CN105842463B - 一种心肌功能检测用试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫层析检测技术领域，具体公开了一种心肌功能检测用试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括塑料板、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜，样本垫和吸水垫，所述玻璃纤维素膜上包被有量子点标记的肌钙蛋白抗体、肌红蛋白抗体和肌酸激酶抗体的混合物；硝酸纤维素膜上设置有检测线1、检测线2、检测线3和控制线，检测线1上包被有肌钙蛋白二抗，检测线2上包被有肌红蛋白二抗，检测线3上包被有肌酸激酶二抗，控制线上包被有羊抗鼠lgG。该试剂盒，利用双抗体/抗原夹心原理结合量子点的荧光特性实现了采用荧光免疫层析的方法对肌钙蛋白、肌红蛋白和肌酸激酶进行快速、灵敏的联合检测。

Description

一种心肌功能检测用试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫层析检测技术领域，具体涉及一种心肌功能检测用试剂盒及其制备方法。
背景技术
肌红蛋白(Myoglobin,Mb)是一种氧结合血红素蛋白，主要分布于心肌和骨骼肌组织。在急性心肌损伤时，Mb最先被释放入血液中，在症状出现约2-3小时后，血中Mb可超出正常上限，9-12小时达到峰值，24-36小时后恢复正常。对于怀疑ACS的病人建议连续采样测定，因为症状出现和蛋白标志物释放到血液之间有一段延迟。在ACS早期诊断和监测的临床效用已有大量文献报告。检测肌红蛋白的浓度可以用于一些疾病的早期诊断，如(1)血中升高:甲状腺功能减低症、高醛固酮血症、肾功能不全、恶性高热以及剧烈运动后等；(2)尿中升高:卟啉病、血红蛋白尿症、血尿等；(3)血、尿中肌红蛋白均升高:见于急性心肌梗死、心绞痛、心源性休克、心肌病、肌疾病(进行性肌营养不良、多发性肌炎、重症肌无力)等。另外，测定血清肌红蛋白可作为急性心肌梗死(AMI)诊断的早期最灵敏的指标。但特异性差，骨骼肌损伤、创伤、肾功能衰竭等疾病，都可导致其升高。Mb阳性虽不能确诊AMI，但可用于早期排除AMI诊断的重要指标，如Mb阴性，则基本排除心肌梗死，还可用于再梗死的诊断，结合临床，如Mb重新升高，应考虑为再梗死或者梗死延展。
肌钙蛋白，由T、C、I三亚基构成，和原肌球蛋白一起通过调节钙离子对横纹肌动蛋白ATP酶的活性来调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用。当心肌损伤后，心肌肌钙蛋白复合物释放到血液中，4-6小时后，开始在血液中升高，升高的肌钙蛋白I能在血液中保持很长时间6-10天。肌钙蛋白I具有高度心肌特异性和灵敏度，所以肌钙蛋白I已成为目前最理想的心肌梗死标志物。
对心肌损伤的诊断在诸多诊断急性心肌梗死(AMI)的临床生化指标中，CK-MB(血清心肌酶)曾一度被认为是诊断AMI的"金标准"，已广泛应用多年.随着对心肌肌钙蛋白(cTn)深入研究，无论是对心肌的特异性还是诊断敏感性，CK-MB的地位都受到了严重挑战。cTn被认为是目前最好的确定标志物，正逐步取代CK-MB成为AMI的诊断"金标准"。
肌钙蛋白(cTn)出现早，最早可在症状发作后2h出现；具有较宽的诊断窗:cTnT(5～14天)，cTnI(4～10天)。在它们的诊断窗中，cTn增高的幅度要比CK-MB高5～10倍。由于在无心肌损伤时cTn在血液中含量很低，因此也可用于minor mycardial damage(MMD，微小心肌损伤)的诊断，这是以前酶学指标所难以做到的。cTn还具有判断预后的价值，对任何冠状动脉疾患病人，即便ECG或其他检查(如运动试验)阴性，只要cTn增高，应视为具有高危险性。
患有各种冠状动脉疾患的病人必然会发生心肌细胞损伤。有些病人的临床表现可能不完全符合WHO关于AMI诊断标准(不稳定心绞痛就是其中之一)，但却伴有某些心肌损伤标志物(如cTnT等)升高，从而导致细胞内的组成成分渗漏入外周血循环，这使得心肌细胞损伤标志物的检测成为可能。cTnT和cTnI在AMI后(3～6h)血中浓度很快升高，和CK-MB(3～8h)相当或稍早，它们测定的特异性和灵敏度明显高于CK-MB。cTn具有相当长的诊断窗口期(cTnI7～9天，cTnT更长)，cTn对急性胸痛病人(无论有无骨骼肌损伤)的诊断均优于CK-MB。研究表明:在对AMI的诊断方面cTnI和cTnT无显著差异，都能鉴别出CK-MB所不能检测出的心肌损伤。相对cTnT而言，cTnI显示出较低的初始灵敏性和较高的特异性。就上升的相对值来说，cTnT比cTnI高；在不稳定心绞痛病人中cTnT上升的频度比cTnI高。在AMI后30天死亡率的预报方面，cTnT优于cTnI。
