CN107794269A - 促进基因编辑t细胞活化及扩增的生物膜、制法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种促进基因编辑T细胞活化及扩增的重组生物膜制备方法，该重组生物膜通过如下步骤制备：1)将修饰的CD137L基因序列通过基因重组方法导入到K562细胞基因组上，获得在K562细胞表面稳定表达修饰CD137L蛋白的稳转株细胞，命名为rCD137L‑K562细胞；2)对步骤1)所述的rCD137L‑K562细胞进行常规培养，通过细胞裂解液将细胞破碎，然后通过差速离心法获得含有修饰CD137L蛋白的生物膜，再使用亲和层析或亲和磁珠分离的方法将含有修饰CD137L蛋白的生物膜片段进行富集提取、纯化。本发明提高对基因编辑T细胞的刺激作用，且无任何不良副作用。

Description

促进基因编辑T细胞活化及扩增的生物膜、制法及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其是生物工程技术领域，具体涉及一种含有修饰CD137L蛋白的生物膜的制备方法并包括该重组生物膜在激活基因编辑T淋巴细胞并促进基因编辑T淋巴细胞增殖方面的应用。用该重组生物膜培养的基因编辑T淋巴细胞可以应用于临床细胞免疫治疗，也可用于基础医学研究、临床应用研究及生物技术研究，尤其可用于免疫系统研究和肿瘤杀伤作用研究。
背景技术
T淋巴细胞是人体最重要的免疫细胞之一，由胸腺内的淋巴干细胞分化而来，成熟后迁移到外周血；按其功能可分为三个亚群：辅助性T细胞、抑制性T细胞和细胞毒性T细胞。T淋巴细胞的正常功能对于维护机体的健康及其重要，它们的缺陷和功能异常可导致包括自身免疫性疾病和肿瘤等在内的各种疾病。目前，免疫学研究包括各种对T淋巴细胞的基础和临床应用的研究日益深入且发展迅速，在人T细胞来源和数量受限的现实情况下，对T细胞的需求日益迫切。因此，有必要建立一个有效，方便的体外T细胞活化和增殖方法来获取大量具功能活性的T细胞以满足需求。T细胞的激活需要两个信号的参与：一个是TCR接受抗原递呈细胞(APC)传导的MHC-抗原肽信号，另一个是细胞膜表面黏附分子提供的协同刺激信号(或称第二信号)。增强T淋巴细胞活化所需要的协同刺激信号是增强抗肿瘤免疫的重要方法。CD137是继CD28/B7之外新发现的另一重要的T细胞协同刺激分子，CD137与CD137配体(CD137L)在维持T细胞，尤其是T细胞的活化、增殖的方面具有重要的意义。
CD137(亦命名为4-1BB)是近年发现的TNFR家族的新成员，在调节细胞增殖、分化、凋亡中起重要作用。CD137是I型跨膜糖蛋白，由信号肽、胞外区、疏水区及胞内区构成，以单体或二聚体形式表达于活化的T细胞表面。它不仅表达于活化的T淋巴细胞、NK细胞、 NKT细胞、CD4/CD25调节T细胞，也可表达于活化的胸腺细胞和上皮内淋巴细胞。此外，CD137还可表达于一些非淋巴细胞，如单核细胞、粒细胞及树突状细胞(DC)等，提示CD137可能在免疫调节中起重要作用。其配体CD137L(亦命名为4-1BBL)首先由Goodwin 等利用表达筛选法在小鼠胸腺瘤细胞中分离出，随后又在人CD4+T 细胞克隆中分离得到。CD137L也是TNFR家族的成员，是存在于细胞表面的II型膜蛋白，与其他TNF家族有相似的C-端氨基酸，分子量为34KD。其膜型也是一种可诱导的细胞表面抗原，可表达于多种抗原呈递细胞(APC)、各种肿瘤细胞及活化诱导的T细胞上。人和小鼠的CD137L氨基酸序列有36％的同源性。CD137分子对T细胞活化的重要作用已得到充分认可。在鼠和人T细胞中均可观察到，仅有亚适量CD3抗体(第一信号)的存在下，CD137便可诱导T细胞增值和细胞因子的合成(主要是IFN-α)，以及抑制活化细胞的死亡。协同刺激信号可通过提高抗原特异性和效应CD8+T细胞的数量来增强效应功能(例如，干扰素的释放，细胞毒作用)。但在缺乏CD3抗体信号时，CD137分子的刺激并不能改变T细胞的功能，表明CD137只是一种协同共刺激分子。
