CN108753716A - 一种体外扩增人外周血cd3+t细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用SA(链亲和素)‐hIL2、SA‐hIL7和SA‐hIL21双功能融合蛋白锚定修饰的磁珠体外高效扩增人外周血CD3⁺T细胞的方法，包括SA‐hIL2/SA‐hIL7/SA‐hIL21双功能融合蛋白的制备及其促T细胞增殖最适浓度的摸索。因hIL2、hIL7和hIL21为IL2家族细胞因子，具有共同的γ链受体，借助生物素与链亲和素的桥联作用将SA‐hIL2、SA‐hIL7和SA‐hIL21双功能融合蛋白共同锚定在已生物素化的磁珠表面，进而通过磁珠的固相表面将CD3⁺T细胞表面的hIL2、hIL7和hIL21受体聚集成簇，从而强烈激活T细胞、并促进其高效扩增。因此，本发明的T细胞体外扩增方法可用于T细胞的过继性免疫治疗。

Description

一种体外扩增人外周血CD3+T细胞的方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种用SA(链亲和素)‐hIL2、SA‐hIL7和SA‐hIL21双功能融合蛋白锚定修饰的磁珠体外高效扩增人外周血CD3⁺T细胞的方法。

背景技术

过继性免疫细胞治疗(adoptive cell therapy,ACT)技术是通过对自体免疫细胞进行体外激活和扩增,然后将其重新输回肿瘤患者体内,促使其在体内发挥杀伤肿瘤细胞作用的技术,以期改善患者抗肿瘤免疫力，达到治疗和预防复发的目的。效应细胞的种类、数量、活性是直接影响临床疗效的关键。对于晚期实体瘤和血液癌症患者来说，这种ACT技术是一种高度有效且比较安全的治疗手段。ACT疗法中最紧迫的技术问题是产生足够量的抗原(antigen,Ag)特异性T细胞用于回输，故体外大量扩增免疫细胞成为ACT的一个重要环节。

人白细胞介素‐2(IL‐2)是一种T细胞生长因子和信号调节因子，在促进T细胞增殖、增强细胞毒性T细胞、NK细胞和单核细胞的活性、以及诱导B细胞生长和抗体产生方面发挥重要的免疫调节作用。白细胞介素7(IL‐7)是由骨髓基质细胞和胸腺基质细胞产生的细胞因子。不仅是正常T、B淋巴细胞分化和成熟的重要细胞因子，还是多能干细胞和骨髓祖细胞迁移的重要调节因子，而且还能促进NK细胞和成熟T细胞的功能，以及T细胞的生长和分化。人白细胞介素‐21(IL‐21)是与IL‐2、IL‐4、IL7、IL9和IL15共用受体γ链的细胞因子。IL21对各种免疫细胞都具有广泛的调节作用，能促进CD8⁺T细胞和NK细胞功能的成熟，增强其细胞毒活性。T细胞表面可表达多种丝裂原(mitogen)受体，丝裂原可非特异性直接诱导静息T细胞活化和增殖。刀豆蛋白A(concanavalin，ConA)和植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)是最常用的T细胞丝裂原。PHA和ConA通过结合细胞膜糖蛋白(包括T细胞受体(TCR)‐CD3复合物)激活T细胞。

细胞膜表面锚定修饰技术是利用细胞膜表面蛋白质含有伯胺(primary amine)并易于生物素化，借助生物素与链亲和素间的超强特异性结合可使带有SA的蛋白锚定在生物素化的细胞膜表面。同理，我们可将SA‐hIL2、SA‐hIL7和SA‐hIL21双功能融合蛋白共同锚定在已生物素化的磁珠表面，进而通过磁珠的固相表面将CD3⁺T细胞表面的hIL2、hIL7和hIL21受体聚集成簇，从而强烈激活T细胞、并促进其高效扩增。

发明内容

本发明提供了一种用SA‐hIL2、SA‐hIL7和SA‐hIL21双功能融合蛋白锚定修饰的磁珠体外高效扩增人外周血CD3+T细胞的方法，包括SA‐hIL2/SA‐hIL7/SA‐hIL21双功能融合蛋白的制备及其促T细胞增殖最适浓度的摸索。

