JP6846429B2 - ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子に見られる認識配列を有する操作されたメガヌクレアーゼ - Google Patents

ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子に見られる認識配列を有する操作されたメガヌクレアーゼ Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年１２月２３日に出願された「ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子に見られる認識配列を有する操作されたメガヌクレアーゼ」と題された米国仮特許出願第６２／３８７３１８号及び２０１６年１１月２日に出願された「ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子に見られる認識配列を有する操作されたメガヌクレアーゼ」と題された米国仮特許出願第６２／４１６５１３号に基づく優先権を主張する。
本開示は、分子生物学及び組換え核酸技術の分野に関する。特に、本開示は、ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子に見られる認識配列を認識及び切断するように操作された組換えメガヌクレアーゼに関する。本開示は更に、遺伝子改変真核細胞を作製する方法におけるこのような組換えメガヌクレアーゼの使用、及びβ−２ミクログロブリンの細胞表面発現が低下した遺伝子改変細胞の集団に関する。
ＥＦＳ−ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
本出願と共に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表の紙コピーが提出されている。この紙コピーは、同様にその全体が参照により本明細書に組み込まれるＡＳＣＩＩ形式のコピーに対応する。２０１６年１２月２０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０００７０６−００１８１ＷＯ１．ｔｘｔという名前で、サイズが７４１６９３バイトである。
Ｔ細胞養子免疫療法は、がん治療のための有望なアプローチである。この戦略は、特定の腫瘍関連抗原に対するそれらの特異性を高めるために遺伝子改変された単離されたヒトＴ細胞を利用する。遺伝子改変は、抗原特異性をＴ細胞に移植するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は外因性Ｔ細胞受容体の発現を含み得る。外因性Ｔ細胞受容体とは対照的に、ＣＡＲはモノクローナル抗体の可変ドメインからその特異性を得る。従って、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）非制限様式で腫瘍免疫反応性を誘導する。今日まで、Ｔ細胞養子免疫療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、及び慢性リンパ球性白血病）、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、膠芽腫、進行した神経膠腫、卵巣がん、中皮腫、黒色腫、及び膵がんを含むいくつかのがんのための臨床療法として利用されている。
がん治療としての潜在的な有用性にもかかわらず、養子免疫療法は、部分的に、宿主組織と同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞との間のアロ反応性によって制限されてきた。アロ反応性の１つの原因は、ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞表面上の非宿主ＭＨＣクラスＩ分子の存在に起因する。ＭＨＣクラスＩ分子は、２つのポリペプチド鎖α及びβからなる。ヒトでは、α鎖が、第６染色体上の多型ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子によってコードされるα１、α２、及びα３の３つのサブユニットからなる。同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞は外来ＭＨＣクラスＩ分子を有するので、ＨＬＡ遺伝子座及びコードされたα鎖サブユニットの可変性は、同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞を、宿主免疫系によって外来細胞として見えるようにし得る。結果として、患者に投与されたＣＡＲ Ｔ細胞は宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶を受け、宿主の細胞傷害性Ｔ細胞によって認識され、死滅させられ得る。
ＭＨＣクラスＩ分子のβ鎖は、第１５染色体上の非多型β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子（配列番号１）によってコードされるβ−２ミクログロブリンからなる。β−２ミクログロブリンはα３サブユニットに非共有結合し、全てのＭＨＣクラスＩ分子に共通である。更に、細胞表面でのＭＨＣクラスＩ分子の発現は、β−２ミクログロブリンとの会合を必要とする。よって、β−２ミクログロブリンは、ＣＡＲ Ｔ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を抑制するための論理的標的となり、細胞を宿主細胞傷害性Ｔ細胞に見えなくし、アロ反応性を低下させ得る。
ＣＡＲ Ｔ細胞に対するアロ反応性の別の原因は、細胞表面上の内因性Ｔ細胞受容体の発現である。Ｔ細胞受容体は、典型的には、可変α鎖及びβ鎖、又はより少数の可変γ鎖及びδ鎖からなる。Ｔ細胞受容体は、ＣＤ３を含むアクセサリータンパク質と複合体化し、細胞表面共受容体（例えば、ＣＤ４及びＣＤ８）と共に機能して、抗原提示細胞上のＭＨＣ分子に結合した抗原を認識する。同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞の場合、内因性Ｔ細胞受容体の発現が、患者への投与後に細胞に宿主ＭＨＣ抗原を認識させ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症をもたらし得る。
アロ反応性を未然に防ぐために、臨床試験は、ドナーのＴ細胞を単離し、遺伝子改変して、キメラ抗原受容体を組み込み、次いで、同じ対象に再注入する自家ＣＡＲ Ｔ細胞の使用に大きく焦点を当てている。自家アプローチは、投与されたＣＡＲ Ｔ細胞に免疫寛容を提供するが、このアプローチは、患者のがんが診断された後に患者特異的ＣＡＲ Ｔ細胞を作製するのに必要な時間と費用の両方によって制約される。
そのため、内因性Ｔ細胞受容体の発現を更に欠く細胞と同様に、β−２ミクログロブリン及びＭＨＣクラスＩ分子の発現を欠く同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞の開発が必要とされている。
本開示は、ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子（配列番号１）内の認識配列を認識及び切断するように操作された組換えメガヌクレアーゼを提供する。このようなメガヌクレアーゼは、β−２ミクログロブリン遺伝子を破壊し、結果として、内因性ＭＨＣクラスＩ受容体の発現及び／又は機能を破壊するために有用である。メガヌクレアーゼ切断は、非相同末端結合の突然変異誘発作用によって、又は相同組換えを介して外因性ポリヌクレオチドの遺伝子への導入を促進することによって遺伝子機能を破壊することができる。本開示は更に、遺伝子改変真核細胞を作製するために、組換えメガヌクレアーゼタンパク質又は組換えメガヌクレアーゼをコードする遺伝子の真核細胞への送達を含む方法を提供する。
本開示は更に、β−２ミクログロブリン及びＭＨＣクラスＩ分子の発現を欠く、並びに／又は内因性Ｔ細胞受容体の発現を更に欠くので、アロ反応性でなく、ＨｖＧ拒絶もＧＶＨＤも誘発しない、第三者ドナーからのＴ細胞を用いて調製された、「既製の」ＣＡＲ Ｔ細胞を提供する。このような製品は、診断に先立って作製及び検証され、必要に応じてすぐに患者に利用可能にすることができる。
本開示は更に、対象となる遺伝子座における特定のＤＮＡ配列を認識するように操作された、部位特異的、希少切断、ホーミングエンドヌクレアーゼ（「メガヌクレアーゼ」とも呼ばれる）の使用に関する。ホーミングエンドヌクレアーゼは、植物及び真菌のゲノムに一般的に見られる１５〜４０塩基対切断部位を認識する天然ヌクレアーゼの群である。これらは、１群自己スプライシングイントロン及びインテイン等の寄生性ＤＮＡエレメントとしばしば関連している。これらは、染色体に二本鎖破壊を生じさせることによって宿主ゲノムの特定の位置での相同組換え又は遺伝子挿入を自然に促進し、細胞のＤＮＡ修復機構を補充する（Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６）、Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９〜９５）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、通常、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１１）ファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリー及びＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分類される。これらのファミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を及ぼす構造モチーフを特徴とする。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１１）ファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１１）モチーフの１つ又は２つのコピーを有することを特徴とする（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００１）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７〜３７７４）。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１１）モチーフの単一コピーを有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１１）ホーミングエンドヌクレアーゼはホモ二量体を形成するが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１１）モチーフの２つのコピーを有するメンバーは単量体として見出される。
操作された部位特異的組換えメガヌクレアーゼを作製する方法は、当技術分野で公知である。Ｉ−ＣｒｅＩ（配列番号１０）は、藻類コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の葉緑体染色体中の２２塩基対の認識配列を認識及び切断する、ホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１１）ファミリーのメンバーである。野生型Ｉ−ＣｒｅＩ切断部位の優先性を改変するために、遺伝子選択技術が使用されている（Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１〜４１；Ｃｈａｍｅｓら（２００５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ１７８；Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：３８７０〜９、Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３〜５８）。より最近では、哺乳動物、酵母、植物、細菌、及びウイルスゲノム中の部位を含む広く多岐にわたるＤＮＡ部位を標的とするＩ−ＣｒｅＩ及び他のホーミングエンドヌクレアーゼを包括的に再設計することができる、モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１１）ホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計する方法が記載された（国際公開第２００７／０４７８５９号パンフレット）。
国際公開第２００９／０５９１９５号パンフレットに最初に記載されているように、Ｉ−ＣｒｅＩ及びその操作された誘導体は、通常二量体であるが、第１のサブユニットのＣ末端を第２のサブユニットのＮ末端に結合する短いペプチドリンカーを用いて単一ポリペプチドに融合することができる（Ｌｉら（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：１６５０〜６２；Ｇｒｉｚｏｔら（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：５４０５〜１９）。従って、機能的「一本鎖」メガヌクレアーゼは、単一転写産物から発現され得る。このような操作されたメガヌクレアーゼは、極めて頻度の低いオフターゲット切断を示す。一本鎖メガヌクレアーゼをコードする遺伝子を細胞に送達することによって、β−２ミクログロブリン遺伝子を特異的且つ優先的に標的化、切断、及び破壊することが可能である。
ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子のＤＮＡ標的を切断するための操作されたメガヌクレアーゼの使用は、国際公開番号ＷＯ２００８／１０２１９９号パンフレット（「１９９号出願」）及び国際公開第２００８／１０２２７４号パンフレット（「２７４号出願」）で以前開示された。１９９号出願及び２７４号出願はそれぞれ、β−２ミクログロブリン遺伝子に見られる認識配列に関するメガヌクレアーゼの選択性を増加させることを意図したアミノ酸置換を有するＩ−ＣｒｅＩ変異体を開示している。しかしながら、記載されたメガヌクレアーゼは、酵母又はＣＨＯレポーター細胞系におけるβ−２ミクログロブリンＤＮＡ標的に対する活性を有することしか示されなかった。本開示は、ヒトＴ細胞のβ−２ミクログロブリン遺伝子の認識配列を効率的に標的化及び切断する組換えメガヌクレアーゼを提供することによって、先行技術の教示を改善する。
従って、一態様では、本開示は、ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子（配列番号１）内の認識配列を認識及び切断する組換えメガヌクレアーゼを提供する。このような組換えメガヌクレアーゼは、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットは認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、第２のサブユニットは認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む。
一実施形態では、認識配列が配列番号２（即ち、Ｂ２Ｍ １３−１４認識配列）を含む。
１つのこのような実施形態では、第１のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号１２〜９６のいずれか１つの残基１９８〜３４４又は配列番号９７〜１００のいずれか１つの残基７〜１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号１２〜９６のいずれか１つの残基７〜１５３又は配列番号９７〜１００のいずれか１つの残基１９８〜３４４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
別のこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域が、（ａ）配列番号１２〜９６のいずれか１つの２１５位；又は（ｂ）配列番号９７〜１００のいずれか１つの２４位に相当する位置にＹを含む。別のこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域が、（ａ）配列番号１２〜９６のいずれか１つの２６１位；又は（ｂ）配列番号９７〜１００のいずれか１つの７０位に相当する位置にＦを含む。別のこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域が、（ａ）配列番号１２〜９６のいずれか１つのそれぞれ２１５位及び２６１位；又は（ｂ）配列番号９７〜１００のいずれか１つのそれぞれ２４位及び７０位に相当する位置にＹ及びＦの１又は複数を含む。
別のこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域が、（ａ）配列番号１２〜９６のいずれか１つの２４位；又は（ｂ）配列番号９７〜１００のいずれか１つの２１５位に相当する位置にＹを含む。別のこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域が、（ａ）配列番号１２〜９６のいずれか１つの４２位；又は（ｂ）配列番号９７〜１００のいずれか１つの２３３位に相当する位置にＹを含む。別のこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域が、（ａ）配列番号９７〜１００のいずれか１つのそれぞれ２４位及び４２位；又は（ｂ）配列番号９７〜１００のいずれか１つのそれぞれ２１５位及び２３３位に相当する位置にＹ及びＹの１又は複数を含む。
別のこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域が、配列番号１２〜９６のいずれか１つの残基２１５〜２７０又は配列番号９７〜１００のいずれか１つの残基２４〜７９を含む。別のこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域が、配列番号１２〜９６のいずれか１つの残基２４〜７９又は配列番号９７〜１００のいずれか１つの残基２１５〜２７０を含む。
別のこのような実施形態では、第１のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号１２〜９６のいずれか１つの残基１９８〜３４４又は配列番号９７〜１００のいずれか１つの残基７〜１５３を含む。別のこのような実施形態では、第２のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号１２〜９６のいずれか１つの残基７〜１５３又は配列番号９７〜１００のいずれか１つの残基１９８〜３４４を含む。
別のこのような実施形態では、組換えメガヌクレアーゼが、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーが、第１のサブユニットと第２のサブユニットを共有結合する。
別のこのような実施形態では、組換えメガヌクレアーゼが、配列番号１２〜１００のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
更なる実施形態では、認識配列が配列番号４（即ち、Ｂ２Ｍ ５−６認識配列）を含む。
１つのこのような実施形態では、第１のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号１０１〜１１１のいずれか１つの残基７〜１５３又は配列番号１１２若しくは１１３のいずれか１つの残基１９８〜３４４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号１０１〜１１１のいずれか１つの残基１９８〜３４４又は配列番号１１２若しくは１１３のいずれか１つの残基７〜１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
別のこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域が、（ａ）配列番号１０１〜１１１のいずれか１つの２４位；又は（ｂ）配列番号１１２若しくは１１３のいずれか１つの２１５位に相当する位置にＹを含む。
別のこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域が、（ａ）配列番号１０１〜１１１のいずれか１つの２１５位；又は（ｂ）配列番号１１２若しくは１１３のいずれか１つの２４位に相当する位置にＹを含む。別のこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域が、（ａ）配列番号１０１〜１１１のいずれか１つの２３３位；又は（ｂ）配列番号１１２若しくは１１３のいずれか１つの４２位に相当する位置にＷを含む。別のこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域が、（ａ）配列番号１０１〜１１１のいずれか１つのそれぞれ２１５位及び２３３位；又は（ｂ）配列番号１１２若しくは１１３のいずれか１つのそれぞれ２４位及び４２位に相当する位置にＹ及びＷの１つ又は複数を含む。
別のこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域が、配列番号１０１〜１１１のいずれか１つの残基２４〜７９又は配列番号１１２若しくは１１３のいずれか１つの残基２１５〜２７０を含む。別のこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域が、配列番号１０１〜１１１のいずれか１つの残基２１５〜２７０又は配列番号１１２若しくは１１３のいずれか１つの残基２４〜７９を含む。
別のこのような実施形態では、第１のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号１０１〜１１１のいずれか１つの残基７〜１５３又は配列番号１１２若しくは１１３のいずれか１つの残基１９８〜３４４を含む。別のこのような実施形態では、第２のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号１０１〜１１１のいずれか１つの残基１９８〜３４４又は配列番号１１２若しくは１１３のいずれか１つの残基７〜１５３を含む。
別のこのような実施形態では、組換えメガヌクレアーゼが、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーが、第１のサブユニットと第２のサブユニットを共有結合する。
別のこのような実施形態では、組換えメガヌクレアーゼが、配列番号１０１〜１１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
更なる実施形態では、認識配列が配列番号６（即ち、Ｂ２Ｍ ７−８認識配列）を含む。
１つのこのような実施形態では、第１のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号１１４〜１１８のいずれか１つの残基７〜１５３又は配列番号１１９〜１２４のいずれか１つの残基１９８〜３４４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号１１４〜１１８のいずれか１つの残基１９８〜３４４又は配列番号１１９〜１２４のいずれか１つの残基７〜１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
別のこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域が、（ａ）配列番号１１４〜１１８のいずれか１つの４４位；又は（ｂ）配列番号１１９〜１２４のいずれか１つの２３５位に相当する位置にＳを含む。別のこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域が、（ａ）配列番号１１４〜１１８のいずれか１つの４６位；又は（ｂ）配列番号１１９〜１２４のいずれか１つの２３７位に相当する位置にＦを含む。別のこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域が、（ａ）配列番号１１４〜１１８のいずれか１つのそれぞれ４４位及び４６位；又は（ｂ）配列番号１１９〜１２４のいずれか１つのそれぞれ２３５位及び２３７位に相当する位置にＳ及びＦの１つ又は複数を含む。
別のこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域が、（ａ）配列番号１１４〜１１８のいずれか１つの２１５位；又は（ｂ）配列番号１１９〜１２４のいずれか１つの２４位に相当する位置にＹを含む。
別のこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域が、配列番号１１４〜１１８のいずれか１つの残基２４〜７９又は配列番号１１９〜１２４のいずれか１つの残基２１５〜２７０を含む。別のこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域が、配列番号１１４〜１１８のいずれか１つの残基２１５〜２７０又は配列番号１１９〜１２４のいずれか１つの残基２４〜７９を含む。
別のこのような実施形態では、第１のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号１１４〜１１８のいずれか１つの残基７〜１５３又は配列番号１１９〜１２４のいずれか１つの残基１９８〜３４４を含む。別のこのような実施形態では、第２のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号１１４〜１１８のいずれか１つの残基１９８〜３４４又は配列番号１１９〜１２４のいずれか１つの残基７〜１５３を含む。
別のこのような実施形態では、組換えメガヌクレアーゼが、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーが、第１のサブユニットと第２のサブユニットを共有結合する。
別のこのような実施形態では、組換えメガヌクレアーゼが、配列番号１１４〜１２４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
更なる実施形態では、認識配列が配列番号８（即ち、Ｂ２Ｍ１１−１２認識配列）を含む。
１つのこのような実施形態では、第１のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号１２５の残基７〜１５３又は配列番号１２６の残基１９８〜３４４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号１２５の残基１９８〜３４４又は配列番号１２６の残基７〜１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
別のこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域が、（ａ）配列番号１２５の２４位；又は（ｂ）配列番号１２６の２１５位に相当する位置にＹを含む。別のこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域が、（ａ）配列番号１２５の２８位；又は（ｂ）配列番号１２６の２１９位に相当する位置にＷを含む。別のこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域が、（ａ）配列番号１２５の４２位；又は（ｂ）配列番号１２６の２３３位に相当する位置にＧを含む。別のこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域が、（ａ）配列番号１２５のそれぞれ２４位、２８位、及び４２位；又は（ｂ）配列番号１２６のそれぞれ２１５位、２１９位、及び２３３位に相当する位置にＹ、Ｗ、及びＧの１つ又は複数を含む。
別のこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域が、（ａ）配列番号１２５の２３３位；又は（ｂ）配列番号１２６の４２位に相当する位置にＶを含む。
別のこのような実施形態では、ＨＶＲ１領域が、配列番号１２５の残基２４〜７９又は配列番号１２６の残基２１５〜２７０を含む。別のこのような実施形態では、ＨＶＲ２領域が、配列番号１２５の残基２１５〜２７０又は配列番号１２６の残基２４〜７９を含む。
別のこのような実施形態では、第１のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号１２５の残基７〜１５３又は配列番号１２６の残基１９８〜３４４を含む。別のこのような実施形態では、第２のメガヌクレアーゼサブユニットが、配列番号１２５の残基１９８〜３４４又は配列番号１２６の残基７〜１５３を含む。
別のこのような実施形態では、組換えメガヌクレアーゼが、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーが、第１のサブユニットと第２のサブユニットを共有結合する。
別のこのような実施形態では、組換えメガヌクレアーゼが、配列番号１２５及び１２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本開示の種々の態様では、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである。一実施形態では、ｍＲＮＡが、本明細書に記載される単一組換えメガヌクレアーゼをコードすることができる。他の実施形態では、ｍＲＮＡが、本明細書に記載される少なくとも１つのメガヌクレアーゼ及び１つの更なる遺伝子をコードするポリシストロン性（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ｍＲＮＡ（例えば、バイシストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）、トリシストロン性（ｔｒｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）等）である。特定の実施形態では、ポリシストロニックｍＲＮＡが、同じ遺伝子内の異なる認識配列を標的化する本開示の２以上のメガヌクレアーゼをコードすることができる。他の実施形態では、ポリシストロン性ｍＲＮＡが、本明細書に記載されるメガヌクレアーゼ及び同じ遺伝子内の異なる認識配列を標的化する、又は別の遺伝子内の異なる認識配列を標的化する第２のヌクレアーゼをコードすることができる。具体的な実施形態では、ポリシストロン性ｍＲＮＡが、本明細書に記載されるＢ２Ｍ認識配列を認識及び切断する本明細書に記載されるメガヌクレアーゼ、並びにＴ細胞受容体α定常領域内の認識配列を認識及び切断するヌクレアーゼをコードすることができる。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。一実施形態では、組換えＤＮＡ構築物がウイルスベクターをコードする。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを提供する。一実施形態では、ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである。
別の態様では、本開示は、真核細胞の染色体に挿入された対象となる外因性配列を含む遺伝子改変真核細胞を作製する方法であって、（ａ）本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び（ｂ）対象となる配列を含む核酸配列を含む１つ又は複数の核酸で真核細胞をトランスフェクトすることを含み；組換えメガヌクレアーゼが配列番号２、配列番号４、配列番号６、又は配列番号８を含む認識配列で染色体中に切断部位を生成し、対象となる配列が切断部位で染色体に挿入される、方法を提供する。
本方法の一実施形態では、β−２ミクログロブリンの細胞表面発現が対照細胞と比較して低下する。
本方法の別の実施形態では、遺伝子改変細胞が、対照細胞と比較して、宿主に導入された場合、又は対象に投与された場合に、低下したアロ反応性及び／又は減少したアロゲニシティ（ａｌｌｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を示す。
本方法の別の実施形態では、対象となる配列を含む核酸が切断部位に隣接する配列と相同な配列をさらに含み、対象となる配列が相同組換えによって切断部位で挿入される。
本方法の別の実施形態では、対象となる配列を含む核酸が切断部位との実質的な相同性を欠いており、対象となる配列が非相同末端結合によって染色体に挿入される。
本方法の別の実施形態では、対象となる配列がキメラ抗原受容体をコードする。本方法の別の実施形態では、対象となる配列が外因性Ｔ細胞受容体をコードする。
本方法の別の実施形態では、少なくとも対象となる配列を含む核酸が、ウイルスベクターによって真核細胞に導入される。本方法の別の実施形態では、組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列及び対象となる配列をコードする核酸配列が、同じウイルスベクター又は別個のウイルスベクターによって真核細胞に導入される。本方法のいくつかの実施形態では、ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである。本方法の特定の実施形態では、ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである。
本方法の別の実施形態では、少なくとも対象となる配列をコードする核酸が、一本鎖ＤＮＡ鋳型を用いて真核細胞に導入される。
本方法の別の実施形態では、真核細胞がヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞である。
本方法の別の実施形態では、真核細胞が、対照細胞と比較して低下した内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現を示すように遺伝子改変されている。
別の態様では、本方法が、（ａ）第２の認識配列を認識及び切断するエンドヌクレアーゼをコードする核酸で真核細胞をトランスフェクトすること；又は（ｂ）第２の認識配列を認識及び切断するエンドヌクレアーゼを真核細胞に導入することを更に含むことができ；第二の認識配列が内因性Ｔ細胞受容体の成分をコードする遺伝子に位置し、遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較して低下したβ−２ミクログロブリン及び内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現を示す。
１つのこのような実施形態では、エンドヌクレアーゼが組換えメガヌクレアーゼである。別のこのような実施形態では、第２の認識配列が配列番号１２７に示されるように、ヒトＴ細胞受容体α定常領域遺伝子に位置する。別のこのような実施形態では、第２の認識配列が配列番号１２８、１２９、又は１３０（即ち、それぞれＴＲＣ１−２、ＴＲＣ３−４、及びＴＲＣ５−６認識配列）を含むことができる。
別のこのような実施形態では、核酸が、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼと第２の認識配列を認識及び切断するエンドヌクレアーゼの両方をコードするポリシストロン性ｍＲＮＡである。
別の態様では、本開示は、真核細胞の染色体に挿入された対象となる外因性配列を含む遺伝子改変真核細胞を作製する方法であって、（ａ）本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼを真核細胞に導入することと；（ｂ）対象となる配列を含む核酸で真核細胞をトランスフェクトすることと、を含み；組換えメガヌクレアーゼが配列番号２、配列番号４、配列番号６、又は配列番号８を含む認識配列で染色体中に切断部位を生成し、対象となる配列が切断部位で染色体に挿入される、方法を提供する。
本方法の一実施形態では、β−２ミクログロブリンの細胞表面発現が対照細胞と比較して低下する。
本方法の別の実施形態では、遺伝子改変細胞が、対照細胞と比較して、宿主に導入された場合又は対象に投与された場合に、低下したアロ反応性及び／又は減少したアロゲニシティ（ａｌｌｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を示す。
本方法の別の実施形態では、対象となる配列を含む核酸が切断部位に隣接する配列と相同な配列を更に含み、対象となる配列が相同組換えによって切断部位で挿入される。
本方法の別の実施形態では、対象となる配列を含む核酸が切断部位との実質的な相同性を欠いており、対象となる配列が非相同末端結合によって染色体に挿入される。
本方法の別の実施形態では、対象となる配列がキメラ抗原受容体をコードする。本方法の別の実施形態では、対象となる配列が外因性Ｔ細胞受容体をコードする。
本方法の別の実施形態では、対象となる配列を含む核酸が、ウイルスベクターによって真核細胞に導入される。本方法のいくつかの実施形態では、ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである。
本方法の別の実施形態では、対象となる配列をコードする核酸が、一本鎖ＤＮＡ鋳型を用いて真核細胞に導入される。
本方法の別の実施形態では、真核細胞がヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞である。
本方法の別の実施形態では、真核細胞が、対照細胞と比較して低下した内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現を示すように遺伝子改変されている。
別の実施形態では、本方法が、（ａ）第２の認識配列を認識及び切断するエンドヌクレアーゼをコードする核酸で真核細胞をトランスフェクトすること；又は（ｂ）第２の認識配列を認識及び切断するエンドヌクレアーゼを真核細胞に導入することを更に含むことができ；第二の認識配列が内因性Ｔ細胞受容体の成分をコードする遺伝子に位置し、遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較して低下したβ−２ミクログロブリン及び内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現を示す。
