CN106950381A - 一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒 - Google Patents

一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒，包括：工作微球探针溶液、人cTn I系列梯度标准品溶液、人CK‑MB系列梯度标准品溶液、人MYO系列梯度标准品溶液，三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液；100×稀释的链霉亲和素藻红蛋白溶液和200×稀释的生物素化鼠抗人二抗IgG溶液；本发明的试剂盒建立了AMI生物标志物的高通量检测方法，可对cTn I、CK‑MB和MYO同时进行快速检测，时间小于2h，适用于AMI的早期诊断、发现，提高对AMI的诊断率，并可在AMI早期筛查、病情监测、疗效观察与复发判断预测等各阶段都具有较高的临床检验应用价值。

Description

一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测生物标志物的试剂盒，特别是涉及一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒。
背景技术
冠心病中主要导致患者死亡最重要的因素之一是急性心肌梗死(AcuteMyocardial Infarction,AMI),是严重危害人类健康的心血管疾病[1]。AMI是在冠状动脉病变基础上，发生冠状动脉血供急剧减少或中断，使得相应的心肌严重而持久地急性缺血导致而心肌短时间内坏死[2]。因此，在AMI发病早期及时诊断并进行再灌注治疗能明显降低死亡率，改善预后。根据中华医学会心血管分会制定的诊断标准，至少应当满足缺血性胸痛等临床症状、动态心电图变化和心肌坏死标志物血清浓度动态改变这3项诊断标准中的2项，强调了实验室检查对于诊断AMI的重要性[3]。
在诊断AMI时，血清学诊断凭借其特异度及灵敏度占有重要位置，但单一的心脏标志物检测有时并不能在两方面达到理想的效果，因此临床上探讨采用多个标志物联合检测，互补不足，使诊断的特异度及灵敏度均达到较高水平，以达到准确诊断的目的。目前，诊断和排除AMI应用最多的生化指标是cTnI、CK-MB和MYO[4]，在发生AMI后，由于这三种物质释放到血液的时间和达到峰值的时间各不相同，因此可通过这三项指标的联合检测来达到互补，以提高AMI的快速诊断率[5]。心肌标志物的检测方法主要有金标层析法、酶联免疫法、化学发光法和生物芯片法，但临床应用中发现各种方法之间差异很大[6]，各有所长。
随着生物芯片技术的发展，高通量悬浮芯片技术逐渐兴起。它也被称为多功能多指标同步分析系统(flexible multiple-analyte profiling，)、多功能悬浮阵列(multi-analyte suspension arrays，MASA)或液体芯片(liquid chip)。2001年12月美国食品药品监督管理局(FDA)已批准将其用于临床进行自身免疫病、人类白细胞抗原分型的诊断，这是唯一被美国FDA批准用于临床诊断的生物芯片产品[7]。
目前，尚未有可同时对肌钙蛋白T I(cardiac troponin I,cTn I)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)和肌红蛋白(myoglobin,MYO)进行快速联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现技术的不足，提供一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒。
本发明的技术方案概述如下：
一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒，包括：工作微球探针溶液、人cTn I系列梯度标准品溶液、人CK-MB系列梯度标准品溶液、人MYO系列梯度标准品溶液，三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液；100×稀释的链霉亲和素藻红蛋白溶液和200×稀释的生物素化鼠抗人二抗IgG溶液；
所述工作微球探针溶液用下述方法制成：
(1)取编码为35,42和52号的羧基荧光编码微球分别置于三支的离心管中，用100μL pH 7.4的PBS重悬后，使所述羧基荧光编码微球的浓度为1.25×107个微球/mL，分别加入100μL pH 8.0 0.1mol/L的PBS，分别加入新鲜配制的10μL浓度为50mg/mL的EDC水溶液和10μL浓度为50mg/mL的S-NHS水溶液，室温下搅拌10-30min，使羧基荧光编码微球活化；
所述EDC为1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐的简称；
所述S-NHS为N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐的简称；
