糖层或聚乙二醇)。其上结合(优选地，共价地)对于包含α-突触核蛋白-的颗粒的捕获分子(例如，抗α-突触核蛋白-抗体)。捕获分子可以全部是相同的或是各种不同捕获分子的混合物。

3.将潜在地包含在样品中的α-突触核蛋白-颗粒(例如α-突触核蛋白聚集体)用对于其他检测有用的探针(例如，结合荧光染料的抗-α-突触核蛋白-抗体)标记。优选的荧光染料尤其也可以包括量子点。优选地，用至少一种其他探针(例如结合荧光染料的抗-α-突触核蛋白-抗体)标记包含α-突触核蛋白-的颗粒。与不同荧光染料偶联的多个不同探针的使用，一方面提高了末端上获得的相关信号的特异性，另一方面这也使α-突触核蛋白-单体的掩蔽成为可能。特别地，如果检测探针之一与捕获分子(来自步骤1)是相同的或两者识别重叠的表位，那么就可以排除α-突触核蛋白-单体的检测。为了增加特异性，可以使用淀粉样蛋白特异的染料硫磺素T作为额外的检测探针。

在一个备选方案中，使用抗-α-突触核蛋白抗体克隆2B2A11、3H2897和/或211作为捕获分子和/或探针。在一个备选方案中，使用α-Syn-AB2B2A11作为捕获抗体和作为检测探针，使用经荧光标记的抗-α-突触核蛋白抗体3H2897-AF633或211-AF488。

1.预处理表面(优选地，玻璃)，从而它拥有尽可能少的非特异结合能力(例如，通过化学修饰共价地盖上一个葡聚糖层或聚乙二醇)。其上结合(优选地，共价地)对于包含Tau-的颗粒的捕获分子(例如，抗Tau-抗体)。捕获分子可以全部是相同的或是各种不同捕获分子的混合物。

3.将潜在地包含在样品中的Tau-颗粒(例如Tau-聚集体)用对于其他检测有用的探针(例如，结合荧光染料的抗-Tau-抗体)标记。优选的荧光染料尤其也可以包括量子点。优选地，用至少一种其他探针(例如结合荧光染料的抗-Tau-抗体)标记包含Tau-的颗粒。与不同荧光染料偶联的多个不同探针的使用，一方面提高了末端上获得的相关信号的特异性，另一方面这也使Tau-单体的掩蔽成为可能。特别地，如果检测探针之一与捕获分子(来自步骤1)是相同的或两者识别重叠的表位，那么就可以排除Tau-单体的检测。为了增加特异性，可以使用淀粉样蛋白特异的染料硫磺素T作为额外的检测探针。

在一个备选方案中，使用抗-Tau抗体克隆E178、Tau46和/或Tau5作为捕获分子和/或探针。在一个备选方案中，使用抗-Tau6E10/Atto488和/或Nab228作为捕获分子和/或探针。

1.预处理表面(优选地，玻璃)，从而它拥有尽可能少的非特异结合能力(例如，通过化学修饰共价地盖上一个葡聚糖层或聚乙二醇)。其上结合(优选地，共价地)对于包含-TDP-43-的颗粒的捕获分子(例如，抗-TDP-43-抗体)。捕获分子可以全部是相同的或是各种不同捕获分子的混合物。

3.将潜在地包含在样品中的-TDP-43-颗粒(例如-TDP-43-聚集体)用对于其他检测有用的探针(例如，结合荧光染料的抗-TDP-43-抗体)标记。优选的荧光染料尤其也可以包括量子点。优选地，用至少一种其他探针(例如结合荧光染料的抗-TDP-43-抗体)标记包含-TDP-43-的颗粒。与不同荧光染料偶联的多个不同探针的使用，一方面提高了末端上获得的相关信号的特异性，另一方面这也使-TDP-43-单体的掩蔽成为可能。特别地，如果检测探针之一与捕获分子(来自步骤1)是相同的或两者识别重叠的表位，那么就可以排除-TDP-43-单体的检测。为了增加特异性，可以使用淀粉样蛋白特异的染料硫磺素T作为额外的检测探针。

在一个备选方案中，使用抗-TARDBP抗体克隆EPR5810、3H8和/或K1B8作为捕获分子和/或探针。在一个备选方案中，(AF488-标记的)：EPR5810作为捕获分子和/或探针。

1.预处理表面(优选地，玻璃)，从而它拥有尽可能少的非特异结合能力(例如，通过化学修饰共价地盖上一个葡聚糖层或聚乙二醇)。其上结合(优选地，共价地)对于包含亨廷顿蛋白-的颗粒的捕获分子(例如，抗亨廷顿蛋白-抗体)。捕获分子可以全部是相同的或是各种不同捕获分子的混合物。

3.将潜在地包含在样品中的亨廷顿蛋白颗粒(例如亨廷顿蛋白聚集体)用对于其他检测有用的探针(例如，结合荧光染料的抗-亨廷顿蛋白抗体)标记。优选的荧光染料尤其也可以包括量子点。优选地，用至少一种其他探针(例如结合荧光染料的抗-亨廷顿蛋白抗体)标记包含亨廷顿蛋白-的颗粒。与不同荧光染料偶联的多个不同探针的使用，一方面提高了末端上获得的相关信号的特异性，另一方面这也使亨廷顿蛋白蛋白单体的掩蔽成为可能。特别地，如果检测探针之一与捕获分子(来自步骤1)是相同的或两者识别重叠的表位，那么就可以排除亨廷顿蛋白单体的检测。为了增加特异性，可以使用淀粉样蛋白特异的染料硫磺素T作为额外的检测探针。

在一个备选方案中，使用抗亨廷顿蛋白抗体克隆EP867Y、D7F7和/或HIP-1作为捕获分子和/或探针。

1.预处理表面(优选地，玻璃)，从而它拥有尽可能少的非特异结合能力(例如，通过化学修饰共价地盖上一个葡聚糖层或聚乙二醇)。其上结合(优选地，共价地)对于包含-ALys-的颗粒的捕获分子(例如，抗-ALys-抗体)。捕获分子可以全部是相同的或是各种不同捕获分子的混合物。

