CN102662065A - 一种快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法，其中多种蛋白包括肌红蛋白/肌酸激酶同工酶/肌钙蛋白I，所述试纸条组件是由底衬、吸水垫、包被分析膜、样品垫组成的试纸条及独立包装的荧光素标记特异抗体；包被分析膜上有三条检测线和一条质控线，包被分析膜上的检测线分别包被抗肌红蛋白单克隆抗体线、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体线和肌钙蛋白I单克隆抗体线；质控线包被兔IgG抗体；荧光素标记特异抗体为抗肌红蛋白单克隆抗体线、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体线和肌钙蛋白I单克隆抗体和抗兔IgG抗体，检测卡组件包括试纸条、由盖板和背板组成的卡盒以及独立包装的铂卟啉标记特异抗体，可同步检测肌红蛋白/肌酸激酶同工酶/肌钙蛋白I，操作简单、快速、灵敏和特异性好。

Description

一种快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件及其制成的检测卡组件和制备方法

技术领域

本发明属于医学检验领域，尤其涉及一种快速定量、联合测定肌红蛋白/肌酸激酶同工酶/肌钙蛋白I的免疫荧光试纸条组件及其制备方法。

背景技术

冠心病已成为影响人群健康的主要疾病。急性心肌梗死(AMI)则是造成冠心病人死亡的主要原因。如何及时地发现急性心肌梗死病人及其相应的治疗是挽救心肌梗死病人生命的关键所在。传统的诊断主要是根据典型的临床表现，心电图的改变及实验室酶学检查。但相当一部分心肌梗死病人临床表现不明显，早期心电图无明显改变。在这种情况下，心肌损伤特异性标志物的应用对AMI的早期确诊就起到了关键的作用。

理想的心肌标志物应具备以下特点才能满足临床的需求，为临床快速、准确提供诊断依据。1)高特异性，即该种物质仅存于心肌中，它在血中浓度的升高或降低只能提示心肌有改变。2)高灵敏性，即在心肌受到损伤的早期或心肌有微小的损伤就能检测到该种物质的改变。3)在血液中持续的时间长，如果一过性出现或在血液中存在较短的时间，很难抓住合适的时机检测到阳性结果，容易造成漏诊。4)检测方法简便，易操作，结果及早回报，便于临床医生尽早诊断和及时治疗。

心肌损伤时的血中生化标志物检测异常，是急性心肌梗死(AMI)的重要诊断指标之一。随着科学研究的进展，临床实践中已陆续发现多种反映心肌损伤的标志物，包括反映心肌缺血损伤的标志物：如缺血修饰蛋白，髓过氧化物酶，CD40配体等；心肌缺血坏死的标志物：如肌红蛋白，脂肪酸结合蛋白；心肌组织损伤的确定性标志物：如肌钙蛋白等。现在心肌损伤的血液生化标志物已从最早的以酶活性为主的检测发展到目前以蛋白浓度为主的检测。

肌红蛋白(Mb)存在于心肌和骨骼肌中，虽特异性不高，但是有较高的灵敏性。尽管如此，肌红蛋白在胸痛发作后头几个小时，比CK和CKMB活性敏感性更高，它常于胸痛发作后2～4h开始升高，AMI发作后6～10h，仍可检测到。肌红蛋白对于因胸痛入院需除外AMI的患者是一种非常好的标志物。如果胸痛发作后8h肌红蛋白仍在正常范围，则可排除AMI之诊断。且Mb的半衰期(T_1/2)短，有助于观察病程中有无再梗死的发生以及梗死有无扩展。Mb还是AMI溶栓治疗中评价再灌注与否的较敏感而准确的指标，早期检测Mb可排除AMI。

由于Mb特异性差，所以检测出Mb阳性还需进一步检测CK-MB和肌钙蛋白I。CK-MB是CK的同工酶，仅存在于心肌中。它的检测方法很多，但会受到很多因素影响；CK-MB质量是测定其蛋白浓度，避免了活性测定中的干扰而且具有高度的敏感性(最低检测限≤1ug)和准确性，测定时间短(最短仅需7min)，已被广泛使用。

近年来的临床实践证实，心肌肌钙蛋白I(cTnI)是目前临床上敏感性和特异性最好的心肌损伤标志物，已成为心肌损伤(心肌梗死)最重要的诊断依据。当心肌细胞膜的完整性受破坏，cTnI先从胞浆内释放，因此血清水平很快升高，而结合的cTnI由于相对分子质量大，从心肌细胞结构蛋白缓慢持续的释放，心肌损伤后4～6h释放入血，达到诊断决定值。心肌缺血症状发作后14～36h出现高峰，高峰出现时间与血中CK、CK-MB相似。持续3～7天，部分病例14天时仍可测到。

