CN108303551A

CN108303551A - 人心肌肌钙蛋白i/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒及制法

Info

Publication number: CN108303551A
Application number: CN201810169898.3A
Authority: CN
Inventors: 邓川; 张守涛; 杨永芳; 陶新博; 郭亚楠
Original assignee: Zhejiang Jukang Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Jukang Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2018-02-07
Filing date: 2018-02-07
Publication date: 2018-07-20

Abstract

本发明涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域，具体地说是一种人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒及制法，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土Eu³⁺荧光微球标记的抗人心肌肌钙蛋白I、抗肌红蛋白、抗肌酸激酶同工酶三种单克隆抗体‑微球偶联复合物，所述稀土荧光微球的直径为150nm，稀土荧光微球含稀土镧系元素Eu³⁺，在基态下稳定，在337nm激发光源作用下发射出波长615nm的荧光：所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，分别来源于针对2‑6个不同人心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶等抗原表位的单克隆抗体细胞株。具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强等优点。

Description

人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒及制法

技术领域

本发明涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域，具体地说是一种能够快速准确的同时对血浆和全血样品中人心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶三个心血管疾病相关指标进行定量分析的三合一测定试剂盒及制法。

背景技术

人心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌红蛋白(Myo)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)是理想的心肌损伤标记物，具有突出的急症救治意义。肌钙蛋白由肌钙蛋白I、T、C三亚基构成，当心肌损伤后，心急肌钙蛋白复合物释放到血液中，4-8小时后开始在血液中升高，升高的cTnI能在血液中保持很长时间(5-10天)，这样就提供了较长的检测期。cTnI目前已被大量临床数据证明是急性冠脉综合征(ACS)尤其是MI(心梗)诊断、危险分层、病情监测和预后评估的首选的最重要的指标。肌红蛋白(Myo)是一种氧结合血红素蛋白，主要分布于心肌和骨骼肌组织。在急性心肌损伤时，肌红蛋白最先被释放入血液中，在临床症状出现约2-3小时后，血中肌红蛋白可超出正常上限，9-12小时达到峰值，24-36小时后恢复正常。测定血清肌红蛋白可作为急性心肌梗塞(AMI)诊断早期最灵敏的指标。但其特异性差，在骨骼肌损伤、创伤、肾功能衰竭等疾病时，都可导致其升高。Myo阳性虽不能确诊AMI，但可作为早期排除AMI的重要指表。CK-MB主要存在于心肌中，一般在心肌损伤后3～8小时升高，9～30小时达高峰，48～72小时恢复正常。且其高峰出现时间与预后程度有一定关系，高峰出现早者预后较好。在20世纪90年代CK-MB被认为是诊断AMI的金标准。

CN 105137071 A公开了一种心肌肌钙蛋白I均相酶免疫法测定试剂盒，该检测试剂盒包括：根据肌钙蛋白I全氨基酸序列合成相应抗体作用位10-30个氨基酸的微型肽段，将合成肽段共价标记于载体(酶蛋白)并制备反应试剂；同时采用肽段作用的抗体制备成免疫酶试剂和纯化人心肌肌钙蛋白I(cTnI)制备而成的标准品。该试剂盒可用于半自动或全自动生化分析仪器准确、特异性的测定血清中心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量，但只能检测人血清中人心肌肌钙蛋白I，未能覆盖血浆或全血样本，且也未能同时检测多个指标，且也以全面、准确判断心肌细胞损伤程度。

CN104407149A公开了一种抗心肌抗体四联诊断试剂盒，该抗心肌抗体四联诊断试剂盒由四段抗心肌抗体多肽抗心肌线粒体腺苷酸转移酶抗体、β1肾上腺素能受体抗体、抗钙离子通道抗体和心肌肌球蛋白重链抗体分别包被组成。利用该试剂盒检测疑诊DCM患者血清中抗心肌肽类抗体，可提高DCM的诊断水平，实现早期诊断，但该检测方法的特异性一般只有百分之90以下。