3.将潜在地包含在样品中的-ALys-颗粒(例如-ALys-聚集体)用对于其他检测有用的探针(例如，结合荧光染料的抗-ALys-抗体)标记。优选的荧光染料尤其也可以包括量子点。优选地，用至少一种其他探针(例如结合荧光染料的抗-ALys-抗体)标记包含-ALys-的颗粒。与不同荧光染料偶联的多个不同探针的使用，一方面提高了末端上获得的相关信号的特异性，另一方面这也使-ALys-单体的掩蔽成为可能。特别地，如果检测探针之一与捕获分子(来自步骤1)是相同的或两者识别重叠的表位，那么就可以排除-ALys-单体的检测。为了增加特异性，可以使用淀粉样蛋白特异的染料硫磺素T作为额外的检测探针。

在一个备选方案中，使用抗溶酶菌抗体克隆BGN/06/961和/或BGN/0696/2B10作为捕获分子和/或探针。在一个备选方案中，使用(AF488-标记的)：EPR2994作为捕获分子和/或探针。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征体液中作为对于AA-淀粉样变性的生物标记的血清-淀粉样蛋白-A-蛋白聚集体类型的聚集体的方法。在一个实施方案中，此外就选自由下列组成的组的其他聚集体类型进行研究：IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、ΙΑΡΡ-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征血清-淀粉样蛋白-A-蛋白聚集体类型与一个或多个选自由下列组成的组的蛋白质的混合聚集体的方法：体液中作为对于AA-淀粉样变性的生物标记的IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、ΙΑΡΡ-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征体液中作为对于AL-淀粉样变性的生物标记的IgG轻链聚集体类型的聚集体的方法。在一个实施方案中，此外就选自由下列组成的组的其他聚集体类型进行研究：血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、ΙΑΡΡ-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征IgG轻链聚集体类型与一个或多个选自由下列组成的组的蛋白质的混合聚集体的方法：体液中作为对于AL-淀粉样变性的生物标记的血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、ΙΑΡΡ-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征体液中作为对于AApoAI-淀粉样变性的生物标记的AApoAI聚集体类型的聚集体的方法。在一个实施方案中，此外就选自由下列组成的组的其他聚集体类型进行研究：血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、ΙΑΡΡ-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征AApoAI聚集体类型与一个或多个选自由下列组成的组的蛋白质的混合聚集体的方法：体液中作为对于AApoAI-淀粉样变性的生物标记的血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、ΙΑΡΡ-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征体液中作为对于AApoAII-淀粉样变性的生物标记的AApoAII聚集体类型的聚集体的方法。在一个实施方案中，此外就选自由下列组成的组的其他聚集体类型进行研究：血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、ΙΑΡΡ-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征AApoAII聚集体类型与一个或多个选自由下列组成的组的蛋白质的混合聚集体的方法：体液中作为对于AApoAII-淀粉样变性的生物标记的血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、ΙΑΡΡ-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征体液中作为对于ATTR-淀粉样变性的生物标记的ATTR聚集体类型的聚集体的方法。在一个实施方案中，此外就选自由下列组成的组的其他聚集体类型进行研究：血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、ΙΑΡΡ-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征ATTR聚集体类型与一个或多个选自由下列组成的组的蛋白质的混合聚集体的方法：体液中作为对于ATTR-淀粉样变性的生物标记的血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、ΙΑΡΡ-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征体液中作为对于DISC1-淀粉样变性的生物标记的DISC1聚集体类型的聚集体的方法。在一个实施方案中，此外就选自由下列组成的组的其他聚集体类型进行研究：血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、FUS-聚集体、ΙΑΡΡ-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体，优选地FUS-聚集体、SOD1-聚集体和/或TDP-43-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征DISC1聚集体类型与一个或多个选自由下列组成的组的蛋白质的混合聚集体的方法：体液中作为对于精神分裂症和其他DISC1-蛋白病变的生物标记的血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、FUS-聚集体、ΙΑΡΡ-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征体液中作为对于肌萎缩侧索硬化、额颞叶变性和其他FUS-蛋白病变的生物标记的FUS-聚集体类型的聚集体的方法。在一个实施方案中，此外就选自由下列组成的组的其他聚集体类型进行研究：血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、ΙΑΡΡ-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体，优选地DISC1-聚集体、SOD1-聚集体和/或TDP-43-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征FUS聚集体类型与一个或多个选自由下列组成的组的蛋白质的混合聚集体的方法：体液中作为对于肌萎缩侧索硬化、额颞叶变性和其他FUS-蛋白病变的生物标记的血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、ΙΑΡΡ-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征体液中作为对于2型糖尿病的生物标记的IAPP-聚集体类型的聚集体的方法。在一个实施方案中，此外就选自由下列组成的组的其他聚集体类型进行研究：血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征IAPP聚集体类型与一个或多个选自由下列组成的组的蛋白质的混合聚集体的方法：体液中作为对于2型糖尿病的生物标记的血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征体液中作为对于肌萎缩侧索硬化的生物标记的SOD1-聚集体类型的聚集体的方法。在一个实施方案中，此外就选自由下列组成的组的其他聚集体类型进行研究：血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、IAPP-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体，优选地DISC1-聚集体、FUS-聚集体和/或TDP-43-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征SOD1聚集体类型与一个或多个选自由下列组成的组的蛋白质的混合聚集体的方法：体液中作为对于肌萎缩侧索硬化的生物标记的血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、IAPP-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征体液中作为对于帕金森病和其他突触核蛋白病变的生物标记的α-突触核蛋白聚集体类型的聚集体的方法。在一个实施方案中，此外就选自由下列组成的组的其他聚集体类型进行研究：血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、IAPP-聚集体、SOD1-聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征α-突触核蛋白聚集体类型与一个或多个选自由下列组成的组的蛋白质的混合聚集体的方法：体液中作为对于帕金森病和其他突触核蛋白病变的生物标记的血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、IAPP-聚集体、SOD1-聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征体液中作为对于Tau病变的生物标记的Tau-聚集体类型的聚集体的方法。在一个实施方案中，此外就选自由下列组成的组的其他聚集体类型进行研究：血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、IAPP-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体，优选地Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征Tau-聚集体类型与一个或多个选自由下列组成的组的蛋白质的混合聚集体的方法：体液中作为对于Tau病变的生物标记的血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、IAPP-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征体液中作为对于肌萎缩侧索硬化、额颞叶变性、慢性创伤性脑病变和其他TDP-43蛋白病变的生物标记的TDP-43-聚集体类型的聚集体的方法。在一个实施方案中，此外就选自由下列组成的组的其他聚集体类型进行研究：血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、IAPP-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体，优选地DISC1-聚集体、FUS-聚集体和/或SOD1-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征TDP-43-聚集体类型与一个或多个选自由下列组成的组的蛋白质的混合聚集体的方法：体液中作为对于TDP-43蛋白病变的生物标记的血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、IAPP-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征体液中作为对于亨廷顿病的生物标记的亨廷顿蛋白聚集体类型的聚集体的方法。在一个实施方案中，此外就选自由下列组成的组的其他聚集体类型进行研究：血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、IAPP-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征亨廷顿蛋白聚集体类型与一个或多个选自由下列组成的组的蛋白质的混合聚集体的方法：体液中作为对于亨廷顿病的生物标记的血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、IAPP-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征体液中作为对于家族内脏性淀粉样变性的生物标记的溶菌酶聚集体类型的聚集体的方法。在一个实施方案中，此外就选自由下列组成的组的其他聚集体类型进行研究：血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、IAPP-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征溶菌酶聚集体类型与一个或多个选自由下列组成的组的蛋白质的混合聚集体的方法：体液中作为对于家族内脏性淀粉样变性的生物标记的血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、IAPP-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体和Aβ-聚集体。

