CN108008136A - 一种t淋巴细胞白血病病毒 (htlv) 抗体化学发光检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种t淋巴细胞白血病病毒 (htlv) 抗体化学发光检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)的化学发光检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括：偶联有T淋巴细胞白血病病毒(HTLV)抗原的磁颗粒、吖啶酯标记的T淋巴细胞白血病病毒(HTLV)抗原、T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)系列标准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。本发明试剂盒以磁分离化学发光技术为检测手段，同时结合吖啶酯标记技术。与现有检测T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)的技术相比，本试剂盒具有灵敏度高，信噪比高，快速检测的优点。

Description

一种T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗体化学发光检测试剂 盒及其制备方法
技术领域
本发明属于免疫检测分析技术领域，具体是一种T淋巴细胞白血病病毒(HTLV)抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
人类嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型(HTLV-Ⅰ)和Ⅱ型(HTLV-Ⅱ)是C型逆转录病毒，是一种复杂的逆转录病毒。可引起成人T淋巴细胞白血病（ATL）、热带痉挛性下肢瘫痪／HTLV-Ⅰ相关骨髓病(TSP／HAM）等相关疾病。
HTLV-Ⅰ呈球形，直径约100 nm，中心为病毒的RNA和逆转录酶，最外层系病毒的包膜，其表面嵌有gp120，能与 CD4 结合而介导病毒的感染，属细胞介导传播，游离的病毒颗粒几乎不能感染细胞。体外实验中HTLV-Ⅰ可感染CD4 +T淋巴细胞、B细胞、成纤维细胞、上皮细胞和神经胶质细胞等，但在体内主要感染CD4 +T淋巴细胞。母乳、精液、血液中存在CD4 +T淋巴细胞，所以HTLV-Ⅰ的传播主要通过母乳喂养、性传播、输血、静脉注射毒品共用针头等几条途径，其中母乳传播被认为是HTLV-Ⅰ最主要的传播方式，传播机率在20%以上；性传播是HTLV-Ⅰ自然传播的另一条途径，主要是由男性传给女性；输血传播HTLV-Ⅰ主要是通过血液制品，如全血、红细胞、血小板等。HTLV-Ⅰ感染主要流行于日本南部、加勒比海地区、非洲中部、美洲中部和南部、巴布亚新几内亚和澳大利亚，近年来欧洲和中东一些国家也有关于HTLV-Ⅰ感染的报道；而美国、巴拿马、巴西、意大利、法国和瑞典等几个国家HTLV-Ⅱ感染率较高。
目前，检测T淋巴细胞白血病病毒(HTLV)抗体的方法有间接免疫荧光法 （IFA）、蛋白印迹试验（WB）、放射免疫沉淀试验（RIPA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和明胶颗粒凝集法（PA）等。其中，放射免疫技术，放射免疫测定法虽然具有高灵敏度、高特异性的优点，但其操作步骤较多，需要特殊的检测设备，试剂价格昂贵，需使用配套的仪器且存在放射性污染，使操作人员受到放射性危害；另外，放射性同位素易衰减，有效期短，不易保存。酶联免疫方法，采用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记物，其酶标记物易失活，显色底物见光易分解，灵敏度低，操作复杂、重复性差、不适于急诊和临床病人及时诊断的需要，且其对结构类似的化合物具有一定的交叉反应，造成测试结果不准确。WB检测主要是通过转印技术将病毒标准株的特异性蛋白电泳带转移到特定载体上，再与待检者血清进行反应，从而达到检测血清中HTLV特异性抗体的目的，其存在非特异性反应的问题，而且操作复杂，成本高难以用于筛选试验，通常作为初筛阳性后的确证试验 。
CN 103713127 A（2014.04）公开了一检测T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)的ELISA试剂盒，该试剂盒采用辣根过氧化物酶标记T淋巴细胞白血病病毒抗原，采用辣根过氧化物酶主要缺点为：鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情况下，也会被H2O2氧化自身发光，本底相对较高，影响信噪比，反应动力学复杂，影响因素多，结果不够稳定，要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。而本公司开发的一种T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)化学发光试剂盒，采用吖啶酯作为标记物，具有检测稳定、测量快速、灵敏度高的优点。
化学发光方法较其他方法的优点在于检测的简单性。
该体系采用磁分离体系，吖啶酯标记的化学发光技术进行检测，其具有的优点是：吖啶酯作为发光剂不需催化剂的存在，在有过氧化氢的稀碱溶液中即能发光；吖啶酯分子量小，避免遮蔽抗体结合位点，可提高系统整体灵敏度，反应迅速；背景低、信噪比高，是一类有效的化学发光标记物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度更高、反应时间短、操作简单、抗干扰性高的T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗体的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法，本发明所提供的磁微粒化学发光方法检测T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV) 的试剂盒，采用磁微粒偶联T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗原，吖啶酯标记T淋巴细胞白血病病毒(HTLV) 抗原。试剂盒还包括T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)校准品、上述吖啶酯作用的化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。
本发明所述磁珠的内核为四氧化三铁或三氧化二铁，所述磁珠的表面修饰基团为羧基、氨基、对甲苯磺酰基或链霉亲和素-生物素。