目前肌红蛋白、CK-MB和cTnI的检测多采用化学发光法，用化学发光物质标记后作为检测抗体，大大提高了测定的精确性和敏感性，但需要昂贵的检测设备，不利于临床推广，尤其是基层医院的应用。目前的床旁检测方法(胶体金试纸法)，虽能满足临床快速和多个心肌标记物联合检测的要求，尤其是符合基层医院需求，但因其只是定性检测，不能满足临床诊断准确定量的要求，无法对AMI的病程起到很好的疗效监测作用。因此，建立一种检测时间尽量缩短，并且检测除了能在实验室进行外，还要求能够进行床旁检测，并能同时定量测定多个心肌标记物的检测方法，从而为临床提供准确的诊断依据，是十分必要的。

发明内容

为解决上述的现有技术的不足，本发明将荧光素发光材料与免疫层析技术相结合，提供了一种试纸条组件以检测人体内多种蛋白水平，所述的多种蛋白为肌红蛋白/肌酸激酶同工酶/肌钙蛋白I，本发明只需要配套常规的专用荧光检测仪即可同时检测肌红蛋白/肌酸激酶同工酶/肌钙蛋白I，其制作成本低廉，操作简单、快速、灵敏，且特异性好，对于心脑血管事件发生的预防有极为重要的意义。

具体的，为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

本发明提供一种快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件，是由底衬和底衬上的依次接合的吸水垫、包被分析膜、样品垫组成的试纸条和独立包装的荧光素标记特异抗体组合而成；所述包被分析膜上有三条检测线和一条质控线，所述的包被分析膜上的三条检测线分别包被一条抗肌红蛋白单克隆抗体线、一条抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体线和一条肌钙蛋白I单克隆抗体线，所述质控线包被兔IgG抗体；所述独立包装的荧光素标记特异抗体为分别独立包装的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体和抗兔IgG抗体。

优选地，所述试纸条的所述底衬一面涂覆黏胶或双面胶，用于固定所述的吸水垫、包被分析膜及样品垫，其中，包被分析膜粘附在所述底衬的中间，两侧分别与所述吸水垫和样品垫连接。

优选地，所述试纸条的所述吸水垫为一种滤纸，所述滤纸为吸水纸或滤油纸；所述吸水垫粘附在所述在底衬上，同时吸水垫与分析膜重叠1-2mm连接。

优选地，所述试纸条组件的所述包被分析膜由硝酸纤维素膜组成。

优选地，所述试纸条的所述样品垫为用PH为7.2的含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、0.01％-0.05％表面活性剂的0.02M磷酸盐缓冲液缓浸泡过的玻璃纤维膜，样品垫与包被分析膜重叠1-2mm连接。

优选地，所述独立包装的荧光素标记特异抗体混合物为抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、5％-20％甘油、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料瓶密封包装。

优选地，所述的独立包装的荧光素标记的激发光光源范围为390-420nm，发射光波长范围为600nm-700nm，所述荧光素为铂卟啉。

一种制备上述的快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，其包括以下步骤：

1)抗体的制备：

选用纯化的基因工程表达的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG抗体；

2)包被分析膜的制备：

采用喷膜机分别在一硝酸纤维膜上划检测线和质控线；

用检测线包被缓冲液分别稀释抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体至浓度为5-20ug/ml，用质控线包被缓冲液稀释抗兔IgG抗体至浓度为5-20ug/ml，其中，抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体分别通过喷膜机喷印在对应的检测线上，抗兔IgG抗体通过喷膜机喷印在质控线上，将喷膜后的硝酸纤维膜放入30-50℃的真空干燥箱内，干燥20-30分钟后取出密封备用；

3)样品垫的制备：

用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液浸泡，缓冲液PH为7.2-7.6，浸泡处理后，将样品垫放入65℃的真空干燥箱内，干燥40-60分钟后取出密封备用；

4)免疫荧光试纸条的制备：

按照反应顺序，先将包被分析膜粘附在底衬中间位置上，在包被分析膜一侧粘附吸水垫，二者重叠1-2mm；在包被分析膜另一侧粘附样品垫，二者重叠1-2mm；再将黏贴好包被分析膜、吸水垫和样品垫的底衬裁切成细条；