本发明采用如下技术方案：一种体外扩增人外周血CD3⁺T细胞的方法，利用锚接有hIL2、hIL7和hIL21细胞因子的磁珠的固相表面将CD3+T细胞表面的细胞因子受体聚集成簇，激活T细胞，实现T细胞的高效扩增。

进一步地，hIL2、hIL7和hIL21在磁珠表面的锚定是通过以下手段实现的：借助生物素与链亲和素的桥联作用将SA‐hIL2、SA‐hIL7和SA‐hIL21双功能融合蛋白共同锚定在已生物素化的磁珠表面。

进一步地，所述双功能融合蛋白纯度均达90％以上。

进一步地，SA‐hIL2、SA‐hIL7和SA‐hIL21在磁珠表面的锚定剂量比4.5:2:1。

进一步地，以一定浓度的磁珠激活T细胞，其中，锚定于磁珠表面的SA‐hIL2的浓度为200U。

本发明的有益效果在于：本发明提供一种新型的体外T细胞高效扩增方法，区别于现有的体外扩增技术。后者通常在培养基中加入游离的细胞因子，包括hIL2、hIL7和hIL21等。而本发明借助生物素与链亲和素的特异性结合，将游离的细胞因子固定在磁珠固相表面，可使相关的细胞因子受体聚集成簇交联后形成强烈的信号传导，促进T细胞的高效扩增。根据本发明，T细胞体外增殖效果显著优于现有的培养方法。

附图说明

图1：SA‐hIL2、SA‐hIL7、SA‐hIL21融合蛋白透析复性后电泳图；

图2：SA‐hIL‐2双功能融合蛋白的生物学活性测定结果；

图3：SA‐hIL‐7双功能融合蛋白的生物学活性测定结果；

图4：SA‐hIL‐21双功能融合蛋白的生物学活性测定结果；

图5：流式检测三种双功能融合蛋白对生物素化磁珠的锚定修饰效率结果；

图6：流式检测人外周血CD3⁺T细胞分选后纯度；

图7：MTT法确定SA‐hIL2、SA‐hIL7、SA‐hIL21双功能融合蛋白促CD3⁺T细胞增殖的最适浓度结果；

图8：台盼蓝计数检测CD3⁺T细胞增殖倍数结果；

图9：流式检测CFSE标记的CD3⁺T细胞增殖结果。

具体实施方式

下述实验所用的设备如下：

Bio‐Tek ELx800酶标仪(美国Millipore公司)，台式高速大容量冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，CO2恒温培养箱(美国Thermo scientific公司)，5453型微型离心机(德国eppendorf公司)，生物安全柜(美国Thermo scientific公司)，流式细胞仪FACS Arial(美国BD公司)。

主要生化试剂及材料：

M‐270 Amine磁珠(美国invitrogen公司)，人外周血T淋巴细胞(健康志愿者)，RPMI‐1640基础培养基(美国GIBCO公司)，胎牛血清(美国GIBCO公司)，MTT试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，台盼蓝(美国GIBCO公司)，CCK‐8检测试剂盒(日本同仁堂)，PE–anti‐histag(美国BD公司)，CFSE试剂(美国BD公司)。

SA‐hIL2、SA‐hIL7、SA‐hIL21融合蛋白均由大肠杆菌原核表达、经纯化复性后，分别获得链亲和素活性和相应细胞因子活性的双功能融合蛋白。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1SA‐hIL‐2、SA‐hIL‐7、SA‐hIL‐21双功能融合蛋白的制备和鉴定

首先将包涵体洗涤液粗纯化后的三种融合蛋白用8M尿素溶液裂解变性，使融合蛋白His标签得以暴露，再经过0.22um滤膜过滤后，用纯化仪进行Ni柱纯化。接得洗脱峰后制样，跑12％分离胶的SDS‐PAGE胶进行鉴定。用ImageJ软件分析得出，经过Ni‐NTA亲和层析柱分别纯化SA‐hIL‐2、SA‐hIL7和SA‐hIL21后，纯度均达90％以上(如图1A‐C所示)。随后，将纯化后的目的蛋白溶解在复性液里，4℃低温进行透析复性，每隔12h更换复性液，以梯度除去变性剂尿素，并在氧化、还原型谷胱甘肽作用下进行蛋白复性，最后跑SDS‐PAGE胶鉴定(结果如图1A‐C所示)。