１つのこのような実施形態では、エンドヌクレアーゼが組換えメガヌクレアーゼである。別のこのような実施形態では、第２の認識配列が配列番号１２７に示されるように、ヒトＴ細胞受容体α定常領域遺伝子に位置する。別のこのような実施形態では、第２の認識配列が配列番号１２８、１２９、又は１３０（即ち、それぞれＴＲＣ１−２、ＴＲＣ３−４、及びＴＲＣ５−６認識配列）を含むことができる。
別の態様では、本開示は、真核細胞の染色体中の標的配列を破壊することによって遺伝子改変真核細胞を作製する方法であって、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸で真核細胞をトランスフェクトすること、又は本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼを真核細胞に導入することを含み；メガヌクレアーゼが配列番号２、配列番号４、配列番号６、又は配列番号８を含む認識配列で染色体中に切断部位を生成し、標的配列が切断部位で非相同末端結合によって破壊される、方法を提供する。このような方法では、遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較して低下したβ−２ミクログロブリンの細胞表面発現を示す。
本方法の一実施形態では、遺伝子改変細胞が、対照細胞と比較して、宿主に導入された場合又は対象に投与された場合に、低下したアロ反応性及び／又は減少したアロゲニシティを示す。
本方法の別の実施形態では、真核細胞がヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞である。
本方法の別の実施形態では、真核細胞が、対照細胞と比較して低下した内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現を示すように遺伝子改変されている。
別の実施形態では、本方法が、（ａ）第２の認識配列を認識及び切断するエンドヌクレアーゼをコードする核酸で真核細胞をトランスフェクトすること；又は（ｂ）第２の認識配列を認識及び切断するエンドヌクレアーゼを真核細胞に導入することを更に含む。このような実施形態では、エンドヌクレアーゼが組換えメガヌクレアーゼである。別のこのような実施形態では、第２の認識配列が内因性Ｔ細胞受容体の成分をコードする遺伝子に位置し、遺伝子改変真核細胞が、対照細胞と比較して低下したβ−２ミクログロブリンと内因性Ｔ細胞受容体の両方の細胞表面発現を示す。
このような実施形態では、核酸が、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼと第２の認識配列を認識及び切断するエンドヌクレアーゼの両方をコードするポリシストロン性ｍＲＮＡである。
本方法の別の実施形態では、真核細胞が細胞表面キメラ抗原受容体を発現する。本方法の別の実施形態では、対象となる配列が外因性Ｔ細胞受容体をコードする。
別の実施形態では、本方法が、対象となる外因性配列を含む核酸で真核細胞をトランスフェクトすることを更に含む。このような実施形態では、対象となる外因性配列を含む核酸が第２の切断部位に隣接する配列と相同な配列を更に含み、対象となる配列が相同組換えによって第２の切断部位で挿入される。別のこのような実施形態では、対象となる配列を含む核酸が切断部位との実質的な相同性を欠いており、対象となる配列が非相同末端結合によって染色体に挿入される。
別のこのような実施形態では、対象となる外因性配列がキメラ抗原受容体をコードする。別のこのような実施形態では、対象となる外因性が外因性Ｔ細胞受容体をコードする。
別のこのような実施形態では、少なくとも対象となる外因性配列を含む核酸が、ウイルスベクターによって真核細胞に導入される。別のこのような実施形態では、エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列及び対象となる配列をコードする核酸配列が、同じウイルスベクター又は別個のウイルスベクターによって真核細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである。
別のこのような実施形態では、対象となる配列をコードする核酸が、一本鎖ＤＮＡ鋳型を用いて真核細胞に導入される。
別の態様では、本開示は、遺伝子改変非ヒト生物を作製する方法であって、本明細書に記載される方法により遺伝子改変非ヒト真核細胞を作製することと；（ｂ）遺伝子改変非ヒト真核細胞を増殖させて、遺伝子改変非ヒト生物を作製することとを含む方法を提供する。
本方法の一実施形態では、非ヒト真核細胞が配偶子、接合体、胚盤胞細胞、胚性幹細胞、及びプロトプラスト細胞からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、そのゲノム中に、改変ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子を含む遺伝子改変細胞であって、改変β−２ミクログロブリン遺伝子が、５’から３’まで、：（ａ）ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子の５’領域；（ｂ）外因性ポリヌクレオチド；及び（ｃ）ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子の３’領域を含む、遺伝子改変細胞を提供する。遺伝子改変細胞は、遺伝子改変ヒトＴ細胞又はヒトＴ細胞に由来する遺伝子改変細胞であり得る。更に、遺伝子改変細胞は、未改変対照細胞と比較して低下したβ−２ミクログロブリンの細胞表面発現を有することができる。
一実施形態では、外因性ポリヌクレオチドがキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含み、キメラ抗原受容体が細胞外リガンド結合ドメイン及び１又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
別の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドが、配列番号２（即ち、Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列）、配列番号４（即ち、Ｂ２Ｍ５−６認識配列）、配列番号６（即ち、Ｂ２Ｍ７−８認識配列）、又は配列番号８（即ち、Ｂ２Ｍ１１−１２認識配列）を含む認識配列内の位置でβ−２ミクログロブリン遺伝子に挿入される。
別の態様では、本開示は、医薬品として使用するための本明細書に記載される遺伝子改変真核細胞を提供する。本開示は更に、それを必要とする対象の疾患を治療するための医薬品の製造における、本明細書に記載される遺伝子改変真核細胞の使用を提供する。１つのこのような実施形態では、医薬品ががんの治療に有用である。別の実施形態では、医薬品が免疫療法を用いたがんの治療に有用である。
別の態様では、本開示は、遺伝子改変真核細胞の集団を提供する。一実施形態では、集団が、少なくとも１×１０６個、２×１０６個、５×１０６個、１×１０９個、２×１０９個、５×１０９個、又はそれ以上の遺伝子改変真核細胞を含む。
別の実施形態では、集団中の遺伝子改変真核細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上が、対照細胞と比較して低下した内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現を示し、遺伝子改変真核細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上が、対照細胞と比較して低下したβ−２ミクログロブリンの細胞表面発現を示す。
別の実施形態では、真核細胞の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上がキメラ抗原受容体を発現する。
別の実施形態では、遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変Ｔ細胞又はそれに由来する細胞である。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される遺伝子改変真核細胞又は遺伝子改変真核細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、遺伝子改変真核細胞が遺伝子改変Ｔ細胞又はそれに由来する細胞である。特定の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体を発現し、β−２ミクログロブリン及び内因性Ｔ細胞受容体の低下した細胞表面発現を示す。本開示のこのような医薬組成物は、がんを治療するための免疫療法としての使用に適している。
更なる態様では、遺伝子改変Ｔ細胞が、対照細胞と比較して、宿主に導入された場合又は対象に投与された場合に、低下したアロ反応性及び／又は減少したアロゲニシティを示す。
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象のがんを治療する方法であって、本明細書に記載される医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。このような方法は、がんを治療するための免疫療法を表す。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキメラ抗原受容体が、少なくとも細胞外リガンド結合ドメイン又は部分と、１又は複数のシグナル伝達ドメイン及び／又は共刺激ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイン又は部分が、特定のエピトープ又は抗原（例えば、がん細胞又は他の疾患を引き起こす細胞若しくは粒子等の細胞の表面上に優先的に存在するエピトープ又は抗原）に対する特異性を提供するモノクローナル抗体に由来する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の形態である。ｓｃＦｖはリンカー配列を介して結合している。細胞外リガンド結合ドメインは、対象となる任意の抗原又はエピトープに特異的である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖがヒト化又は完全ヒトである。キメラ抗原受容体の細胞外ドメインはまた、Ｂリンパ球上の自己抗原特異的Ｂ細胞受容体によって認識される自己抗原（Ｐａｙｎｅら（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３５３巻（６２９５）：１７９〜１８４参照）を含み、従ってＴ細胞を標的に特異的に向け、抗体媒介自己免疫疾患において自己反応性Ｂリンパ球を死滅させることができる。このようなＣＡＲはキメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）と呼ばれ、その使用は本開示に包含される。
本開示の前記の及び他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲を参照することによって、より完全に理解され得る。明確にするために、別個の実施形態の文脈で記載される本開示の一定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得る。実施形態の全ての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、あたかもそれぞれの及び全ての組み合わせが個別的に又は明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で記載される本開示の種々の特徴は、別々に又は任意の適切な部分組み合わせでも提供され得る。実施形態で列挙される特徴の全ての部分組み合わせも、本開示によって具体的に包含され、あたかもそれぞれの及び全てのこのような部分組み合わせが本明細書に個別的に又は明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。本明細書に開示される本開示の各態様の実施形態は、必要な変更を加えて本開示の各他の態様に適用される。
ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子のＢ２Ｍ認識配列を示す図である。本開示の組換えメガヌクレアーゼによって標的化される各認識配列は、２つの認識半部位を含む。各認識半部位は、４塩基対の中央配列によって分離された９塩基対を含む。Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列（配列番号２）は、ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子（配列番号１）のヌクレオチド９１１５〜９１３６に及んでおり、Ｂ２Ｍ１３及びＢ２Ｍ１４と呼ばれる２つの認識半部位を含む。Ｂ２Ｍ５−６認識配列（配列番号４）は、ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子（配列番号１）のヌクレオチド８９５１〜８９７２に及んでおり、Ｂ２Ｍ５及びＢ２Ｍ６と呼ばれる２つの認識半部位を含む。Ｂ２Ｍ７−８認識配列（配列番号６）は、ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子（配列番号１）のヌクレオチド９１８２〜９２０３に及んでおり、Ｂ２Ｍ７及びＢ２Ｍ８と呼ばれる２つの認識半部位を含む。Ｂ２Ｍ１１−１２認識配列（配列番号８）は、ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子（配列番号１）のヌクレオチド５０５７〜５０７８に及んでおり、Ｂ２Ｍ１１及びＢ２Ｍ１２と呼ばれる２つの認識半部位を含む。 本開示の組換えメガヌクレアーゼは、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットが第１の認識半部位（例えば、Ｂ２Ｍ１３、Ｂ２Ｍ５、Ｂ２Ｍ７、又はＢ２Ｍ１１）に結合し、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットが第２の認識半部位（例えば、Ｂ２Ｍ１４、Ｂ２Ｍ６、Ｂ２Ｍ８、又はＢ２Ｍ１２）に結合する２つのサブユニットを含むことを示す図である。組換えメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットを、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして配置することができる。同様に、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットを、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして配置することができる。 β−２ミクログロブリン遺伝子（配列番号１）に見られる認識配列を標的化する組換えメガヌクレアーゼを評価するためのＣＨＯ細胞におけるレポーターアッセイの概略図である。本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼについては、レポーターカセットが細胞のゲノムに安定に組み込まれたＣＨＯ細胞株を作製した。レポーターカセットは、５’から３’の順序で、ＳＶ４０初期プロモータ；ＧＦＰ遺伝子の５’２／３；本開示の操作されたメガヌクレアーゼについての認識配列（例えば、Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列、Ｂ２Ｍ５−６認識配列、Ｂ２Ｍ７−８認識配列、又はＢ２Ｍ１１−１２認識配列）；ＣＨＯ−２３／２４メガヌクレアーゼについての認識配列（国際公開第２０１２／１６７１９２号パンフレット）；及びＧＦＰ遺伝子の３’２／３を含んでいた。このカセットで安定にトランスフェクトされた細胞は、ＤＮＡ破壊誘発剤の非存在下ではＧＦＰを発現しなかった。メガヌクレアーゼは、それぞれのメガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡの形質導入によって導入された。メガヌクレアーゼ認識配列のいずれかでＤＮＡ破壊が誘発されると、ＧＦＰ遺伝子の重複領域が互いに組み換えられて機能的ＧＦＰ遺伝子を産生した。次いで、ＧＦＰ発現細胞の割合を、メガヌクレアーゼによるゲノム切断の頻度の間接的尺度として、フローサイトメトリーによって決定することができた。 ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおいて、ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子（配列番号１）の認識配列を認識及び切断するための組換えメガヌクレアーゼの効率を示す図である。配列番号１２〜１２６に示される組換えメガヌクレアーゼの各々を、Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列（配列番号２）、Ｂ２Ｍ５−６認識配列（配列番号４）、Ｂ２Ｍ７−８認識配列（配列番号６）、又はＢ２Ｍ１１−１２認識配列（配列番号８）を標的化するように操作し、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイで有効性についてスクリーニングした。示される結果は、各アッセイで観察されるＧＦＰ発現細胞の割合を提供しており、β−２ミクログロブリン標的認識配列又はＣＨＯ−２３／２４認識配列の切断についての各メガヌクレアーゼの有効性を示している。陰性対照（Ｂ２Ｍ ｂｓ）を更に各アッセイに含めた。 Ｂ２Ｍ５−６認識配列を標的化するメガヌクレアーゼを示す図である。 Ｂ２Ｍ７−８認識配列を標的化するメガヌクレアーゼを示す図である。 Ｂ２Ｍ１１−１２認識配列を標的化するメガヌクレアーゼを示す図である。 Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列を標的化するメガヌクレアーゼを示す図である。 Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列を標的化するメガヌクレアーゼを示す図である。 Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列を標的化するメガヌクレアーゼを示す図である。 Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列を標的化するメガヌクレアーゼを示す図である。 Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列を標的化するメガヌクレアーゼを示す図である。 Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列を標的化するメガヌクレアーゼを示す図である。 Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列を標的化するメガヌクレアーゼを示す図である。 ヒトＴ細胞におけるβ−２ミクログロブリンの細胞表面発現を阻害するための組換えＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼの効率を示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。陽性対照として、細胞を疑似電気穿孔した。電気穿孔効率についての更なる対照では、細胞を、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。電気穿孔の３日後、β−２ミクログロブリンを認識する抗体で細胞を染色し、フローサイトメトリーによって分析した。 ヒトＴ細胞におけるβ−２ミクログロブリンの細胞表面発現を阻害するための組換えＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼの効率を示す図である。第１のメガヌクレアーゼサブユニットがＢ２Ｍ１３−１４ｘ．９３と同じままであるが、第２のメガヌクレアーゼサブユニットがＢ２Ｍ１３−１４認識配列と接触する位置に新しいアミノ酸置換を含む追加のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼを設計した。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔したことを示す図である。Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＥを、以前の変異体との比較を可能にするために含めた。電気穿孔の６日後に、細胞を、β−２ミクログロブリンを認識する抗体及びＣＤ３を認識する抗体で染色した。データをフローサイトメトリープロットによって提示する。 ヒトＴ細胞におけるβ−２ミクログロブリンの細胞表面発現を阻害するための組換えＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼの効率を示す図である。更なるＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼを作製し、ヒトＴ細胞上のβ−２ミクログロブリンの細胞表面発現を排除するそれらの能力について評価した。これらのヌクレアーゼは、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６９に基づいていた。第１のメガヌクレアーゼサブユニットにアミノ酸置換を行って代わりの塩基接触を導入した一方、第２のメガヌクレアーゼサブユニットはＢ２Ｍ１３−１４ｘ．１６９と同じままであった。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。 ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔したことを示す図である。Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２０２を、図６Ａ〜図６Ｊに示される以前の変異体との比較を可能にするために含めた。細胞を、β−２ミクログロブリンを認識する抗体及びＣＤ３を認識する抗体で染色した。４０％超のＢ２Ｍノックアウト効率を示したＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼのフローサイトメトリーデータを示す。 異なるメガヌクレアーゼをコードする２つのｍＲＮＡの同時ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）によるヒトＴ細胞におけるβ−２ミクログロブリン及びＴ細胞受容体の二重ノックアウトを示す図である。ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で２日間刺激し、次いで、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２０２をコードするｍＲＮＡ及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを用いて同時電気穿孔（ｃｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ）した。対照として、ヒトＴ細胞を模擬電気穿孔した、又はＢ２Ｍ１３−１４ｘ．２０２若しくはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥのいずれかの単一メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。電気穿孔の６日後、細胞をＣＤ３に対する抗体及びＢ２Ｍに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。 模擬電気穿孔細胞を示す図である。 ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥヌクレオフェクションした（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）細胞を示す図である。 Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２０２ヌクレオフェクションした細胞を示す図である。 Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２０２及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥで二重ヌクレオフェクションした細胞を示す図である。 異なるメガヌクレアーゼをコードする２つのｍＲＮＡの同時ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）によるヒトＴ細胞におけるβ−２ミクログロブリン及びＴ細胞受容体の二重ノックアウトを示す図である。ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で２日間刺激し、次いで、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６９をコードするｍＲＮＡ及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを用いて同時電気穿孔した。対照として、ヒトＴ細胞を模擬電気穿孔した、又はＢ２Ｍ１３−１４ｘ．１６９若しくはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥのいずれかの単一メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。電気穿孔の６日後、細胞をＣＤ３に対する抗体及びＢ２Ｍに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。 模擬ヌクレオフェクションした細胞を示す図である。 ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥヌクレオフェクションした細胞を示す図である。 Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６９ヌクレオフェクションした細胞を示す図である。 Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６９及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥで二重ヌクレオフェクションした細胞を示す図である。 逐次ヌクレオフェクションによる、ヒトＴ細胞におけるβ−２ミクログロブリン及びＴ細胞受容体の二重ノックアウトを示す図である。ドナーＣＤ３＋ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＥをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。電気穿孔の４日後に、ビオチン化抗Ｂ２Ｍ抗体及びヒトビオチン選択カクテルキットを用いてＢ２Ｍ陰性細胞を濃縮した。Ｂ２Ｍ陰性濃縮細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間再刺激し、次いで、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。電気穿孔の５日後、細胞をＢ２Ｍ及びＴＣＲに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。 模擬ヌクレオフェクションした細胞を示す図である。 Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＥヌクレオフェクションした細胞を示す図である。 Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＥ及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥで二重ヌクレオフェクションした細胞を示す図である。 β−２ミクログロブリン及びＴ細胞受容体二重ノックアウト集団の濃縮を示す図である。ドナーヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で２日間刺激し、次いで、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＥをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。Ｂ２Ｍ陰性細胞を濃縮し、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間再刺激し、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。電気穿孔の６日後、ＣＤ３陰性細胞を、ＣＤ３陽性選択キットを用いて濃縮し、引き続いてビオチン化抗Ｂ２Ｍ抗体及びビオチン選択キットを用いてＢ２Ｍ陰性細胞を更に濃縮した。濃縮細胞をＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１５の存在下で３日間インキュベートし、次いで、Ｂ２Ｍ及びＣＤ３に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。 抗ＣＤ３抗体で染色した非ヌクレオフェクトＰＢＭＣを示す図である。 抗ＣＤ３抗体及び抗Ｂ２Ｍ抗体で染色した非ヌクレオフェクトＰＢＭＣを示す図である。 抗ＣＤ３抗体及び抗Ｂ２Ｍ抗体で染色したβ−２ミクログロブリン及びＴ細胞受容体二重ノック細胞の濃縮集団を示す図である。 Ｂ２ＭノックアウトＴ細胞の減少したアロゲニシティを示す図である。２人のドナー（ドナー３６及びドナー７５）からのＴ細胞及び別のドナーからの不適合樹状細胞を用いて、同種異系細胞傷害性アッセイでＢ２ＭノックアウトＴ細胞のアロゲニシティを測定した。細胞傷害性を、ＶＡＤ−ＦＭＫ−ＦＩＴＣシグナルによって測定した。 野生型Ｔ細胞；ドナー３６由来のエフェクター細胞及びドナー細胞を示す図である。 野生型Ｔ細胞；ドナー３６由来のエフェクター細胞、ドナー７５由来の標的細胞を示す図である。 野生型Ｔ細胞；ドナー７５由来のエフェクター細胞及びドナー細胞を示す図である。 野生型Ｔ細胞；ドナー７５由来のエフェクター細胞、ドナー３６由来の標的細胞を示す図である。 Ｂ２ＭノックアウトＴ細胞；ドナー３６由来のエフェクター細胞及びドナー細胞を示す図である。 Ｂ２ＭノックアウトＴ細胞；ドナー３６由来のエフェクター細胞、ドナー７５由来の標的細胞を示す図である。 Ｂ２ＭノックアウトＴ細胞；ドナー７５由来のエフェクター細胞及びドナー細胞を示す図である。 Ｂ２ＭノックアウトＴ細胞；ドナー７５由来のエフェクター細胞、ドナー３６由来の標的細胞を示す図である。 Ｂ２ＭノックアウトＴ細胞の減少したアロゲニシティを示す図である。ＥＬＩＳＡによって測定したＩＦＮ−γ分泌によって決定される細胞傷害性を示す図である。 Ｂ２ＭノックアウトＴ細胞の減少したアロゲニシティを示す図である。ＬＤＨ分泌によって決定される細胞傷害性を示す図である。 バイシストロン性ｍＲＮＡを用いたＴＲＣとＢ２Ｍの同時ノックアウトを示す図である。ドナーヒトＴ細胞を、１μｇのＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ ｍＲＮＡ又はＢ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９ＲＮＡを用いて電気穿孔した。細胞の更なる試料を、両方の個々のヌクレアーゼｍＲＮＡの各１μｇを用いて電気穿孔した。対照として、ヒトＴ細胞をｍＲＮＡの非存在下で電気穿孔した。電気穿孔の３日後及び７日後に、バイシストロン性ｍＲＮＡを用いて電気穿孔した細胞をＣＤ３（ＴＲＣノックダウンを決定するため）に対する抗体及びＢ２Ｍに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。 模擬処理を示す図である。 Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９を示す図である。 ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを示す図である。 ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ及びＢ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９を示す図である。 Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣを示す図である。 Ｂ２Ｍ−Ｅ２Ａ−ＴＲＣを示す図である。 Ｂ２Ｍ−Ｆ２Ａ−ＴＲＣを示す図である。 Ｂ２Ｍ−Ｐ２Ａ−ＴＲＣを示す図である。 Ｂ２Ｍ−Ｔ２Ａ−ＴＲＣを示す図である。 ＴＲＣ−ＩＲＥＳ−Ｂ２Ｍを示す図である。 ＴＲＣ−Ｅ２Ａ−Ｂ２Ｍを示す図である。 ＴＲＣ−Ｆ２Ａ−Ｂ２Ｍを示す図である。 ＴＲＣ−Ｐ２Ａ−Ｂ２Ｍを示す図である。 ＴＲＣ−Ｔ２Ａ−Ｂ２Ｍを示す図である。 Ｔ細胞におけるバイシストロン性ｍＲＮＡの滴定を示す図である。Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣ、Ｂ２Ｍ−Ｔ２Ａ−ＴＲＣ、ＴＲＣ−Ｐ２Ａ−Ｂ２Ｍ、又はＴＲＣ−Ｔ２Ａ−Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡを、増加する濃度でドナーヒトＴ細胞に導入し、細胞表面ＣＤ３及びＢ２Ｍのノックダウン率（ＴＲＣノックダウンを示した）を決定した。比較のために、ドナーヒトＴ細胞を、１μｇのＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ又は１μｇのＢ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９を用いて電気穿孔した。更に、ドナーヒトＴ細胞を、０．５μｇの各ヌクレアーゼ又は１μｇの各ヌクレアーゼの用量を使用して、別々のＲＮＡ分子にコードされた両ヌクレアーゼを用いて電気穿孔した。対照として、ヒトＴ細胞をＲＮＡなしで電気穿孔した。電気穿孔の７日後に、細胞を計数し、トリパンブルーを用いて生存率を評価した。細胞をＣＤ３（ＴＲＣノックダウンを決定するため）に対する抗体及びＢ２Ｍに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析し、同様にゴースト色素７８０で染色して死細胞を分析から除外した。 Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣ１μｇを示す図である。 Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣ２μｇを示す図である。 Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣ４μｇを示す図である。 Ｂ２Ｍ−Ｔ２Ａ−ＴＲＣ１μｇを示す図である。 Ｂ２Ｍ−Ｔ２Ａ−ＴＲＣ２μｇを示す図である。 Ｂ２Ｍ−Ｔ２Ａ−ＴＲＣ４μｇを示す図である。 ＴＲＣ−Ｐ２Ａ−Ｂ２Ｍ１μｇを示す図である。 ＴＲＣ−Ｐ２Ａ−Ｂ２Ｍ２μｇを示す図である。 ＴＲＣ−Ｐ２Ａ−Ｂ２Ｍ４μｇを示す図である。 ＴＲＣ−Ｔ２Ａ−Ｂ２Ｍ１μｇを示す図である。 ＴＲＣ−Ｔ２Ａ−Ｂ２Ｍ２μｇを示す図である。 ＴＲＣ−Ｔ２Ａ−Ｂ２Ｍ４μｇを示す図である。 ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥを示す図である。 Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９を示す図である。 ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ０．５μｇ及びＢ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９ ０．５μｇを示す図である。 ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ１．０μｇ及びＢ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９ １．０μｇを示す図である。 バイシストロン性ｍＲＮＡ及びＡＡＶを用いた抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞の作製を示す図である。バイシストロン性Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣをＡＡＶベクターと共に使用して、キメラ抗原受容体をコードする外因性核酸配列を、相同組換えを介して、ＴＲＣ１−２認識配列でヒトＴ細胞のゲノムに導入し、同時にＴ細胞受容体とＢ２Ｍの両方の細胞表面発現をノックアウトした。ＡＡＶベクターは、相同性アームが隣接した、前に記載した抗ＣＤ１９ＣＡＲコード配列を含む核酸を含んでいた。ＣＡＲカセットの発現をＪｅＴプロモータによって駆動した。対照として、細胞を、ＡＡＶ形質導入の前に、１μｇのＴＲＣ１−２ｘ８７ＥＥ ＲＮＡを用いて電気穿孔した。更に、Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣ及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ電気穿孔細胞を模擬形質導入した。電気穿孔／形質導入の３日後及び６日後に、編集された細胞をＣＤ３（ＴＲＣノックダウンを決定するため）に対する抗体及びＢ２Ｍに対する抗体並びにＣＡＲを検出するためのビオチン化組換えＣＤ１９−Ｆｃ融合タンパク質で染色した。ストレプトアビジン−ＰＥをＣＡＲ染色のための二次検出試薬として使用した。ＣＤ３、Ｂ２ｍ及びＣＡＲレベルをフローサイトメトリーによって評価した。 ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥでのヌクレオフェクション後のＣＤ３（Ｘ軸）及びＢ２Ｍ（Ｙ軸）についての染色を示す図である。 Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣでのヌクレオフェクション後のＣＤ３（Ｘ軸）及びＢ２Ｍ（Ｙ軸）についての染色を示す図である。 ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥでのヌクレオフェクション及び模擬形質導入後のＣＤ３（Ｘ軸）及びＣＡＲ（Ｙ軸）についての染色を示す図である。 Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣでのヌクレオフェクション及び模擬形質導入後のＣＤ３（Ｘ軸）及びＣＡＲ（Ｙ軸）についての染色を示す図である。 ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥでのヌクレオフェクション及びＡＡＶによる形質導入後のＣＤ３（Ｘ軸）及びＣＡＲ（Ｙ軸）についての染色を示す図である。 Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣでのヌクレオフェクション及びＡＡＶによる形質導入後のＣＤ３（Ｘ軸）及びＣＡＲ（Ｙ軸）についての染色を示す図である。 ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥでヌクレオフェクションし、ＡＡＶにより形質導入した細胞におけるＢ２Ｍについての染色を示す図である。 Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣでヌクレオフェクションし、ＡＡＶにより形質導入した細胞におけるＢ２Ｍについての染色を示す図である。