5)荧光素标记抗体的制备：

将抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体、和抗兔IgG抗体，分别用0.05-0.2M pH为9.5-11.0的碳酸氢钠溶液稀释至1-2mg/ml，分别加入适量的铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1-2小时，孵育过程中每隔15-20分钟分别混匀一次；最后分别用规格型号为G25的凝胶柱过柱分离纯化，分别收集荧光素标记好的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体、和抗兔IgG抗体，各自用0.01-0.1M pH、7.2-7.6磷酸盐缓冲液稀释混匀后于-20℃保存；

6)独立包装的荧光素标记特异抗体工作液的制备：

按照需要取适当浓度的荧光素标记的抗肌红蛋白单克隆抗体或抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体或抗肌钙蛋白I单克隆抗体分别和抗兔IgG抗体混合，采用含5％-20％甘油、1％-5％牛血清白蛋白、0.01-0.5％聚乙二醇、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液一并稀释，分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖，其中每个塑料试剂瓶的分装量为0.3-3ml，统一在2-8℃下保存。

优选地，所述2)中的检测线包被缓冲液的制备方法是：用50mM pH7.6磷酸盐缓冲液，含甲醇0.8％、蔗糖1％、牛血清蛋白0.6％的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体的浓度至1mg/m；质控线包被缓冲液的制备方法是：用50mMpH7.6的聚丁烯缓冲液稀释，含甲醇0.7％、牛血清蛋白0.5％的兔IgG抗体的浓度至0.5mg/ml；包被分析膜的制备：调试喷膜机，膜液量为20ul/40cm，机器划线，检测线与质控线间隔5mm，划线细致均匀，放置25℃-37℃真空干燥箱处理1.5小时，装袋密封备用。

优选地，所述荧光素标记抗体的制备中，标记抗肌红蛋白单克隆抗体3、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体和抗兔IgG抗体的铂卟啉标记的铂卟啉溶解液为30mg-50mg。

优选地，样品垫的制备中用含0.5％聚乙二醇、1.6％牛血清白蛋白、0.01％表面活性剂的0.02M磷酸盐缓冲液浸泡，将浸泡后的样品垫放入65℃的真空干燥箱内，干燥40-60分钟后取出密封备用。

一种由上述的快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件，其包括试纸条组件、用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的盖板和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的背板组成的卡盒，所述背板包括放置所述试纸条组件的卡槽和用于与所述盖板结合的卡齿，所述盖板包括可观测检测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔和用于与所述背板的卡齿结合的固定，所述试纸条组件通过所述卡齿与所述固定孔结合而嵌合在所述背板和所述盖板之间，其中，所述包被分析膜正对所述检测窗，所述样品垫正对所述加样孔；另外，独立包装的荧光素标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。

一种制备上述的快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件的方法，其包括以下步骤：

1)制成背板和盖板：

用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材质制成背板和盖板，所述背板包括放置所述试纸条组件的卡槽和用于与所述盖板结合的卡齿，所述盖板包括可测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔以及用于与所述背板的卡齿(14)结合的固定孔；

2)组装：

将试纸条组件放在所述背板的所述卡槽内，通过所述背板的卡齿与所述盖板的固定孔结合，将试纸条组件嵌合在背板和盖板之间，其中，包被分析膜正对所述检测窗，样品垫正对所述加样孔；另外，独立包装的荧光素标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。

3)包装：

将1人份的检测卡组件与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备1瓶独立包装的荧光素标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的荧光素标记特异抗体装入一个包装盒，在2℃-8℃环境下避光不冻存的进行保存。

本发明具有以下有益之处：

1、本发明采用免疫荧光快速检测技术，利用荧光的高灵敏特点，且样品与荧光标记抗体在试剂瓶内反应后再加入检测卡。由于样品与荧光标记抗体在液相中全面接触，反应充分，因此可大幅度提高反应灵敏度，同时增加了样品的稀释倍数，去除了样品的基质效应，使定量结果有很好的可重复性，而且此方法省略了直接加样步骤，提高了定量结果的精密度和准确度，可满足同时定量测定多个心肌标记物的临床诊断要求。

2、应用本发明提供的试纸条定量、联合测定人体内多种蛋白水平，成本低廉，操作简单、快速、灵敏，且特异性好，只需要配套专用荧光检测仪，因此可广泛应用于各级医疗检验场所，尤其是基层医疗机构，包括乡镇卫生院等均可开展，其对于心脑血管事件发生的预防有极为重要的意义。