在一个实施方案中，本发明的目标是用于选择性地定量和/或表征体液中作为对于阿尔茨海默病的生物标记的Aβ-聚集体类型的聚集体和至少一个其他聚集体类型，优选地Tau-聚集体类型的方法。在一个实施方案中，此外就选自由下列组成的组的其他聚集体类型进行研究：血清-淀粉样蛋白-A-蛋白-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、IAPP-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体和溶菌酶聚集体。

用于选择地定量和/或表征包含聚合物的疾病指示物的标准物也是本发明的目标，所述聚合物由关于其序列与内生蛋白质的分区是相同的或在相应分区内具有至少50％的同源性的单体序列构成，其中这些聚合物不聚集而内生蛋白质是聚集的那些。

在本发明范围内的标准物是指一般地有效的和可接受的、固定的参考值，其用于特性和/或量的比较和测定，特别是用于由内生(错误折叠的)蛋白质形成的(致病)聚集体的大小和量的测定。可以使用本发明范围内的标准物以校准仪器和/或测量。

对于根据本发明的标准物基本的是，标准物不聚集，优选地通过使用不聚集的单体序列，因为内生蛋白质的相应分区不对聚集负责，或其由于对聚集负责的基团的封阻而不聚集。

在该意义下，在此术语“单体序列”描述分区，形成错误折叠蛋白质的聚集体的单一蛋白质(单体)的片段。

在一个实施方案中，所述分区为一个表位或与其具有至少50％同一性和表位的生物学活性的同源物，优选地包含在SEQIDNO：1-15之一中的表位。

经如此选择的单体序列以所希望的数目嵌入根据本发明的标准物的结构中和/或根据本发明相互连接。

根据本发明的标准物为由上面所描述的单体序列，优选地表位组成的聚合物，需要时包含其他成分。

在本发明的另一个实施方案中，上面所描述的单体序列，优选地表位，和/或其具有相应表位的生物学活性的同源物，提供关于标准物的其余单体类型的每一个的数目和/或关于所有其他单体的数目而言相同的或最大的单体数目。

根据本发明的标准物分子为由上面所定义的单体序列组成的聚合物。本发明范围内的寡聚物为由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个单体或其多倍，优选地2-16、4-16、8-16，优选地8或16或其多倍形成的聚合物。

在本发明的一个备选方案中，所述标准物是水溶性的。

在本发明的一个备选方案中，根据本发明的标准物由相同的单体序列构成。

在本发明的一个备选方案中，根据本发明的标准物由不同的单体序列构成。

在本发明的一个备选方案中，这样的上面定义的单体序列以线性构象相互排列。

在本发明的一个备选方案中，这样的上面定义的单体序列与支化的、根据本发明的寡聚物相互排列。

在本发明的一个备选方案中，这样的上面定义的单体序列交联的、根据本发明的的寡聚物相互排列。

支化的或交联的根据本发明的寡聚物可以通过单个构件借助于赖氨酸或借助于点击化学的连接来制备。

如上面所描述的，根据本发明的标准物，即根据本发明的寡聚物或聚合物，除了以精确确定的数目存在的单体序列，优选地表位外，还包含额外的氨基酸、间隔子和/或官能团，通过其单体序列，优选地表位，共价地相互连接。

在一个备选方案中，排除单体序列，优选地表位与半胱氨酸，特别地借助于通过半胱氨酸的二硫桥的直接连接(以避免还原剂解开桥接)。同样，在另一个变化形式中，排除间隔子一方面与单体序列和另一方面与半胱氨酸的直接连接。

通过官能团的表位的复制可以在单个构件的合成之前或之后进行。对于根据本发明的标准物特征性的是，单体序列的共价连接。

根据本发明使用的单体序列可以与蛋白质的序列相同或显示与形成聚集体的全长蛋白质之一的序列50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％的同源性。