配列の簡単な説明
配列番号１は、ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子の核酸配列を示す。
配列番号２は、Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列（センス）の核酸配列を示す。
配列番号３は、Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。
配列番号４は、Ｂ２Ｍ５−６認識配列（センス）の核酸配列を示す。
配列番号５は、Ｂ２Ｍ５−６認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。
配列番号６は、Ｂ２Ｍ７−８認識配列（センス）の核酸配列を示す。
配列番号７は、Ｂ２Ｍ７−８認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。
配列番号８は、Ｂ２Ｍ１１−１２認識配列（センス）の核酸配列を示す。
配列番号９は、Ｂ２Ｍ１１−１２認識配列（アンチセンス）の核酸配列を示す。
配列番号１０は、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３７７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２０２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＥメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＱメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＥメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＱＹ６６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＱＫ６６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＱＲ６６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＥＹ６６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＥＫ６６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＥＲ６６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＱＹ６６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＱＫ６６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＱＲ６６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列
を示す。
配列番号３１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．６７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．８４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．８５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１０２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１０５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１０６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１１５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１３９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１４１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１４６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１７８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１８２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１９８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１９９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２０７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２２２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２４５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２５５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２５９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２７５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２９５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３０１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３０６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３１７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３２５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３３５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３３８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３４７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３６１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３６２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３６５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３６９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３７１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３７２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３７５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３７８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３８５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３９２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４３２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４３３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４４０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４４９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４５６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４５７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４５９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４６４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４６５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号９０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４７０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号９１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４７１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号９２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．５４０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号９３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．５４３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号９４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．５５１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号９５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．５５４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号９６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．５５６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号９７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．７６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号９８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．８２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号９９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１００は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０１はＢ２Ｍ５−６ｘ．１４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０２は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０３は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０４は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．１３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０５は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．２２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０６は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．３１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０７は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．６９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０８は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．７３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０９は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．８５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１０は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．８６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１１は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．９１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１２は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．２８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１３は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１４は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．８８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１５は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１６は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．２３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１７は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．３０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１８は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．５３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１９は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２０は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２１は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２２は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．２５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２３は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．７８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２４は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．８５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２５は、Ｂ２Ｍ１１−１２ｘ．４５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２６は、Ｂ２Ｍ１１−１２ｘ．２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２７は、ヒトＴ細胞受容体α定常領域遺伝子の核酸配列を示す。
配列番号１２８は、ＴＲＣ１−２認識配列（センス）の核酸配列を示す。
配列番号１２９はＴＲＣ３−４認識配列（センス）の核酸配列を示す。
配列番号１３０は、ＴＲＣ７−８認識配列（センス）の核酸配列を示す。
配列番号１３１は、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１３３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１３４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３７７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１３５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１３６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２０２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１３７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１３８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＥメガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１３９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＱメガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１４０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＥメガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１４１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＱＹ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１４２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＱＫ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１４３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＱＲ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１４４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＥＹ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１４５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＥＫ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１４６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＥＲ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１４７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＱＹ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１４８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＱＫ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１４９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＱＲ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１５０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１５１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１０メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１５２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１４メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１５３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１５４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．６７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１５５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．８４メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１５６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．８５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１５７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１５８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１５９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１０２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１６０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１０５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１６１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１０６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１６２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１１５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１６３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１３９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１６４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１４１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１６５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１４６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１６６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１６７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１６８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１７８メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１６９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１８２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１７０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１９８メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１７１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１９９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１７２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２０７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１７３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２２２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１７４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２４５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１７５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２５５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１７６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２５９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１７７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２７５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１７８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８０メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１７９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１８０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１８１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１８２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１８３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２９５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１８４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３０１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１８５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３０６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１８６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３１７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１８７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３２５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１８８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３３５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１８９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３３８メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１９０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３４７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１９１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３６１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１９２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３６２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１９３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３６５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１９４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３６９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１９５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３７１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１９６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３７２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１９７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３７５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１９８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３７８メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号１９９は、Ｂ２Ｍ １３−１４ｘ．３８５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２００は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３９２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２０１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４３２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２０２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４３３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２０３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４４０メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２０４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４４９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２０５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４５６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２０６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４５７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２０７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４５９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２０８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４６４メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２０９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４６５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２１０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４７０メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２１１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４７１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２１２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．５４０メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２１３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．５４３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２１４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．５５１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２１５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．５５４メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２１６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．５５６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２１７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．７６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２１８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．