细胞膜又称细胞质膜或者生物膜，是细胞对外界的屏障，它使细胞与周围环境相隔离，并保持着稳定的细胞构型及胞内外的环境。细胞膜表面蛋白是细胞膜的重要组成部分，它们参与了细胞的免疫应答、信号传导、物质及能量的传递等重要功能，对细胞的生存、生长、分裂和分化都至关重要。
发明内容
针对修饰CD137L对T细胞的扩增的刺激作用，以及现有技术在 T细胞体外扩增中的不足及实际的需求，本发明提供了一种含有修饰 CD137L的重组细胞膜蛋白的制备方法及应用，本发明提供了该重组生物膜的制备方法以及该重组生物膜在基因编辑T细胞活化及扩增中的应用。
本发明提供了一种促进基因编辑T细胞活化及扩增的重组生物膜制备方法，该重组生物膜通过如下步骤制备：
1)将修饰的CD137L基因序列通过基因重组方法导入到K562细胞基因组上，获得在K562细胞表面稳定表达修饰CD137L蛋白的的稳转株细胞，命名为rCD137L-K562细胞。所述rCD137L的含义即为前述的“修饰的CD137L”
2)对步骤1)所述的rCD137L-K562细胞进行常规培养，通过细胞裂解液将细胞破碎，然后通过差速离心法获得含有修饰CD137L蛋白的生物膜，再使用亲和层析或亲和磁珠分离的方法将含有修饰 CD137L蛋白的生物膜片段进行富集、纯化。
所述修饰的CD137L基因为NM_003811中第39位至第803位基因表示的CD137L的全基因序列和在CD137L基因终止密码子(第801 位至第803位)前加入蛋白标签序列后所得的基因。
作为一个可选的方案，所述蛋白标签序列为6个His蛋白基因序列。
步骤1)中所述的基因重组方法包括ZEN，TALENs、CRISPR-CAS9 基因编辑方法中的一种。
优选的，所述基因重组方法为CRISPR-CAS9基因编辑方法。
优选的，所述富集提取、纯化的方法为：
1)向所述rCD137L-K562细胞中加入细胞裂解液，将裂解液置于冰上30分钟，细胞裂解液包含终浓度250mM的蔗糖、pH7.5且终浓度20MM的HEPES、终浓度10mM的KCl、终浓度1.5mM的EDTA、终浓度1mM的EGTA、质量体积比0.5％的蛋白酶抑制剂；
2)4℃条件下，1000G离心10分钟，取上清；
3)4℃条件下，16000G离心10分钟，取上清；
4)4℃条件下，100000G离心60分钟，取上清；
5)将上述经差速离心获得的细胞上清，用0.45um滤膜过滤；采用表面富含His抗体的磁珠纯化含有rCD137L的重组细胞膜，分别用含20mM、50mM、100mM和400mM咪唑浓度的缓冲液进行阶段洗脱，得到含有rCD137L膜蛋白的生物膜；
本发明还提供了由上述方法制备得到的生物膜。
本发明还提供了上述生物膜在促进基因编辑T细胞活化及扩增方面的应用，其特征在于，所述应用的方法包括以下步骤：将所述生物膜与体外培养的基因编辑T淋巴细胞接触。
本发明的有益效果：
本发明提供的重组生物膜可以和悬浮培养的基因编辑T细胞相互黏附，充分提高生物活性分子CD137L对基因编辑T细胞的刺激作用。此外，在细胞培养条件下，生物膜可以被有效地自然降级，对基因编辑T细胞无任何不良副作用，且避免使用磁珠刺激后需要洗脱等耗损步骤的缺点，最大程度简化基因编辑T细胞活化和扩增的培养程序和步骤，解决了CD137L抗体价格昂贵，避免了磁珠刺激导致的额外清洗步骤和污染机会。
附图说明
图1是流式细胞仪测定转染rCD137L基因后的K562细胞表面rCD137L 蛋白表达的检测结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1：具有rCD137L膜蛋白重组生物膜的制备与纯化
步骤一、采用CRISPR-CAS9基因编辑的方法将CD137L基因定点插入到K562细胞基因组中，具体步骤为：
1)合成带有6个His标签基因序列的CD137L基因全序列，序列如下SEQ ID NO:1所示；
2)根据目标基因序列设计、制备并构建3条gRNA。
3)将构建好的gRNA构建转染至K-562细胞，检测gRNA细胞内编辑效率。
4)比较分析3个gRNA细胞内的编辑效率，选择编辑效率最高的 gRNA并设计相应的ssDNA。
5)将制备好的编辑效率最高的gRNA和ssDNA共转染至K-562 宿主细胞中。