备选地，也使用单体序列以构成根据本发明的标准物分子，其与全长蛋白质的一个分区是相同的或显示与全长蛋白质的一个分区50、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％的同源性。

对根据本发明使用的序列基本的是其不(或仅根据条件受控地)聚集的特性和/或其作为表位的活性。

在一个备选方案中，标准物有利地具有比致病聚集体或内生蛋白质形成的寡聚体较高的水溶性。

在本发明的一个实施方案中，所述标准物具有精确确定数目的表位，其共价地相互连接(直接或通过氨基酸、间隔子和/或官能团)以为了相应结合伙伴的结合。

在该意义下，关于标准物，所述结合伙伴选自由下列组成的组：抗体、纳米抗体和亲和体(Affibody)。结合伙伴此外是所有这样的分子，其具有对于待测定的聚集体而言足够的亲和特异性，例如染料(硫磺素T、刚果红等)。

根据本发明的标准物分子可以包含对于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个各种不同的结合伙伴的表位。

可以借此将对各种不同的结合伙伴特征性的表位嵌入在根据本发明的标准物中，即使用这样的单体序列，其与一个或不同蛋白质(其形成错误蛋白质的聚集体)的不同区域是相同的或具有与其至少50％的同源性，但拥有相应表位的活性。

在本发明的一个实施方案中，所述标准物分子包含所谓的间隔子。

“间隔子”，理解为这样的分子，其通过共价键被嵌入标准物分子中并且拥有一定的物理和/或化学特性，通过其标准物分子的特性被改变。在根据本发明的标准物的一个实施方案中，使用亲水性或疏水性，优选地亲水性间隔子。亲水性间隔子选自由聚乙二醇、糖、甘油、多聚-L-赖氨酸或β-丙氨酸形成的分子的组。

在本发明的一个备选方案中，根据本发明的标准物包含(其他)官能团。

“官能团”，理解为这样的分子，其与标准物分子共价结合。在一个变化形式中，所述官能团包含生物素基团。由此使得与链霉抗生物素蛋白的强共价结合成为可能。包含生物素基团的标准分子可以因此与包含链霉抗生物素蛋白基团的分子相结合。如果根据本发明的标准物分子包含生物素和/或链霉抗生物素蛋白基团，那么可以因此组装更大的标准物或更多的，需要时不同的标准物分子与骨架相结合。

在本发明的另一个备选方案中，所述标准物分子包含用于分光光度法测定的染料和/或芳香氨基酸。芳香氨基酸为例如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或组氨酸，或选自该组。通过色氨酸的嵌入，使溶液中标准物浓度的测定成为可能。

在本发明的另一个实施方案中，标准物作为树状聚合物(Dendrimere)构成。根据本发明的树状聚合物由上面所描述的根据本发明的待使用的单体序列构成并且可以包含中心骨架分子。优选地，所述骨架分子为链霉抗生物素蛋白单体，特别优选地为聚合物，特别地，四聚体。

在一个变化形式中，根据本发明的四聚体包含具有这样的序列的单体序列，其与蛋白质的分区是相同的，或显示与相应分区至少50％的同源性。

根据本发明，术语“至少50％的同源性”也理解为选自由50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％组成的组的较高同源性。

本发明的其他目标是包含这样的多肽的树状聚合物，其关于其序列在相应分区与内生蛋白质是相同的或在相应分区内与内生蛋白质具有至少50％的同源性。

根据本发明的树状聚合物可以包含上面描述的标准物特征中的每一个或其任一种组合。

在本发明的一个备选方案中，所述树状聚合物是：

·包含用于结合伙伴的共价结合的精确确定数目的表位的树状聚合物，

·包含一个或多个蛋白质的表位的树状聚合物，所述蛋白质形成错误折叠蛋白质的聚集体，优选地为根据SEQIDNO：1-15，

·树状聚合物，其特征在于，它具有比由内生蛋白质组成的致病聚集体高的水溶性的，

·包含官能团的树状聚合物，

·包含至少一个间隔子分子的树状聚合物，和/或

·包含用于分光光度法确定的染料和/或芳香氨基酸的树状聚合物。

根据本发明，所述树状聚合物具有径向对称性。

在一个变化形式中，第一代树状聚合物的支化通过赖氨酸，特别是三个赖氨酸氨基酸来实现。

在本发明的另一个备选方案中，在标准物，特别是树状聚合物中，多肽序列，优选地表位，不通过与硫原子的结合，不通过硫醚键和/或不通过半胱氨酸(需要时借助于通过半胱氨酸的二硫桥)相互或与标准物的其他成分例如氨基酸、间隔子和/或官能团和/或其他上面所描述的成分相连接，特别是共价连接。同样地，在另一个变化形式中，多肽序列，优选地表位，和与其连接的间隔子在间隔子不通过与硫原子的结合，不通过硫醚键和/或不通过半胱氨酸(需要是借助于通过半胱氨酸的二硫桥)相互或与标准物的其他成分例如氨基酸、其他间隔子和/或官能团和/或其他上面所描述的成分相连接，特别是共价地连接。

本发明还涉及用于制备上面描述的标准物的方法。

在一个实施方案中，根据本发明的标准物借助于专业人员已知的肽合成或重组方法制备。

本发明的另一个目标是上面描述的标准物或上面描述的树状聚合物用于定量由内生蛋白质形成的致病聚集体或寡聚体的用途。

根据本发明，在用于定量由内生蛋白质形成的致病聚集体或寡聚体的方法中使用根据本发明的标准物。

在本发明的一个实施方案中，使用根据本发明的标准物以为了在表面-FIDA-方法(sFIDA)、Elisa(夹心-Elisa)或FACS的情况下进行校准。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含根据本发明的标准物的试剂盒。可以将本发明的试剂盒的化合物和/或组分包装在容器中，需要是具有/在缓冲液和/或溶液中。备选地，可以在相同的容器中包装几个成分。此外为此或备选地为此可以将一个或多个组分吸附在固体载体，例如玻璃板、芯片或尼龙膜上或在微量滴定板的凹口上。