本发明中的磁颗粒偶联悬浮液由T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗原偶联的磁颗粒和试剂缓冲液组成，其中T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗原捕获抗体的浓度为0.1-2.0mg/mL。
本发明中的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
本发明中的吖啶酯标记物是吖啶酯标记T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV)抗原溶液，其中吖啶酯溶液的浓度范围为2-85 mmol/L。
本发明中偶联缓冲液是pH 5.0-6.0，浓度为20-200 mmol/L的MES缓冲液。
本发明中在制备磁微粒混悬液时，所述封闭缓冲液为含1-5% BSA的缓冲液。
本发明中所述的T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)系列校准品浓度分别
为：0 ng/mL、6.0 ng/mL、12.0 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL，其缓冲液是含有0.5-5.0 % BSA的Tris或PBS或HEPES。
本发明中的吖啶酯标记T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)检测抗体的缓冲液是pH8.0-11.0、浓度为0.01-0.20 mol/L的Na2CO3-NaHCO3。
本发明中的化学发光预激发液A为：H2O2和HNO3的混合液，其中H2O2的质量分数为0.01-5.0%，HNO3浓度为0.01-1.0 mol/L。
本发明中的化学发光激发液B为：Triton X-100和NaOH的混合液，其中Triton X-100的质量分数为0.01-2.0 %，NaOH的浓度为0.05-1.0 mol/L。
本发明中的清洗液为：pH 7.0-9.0、浓度为5.0-50.0 mmol/L的Tris或HEPES或其它缓冲液，其中含质量分数为0.01-0.25% 的Tween-20。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的试剂盒稳定、检测快、灵敏度高和特异性好。
具体实施方式
下面将对本发明中的技术方案进行清楚、详细的阐述。实例中实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例：试剂盒的组建及其具体组分的制备
1. 试剂盒的组建
一种T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)的化学发光检测试剂盒，使其含有下列组分：
羧基磁珠偶联T淋巴细胞白血病病毒抗原(HTLV)；
吖啶酯标记的T淋巴细胞白血病病毒抗原(HTLV)；
T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)系列标准品溶液
化学发光预激发液A和化学发光激发液B；
清洗液。
实施例2：具体组分的制备
1. 磁珠偶联抗原的制备
（1）取1 mg羧基磁微粒于0.5 mL离心管中，加入的0.1 mol/L MES缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5 min使磁微粒与液体分开，弃去上清液，洗涤3次，再加入200 μL的 MES（pH值为6.0）缓冲液，涡旋。
（2）加入15 μg T淋巴细胞白血病病毒抗原(HTLV)，使羧基与抗体的摩尔比为150:1：涡旋，旋转反应管，室温孵育30 min。
（3）加入10 μL浓度为10 mg/mL的偶联试剂EDC，于旋转反应器上涡旋，室温孵育2h。
（4）取200 μL含1%BSA的甘氨酸缓冲液（浓度为50 mmol/L）进行封闭，时间为1h。
（5）去上清，加入200 μL的清洗缓冲液（TBS+0.05%Tween-20），洗涤3次。
（6）将上述制备好的磁微粒混悬液置于500 μL保存液（300 mmol/L甘氨酸、2%甘油、5%蔗糖）中，2-8℃保存。
1.1. MES缓冲液的配制（0.1 mol/L）
取19.52 g的MES固体，溶于500 mL的去离子水中，用1 mol/L的NaOH调节到pH为6.0；把调好的溶液转移到1 L的容量瓶中，定容。
1.2. 偶联试剂EDC的配制（浓度为10 mg/mL）
取1 g的EDC于50 mL的烧杯中，加入预冷的MES缓冲液，搅拌，待其溶解转移至100 mL的容量瓶中，定容。
2. 吖啶酯标记抗原的制备
（1）将100 μg的T淋巴细胞白血病病毒抗原(HTLV)置于透析袋中，并将透析袋置于不小于1 L的标记缓冲液中透析，期间缓冲液至少更换5次，最后一次透析过夜，标记缓冲液是pH9.8、浓度为50 mmol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
（2）称取1.7 mg的吖啶酯NSP-DMAE-NHS，溶于447 μL无水二甲基甲酰胺（DMF）中，配成6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液。
（3）将透析后的抗原溶液置于500 μL离心管内，加入200 μL的标记缓冲液，加入759 μL 6.5 mmol/L的NSP-DMAE-NHS DMF溶液（避光反应），使吖啶酯与抗原的摩尔比值为7.4:1，震荡混匀，室温反应1 h，加入100 μL 浓度为10 g/L 赖氨酸，静置15 min，使标记反应终止。
（4）标记物NSP-DMAE-NHS-Ag与游离NSP-DMAE-NHS通过Sephadex G-50柱（1×25cm）分离，用纯化缓冲液pH 6.3、浓度为0.1mol/L的PBS平衡并淋洗层析柱。
（5）分离过程中用色谱仪检测蛋白峰，分别测量流出液的化学发光强度和280 nm吸光度值。
（6）收集光度值高且吸光度大的洗脱液，加入1%BSA后分装冰冻保存。
3.标准品的制备
T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)系列标准品制备用含有2% BSA的Tris-HCl 缓冲液将T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)纯品配制成标示浓度为：0 ng/mL、6.0 ng/mL、12.0ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL，共6个浓度的校准品梯度值。
4. 化学发光激发液A、B的制备
（1）化学发光预激发液A由H2O2和HNO3组成。其中，H2O2质量分数为1.5%，HNO3浓度为0.1mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