实施例2SA‐hIL‐2、SA‐hIL‐7、SA‐hIL‐21双功能融合蛋白的相应细胞因子生物学活性检测

取4‐6周健康野生型BABLC小鼠的脾脏淋巴细胞，调整细胞密度为1M/ml，每孔200ul体系细胞悬液铺于96孔板中。随后，分别配制不同浓度梯度的融合蛋白及蛋白标准品并加入到96孔板相应的孔中。每孔使SA‐hIL‐2终浓度分别稀释为10^‐4,10^‐3,10^‐2，10^‐1,10⁰，10¹,10²一系列浓度梯度，使SA‐hIL‐7终浓度分别稀释为10^‐4,10^‐3,10^‐2，10^‐1,10⁰，10¹一系列浓度梯度，使SA‐hIL‐21终浓度分别稀释为10^‐3,10^‐2，10^‐1,10⁰，10¹,10²，10³一系列浓度梯度，以及各自的标准品稀释成相对应的终浓度。同时，加入终浓度0.5ug/ml的ConA进行诱导激活淋巴细胞，放于37℃5％CO2培养箱培养。48小时后轻轻吸弃上清100ul，每孔加入10ulCCK‐8试剂，再继续培养2小时后，用酶标仪检测OD450nm处吸光度值。所得数据用GraphPadPrism5软件进行统计学分析，根据量‐效关系方程，将融合蛋白组及蛋白标准品组对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的不同吸光度值进行拟合，采用独立样本t检验，方差齐性，P＝0.380>0.05，可认为SA‐hIL‐2融合蛋白和IL2标准品的活性无显著性差异。结果显示IL2标准品的生物学活性为3.1×10⁶U/mg，SA‐hIL2融合蛋白生物学活性为1.81×10⁶U/mg，其半数有效浓度是0.5523ng/ml(如图2和表1所示)。SA‐hIL‐7融合蛋白和IL7标准品的活性无显著性差异P＝0.380>0.05。IL7标准品的生物学活性为1.18×10⁶U/mg，SA‐hIL7融合蛋白生物学活性为0.766×10⁶U/mg，其半数有效浓度是1.305ng/ml(如图3和表2所示)。SA‐hIL‐21融合蛋白和IL21标准品的活性无显著性差异P＝0.559>0.05。IL21标准品的生物学活性为1.03×10⁶U/mg，SA‐hIL21融合蛋白生物学活性为0.645×10⁶U/mg，其半数有效浓度是1.548ng/ml(如图4和表3所示)。

表1：SA‐hIL2不同浓度梯度检测后CCK8(OD450)值比较(x士s)