这样的试剂盒可以包含一个或多个下列组分：

-玻璃基底，其涂覆有疏水性物质，优选地葡聚糖，优选地羧甲基葡聚糖或聚乙二醇，优选地双功能聚乙二醇(NHS-PEG-COOH)；

-标准物；

-捕获分子；

-探针；

-具有捕获分子的基底。

进一步，试剂盒可以包含适合于任意一个实施方案的试剂盒使用说明书。

在本发明的一个备选方案中，使用标准物以定量由内生蛋白质形成的致病聚集体或寡聚体，通过：

在第一个步骤中，用结合伙伴标记标准物或树状聚合物并测定与标准物或树状聚合物结合的结合伙伴的数目。

在第二个步骤中，用探针标记由内生蛋白质形成的致病聚集体或寡聚体，并测定与每个致病聚集体或寡聚体结合的探针的数目，

在第三个步骤中，比较来自步骤1的与每个标准物或树状聚合物结合的结合伙伴的数目和来自步骤2的与聚集体结合的探针的数目，和

在第四个步骤中由此测定来自体液的寡聚物的数目和大小。

在本发明的一个变化形式中，使用根据本发明的标准物，优选地树状聚合物以为了表面-FIDA-方法的校准。在第一个步骤中，将来自体液的内生致病聚集体固定化在玻璃表面上。在固定化后，通过两个不同的探针标记聚集体。将检测探针用优选地不同的荧光染料标记。借此它在显微镜例如激光扫描显微镜下是可见的。

也可以将根据本发明的标准物或其部分作为捕获分子和/或探针使用。因此，包含根据本发明的标准物的捕获分子和/或探针也是本发明的目标。

包含具有对于疾病指示物和/或聚集体的捕获分子的精确确定区域的基底是本发明的目标。

在用于诊断选自由下列组成的组的疾病的方法中使用该基底：

阿尔茨海默病、AA-淀粉样变性、AL-淀粉样变性、AApoAI-淀粉样变性、AApoAII-淀粉样变性、ATTR-淀粉样变性、精神分裂症和其他DISC1病变、肌萎缩侧索硬化、额颞叶变性和其他FUS-蛋白病变、2型糖尿病、帕金森病和其他突触核蛋白病变、Tau病变、慢性创伤性脑病变和其他TDP-43-蛋白病变、亨廷顿病、家族性内脏淀粉样变性和/或阿尔茨海默病。

取样后的所有方法步骤都是离体的(体外的)，即在人或动物身体外进行。

样品可以从人或动物抽取。内生错误折叠蛋白质的聚集体类型在下列疾病的情况下发现并可以作为生物标记或生物标记的一部分使用：表A，1-15行

表A

在本发明的一个实施方案中，使用表A的生物标记也作为对于表A的其他疾病的疾病指示物，如在表中生物标记的同一行中所说明的。

例如，Tau聚集体也可以用作对于阿尔茨海默病的生物标记或如在表中所指示的，DISC1-聚集体、FUS-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体或TDP-43-聚集体对于多种疾病。

例如，混合聚集体，例如由Tau和α-突触核蛋白组成的，也可以用作对于例如帕金森病的生物标记。也可以使用所有其他的混合聚集体作为生物标记。

因此，不仅疾病的联合诊断是可能的，而且也能够从这些结果也排除其他疾病。由此同样使准确的诊断成为可能。

本发明的目标是用于确定具有错误折叠蛋白质的聚集体的疾病的差异诊断，其包括下列步骤：

i)以包含下列的方法测量样品中错误折叠蛋白质的量：

a)从人或动物身体抽取样品，需要时进行预处理并在基底上涂抹待研究的样品，

b)添加为检测而标记的探针，其通过与各自聚集体的特异结合标记后者，和

c)检测经标记的聚集体，

其中步骤b)可以在步骤a)之前进行并且，所述疾病选自由下列组成的组：

AA-淀粉样变性、AL-淀粉样变性、AApoAI-淀粉样变性、AApoAII-淀粉样变性、ATTR-淀粉样变性、精神分裂症和其他DISC1病变、肌萎缩侧索硬化、额颞叶变性和其他FUS-蛋白病变、2型糖尿病、帕金森病和其他突触核蛋白病变、Tau病变、慢性创伤性脑病变和其他TDP-43-蛋白病变、亨廷顿病、家族性内脏淀粉样变性和/或阿尔茨海默病；

ii)将这些数据与正常值进行比较；

iii)查明在该比较中显著较高的蛋白质聚集体量；

iv)根据疾病指示物，将偏差归因于病象。

在根据本发明的基底上，在至少两个精确确定的区域中使特异的捕获分子固定化，其与不同的内生蛋白质聚集体结合。在一个备选方案中，使3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多个不同的特异捕获分子在基底的精确确定的区域上固定化。根据聚集体的结合和随后的检测，然后差异诊断是可能的。

在一个备选方案中，将每孔16或更多个不同的捕获分子施加(点样)在确定的子区域上。因此可以在唯一的样品中鉴定各种不同的聚集体类型甚至由各种不同单体组成的异源聚集体。因此小量体液就足够了。此外，栅格位置因此就可以用于聚集体的鉴定。

在一个备选方案中，可以在唯一的基底(孔)中固定化各种不同捕获分子的混合物，或通过“点样”方法在唯一表面内的各种不同位置上，例如微量滴定板-孔的底部施加不同的捕获分子(例如，抗体)，其例如特异地结合一个或多个探针或特异地结合一个或多个聚集体的蛋白质。通过使用各种不同的各自携带另一荧光团的探针，可以因此几乎同时地在唯一样品等份中分析各种不同的聚集体种类。