８２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２１９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２２０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２２１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２２２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２２３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３７７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２２４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２２５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２０２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２２６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２２７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＥメガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２２８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＱメガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２２９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＥメガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２３０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＱＹ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２３１は、Ｂ２Ｍ １３−１４ｘ．９３ＱＱＫ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２３２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＱＲ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２３３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＥＹ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２３４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＥＫ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２３５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＥＲ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２３６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＱＹ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２３７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＱＫ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２３８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＱＲ６６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２３９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２４０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１０メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２４１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１４メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２４２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２４３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．６７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２４４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．８４メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２４５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．８５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２４６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２４７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２４８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１０２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２４９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１０５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２５０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１０６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２５１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１１５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２５２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１３９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２５３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１４１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２５４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１４６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２５５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２５６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２５７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１７８メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２５８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１８２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２５９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１９８メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２６０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１９９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２６１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２０７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２６２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２２２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２６３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２４５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２６４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２５５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２６５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２５９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２６６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２７５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２６７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８０メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２６８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２６９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２７０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２７１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２７２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２９５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２７３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３０１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２７４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３０６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２７５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３１７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２７６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３２５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２７７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３３５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２７８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３３８メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２７９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３４７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２８０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３６１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２８１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３６２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２８２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３６５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２８３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３６９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２８４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３７１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２８５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３７２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２８６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３７５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２８７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３７８メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２８８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３８５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２８９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３９２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２９０は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４３２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２９１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４３３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２９２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４４０メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２９３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４４９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２９４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４５６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２９５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４５７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２９６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４５９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２９７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４６４メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２９８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４６５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号２９９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４７０メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３００は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４７１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３０１は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．５４０メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３０２は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．５４３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３０３は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．５５１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３０４は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．５５４メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３０５は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．５５６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３０６は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．７６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３０７は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．８２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３０８は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３０９は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．３２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１４半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３１０は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．１４メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ５半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３１１は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ５半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３１２は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ５半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３１３は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．１３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ５半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３１４は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．２２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ５半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３１５は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．３１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ５半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３１６は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．６９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ５半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３１７は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．７３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ５半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３１８は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．８５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ５半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３１９は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．８６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ５半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３２０は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．９１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ５半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３２１は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．２８メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ５半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３２２は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ５半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３２３は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．１４メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ６半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３２４は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ６半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３２５は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ６半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３２６は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．１３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ６半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３２７は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．２２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ６半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３２８は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．３１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ６半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３２９は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．６９メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ６半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３３０は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．７３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ６半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３３１は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．８５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ６半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３３２は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．８６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ６半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３３３は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．９１メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ６半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３３４は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．２８メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ６半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３３５は、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ６半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３３６は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．８８メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ７半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３３７は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ７半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３３８は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．２３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ７半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３３９は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．３０メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ７半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３４０は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．５３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ７半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３４１は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ７半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３４２は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ７半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３４３は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ７半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３４４は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．２５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ７半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３４５は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．７８メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ７半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３４６は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．８５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ７半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３４７は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．８８メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ８半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３４８は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．７メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ８半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３４９は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．２３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ８半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３５０は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．３０メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ８半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３５１は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．５３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ８半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３５２は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ８半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３５３は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．３メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ８半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３５４は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．６メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ８半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３５５は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．２５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ８半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３５６は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．７８メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ８半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３５７は、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．８５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ８半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３５８は、Ｂ２Ｍ１１−１２ｘ．４５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１１半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３５９は、Ｂ２Ｍ１１−１２ｘ．２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１１半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３６０は、Ｂ２Ｍ１１−１２ｘ．４５メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１２半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３６１は、Ｂ２Ｍ１１−１２ｘ．２メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１２半部位結合サブユニットを示す。