现有技术未公开报道能够同时定量能检测人心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶的心肌损伤标记物指标的免疫分析技术，使其具备良好的检测特异性，高灵敏度和准确性，已达到临床检测的实际意义。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的缺点和不足，提出了一种利用荧光免疫层析的灵敏性，结合荧光免疫层析分析仪实现的灵敏度高、快捷简便，可以同时准确定量检测人心肌肌钙蛋白 I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒及制法。

本发明可以通过以下措施达到：

一种人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球分别标记的抗人心肌肌钙蛋白I、抗肌红蛋白、抗肌酸激酶同工酶三种单克隆抗体-微球偶联复合物，所述稀土荧光微球的直径为100-250nm，稀土荧光微球含稀土镧系元素中的一种或几种，在基态下稳定，在300-400nm的激发光源作用下发射出波长范围550-650mm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，分别均来源于针对2-6个不同的人心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶抗原表位的单克隆抗体细胞株。

本发明所述结合垫的稀土荧光微球的直径优选是120-200nm；所述稀土荧光微球优选含有一种或几种稀土镧系元素；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体优选来源于针对2个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。

本发明所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于150mM Tris-HCl处理液中 (含1.0％Triton X-100，2.5％BSA，pH7.4)，4℃浸泡2小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用。将玻璃纤维膜放在三维喷点平台上，用非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的抗人心肌肌钙蛋白I、抗肌红蛋白和抗肌酸激酶同工酶抗体的三种偶联复合物混匀后喷到玻璃纤维膜上，37℃烘干1小时后制得。

本发明中结合垫上的所述稀土荧光微球标记的人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒中三种单克隆抗体采用如下步骤制得：

步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：分别用人心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶纯品分别免疫小鼠，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力高的单克隆抗体细胞株，对所获得的单抗细胞株进行配对筛选，根据配对结果和亲和力数据优选出用于试剂盒的单抗细胞株；

步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化抗人心肌肌钙蛋白I 抗体、抗肌红蛋白抗体和抗肌酸激酶同工酶抗体等三种鼠源单克隆抗体，分装后保存于-20℃ 备用；

步骤3：稀土荧光微球的醛基化：取5mg稀土荧光微球，用20mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为5分钟，最后重悬于100ul的上述碳酸盐缓冲液中，加入500ul醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100ul的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用；

步骤4：稀土荧光微球标记的抗人心肌肌钙蛋白I抗体、抗肌红蛋白抗体和抗肌酸激酶同工酶抗体等三种偶联复合物的制备：三种抗体-微球偶联复合物分别单独偶联，操作如下：选取来自2个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株的抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体，按照质量比1∶1将2mg人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4℃反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度5mM，4℃反应4 小时；再加入等体积的封闭液(50mM Tris-HCl，pH7.4，含2.5％BSA，5％蔗糖)，4℃封闭过夜；然后用50mM Tris-HCl，pH7.4的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100ul的50mM Tris-HCl缓冲液中(含1.2％NaCl，0.5％BSA，0.1％Tween 20)，4℃避光保存备用。同样操作分别制备抗肌红蛋白抗体-微球偶联复合物和抗肌酸激酶同工酶抗体-微球偶联复合物，4℃避光保存备用。

本发明所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维膜通过以下步骤制得：

步骤1：采用与结合垫上所用的抗人心肌肌钙蛋白I、抗肌红蛋白和抗肌酸激酶同工酶三种单克隆抗体细胞株不同的细胞株，采用标准的腹水生产工艺制备并纯化抗人心肌肌钙蛋白 I抗体、抗肌红蛋白抗体和抗肌酸激酶同工酶抗体等三种鼠源单克隆抗体，得到与标记抗体配对的单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；

步骤2：分别用包被稀释液将上述三种鼠源单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到 1-3mg/ml，膜液量为1-3ul/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

本发明所述样品垫通过以下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于含有1.0％Triton X-100， 2.5％BSA，0.15M Tris缓冲液，pH7.5的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中， 37℃烘干2小时。