附图说明

下面结合附图中的实施例对本发明作进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制。

图1是本发明试纸条的结构示意图。

图2是本发明检测卡的结构示意图。

图3是铂卟啉发光材料的发射光谱曲线。

图4为本发明的反应方式示意图。

图5为本发明的检测结果示意图；

其中，图a为本发明的有效检测结果示意图；

图b为本发明的无效检测结果示意图；

图6为本发明的多种蛋白检测标准工作曲线。

图7为本发明的多种蛋白检测结果相关性分析曲线。

图中：底衬1、吸水垫2、包被分析膜3、检测线4、质控线5、样品垫6、加样孔7、检测窗8、项目名称9、固定孔10、盖板11、卡槽12、背板13、卡齿14、铂卟啉标记特异抗体15、多种蛋白16、检测线抗多种蛋白单克隆抗体17、质控线兔IgG抗体18。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

实施例1：

参阅图1所示，本发明的一种快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件，是由底衬1和底衬1上的依次接合的吸水垫2、包被分析膜3、样品垫6组成的试纸条和独立包装的荧光素标记特异抗体组合而成；所述包被分析膜3上有三条检测线4和一条质控线5，所述的包被分析膜上的三条检测线4分别包被一条抗肌红蛋白单克隆抗体线、一条抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体线和一条肌钙蛋白I单克隆抗体线，所述质控线5包被兔IgG抗体；所述独立包装的荧光素标记特异抗体为分别独立包装的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体和抗兔IgG抗体。

试纸条的底衬1一面涂覆黏胶或双面胶，用于固定吸水垫2、包被分析膜3及样品垫6；吸水垫2为一种滤纸，该滤纸为吸水纸或滤油纸；包被分析膜3由硝酸纤维素膜组成；样品垫为磷酸盐缓冲液缓浸泡过的玻璃纤维膜。

独立包装的铂卟啉标记特异抗体15为为抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体和抗兔IgG抗体，用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、5％-20％甘油、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料瓶密封包装。

一种制备上述的快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，其包括以下步骤：

1)抗体的制备：

选用纯化的基因工程表达的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG；

2)包被分析膜3的制备：

采用喷膜机分别在一硝酸纤维膜上划检测线4和质控线5；

用检测线包被缓冲液分别稀释抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体至浓度为5-20ug/ml，用质控线包被缓冲液稀释抗兔IgG抗体至浓度为5-20ug/ml，其中，抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体分别通过喷膜机喷印在对应的检测线4上，抗兔IgG抗体通过喷膜机喷印在质控线5上，将喷膜后的硝酸纤维膜放入30-50℃的真空干燥箱内，干燥20-30分钟后取出密封备用；

3)样品垫6的制备：

用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液浸泡，缓冲液PH为7.2-7.6，浸泡处理后，将样品垫6放入65℃的真空干燥箱内，干燥40-60分钟后取出密封备用；

4)免疫荧光试纸条的制备：

按照反应顺序，先将包被分析膜3粘附在底衬1中间位置上，在包被分析膜3一侧粘附吸水垫2，二者重叠1-2mm；在包被分析膜3另一侧粘附样品垫6，二者重叠1-2mm；再将黏贴好包被分析膜3、吸水垫2和样品垫6的底衬1裁切成细条；

5)荧光素标记抗体的制备：

将抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体、和抗兔IgG抗体，分别用0.05-0.2M pH、9.5-11.0碳酸氢钠溶液稀释至1-2mg/ml，分别加入适量的铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1-2小时，孵育过程中每隔15-20分钟分别混匀一次；最后分别用规格型号为G25的凝胶柱过柱分离纯化，分别收集荧光素标记好的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体、和抗兔IgG抗体，各自用0.01-0.1M pH、7.2-7.6磷酸盐缓冲液稀释混匀后于-20℃保存；

6)独立包装的荧光素标记特异抗体工作液的制备：

按照需要取适当浓度的荧光素标记的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体和抗兔IgG抗体混合，采用含5％-20％甘油、1％-5％牛血清白蛋白、0.01-0.5％聚乙二醇、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液一并稀释，分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖，其中每个塑料试剂瓶的分装量为0.3-3ml，统一在2-8℃下保存。