配列番号３６２は、ＩＲＥＳエレメントの核酸配列を示す。
配列番号３６３は、Ｔ２Ａエレメントの核酸配列を示す。
配列番号３６４は、Ｐ２Ａエレメントの核酸配列を示す。
配列番号３６５は、Ｅ２Ａエレメントの核酸配列を示す。
配列番号３６６は、Ｆ２Ａエレメントの核酸配列を示す。
配列番号３６７は、ＴＲＣ−ＩＲＥＳ−Ｂ２Ｍバイシストロン性ｍＲＮＡの核酸配列を示す。
配列番号３６８は、ＴＲＣ−Ｔ２Ａ−Ｂ２Ｍバイシストロン性ｍＲＮＡの核酸配列を示す。
配列番号３６９は、ＴＲＣ−Ｐ２Ａ−Ｂ２Ｍバイシストロン性ｍＲＮＡの核酸配列を示す。
配列番号３７０は、ＴＲＣ−Ｅ２Ａ−Ｂ２Ｍバイシストロン性ｍＲＮＡの核酸配列を示す。
配列番号３７１は、ＴＲＣ−Ｆ２Ａ−Ｂ２Ｍバイシストロン性ｍＲＮＡの核酸配列を示す。
配列番号３７２は、Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣバイシストロン性ｍＲＮＡの核酸配列を示す。
配列番号３７３は、Ｂ２Ｍ−Ｔ２Ａ−ＴＲＣバイシストロン性ｍＲＮＡの核酸配列を示す。
配列番号３７４は、Ｂ２Ｍ−Ｐ２Ａ−ＴＲＣバイシストロン性ｍＲＮＡの核酸配列を示す。
配列番号３７５は、Ｂ２Ｍ−Ｅ２Ａ−ＴＲＣバイシストロン性ｍＲＮＡの核酸配列を示す。
配列番号３７６は、Ｂ２Ｍ−Ｆ２Ａ−ＴＲＣバイシストロン性ｍＲＮＡの核酸配列を示す。
１．１ 参照及び定義
本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書に引用されるＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む、発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、及び参考文献は、それぞれが具体的且つ個別的に参照により組み込まれることを示されているのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、異なる形態で具体化され、本明細書に示される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的且つ完全であり、開示の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。例えば、一実施形態に関して例示される特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して例示される特徴をその実施形態から削除することができる。更に、本開示から逸脱しない本明細書で示唆される実施形態に対する多数の変形及び追加は、本開示に照らして当業者に明らかであろう。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の開示の説明で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本開示を限定することを意図していない。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」は、１又は２以上を意味することができる。例えば、細胞（「ａ」ｃｅｌｌ）は単一細胞又は多数の細胞を意味することができる。
本明細書で使用される場合、特に指示しない限り、「又は」という単語は、「及び／又は」の包括的な意味で使用され、「いずれか／又は」の排他的な意味で使用されるものではない。
本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ」という用語は、１２塩基対を超える認識配列で二本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。好ましくは、本開示のメガヌクレアーゼの認識配列は２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩに由来するエンドヌクレアーゼであり、例えばＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ結合親和性、又は二量化特性に関して、天然Ｉ−ＣｒｅＩに対して改変されたＩ−ＣｒｅＩの操作された変異体を指すことができる。Ｉ−ＣｒｅＩのこのような改変された変異体を作製する方法は、当技術分野で公知である（例えば、国際公開第２００７／０４７８５９号パンフレット）。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖ＤＮＡに結合する。メガヌクレアーゼはまた、一対のＤＮＡ結合ドメインがペプチドリンカーを用いて単一ポリペプチドに連結されている「一本鎖メガヌクレアーゼ」であってもよい。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である。本開示のメガヌクレアーゼは、本明細書に記載される方法を用いて測定した場合に、細胞生存率への有害効果もメガヌクレアーゼ切断活性の有意な低下も観察することなく、細胞を３７℃でトランスフェクト及び維持することができるように、細胞、特にヒトＴ細胞で発現した場合に実質的に非毒性である。
本明細書で使用される場合、「一本鎖メガヌクレアーゼ」という用語は、リンカーによって連結された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドを指す。一本鎖メガヌクレアーゼは、構成：Ｎ末端サブユニット−リンカー−Ｃ末端サブユニットを有する。２つのメガヌクレアーゼサブユニットは、一般に、アミノ酸配列において同一ではなく、同一でないＤＮＡ配列を認識するであろう。従って、一本鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、偽回文構造又は非回文構造認識配列を切断する。一本鎖メガヌクレアーゼは、実際には二量体ではないが、「一本鎖ヘテロ二量体」又は「一本鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。明確にするために、他に指定しない限り、「メガヌクレアーゼ」という用語は、二量体又は一本鎖メガヌクレアーゼを指すことができる。
本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つのメガヌクレアーゼサブユニットを単一ポリペプチドに連結させるために使用される外因性ペプチド配列を指す。リンカーは、天然タンパク質に見られる配列を有してもよく、又は天然タンパク質には見られない人工配列である。リンカーは、可撓性であり、二次構造が欠如している、又は生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有し得る。リンカーは、限定されないが、米国特許第８４４５２５１号明細書に包含されるものを含むことができる。いくつかの実施形態では、リンカーが、配列番号１２〜１２６のいずれか１つの残基１５４〜１９５を含むアミノ酸配列を有し得る。
本明細書で使用される場合、「ＴＡＬＥＮ」という用語は、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの任意の部分に融合した１６〜２２個のＴＡＬドメインリピートを含むＤＮＡ結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。
本明細書で使用される場合、「コンパクトＴＡＬＥＮ」という用語は、Ｉ−ＴｅｖＩホーミングエンドヌクレアーゼの任意の部分に任意の配向で融合した１６〜２２個のＴＡＬドメインリピートを有するＤＮＡ結合ドメインを含むエンドヌクレアーゼを指す。
本明細書で使用される場合、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」又は「ＺＦＮ」という用語は、ＦｏｋＩ制限酵素のヌクレアーゼドメインに融合したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むキメラエンドヌクレアーゼを指す。ジンクフィンガードメインを、合理的又は実験的手段を通して、長さが約１８塩基対であり、２〜１０塩基対で分離された１対の９塩基対半部位を含む所定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質を作製するよう再設計することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼによる切断は、可変長の平滑末端又は５’オーバーハンド（しばしば４塩基対）を作り出すことができる。
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、Ｃａｓ９等のカスパーゼと、ゲノムＤＮＡ中の認識部位にハイブリダイズすることによってカスパーゼのＤＮＡ切断を指向するガイドＲＮＡとを含むカスパーゼに基づくエンドヌクレアーゼを指す。
本明細書で使用される場合、「ｍｅｇａＴＡＬ」という用語は、操作された配列特異的ホーミングエンドヌクレアーゼを有する転写アクチベータ様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含む一本鎖ヌクレアーゼを指す。
本明細書で使用される場合、タンパク質に関して、「組換え」という用語は、タンパク質をコードする核酸及びタンパク質を発現する細胞又は生物に遺伝子工学技術を適用した結果として変化したアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関して、「組換え」という用語は、遺伝子工学技術を適用した結果として変化した核酸配列を有することを意味する。遺伝子工学技術には、それだけに限らないが、ＰＣＲ及びＤＮＡクローニング技術；トランスフェクション、形質転換、及び他の遺伝子導入技術；相同組換え；部位特異的突然変異誘発；並びに遺伝子融合が含まれる。この定義によると、天然タンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主でのクローニング及び発現によって産生されたタンパク質は、組換えとはみなされない。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドがその元の機能を有する、同種の遺伝子の対立遺伝子集団における最も一般的な天然対立遺伝子（即ち、ポリヌクレオチド配列）を指す。「野生型」という用語はまた、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。野生型対立遺伝子（即ち、ポリヌクレオチド）及びポリペプチドは、１又は複数の野生型配列に対する１又は複数の突然変異及び／又は置換を含む突然変異体又は変異体の対立遺伝子及びポリペプチドと区別される。野生型対立遺伝子又はポリペプチドは、生物において正常な表現型を付与することができるが、突然変異体又は変異体の対立遺伝子又はポリペプチドは、場合によっては、変化した表現型を付与することができる。野生型ヌクレアーゼは、組換え又は非天然ヌクレアーゼとは区別可能である。
組換えタンパク質に関して本明細書で使用される場合、「改変」という用語は、参照配列（例えば、野生型又は天然配列）に対する組換え配列中のアミノ酸残基の任意の挿入、欠失、又は置換を意味する。
本明細書中で使用される場合、「認識配列」という用語は、エンドヌクレアーゼによって結合及び切断されるＤＮＡ配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、４塩基対によって分離された１対の逆位９塩基対「半部位」を含む。一本鎖メガヌクレアーゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインが第１の半部位に接触し、タンパク質のＣ末端ドメインが第２の半部位に接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、４塩基対の３’「オーバーハング」を生じる。「オーバーハング」又は「付着末端」は、二本鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断によって産生され得る短い一本鎖ＤＮＡセグメントである。Ｉ−ＣｒｅＩに由来するメガヌクレアーゼ及び一本鎖メガヌクレアーゼの場合、オーバーハングは、２２塩基対の認識配列の塩基１０〜１３を含む。コンパクトＴＡＬＥＮの場合、認識配列は、Ｉ−ＴｅｖＩドメインによって認識される第１のＣＮＮＮＧＮ配列、引き続いて長さ４〜１６塩基対の非特異的スペーサー、引き続いてＴＡＬ−エフェクタードメインによって認識される長さ１６〜２２ｂｐの第２の配列（この配列は、典型的には５’Ｔ塩基を有する）を含む。コンパクトＴＡＬＥＮによる切断は、２塩基対の３’オーバーハングを生じる。ＣＲＩＳＰＲの場合、認識配列は、典型的には１６〜２４塩基対の配列であり、これにガイドＲＮＡが結合してＣａｓ９切断を誘導する。ＣＲＩＳＰＲによる切断は平滑末端を生じた。
本明細書で使用される場合、「標的部位」又は「標的配列」という用語は、ヌクレアーゼの認識配列を含む細胞の染色体ＤＮＡの領域を指す。
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合親和性」又は「結合親和性」という用語は、メガヌクレアーゼが参照ＤＮＡ分子（例えば、認識配列又は任意の配列）と非共有結合する傾向を意味する。結合親和性は、解離定数Ｋｄによって測定される。本明細書で使用される場合、ヌクレアーゼは、参照認識配列に対するヌクレアーゼのＫｄが、参照ヌクレアーゼに対して統計学的に有意な（ｐ＜０．０５）量だけ増加又は減少した場合、「変化した」結合親和性を有する。
本明細書で使用される場合、「相同組換え」又は「ＨＲ」という用語は、修復鋳型として相同ＤＮＡ配列を使用して二本鎖ＤＮＡ切断が修復される天然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６）、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８〜１９７６）。相同ＤＮＡ配列は、細胞に送達された内因性染色体配列又は外因性核酸である。
本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」又は「ＮＨＥＪ」という用語は、二本鎖ＤＮＡ切断が２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接接合によって修復される天然の細胞プロセスを指す（例えば、例えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６）、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８〜１９７６）。非相同末端結合によるＤＮＡ修復は間違いを起こしやすく、頻繁に修復部位でのＤＮＡ配列のテンプレート化されていない付加又は欠失が起こる。いくつかの例では、標的認識配列における切断が、標的認識部位におけるＮＨＥＪを生じる。遺伝子のコード配列中の標的部位のヌクレアーゼ誘導切断に引き続くＮＨＥＪによるＤＮＡ修復が、遺伝子機能を破壊するフレームシフト突然変異等の突然変異をコード配列に導入し得る。このように、操作されたヌクレアーゼを使用して、細胞の集団中の遺伝子を有効にノックアウトすることができる。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、免疫エフェクター細胞（例えば、ヒトＴ細胞）上に抗原に対する特異性を移植する操作された受容体を指す。キメラ抗原受容体は、典型的には、細胞外リガンド結合ドメイン又は部分と、１又は複数の刺激ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイン又は部分が、特定のエピトープ又は抗原（例えば、がん細胞又は他の疾患を引き起こす細胞若しくは粒子の表面上に優先的に存在するエピトープ又は抗原）に対する特異性を提供するモノクローナル抗体に由来する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の形態であり得る。ｓｃＦｖはリンカー配列を介して結合し得る。細胞外リガンド結合ドメインは、対象となる任意の抗原又はエピトープに特異的であり得る。特定の実施形態では、リガンド結合ドメインがＣＤ１９に特異的である。他の実施形態では、ｓｃＦｖがヒト化又は完全ヒトであり得る。キメラ抗原受容体の細胞外ドメインはまた、Ｂリンパ球上の自己抗原特異的Ｂ細胞受容体によって認識され得る自己抗原（Ｐａｙｎｅら（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３５３巻（６２９５）：１７９〜１８４参照）を含むことができ、従って、Ｔ細胞を標的に特異的に向け、抗体媒介自己免疫疾患において自己反応性Ｂリンパ球を死滅させることができる。このようなＣＡＲはキメラ自己抗体受容体（ＣＡＡＲ）と呼ばれ得、その使用は本開示に包含される。
いくつかの非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、腫瘍関連表面抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＳ１、ＣＤ２０、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＦＬＴ３Ｒ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ジシアロガングリオシドＧＤ２、管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ−７２、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、Ｂヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、プロスターゼ特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＡ−１ａ、ｐ５３、プロスタイン、ＰＳＭＡ、生存及びテロメラーゼ、前立腺癌腫腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ１）−１、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、メソテリン、腫瘍特異ペプチドエピトープを提示する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）及びエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）並びにテネイシン−ＣのＡ１ドメイン（ＴｎＣ ＡＩ）並びに線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）；系列特異又は組織特異抗原、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、エンドグリン、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、又はウイルス特異表面抗原、例えばＨＩＶ特異抗原（ＨＩＶ ｇｐｌ２０等）；ＥＢＶ特異抗原、ＣＭＶ特異抗原、ＨＰＶ特異抗原、ラッサウイルス特異抗原、インフルエンザウイルス特異抗原、並びにこれらの表面マーカーの任意の誘導体又は変異体に対する特異性を有することができる。本発明の特定の実施形態では、リガンド結合ドメインがＣＤ１９に特異的である。
細胞内刺激ドメインは、抗原結合後に免疫エフェクター細胞に活性化シグナルを伝達する１又は複数の細胞質シグナル伝達ドメインを含むことができる。細胞内刺激ドメインは、対象となる任意の細胞内刺激ドメインであり得る。このような細胞質シグナル伝達ドメインには、限定されないが、ＣＤ３−ζが含まれ得る。細胞内刺激ドメインはまた、リガンド結合後に増殖及び／又は細胞生存シグナルを伝達する１又は複数の細胞内共刺激ドメインを含むことができる。細胞内共刺激ドメインは、対象となる任意の細胞内共刺激ドメインであり得る。このような細胞内共刺激ドメインには、限定されないが、ＣＤ２８ドメイン、４−１ＢＢドメイン、ＯＸ４０ドメイン、又はこれらの組み合わせが含まれ得る。キメラ抗原受容体は、ヒンジ又はスペーサー配列を介して細胞外リガンド結合ドメインに結合した膜貫通ドメインを含む追加の構造エレメントを更に含むことができる。
本明細書で使用される場合、「外因性Ｔ細胞受容体」又は「外因性ＴＣＲ」とは、ＴＣＲを内因的に発現してもしなくてもよい免疫エフェクター細胞（例えば、ヒトＴ細胞）のゲノムにその配列が導入されるＴＣＲを指す。免疫エフェクター細胞上の外因性ＴＣＲの発現は、特定のエピトープ又は抗原（例えば、がん細胞又は他の疾患を引き起こす細胞若しくは粒子の表面上に優先的に存在するエピトープ又は抗原）に対する特異性を付与することができる。このような外因性Ｔ細胞受容体は、α及びβ鎖を含むことができる、あるいは、γ及びδ鎖を含むことができる。本開示において有用な外因性ＴＣＲは、対象となる任意の抗原又はエピトープに対する特異性を有し得る。
本明細書で使用される場合、「低下した」という用語は、遺伝子改変細胞の細胞表面での又は対照細胞と比較した場合の、内因性ポリペプチド（例えば、β−２ミクログロブリン、内因性Ｔ細胞受容体等）の発現の任意の低下を指す。「低下した」という用語はまた、対照細胞の集団と比較した場合の細胞表面で内因性ポリペプチドを発現する細胞の集団における細胞の割合の低下を指すことができる。どちらの場合でも、このような低下は、最大５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は最大１００％である。従って、「低下した」という用語は、内因性ポリペプチドの部分的ノックダウンと完全ノックダウンの両方を包含する。
アミノ酸配列と核酸配列の両方に関して本明細書で使用される場合、「同一性％」、「配列同一性」、「類似性割合」、「配列類似性」等の用語は、整列されたアミノ酸残基又はヌクレオチド間の類似性を最大化し、同一又は類似の残基又はヌクレオチドの数、全残基又はヌクレオチドの数、並びに配列アラインメント中のギャップの存在及び長さの関数である配列のアラインメントに基づく２つの配列の類似性の程度の尺度を指す。標準的なパラメータを使用して配列類似性を決定するための種々のアルゴリズム及びコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書中で使用される場合、配列類似性は、共にＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通して入手可能であり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；Ｇｉｓｈ及びＳｔａｔｅｓ（１９９３）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６〜２７２；Ｍａｄｄｅｎら（１９９６）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１〜１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３ ８９〜３４０２）；Ｚｈａｎｇら（２０００）、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（１〜２）：２０３〜１４に記載されている、アミノ酸配列についてはＢＬＡＳＴｐプログラム及び核酸配列についてはＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて測定される。本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列の類似性％は、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムについての以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝３；ギャップオープニングペナルティ＝−１１；ギャップ伸長ペナルティ＝−１；及びスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。本明細書で使用される場合、２つの核酸配列の類似性％は、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズムについての以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝１１；ギャップオープニングペナルティ＝−５；ギャップ伸長ペナルティ＝−２；一致報酬＝１；及び不一致ペナルティ＝−３。
２つのタンパク質又はアミノ酸配列の改変に関して本明細書で使用される場合、「〜に相当する」という用語は、２つのタンパク質を標準的な配列アラインメント（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを用いる）に供した場合に、第１のタンパク質における特定の改変が第２のタンパク質における改変におけるのと同じアミノ酸残基の置換であること、及び第１のタンパク質における改変のアミノ酸位置が、第２のタンパク質における改変のアミノ酸位置に相当する又はこれと一列に整列することを示すために使用される。従って、残基ＸとＹが配列アラインメントで互いに相当する場合、ＸとＹが異なる数であるという事実にもかかわらず、第１のタンパク質における残基「Ｘ」のアミノ酸「Ａ」への改変は、第２のタンパク質における残基「Ｙ」のアミノ酸「Ａ」への改変に相当する。
本明細書中で使用される場合、「認識半部位」、「認識配列半部位」、又は単に「半部位」という用語は、ホモ二量体若しくはヘテロ二量体メガヌクレアーゼの単量体によって、又は一本鎖メガヌクレアーゼの１つのサブユニットによって認識される二本鎖ＤＮＡ分子中の核酸配列を意味する。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、比較的高い変動性を有するアミノ酸を含むメガヌクレアーゼモノマー又はサブユニット内の局在配列を指す。超可変領域は、約５０〜６０個の連続残基、約５３〜５７個の連続残基、又は好ましくは約５６個の残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、超可変領域の残基が、配列番号１２〜１２６のいずれか１つの２４〜７９位又は２１５〜２７０位に相当し得る。超可変領域は、認識配列中のＤＮＡ塩基と接触する１個又は複数の残基を含むことができ、単量体又はサブユニットの塩基優先度を変更するように改変することができる。超可変領域はまた、メガヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ認識配列と会合すると、ＤＮＡ骨格に結合する１個又は複数の残基を含むことができる。このような残基を、ＤＮＡ骨格及び標的認識配列に対するメガヌクレアーゼの結合親和性を変化させるように改変することができる。本開示の異なる実施形態では、超可変領域は、可変性を示す約１〜２１個の残基を含み、塩基優先度及び／又はＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすように改変することができる。いくつかの実施形態では、超可変領域内の可変残基が、配列番号１２〜１２６のいずれか１つの２４位、２６位、２８位、２９位、３０位、３２位、３３位、３８位、４０位、４２位、４４位、４６位、４８位、６６位、６８位、６９位、７０位、７２位、７３位、７５位、及び７７位の１又は複数に相当する。他の実施形態では、超可変領域内の可変残基が、配列番号１２〜１２６のいずれか１つの２１５位、２１７位、２１９位、２２０位、２２１位、２２３位、２２４位、２２９位、２３１位、２３３位、２３５位、２３７位、２３９位、２４８位、２５７位、２５９位、２６０位、２６１位、２６３位、２６４位、２６６位、及び２６８位の１又は複数に相当する。
本明細書で使用される場合、「ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子」、「Ｂ２Ｍ遺伝子」等の用語は互換的に使用され、配列番号１に示されるＮＣＢＩ遺伝子識別番号５６７（受託番号ＮＧ＿０１２９２０．１）によって特定されるヒト遺伝子及び機能的Ｂ２Ｍポリペプチドをコードするヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子の天然変異体を指す。
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体α定常領域遺伝子」、「ＴＣＲα定常領域遺伝子」等の用語は互換的に使用され、配列番号１２７に示されるＮＣＢＩ遺伝子識別番号２８７５５によって特定されるヒト遺伝子、並びに機能的ポリペプチドをコードするＴ細胞受容体α定常領域遺伝子の天然変異体を指す。
「組換えＤＮＡ構築物」、「組換え構築物」、「発現カセット」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、及び「組換えＤＮＡ断片」という用語は、本明細書で互換的に使用され、核酸断片である。組換え構築物は、限定されないが、天然には一緒には見られない調節配列及びコード配列を含む、核酸断片の人工的な組み合わせを含む。例えば、組換えＤＮＡ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来し、天然に見られるものとは異なる様式で配置される調節配列及びコード配列を含み得る。このような構築物は、単独で使用される、又はベクターと合わせて使用される。
本明細書で使用される場合、「ベクター」又は「組換えＤＮＡベクター」は、所定の宿主細胞におけるポリペプチドコード配列の転写及び翻訳が可能な複製系及び配列を含む構築物である。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、当業者に周知のように宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。ベクターには、限定されないが、プラスミドベクター及び組換えＡＡＶベクター、又は本開示のメガヌクレアーゼをコードする遺伝子を標的細胞に送達するのに適した当技術分野で公知の任意の他のベクターが含まれ得る。当業者であれば、本開示の単離されたヌクレオチド又は核酸配列のいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択、及び増殖させるために、ベクター上に存在しなければならない遺伝要素を十分に認識している。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ウイルスベクターを指すこともできる。ウイルスベクターには、限定されないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「ポリシストロン性」ｍＲＮＡは、２以上のコード配列（即ち、シストロン）を含み、２以上のタンパク質をコードする単一メッセンジャーＲＮＡを指す。ポリシストロン性ｍＲＮＡは、それだけに限らないが、ＩＲＥＳエレメント、Ｔ２Ａエレメント、Ｐ２Ａエレメント、Ｅ２Ａエレメント、及びＦ２Ａエレメントを含む、同じｍＲＮＡ分子からの２以上の遺伝子の翻訳を可能にする当技術分野で公知の任意のエレメントを含むことができる。
本明細書で使用される場合、「ヒトＴ細胞」又は「Ｔ細胞」は、ヒトドナーから単離されたＴ細胞を指す。ヒトＴ細胞及びこれに由来する細胞には、培養で継代されていない単離されたＴ細胞、不死化しないで細胞培養条件下で継代及び維持されたＴ細胞、並びに不死化され、細胞培養条件下で無限に維持されるＴ細胞が含まれる。
本明細書で使用される場合、「対照」又は「対照細胞」は、遺伝子改変細胞の遺伝子型又は表現型における変化を測定するための基準点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例えば：（ａ）野生型細胞、即ち、遺伝子改変細胞を生じた遺伝子改変のための出発材料と同じ遺伝子型の細胞；（ｂ）遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型の細胞であるが、ヌル構築物（即ち、対象となる形質に対して既知の効果を有さない構築物）で形質転換された細胞；（ｃ）遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、変化した遺伝子型又は表現型の発現を誘導する条件、刺激又は更なる遺伝子改変に曝されない細胞を含み得る。
本明細書で使用される場合、変数の数値範囲の列挙は、開示がその範囲内の値のいずれかに等しい変数で実施されることを伝えることを意図している。従って、本質的に離散的な変数については、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しい。同様に、本質的に連続する変数については、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の実数値に等しい。一例として、限定ではないが、変数が本質的に離散的である場合、０〜２の値を有すると記載される変数は、０、１、又は２の値をとることができ、変数が本質的に連続する場合、０．０、０．１、０．０１、０．００１、又は０以上２以下の任意の他の実数をとることができる。
２．１ 本発明の原理
本開示は、部分的には、切断された部位のＮＨＥＪが細胞表面でβ−２ミクログロブリンポリペプチドの発現を破壊し、よってＨＬＡ遺伝子によってコードされる内因性ＭＨＣクラスＩ受容体の集合及び活性化を妨害するように、操作されたヌクレアーゼがヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子（配列番号１）内に見られる認識配列を認識及び切断するために利用されるという仮説に基づく。更に、本開示によると、外因性ポリヌクレオチド配列を、例えば、相同組換えによって、ヌクレアーゼ切断部位でβ−２ミクログロブリン遺伝子に挿入する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列が、細胞内で同時に発現される対象となる配列を含む。更に、本開示の操作されたヌクレアーゼは、１又は複数の追加のノックアウト（例えば、内因性Ｔ細胞受容体のノックアウト）を示すように遺伝子改変された、並びに／あるいは１又は複数の対象となるポリペプチド（例えば、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体）を発現するように遺伝子改変された真核細胞におけるβ−２ミクログロブリンの細胞表面発現をノックアウトするために使用される。従って、好ましい実施形態では、本開示は、細胞表面でβ−２ミクログロブリンと内因性Ｔ細胞受容体の両方のノックアウトを示す一方で、キメラ抗原受容体又は外因性Ｔ細胞受容体を同時に発現するＴ細胞等の遺伝子改変真核細胞の産生を可能にする。このような細胞は、対象に投与されると、低下したアロ反応性及び／又は減少したアロゲニシティを示すことができる。
２．２ ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子内の認識配列を認識及び切断するためのヌクレアーゼ
生細胞のゲノムにおいて部位特異的ヌクレアーゼを使用してＤＮＡ破壊を行うことが可能であり、このようなＤＮＡ破壊は突然変異誘発ＮＨＥＪ修復を介して又はトランスジェン性ＤＮＡ配列との相同組換えを介してゲノムの持続改変をもたらすことができることが当技術分野で知られている。ＮＨＥＪは切断部位で突然変異誘発を生じ、対立遺伝子の不活性化をもたらし得る。ＮＨＥＪ関連突然変異誘発は、初期終止コドンの生成、異常な非機能性タンパク質を産生するフレームシフト突然変異を介して対立遺伝子を不活性化し得る、あるいは非センス媒介ｍＲＮＡ崩壊等の機序を誘引し得る。ＮＨＥＪを介した突然変異誘発を誘導するためのヌクレアーゼの使用は、特定の突然変異又は野生型対立遺伝子に存在する配列を標的化するために使用され得る。標的遺伝子座における二本鎖破壊を誘導するためのヌクレアーゼの使用は、特にゲノム標的と相同である配列が隣接するトランスジェン性ＤＮＡ配列の相同組換えを刺激することが知られている。このようにして、外因性核酸配列を標的遺伝子座に挿入することができる。このような外因性核酸は、例えば、キメラ抗原受容体、外因性ＴＣＲ、又は対象となる任意の配列若しくはポリペプチドをコードし得る。
異なる実施形態では、種々の異なるタイプのヌクレアーゼが、本開示を実施するために有用である。一実施形態では、本開示が組換えメガヌクレアーゼを用いて実施される。別の実施形態では、本開示がＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲニッカーゼを用いて実施される。所定のＤＮＡ部位を認識するＣＲＩＳＰＲ及びＣＲＩＳＰＲニッカーゼを作製する方法は、例えば、Ｒａｎら（２０１３）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．８：２２８１〜３０８等、当技術分野で公知である。別の実施形態では、本開示が、ＴＡＬＥＮ又はコンパクトＴＡＬＥＮを用いて実施される。所定のＤＮＡ部位に結合するＴＡＬＥドメインを作製する方法は、例えば、Ｒｅｙｏｎら（２０１２）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：４６０〜５等、当技術分野で公知である。更なる実施形態では、本開示が、メガＴＡＬを用いて実施される。
好ましい実施形態では、本開示を実施するために使用されるヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである。一本鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによって連結されたＮ末端サブユニット及びＣ末端サブユニットを含む。２つのドメインの各々が、認識配列の半分（即ち、認識半部位）を認識し、ＤＮＡ切断の部位は、２つのサブユニットの界面付近の認識配列の中央にある。ＤＮＡ鎖切断は、メガヌクレアーゼによるＤＮＡ切断が１対の４塩基対３’一本鎖オーバーハングを生成するように、４塩基対によって相殺される。