本发明还提供了一种如上所述试剂盒实现的人心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶三合一制法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1：将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；

步骤2：读卡；将IC卡放置在荧光免疫分析仪标注位置，读出相关信息，所述荧光免疫层析分析仪是一种光学检测系统，检测范围分别为：cTnI：0.20-40ng/ml、Myo：50-400ng/ml、 CK-MB：2.5-80ng/ml；

步骤3：加样：取100ul血浆样本或150ul全血样本加到一管缓冲液中，充分混匀，垂直滴加100ul混合液至测试卡加样处；取样时注意不要吸入气泡；

步骤4：可采用自动测试或即时测试两种模式进行检测，自动测试：将测试卡插入荧光免疫分析仪的承载器上，按测试键，仪器将自动对测试卡进行扫描分析检测，即时测试：测试卡温室放置10min后，插入荧光免疫分析仪的承载器上，点击即时测试。

本发明提供一种利用稀土羧基乳胶微球标记的荧光免疫层析技术制备的人心肌肌钙蛋白 I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测试剂盒，与现有技术相比，具备以下优点：

(1)同时适合血浆和全血样本，并适合临床上单人份检测，具备良好的检测特异性、较高的灵敏度、操作的简便性以及稳定的荧光标记物保证了检测的准确性；

(2)同时定量检测样本中的人心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白和肌酸激酶同工酶的含量，三项联检对诊断急性心肌梗塞(AMI)有协同互补作用，可以为心肌损伤病人提供准确可靠的诊断，危险分层和预后信息，具有更快速、更有效、更准确等优点。

(3)通过本发明方法制备得到的三种单克隆抗体-微球偶联复合物，相比现有技术，荧光寿命长，Stokes位移大，激发光谱和发射光谱不重叠，不存在相互干扰现象。

附图说明

图1是本发明中试纸卡的结构示意图。

图2是本发明中实施例2的准确度分析结果示意图。

图3是本发明中实施例2的准确度分析结果示意图。

图4是本发明中实施例2的准确度分析结果示意图。

图5是本发明中实施例2的准确度分析结果示意图。

图6是本发明中实施例2的准确度分析结果示意图。

图7是本发明中实施例2的准确度分析结果示意图。

附图标记：PVC板1、样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫5。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明：

如图1所示，本发明首先提出了一种人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定剂盒，盒内设有试纸卡，所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板1、样品垫2、结合垫 3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，其中结合垫3上吸附有稀土荧光微球标记的分别抗人心肌肌钙蛋白I、抗肌红蛋白和抗肌酸激酶同工酶三种单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为 150nm，稀土荧光微球包含稀土镧系元素Eu³⁺，在基态下稳定，在337nm的激发光源作用下发射出波长615nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，分别均来源于针对2-6 个不同的人心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶抗原表位的单克隆抗体细胞株。

所述结合垫3的稀土荧光微球的直径优选是200nm；所述稀土荧光微球优选含有稀土镧系元素有铕(Eu)；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体优选来源于针对2个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。

实施例1：

人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒中试剂卡的各组成部分可以通过以下措施制得：

1、样品垫2的制备：

将玻璃纤维膜浸泡于含有1.0％Triton X-100，2.5％BSA，0.15M Tris缓冲液，pH7.5的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

2、吸附荧光微球标记抗体的结合垫3的制备：

将玻璃纤维膜浸泡于150mM Tris-HCL处理液中(含1.0％Triton X-100，2.5％BSA，pH7.4)， 4℃浸泡2小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用。将玻璃纤维放在三维喷点平台上，用非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白和肌酸激酶同工酶三种偶联复合物混匀后喷到玻璃纤维膜上，37℃烘干1小时后制得。

稀土荧光纳米微球的醛基化：取5mg稀土荧光纳米微球，用20mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为5分钟，最后重悬于100ul的上述碳酸盐缓冲液中，加入500ul醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100ul的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用；