(2)在装有活化后的35号羧基荧光编码微球的离心管中加入10μg cTn I；在装有活化后的42号羧基荧光编码微球的离心管中加入10μg CK-MB；在装有活化后的52号羧基荧光编码微球的离心管中加入10μg MYO；分别加pH 7.4的PBS使终体积到500μL，室温下以500-800rpm旋涡混匀2-4h，以12,000-16,000g离心3-6min，弃去上清液；分别加入100μL封闭缓冲液重悬并封闭交联微球保持20min；离心，弃上清，用pH 7.4的PBS清洗；
所述cTn I为肌钙蛋白的简写；CK-MB为肌酸激酶同工酶的简写；MYO为肌红蛋白的简写；
所述封闭缓冲液为：PBS中含有1wt％BSA,0.05wt％叠氮钠，pH 7.4；
(3)分别用150μL储备缓冲液重悬步骤(2)获得的微球，用血球计数器确定浓度，用储备缓冲液稀释到3000个/μL，分别得到偶联有cTn I探针微球溶液、偶联有CK-MB探针微球溶液和偶联有MYO探针微球溶液；
(4)分别取偶联有cTn I探针微球溶液、偶联有CK-MB探针微球溶液和偶联有MYO探针微球溶液50μL，混合，得工作微球探针溶液，工作微球探针溶液中偶联有cTn I探针微球的浓度为1000个/μL，偶联有CK-MB探针微球的浓度为1000个/μL，偶联有MYO探针微球的浓度为1000个/μL，4℃储存；
所述储备缓冲液为PBS中含有0.1wt％BSA,0.02wt％吐温-20,0.05wt％叠氮钠,pH7.4。
优选地，人cTn I系列梯度标准品溶液是用pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制的浓度分别为0、0.013、0.064、0.32、1.6、8和40μg/L的溶液。
优选地，人CK-MB系列梯度标准品溶液是用pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制的浓度分别为0、0.064、0.32、1.6、8、40和200μg/L的溶液。
优选地，人MYO系列梯度标准品溶液是用pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制的浓度分别为0、0.16、0.8、4、20、100和500μg/L的溶液。
三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液用下述方法制成：
(1)取浓度为2mg/mL的cTn I单抗原液100μL，加pH＝7.4的PBS缓冲液，配成浓度为150μg/mL的cTn I单抗溶液；
(2)取浓度为1mg/mL的CK-MB单抗原液100μL，加pH＝7.4的PBS缓冲液，配成浓度为150μg/mL的CK-MB单抗溶液；
(3)取浓度为1mg/mL的MYO单抗原液100μL，加pH＝7.4的PBS缓冲液，配成浓度为150μg/mL的MYO单抗溶液；
(4)各取等体积步骤(1)、(2)和(3)获得的单抗溶液，混合，得到人cTn I单抗溶液浓度为50μg/mL，人CK-MB单抗溶液浓度为50μg/mL，人MYO单抗溶液浓度为50μg/mL的三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液；4℃储存。
优选地，100×稀释的链霉亲和素藻红蛋白中的稀释剂为pH＝7.4的PBS缓冲液。
优选地，200×稀释的生物素化鼠抗人二抗IgG中的稀释剂为pH＝7.4的PBS缓冲液。
本发明的试剂盒建立了AMI生物标志物的高通量检测，可对cTn I、CK-MB和MYO同时进行快速检测，时间小于2h，适用于AMI的早期诊断、发现，提高对AMI的诊断率，并可在AMI早期筛查、病情监测、疗效观察与复发判断预测等各阶段都具有较高的临床检验应用价值。
附图说明
图1为悬浮芯片检测三种AMI标志物标准曲线方程图。
具体实施方式
人cTn I标准品(Fitzgerald Biotech公司，货号:30R-AT033，100μg，5mg/mL溶于150mM NaCl，5mM CaCl2，20mM Tris，pH 7.5的缓冲液，来源:人类心肌)。
人CK-MB标准品(Fitzgerald Biotech公司，货号：30-1082，250μg，纯度>90％，5mg/mL溶于50％甘油、Tris缓冲液，pH 6.3-7.2，来源：人类心肌)。
人MYO标准品(Fitzgerald Biotech公司，货号：30-1005，1mg，纯度>95％，2mg/mL溶于50％甘油、150mM NaCl、10mM磷酸钠、0.05％叠氮化钠，pH值7的缓冲液，来源：人类心肌)
链霉亲和素藻红蛋白(Life Science公司，货号：S866，1mg/mL，纯度>99％)
生物素化鼠抗人二抗IgG(武汉博士德公司，货号：BM2001，生物素标记抗体含1mg左右亲和纯化特异性抗体，1：20的生物素标记，0.01M PBS,1％BSA,0.01％硫柳汞)