也可以因此鉴定由各种不同的蛋白质单体组成的聚集体混合形式。

因此不仅疾病的联合诊断是可能的，而且从这些结果也能够排除其他的疾病。由此同样使得精确的诊断成为可能。

根据本发明的方法的优点是这样的可能性，借助于唯一的患者样品，其包含许多伴随蛋白质聚集体的实体，就基于内生错误折叠蛋白质的所有可能的聚集体类型进行研究。其他优点是这样的可能性，直接地、离体地在样品，例如血液和脑脊液或尿、唾液、粘膜、活组织检查材料，特别是血液和脑脊液样品中直接研究蛋白质聚集体。

通过根据本发明的方法，可以定性和/或定量地测定新的疾病指示物。本发明的目标因此也是这样的疾病指示物，生物标记，其特征在于根据本发明研究的内生错误折叠蛋白质聚集体类型的存在和需要时，至少一种其他聚集体类型的存在和/或缺乏。

通过根据本发明的方法和新的生物标记，可以鉴定基于错误折叠蛋白质聚集体(如上面所提到的)的疾病并与其他组的疾病，需要时具有类似或相符的症状的，明确地区分开来。

本发明的目标因此还是用根据本发明的方法确定的生物标记，通过至少一种内生错误折叠蛋白质的聚集体类型的存在，所述聚集体类型选自由血清-淀粉样蛋白-A-聚集体、IgG轻链聚集体、AApoAI-聚集体、AApoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、IAPP-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、Tau-聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体或其聚集体混合形式，和可能地通过至少另一种上面提到的聚集体类型或聚集体混合形式的存在和/或缺乏。

还可以使用根据本发明的方法以确定蛋白质聚集体的浓度阈值，所述蛋白质聚集体对于病象或疾病的诊断是重要的。

本发明的目标是用于差异诊断的试剂盒，其包含一个或多个下列组分：

-如上面描述的基底，

-如上面描述的标准物，

-探针，

-溶液，

-缓冲液，

其中所述疾病选自AA-淀粉样变性、AL-淀粉样变性、AApoAI-淀粉样变性、AApoAII-淀粉样变性、ATTR-淀粉样变性、精神分裂症和其他DISC1病变、肌萎缩侧索硬化、额颞叶变性和其他FUS-蛋白病变、2型糖尿病、帕金森病和其他突触核蛋白病变、Tau病变、慢性创伤性脑病变和其他TDP-43-蛋白病变、亨廷顿病、家族性内脏淀粉样变性和/或阿尔茨海默病。

本发明的其他目标是根据本发明的方法用于上面提到的疾病的诊断、早诊断和/或预后的用途。

本发明的其他目标是根据本发明的方法用于监视上面提到的疾病的治疗以及用于监视和/或检查活性物质和/或疗法的效果的用途。这可以在临床试验、研究以及在治疗监测的情况下使用。为此，测量根据本发明的方法并比较结果。

本发明的其他目标是根据本发明的方法和生物标记用于决定一个人是否被接纳入临床研究的用途。为此，根据本发明的方法测量样品并基于边界值做出决定。

本发明的其他目标是用于借助于根据本发明的方法确定活性物质和/或疗法的效果的方法，其中相互比较样品的结果。样品是在活性物质施用或疗法进行之前或之后，或在活性物质施用或疗法的不同时间点抽取的体液。按照结果，选择通过其实现聚集体的减少的活性物质和/或疗法。根据本发明，将结果与未经历活性物质和/或疗法的对照进行比较。

实施例

1.材料与方法

作为样品载体，在试验中使用具有170μm厚的玻璃底的多孔板(SensoPlatePlus384GreinerBioOne，Kremsmünster，)。所有待使用的试剂和溶液以最高的纯度购进并在使用前无颗粒地灭菌。

在第一个步骤中，用100μl氢氧化钠溶液(5M)填充每个样品室(孔)，在室温下孵育15分钟，用水冲洗三次，掺入100μl盐酸并在室温下再次孵育15分钟。在三次用水洗涤和两次用乙醇洗涤后，将孔在氮气气氛下干燥。

为了在玻璃表面上产生氨基基团，在每个孔中提供各自20μl乙胺(5.6M)并在室温下孵育过夜。将孔用DMSO冲洗三次，用乙醇冲洗两次并在氮气气氛下干燥。

将异双官能团聚乙二醇(NHS-PEG-COOH,MW3400Da)于70℃在DMSO中溶解1分钟至50mM，冷却至室温并用2％三乙胺调节。从该溶液，提供各自15μl于孔中并在室温下孵育至少一小时。从孔中除去溶液并将孔用水洗涤三次。

为了活化PEG-层，将NHS和EDC(碳二亚胺)在MES-缓冲液(0.1M，pH5，MES：2-N-吗啉乙磺酸)中溶解至各自100mM并以1:1比例混合至各自50mM的最终浓度。将每30μl该溶液填充于孔中并孵育30-60分钟。在除去溶液后，将孔用MES-缓冲液(0.1M，pH5)洗涤三次。

将捕获抗体在PBS中稀释至30ng/μl。从其提供15μl于孔中并在室温下孵育1-3小时。随后除去溶液并用PBST(PBS，具有Tween20)洗涤三次，然后用PBS洗涤三次。

首先将3％BSA在100000g(1小时，在4℃下)下离心。将每50μl上清液填入孔中并在室温下孵育一小时。除去BSA溶液并用PBST洗涤三次。

将样品(例如，由重组蛋白质和天然患者样品形成的聚集体)-如果需要–稀释在PBS中并从中提供各自15μl于孔中。将多孔板在1000g下在4℃下在甩开转子中离心一小时。除去上清液并用PBST洗涤三次和用PBS洗涤三次。