表2：SA‐hIL7不同浓度梯度检测后CCK8(OD450)值比较(x士s)；

表3：SA‐hIL21不同浓度梯度检测后CCK8(OD450)值比较(x士s)；

实施例3SA‐hIL2、SA‐hIL7、SA‐hIL21融合蛋白的链亲和素功能鉴定

取适量磁珠(磁珠浓度2M/ul)于无菌流式管里，加入1ml PBS后放于磁力架上，因磁力作用磁珠吸附于紧靠磁力架的试管壁一侧，静置4min后吸弃上清，重复清洗3次。分别设置实验组、空白对照与阴性对照组。将磁珠均分至各组后置于磁力架上，静置4min后弃上清，同时配制生物素试剂，先将生物素试剂配制成1mg/ml，再稀释为终浓度0.05mg/ml。取200ul的0.05mg/ml的生物素溶液(即质量10ug)加入到磁力架上含磁珠沉淀的试管里，重悬磁珠并混匀，室温孵育45min，进行生物素化磁珠。中间每隔10分钟摇晃一下流式管，以防磁珠沉降导致反应不充分。其中阴性对照组磁珠不进行生物素化。孵育结束后，将各组流式管置于磁力架上，吸弃上清后再用PBS重复洗3次，以洗去未结合磁珠的生物素试剂。随后进行蛋白孵育，分别于实验组的每管磁珠加入200ul相同浓度的对应的融合蛋白，以及阴性对照组未生物素化的磁珠只加入等量SA‐hIL‐2融合蛋白。另外对SA‐hIL‐2设置了梯度实验。室温孵育1h，中间每隔10min摇晃一下试管以免磁珠沉降。锚定结束后，流式检测SA‐hIL‐2融合蛋白的锚定率最高达93.1％。SA‐hIL‐7融合蛋白的锚定率达到98.9％。SA‐hIL‐21融合蛋白的锚定率达到99.4％。SA‐hIL2、SA‐hIL7、SA‐hIL21共同锚定修饰磁珠时，锚定率达99.7％(如图5所示)。通过BCA检测上清蛋白浓度，经过计算得出1M磁珠最多可修饰SA‐hIL2为1454.5U，SA‐hIL7为613U，SA‐hIL21为323U。因此，我们证实了三种融合蛋白具有良好的链亲和素功能且锚定磁珠的饱和剂量比约是4.5:2:1。

实施例4锚定于磁珠的SA‐hIL2/SA‐hIL7/SA‐hIL21促人外周血CD3⁺T细胞增殖最适浓度的确定及其促增殖能力的测定

抽取健康人外周血分离PBMC后，用PanT磁珠分选出CD3⁺T细胞(阴性选择)，流式检测分选后CD3⁺T细胞纯度达92.1％(如图6所示)。由于三种蛋白同时锚定修饰磁珠，且其锚定磁珠的饱和剂量存在差异，我们选取可锚定磁珠最大剂量的SA‐hIL2为基准，将其剂量设置5个浓度梯度(如图7所示)，再将另外两种蛋白按之前比例锚定修饰于磁珠上，进行体外培养。随后MTT试剂检测结果显示在与对照组及其他浓度梯度组相比，以SA‐hIL2终浓度200U时(结果如图7所示)，检测的OD吸光度值最高，即细胞的数量最多。根据前期三种蛋白锚定剂量4.5:2:1的比例计算出，SA‐hIL2终浓度200U时，SA‐hIL7为88.9U，SA‐hIL21为44.4U。因此，我们按照这个终浓度方式进行后续实验。在将SA‐hIL2、SA‐hIL7和SA‐hIL21共同锚定修饰磁珠后，与对照组(相同终浓度游离的细胞因子)进行体外短期培养，期间隔天半量换液并补充细胞因子维持，比较两种培养方式下T细胞的增殖率。台盼蓝染色计数细胞，结果显示锚定修饰磁珠组的T细胞增殖显著快于游离对照组(如图8所示)。此外，我们通过CFSE荧光探针标记T细胞，培养3天后，流式检测结果也证实了锚定修饰磁珠组的T细胞增殖显著快于游离对照组(如图9所示)。

综上所述，本发明的T细胞体外扩增方法可用于T细胞的过继性免疫治疗。

Claims (5)

1.一种体外扩增人外周血CD3⁺T细胞的方法，其特征在于，利用锚接有hIL2、hIL7和hIL21细胞因子的磁珠的固相表面将CD3+T细胞表面的细胞因子受体聚集成簇，激活T细胞，实现T细胞的高效扩增。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，hIL2、hIL7和hIL21在磁珠表面的锚定是通过以下手段实现的：借助生物素与链亲和素的桥联作用将SA‐hIL2、SA‐hIL7和SA‐hIL21双功能融合蛋白共同锚定在已生物素化的磁珠表面。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双功能融合蛋白纯度均达90％以上。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，SA‐hIL2、SA‐hIL7和SA‐hIL21在磁珠表面的锚定剂量比4.5:2:1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以一定浓度的磁珠激活T细胞，其中，锚定于磁珠表面的SA‐hIL2的浓度为200U。