参阅图2所示，一种由快速定量、联合测定肌红蛋白/肌酸激酶同工酶/肌钙蛋白I的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件，其包括试纸条、由用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的盖板11和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的背板13组成的卡盒。所述背板13包括放置试纸条的卡槽12和用于与盖板结合的卡齿14；所述盖板11包括可观测检测结果的检测窗8、可滴加样品的加样孔7和用于与背板13的卡齿14结合的固定孔10。所述试纸条通过所述卡齿14与所述固定孔10结合而嵌合在所述背板13和所述盖板11之间，即形成了检测卡。其中，所述包被分析膜3正对所述检测窗8，所述样品垫6正对所述加样孔7；另外，独立包装的铂卟啉标记特异抗体15分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。

本发明提供一种制备快速定量、联合测定肌红蛋白/肌酸激酶同工酶/肌钙蛋白I的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件的方法，其包括以下步骤：

1)制成背板和盖板：

用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材质制成背板和盖板，所述背板包括放置所述试纸条组件的卡槽和用于与所述盖板结合的卡齿，所述盖板包括可观测结果的检测窗、可滴加样品的加样孔以及用于与所述背板的卡齿结合的固定孔；

2)组装：

将试纸条放在所述背板的所述卡槽内，通过所述背板的卡齿与所述盖板的固定孔结合，将试纸条组件嵌合在背板和盖板之间，其中，包被分析膜正对所述检测窗，样品垫正对所述加样孔。另外，独立包装的荧光素标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。

3)包装：

将1人份的检测卡与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备1瓶独立包装的铂卟啉标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的铂卟啉标记特异抗体装入一个包装盒，在2℃-8℃环境下避光不冻存的进行保存。

检测原理：

参阅图3所示，铂卟啉发光材料的发射光谱曲线进行分析，发现铂卟啉所具有的特征光谱的激发光光源范围为390-420nm，发射光波长范围为600-700nm。由于铂卟啉发光标记物的特点，使得以其作为标记物的免疫荧光试纸条可与仪器结合，使得基于铂卟啉发光技术的免疫层析试纸条可进行灵敏度极高的多重分析、且对目标被检测物进行灵敏度极高的精确定量检测。

另外，本发明的快速定量检测肌红蛋白、肌酸激酶同工酶及肌钙蛋白I的免疫荧光试纸条及检测卡，利用荧光的高灵敏特点，使待测样品与铂卟啉标记先在试剂瓶内反应，由于待测样品与铂卟啉标记在液相中全面接触，反应充分，因此可大幅度提高反应灵敏度，同时增加了待测样品的稀释倍数，去除了待测样品的基质效应，使定量结果有很好的可重复性；而且铂卟啉标记上的特异抗体与待测样品充分结合形成一复合物，然后将复合物转加到检测卡的加样孔7的样品垫6上，实现铂卟啉发光材料与免疫层析技术相结合从而检测人体内肌红蛋白、肌酸激酶同工酶及肌钙蛋白I的水平。如图4所示，当复合物加到检测卡的加样孔7的样品垫6上后，在吸水垫2的吸力下铂卟啉标记抗体15流经到检测卡中的包被分析膜3上，如果该复合物具有肌红蛋白、肌酸激酶同工酶及肌钙蛋白I，其能被检测线4上的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体及抗肌钙蛋白I单克隆抗体17捕获，在绿色光照射下以红外光光信号的形式表现出来，所发出的荧光可用专用仪器定量测定，荧光强度与样品中肌红蛋白、肌酸激酶同工酶及肌钙蛋白I的浓度成正比。如果复合物中肌红蛋白、肌酸激酶同工酶及肌钙蛋白I低于最低检测标准，则检测线4不会发出荧光。另外，参阅图5中的a图和b图，在试纸条有效的情况下，质控线5发光的同时，至少有一条检测线4会发光，试纸条呈阳性；只有质控线未发光，则试纸条检测结果无效。

本发明标准工作曲线：

首先，将提纯的肌红蛋白、肌酸激酶同工酶及肌钙蛋白标准品用1∶10稀释的正常人血清(采用pH7.20.02M PB缓冲液稀释)作为稀释液配制系列浓度标准品，浓度为：0ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的6份样品。其次，每个样品分别用10个MA试纸条检测10次，10次检测仪器判读的样品检测T值和对照C值分别取平均值，最终根据二者的比值得出每个浓度对应的T/C结果，列于表1。

表1、不同浓度下的T/C值

以T/C值作为X坐标，以本发明中的肌红蛋白、肌酸激酶同工酶及肌钙蛋白浓度作为Y坐标绘制标准工作曲线，经统计拟合标准工作曲线的表达式为：Y＝0.6919X+1.5387，拟合系数的平方为R²＝0.999。结果见图6：本发明检测标准工作曲线。