6)采用PCR扩增和Sanger测序法对转染的细胞进行鉴定，筛选出CD137L基因定点敲入的细胞系。
步骤二、具有rCD137L膜蛋白重组生物膜的制备
1)培养筛选出的稳转株rCD137L-K562细胞，收集生长密度达到 95％的稳定表达CD137L的K562细胞5×107，加入生物膜裂解液2ml。
2)用带25G针头的注射器将裂解细胞反复吹打10次，随后置于冰上30分钟。4℃条件下，1000G离心10分钟，取上清；4℃条件下，16000G离心10分钟，取上清；4℃条件下，100000G离心60分钟，取上清；所得上清即为含有CD137L膜蛋白的生物膜片段。
步骤三、具有rCD137L膜蛋白生物膜的纯化
采用步骤二收集的含有rCD137L膜蛋白的重组生物膜片段上清，用0.45μm滤膜过滤。采用表面富含His抗体的磁珠纯化重组生物膜，分别用含20mM，50mM，100mM和400mM咪唑浓度的缓冲液进行阶段洗脱，收集最终产物。
实施例2：具有rCD137L蛋白重组生物膜对基因编辑T细胞的活化和增殖
用实施例1获得的具有rCD137L膜蛋白的重组生物膜对基因编辑 T细胞进行活化和扩增。
现以人外周血单个核细胞为处理样品，运用CRISPR-Cas9技术敲除人PD-1基因，构建PD-1基因敲除T细胞，并对该基因编辑活化T 细胞进行体外高效扩增培养。具体步骤如下：
步骤一：从血液中分离出外周血单个核细胞
直接抽取供者静脉血80～100ml，加入抗凝剂--肝素；
将采集的血样在室温下2000rpm离心10min，小心吸取上层血浆层培养时备用；血样样本还原至原体积，混匀；稀释血缓慢加在Ficoll 上，1000rpm离心20min；吸取分离液界面乳白色单个核细胞层，离心洗涤2次，得到PBMC。
步骤二：从PBMC中分离T细胞
取分离的PBMC，加入基础培养基RPMI-1640配成细胞悬液，调整细胞浓度为1～2×106个/ml，37℃，5％CO2孵育2小时后搜集悬浮细胞即为T细胞。
步骤三：运用CRISPR-Cas9技术敲除T细胞上的人PD-1基因
构建携带PD-1基因sgRNA寡聚核苷酸病毒载体。
根据sgRNA的设计原则，设计sgRNA在PD-1基因上的靶序列，合成sgRNA寡聚核苷酸双链，混合后于95℃退火5min，之后与线性化的慢病毒载体连接，获得携带PD-1基因sgRNA寡聚核苷酸病毒载体；
构建携带Cas9-核酸酶相关载体。
将Cas9核酸酶克隆进相关载体中，获得Cas9-核酸酶载体；
转导T细胞
采用特定方式将对应的sgRNA和Cas9-核酸酶同步转导步骤二收集的T细胞，完成敲除人PD-1基因，即获得敲除PD-1基因T细胞，即为基因编辑T细胞。
步骤四：将基因编辑T细胞分成4个实验组，第一组为未加任何抗体刺激的基因编辑T细胞空白组；第二组为添加CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体联合刺激组；第三组为添加CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体以及添加偶联了CD3及CD28抗体的磁珠，添加比例为1:4(PBMC:磁珠)；第四组为添加CD3单克隆抗体和抗 CD28单克隆抗体以及添加2ug/ml生物膜组。在第1、7、14、21天取200μl细胞，吹打成单个细胞，利用Counterstar自动血细胞计数仪进行计数，细胞扩增倍数＝当天计数的细胞总数/第1天培养前的细胞总数。实验结果如表1。
表1 T细胞在不同时间细胞数量的变化(×108/L)
序列表
<110> 成都美杰赛尔生物科技有限公司
<120> 促进基因编辑T细胞活化及扩增的生物膜、制法及应用
<130> 2017
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 783
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60
gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120
ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180
tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240
cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300
ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360
acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420
tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480
gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540
ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600
ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660
agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720
acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aaaccaccac caccaccacc 780
taa 783

Claims (7)

1.一种促进基因编辑T细胞活化及扩增的重组生物膜制备方法，其特征在于，该重组生物膜通过如下步骤制备：
1)将修饰的CD137L基因序列通过基因重组方法导入到K562细胞基因组上，获得在K562细胞表面稳定表达修饰CD137L蛋白的的稳转株细胞，命名为rCD137L-K562细胞；
2)对步骤1)所述的rCD137L-K562细胞进行常规培养，通过细胞裂解液将细胞破碎，然后通过差速离心法获得含有修饰CD137L蛋白的生物膜，再使用亲和层析或亲和磁珠分离的方法将含有修饰CD137L蛋白的生物膜片段进行富集提取、纯化；
所述修饰的CD137L基因为NM_003811中第39位至第803位基因表示的CD137L的全基因序列和在CD137L基因终止密码子(第801位至第803位)前加入蛋白标签序列后所得的基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白标签序列为6个His蛋白基因序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的基因重组方法包括ZEN，TALENs、CRISPR-CAS9基因编辑方法中的一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因重组方法为CRISPR-CAS9基因编辑方法。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富集提取、纯化的方法为：
1)向所述rCD137L-K562细胞中加入细胞裂解液，将裂解液置于冰上30分钟，细胞裂解液包含终浓度250mM的蔗糖、pH7.5且终浓度20MM的HEPES、终浓度10mM的KCl、终浓度1.5mM的EDTA、终浓度1mM的EGTA、质量体积比0.5％的蛋白酶抑制剂；
2)4℃条件下，1000G离心10分钟，取上清；
3)4℃条件下，16000G离心10分钟，取上清；
4)4℃条件下，100000G离心60分钟，取上清；
5)将上述经差速离心获得的细胞上清，用0.45um滤膜过滤；采用表面富含His抗体的磁珠纯化含有rCD137L的重组细胞膜，分别用含20mM、50mM、100mM和400mM咪唑浓度的缓冲液进行阶段洗脱，得到含有rCD137L膜蛋白的生物膜。
6.如权利要求1～5任一项所述方法制备得到的生物膜。
7.权利要求6所述的生物膜在促进基因编辑T细胞活化及扩增方面的应用，其特征在于，所述应用的方法包括以下步骤：将所述生物膜与体外培养的基因编辑T淋巴细胞接触。
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