いくつかの例では、本開示の組換えメガヌクレアーゼが、Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列（配列番号２）を認識及び切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレアーゼは、本明細書では「Ｂ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼ」と総称される。代表的なＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼは、配列番号１２〜１００で提供される。
他の例では、本開示の組換えメガヌクレアーゼが、Ｂ２Ｍ５−６認識配列（配列番号４）を認識及び切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレアーゼは、本明細書では「Ｂ２Ｍ５−６メガヌクレアーゼ」と総称される。代表的なＢ２Ｍ５−６メガヌクレアーゼは、配列番号１０１〜１１３で提供される。
更なる例では、本開示の組換えメガヌクレアーゼが、Ｂ２Ｍ７−８認識配列（配列番号６）を認識及び切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレアーゼは、本明細書では「Ｂ２Ｍ７−８メガヌクレアーゼ」と総称される。代表的なＢ２Ｍ７−８メガヌクレアーゼは、配列番号１１４〜１２４で提供される。
更なる例では、本開示の組換えメガヌクレアーゼが、Ｂ２Ｍ１１−１２認識配列（配列番号８）を認識及び切断するように操作されている。このような組換えメガヌクレアーゼは、本明細書では「Ｂ２Ｍ１１−１２メガヌクレアーゼ」と総称される。代表的なＢ２Ｍ１１−１２メガヌクレアーゼは、配列番号１２５及び１２６で提供される。
本開示の組換えメガヌクレアーゼは、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含む第１のサブユニット及び第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む第２のサブユニットを含む。更に、第１のサブユニットは、認識配列の第１の認識半部位（例えば、Ｂ２Ｍ１３、Ｂ２Ｍ５、Ｂ２Ｍ７、又はＢ２Ｍ１１半部位）に結合し、第２のサブユニットは、認識配列の第２の認識半部位（例えば、Ｂ２Ｍ１４、Ｂ２Ｍ６、Ｂ２Ｍ８、又はＢ２Ｍ１２半部位）に結合する。組換えメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、第１及び第２のサブユニットが、ＨＶＲ１領域を含み、第１の半部位に結合する第１のサブユニットがＮ末端サブユニットとして配置され、ＨＶＲ２領域を含み、第２の半部位に結合する第２のサブユニットがＣ末端サブユニットとして配置されるように配向される。代替実施形態では、第１及び第２のサブユニットが、ＨＶＲ１領域を含み、第１の半部位に結合する第１のサブユニットがＣ末端サブユニットとして配置され、ＨＶＲ２領域を含み、第２の半部位に結合する第２のサブユニットがＮ末端サブユニットとして配置されるように配向される。本開示の代表的なＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼを表１に提供する。本開示の代表的なＢ２Ｍ５−６メガヌクレアーゼを表２に提供する。本開示の代表的なＢ２Ｍ７−８メガヌクレアーゼを表３に提供する。本開示の代表的なＢ２Ｍ１１−１２メガヌクレアーゼを表４に提供する。
表１．Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列（配列番号２）を認識及び切断するように操作された代表的な組換えメガヌクレアーゼ
Figure 0006846429
Figure 0006846429
Figure 0006846429
＊「Ｂ２Ｍ１３サブユニット％」及び「Ｂ２Ｍ１４サブユニット％」は、各メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１３結合サブユニット領域及びＢ２Ｍ１４結合サブユニット領域と、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９メガヌクレアーゼの、それぞれ、Ｂ２Ｍ１３結合サブユニット領域及びＢ２Ｍ１４結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。
表２．Ｂ２Ｍ５−６認識配列（配列番号４）を認識及び切断するように操作された代表的な組換えメガヌクレアーゼ
Figure 0006846429
＊「Ｂ２Ｍ５サブユニット％」及び「Ｂ２Ｍ６サブユニット％」は、各メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ５結合サブユニット領域及びＢ２Ｍ６結合サブユニット領域と、Ｂ２Ｍ５−６ｘ．１４メガヌクレアーゼの、それぞれ、Ｂ２Ｍ５結合サブユニット領域及びＢ２Ｍ６結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。
表３．Ｂ２Ｍ７−８認識配列（配列番号６）を認識及び切断するように操作された代表的な組換えメガヌクレアーゼ
Figure 0006846429
＊「Ｂ２Ｍ７サブユニット％」及び「Ｂ２Ｍ８サブユニット％」は、各メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ７結合サブユニット領域及びＢ２Ｍ８結合サブユニット領域と、Ｂ２Ｍ７−８ｘ．８８メガヌクレアーゼの、それぞれ、Ｂ２Ｍ７結合サブユニット領域及びＢ２Ｍ８結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。
表４．Ｂ２Ｍ１１−１２認識配列（配列番号８）を認識及び切断するように操作された代表的な組換えメガヌクレアーゼ
Figure 0006846429
＊「Ｂ２Ｍ１１サブユニット％」及び「Ｂ２Ｍ１２サブユニット％」は、各メガヌクレアーゼのＢ２Ｍ１１結合サブユニット領域及びＢ２Ｍ１２結合サブユニット領域と、Ｂ２Ｍ１１−１２ｘ．４５メガヌクレアーゼの、それぞれ、Ｂ２Ｍ１１結合サブユニット領域及びＢ２Ｍ１２結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性を表す。
２．３ 遺伝子改変細胞を作製する方法
本開示は、ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子（配列番号１）内に見られる認識配列を認識及び切断する操作されたヌクレアーゼを用いて遺伝子改変細胞を作製する方法を提供する。このような認識配列での切断は、切断部位でのＮＨＥＪ及びβ−２ミクログロブリンポリペプチドの発現破壊を可能にし、よってＨＬＡ遺伝子によってコードされる内因性ＭＨＣクラスＩ受容体の集合及び活性化を妨害することができる。更に、このような認識配列での切断は更に、外因性核酸配列の直接的なβ２ミクログロブリン遺伝子への相同組換えを可能にすることができる。
いくつかの態様では、本開示は更に、内因性Ｔ細胞受容体の細胞表面発現が低下した遺伝子改変真核細胞を作製する方法を提供する。このような方法は、内因性Ｔ細胞受容体の成分をコードする遺伝子に位置する認識配列を認識及び切断するように操作されたエンドヌクレアーゼを利用する。このような遺伝子には、限定されないが、ヒトＴ細胞受容体α定常領域遺伝子（配列番号１２７）をコードする遺伝子が含まれ得る。この方法に有用なエンドヌクレアーゼには、限定されないが、組換えメガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、コンパクトＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガＴＡＬが含まれ得る。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼが組換えメガヌクレアーゼであり、メガヌクレアーゼ認識配列が配列番号１２８〜１３０のいずれか１つを含む。ヒトＴ細胞受容体α定常領域遺伝子における認識配列を認識及び切断するために有用な組換えメガヌクレアーゼには、限定されないが、米国特許出願公開第６２／２３７３８２号明細書及び第６２／２３７３９４号明細書に開示されるものが含まれ得る。ＴＣＲ認識配列での切断は、切断部位でのＮＨＥＪ及び内因性Ｔ細胞受容体の発現破壊を可能にすることができる。更に、ＴＣＲ認識配列での切断は更に、外因性核酸配列の直接的な標的化遺伝子への相同組換えを可能にすることができる。
本開示の操作されたヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、又は好ましくは、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸として、細胞に送達される。このような核酸は、ＤＮＡ（例えば、環状若しくは線状のプラスミドＤＮＡ又はＰＣＲ産物）又はＲＮＡである。操作されたヌクレアーゼコード配列がＤＮＡ形態で送達される実施形態では、これがメガヌクレアーゼ遺伝子の転写を促進するためにプロモータに作動可能に連結されるべきである。本開示に適した哺乳動物プロモータには、サイトメガロウイルス初期（ＣＭＶ）プロモータ（Ｔｈｏｍｓｅｎら（１９８４）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８１（３）：６５９〜６３）又はＳＶ４０初期プロモータ（Ｂｅｎｏｉｓｔ及びＣｈａｍｂｏｎ（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ．２９０（５８０４）：３０４〜１０）等の構成的プロモータ、並びにテトラサイクリン誘導型プロモータ（Ｄｉｎｇｅｒｍａｎｎら（１９９２）、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（９）：４０３８〜４５）等の誘導型プロモータが含まれる。
いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡが、操作されたヌクレアーゼをコードする遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれる可能性を減らすので、細胞に送達される。操作されたヌクレアーゼをコードするこのようなｍＲＮＡは、インビトロ転写等の当技術分野で公知の方法を用いて作製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡが７−メチル−グアノシンを用いてキャップ付加される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡがポリアデニル化される。
特定の実施形態では、本開示の操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡが、細胞内で同時に発現する２以上のヌクレアーゼをコードするポリシストロン性ｍＲＮＡである。ポリシストロン性ｍＲＮＡは、同じ標的遺伝子内の異なる認識配列を標的化する本開示の２以上のヌクレアーゼをコードすることができる。あるいは、ポリシストロン性ｍＲＮＡは、本開示の１又は複数のヌクレアーゼ及び同じ遺伝子に位置する別個の認識配列を標的化する第２のヌクレアーゼ、あるいは切断部位が両遺伝子において生成されるように、第２の遺伝子に位置する第２の認識配列をコードし得る。ポリシストロン性ｍＲＮＡは、それだけに限らないが、ＩＲＥＳエレメント（例えば、配列番号３６２）、Ｔ２Ａエレメント（例えば、配列番号３６３）、Ｐ２Ａエレメント（例えば、配列番号３６４）、Ｅ２Ａエレメント（例えば、配列番号３６５）、及びＦ２Ａエレメント（例えば、配列番号３６６）を含む、同じｍＲＮＡ分子からの２つの遺伝子（即ち、シストロン）の翻訳を可能にする当技術分野で公知の任意のエレメントを含むことができる。開示
精製されたヌクレアーゼタンパク質を細胞に送達してゲノムＤＮＡを切断することができ、これによって、当技術分野で公知の様々な異なる機構による、対象となる配列を含む切断部位での相同組換え又は非相同末端結合が可能になる。
いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼタンパク質又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡを、細胞透過性ペプチド又は標的リガンドに結合して細胞取り込みを促進する。当技術分野で公知の細胞透過性ペプチドの例としては、ポリアルギニン（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎら（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１６：１６２４〜９）、ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴペプチド（Ｈｕｄｅｃｚら（２００５）、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：６７９〜７３６）、ＭＰＧ（Ｓｉｍｅｏｎｉら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７〜２７２４）、Ｐｅｐ−１（Ｄｅｓｈａｙｅｓら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３：７６９８〜７７０６）及びＨＳＶ−１ ＶＰ−２２（Ｄｅｓｈａｙｅｓら（２００５）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２：１８３９〜４９）が挙げられる。別の実施形態では、操作されたヌクレアーゼ又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡを、ヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡが標的細胞に結合し、標的細胞によって内部移行されるように、標的細胞上で発現される特異的細胞表面受容体を認識する抗体に共有結合的又は非共有結合的に結合させる。あるいは、操作されたヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡを、このような細胞表面受容体の天然リガンド（又は天然リガンドの一部）に共有結合的又は非共有結合的に結合させる。（（ＭｃＣａｌｌら（２０１４）Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｒｒｉｅｒｓ．２（４）：ｅ９４４４４９；Ｄｉｎｄａら（２０１３）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２６４〜７４；Ｋａｎｇら（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（３）：２２０〜３０；Ｑｉａｎら（２０１４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１０（１１）：１４９１〜５０８）。
いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼタンパク質又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡを、当技術分野で公知の方法（Ｓｈａｒｍａら（２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１４）を用いて、ナノ粒子に共有結合的、あるいは好ましくは非共有結合的に結合させる、又はこのようなナノ粒子内にカプセル化する。ナノ粒子は、その長さスケールが１μｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満であるナノスケール送達システムである。このようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、又は生物学的高分子で構成されるコアを用いて設計され、組換えメガヌクレアーゼタンパク質、ｍＲＮＡ又はＤＮＡの複数のコピーがナノ粒子コアに結合又はカプセル化される。これにより、各細胞に送達されるタンパク質／ｍＲＮＡ／ＤＮＡのコピー数が増加し、従って、各操作されたヌクレアーゼの細胞内発現が増加して、標的認識配列が切断される可能性が最大化される。このようなナノ粒子の表面を、ポリマー又は脂質（例えば、キトサン、カチオン性ポリマー、又はカチオン性脂質）で更に修飾して、表面がペイロードの細胞送達及び取り込みを増強するために追加の機能性を付与するコア−シェルナノ粒子を形成する（Ｊｉａｎら２０１２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３３（３０）：７６２１〜３０）。有利には、ナノ粒子を標的化分子に更に結合させて、ナノ粒子を適切な細胞型に導く、及び／又は細胞取り込みの可能性を高めることができる。このような標的化分子の例としては、細胞表面受容体に特異的な抗体及び細胞表面受容体の天然リガンド（又は天然リガンドの一部）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼ又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡを、リポソーム内にカプセル化する、あるいはカチオン性脂質（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；Ｚｕｒｉｓら（２０１５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７３〜８０；Ｍｉｓｈｒａら（２０１１）Ｊ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２０１１：８６３７３４）を用いて複合体化する。リポソーム及びリポプレックス製剤は、ペイロードを分解から保護し、細胞の細胞膜との融合及び／又は破壊を通して細胞取り込み及び送達効率を促進することができる。
いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼタンパク質又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡを、ポリマー足場（例えば、ＰＬＧＡ）内にカプセル化する、あるいはカチオン性ポリマー（例えばＰＥＩ、ＰＬＬ）を用いて複合体化する（Ｔａｍｂｏｌｉら（２０１１）Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ．２（４）：５２３〜５３６）。
いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼタンパク質又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡを、ミセルに自己組織化する両親媒性分子と組み合わせる（Ｔｏｎｇら（２００７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９（１１）：９５６〜６６）。ポリマーミセルは、凝集を防止し、電荷相互作用をマスクし、細胞外の非特異的相互作用を減少させることができる親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）で形成されたミセルシェルを含み得る。
いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼタンパク質又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡを、細胞への送達のために、エマルジョン又はナノエマルジョン（即ち、１ｎｍ未満の平均粒径を有する）に製剤化する。「エマルジョン」という用語は、限定されないが、水不混和相が水相と混合されると、極性残基（例えば、長い炭化水素鎖）を水から離し、極性頭部基を水に向ける疎水力の結果として形成することができる水中油型、油中水型、水中油中水型、若しくは油中水中油型の分散液又は液滴（脂質構造を含む）を指す。これらの他の脂質構造としては、限定されないが、単層、少層（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌｌａｒ）、及び多層脂質小胞、ミセル並びにラメラ相が挙げられる。エマルジョンは、水相及び親油相（典型的には油及び有機溶媒を含有する）で構成される。エマルジョンはまた、しばしば、１種又は複数の界面活性剤を含有する。ナノエマルジョン製剤は、例えば、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００２／００４５６６７号明細書及び第２００４／００４３０４１号明細書並びに米国特許第第６０１５８３２号明細書、第６５０６８０３号明細書、第６６３５６７６号明細書、及び第６５５９１８９号明細書に記載されているように周知である。
いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼタンパク質又は操作されたヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡを、多官能性ポリマーコンジュゲート、ＤＮＡデンドリマー、及びポリマーデンドリマーと共有結合させる又は非共有結合的に会合させる（Ｍａｓｔｏｒａｋｏｓら（２０１５）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．７（９）：３８４５〜５６；Ｃｈｅｎｇら（２００８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９７（１）：１２３〜４３）。デンドリマー生成は、ペイロードの容量及びサイズを制御することができ、高いペイロード容量を提供することができる。更に、複数の表面基の表示を活かして、安定性を向上させ、非特異的相互作用を低減する。
いくつかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼをコードする遺伝子を、ウイルスベクターを用いて細胞に導入する。このようなベクターは、当技術分野で公知であり、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれる（Ｖａｎｎｕｃｃｉら（２０１３ Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１〜２２）に概説）。本開示で有用な組換えＡＡＶベクターは、ウイルスの細胞への形質導入及びヌクレアーゼ遺伝子の細胞ゲノムへの挿入を可能にする任意の血清型を有することができる。特定の実施形態では、組換えＡＡＶベクターがＡＡＶ２又はＡＡＶ６の血清型を有する。組換えＡＡＶベクターはまた、それらが宿主細胞において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であり得る（ＭｃＣａｒｔｙら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２４８〜５４）。
操作されたヌクレアーゼ遺伝子をＤＮＡ形態（例えばプラスミド）で及び／又はウイルスベクター（例えばＡＡＶ）を介して送達する場合、これらをプロモータに作動可能に連結しなければならない。いくつかの実施形態では、これが、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターのＬＴＲ）の内因性プロモータ又は周知のサイトメガロウイルス−若しくはＳＶ４０ウイルス−初期プロモータ等のウイルスプロモータである。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ遺伝子を、標的細胞（例えば、ヒトＴ細胞）において遺伝子発現を優先的に駆動するプロモータに作動可能に連結する。
本開示は更に、外因性核酸配列がヌクレアーゼ切断部位でβ−２ミクログロブリン遺伝子に挿入されるように、外因性核酸の細胞への導入を提供する。いくつかの実施形態では、外因性核酸が、５’相同性アーム及び３’相同性アームを含み、核酸配列のヌクレアーゼ切断部位での細胞ゲノムへの組換えを促進する。
本開示の外因性核酸は、前に論じられた手段のいずれかによって細胞に導入される。特定の実施形態では、外因性核酸を、ウイルスベクター、好ましくは組換えＡＡＶベクターによって導入する。外因性核酸を導入するために有用な組換えＡＡＶベクターは、ウイルスの細胞への形質導入及び外因性核酸配列の細胞ゲノムへの挿入を可能にする任意の血清型を有することができる。特定の実施形態では、組換えＡＡＶベクターがＡＡＶ２又はＡＡＶ６の血清型を有する。組換えＡＡＶベクターはまた、それらが宿主細胞において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であり得る。
別の特定の実施形態では、外因性核酸を、一本鎖ＤＮＡ鋳型を用いて細胞に導入する。一本鎖ＤＮＡは、外因性核酸を含むことができ、好ましい実施形態では、相同組換えによる核酸配列のヌクレアーゼ切断部位への挿入を促進するための５’及び３’相同性アームを含むことができる。一本鎖ＤＮＡは、５’相同性アームの５’上流に５’ＡＡＶ末端逆位リピート（ＩＴＲ）配列、及び３’相同性アームの３’下流に３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列を更に含むことができる。
２．４ 医薬組成物
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の遺伝子改変細胞又は遺伝子改変細胞の集団と、医薬担体とを含む医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、公知の技術によって調製される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２１版２００５）を参照されたい。本開示による医薬製剤の製造では、細胞が、典型的には、薬学的に許容される担体と混和され、得られた組成物が対象に投与される。担体は、当然、製剤中の他の成分と相溶性であるという意味で許容されなければならず、対象に有害であってはならない。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物が、対象の疾患の治療に有用な１種又は複数の更なる薬剤を更に含むことができる。遺伝子改変細胞が遺伝子改変ヒトＴ細胞（又はそれに由来する細胞）である更なる実施形態では、本開示の医薬組成物が、インビボでの細胞増殖及び生着を促進するサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及び／又はＩＬ−２１）等の生物学的分子を更に含むことができる。本開示の遺伝子改変細胞を含む医薬組成物は、更なる薬剤又は生物学的分子と同じ組成物で投与される、あるいは、別個の組成物で同時投与される。
本開示の医薬組成物は、Ｔ細胞養子免疫療法によって標的化される任意の疾患状態を治療するのに有用である。特定の実施形態では、本開示の医薬組成物が、がんの治療に有用である。このようながんには、限定されないが、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽腫、白血病、Ｂ細胞起源のがん、乳がん、胃がん、神経芽細胞腫、骨肉腫、肺がん、黒色腫、前立腺がん、結腸がん、腎細胞癌、卵巣がん、横紋筋肉腫、白血病、及びホジキンリンパ腫が含まれ得る。一定の実施形態では、Ｂ細胞起源のがんには、限定されないが、Ｂ系列急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、及びＢ細胞非ホジキンリンパ腫が含まれる。
２．５ 組換えＡＡＶベクターを作製する方法
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の方法に使用するための組換えＡＡＶベクターを提供する。組換えＡＡＶベクターは、典型的には、ＨＥＫ−２９３等の哺乳動物細胞株において産生される。ウイルスｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子は、その自己複製が１又は複数の治療遺伝子（例えば、エンドヌクレアーゼ遺伝子）を送達する余地を作り出すのを防ぐためにベクターから除去されるので、これらをパッケージング細胞株においてトランスで提供することが必要である。更に、複製を支持するために必要な「ヘルパー」（例えば、アデノウイルス）成分を提供することが必要である（Ｃｏｔｓ Ｄ、Ｂｏｓｃｈ Ａ、Ｃｈｉｌｌｏｎ Ｍ（２０１３）Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（５）：３７０〜８１）。しばしば、組換えＡＡＶベクターを、細胞株を、「ヘルパー」成分をコードする第１のプラスミド、ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子を含む第２のプラスミド、並びにウイルスにパッケージングされる介在ＤＮＡ配列を含むウイルスＩＴＲを含む第３のプラスミドでトランスフェクトする三重トランスフェクションを用いて作製する。次いで、カプシドに包まれたゲノム（ＩＴＲ及び対象となる１又は複数の介在遺伝子）を含むウイルス粒子を、凍結−解凍サイクル、超音波処理、界面活性剤、又は当技術分野で公知の他の手段によって細胞から単離する。次いで、粒子を塩化セシウム密度勾配遠心分離又はアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、その後、対象となる１又は複数の遺伝子、細胞、組織、又は生物（ヒト患者等）に送達する。
組換えＡＡＶ粒子は、典型的には細胞内で産生（製造）されるので、本開示を実施する際に、部位特異的エンドヌクレアーゼがパッケージング細胞中で確実に発現されないように注意を払わなければならない。本開示のウイルスゲノムは、エンドヌクレアーゼの認識配列を含むので、パッケージング細胞株で発現される任意のエンドヌクレアーゼは、それがウイルス粒子にパッケージングされる前にウイルスゲノムを切断することができる。これは、パッケージング効率の低下及び／又は断片化したゲノムのパッケージングを生じる。以下を含むいくつかのアプローチが、パッケージング細胞におけるエンドヌクレアーゼ発現を防止するために使用される：
１．エンドヌクレアーゼは、パッケージング細胞において活性ではない組織特異的プロモータの制御下に置かれる。例えば、筋組織への１又は複数のエンドヌクレアーゼ遺伝子の送達のためのウイルスベクターを開発する場合、筋特異的プロモータを使用する。筋特異的プロモータの例としては、Ｃ５−１２（Ｌｉｕら（２００４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：７８３〜９２）、筋特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ（Ｙｕａｓａら（２００２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１５７６〜８８）又は平滑筋２２（ＳＭ２２）プロモータ（Ｈａａｓｅら（２０１３）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４９〜５４）が挙げられる。ＣＮＳ（ニューロン）特異的プロモータの例としては、ＮＳＥ、シナプシン、及びＭｅＣＰ２プロモータが挙げられる（Ｌｅｎｔｚら（２０１２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．４８：１７９〜８８）。肝特異的プロモータの例としては、アルブミンプロモータ（Ｐａｌｂ等）、ヒトα１−抗トリプシン（Ｐａ１ＡＴ等）、及びヘモペキシン（Ｐｈｐｘ等）が挙げられる（Ｋｒａｍｅｒ，ＭＧら、（２００３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ７：３７５〜８５）。眼特異的プロモータの例としては、オプシン、及び角膜上皮特異的Ｋ１２プロモータが挙げられる（Ｍａｒｔｉｎ ＫＲＧ、Ｋｌｅｉｎ ＲＬ及びＱｕｉｇｌｅｙ ＨＡ（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ（２８）：２６７〜７５）（Ｔｏｎｇ Ｙら、（２００７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ、９：９５６〜６６）。これらのプロモータ又は当技術分野で公知の他の組織特異的プロモータは、ＨＥＫ−２９３細胞において高度に活性ではなく、従って、本開示のウイルスベクターに組み込まれた場合にパッケージング細胞において有意なレベルのエンドヌクレアーゼ遺伝子発現を生じることは期待されない。同様に、本開示のウイルスベクターは、不適合組織特異的プロモータ（即ち、周知のＨｅＬａ細胞株（ヒト上皮細胞）及び肝特異的ヘモペキシンプロモータを使用）を用いる他の細胞株の使用を熟慮する。組織特異的プロモータの他の例としては、滑膜肉腫ＰＤＺＤ４（小脳）、Ｃ６（肝臓）、ＡＳＢ５（筋肉）、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ（心臓）、ＳＬＣ５Ａ１２（腎臓）、コレステロール調節ＡＰＯＭ（肝臓）、ＡＤＰＲＨＬ１（心臓）、及び単一遺伝子奇形症候群ＴＰ７３Ｌ（筋肉）が挙げられる。（Ｊａｃｏｘ Ｅら、（２０１０）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ｖ．５（８）：ｅ１２２７４）。
２．あるいは、ベクターは、エンドヌクレアーゼが発現されにくい異なる種の細胞にパッケージングされる。例えば、ウイルス粒子は、非哺乳動物パッケージング細胞において活性ではない、周知のサイトメガロウイルス−又はＳＶ４０ウイルス−初期プロモータ等の哺乳動物プロモータを用いて、微生物、昆虫、又は植物細胞中で産生される。好ましい実施形態では、ウイルス粒子が、Ｇａｏら（Ｇａｏ，Ｈ．ら（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３１（２）：１３８〜４３）によって記載されるバキュロウイルス系を用いて昆虫細胞中で作製される。哺乳動物プロモータの制御下にあるエンドヌクレアーゼは、これらの細胞で発現する可能性が低い（Ａｉｒｅｎｎｅ，ＫＪら（２０１３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１（４）：７３９〜４９）。更に、昆虫細胞は、哺乳動物細胞とは異なるｍＲＮＡスプライシングモチーフを利用する。従って、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）イントロン又はＳＶ４０ラージＴ抗原イントロン等の哺乳動物イントロンをエンドヌクレアーゼのコード配列に組み込むことが可能である。これらのイントロンは昆虫細胞においてプレｍＲＮＡ転写産物から効率的にスプライシングされないので、昆虫細胞は機能的エンドヌクレアーゼを発現せず、全長ゲノムをパッケージングする。対照的に、得られた組換えＡＡＶ粒子が送達される哺乳動物細胞は、プレｍＲＮＡを適切にスプライシングし、機能的エンドヌクレアーゼタンパク質を発現する。Ｈａｉｆｅｎｇ Ｃｈｅｎは、ＨＧＨ及びＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンの使用が、昆虫パッケージング細胞中の毒性タンパク質バルナーゼ及びジフテリア毒素断片Ａの発現を減弱させ、これらの毒素遺伝子を有する組換えＡＡＶベクターの産生を可能にすることを報告した（Ｃｈｅｎ，Ｈ（２０１２）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１（１１）：ｅ５７）。
３．エンドヌクレアーゼ発現のために小分子誘導物質が必要とされるように、エンドヌクレアーゼ遺伝子が誘導型プロモータに作動可能に連結される。誘導型プロモータの例としては、Ｔｅｔ−Ｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｃｈｅｎ Ｈ．ら、（２０１５）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１）：４））及びＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈシステム（Ｉｎｔｒｅｘｏｎ；Ｓｏｗａ Ｇ．ら、（２０１１）Ｓｐｉｎｅ、３６（１０）：Ｅ６２３−８）が挙げられる。両システム及び当技術分野で公知の同様のシステムは、小分子アクチベータ（それぞれドキシサイクリン又はエクジソン）に応答して転写を活性化するリガンド誘導型転写因子（それぞれＴｅｔリプレッサー及びエクジソン受容体の変異体）に依存する。このようなリガンド誘導型転写アクチベータを用いた本開示の実施は、１）転写因子のための１又は複数の結合部位を有するエンドヌクレアーゼ遺伝子を、対応する転写因子に応答するプロモータの制御下に配置することと；２）転写因子をコードする遺伝子をパッケージングされたウイルスゲノムに含めることとを含む。転写アクチベータも同じ細胞に供給されない場合、組換えＡＡＶ送達後にエンドヌクレアーゼが標的細胞でも組織でも発現されないので、後者のステップが必要である。次いで、転写アクチベータが、同族小分子アクチベータで処理された細胞又は組織においてのみエンドヌクレアーゼ遺伝子発現を誘導する。このアプローチは、小分子誘導物質がいつ及びどの組織に送達されるかを選択することによって、エンドヌクレアーゼ遺伝子発現を空間−時間的様式で調節することができるので有利である。しかしながら、担持能力が著しく制限されたウイルスゲノムに誘導物質を含める必要性が、このアプローチの欠点を生み出す。
４．別の好ましい実施形態では、組換えＡＡＶ粒子が、エンドヌクレアーゼの発現を妨げる転写リプレッサーを発現する哺乳動物細胞株において産生される。転写リプレッサーは当技術分野で公知であり、Ｔｅｔリプレッサー、Ｌａｃリプレッサー、Ｃｒｏリプレッサー、及びλリプレッサーを含む。エクジソン受容体等の多くの核内ホルモン受容体は、それらの同族ホルモンリガンドの非存在下で転写リプレッサーとしても作用する。本開示を実施するために、パッケージング細胞を、転写リプレッサーをコードするベクターでトランスフェクト／形質導入し、ウイルスゲノム（パッケージングベクター）中のエンドヌクレアーゼ遺伝子を、リプレッサーがプロモータをサイレンシングするように、リプレッサーのための結合部位を含むように改変されたプロモータに作動可能に連結する。転写リプレッサーをコードする遺伝子は種々の位置に置かれる。これは別のベクターにコードされる；これはＩＴＲ配列の外側のパッケージングベクターに組み込まれる；これはｃａｐ／ｒｅｐベクター又はアデノウイルスヘルパーベクターに組み込まれる；あるいは最も好ましくは、これは構成的に発現されるようにパッケージング細胞のゲノムに安定に組み込まれる。転写リプレッサー部位を組み込むために一般的な哺乳動物プロモータを改変する方法は、当技術分野で公知である。例えばＣｈａｎｇ及びＲｏｎｉｎｓｏｎは強力な構成的ＣＭＶ及びＲＳＶプロモータをＬａｃリプレッサーのオペレーターを含むように改変し、改変プロモータからの遺伝子発現がリプレッサーを発現する細胞で大いに減弱することを示した（Ｃｈａｎｇ ＢＤ及びＲｏｎｉｎｓｏｎ ＩＢ（１９９６）Ｇｅｎｅ １８３：１３７〜４２）。非ヒト転写リプレッサーの使用は、エンドヌクレアーゼ遺伝子の転写が、リプレッサーを発現するパッケージング細胞においてのみ抑制され、得られる組換えＡＡＶベクターで形質導入された標的細胞でも組織でも抑制されないことを保証する。