实施例2：

本实施例的制备方法与实施例一基本相同，不同点在于：

步骤2中，用50mM pH7.6磷酸盐缓冲液，含甲醇0.8％、蔗糖1％、牛血清蛋白0.6％的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体的浓度至1mg/m；质控线包被缓冲液的制备方法是：用50mM pH7.6的聚丁烯缓冲液稀释，含甲醇0.7％、牛血清蛋白0.5％的兔IgG抗体的浓度至0.5mg/ml；包被分析膜的制备：调试喷膜机，膜液量为20ul/40cm，机器划线，检测线与质控线间隔5mm，划线细致均匀，放置25℃-37℃真空干燥箱处理1.5小时，装袋密封备用。

实施例3：

本实施例的制备方法与实施例一基本相同，不同点在于：

步骤3中，将抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，各取5ml抗体溶液，分别加入40mg荧光材料铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1.5小时，每隔15分钟混匀一次。最后用规格型号为G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的荧光素标记抗体，用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、5％-20％甘油、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料瓶密封包装，于4℃保存。

实施例4：

本实施例的制备方法与实施例一基本相同，不同点在于：

步骤3中，将抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体和抗兔IgG抗体，分别用0.1M碳酸氢钠溶液稀释至1mg/ml，各取5ml抗体溶液，分别加入50mg荧光材料铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育2小时，每隔15分钟混匀一次。最后用规格型号为G25凝胶柱过柱分离纯化，收集标记好的荧光素标记抗体，用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、5％-20％甘油、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01M磷酸盐缓冲液稀释，用塑料瓶密封包装，于4℃保存。

实施例5：

本实施例的制备方法与实施例一基本相同，不同点在于：

步骤4中，用含0.5％聚乙二醇、1.6％牛血清蛋白、0.01％表面活性剂的0.02M磷酸盐缓冲液，将浸泡印后的样品垫放入65℃的真空干燥箱内，干燥40-60分钟后取出密封备用。

对实施例1-5的试纸条进行性能方面的测定，最低检测限为0.01ng/ml。同时对临床样品进行检测。将58例收集自医院的肌红蛋白、肌酸激酶同工酶及肌钙蛋白临床样品(其中阳性37份，阴性21份)同时用胶体金免疫层析试纸与本系统进行双盲法检测：

胶体金免疫层析试纸法——31份阳性，27份阴性(即6份阳性漏检)；

铂卟啉试纸与仪器法——37份阳性，21份阴性，与实际结果完全吻合。同时，与胶体金免疫层析试纸的定性检测相比，铂卟啉试纸与仪器法给出了每份样品的最终准确浓度。

将此58例收集自医院的肌红蛋白、肌酸激酶同工酶及肌钙蛋白临床样品，同时与化学发光法检测进行相关性分析，以化学发光检测结果作为X坐标，铂卟啉试纸与仪器法结果作为Y坐标绘制相关性分析曲线，表达式为Y＝0.9993X-2.6157，相关性系数为r＝0.9988。分析结果见图7：本发明检测结果相关性分析曲线。按照统计学分析，r＞95％，P＜0.01，具有正相关关系。

在批内精密度方面，利用实施例1-5的试纸条，对含量分别为高值、中值和低值的样品，连续进行至少10次检测，计算变异系数(CV)。对于肌红蛋白、肌酸激酶同工酶及肌钙蛋白含量高值(200ng/ml)、中值(90ng/ml)、低值(15ng/ml)样品各一份分别测定10次，根据其测定的数据，采用SPSS统计方法分析，以测定结果均值±标准差表示，高值201.8±2.7ng/ml，CV2.3％；中值89.6±1.3ng/ml，CV5.2％；低值15.1±1.2ng/ml，CV7.9％；检测结果CV值均小于15％。

在批间精密度方面，利用实施例1-5的试纸条，对一份肌红蛋白、肌酸激酶同工酶及肌钙蛋白临床阳性样品用pH7.20.02M PB缓冲液稀释10倍，联系进行至少10次检测，结果列于表2。计算该份样品重复检测的变异系数(CV)为1.83％。

表2为本发明的实施例的检测值

重复检测序号	1	2	3	4	5
						T/C	36.70	35.40	37.80	36.85	38.10
MA浓度(ng/ml)	30.0	29.5	31.0	30.0	31.5
						重复检测序号	6	7	8	9	10
T/C	35.45	38.20	37.60	34.75	34.80
						MA浓度(ng/ml)	29.5	31.5	31.0	29.0	29.0

