ES2920525T3 - Células genéticamente modificadas que comprenden un gen de región constante alfa del receptor de linfocitos T humano modificado - Google Patents
Células genéticamente modificadas que comprenden un gen de región constante alfa del receptor de linfocitos T humano modificado Download PDFInfo
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Abstract
Declectado aquí hay una célula genéticamente modificada que comprende en su genoma un gen modificado de la región constante del receptor T de células T humanas, en el que la célula ha reducido la expresión de la superficie celular del receptor endógeno de células T. La presente divulgación se relaciona además con los métodos para producir una célula genéticamente modificada, y con los métodos de usar dicha célula para tratar una enfermedad en un sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Células genéticamente modificadas que comprenden un gen de región constante alfa del receptor de linfocitos T humano modificado
Campo de la invención
La invención se refiere a los campos de la oncología, inmunoterapia contra el cáncer, biología molecular y tecnología de ácido nucleico recombinante. En particular, la invención se refiere a un linfocito T humano modificado genéticamente que comprende en su genoma un gen de la región constante alfa del receptor de linfocitos T humano modificado, en el que la célula tiene una expresión reducida de la superficie celular del receptor de linfocitos T endógeno. La invención se refiere además a procedimientos de producción de dicho linfocito T humano modificado genéticamente, y a una célula tal para uso en el tratamiento de una enfermedad, incluyendo el cáncer, en un sujeto.
Antecedentes de la invención
[La inmunoterapia adoptiva con células T es un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer. Esta estrategia utiliza células T humanas aisladas que han sido modificadas genéticamente para mejorar su especificidad por un antígeno específico asociado al tumor. La modificación genética puede implicar la expresión de un receptor de antígeno quimérico o un receptor de linfocitos T exógeno para injertar la especificidad del antígeno en la linfocito T. A diferencia de los receptores exógenos de linfocitos T, los receptores de antígenos quiméricos derivan su especificidad de los dominios variables de un anticuerpo monoclonal. Por lo tanto, los linfocitos T que expresan receptores de antígeno quimérico (linfocitos T con CAR) inducen inmunorreactividad tumoral en un complejo principal de histocompatibilidad de manera no restringida. Hasta la fecha, la inmunoterapia adoptiva de linfocitos T se ha utilizado como terapia clínica para varios tipos de cánceres, incluyendo neoplasias de linfocitos B (por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (ALL), linfoma no Hodgkin (LNH) de linfocitos B y leucemia linfocítica crónica), mieloma múltiple, neuroblastoma, glioblastoma, gliomas avanzados, cáncer de ovario, mesotelioma, melanoma y cáncer de páncreas.
A pesar de su posible utilidad como tratamiento contra el cáncer, la inmunoterapia adoptiva con linfocitos T con CAR se ha limitado, en parte, por la expresión del receptor endógeno de linfocitos T en la superficie celular. Los linfocitos T con CAR que expresan un receptor endógeno de linfocitos T pueden reconocer antígenos de histocompatibilidad mayor y menor después de la administración a un paciente alogénico, lo que puede llevar al desarrollo de la enfermedad de injerto contra huésped (EICH). Como resultado, los ensayos clínicos se han centrado en gran medida en el uso de linfocitos T con CAR autólogos, en los que los linfocitos T de un paciente se aíslan, se modifican genéticamente para incorporar un receptor de antígeno quimérico, y luego se reinfunden en el mismo paciente. Una estrategia autóloga proporciona tolerancia inmunitaria a los linfocitos T con CAR administrados; sin embargo, este enfoque está limitado tanto por el tiempo como por los esfuerzos necesarios para producir linfocitos T con CAR específicos del paciente después de que se diagnostica el cáncer de un paciente.
Por lo tanto, sería ventajoso desarrollar linfocitos T con CAR "listos para usar", preparados usando linfocitos T de un donante externo, que han reducido la expresión del receptor endógeno de linfocitos T y no inician EICH tras la administración. Dichos productos se podrían generar y validar antes del diagnóstico, y podrían ponerse a disposición de los pacientes tan pronto como sea necesario. Por lo tanto, existe una necesidad para el desarrollo de linfocitos T con c A r alogénicos que carecen de un receptor endógeno de linfocitos T para prevenir la aparición de EICH.