无论是不稳定心绞痛还是无Q波的心肌梗死，最初24小时的cTnT最具预后价值。对不稳定冠状动脉疾患病人的随访发现，cTnT和运动试验两项都正常者，死亡或AMI的仅1％；若异常，死亡或AMI可达50％。对急性冠状动脉疾患(包括心肌梗死)病人的随访研究发现，cTnT小于0.1μg/L的病人的死亡率仅4％，相比而言，大于0.1μg/L的病人的死亡率则大3倍，发生休克的百分率大3倍，发生充血性心功能衰竭的百分率也增加1倍。对cTnI的观察研究得到了类似的结果。不稳定冠状动脉疾患病人中，cTnI大于0.1μg/L的病人死亡率较cTnI小于0.1μg/L的病人的死亡率大3倍多。因此，任何急性冠状动脉疾患病人同时测得cTn增高，应视为高危险性。
对围手术期心肌梗死的诊断冠状动脉搭桥术后心肌梗死的诊断在心脏手术中有重要作用，cTn是围手术期心肌梗死的敏感和特异的标志物，能够鉴别出没有达到常规围手术期心肌梗死判断标准的微小的围手术期心肌损伤。对心肌炎的诊断与CK活性相比，心肌炎时cTnT因其相对较高的血清检测值和较长的上升时间而具有较高的检测敏感性，血清cTnT可作为急性心肌炎的诊断标志物.与肾功能衰竭的关系缺血性心脏病是晚期肾病病人发病和死亡的主要原因之一，占总死亡率的大约40％；这些缺血性心脏病中的大约25％发展为AMI。因此，在晚期肾脏病病人的临床治疗中，心血管并发症的诊断成为至关重要的问题。在晚期肾脏病病人血清中，cTnT和cTnI的检测值存在着差异.晚期肾脏病病人的cTnT升高的可能原因有3：检测方法的交叉反应；cTnT在骨骼肌中的重表达；存在着微小心肌损伤。第2代cTnT分析法不会因为cTnT在晚期肾脏病病人骨骼肌中的重表达而产生假阳性，从而排除了分析法的交叉反应.研究结果认为，晚期肾脏病病人血清中cTnT的升高可能是由于存在一定程度的心肌损伤。
肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶1,2，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。肌酸激酶有四种同功酶形式：肌肉型(MM)、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)。MM型主要存在于各种肌肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞中，MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。肌肉型肌酸激酶分子是由两个相同的亚基组成的二聚体。根据目前已经测定的兔、人、鸡、鼠肌酸激酶的一级结构，M型亚基由387个氨基酸残基组成，分子量为43KDa左右，分子内有8个巯基，但无二硫键。大熊猫肌肉型肌酸激酶也是二聚体酶，每个亚基由376个氨基酸残基组成，分子量为42KDa。
肌酸激酶的同功酶在临床诊断中有十分重要的意义，在各种病变包括肌肉萎缩和心肌梗塞发生时，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高，目前认为在心肌梗塞的诊断中测定肌酸激酶的活性比做心电图更为可靠。心肌梗死时，肌酸激酶在起病6小时内升高，24小时达高峰，3-4日内恢复正常。其中肌酸激酶的同工酶CK-MB诊断的特异性最高。肌酸激酶因其具有重要的生理功能和临床应用价值已引起人们广泛的重视和深入的研究。
因此，研究开发出一种能够同时检测肌钙蛋白、肌红蛋白和肌酸激酶的检测方法，对于临床判断心肌功能，初步针对心肌梗死等疾病具有重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种灵敏度高、准确度高、操作简便、成本低的心肌功能检测用试剂盒，实现对肌钙蛋白、肌红蛋白和肌酸激酶三种成分的同时联合检测。