人cTn I单克隆抗体(Fitzgerald Biotech公司，货号：10R-T123M，1mg，2mg/mL溶于PBS、0.1％NaN3缓冲液，pH 7.5，来源：小鼠P45-10IgG 1)。
CK-MB单克隆抗体(Fitzgerald Biotech公司，货号：10R-3127-AF，1mg，1mg/mL溶于PBS缓冲液，pH 7.3，来源：小鼠M120222IgG 1κ)。
MYO单克隆抗体(Fitzgerald Biotech公司，货号：10-M50C，1mg，1mg/mL溶于PBS、0.1％NaN3缓冲液，pH 7.5，来源：小鼠IgG 1M0110519)。
在各实施例中：
EDC为1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐的简称；
S-NHS为N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐的简称；
cTn I为肌钙蛋白的简写；CK-MB为肌酸激酶同工酶的简写；MYO为肌红蛋白的简写；
封闭缓冲液为：PBS中含有1wt％BSA,0.05wt％叠氮钠，pH 7.4；
储备缓冲液为PBS中含有0.1wt％BSA,0.02wt％吐温-20,0.05wt％叠氮钠,pH7.4。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒，包括：工作微球探针溶液、人cTn I系列梯度标准品溶液、人CK-MB系列梯度标准品溶液、人MYO系列梯度标准品溶液，三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液；100×稀释的链霉亲和素藻红蛋白溶液和200×稀释的生物素化鼠抗人二抗IgG溶液；
所述工作微球探针溶液用下述方法制成：
(1)取编码为35,42和52号的羧基荧光编码微球分别置于三支的离心管中，用100μL pH 7.4的PBS重悬后，使所述羧基荧光编码微球的浓度为1.25×107个微球/mL，分别加入100μL pH 8.0 0.1mol/L的PBS，分别加入新鲜配制的10μL浓度为50mg/mL的EDC水溶液和10μL浓度为50mg/mL的S-NHS水溶液，室温下搅拌20min，使羧基荧光编码微球活化；
(2)在装有活化后的35号羧基荧光编码微球的离心管中加入10μg cTn I；在装有活化后的42号羧基荧光编码微球的离心管中加入10μg CK-MB；在装有活化后的52号羧基荧光编码微球的离心管中加入10μg MYO；分别加pH 7.4的PBS使终体积到500μL，室温下以700rpm旋涡混匀3h，以14,000g离心5min，弃去上清液；分别加入100μL封闭缓冲液重悬并封闭交联微球保持20min；离心，弃上清，用pH 7.4的PBS清洗；
(3)分别用150μL储备缓冲液重悬步骤(2)获得的微球，用血球计数器确定浓度，用储备缓冲液稀释到3000个/μL，分别得到偶联有cTn I探针微球溶液、偶联有CK-MB探针微球溶液和偶联有MYO探针微球溶液；
(4)分别取偶联有cTn I探针微球溶液、偶联有CK-MB探针微球溶液和偶联有MYO探针微球溶液50μL，混合，得工作微球探针溶液，工作微球探针溶液中偶联有cTn I探针微球的浓度为1000个/μL，偶联有CK-MB探针微球的浓度为1000个/μL，偶联有MYO探针微球的浓度为1000个/μL，4℃储存；
人cTn I系列梯度标准品溶液是用pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制的浓度分别为0、0.013、0.064、0.32、1.6、8和40μg/L的溶液。
人CK-MB系列梯度标准品溶液是用pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制的浓度分别为0、0.064、0.32、1.6、8、40和200μg/L的溶液。
人MYO系列梯度标准品溶液是用pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制的浓度分别为0、0.16、0.8、4、20、100和500μg/L的溶液。
三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液用下述方法制成：
(1)取浓度为2mg/mL的cTn I单抗原液100μL，加pH＝7.4的PBS缓冲液，配成浓度为150μg/mL的cTn I单抗溶液；
(2)取浓度为1mg/mL的CK-MB单抗原液100μL，加pH＝7.4的PBS缓冲液，配成浓度为150μg/mL的CK-MB单抗溶液；
(3)取浓度为1mg/mL的MYO单抗原液100μL，加pH＝7.4的PBS缓冲液，配成浓度为150μg/mL的MYO单抗溶液；
(4)各取567μL的步骤(1)、(2)和(3)获得的单抗溶液，混合，得到人cTn I单抗溶液浓度为50μg/mL，人CK-MB单抗溶液浓度为50μg/mL，人MYO单抗溶液浓度为50μg/mL的三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液；4℃储存。