２．６ 操作されたヌクレアーゼ変異体
本開示の実施形態は、本明細書に記載される操作されたヌクレアーゼ、特に組換えメガヌクレアーゼ及びその変異体を包含する。本開示の更なる実施形態は、本明細書に記載される組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド及びこのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。
本明細書で使用される場合、「変異体」は、実質的に類似の配列を意味することを意図している。「変異体」ポリペプチドは、天然タンパク質の１又は複数の内部部位での１又は複数のアミノ酸の欠失又は付加、並びに／あるいは天然ポリペプチドの１又は複数の部位での１又は複数のアミノ酸の置換によって、「天然」ポリペプチドから誘導されるポリペプチドを意味することを意図している。本明細書で使用される場合、「天然」ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、変異体が由来する親配列を含む。実施形態によって包含される変異体ポリペプチドは生物学的に活性である。即ち、これらは天然タンパク質の所望の生物学的活性；即ち、例えば、Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列（配列番号２）、Ｂ２Ｍ５−６認識配列（配列番号４）、Ｂ２Ｍ７−８認識配列（配列番号６）、及びＢ２Ｍ１１−１２認識配列（配列番号８）を含む、ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子（配列番号１）に見られる認識配列を認識及び切断する能力を保持し続けている。このような変異体は、例えばヒトの操作から生じ得る。実施形態の天然ポリペプチド（例えば、配列番号１２〜１２６）の生物学的に活性な変異体、又は本明細書に記載される認識半部位結合サブユニット（例えば、配列番号１３２〜３６１）の生物学的に活性な変異体は、本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメータによって決定される、少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の天然ポリペプチド又は天然サブユニットのアミノ酸配列との配列同一性を有する。実施形態のポリペプチド又はサブユニットの生物学的に活性な変異体は、わずか約１〜４０アミノ酸残基、わずか約１〜２０、わずか約１〜１０、わずか約５、わずか４、３、２、又は１アミノ酸残基しか、そのポリペプチド又はサブユニットと異ならない。
実施形態のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断、及び挿入を含む種々の方法で改変される。このような操作の方法は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、アミノ酸配列変異体は、ＤＮＡ中の突然変異によって調製される。突然変異誘発及びポリヌクレオチド改変のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８〜４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７〜３８２；米国特許第４８７３１９２号明細書；Ｗａｌｋｅｒ及びＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク）、並びにこれらの文献に引用されている参考文献を参照されたい。対象となるタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、参照により本明細書に組み込まれるＤａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、ワシントンＤ．Ｃ．）のモデルに見出される。あるアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸で交換する等の保存的置換が最適である。
得られた合理的に設計されたメガヌクレアーゼが野生型酵素と異なる半部位特異性を有するように、単独で又は組み合わせて、ＤＮＡ認識配列半部位内の個々の塩基で変えられた特異性を有する組換えメガヌクレアーゼをもたらす、野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対する相当な数のアミノ酸改変が以前同定された（例えば、米国特許第８０２１８６７号明細書）。表５は、認識半部位の各半部位位置（−１〜−９）に存在する塩基に基づいて特異性を増強するために組換えメガヌクレアーゼ単量体又はサブユニットにおいてなされ得る潜在的置換を提供する。このような置換を、本明細書に開示されるメガヌクレアーゼの変異体に組み込む。
Figure 0006846429
ポリヌクレオチドの場合、「変異体」は、天然ポリヌクレオチド内の１又は複数の部位での１又は複数のヌクレオチドの欠失及び／又は付加を含む。当業者であれば、オープンリーディングフレームが維持されるように実施形態の核酸の変異体が構築されることを認識するであろう。ポリヌクレオチドの場合、保存的変異体には、遺伝暗号の縮重のために、実施形態のポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列が含まれる。変異体ポリヌクレオチドには、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて生成されるが、実施形態の組換えメガヌクレアーゼを依然としてコードするポリヌクレオチド等の合成由来のポリヌクレオチドが含まれる。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体は、本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメータによって決定される、少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又はそれ以上の特定のポリヌクレオチドとの配列同一性を有する。実施形態の特定のポリヌクレオチド（即ち、参照ポリヌクレオチド）の変異体は、変異体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間の配列同一性％を比較することによって評価することもできる。
本明細書に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入、及び置換は、ポリペプチドの特徴において根本的な変化を生じることは期待されない。しかしながら、それに先立って置換、欠失、又は挿入の正確な効果を予測することが困難な場合、当業者は、ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子（配列番号１）内に見られる認識配列を優先的に認識及び切断する能力についてポリペプチドをスクリーニングすることによってその効果が評価されることを理解するであろう。
本開示は、以下の実施例によって更に説明されるが、これは限定的であると解釈されるべきではない。当業者であれば、日常的な実験にすぎないものを用いて、本明細書に記載される特定の物質及び手順に対する多数の等価物を認識する、又は確認することができるであろう。このような等価物は、以下の実施例に従う特許請求の範囲に包含されることが意図される。
実施例１；Ｂ２Ｍ認識配列を認識及び切断するメガヌクレアーゼの特徴付け
１．Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列を認識及び切断するメガヌクレアーゼ
「Ｂ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼ」と本明細書で総称される組換えメガヌクレアーゼ（配列番号１２〜１００）は、ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子（配列番号１）に存在するＢ２Ｍ１３−１４認識配列（配列番号２）を認識及び切断するように操作された。各Ｂ２Ｍ１３−１４組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０に由来するＮ末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各Ｂ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは配列番号２のＢ２Ｍ１３認識半部位に結合する一方で、第２のサブユニットはＢ２Ｍ１４認識半部位に結合する（図１参照）。
Ｂ２Ｍ１３結合サブユニット及びＢ２Ｍ１４結合サブユニットはそれぞれ、それぞれＨＶＲ１及びＨＶＲ２と呼ばれる５６塩基対超可変領域を含む。Ｂ２Ｍ１３結合サブユニットは、８０位又は２７１位（Ｑ又はＥ残基を含む）を除いてＨＶＲ１領域の外側で高度に保存されている、あるいは多くの場合、同一であり、ＨＶＲ１領域内で高度に保存されている。同様に、Ｂ２Ｍ１４結合サブユニットも、８０位又は２７１位（Ｑ又はＥ残基を含む）を除いてＨＶＲ２領域の外側で高度に保存されている、あるいは多くの場合、同一である。ＨＶＲ１領域と同様に、ＨＶＲ２領域も高度に保存されている。
配列番号１２〜１００のＢ２Ｍ１３結合領域は、それぞれ配列番号１３２〜２２０として提供される。配列番号１３２〜２２０の各々は、メガヌクレアーゼＢ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９（配列番号１２）のＢ２Ｍ１３結合領域である配列番号１３２と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号１２〜１００のＢ２Ｍ１４結合領域は、それぞれ配列番号２２１〜３０９として提供される。配列番号２２１〜３０９の各々は、メガヌクレアーゼＢ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９（配列番号１２）のＢ２Ｍ１４結合領域である配列番号２２１と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
２．Ｂ２Ｍ ５−６認識配列を認識及び切断するメガヌクレアーゼ
「Ｂ２Ｍ５−６メガヌクレアーゼ」と本明細書で総称される組換えメガヌクレアーゼ（配列番号１０１〜１１３）は、ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子（配列番号１）に存在するＢ２Ｍ５−６認識配列（配列番号４）を認識及び切断するように操作された。各Ｂ２Ｍ５−６組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０に由来するＮ末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各Ｂ２Ｍ５−６メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは配列番号４のＢ２Ｍ５認識半部位に結合する一方で、第２のサブユニットはＢ２Ｍ６認識半部位に結合する（図１参照）。
Ｂ２Ｍ５結合サブユニット及びＢ２Ｍ６結合サブユニットはそれぞれ、それぞれＨＶＲ１及びＨＶＲ２と呼ばれる５６塩基対超可変領域を含む。Ｂ２Ｍ５結合サブユニットは、８０位又は２７１位（Ｑ又はＥ残基を含む）を除いてＨＶＲ１領域の外側で高度に保存されている、あるいは多くの場合、同一であり、ＨＶＲ１領域内で高度に保存されている。同様に、Ｂ２Ｍ５結合サブユニットも、８０位又は２７１位（Ｑ又はＥ残基を含む）を除いてＨＶＲ２領域の外側で高度に保存されている、あるいは多くの場合、同一であり、ＨＶＲ２領域内で高度に保存されている。
配列番号１０１〜１１３のＢ２Ｍ５結合領域は、それぞれ配列番号３１０〜３２２として提供される。配列番号３１０〜３２２の各々は、メガヌクレアーゼＢ２Ｍ５−６ｘ．１４（配列番号１０１）のＢ２Ｍ５結合領域である配列番号３１０と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号１０１〜１１３のＢ２Ｍ６結合領域は、それぞれ配列番号３２３〜３３５として提供される。配列番号３２３〜３３５の各々は、メガヌクレアーゼＢ２Ｍ５−６ｘ．１４（配列番号１０１）のＢ２Ｍ６結合領域である配列番号３２３と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
３．Ｂ２Ｍ ７−８認識配列を認識及び切断するメガヌクレアーゼ
「Ｂ２Ｍ７−８メガヌクレアーゼ」と本明細書で総称される組換えメガヌクレアーゼ（配列番号１１４〜１２４）は、ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子（配列番号１）に存在するＢ２Ｍ７−８認識配列（配列番号６）を認識及び切断するように操作された。各Ｂ２Ｍ７−８組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０に由来するＮ末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各Ｂ２Ｍ７−８メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは配列番号６のＢ２Ｍ７認識半部位に結合する一方で、第２のサブユニットはＢ２Ｍ８認識半部位に結合する（図１参照）。
Ｂ２Ｍ７結合サブユニット及びＢ２Ｍ８結合サブユニットはそれぞれ、それぞれＨＶＲ１及びＨＶＲ２と呼ばれる５６塩基対超可変領域を含む。Ｂ２Ｍ７結合サブユニットは、８０位又は２７１位（Ｑ又はＥ残基を含む）を除いてＨＶＲ１領域の外側で高度に保存されている、あるいは多くの場合、同一であり、ＨＶＲ１領域内で高度に保存されている。同様に、Ｂ２Ｍ８結合サブユニットも、８０位又は２７１位（Ｑ又はＥ残基を含む）を除いてＨＶＲ２領域の外側で高度に保存されている、あるいは多くの場合、同一であり、ＨＶＲ２領域内で高度に保存されている。
配列番号１１４〜１２４のＢ２Ｍ７結合領域は、それぞれ配列番号３３６〜３４６として提供される。配列番号３３６〜３４６の各々は、メガヌクレアーゼＢ２Ｍ７−８ｘ．８８（配列番号１１４）のＢ２Ｍ７結合領域である配列番号３３６と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号１１４〜１２４のＢ２Ｍ８結合領域は、それぞれ配列番号３４７〜３５７として提供される。配列番号３４７〜３５７の各々は、メガヌクレアーゼＢ２Ｍ７−８ｘ．８８（配列番号１１４）のＢ２Ｍ８結合領域である配列番号３４７と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
４．Ｂ２Ｍ １１−１２認識配列を認識及び切断するメガヌクレアーゼ
「Ｂ２Ｍ１１−１２メガヌクレアーゼ」と本明細書で総称される組換えメガヌクレアーゼ（配列番号１２５及び１２６）は、ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子（配列番号１）に存在するＢ２Ｍ１１−１２認識配列（配列番号８）を認識及び切断するように操作された。各Ｂ２Ｍ１１−１２組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０に由来するＮ末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各Ｂ２Ｍ１１−１２メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは配列番号８のＢ２Ｍ１１認識半部位に結合する一方で、第２のサブユニットはＢ２Ｍ１２認識半部位に結合する（図１参照）。
Ｂ２Ｍ１１結合サブユニット及びＢ２Ｍ１２結合サブユニットはそれぞれ、それぞれＨＶＲ１及びＨＶＲ２と呼ばれる５６塩基対超可変領域を含む。Ｂ２Ｍ１１結合サブユニットは、８０位又は２７１位（Ｑ又はＥ残基を含む）を除いてＨＶＲ１領域の外側で高度に保存されている、あるいは多くの場合、同一であり、ＨＶＲ１領域内で高度に保存されている。同様に、Ｂ２Ｍ１２結合サブユニットも、８０位又は２７１位（Ｑ又はＥ残基を含む）を除いてＨＶＲ２領域の外側で高度に保存されている、あるいは多くの場合、同一であり、ＨＶＲ２領域内で高度に保存されている。
配列番号１２５及び１２６のＢ２Ｍ１１結合領域は、それぞれ配列番号３５８及び３５９として提供される。配列番号３５８及び３５９は、９９％の配列同一性を共有する。配列番号１２５及び１２６のＢ２Ｍ１２結合領域は、それぞれ配列番号３６０及び３６１として提供される。配列番号３６０及び３６１は、９９％の配列同一性を共有する。
５．ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおけるＢ２Ｍ認識配列の切断
Ｂ２Ｍ１３−１４、Ｂ２Ｍ５−６、Ｂ２Ｍ７−８、及びＢ２Ｍ１１−１２メガヌクレアーゼがそれらのそれぞれの認識配列（それぞれ配列番号２、４、６、及び８）を認識及び切断することができるかどうかを決定するために、以前に記載されたＣＨＯ細胞レポーターアッセイ（国際公開第２０１２／１６７１９２号パンフレット及び図８Ａ〜図８Ｄ参照）を用いて、各組換えメガヌクレアーゼを評価した。アッセイを行うために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能的緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子発現カセットを保有するＣＨＯ細胞レポーター株を作製した。各細胞株のＧＦＰ遺伝子を、メガヌクレアーゼによるいずれかの認識配列の細胞内切断が機能的ＧＦＰ遺伝子をもたらす相同組換え事象を刺激するように、一対の認識配列によって中断した。
この試験のために開発されたＣＨＯレポーター細胞株では、ＧＦＰ遺伝子に挿入された１つの認識配列が、Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列（配列番号２）、Ｂ２Ｍ５−６認識配列（配列番号４）、Ｂ２Ｍ７−８認識配列（配列番号６）、又はＢ２Ｍ１１−１２認識配列（配列番号８）であった。ＧＦＰ遺伝子に挿入された第２の認識配列は、「ＣＨＯ−２３／２４」と呼ばれる対照メガヌクレアーゼによって認識及び切断されるＣＨＯ−２３／２４認識配列であった。Ｂ２Ｍ１３−１４認識配列及びＣＨＯ−２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞は、本明細書で「Ｂ２Ｍ１３−１４細胞」と呼ばれる。Ｂ２Ｍ５−６認識配列及びＣＨＯ−２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞は、本明細書で「Ｂ２Ｍ５−６細胞」と呼ばれる。Ｂ２Ｍ７−８認識配列及びＣＨＯ−２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞は、本明細書で「Ｂ２Ｍ７−８細胞」と呼ばれる。Ｂ２Ｍ１１−１２認識配列及びＣＨＯ−２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞は、本明細書で「Ｂ２Ｍ１１−１２細胞」と呼ばれる。
ＣＨＯレポーター細胞を、対応する組換えメガヌクレアーゼをコードする（例えば、Ｂ２Ｍ１３−１４細胞を、Ｂ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした）又はＣＨＯ−２３／３４メガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。各アッセイで、４ｅ５ＣＨＯレポーター細胞を、製造業者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、９６ウェルプレート中５０ｎｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞をフローサイトメトリーによって評価して、トランスフェクトされていない陰性対照（例えば、Ｂ２Ｍ１３−１４ｂｓ）と比較したＧＦＰ陽性細胞の割合を決定した。図４Ａ〜図４Ｊに示されるように、試験したＢ２Ｍ１３−１４、Ｂ２Ｍ５−６、Ｂ２Ｍ７−８、及びＢ２Ｍ１１−１２メガヌクレアーゼは全て、陰性対照を有意に超える頻度で、それらの対応する認識配列を含む細胞株においてＧＦＰ陽性細胞を産生することが分かった。
これらの試験は、本開示に包含されるＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼ、Ｂ２Ｍ５−６メガヌクレアーゼ、Ｂ２Ｍ１１−１２メガヌクレアーゼ、及びＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼが、細胞内でそれらのそれぞれの認識配列を効率的に標的化及び切断することができることを実証した。
実施例２；Ｔ細胞における細胞表面Ｂ２Ｍ発現の抑制
１．ヒトＴ細胞におけるＢ２Ｍ細胞表面発現の抑制
この試験は、本開示に包含される選択された数のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼが、ドナーから得られたヒトＴ細胞のＢ２Ｍ１３−１４認識配列を切断し、Ｂ２Ｍ細胞表面発現の抑制をもたらし得ることを実証した。Ｂ２ＭメガヌクレアーゼがヒトＴ細胞のＢ２Ｍ１３−１４認識配列を切断することができるかどうかを試験するために、ドナー細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔した。陽性対照として、細胞を疑似電気穿孔した。電気穿孔効率についての更なる対照では、細胞を、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔した。電気穿孔の３日後、細胞を、β−２ミクログロブリンを認識する抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。フロープロットを図５Ａ〜図５Ｎに示し、データを表６に要約する。
陽性対照細胞及びＧＦＰ電気穿孔細胞は、Ｂ２Ｍ発現について圧倒的に陽性に染色され、それぞれ０．１８％及び０．２３％の細胞が陰性染色であった（図５Ａ及び図５Ｃ、並びに表６）。染色されていない対照細胞は、Ｂ２Ｍ染色について９９．９９％陰性であった（図５Ｂ及び表６）。驚くべきことに、試験したＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼの全てがＣＨＯレポーターアッセイにおいて成功したが、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３は、Ｂ２Ｍ遺伝子で挿入欠失をもたらし、Ｂ２Ｍ細胞表面発現を低下させ得る兆候を示した唯一のメガヌクレアーゼであり、細胞の２．１８％がＢ２Ｍについて陰性染色であった（図５Ｎ及び表６）。試験した他のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼのいずれかを用いて電気穿孔した細胞は、０．０１％〜０．１４％陰性に及ぶ模擬電気穿孔対照とほぼ同等のＢ２Ｍ陰性細胞を示した（図５Ａ〜５Ｍ及び表６）。これらの結果は、Ｂ２Ｍ遺伝子について、レポーター細胞におけるＢ２Ｍ認識配列の成功した切断が、Ｔ細胞における認識配列の切断、及びその後、Ｂ２Ｍの細胞表面発現低下を保証しないことを示した。
Figure 0006846429
Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３は、ヒトＴ細胞のＢ２Ｍ認識配列に対する活性を示すＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼの唯一のものであったので、このメガヌクレアーゼを更に改変してヌクレアーゼ活性を増加させた。本発明者らは、以前、Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼサブユニットのアミノ酸８０位及び６６位（それぞれ単鎖メガヌクレアーゼの２７１位及び２５７位に相当する）の突然変異が、おそらくは負に荷電したＤＮＡ骨格との非特異的相互作用のために、ヌクレアーゼ活性に劇的に影響し得ることを示した。一般的な置換には、アミノ酸８０位のＥ又はＱ、及びアミノ酸６６位のＹ、Ｋ、又はＲが含まれる。第１のメガヌクレアーゼサブユニット及び／又は第２のメガヌクレアーゼサブユニットのアミノ酸８０位を変化させることができ、以下の考えられる組み合わせを生み出す：両メガヌクレアーゼサブユニットのＥ、両メガヌクレアーゼサブユニットのＱ、第１のメガヌクレアーゼサブユニットのＥ及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットのＱ、又は第１のメガヌクレアーゼサブユニットのＱ及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットのＥ。アミノ酸６６位はメガヌクレアーゼサブユニットのいずれでも改変することができるが、この場合、第１のメガヌクレアーゼサブユニットにおいてのみ改変する。元のＢ２Ｍ１３−１４ｘ．９３メガヌクレアーゼは、両メガヌクレアーゼサブユニットにおいてアミノ酸８０位にＱを有していた。
表７は、第１及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットの８０位のアミノ酸を示すＥ又はＱ、引き続いて第１のメガヌクレアーゼサブユニットの６６位で行われたアミノ酸置換により作製されたＢ２Ｍ１３−１４ｘ．９３変異体を示す。例えば、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＱＹ６６は、第１のメガヌクレアーゼサブユニットのアミノ酸８０がＥであり、第２のメガヌクレアーゼサブユニットのアミノ酸８０（即ち、２７１）がＱであり、第１のメガヌクレアーゼサブユニットのアミノ酸６６がＹであることを示す。
Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３のこれらの変異体を試験するために、ドナーヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔した。電気穿孔の３日後、細胞を、β−２ミクログロブリンを認識する抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリーの結果を表７に要約する。全てのＢ２Ｍ１３−１４ｘ．９３変異体が、１．５８％〜３７％に及ぶノックアウト効率でＢ２Ｍ遺伝子を破壊することができた（表７）。最も活性のＢ２Ｍ１３−１４ｘ．９３変異体はＢ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＥであり、これは３７％のＢ２Ｍ陰性細胞をもたらした（表７）。次の２つの最も活性のＢ２Ｍ１３−１４ｘ．９３メガヌクレアーゼ変異体は共に、第２のメガヌクレアーゼサブユニットの８０位にＱを有し、６６位にＹを有していた（Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＱＹ６６及びＢ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＱＹ６６）。興味深いことに、変異体の大部分は元のＢ２Ｍ１３−１４ｘ．９３メガヌクレアーゼと著しくは異なっていなかった（Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＥＱ、ＱＱＫ６６、ＱＱＲ６６、ＥＥＹ６６、ＥＥＫ６６、ＥＥＲ６６、ＥＱＫ６６、及びＥＱＲ６６）。
Figure 0006846429
アミノ酸８０位及び６６位におけるこれらの置換は、元のＢ２Ｍ１３−１４ｘ．９３メガヌクレアーゼよりＢ２Ｍ１３−１４認識配列に対して活性なＢ２Ｍ１３−１４ｘ．９３メガヌクレアーゼをもたらしたが、更なる最適化を行って、Ｂ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼの活性を最大化した。第１のメガヌクレアーゼサブユニットがＢ２Ｍ１３−１４ｘ．９３と同じままであるが、第２のメガヌクレアーゼサブユニットがＢ２Ｍ１３−１４認識配列と接触する位置に新しいアミノ酸置換を含む新たなＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼを設計した。
これらの新たなＢ２Ｍ１３−１４変異体を試験するために、ドナーヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔した。Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＥを、以前の変異体との比較を可能にするために含めた。電気穿孔の６日後に、細胞を、β−２ミクログロブリンを認識する抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）並びにＣＤ３を認識する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、Ｔ細胞のマーカーで染色した。フローサイトメトリープロットを図６Ａ〜図６Ｊに示す。
この実験では、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＥが、非電気穿孔対照細胞における０．４９％と比較して、２１．２％のＢ２Ｍ陰性細胞を生じた（それぞれ図６Ｂ及び図６Ａ）。Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９７、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１９９、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２０２、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６９、及びＢ２Ｍ１３−１４ｘ．２７５を含む新たな変異体のいくつかは、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＥよりも有意に活性であり、Ｂ２Ｍノックアウト効率が５８．４％と高かった（図６Ｊ）。
Ｂ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼの最終グループを作製し、ヒトＴ細胞上のＢ２Ｍの細胞表面発現を排除するそれらの能力について評価した。これらのヌクレアーゼは、上記変異体の１つであるＢ２Ｍ１３−１４ｘ．１６９に基づいていた。第１のメガヌクレアーゼサブユニットに改変を行って代わりの塩基接触を導入した一方、第２のメガヌクレアーゼサブユニットはＢ２Ｍ１３−１４ｘ．１６９と同じままであった。
ドナーヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、所与のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔した。Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２０２を、図６Ａ〜図６Ｊに示される以前の変異体との比較を可能にするために含めた。Ｂ２Ｍ表面発現の喪失を探すために、細胞を、β−２ミクログロブリンを認識する抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）並びにＣＤ３を認識する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、Ｔ細胞のマーカーで染色した。電気穿孔後３日目の変異体パネル全体のフローサイトメトリーデータを表８に要約し、４０％超のＢ２Ｍノックアウト効率を示したＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼのフロープロットを図７Ａ〜図７Ｈに示す。
前の実験と同様に、Ｂ２Ｍ １３−１４ｘ．２０２は、６０．９％のＢ２Ｍノックアウト効率を示した（表８）。試験したＢ２Ｍ１３−１４変異体のいくつかは、４０％を超えるノックアウト効率を示し（図７Ａ〜図７Ｈ）、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２８７及びＢ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９の２つの変異体は、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２０２の効率を上回り、陰性染色集団はそれぞれ７５．７％及び６７．２％であった。
Figure 0006846429
上記のデータは、β−２ミクログロブリン遺伝子における二本鎖破壊を標的化するように設計されたメガヌクレアーゼの成功した操作、及びヒトＴ細胞におけるβ−２ミクログロブリン遺伝子に突然変異を生成するためのこのようなメガヌクレアーゼの使用が、遺伝子のノックアウトをもたらしたことを実証している。驚くべきことに、ＣＨＯレポーターアッセイで成功した１１種のＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼのうちの１つのみが、実際にＢ２Ｍ遺伝子の発現を排除することができた。更に、Ｂ２Ｍ遺伝子の欠失を引き起こした初期Ｂ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼのただ１つであるＢ２Ｍ１３−１４ｘ．９３は非常に低頻度でそうであった（２．１８％、表６）。Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３を、その活性及び特異性を最適化するために、数回の再設計に通し、最終的に６０〜７５％の範囲の効率でＢ２Ｍノックアウトを生成することができるいくつかのＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼを得た（表８）。
実施例３；Ｔ細胞における細胞表面Ｂ２Ｍ及びＴ細胞受容体の二重ノックアウト
１．同時ヌクレオフェクションによる二重ノックアウト
β−２ミクログロブリン遺伝子と天然Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の両方をノックアウトすることが望ましい場合がある。本発明者らは、同様に内因性ＴＣＲの細胞表面発現を破壊するＴ細胞受容体α定常遺伝子（配列番号１２７）において二本鎖破壊を引き起こすように設計されたメガヌクレアーゼを以前記載している。このようなメガヌクレアーゼの１つはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ（配列番号１３１）と呼ばれ、配列番号１２８に示される認識配列を標的化する。ＴＣＲの喪失は、ＴＣＲが発現されている場合にのみ細胞の表面上に発現されるＣＤ３タンパク質に対する抗体で細胞を染色することによって観察することができる。
ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ及びＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼを、ＴＲＣ遺伝子とＢ２Ｍ遺伝子の両方がノックアウトされた細胞の集団を作製するために使用することができるかどうかを試験するために、これらのメガヌクレアーゼをコードする別個のｍＲＮＡをヒトＴ細胞に同時に送達する実験を行った。第１の試験で、ドナーヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で２日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２０２をコードするｍＲＮＡ（１μｇ）及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて同時電気穿孔した。対照として、ヒトＴ細胞を模擬電気穿孔した、又はＢ２Ｍ１３−１４ｘ．２０２若しくはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥのいずれかの単一メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。電気穿孔の６日後、細胞をＣＤ３に対する抗体及びＢ２Ｍに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した（図８Ａ〜図８Ｄ）。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ単独で電気穿孔した細胞は、模擬電気穿孔細胞（図８Ａ）の２．３５％と比較して５７．６％のＴＣＲ陰性であり（図８Ｂ）、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２０２単独で電気穿孔した細胞は、模擬電気穿孔細胞（図８Ａ）の０．７２％と比較して、４９．４％Ｂ２Ｍ陰性（図８Ｃ）であった。Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．２０２をコードするｍＲＮＡ及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを用いて同時電気穿孔した細胞は、模擬電気穿孔細胞（図８Ａ）の０．６６％と比較して、細胞の２１．５％がＢ２Ｍ発現とＴＣＲ発現の両方について陰性である（図８Ｄ）はっきりした集団を示す。両メガヌクレアーゼについてｍＲＮＡを用いて同時電気穿孔した細胞では、ＴＣＲ及びＢ２Ｍに対する単一ノックアウト効率は、それぞれ２８．３％及び１６．７％であった。