作为检测探针，使用荧光标记的抗体。将其在PBS中稀释至1-2ng/μl并掺入1.5％BSA。将批料在100000g下于4℃离心一小时。将每15μl上清液填入孔中并在室温下孵育1-2小时。随后除去溶液并用PBST洗涤五次和用PBS洗涤五次。

使表面荧光借助于全内反射荧光显微镜(TIRFM)可视化。备选地，可以用共聚焦激光扫描使蛋白质颗粒在玻璃表面层上可见。每个孔用高敏感CCD-照相机拍摄直至50个单个图像(1000x1000像素，114nm/像素)/荧光通道。

图像数据中的背景信号通过强度阈值清除。查明具有阈值以上灰度值的平均像素数(sFIDA-读数值)。如果使用多个检测探针，那么仅评价在所有荧光通道中共定位的事件。

2.sFIDA实验方案

2.1.预处理

·15分钟NaOH(5M)100μl/孔

·3xH₂O

·15分钟HCl(1M)100μl/孔

·3xH₂O

·2xEtOH冲洗

·用N₂干燥

2.2.玻璃活化(氨基基团)

·20μl/孔乙胺(5.6M)→孵育ON(过夜)，室温或更长，4℃

_____________________________________________________

·3xDMSO

·2xEtOH

·用N₂干燥

2.3.间隔子NHS-PEG-COOH

·在70℃下将17mgPEG(迅速地)溶解在100μlDMSO，让其冷却，+2μl三乙胺(TEA)

·15μl/孔→孵育：至少1小时

·3xH₂O

2.4.用NHS/EDC(50mM)的PEG活化

·将5.8mgNHS和9.6mgEDC稀释在500μlMES(0.1M)中，在涂抹前直接进行1：1混合

·30μl/孔→孵育：30分钟–最大1h

·迅速地3xMES(0.1M)

2.5捕获

·将抗体稀释在PBS中(30ng/μl)

·15μl/孔→孵育1-3小时，室温或更长，4℃

·3xPBST，3xPBS

2.6.封闭

·3％BSA1小时在100000xg下，4℃(转子TLA-45)

·50μl/孔→孵育1小时

·3xPBST

·3xPBS

第2天

___________________________________________________________________________________________________________________________

2.7.靶标

·15μl靶标，稀释在PBS中

·孵育1小时，离心，1000g，25℃，

·HH：3x0.2％SDS/PBS；5xPBST；5xPBS

·血浆和重组聚集体：3xPBST；3xPBS

2.8.检测抗体

·1-2ng/μl在1.5％BSA中,用PBS，按照100000xg，4℃(转子TLA-45)后

·每15μl上清液/孔→孵育>＝1-2h，RT

·5xPBST

·5xPBS

(对于洗涤步骤，使用各自100μl的相应溶液)

3.用由重组蛋白质形成的聚集体的应用

首先证明用于检测各种不同的聚集体种类的sFIDA-试验的基本可行性。示例性地，制备各种不同的蛋白质(AApoAI、AL、SOD1、ALys、AA、TDP-43)的聚集体，并在sFIDA-试验研究相应的稀释系列。在这种情况下，作为捕捉和检测抗体，总是使用针对各自蛋白质的抗体。将检测探针各自用Alexafluor488标记。所有聚集体可以浓度依赖地直至在皮摩尔范围内借助于sFIDA进行检测。

图1A-F：各种不同蛋白质的聚集体的sFIDA。将蛋白质聚集体以所说明的浓度稀释在PBS-缓冲液中并在sFIDA-试验中分析。作为阴性对照，使用PBS-缓冲液。A)ApoAI，捕获探针和检测探针(经AF488-标记的)：EPR1368Y；B)AL，捕获探针和检测探针(AF488-标记的)：EPR5367；C)SOD1，捕获探针和检测探针(AF488-标记的)：EPR1726；D)ALys，捕获探针和检测探针(AF488-标记的)：EPR2994(2)；E)AA，捕获探针和检测探针(AF488-标记的)：EPR4134；F)TDP-43，捕获探针和检测探针(AF488-标记的)：EPR5810。

4.天然样品的应用

为了示例性地证明血液和脑脊液样品(CSF-样品)或尿、唾液、粘膜、活组织检查材料中的蛋白质聚集体可以被检测，稀释CSF中的蛋白质聚集体(α-突触核蛋白和DISC1)并用sFIDA进行分析。对于α-突触核蛋白的检测，作为捕获抗体，使用抗α-Syn-AB2B2A11和作为检测探针，使用荧光标记的抗α-Syn-ABs3H2897-AF633或211-AF488。为了DISC1-聚集体的检测，使用抗-DISC1-AK14F2作为捕获抗体和14F2-AF633作为检测探针。不仅突触核蛋白而且DISC1-聚集体能够浓度依赖地直至在皮摩尔范围内借助于sFIDA进行检测(参见图2A和B)。

为了研究精神分裂症的分子基础，CarstenKorth的实验室中发展了鼠模型，其强烈地表达蛋白质DISC1。为了检查是否该蛋白质天然地存在于聚集体中，借助于sFIDA分析转基因动物的CSF-样品。与两只对照动物相比，显示在转基因样品中明显增高的DISC1-聚集体滴度(图2A，样品WT1、WT2、Tg)。

图2：CSF中蛋白质聚集体的sFIDA-检测。将由重组蛋白质形成的聚集体在人CSF中稀释并在sFIDA-试验中进行研究。A)DISC1-检测。作为捕获抗体和检测探针(AF633-标记的)，使用mAB14F2。除了重组的DISC1-聚集体(10pg-10ng)，还使鼠的CSF-样品(WT1、WT2、Tg)经历sFIDA-分析。B)借助于2DsFIDA的突触核蛋白检测。作为捕获抗体，使用抗α-Syn-AB2B2A11和作为检测探针，使用荧光标记的抗-α-Syn-ABs3H2897-AF633或211-AF488。仅考虑在阈值以上的在两个颜色通道中共定位的信号。