La modificación genética del ADN genómico se puede realizar utilizando endonucleasas específicas de sitio, con sitio de reconocimiento poco frecuente, que están diseñadas para reconocer secuencias de a Dn en el locus de interés. Los procedimientos de producción de endonucleasas específicas del sitio diseñadas genéticamente son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) pueden ser diseñadas para reconocer y cortar sitios predeterminados en un genoma. Las ZFN son proteínas quiméricas que comprenden un dominio de unión al ADN de dedo de zinc fusionado con el dominio nucleasa de la enzima de restricción FokI. El dominio del dedo de zinc se puede rediseñar a través de medios racionales o experimentales para producir una proteína que se une a una secuencia de ADN predeterminada de ~18 pares de bases de longitud. Al fusionar este dominio de proteínas diseñadas con la nucleasa FokI, es posible dirigir las rupturas de ADN con especificidad a nivel de genoma. Los ZFN se han utilizado ampliamente para dirigir la adición, eliminación y sustitución de genes en una amplia gama de organismos eucariotas (revisado en Durai et al. (2005), Nucleic Acids Res 33, 5978). Igualmente, las nucleasas efectoras de TAL (TALEN) se pueden generar para escindir sitios específicos en el ADN genómico. Al igual que un ZFN, un TALEN está compuesto por un dominio de unión al ADN específico del sitio, diseñado, fusionado con el dominio de la nucleasa FokI (revisado en Mak et al. (2013), Curr Opin Struct Biol. 23:93-9). En este caso, sin embargo, el dominio de unión al ADN comprende un conjunto en tándem de dominios efectores TAL, cada uno de los cuales reconoce específicamente un único par de bases de ADN. Una limitación que tienen los ZFN y los TALEN para la práctica de la presente invención es que son heterodiméricos, de modo que la producción de una única nucleasa funcional en una célula requiere la coexpresión de dos monómeros de proteínas.
Las TALEN compactas tienen una arquitectura de endonucleasa alternativa que evita la necesidad de dimerización (Beurdeley y col. (2013), Nat Commun. 4:1762). Una TALEN compacta comprende un dominio de unión al ADN del efector TAL específico del lugar, diseñado, fusionado con el dominio de la nucleasa de la endonucleasa de localización
I-TevI. A diferencia de Fokl, I-TevI no necesita dimerizarse para producir una rotura de doble cadena de ADN, por lo que una TALEN compacta es funcional como monómero.
Las endonucleasas diseñadas genéticamente basadas en el sistema CRISPR/Cas9 también se conocen en la técnica (Ran y col. (2013), Nat Protoc. 8:2281-2308; Mali y col. (2013), Nat Methods 10:957-63). Una endonucleasa CRISPR comprende dos componentes: (1) una nucleasa efectora de caspasas, típicamente la Cas9 microbiana; y (2) un "ARN guía" corto que comprende una secuencia de orientación de 20 nucleótidos que dirige la nucleasa a un lugar de interés en el genoma. Al expresar múltiples ARN guía en la misma célula, teniendo, cada una, una secuencia de direccionamiento diferente, es posible dirigir las roturas de ADN de manera simultáneamente a múltiples sitios en el genoma. Por lo tanto, las nucleasas CRISPR/Cas9 son adecuadas para la presente invención. El principal inconveniente del sistema CRISPR/Cas9 es su alta frecuencia de roturas de ADN fuera del objetivo, que podría limitar la utilidad del sistema para el tratamiento de pacientes humanos (Fu et al. (2013), Nat Biotechnol. 31:822-6).
Las endonucleasas autoguiadas son un grupo de nucleasas naturales que reconocen sitios de escisión de 15-40 pares de bases que se encuentran comúnmente en los genomas de plantas y hongos. Con frecuencia se asocian con elementos de ADN parásitos, tal como los intrones e inteínas de auto-empalme del grupo 1. Promueven de forma natural la recombinación homóloga o la inserción de genes en lugares específicos del genoma del anfitrión al producir una rotura de doble cadena en el cromosoma, que recluta la maquinaria celular de reparación del ADN (Stoddard (2006), Q. Rev. Biophys. 38:. 49-95). Las endonucleasas autoguiadas se agrupan comúnmente en cuatro familias: la familia LAGLIDAd G (Se Q ID NO: 7), la familia GIY-YIG, la familia His-Cys box y la familia HNH. Estas familias se caracterizan por motivos estructurales, que afectan a la actividad catalítica y a la secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, los miembros de la familia LAGLIDADG (SEQ ID NO: 7) se caracterizan por tener una o dos copias del motivo conservado LAGLIDADG (SEQ ID NO: 7) (véase Chevalier y col. (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774). Las endonucleasas autoguiadas LAGLIDAd G (SEQ ID NO: 7) con una única copia del motivo LAg L idA d G (SEQ iD NO: 7) forman homodímeros, mientras que los miembros con dos copias del motivo LAGLIDADG (SEQ ID NO: 7) se encuentran como monómeros.