第２の試験で、ドナーヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で２日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６９をコードするｍＲＮＡ（１μｇ）及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて同時電気穿孔した。対照として、ヒトＴ細胞を模擬電気穿孔した、又はＢ２Ｍ１３−１４ｘ．１６９若しくはＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥのいずれかの単一メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。電気穿孔の６日後、細胞をＣＤ３に対する抗体及びＢ２Ｍに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した（図９Ａ〜図９Ｄ）。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ単独で電気穿孔した細胞は、模擬電気穿孔細胞（図９Ａ）の２．３５％と比較して５７．６％のＴＣＲ陰性であり（図９Ｂ）、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６９単独で電気穿孔した細胞は、模擬電気穿孔細胞（図９Ａ）の０．７２％と比較して、２８．１％Ｂ２Ｍ陰性（図９Ｃ）であった。Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．１６９をコードするｍＲＮＡ及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを用いて同時電気穿孔した細胞は、模擬電気穿孔細胞（図９Ａ）の０．６６％と比較して、細胞の１５．４％がＢ２Ｍ発現とＴＣＲ発現の両方について陰性であった（図９Ｄ）はっきりした集団を示す。両メガヌクレアーゼについてｍＲＮＡを用いて同時電気穿孔した細胞では、ＴＣＲ及びＢ２Ｍに対する単一ノックアウト効率は、それぞれ３３．７％及び１３．０％であった。
２．逐次ヌクレオフェクションによる二重ノックアウト
Ｂ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いたヒトＴ細胞の同時電気穿孔は、Ｂ２Ｍ／ＴＣＲ二重陰性集団を作製するのに有効であるが、メガヌクレアーゼｍＲＮＡの逐次電気穿孔を使用して、二重ノックアウト集団を作製するのも有用となり得る。
これを試験するために、ドナーヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＥをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔した。電気穿孔の４日後、ビオチン化抗Ｂ２Ｍ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びヒトビオチン選択カクテルキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＢ２Ｍ陰性細胞を濃縮し、Ｂ２Ｍに対する抗体で染色した後のフローサイトメトリー分析によって示される８８．１５％Ｂ２Ｍ陰性（図１０Ｂ）の細胞の集団を得た。Ｂ２Ｍ陰性濃縮細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間再刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔した。電気穿孔の５日後、細胞をＢ２Ｍ及びＴＣＲに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した（図１０Ｃ）。これらの細胞の３１．６７％は、出発集団（図１０Ａ）の０．５８％と比較して、Ｂ２ＭとＴＣＲの両方の表面発現について陰性であり、Ｂ２Ｍ１３−１４及びＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いた細胞の逐次電気穿孔もまたヒトＴ細胞のＢ２Ｍ／ＴＣＲ二重陰性集団を作製する有効な方法であることを示している。
次いで、Ｂ２Ｍ／ＴＣＲ二重陰性細胞の高度に精製された集団を濃縮することができるかどうかを決定した。この試験では、ドナーヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で２日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．９３ＱＥをコードするｍＲＮＡ（１μｇ）を用いて電気穿孔した。Ｂ２Ｍ陰性細胞を上記のように濃縮した。次いで、細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間再刺激し、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。電気穿孔の６日後、ＣＤ３陰性細胞を、ＣＤ３陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて濃縮し、引き続いてビオチン化抗Ｂ２Ｍ抗体及びビオチン選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＢ２Ｍ陰性細胞を更に濃縮した。濃縮細胞をＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１５の存在下で３日間インキュベートし、次いで、Ｂ２Ｍ及びＣＤ３に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した（図１１Ａ〜図１１Ｃ）。図１１Ａ及び図１１Ｂは、抗ＣＤ３単独（図１１Ａ）又は抗ＣＤ３と抗Ｂ２Ｍ（図１１Ｂ）のいずれかで染色した出発ＰＢＭＣを示す。Ｂ２Ｍ１３−１４をコードするｍＲＮＡを用いた逐次電気穿孔、次いでＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡ、続いてＣＤ３抗体及びＢ２Ｍ陰性細胞の濃縮により、９８．５％のＢ２Ｍ／ＴＣＲ二重陰性である集団を得た（図１１Ｃ）。
３．Ｂ２Ｍ／ＴＣＲ二重ノックアウトＴ細胞の濃縮及び増殖集団の作製
Ｂ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡの同時電気穿孔は、Ｂ２Ｍ／ＴＣＲ二重陰性ヒトＴ細胞の治療的に関連する量（即ち、１０００万個超の細胞）の製造及び作製を可能にし得る。１０００万個超のＢ２Ｍ／ＴＣＲ二重陰性細胞を作製するため、ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９をコードするｍＲＮＡ及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔する。典型的な実験では、各試料について１００万個の細胞を電気穿孔する。治療的に関連する量のＢ２Ｍ／ＴＣＲ二重陰性細胞を製造するために、１０００万個もの細胞を電気穿孔する。電気穿孔後、細胞をＩＬ−２（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む培地で７日間インキュベートする。Ｂ２Ｍ／ＴＣＲ二重陰性細胞を、ＣＤ３陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて濃縮し、引き続いてビオチン化抗Ｂ２Ｍ抗体及びビオチン選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＢ２Ｍ陰性細胞を濃縮する。Ｂ２Ｍ及びＣＤ３に対する抗体を用いたフローサイトメトリーによって純度を評価する。Ｂ２Ｍ／ＴＣＲ二重陰性細胞を、ＩＬ−２（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む培地で更に７日間インキュベート及び増殖させる。
実施例４；Ｂ２ＭノックアウトＴ細胞の減少したアロゲニシティ
１．細胞傷害性アッセイにおけるＢ２ＭノックアウトＴ細胞の評価
この試験の目的は、Ｂ２ＭノックアウトＴ細胞がＢ２Ｍ陽性Ｔ細胞と比較して減少したアロゲニシティを示すかどうかを実証することであった。
ここでは、２人の不適合ドナー由来の凍結ＰＢＭＣバイアルを、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（Ｃ．Ｔ．Ｌ．−カタログ番号ＣＴＬ−ＣＰ１ロット２００６０９０６（ドナー３６）及び２０１１０５２５（ドナー７５））から得た。彼らのＨＬＡクラスＩの分類は表９に示されている。
Figure 0006846429
戦略は、不適合樹状細胞（ＤＣ）（他のドナーから産生された）を用いて、アロ抗原に対して各ドナーからのＴ細胞をプライミングすることであった。これらのアロ感作Ｔ細胞は、細胞傷害性アッセイにおいてエフェクターとして役立った。手短に言えば、凍結ＰＢＭＣを解凍し、２％ＨＡＢＳを含むＸ−ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ）中で培養することによって、ＤＣを作製した。細胞をＴ７５フラスコ中で培養し、１時間インキュベートして単球前駆体を接着させた。非接着細胞を取り出し、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２中で別々に培養した。接着細胞を、８００Ｕ／ｍＬ組換えヒト（ｒｈ）ＧＭ−ＣＳＦ及び５００Ｕ／ｍＬ ｒｈＩＬ−４を補充したＸ−ＶＩＶＯ＋２％ＨＡＢＳ２０ｍＬで培養した。酵素を含まない解離緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて接着ＤＣを収穫した。次いで、収穫したＤＣを、５：１のＴ細胞：ＤＣ比で、磁気濃縮ＣＤ８＋Ｔ細胞と共に５日間共培養した。
別々の培養物で、各ドナーからのＴ細胞をＢ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９メガヌクレアーゼで編集した。Ｂ２Ｍ陰性及びＢ２Ｍ陽性Ｔ細胞が、細胞傷害性アッセイの標的として役立った。手短に言えば、ドナーヒトＴ細胞を、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び抗ＣＤ２抗体の多量体からなるＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した試薬ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔで刺激した。刺激は、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ４７９ｍＲＮＡ１μｇで電気穿孔する前に３日間行った。対照として、ヒトＴ細胞をｍＲＮＡの非存在下で電気穿孔した。電気穿孔の６日後に、Ｂ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９ｍＲＮＡで電気穿孔した細胞を、Ｂ２Ｍに対するビオチン化抗体及び抗ビオチン磁気分離キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＢ２Ｍ陰性細胞について濃縮した。Ｂ２Ｍ陰性及び対照Ｂ２Ｍ陽性細胞を、製造者の指示に従って２μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識した。
細胞傷害性を測定するために、ドナー３６からのアロ感作Ｔ細胞を、ドナー３６（同系対照）又はドナー７５（同種異系試料）のいずれかからのＢ２Ｍ陽性又はＢ２Ｍ陰性ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ標識Ｔ細胞と共に培養した。同様にドナー７５からのアロ感作Ｔ細胞、及びドナー７５（同系対照）又はドナー３６（同種異系試料）のいずれかからのＢ２Ｍ陽性又はＢ２Ｍ陰性ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ標識Ｔ細胞を用いて共培養を行った。共培養は、５：１のエフェクター：標的比で７時間行った。インキュベーションの７時間後、細胞を、販売業者の推奨濃度でＶＡＤ−ＦＭＫ−ＦＩＴＣ（ＣａｓｐＡＣＥ−Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＢ２Ｍに対する蛍光抗体で標識した。複製プレートを１８時間培養し、ＩＦＮγ（ＥＬＩＳＡ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製のキットを使用）及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ製のキットを使用）等の分泌物質の分析のために上清を回収した。
標的をそのＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔシグナルに基づいて同定し、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって死滅した頻度を、そのＶＡＤ−ＦＭＫ−ＦＩＴＣシグナルによって評価した。ＣＴＬアッセイの結果を図１２Ａ〜図１２Ｈに示す。アロ感作Ｔ細胞は同系標的において有意なＶＡＤ−ＦＭＫ−ＦＩＴＣシグナルを誘導しないが、同種異系標的は２４〜２７％ＶＡＤ−ＦＭＫ−ＦＩＴＣ＋であり、エフェクター生成パーフォリンＡ及びグランザイムＢが不適合標的でアポトーシスを誘発していることを示している。ＶＡＤ−ＦＭＫ−ＦＩＴＣシグナルは、標的細胞がＢ２Ｍ十分である同種異系培養でのみ検出される。Ｂ２Ｍノックアウト標的細胞は同種抗原感作Ｔ細胞によって死滅しない。
この所見は、１８時間培養上清中の分泌物質の分析によって支持される。ＩＦＮγの同種異系Ｔ細胞分泌は、Ｂ２Ｍ陽性標的を含む培養物と比較して、Ｂ２Ｍ陰性標的を含む共培養物において６６〜７５％減少する（図１３）。標的細胞がＢ２Ｍ発現を欠く場合、死滅標的細胞によるＬＤＨ放出も同様に低下する（図１４）。
そのため、Ｂ２Ｍノックアウト細胞が、同種抗原プライミング細胞傷害性リンパ球による死滅に対する感受性低下を示すことが観察された。
実施例５；ＴＣＲ及びＢ２Ｍ二重ノックアウトＴ細胞におけるキメラ抗原受容体の発現
１．組換えＡＡＶベクター
この試験では、相同組換えを介して、ＴＲＣ１−２認識配列（配列番号１２８）でヒトＴ細胞のゲノムにキメラ抗原受容体をコードする外因性核酸配列を導入するように組換えＡＡＶベクターを設計する。各組換えＡＡＶベクターを、以前に記載された三重トランスフェクションプロトコルを用いて調製する。この試験のために調製した組換えＡＡＶベクターは、自己相補的又は一本鎖ＡＡＶベクターであり得る。いずれの場合も、組換えＡＡＶベクターは、一般に、５’ＩＴＲ、５’相同性アーム、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル配列、３’相同性アーム及び３’ＩＴＲを含む。これらの試験は更に、ＡＡＶ形質導入効率についての陽性対照として組み込まれるＧＦＰをコードするＡＡＶベクター（ＧＦＰ−ＡＡＶ）の使用を含む。
２．同時のキメラ抗原受容体配列のＴＲＣ１−２認識配列への導入とＢ２Ｍのノックアウト。
キメラ抗原受容体配列をＴＣＲα定常領域遺伝子に挿入するためにＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥと合わせて組換えＡＡＶベクターを同時に使用しながら、Ｂ２Ｍをノックアウトする効率を決定するための試験を行う。ＣＡＲのＴＣＲα定常領域への挿入は、内因性ＴＣＲの発現を排除するので、Ｂ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼによってＢ２Ｍもノックアウトされた細胞は、ＣＡＲ陽性、Ｂ２Ｍ／ＴＣＲ二重陰性である。
一般に、ヒトＴ細胞を、Ｂ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及び１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡで同時電気穿孔し、次いで直ちにＴＲＣ１−２認識部位遺伝子座と相同性の隣接ＣＡＲをコードするＡＡＶベクターで形質導入する。Ｂ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼはＢ２Ｍ遺伝子の欠失を引き起こし、細胞表面でのＢ２Ｍのノックアウトをもたらすが、ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼはＴＲＣ１−２認識部位での二本鎖破壊を引き起こし、相同組換えを通してＡＡＶベクターによる組換えを刺激する。
これらの試験で、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を得て、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で３日間刺激し、次いで、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡ及びＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて同時電気穿孔する。細胞を、ＴＲＣ１−２認識部位遺伝子座と相同性の隣接ＣＡＲをコードする組換えＡＡＶベクターで直ちに形質導入する。Ｂ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼはＢ２Ｍ遺伝子の欠失を引き起こし、細胞表面でのＢ２Ｍのノックアウトをもたらすが、ＴＲＣ１−２メガヌクレアーゼはＴＲＣ１−２認識部位での二本鎖破壊を引き起こし、相同組換えを通してＡＡＶベクターによる組換えを刺激する。形質導入効率を確認するために、メガヌクレアーゼでトランスフェクトしたヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の別の群を、上記のようにトランスフェクション直後にＧＦＰ−ＡＡＶ（細胞１個あたり１ｅ５ウイルスゲノム）で形質導入する。形質導入の７２時間後にＧＦＰ発現についてフローサイトメトリーにより細胞を分析して、形質導入効率を決定する。
形質導入のみの対照として、細胞を模擬トランスフェクションし（水で）、組換えＡＡＶベクターで形質導入する。メガヌクレアーゼのみの対照については、細胞をＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥをコードするｍＲＮＡとＢ２Ｍ１３−１４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡで同時トランスフェクトし、次いで、トランスフェクション直後に（水で）模擬形質導入する。
キメラ抗原受容体配列の挿入を、ＴＣＲα定常領域遺伝子中の切断部位の配列決定によって確認する。キメラ抗原受容体の細胞表面発現を、抗Ｆａｂ又は特定の場合には抗ＣＤ１９抗体を用いるフローサイトメトリーによって確認する。細胞表面での内因性Ｔ細胞受容体及びＢ２Ｍのノックアウトを、前記のフローサイトメトリーによって決定する。
実施例６；別個の認識配列を標的化する２つのメガヌクレアーゼをコードするバイシストロン性ｍＲＮＡ
１．バイシストロン性ｍＲＮＡ変異体の設計及び評価
この試験の目的は、ヒトＴ細胞の複数の遺伝子標的のノックダウンについて２つのメガヌクレアーゼを同時にコードするバイシストロン性ｍＲＮＡの使用を評価することであった。以下の通り、配列がＩＲＥＳ、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、又はＦ２Ａ配列によって分離された、いくつかの変異体ｍＲＮＡを、異なる配向のＴＲＣ１−２ｘ．８７Ｅメガヌクレアーゼ配列及びＢ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９配列を使用して設計した：
Figure 0006846429
この試験では、ドナーヒトＴ細胞を、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び抗ＣＤ２抗体の多量体からなるＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で刺激した。刺激は、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、上記のバイシストロン性ｍＲＮＡの１つ１μｇで電気穿孔する前に３日間行った。更に、ドナーヒトＴ細胞を、１μｇのＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ ｍＲＮＡ又はＢ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９ＲＮＡを用いて電気穿孔した。細胞の更なる試料を、両方の個々のヌクレアーゼｍＲＮＡの各１μｇを用いて電気穿孔した。対照として、ヒトＴ細胞をｍＲＮＡの非存在下で電気穿孔した。電気穿孔の３日後及び７日後に、バイシストロン性ｍＲＮＡを用いて電気穿孔した細胞をＣＤ３（ＴＲＣノックダウンを決定するため）に対する抗体及びＢ２Ｍに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
細胞数及び生存率の評価を、表１１に示されるように、電気穿孔後３日目（図示せず）及び７日目に行った。サイトメトリー分析によって、ＴＲＡＣ遺伝子が編集された（ＴＲＣ ＫＯ）、Ｂ２Ｍ遺伝子が編集された（Ｂ２Ｍ ＫＯ）、又は両遺伝子が編集された（ｄＫＯ）細胞を同定した（図１５Ａ〜図１５Ｎ）。
Figure 0006846429
表１１及び図１５Ａ〜図１５Ｎに示されるように、２つのヌクレアーゼＲＮＡの送達は、最高頻度のｄＫＯ細胞（１７．１％）、引き続いてＢ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣ（１６．３％）、Ｂ２Ｍ−Ｔ２Ａ−ＴＲＣ（１２．８％）、Ｂ２Ｍ−Ｅ２Ａ−ＴＲＣ（１２．６％）、及びＴＲＣ−ＩＲＥＳ−Ｂ２Ｍ（１１．３％）をそれぞれもたらした。残りのヌクレアーゼは、約半分の頻度のｄＫＯ細胞を個々のＲＮＡとして生成した。ＲＮＡは種々の程度でＴ細胞に対する毒性を示した。更に、各個々のメガヌクレアーゼを使用すると最高のｄＫＯ％をもたらしたが、産生されたｄＫＯ細胞の総数は、Ｂ２Ｍ−Ｔ２Ａ−ＴＲＣ（０．８９１×１０＾６）、Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣ（０．８１７×１０＾６）、及びＴＲＣ−Ｐ２Ａ−Ｂ２Ｍ（０．７６８×１０＾６）を用いた場合に最高であった。
これらの実験は、２つのメガヌクレアーゼを真核細胞に送達して２つの別個の遺伝子標的、この場合、ＴＲＣ及びＢ２Ｍ認識配列を同時に編集及び／又はノックダウンするために、バイシストロン性ｍＲＮＡを用いることの有用性を明らかに実証している。７日間の培養期間にわたる細胞の生存率及び増殖を考慮すると、最高頻度のｄＫＯ細胞を含む培養物は、必ずしも最大数のｄＫＯ細胞を含むものではなかった。Ｂ２Ｍ−Ｔ２Ａ−ＴＲＣ及びＢ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣは、遺伝子と生存可能な編集された細胞の増殖の両方の最良の編集を可能にした。
２．バイシストロン性ｍＲＮＡの滴定
この試験の目的は、ヒトＴ細胞のＴＲＣ及びＢ２Ｍ認識配列を標的化するためのバイシストロン性ｍＲＮＡの最適濃度を決定することであった。前の実施例に記載されるように、ヒトＴ細胞における同時発現及び標的化のためのＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ配列及びＢ２Ｍ−１３−１４ｘ．４７９配列を含むいくつかのバイシストロン性ｍＲＮＡを開発した。試験した中でも、Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣ、Ｂ２Ｍ−Ｔ２Ａ−ＴＲＣ、ＴＲＣ−Ｐ２Ａ−Ｂ２Ｍ、及びＴＲＣ−Ｔ２Ａ−Ｂ２Ｍを、更なる評価のために選択した。
ここで、Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣ、Ｂ２Ｍ−Ｔ２Ａ−ＴＲＣ、ＴＲＣ−Ｐ２Ａ−Ｂ２Ｍ、又はＴＲＣ−Ｔ２Ａ−Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡを、増加する濃度でドナーヒトＴ細胞に導入し、細胞表面ＣＤ３のノックダウン率（ＴＲＣノックダウンを示した）及びＢ２Ｍを決定した。手短に言うと、製造業者の指示に従ってＡｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、上記のＢ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣ、Ｂ２Ｍ−Ｔ２Ａ−ＴＲＣ、ＴＲＣ−Ｐ２Ａ−Ｂ２Ｍ、又はＴＲＣ−Ｔ２Ａ−Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡ１、２、又は４μｇで電気穿孔する前に、ドナーヒトＴ細胞をＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔで３日間刺激した。比較のために、ドナーヒトＴ細胞をＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ１μｇ又はＢ２Ｍ１３−１４ｘ．４７９ １μｇを用いて電気穿孔した。更に、ドナーヒトＴ細胞を、０．５μｇの各ヌクレアーゼ又は１μｇの各ヌクレアーゼの用量を使用して、別々のＲＮＡ分子にコードされた両ヌクレアーゼを用いて電気穿孔した。対照として、ヒトＴ細胞をＲＮＡなしで電気穿孔した。電気穿孔の７日後に、細胞を計数し、トリパンブルーを用いて生存率を評価した。細胞をＣＤ３（ＴＲＣノックダウンを決定するため）に対する抗体及びＢ２Ｍに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析し、同様にゴースト色素７８０で染色して死細胞を分析から除外した。
図１６Ａ〜図１６Ｐ及び表１２に示されるように、ドナーのヒトＴ細胞に電気穿孔されるバイシストロン性ｍＲＮＡの量を増加させると、一般に、培養物中のｄＫＯ細胞の頻度が増加したが、場合によっては、電気穿孔７日後に存在する生細胞の総数が減少した。
Figure 0006846429
Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣについては、より高用量のＲＮＡが耐容性は良好であったが、ｄＫＯ細胞の頻度又は数を必ずしも増加させなかった。Ｂ２Ｍ−Ｔ２Ａ−ＴＲＣについては、より多量のＲＮＡが耐容性が良好であり、より高いｄＫＯ頻度及びより多くのｄＫＯ細胞をもたらした。ＴＲＣ−Ｐ２Ａ−Ｂ２Ｍについてもこれが当てはまったが、より高いＲＮＡ用量で細胞生存率は低下した。ＴＲＣ−Ｔ２Ａ−Ｂ２Ｍは高用量で耐容性が良好であるように見えたが、堅牢な細胞増殖を明らかに可能にしなかった。この実験で、Ｂ２Ｍ−Ｔ２Ａ−ＴＲＣは、別個のｍＲＮＡ分子上の２つのヌクレアーゼでＴ細胞を電気穿孔するよりも、わずかに高い頻度及び数のｄＫＯ細胞を産生するようである。
そのため、バイシストロン性ｍＲＮＡの量を増加させることによって、より高い頻度及び数のｄＫＯ細胞を達成することができた。具体的には、Ｂ２Ｍ−Ｔ２Ａ−ＴＲＣ４μｇが、この実験において最も多くの標的細胞をもたらし、それぞれＴＲＣ及びＢ２Ｍの各１μｇより優れていた。
実施例７；バイシストロン性ｍＲＮＡ及びＡＡＶを用いた抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の作製
１．バイシストロン性ｍＲＮＡを用いたＴ細胞の電気穿孔及びＡＡＶによる形質導入
この試験の目的は、Ｔ細胞受容体及びＢ２Ｍの二重ノックアウトを有するＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞を製造するためのバイシストロン性ｍＲＮＡの使用を評価することであった。前の実施例に記載されるように、ヒトＴ細胞における同時発現及び標的化のためのＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ配列及びＢ２Ｍ−１３−１４ｘ．４７９配列を含むいくつかのバイシストロン性ｍＲＮＡを開発した。試験したものの中で、その最適濃度を決定した後、Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣを更なる評価のために選択した。
ここで、Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣをＡＡＶベクターと共に使用して、キメラ抗原受容体をコードする外因性核酸配列を、相同組換えを介して、ＴＲＣ１−２認識配列でヒトＴ細胞のゲノムに導入し、同時にＴ細胞受容体とＢ２Ｍの両方の細胞表面発現をノックアウトした。ＡＡＶベクターは、相同性アームが隣接した、前に記載した抗ＣＤ１９ＣＡＲコード配列を含む核酸を含んでいた。ＣＡＲカセットの発現をＪｅＴプロモータによって駆動した。ＡＡＶベクターは、ドナープラスミドからＶｉｒｏｖｅｋ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によって調製した。
これらの実験では、ドナーヒトＴ細胞を得て、電気穿孔の前にＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３日間刺激した。次いで、３μｇ／１×１０６個の細胞を、製造業者の指示に従ってＡｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、上記のバイシストロン性Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣ ｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。細胞を、ＴＲＣ１−２認識部位遺伝子座との相同性アームが隣接する抗ＣＤ１９ＣＡＲをコードする組換えＡＡＶベクターで直ちに形質導入した。対照として、細胞を、ＡＡＶ形質導入の前に、１μｇのＴＲＣ１−２ｘ８７ＥＥ ＲＮＡを用いて電気穿孔した。更に、Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣ及びＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ電気穿孔細胞を模擬形質導入した。
電気穿孔／形質導入の３日後及び６日後に、編集された細胞をＣＤ３（ＴＲＣノックダウンを決定するため）に対する抗体及びＢ２Ｍに対する抗体並びにＣＡＲを検出するためのビオチン化組換えＣＤ１９−Ｆｃ融合タンパク質で染色した。ストレプトアビジン−ＰＥをＣＡＲ染色のための二次検出試薬として使用した。ＣＤ３、Ｂ２ｍ、及びＣＡＲレベルをフローサイトメトリーによって評価した。
２．結果
電気穿孔後６日目にＣＤ３、Ｂ２Ｍ、及びＣＡＲ発現レベルのサイトメトリー測定を行い、これを図１７Ａ〜図１７Ｈに示す。ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥはＣＤ３−イベントの集団（６７．３％）を生成したが（図１７Ａ）、Ｂ２Ｍ発現は変化しなかった。Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣは、ＣＤ３発現（１７．３％）、Ｂ２Ｍ発現（１９．７％）、又は両マーカーの発現（３０．７％）を欠く集団を生成した（１７Ｂ）。模擬形質導入培養物を使用して、ＣＡＲ染色についてのベースラインを設定し（１７Ｃ及び１７Ｄ）、ＴＲＣ１−２ｘ．８７ＥＥ（２２．２％ＣＤ３−／ＣＡＲ＋）（１７Ｅ）又はＢ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣ（１５．７％ＣＤ３−／ＣＡＲ＋）（１７Ｆ）のいずれかで電気穿孔した形質導入培養物についてＣＡＲ発現を決定した。ＣＡＲ＋／ＣＤ３−イベントのゲーティングは、Ｂ２Ｍ−ＩＲＥＳ−ＴＲＣ培養物においてＣＡＲ Ｔ細胞の６７％が細胞表面Ｂ２Ｍ発現を欠いていたことを示している（１７Ｈ）。
３．結論
バイシストロン性ｍＲＮＡは、細胞表面ＴＲＣ及びＢ２Ｍに対して陰性であるＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するためにＡＡＶと組み合わせて使用すると有効であった。

Claims (20)

  1. ヒトβ−２ミクログロブリン遺伝子内の配列番号２からなる認識配列と結合及び切断する組換えメガヌクレアーゼであって、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、前記第１のサブユニットは前記認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、前記第２のサブユニットは前記認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含み、前記設計されたメガヌクレアーゼは、配列番号１２と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えメガヌクレアーゼ。
  2. 前記第１のサブユニットが、配列番号１２の残基１９８〜３４４と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが、配列番号１２の残基７〜１５３と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
  3. 前記第１のサブユニットが、配列番号１２の残基１９８〜３４４を含む、請求項１又は２に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
  4. 前記第２のサブユニットが、配列番号１２の残基７〜１５３を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
  5. 配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えメガヌクレアーゼ。
  6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の前記組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  7. 請求項６に記載の前記単離されたポリヌクレオチドを含む、組換えＤＮＡ構築物。
  8. 組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターをコードする、請求項７に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  9. 請求項６に記載の前記単離されたポリヌクレオチドを含む、組換えＡＡＶベクター。
  10. 生体外（エクスビボ）で真核細胞（ヒト配偶子、ヒト接合子、ヒト胚盤胞、及びヒト胚性幹細胞を除く）の染色体に挿入された対象となる外因性配列を含む遺伝子改変真核細胞を作製する方法であって、
    （ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸配列；及び
    （ｂ）前記対象となる配列を含む核酸配列；
    を含む１又は複数の核酸で真核細胞をトランスフェクトすることを含み；
    前記組換えメガヌクレアーゼが配列番号２からなる認識配列で前記染色体中に切断部位を生成し、前記対象となる配列が前記切断部位で前記染色体に挿入される、方法。
  11. 生体外（エクスビボ）で真核細胞（ヒト配偶子、ヒト接合子、ヒト胚盤胞、及びヒト胚性幹細胞を除く）の染色体に挿入された対象となる外因性配列を含む遺伝子改変真核細胞を作製する方法であって、
    （ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の前記組換えメガヌクレアーゼを真核細胞に導入することと；
    （ｂ）前記対象となる配列を含む核酸で前記真核細胞をトランスフェクトすることと；
    を含み；
    前記組換えメガヌクレアーゼが配列番号２からなる認識配列で前記染色体中に切断部位を生成し、前記対象となる配列が前記切断部位で前記染色体に挿入される、方法。
  12. 前記対象となる配列を含む前記核酸が前記切断部位に隣接する配列と相同な配列を更に含み、前記対象となる配列が相同組換えによって前記切断部位で挿入される、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 前記対象となる配列がキメラ抗原受容体をコードする、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 少なくとも前記対象となる配列を含む前記核酸が組換えＡＡＶベクターによって前記真核細胞に導入される、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記真核細胞がヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記真核細胞が、細胞表面に内因性Ｔ細胞受容体を発現しない、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 生体外（エクスビボ）で真核細胞（ヒト配偶子、ヒト接合子、ヒト胚盤胞、及びヒト胚性幹細胞を除く）の染色体中の標的配列を破壊することによって遺伝子改変真核細胞を作製する方法であって、
    請求項１〜５のいずれか１項に記載の前記組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸で前記真核細胞をトランスフェクトすることを含み；
    前記メガヌクレアーゼが配列番号２からなる認識配列で前記染色体中に切断部位を生成し、前記標的配列が前記切断部位で非相同末端結合によって破壊され、前記遺伝子改変真核細胞が、細胞表面にβ−２ミクログロブリンを発現しない、方法。
  18. 生体外（エクスビボ）で真核細胞（ヒト配偶子、ヒト接合子、ヒト胚盤胞、及びヒト胚性幹細胞を除く）の染色体中の標的配列を破壊することによって遺伝子改変真核細胞を作製する方法であって、
    請求項１〜５のいずれか１項に記載の前記組換えメガヌクレアーゼを前記真核細胞に導入することを含み；
    前記メガヌクレアーゼが配列番号２からなる認識配列で前記染色体中に切断部位を生成し、前記標的配列が前記切断部位で非相同末端結合によって破壊され、前記遺伝子改変真核細胞が、細胞表面にβ−２ミクログロブリンを発現しない、方法。
  19. 前記真核細胞がヒトＴ細胞又はそれに由来する細胞である、請求項１７又は１８に記載の方法。
  20. 前記真核細胞が、細胞表面に内因性Ｔ細胞受容体を発現しない、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
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