有上述检测可见，本发明检测方法具有更高的灵敏度，且在实现精确定量检测的同时具有很好地稳定性。

以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。本技术领域的普通技术人员依据以上实施例对本发明公开的内容和各项参数所取范围作出适当的修改和变动，均属于本发明的保护范围。

Claims (13)

1.一种快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件，所述的多种蛋白为肌红蛋白/肌酸激酶同工酶/肌钙蛋白I，其特征在于：所述试纸条组件是由底衬(1)和底衬(1)上的依次接合的吸水垫(2)、包被分析膜(3)、样品垫(6)组成的试纸条和独立包装的荧光素标记特异抗体组合而成；所述包被分析膜(3)上有三条检测线(4)和一条质控线(5)，所述的包被分析膜上的三条检测线(4)分别包被一条抗肌红蛋白单克隆抗体线、一条抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体线和一条肌钙蛋白I单克隆抗体线，所述质控线(5)包被兔IgG抗体；所述独立包装的荧光素标记特异抗体为分别独立包装的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体和抗兔IgG抗体。

2.根据权利要求1所述快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述试纸条的所述底衬(1)一面涂覆黏胶或双面胶，用于固定所述的吸水垫(2)、包被分析膜(3)及样品垫(6)，其中，包被分析膜粘附在所述底衬(1)的中间，两侧分别与所述吸水垫(2)和样品垫(6)连接。

3.根据权利要求1或2所述快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述试纸条的所述吸水垫(2)为一种滤纸，所述滤纸为吸水纸或滤油纸；所述吸水垫(2)粘附在所述在底衬(1)上，同时吸水垫(2)与分析膜(3)重叠1-2mm连接。

4.根据权利要求1或2所述快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述试纸条组件的所述包被分析膜(3)由硝酸纤维素膜组成。

5.根据权利要求1或2快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述试纸条的所述样品垫(6)为用PH为7.2的含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、0.01％-0.05％表面活性剂的0.02M磷酸盐缓冲液浸泡过的玻璃纤维膜，样品垫(6)与包被分析膜(3)重叠1-2mm连接。

6.根据权利要求1或2所快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于：所述独立包装的荧光素标记特异抗体混合物为抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体和抗兔IgG抗体，并分别用含如下组分的0.01M磷酸盐缓冲液稀释后用塑料瓶密封而得：0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、5％-20％甘油、0.01％-0.05％表面活性剂。

7.根据权利要求1所述快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件，其特征在于，所述的独立包装的荧光素标记的激发光光源范围为390-420nm，发射光波长范围为600nm-700nm，所述荧光素为铂卟啉。

8.一种制备权利要求1所述的快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)抗体的制备：

选用纯化的基因工程表达的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体、抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG，抗兔IgG抗体和纯化的兔IgG直接反应结合；

2)包被分析膜的制备：

采用喷膜机分别在一硝酸纤维膜上划检测线(4)和质控线(5)；

用检测线包被缓冲液分别稀释抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体至浓度为5-20ug/ml，用质控线包被缓冲液稀释兔IgG抗体至浓度为5-20ug/ml，其中，抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体分别通过喷膜机喷印在对应的检测线(4)上，兔IgG抗体通过喷膜机喷印在质控线(5)上，将喷膜后的硝酸纤维膜放入30-50℃的真空干燥箱内，干燥20-30分钟后取出密封备用；

3)样品垫(6)的制备：

用含0.01％-0.5％聚乙二醇、1％-5％牛血清白蛋白、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液浸泡，缓冲液PH为7.2-7.6，浸泡处理后，将样品垫(6)放入65℃的真空干燥箱内，干燥40-60分钟后取出密封备用；

4)免疫荧光试纸条的制备：

按照反应顺序，先将包被分析膜(3)粘附在底衬(1)中间位置上，在包被分析膜(3)一侧粘附吸水垫(2)，二者重叠1-2mm；在包被分析膜(3)另一侧粘附样品垫(6)，二者重叠1-2mm；再将黏贴好包被分析膜(3)、吸水垫(2)和样品垫(6)的底衬(1)裁切成细条；