本发明的目的还在于提供一种心肌功能检测用试剂盒的制备方法。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种心肌功能检测用试剂盒，包括塑料板、设置在塑料板上的玻璃纤维素膜、设置在玻璃纤维素膜上的硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上一端设有样本垫，对应的另一端设有吸水垫，所述玻璃纤维素膜上包被有量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体的混合物；所述硝酸纤维素膜上设置有检测线1、检测线2、检测线3和控制线，所述检测线1上包被有肌钙蛋白二抗，所述检测线2上包被有肌红蛋白二抗，所述检测线3上包被有肌酸激酶二抗，所述控制线上包被有羊抗鼠lgG。
所述玻璃纤维上包被的量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体的混合物中量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体的质量比为1：1：1。
所述量子点为硒化镉或硫化镉量子点。
所述硝酸纤维素膜上设置的检测线1与检测线2之间、检测线2与检测线3之间、检测线1与控制线之间的间隔均不小于5mm。
上述心肌标志物功能检测用试剂盒的制备方法，包括以下操作步骤：
1)原材料的制备：
A：制备玻璃纤维素膜：将量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体、量子点标记的肌酸激酶抗体混合包被在玻璃纤维素膜上，干燥，备用；
B：制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，间隔划分出检测线1、检测线2、检测线3和控制线，然后将肌钙蛋白二抗、肌红蛋白二抗、肌酸激酶二抗、羊抗鼠lgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上，之后将包被后的硝酸纤维素膜放入封闭液中封闭，干燥，备用；
2)组装：在塑料板上放置步骤1)制备的玻璃纤维素模，然后在步骤1)制备的玻璃纤维素膜上放置步骤1)制备的硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素的一端放置样品垫，对应的另一端放置吸水垫，干燥，即完成。
步骤A中还包括首先制备量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体的混合物，具体方法包括以下操作步骤：
a：在胶乳颗粒悬浊液中加入改性环糊精，混匀24小时，纯化，得改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；
b：在步骤a制备的改性环糊精-胶乳复合物悬浊液中加入量子点，混匀24小时，纯化，得量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；
c：在步骤b制备的量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液中加入活化剂，活化15分钟，纯化，之后加入肌钙蛋白抗体，混匀2～4小时后，离心得沉淀物颗粒，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1小时，之后再进行纯化，即得量子点标记的肌钙蛋白抗体；
d：按照上述步骤a～c同样的方法制备量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体，然后将量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体混合，备用；
所述改性环糊精为羧甲基化改性环糊精或氨基化改性环糊精。
所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
步骤c中所述量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液与活化剂的质量比为1：10。
步骤B中所用的封闭液为牛血清白蛋白溶液。
步骤c中所用的封闭液为牛血清白蛋白溶液。
步骤a中所述改性环糊精与胶乳颗粒的质量比为20：1；步骤b中所述量子点与环糊精-乳胶复合物的质量比为10：1；步骤c中所述肌钙蛋白抗体与量子点-改性环糊精-胶乳复合物的质量比为1：20。
步骤a中胶乳颗粒使用前进行纯化处理，所述纯化处理的具体方法为：取胶乳颗粒加入第一缓冲液中，离心分离，弃去上清，再用第一缓冲液重悬沉淀物颗粒，然后再离心分离，弃去上清，再用第一缓冲液重悬沉淀物颗粒，4℃保存备用。