100×稀释的链霉亲和素藻红蛋白中的稀释剂为pH＝7.4的PBS缓冲液。
200×稀释的生物素化鼠抗人二抗IgG中的稀释剂为pH＝7.4的PBS缓冲液。
实施例2
一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒，包括：工作微球探针溶液、人cTn I系列梯度标准品溶液、人CK-MB系列梯度标准品溶液、人MYO系列梯度标准品溶液，三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液；100×稀释的链霉亲和素藻红蛋白溶液和200×稀释的生物素化鼠抗人二抗IgG溶液；
所述工作微球探针溶液用下述方法制成：
(1)除室温搅拌时间为10min外，其它同实施例1的工作微球探针溶液制备方法中的步骤(1)；(2)在装有活化后的35号羧基荧光编码微球的离心管中加入10μg cTn I；在装有活化后的42号羧基荧光编码微球的离心管中加入10μg CK-MB；在装有活化后的52号羧基荧光编码微球的离心管中加入10μg MYO；分别加pH 7.4的PBS使终体积到500μL，室温下以500rpm旋涡混匀4h，以12,000g离心6min，弃去上清液；分别加入100μL封闭缓冲液重悬并封闭交联微球保持20min；离心，弃上清，用pH 7.4的PBS清洗；
(3)、(4)同实施例1的工作微球探针溶液制备方法中的步骤(3)、(4)。
人cTn I系列梯度标准品溶液是用pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制的浓度分别为0、0.013、0.064、0.32、1.6、8和40μg/L的溶液。
人CK-MB系列梯度标准品溶液是用pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制的浓度分别为0、0.064、0.32、1.6、8、40和200μg/L的溶液。
人MYO系列梯度标准品溶液是用pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制的浓度分别为0、0.16、0.8、4、20、100和500μg/L的溶液。
三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液的制备同实施例1的三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液的制备。
100×稀释的链霉亲和素藻红蛋白中的稀释剂为pH＝7.4的PBS缓冲液。
200×稀释的生物素化鼠抗人二抗IgG中的稀释剂为pH＝7.4的PBS缓冲液。
实施例3
一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒，包括：工作微球探针溶液、人cTn I系列梯度标准品溶液、人CK-MB系列梯度标准品溶液、人MYO系列梯度标准品溶液，三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液；100×稀释的链霉亲和素藻红蛋白溶液和200×稀释的生物素化鼠抗人二抗IgG溶液；
所述工作微球探针溶液用下述方法制成：
(1)除室温搅拌时间为30min外，其它同实施例1的工作微球探针溶液制备方法中步骤(1)；(2)在装有活化后的35号羧基荧光编码微球的离心管中加入10μg cTn I；在装有活化后的42号羧基荧光编码微球的离心管中加入10μg CK-MB；在装有活化后的52号羧基荧光编码微球的离心管中加入10μg MYO；分别加pH 7.4的PBS使终体积到500μL，室温下以800rpm旋涡混匀2h，以16,000g离心3min，弃去上清液；分别加入100μL封闭缓冲液重悬并封闭交联微球保持20min；离心，弃上清，用pH 7.4的PBS清洗；
(3)、(4)同实施例1的工作微球探针溶液制备方法中的步骤(3)、(4)。
人cTn I系列梯度标准品溶液是用pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制的浓度分别为0、0.013、0.064、0.32、1.6、8和40μg/L的溶液。
人CK-MB系列梯度标准品溶液是用pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制的浓度分别为0、0.064、0.32、1.6、8、40和200μg/L的溶液。
人MYO系列梯度标准品溶液是用pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制的浓度分别为0、0.16、0.8、4、20、100和500μg/L的溶液。
三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液的制备同实施例1的三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液的制备。