（2）化学发光激发液B由Triton X-100 和NaOH的混合液组成。其中，Triton X-100质量分数为1.0%，NaOH浓度为0.4 mol/L，用棕色瓶分装成20 mL/支，2-8℃保存备用。
5. 清洗液的制备
称量3.05 g Tris，8.775 g NaCl至1000 mL的烧杯中，加入1mL质量分数为0.05%Tween-20，搅拌混匀，定容，将pH调为 7.6，保存备用。
实施例3：具体试剂盒的实施
（1）在反应杯中加入待测样本50 μL，再加入磁颗粒偶联悬浮液150 μL，振荡混匀，37℃孵育8 min。
（2）分离、洗涤3次，将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
（3）向反应杯中加入吖啶酯标记物150 μL，振荡混匀，37℃孵育7 min。
（4）分离，清洗3次，将洗涤后的反应容器充分振荡使磁微粒散开。
（5）加入100 μL化学发光预激发液A，1 s后加入100 μL化学发光激发液B，测量其相对发光强度，样本中T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)的含量与其相对发光强度成一定比例关系。
实施例4：试剂盒的性能指标
（1）分析灵敏度
用试剂盒中0 ng/mL校准品作为待测样本，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值（相对发光值），计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD所对应RLU值，根据零浓度校准品与相邻校准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值带入上述方程中，求出对应的浓度值。按检测方案中最低检测限检测方法，重复3次实验，最后求出本试剂盒对T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)的分析灵敏度为1.0 ng/mL。
（2）精密度
用T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)试剂盒测试浓度为(10.0±1.0) ng/mL和(300.0±30.0) ng/mL的样本，每个浓度重复测试10次，计算试剂盒精密度，结果表明该试剂盒CV均小于5%。
（4）稳定性
取T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)检测试剂盒进行常规贮存稳定性试验，2-8℃放置分别按时间1，3，5，7，9，11，12，13，14，15个月进行检测；开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天、32天进行测定。结果显示T淋巴细胞白血病病毒抗体(HTLV)检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为12个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为30天。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (8)

1.一种T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗体的化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于，包括：偶联有T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗原的磁微粒混悬液、吖啶酯标记的T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗原、T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗体系列标准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。
2.根据权利要求1所述的一种T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗体的化学发光检测试剂盒及其组成，其特征在于：所述的磁珠的内核为四氧化三铁或三氧化二铁，磁微粒的表面修饰基团为一种或多种活性功能基团，包括但不限于羧基、氨基、对甲苯磺酰基或链霉亲和素-生物素。
3.根据权利要求1所述的一种T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光标记物为吖啶酯，如NSP-DMAE-NHS、NSP-SA-NHS等。
4.根据权利要求1所述的一种T淋巴细胞白血病病毒抗体 (HTLV) 的化学发光检测试剂盒，其特征在于，吖啶酯标记的是T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗原检测抗体。
5.根据权利要求1所述的一种T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒可直接与T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗原，或将磁微粒与链霉亲和素偶联，同时采用生物素标记T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗原。
6.根据权利要求1所述的一种T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的化学发光预激发液A由H2O2和HNO3 的混合液组成，化学发光激发液B由Triton X-100和NaOH的混合液组成。
7.根据权利要求1所述的一种T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗体的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的校准品是以含有BSA的缓冲液为基质，加入T淋巴细胞白血病病毒(HTLV) 抗体配置而成的系列浓度梯度的校准品溶液。
8.根据权利要求1所述的一种T淋巴细胞白血病病毒 (HTLV) 抗体的化学发光检测试剂盒，包括以下步骤：在反应杯中加入一定量的待测样本，再加入磁颗粒偶联悬浮液，混匀，37℃孵育，加入清洗液去掉上清；之后按照一定的比例加入吖啶酯标记物，37℃孵育，加入清洗液去掉上清，加入化学发光预激发液A和激发液B，测定相应的发光强度RLU/s。
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