稀土Eu3+荧光微球标记的抗人心肌肌钙蛋白I抗体、抗肌红蛋白抗体和抗肌酸激酶同工酶抗体三种偶联复合物的制备：三种抗体-微球偶联复合物分别单独偶联，操作如下：选取来自2个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株的抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体，按照质量比1∶1 将2mg人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4℃反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度5mM，4℃反应4小时；再加入等体积的封闭液(50mM Tris-HCl，pH7.4，含2％BSA，5％蔗糖)，4℃封闭过夜；然后用50mM Tris-HCl，pH7.4的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100ul的50mMTris-HCl 缓冲液中(含1.2％NaCl，0.5％BSA，0.1％Tween 20)，4℃避光保存备用。同样操作分别制备抗肌红蛋白抗体-微球偶联复合物和抗肌酸激酶同工酶抗体-微球偶联复合物，4℃避光保存备用。

3、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜4的制备：

采用与结合垫上所用的人心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白和肌酸激酶同工酶三种单克隆抗体细胞株不同的细胞株，采用标准的腹水生产工艺制备并纯化抗人心肌肌钙蛋白I抗体、抗肌红蛋白抗体和抗肌酸激酶同工酶抗体等三种鼠源单克隆抗体，得到与标记抗体配对的单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；

分别用包被稀释液将上诉三种鼠源单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到1.5mg/ml，膜液量为1.5ul/cm，将它们分别作为检测线和质控平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，三条检测线之间以及与质控线间隔为3mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

试剂卡的组装：在PVC板1上依次粘贴经过处理的样品垫2、吸附有稀土荧光标记的抗体的结合垫3、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜4和吸水垫5，组装后得到试纸大板，按照要求切割成4mm宽，将试纸装入塑料卡内形成试纸卡。

上述各步骤选用的设备及原料优选以下原料：

人心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶三种特异性配对抗体；人心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶三种质控品：英国朗道实验诊断有限公司；稀土荧光微球：南京微测生物科技有限公司；硝酸纤维素(NC)膜：Millipore公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白：Sigma产品，其它常用试剂均为分析纯试剂。

实施例2：准确度试验

选用上述试纸卡以及荧光免疫层析分析仪(型号：JK-001)，荧光免疫分析仪参数的设定：在荧光免疫分析仪上设定好试纸卡工艺参数后，取上述组装好的试纸卡，分别用0.2、1、 5、10、20、30、40ng/ml的心肌肌钙蛋白I，50、80、100、200、250、300、400ng/ml的肌红蛋白，2.5、5、10、20、40、60、80ng/ml的肌酸激酶同工酶校准品，用试纸卡进行测定，得到各校准品的荧光强度值，将结果输入到分析仪的参数中，完成分析仪的参数的设定。

主要检测材料：临床样本由相关医院获得，共200份胶乳增强免疫比浊法定值样本，其中血浆样本100份，全血样本100份，人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶含量分布区间分别为：cTnI：0.20-40ng/ml、Myo：50-400ng/ml、CK-MB：2.5-80ng/ml。

制法：

步骤1：将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；

步骤2：读卡：将IC卡放置在荧光免疫分析仪标注位置，读取相关信息；

步骤3：加样：取100ul血浆样本或150ul全血样本加到一管缓冲液中，充分混匀，垂直滴加100ul混合液至测试卡加样处，取样时注意不要吸入气泡；步骤4：检测，可采用自动测试或即时测试两种模式进行检测，自动测试：将测试卡插入干式荧光免疫分析仪的承载器上，按测试键，仪器将自动对测试卡进行扫描分析检测，即时测试：测试卡室温放置10min后，插入荧光免疫分析仪的承载器上，点击即时测试。

试验结果分析：临床样本检测试剂制备完成后，按制法对所有临床样本进行检测，并分析检测结果。

试验结果：

如图2-7所示，以实验系统的检测值为Y轴，以对照系统的测验值为X轴，绘制散点图，并进行相关性分析。临床样本检测对200份临床定值样本检测，样本平均偏差值小于10％，最大偏差小于20％，R²＞0.98，一致性系数＞0.90。检测结果表明制备的检测试剂盒检测心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶的敏感性都在99％以上，特异性在95％以上，适合用于临床检测，满足不同客户不同检测场合的差异化需要。