5)荧光素标记抗体的制备：

将抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体、和抗兔IgG抗体，分别用0.05-0.2M pH、9.5-11.0碳酸氢钠溶液稀释至1-2mg/ml，分别加入适量的铂卟啉溶解液，搅匀，室温孵育1-2小时，孵育过程中每隔15-20分钟分别混匀一次；最后分别用规格型号为G25的凝胶柱过柱分离纯化，分别收集荧光素标记好的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体、和抗兔IgG抗体，各自用0.01-0.1M pH、7.2-7.6磷酸盐缓冲液稀释混匀后于-20℃保存；6)独立包装的荧光素标记特异抗体工作液的制备：

按照需要取适当浓度的荧光素标记的抗肌红蛋白单克隆抗体或抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体或抗肌钙蛋白I单克隆抗体分别和抗兔IgG抗体混合，采用含5％-20％甘油、1％-5％牛血清白蛋白、0.01-0.5％聚乙二醇、0.01％-0.05％表面活性剂的0.01-0.1M磷酸盐缓冲液一并稀释，分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖，其中每个塑料试剂瓶的分装量为0.3-3ml，统一在2-8℃下保存。

9.如权利要求8所述的制备权利要求1所述的快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于：检测线包被缓冲液的制备方法是：用50mM pH7.6磷酸盐缓冲液，含甲醇0.8％、蔗糖1％、牛血清蛋白0.6％的抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体的浓度稀释至1mg/m；质控线包被缓冲液的制备方法是：用50mM pH7.6的聚丁烯缓冲液稀释，含甲醇0.7％、牛血清蛋白0.5％的兔IgG抗体的浓度至稀释0.5mg/ml；包被分析膜的制备：调试喷膜机，膜液量为20ul/40cm，机器划线，检测线与质控线间隔5mm，划线细致均匀，放置25℃-37℃真空干燥箱处理1.5小时，装袋密封备用。

10.如权利要求8所述的制备权利要求1所述的快速定量、联合测定多种蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于：荧光素标记抗体的制备中，标记抗肌红蛋白单克隆抗体、抗肌酸激酶同工酶单克隆抗体、抗肌钙蛋白I单克隆抗体和抗兔IgG抗体的铂卟啉标记的铂卟啉溶解液为30mg-50mg。

11.如权利要求8所述的制备权利要求1所述的快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件的方法，其特征在于：样品垫(6)的制备中，用含0.5％聚乙二醇、1.6％牛血清白蛋白、0.01％表面活性剂的0.02M磷酸盐缓冲液浸泡，将浸泡后的样品垫放入65℃的真空干燥箱内，干燥40-60分钟后取出密封备用。

12.一种由权利要求1所述的快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡组件，其特征在于：所述检测卡组件包括试纸条组件、用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的盖板(11)和用聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的背板(13)组成的卡盒，所述背板(13)包括放置所述试纸条组件的卡槽(12)和用于与所述盖板(11)结合的卡齿(14)，所述盖板(11)包括可观测检测结果的检测窗(8)、可滴加样品的加样孔(7)和用于与所述背板的卡齿(14)结合的固定(10)，所述试纸条组件通过所述卡齿(14)与所述固定孔(10)结合而嵌合在所述背板(13)和所述盖板(11)之间，其中，所述包被分析膜(3)正对所述检测窗(8)，所述样品垫(6)正对所述加样孔(7)；另外，独立包装的荧光素标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。

13.一种制备权利要求8所述的快速定量检测多种蛋白的免疫荧光试纸条组件制成的检测卡

组件的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制成背板(13)和盖板(11)：

用聚苯乙烯或聚氯乙烯等塑料材质制成背板(13)和盖板(11)，所述背板(13)包括放置所述试纸条组件的卡槽(12)和用于与所述盖板(11)结合的卡齿(14)，所述盖板(11)包括可测结果的检测窗(8)、可滴加样品的加样孔(7)以及用于与所述背板的卡齿(14)结合的固定孔(10)；另外，独立包装的荧光素标记特异抗体分装在塑料试剂瓶中并密封瓶盖。

2)组装：

将试纸条组件放在所述背板(13)的所述卡槽内(12)，通过所述背板(13)的卡齿(14)与所述盖板(11)的固定孔(10)结合，将试纸条组件嵌合在背板(13)和盖板(11)之间，其中，包被分析膜(3)正对所述检测窗(8)，样品垫(6)正对所述加样孔(7)；

3)包装：

将1人份的检测卡组件与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，并配备1瓶独立包装的荧光素标记特异抗体，将多组所述铝箔塑料袋和所述独立包装的荧光素标记特异抗体装入一个包装盒，在2℃-8℃环境下避光不冻存的进行保存。

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