100×稀释的链霉亲和素藻红蛋白中的稀释剂为pH＝7.4的PBS缓冲液。
200×稀释的生物素化鼠抗人二抗IgG中的稀释剂为pH＝7.4的PBS缓冲液。
实施例4
检测实验(使用实施例1试剂盒)
(1)取试剂盒中人cTn I系列梯度标准品溶液、人CK-MB系列梯度标准品溶液、人MYO系列梯度标准品溶液，以10μL/孔分别加入96孔微滴定板的反应孔中，每孔分别加入10μL三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液，再每孔再加入2μL工作微球探针溶液，pH＝7.4的PBS补足50μL反应体系，在37℃下，中速振荡1h。然后加入200×稀释的生物素化鼠抗人二抗IgG溶液50μL/孔，再次漩涡振荡器上37℃中速振荡1h。然后进行磁分离，再加入pH＝7.4的PBS，重复磁分离三次。最后加入100×稀释的链霉亲和素藻红蛋白溶液50μL/孔，37℃中速振荡反应0.5h，用Luminex悬浮芯片检测系统进行测定，获得cTn I、CK-MB和MYO系列标准品溶液各个不同浓度的中位荧光强度值，由这些中位荧光强度值获得cTn I、CK-MB和MYO的检测标准曲线，见图1。
(2)对10例AMI住院患者和5例健康体检人员，抽取每名患者静脉血5mL，并编号，将血样以5000rpm/min 4℃离心10min，取上清后置于-20℃保存。检测时各取10μL加入到96孔微滴定板的反应孔中；
(3)用移液器分别吸取pH＝7.4的PBS缓冲液28μL，对每孔加入的血清进行吹打混匀；
(4)用移液器分别于每孔加入10μL三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液，再用移液器分别取工作微球探针溶液2μL加入到上述孔中，在漩涡振荡器上37℃中速振荡1h。反应后加入200×稀释的生物素化鼠抗人二抗IgG 50μL/孔，再次漩涡振荡器上37℃中速振荡1h。然后进行磁分离，PBS清洗三次，弃上清；
(5)加入100×稀释的链霉亲和素藻红蛋白溶液，50μL/孔，37℃中速振荡反应0.5h；
(6)悬浮芯片系统读取100个微球/孔，获得中位荧光强度值，代入获得的标准曲线中，计算10例AMI住院患者和5例健康体检人员血清中样品cTn I、CK-MB和MYO的检测值，具体检测结果如表1所示。从表1可以看出，针对10例AMI住院患者血清样品，检出cTn I、CK-MB和MYO值分别为12.27±3.47、19.83±3.37和547.74±121.22μg/L，全部超过阳性限值标准；对5例健康体检人员检测的三种AMI标志物分别为：0.40±0.05、2.88±1.51和23.37±9.51μg/L，未发现有超过阳性限值标准。经过配对t检验发现，AMI患者与健康体检人员血清样品cTn I、CK-MB和MYO检测值有显著性差异(P<0.01)。
表1 10例AMI住院患者和5例健康体检人员血清cTn I、CK-MB和MYO检测值
实施例5
检测实验(使用实施例1试剂盒)
(1)抽取1名疑似患者静脉血5mL，将血样以5000rpm/min 4℃离心10min，取上清后置于-20℃保存。检测时取10μL加入到96孔微滴定板的反应孔中；
(2)用移液器吸取pH＝7.4的PBS缓冲液28μL，对该孔加入的血清进行吹打混匀；
(3)用移液器在该孔加入10μL三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液，再用移液器取工作微球探针溶液2μL加入到该孔中，在漩涡振荡器上37℃中速振荡1h。反应后加入200×稀释的生物素化鼠抗人二抗IgG 50μL，再次漩涡振荡器上37℃中速振荡1h。然后进行磁分离，PBS清洗三次，弃上清；
(4)加入100×稀释的链霉亲和素藻红蛋白溶液，50μL，37℃中速振荡反应0.5h；
(5)悬浮芯片系统读取100个微球，获得中位荧光强度值，代入实施例4步骤(1)获得的标准曲线中，得到该疑似患者的cTn I、CK-MB和MYO值分别为：11.3,15.5和236.7μg/L。获得检测值跟正常参考范围(cTn I、CK-MB和MYO的正常参考范围分别是0～0.5μg/L，0～5.0μg/L和0～80μg/L)相比，可确认该患者是AMI患者。
实验证明，实施例2和实施例3的试剂盒也可以用于检测急性心肌梗死生物标志物。

Claims (7)

1.一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒，其特征是包括：工作微球探针溶液、人cTn I系列梯度标准品溶液、人CK-MB系列梯度标准品溶液、人MYO系列梯度标准品溶液，三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液；100×稀释的链霉亲和素藻红蛋白溶液和200×稀释的生物素化鼠抗人二抗IgG溶液；
所述工作微球探针溶液用下述方法制成：