上述纯化后的胶乳颗粒在使用时取胶乳颗粒，采用第二缓冲液将胶乳颗粒稀释成浓度为10mg/ml。
上述步骤b中还包括首先将步骤a中制备的改性环糊精-胶乳复合物悬浊液，采用第二缓冲液稀释成浓度为10mg/ml的悬浊液，然后再加入量子点。
上述步骤c中还包括首先将步骤b中制备的量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液，采用第二缓冲液稀释成浓度为10mg/ml的悬浊液，然后再加入活化剂活化。
步骤c中所述封闭后进行纯化的具体方法为：8000rpm条件下离心15min，弃去上清，沉淀复溶于分散液中。
步骤A中将量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体、量子点标记的肌酸激酶抗体混合包被在玻璃纤维素膜上的具体方法为：将将量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体混合物均匀喷涂于玻璃纤维素膜上。
步骤a和步骤b中所述纯化的具体方法为：8000rpm条件下离心，弃去上清，沉淀用第一缓冲液进行重悬，之后在8000rpm条件下离心，弃去上清，沉淀复溶于第一缓冲液中。
步骤c中活化后纯化的具体方法为：8000rpm条件下离心弃去上清，沉淀用第一缓冲液进行重悬。
步骤B中将肌钙蛋白二抗、肌红蛋白二抗、肌酸激酶二抗、羊抗鼠lgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上的具体方法为：分别取浓度均为1mg/ml的肌钙蛋白二抗、肌红蛋白二抗、肌酸激酶抗体和羊抗鼠IgG，以1ul/cm，10cm/秒的速度分别喷涂到硝酸纤维的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上。
步骤1)和步骤2)中所述的干燥为37℃干燥3～5小时。
上述第一缓冲液为0.02M，pH7.4的PB缓冲液。上述第二缓冲液为0.02M，pH6.1的MES缓冲液。
上述心肌标志物功能检测用试剂盒在使用时，将待测样品加入试剂盒的样品垫上，玻璃纤维素膜上的量子化标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体、量子点标记的肌酸激酶抗体混合物首先特异性的捕捉到待测样品中的肌钙蛋白、肌红蛋白和肌酸激酶，然后在达到检测线3时，量子点标记的肌酸激酶-肌酸激酶抗体结合物与检测线3上的肌酸激酶二抗特异性结合，在检测线2时，量子点标记的肌红蛋白抗体-肌红蛋白结合物与检测线2上的肌红蛋白二抗特异性结合；在检测线1时，量子点标记的肌钙蛋白抗体-肌钙蛋白结合物与检测线1上的肌钙蛋白二抗特异性结合；之后通过检测检测线1、检测线2和检测线3上结合的量子点的荧光效应，定量和定性判断待测样品中肌钙蛋白、肌红蛋白和肌酸激酶。
本发明心肌标志物功能检测用试剂盒，以量子化标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体、量子点标记的肌酸激酶抗体混合物包被在玻璃纤维素膜上，作为检测探针，利用双抗体/抗原夹心原理结合量子点的荧光特性实现了采用荧光免疫层析的方法对肌钙蛋白、肌红蛋白和肌酸激酶进行快速、特异、简便、灵敏的联合检测。本发明心肌标志物功能检测用试剂盒检测线低，检测灵敏度高。
本发明心肌标志物功能检测用试剂盒的制备方法，操作简便，易于控制，适于工业化推广应用。
进一步优选的，本发明制备方法中，创新量子点标记技术，采用羧甲基化或氨基化改性的环糊精修饰量子点，然后将肌钙蛋白抗体、肌红蛋白抗体、肌酸激酶抗体分别结合在改性环糊精的羧甲基基团或氨基基团上，实现制备获得量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体、量子点标记的肌酸激酶抗体。
附图说明：
图1是采用实施例1制备的试剂盒检测肌钙蛋白标准溶液发光值与实际浓度之间对应关系的标准曲线；
图2是采用实施例1制备的试剂盒检测肌红蛋白标准溶液发光值与实际浓度之间对应关系的标准曲线；
图3是采用实施例1制备的试剂盒检测肌酸激酶标准溶液发光值与实际浓度之间对应关系的标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