5.sFIDA的差异诊断应用

将样品分布在各种不同的反应室(孔)中，其覆盖有各种不同的捕获抗体。备选地，可以将各种不同捕获抗体的混合物固定化在唯一的孔中，或通过“点样”方法施加在唯一表面内的各个不同位置，例如微量滴定板孔的底部，不同的捕获抗体。

通过使用各种不同的各自携带另一荧光团的探针，因此几乎同时地在唯一的样品等份中分析各种不同的聚集体种类。

在该实施例中显示，ALys-特异的sFIDA-试验(抗溶菌酶抗体作为探针和捕手)在宽的浓度范围内不与其他蛋白质聚集体交叉反应(图3)。抗-溶菌酶抗体作为探针和捕手仅与ALys类型的聚集体相互作用。

在另一个实施例中显示，其他蛋白质的存在对淀粉样蛋白β-聚集体的检查不具有负的影响。为此使淀粉样蛋白β-聚集体和Tau-聚集体的混合物经历sFIDA-试验。

图3.特异性分析。在用捕获抗体兔单克隆EPR2994(2)和检测探针EPR2994(2)-AF488的ALys-特异sFIDA-试验中，除了其他蛋白质聚集体(Tau、TDP-43、SOD1、AA、AL、突触核蛋白、ApoAI)的重组ALys-聚集体的稀释外，还考查交叉反应性检测。

图4：Tau-蛋白存在下的Aβ-特异sFIDA。将由Aβ形成的蛋白质聚集体以所说明的浓度稀释并在1μΜTau-蛋白聚集体存在或不存在下在Aβ-特异的sFIDA-试验(检测探针6E10/Atto488，捕获Nab228)中进行分析。

Claims

1.用于定性和/或定量地测定疾病指示物的方法，其特征在于，就内生错误折叠蛋白质的至少一种聚集体类型，优选地至少两种聚集体类型研究样品，所述方法包括下列步骤：

a)将待研究的样品涂在基底上，

b)添加为检测而标记的探针，其通过与各自聚集体的特异结合标记这些聚集体，和

c)检测经标记的聚集体，

其中，

-步骤b)可以在步骤a)之前进行，和

-所述疾病从由下列组成的组中选择：Tau病变、AA-淀粉样变性、AL-淀粉样变性、AApoAI-淀粉样变性、AApoAII-淀粉样变性、ATTR-淀粉样变性、精神分裂症和其他DISC1病变、肌萎缩侧索硬化、额颞叶变性和其他FUS-蛋白病变、2型糖尿病、帕金森病和其他突触核蛋白病变、慢性创伤性脑病变和其他TDP-43-蛋白病变、亨廷顿病、家族性内脏淀粉样变性和/或阿尔茨海默病，和

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，没有其他加工和/或处理，就内生错误折叠蛋白质的至少两种不同类型的聚集体研究样品。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于，在一个方法步骤中就至少两种不同的聚集体类型研究样品。

4.根据权利要求2的方法，其特征在于，在相同的基底上就至少两种不同的聚集体类型研究样品。

5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述内生错误折叠蛋白质的聚集体类型选自由下列组成的组：Tau-聚集体、血清-淀粉样蛋白-A-聚集体、IgG轻链聚集体、AapoAI-聚集体、AapoAII-聚集体、ATTR-聚集体、DISC1-聚集体、FUS-聚集体、IAPP-聚集体、SOD1-聚集体、α-突触核蛋白聚集体、TDP-43-聚集体、亨廷顿蛋白聚集体、溶菌酶聚集体和Aβ-聚集体和混合聚集体。

6.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤c)中的检测借助于具有位置分辨信号的方法，优选地sFIDA-方法来进行。

7.根据权利要求1的方法，其特征在于，在步骤a)之前在基底上使捕获分子固定化。

8.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，将捕获分子和/或探针用荧光染料标记。

9.根据前述权利要求之一的方法，其特征在于，捕获分子和/或探针具有针对形成聚集体的蛋白质的表位的抗体。

10.根据权利要求1的方法，其特征在于，使用内或外标准物。

11.根据权利要求8或10的方法，其特征在于，所述捕获分子、探针和/或标准物包含由单体序列构成的聚合物，所述单体序列就其序列而言与内生蛋白质的部分区域是相同的或就相应的部分区域具有至少50％的同源性，其中这些聚合物不聚集而内生蛋白质是聚集的那些。

12.用于选择性定量和/或表征根据权利要求1的疾病指示物的标准物，其包含使用由单体序列构成的聚合物，所述单体序列就其序列而言与内生蛋白质的部分区域是相同的或就相应的部分区域具有至少50％的同源性，其中这些聚合物不聚集而内生蛋白质是聚集的那些。

13.基底，其包含具有针对根据权利要求1的疾病指示物和/或聚集体的捕获分子的精确确定区域。

14.用于确定具有错误折叠蛋白质的聚集体的疾病的差异诊断，其包括下列步骤：

i)定量测定根据权利要求1的疾病指示物；

ii)将这些数据与标准值比较；

iii)在该比较中测定疾病指示物的明显不同的量；

iv)将偏差归因于根据权利要求1的疾病。

15.用于差异诊断的试剂盒，其包含一个或多个下列组分：

-根据权利要求13的基底，

-根据权利要求12的标准物，

-探针，

-溶液，

-缓冲液，

其中所述疾病选自由下列组成的组：AA-Tau病变、淀粉样变性、AL-淀粉样变性、AApoAI-淀粉样变性、AApoAII-淀粉样变性、ATTR-淀粉样变性、精神分裂症和其他DISC1病变、肌萎缩侧索硬化、额颞叶变性和其他FUS-蛋白病变、2型糖尿病、帕金森病和其他突触核蛋白病变、慢性创伤性脑病变和其他TDP-43-蛋白病变、亨廷顿病、家族性内脏淀粉样变性和/或阿尔茨海默病。