(1)取编码为35,42和52号的羧基荧光编码微球分别置于三支的离心管中，用100μL pH7.4的PBS重悬后，使所述羧基荧光编码微球的浓度为1.25×107个微球/mL，分别加入100μLpH 8.0 0.1mol/L的PBS，分别加入新鲜配制的10μL浓度为50mg/mL的EDC水溶液和10μL浓度为50mg/mL的S-NHS水溶液，室温下搅拌10-30min，使羧基荧光编码微球活化；
所述EDC为1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐的简称；
所述S-NHS为N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐的简称；
(2)在装有活化后的35号羧基荧光编码微球的离心管中加入10μg cTn I；在装有活化后的42号羧基荧光编码微球的离心管中加入10μg CK-MB；在装有活化后的52号羧基荧光编码微球的离心管中加入10μg MYO；分别加pH 7.4的PBS使终体积到500μL，室温下以500-800rpm旋涡混匀2-4h，以12,000-16,000g离心3-6min，弃去上清液；分别加入100μL封闭缓冲液重悬并封闭交联微球保持20min；离心，弃上清，用pH 7.4的PBS清洗；
所述cTn I为肌钙蛋白的简写；CK-MB为肌酸激酶同工酶的简写；MYO为肌红蛋白的简写；
所述封闭缓冲液为：PBS中含有1wt％BSA,0.05wt％叠氮钠，pH 7.4；
(3)分别用150μL储备缓冲液重悬步骤(2)获得的微球，用血球计数器确定浓度，用储备缓冲液稀释到3000个/μL，分别得到偶联有cTn I探针微球溶液、偶联有CK-MB探针微球溶液和偶联有MYO探针微球溶液；
(4)分别取偶联有cTn I探针微球溶液、偶联有CK-MB探针微球溶液和偶联有MYO探针微球溶液50μL，混合，得工作微球探针溶液，工作微球探针溶液中偶联有cTn I探针微球的浓度为1000个/μL，偶联有CK-MB探针微球的浓度为1000个/μL，偶联有MYO探针微球的浓度为1000个/μL，4℃储存；
所述储备缓冲液为PBS中含有0.1wt％BSA,0.02wt％吐温-20,0.05wt％叠氮钠,pH7.4。
2.根据权利要求1所述的一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒，其特征是所述人cTn I系列梯度标准品溶液是用pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制的浓度分别为0、0.013、0.064、0.32、1.6、8和40μg/L的溶液。
3.根据权利要求1所述的一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒，其特征是所述人CK-MB系列梯度标准品溶液是用pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制的浓度分别为0、0.064、0.32、1.6、8、40和200μg/L的溶液。
4.根据权利要求1所述的一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒，其特征是所述人MYO系列梯度标准品溶液是用pH＝7.4的PBS缓冲液为溶剂，配制的浓度分别为0、0.16、0.8、4、20、100和500μg/L的溶液。
5.根据权利要求1所述的一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒，其特征是三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液用下述方法制成：
(1)取浓度为2mg/mL的cTn I单抗原液100μL，加pH＝7.4的PBS缓冲液，配成浓度为150μg/mL的cTn I单抗溶液；
(2)取浓度为1mg/mL的CK-MB单抗原液100μL，加pH＝7.4的PBS缓冲液，配成浓度为150μg/mL的CK-MB单抗溶液；
(3)取浓度为1mg/mL的MYO单抗原液100μL，加pH＝7.4的PBS缓冲液，配成浓度为150μg/mL的MYO单抗溶液；
(4)各取等体积步骤(1)、(2)和(3)获得的单抗溶液，混合，得到人cTn I单抗溶液浓度为50μg/mL，人CK-MB单抗溶液浓度为50μg/mL，人MYO单抗溶液浓度为50μg/mL的三联急性心肌梗死生物标志物单抗溶液；4℃储存。
6.根据权利要求1所述的一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒，其特征是所述100×稀释的链霉亲和素藻红蛋白中的稀释剂为pH＝7.4的PBS缓冲液。
7.根据权利要求1所述的一种联合检测急性心肌梗死生物标志物的试剂盒，其特征是所述200×稀释的生物素化鼠抗人二抗IgG中的稀释剂为pH＝7.4的PBS缓冲液。
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