本实施例心肌标志物功能检测用试剂盒，包括塑料板、设置在塑料板上的玻璃纤维素膜、设置在玻璃纤维素膜上的硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上一端设有样本垫，对应的另一端设有吸水垫，所述玻璃纤维素膜上包被有质量比为1：1：1的量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体的混合物；所述硝酸纤维素膜上设置有检测线1、检测线2、检测线3和控制线，所述检测线1上包被有肌钙蛋白二抗，所述检测线2上包被有肌红蛋白二抗，所述检测线3上包被有肌酸激酶二抗，所述控制线上包被有羊抗鼠lgG；所述量子点为硒化镉量子点。
本实施例心肌标志物功能检测用试剂盒的制备方法，具体操作步骤为：
1)制备玻璃纤维素膜：
a：取1ml未标记胶乳颗粒加入10ml，0.02M，pH7.4PB缓冲液中；离心机10000rpm离心20min；去掉上清液，再用10ml，0.02M，pH7.4PB缓冲液重悬沉淀颗粒物；之后再离心机10000rpm离心20min，去掉上清并用5ml0.02M，pH7.4，PB缓冲液重悬沉淀颗粒物，4℃保存待用；
b：取步骤a制备的胶乳颗粒用0.02M，pH6.1的MES缓冲液将胶乳颗粒稀释至10mg/ml，取0.05ml稀释后的胶乳颗粒悬浊液加入10mg羧甲基化改性环糊精，混匀24小时后，离心机8000rpm离心，弃去上清，并用0.02M，pH7.4的PB缓冲液重悬沉淀颗粒物，之后再次离心机8000rpm离心，弃去上清，沉淀颗粒物复溶于0.02M，pH7.4的PB缓冲液中，得羧甲基化改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；
c：取步骤b制备的羧甲基化改性环糊精-胶乳复合物悬浊液，用0.02M，pH6.1的MES缓冲液将其稀释至10mg/ml，取20ml稀释后的羧甲基化改性环糊精-胶乳复合悬浊液，加入20mg硒化镉量子点，混匀24小时，离心机8000rpm离心，弃去上清，并用0.02M，pH7.4的PB缓冲液重悬沉淀颗粒物，之后再次离心机8000rpm离心，弃去上清，沉淀颗粒物复溶于0.02M，pH7.4的PB缓冲液中，得量子点-羧甲基化改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；
d：取步骤c制备的量子点-羧甲基化改性环糊精-胶乳复合物悬浊液，用0.02M，pH6.1的MES缓冲液将其稀释至10mg/ml，然后按照量子点-改性环糊精-胶乳复合物与活化剂的质量比为1：10，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，活化15分钟后，8000rpm离心，弃去上清，并用0.02M，pH7.4的PB缓冲液重悬沉淀物颗粒，之后按照肌钙蛋白抗体：量子点-羧甲基化改性环糊精-胶乳复合物＝1：20的比例加入肌钙蛋白抗体，混匀3小时后，8000rpm离心15分钟，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1小时，之后8000rpm离心15min，沉淀颗粒物复溶于分散液，即得量子点标记的肌钙蛋白抗体；
e：按照上述步骤a～c同样的方法制备量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体，然后将量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体混合，喷涂于玻璃纤维素模上，37℃干燥4小时，即得量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体混合物标记的玻璃纤维素膜；
2)制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，间隔6mm依次划分检测线3、检测线2、检测线1和控制线，之后取浓度均为1mg/ml的肌钙蛋白二抗、肌红蛋白二抗、肌酸激酶二抗、羊抗鼠IgG，以1ul/cm，10cm/秒的速度分别喷涂到硝酸纤维膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上，之后将硝酸纤维素膜放入牛血清白蛋白溶液中封闭，37℃干燥3小时，即得所述的硝酸纤维素膜；
3)组装：在塑料板上放置步骤1)制备的玻璃纤维素模，在步骤1)制备的玻璃纤维素膜上放置步骤2)制备的硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素的一端放置样品垫，对应的另一端放置吸水垫，37℃干燥5小时，即完成。