本发明提供一种利用稀土元素作为标记物质的荧光免疫层析技术制备的人心肌肌钙蛋白 I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒，适合血浆和全血样本，并适合临床上单人份检测，相对于定性胶体金试剂，能同时定量检测样本中的心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白、肌酸酸激酶同工酶三种物质的含量，有明确的临床指导意义，具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。

Claims

1.一种人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球分别标记的抗人心肌肌钙蛋白I、抗肌红蛋白、抗肌酸激酶同工酶三种单克隆抗体-微球偶联复合物，所述稀土荧光微球的直径为100-250nm，稀土荧光微球含稀土镧系元素的一种或几种：所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于2-6个不同人心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶抗原表位的单克隆抗体细胞株。

2.根据权利要求1所述的一种人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒，其特征在于所述结合垫的稀土荧光微球的直径是120-200nm；所述稀土荧光微球掺杂有稀土镧系元素Eu³⁺。

3.根据权利要求2所述的一种人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒，其特征在于结合垫上稀土荧光微球标记的三种抗体均来源于针对2个不同抗原表位的单克隆细胞株。

4.根据权利要求1所述的一种人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒，其特征在于所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于150mM Tris-HCl处理液中，所述处理液含1.0％Triton X-100和2.5％BSA，pH为7.4，，4℃浸泡4小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜放在三维喷点平台上，用非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的人心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶三种偶联复合物混匀后喷到玻璃纤维膜上，37℃烘干1小时后制得。

5.根据权利要求4所述的一种人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒，其特征在于所述结合垫上的所述稀土荧光微球分别标记的抗人心肌肌钙蛋白I、抗肌红蛋白、抗肌酸激酶同工酶三种单克隆抗体-微球偶联复合物采用如下步骤制得：

步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化抗人心肌肌钙蛋白I、抗肌红蛋白、抗肌酸激酶同工酶三种单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；

步骤3：稀土Eu³⁺荧光微球的醛基化：取5mg稀土荧光微球，用20mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液。采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为5分钟，最后重悬于100ul的上述碳酸盐缓冲液中，加入500ul醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100ul的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用；

步骤4：稀土Eu³⁺荧光微球标记的抗人心肌肌钙蛋白I、抗肌红蛋白、抗肌酸激酶同工酶抗体三种偶联复合物的制备：三种抗体-微球偶联复合物分别单独偶联，操作如下：选取来自2个不同抗原表位的单克隆细胞株的抗人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体或抗肌红蛋白或抗肌酸激酶同工酶抗体，按照质量比1∶1将2mg人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4℃反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度5mM，4℃反应4小时；再加入等体积的封闭液，所述封闭液含有50mM Tris-HCl，含2.5％BSA，5％蔗糖，pH为7.4，4℃封闭过夜；然后用50mM Tris-HCl，pH7.4的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100ul 50mM Tris-HCl缓冲液中，所述缓冲液含有1.2％NaCl、0.5％BSA和0.1％Tween 20，4℃避光保存备用。

6.根据权利要求1所述的一种人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒，其特征在于所述硝酸纤维素膜包被有检测线和质控线，通过以下步骤制得：

步骤1：采用与结合垫上所用的人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三种单克隆抗体细胞株不同的细胞株，采用标准的腹水生产工艺制备并纯化抗人心肌肌钙蛋白I抗体、抗肌红蛋白抗体和抗肌酸激酶同工酶抗体三种鼠源单克隆抗体，得到与标记抗体配对的单克隆抗体，分装后保存与-20℃备用；

步骤2：分别用包被稀释液将上述三种鼠源单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到1.5mg/ml，膜液量为1.5ul/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

7.根据权利要求1所述的一种人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒，其特征在于所述样品垫通过以下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于含有1.0％TritonX-100，2.5％BSA，0.15M Tris缓冲液，pH7.5的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。