实施例2
本实施例心肌标志物功能检测用试剂盒，与实施例不同的地方在于，采用的量子点为硫化镉量子点，采用的改性环糊精为氨基化干性环糊精，制备肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体的过程中，在活化的量子点-改性环糊精-胶乳悬浊液中加入抗体或抗原的混匀时间为2小时，其他同实施例1。
实施例3
本实施例心肌标志物功能检测用试剂盒，与实施例不同的地方在于，制备肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体的过程中，在活化的量子点-改性环糊精-胶乳悬浊液中加入抗体或抗原的混匀时间为4小时，其他同实施例1。
试验例：
将肌红蛋白稀释为0.1953125ug/L、0.390625ug/L、0.78125ug/L、1.5625ug/L、3.125ug/L、6.25ug/L、12.5ug/L、25ug/L、50ug/L、100ug/L、200ug/L；肌钙蛋白稀释为0.1953125ug/L、0.390625ug/L、0.78125ug/L、1.5625ug/L、3.125ug/L、6.25ug/L、12.5ug/L、25ug/L、50ug/L、100ug/L；肌酸激酶稀释为0.1953125ug/L、0.390625ug/L、0.78125ug/L、1.5625ug/L、3.125ug/L、6.25ug/L、12.5ug/L、25ug/L、50ug/L、100ug/L作为标准品溶液，并同时配制空白溶液。
分别取各浓度的标准品100ul分别加入到实施例1制备的试剂盒的样品垫上，5min后将显色完成的试剂盒放入荧光免疫层析读数仪(南京美宁康诚生物科技有限公司)重，读取相应检测线的发光值，并记录各浓度标准样品检测的发光值与实际浓度之间的对应关系，绘制标准曲线，如图1～图3所示，肌钙蛋白的标准曲线回归方程为：y＝-0.00000004x2+0.00088x+0.09312，R2＝0.99862；肌红蛋白的标准曲线回归方程为：y＝-0.0000005x2+0.00336x+0.02718，R2＝0.99967；肌酸激酶的标准曲线回归方程为：y＝-0.00005x2+0.2899x+0.0573，R2＝0.99974，由上述标准曲线可知本发明制备的试剂盒针对肌红蛋白的最低检测限为21μg/L、肌钙蛋白的最低检测限为3ng/L、肌酸激酶最低检测限为0.3μg/L。
另外，取空白溶液加入到实施例1制备的试剂盒中，未检测到荧光效应。
取100例随机的临床样本，采用本发明实施例1制备的试剂盒对血清中肌钙蛋白、肌红蛋白和肌酸激酶的浓度进行联合检测。检测方法为：100ul待测样品(50ul样品+50ul样品稀释液)滴入试剂盒样本垫上，5min后将显色完成的标准品与待测样品的试纸条放入荧光免疫层析读数仪(南京美宁康诚生物科技有限公司)中，读取T/C线的发光值，并记录，将待测样品T/C值带入标准曲线中，得到肌钙蛋白、肌红蛋白、肌酸激酶的浓度，结果如下表1所示：
表1
由此可见，本方法可以直接定量检测心肌三项，不需专业培训，操作方便，快速，10min即可获得结果，适合在基层医院和体检中心推广和运用。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种心肌功能检测用试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试剂盒包括塑料板、设置在塑料板上的玻璃纤维素膜、设置在玻璃纤维素膜上的硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上一端设有样本垫，对应的另一端设有吸水垫，其特征在于，所述玻璃纤维素膜上包被有量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体的混合物；所述硝酸纤维素膜上设置有检测线1、检测线2、检测线3和控制线，所述检测线1上包被有肌钙蛋白二抗，所述检测线2上包被有肌红蛋白二抗，所述检测线3上包被有肌酸激酶二抗，所述控制线上包被有羊抗鼠lgG；
其制备方法包括以下操作步骤：
1)原材料的制备：
A：制备玻璃纤维素膜：将量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体、量子点标记的肌酸激酶抗体混合包被在玻璃纤维素膜上，干燥，备用；
B：制备硝酸纤维素膜：取硝酸纤维素膜，间隔划分出检测线1、检测线2、检测线3和控制线，然后将肌钙蛋白二抗、肌红蛋白二抗、肌酸激酶二抗、羊抗鼠lgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上，之后将包被后的硝酸纤维素膜放入封闭液中封闭，干燥，备用；
2)组装：在塑料板上放置步骤1)制备的玻璃纤维素膜，然后在步骤1)制备的玻璃纤维素膜上放置步骤1)制备的硝酸纤维素膜，然后在硝酸纤维素的一端放置样品垫，对应的另一端放置吸水垫，干燥，即完成；
步骤A中还包括首先制备量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体的混合物，具体方法包括以下操作步骤：
a：在胶乳颗粒悬浊液中加入改性环糊精，混匀24小时，纯化，得改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；
b：在步骤a制备的改性环糊精-胶乳复合物悬浊液中加入量子点，混匀24小时，纯化，得量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液；
c：在步骤b制备的量子点-改性环糊精-胶乳复合物悬浊液中加入活化剂，活化15分钟，纯化，之后加入肌钙蛋白抗体，混匀2～4小时后，离心得沉淀物颗粒，将沉淀物颗粒用封闭液重悬，室温混匀1小时，之后再进行纯化，即得量子点标记的肌钙蛋白抗体；
d：按照上述步骤a～c同样的方法制备量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体，然后将量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体混合，备用。
2.如权利要求1所述的心肌功能检测用试剂盒的制备方法，其特征在于，所述改性环糊精为羧甲基化改性环糊精或氨基化改性环糊精。
3.如权利要求1所述的心肌功能检测用试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤a中所述改性环糊精与胶乳颗粒的质量比为20：1；步骤b中所述量子点与环糊精-乳胶复合物的质量比为10：1；步骤c中所述肌钙蛋白抗体与量子点-改性环糊精-胶乳复合物的质量比为1：20。
4.如权利要求1所述的心肌功能检测用试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤A中将量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体、量子点标记的肌酸激酶抗体混合包被在玻璃纤维素膜上的具体方法为：将量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体混合物均匀喷涂于玻璃纤维素膜上。
5.如权利要求1所述的心肌功能检测用试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤B中将肌钙蛋白二抗、肌红蛋白二抗、肌酸激酶二抗、羊抗鼠lgG分别包被在硝酸纤维素膜的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上的具体方法为：分别取浓度均为1mg/ml的肌钙蛋白二抗、肌红蛋白二抗、肌酸激酶二抗和羊抗鼠IgG，以1ul/cm，10cm/秒的速度分别喷涂到硝酸纤维的检测线1、检测线2、检测线3和控制线上。
6.一种心肌功能检测用试剂盒，其特征在于，由如权利要求1～5任一项所述的制备方法制备而成。
7.如权利要求6所述的心肌功能检测用试剂盒，其特征在于，所述玻璃纤维上包被的量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体的混合物中量子点标记的肌钙蛋白抗体、量子点标记的肌红蛋白抗体和量子点标记的肌酸激酶抗体的质量比为1：1：1。
8.如权利要求6所述的心肌功能检测用试剂盒，其特征在于，所述量子点为硒化镉或硫化镉量子点。
9.如权利要求6任一项所述的心肌功能检测用试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上设置的检测线1与检测线2之间、检测线2与检测线3之间、检测线1与控制线之间的间隔均不小于5mm。
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