I-Crel (SEQ ID NÚM.: 6) es miembro de la familia LAGLIDADG (SEQ ID NO: 7) de endonucleasas autoguiadas que reconoce y corta una secuencia de reconocimiento de 22 pares de bases en el cromosoma de cloroplasto de las algas Chlamydomonas reinhardtii. Se han utilizado técnicas de selección genética para modificar la preferencia del sitio de escisión I-Crel de tipo silvestre (Sussman y col. (2004), J. Mol. Biol. 342: 31-41 Chames et al. (2005), Nucleic Acids Res. 33: e178 Seligman et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30: 3870-9, Arnould et al. (2006), J. Mol. Biol. 355: 443-58). Más recientemente, se describió un procedimiento de diseño racional de endonucleasas de referencia mono-LAGLIDADG (SEQ ID NO: 7) que es capaz de rediseñar completamente I-Crel y otras endonucleasas de referencia para dirigir sitios de ADN ampliamente divergentes, incluyendo sitios en genomas de mamíferos, levadura, planta, bacterias y virus (documento WO 2007/047859).
Tal como se describió por primera vez en el documento WO 2009/059195, I-Crel y sus derivados diseñados genéticamente son normalmente diméricos, pero se pueden fusionar en un solo polipéptido utilizando un enlazador peptídico corto que une el extremo C-terminal de una primera subunidad al extremo N-terminal de una segunda subunidad (Li y col. (2009), Nucleic Acids Res. 37:1650-62; Grizot y col. (2009), Nucleic Acids Res. 37:5405-19). Así, una meganucleasa funcional de "cadena única" puede expresarse a partir de un único transcrito.
El uso de meganucleasas diseñadas genéticamente para escindir dianas de ADN en la región constante alfa del receptor de linfocitos T humanos se describió previamente en la Publicación Internacional WO 2014/191527. La publicación '527 desvela variantes de la meganucleasa I-Onul que están diseñadas para dirigirse a una secuencia de reconocimiento (SEQ ID NO: 3 de la publicación' 527) dentro del exón 1 del gen de la región constante TCR alfa. Aunque la publicación '527 discute que un receptor de antígeno quimérico se puede expresar en células TCR inactivadas, los autores no desvelan la inserción de la secuencia codificante del receptor de antígeno quimérico en el sitio de escisión de meganucleasa en el gen de la región constante de TCR alfa.
También se ha desvelado el uso de otras nucleasas y mecanismos para alterar la expresión del TCR endógeno. Por ejemplo, el uso de las nucleasas de dedos de zinc para alterar los genes TCR en los linfocitos T humanos se describió en la Patente de los Estados Unidos Núm. 8.95.828 y en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. US2014/034902. La publicación de EE.UU. N.° US2014/0301990 describe el uso de nucleasas de dedo de zinc y activadores de la transcripción como nucleasas efectoras (TALEN), y un sistema CRISPR/Cas con un ARN guía único diseñado para atacar genes TCR en un linfocito T aislado. La Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° US2012/0321667 desvela el uso de ARN de horquilla pequeña que se dirigen a ácidos nucleicos que codifican TCR específicos y/o cadenas de CD3 en linfocitos T.
Los documentos WO 2014/191527 A1, Poirot y col. (Cancer Research 2015, 75 (18):3853-3864), WO 2013/176915 A1, WO 2014/191128 A1 y WO 2014/153470 A2 desvelan la inactivación del gen alfa TCR en linfocitos T humanos combinado con la introducción de un receptor de antígeno quimérico.
Sin embargo, la presente invención mejora las enseñanzas de la técnica anterior. Los presentes inventores son los primeros en enseñar células genéticamente modificadas que comprenden un receptor de antígeno quimérico insertado en el gen de la región constante alfa TCR humana, que al mismo tiempo altera la expresión del receptor endógeno de
linfocitos T en la superficie celular. Además, la técnica anterior no enseña las meganucleasas o las secuencias de reconocimiento descritas en el presente documento, ni su uso para producir tales células genéticamente modificadas.
Sumario de la invención
La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención proporciona un linfocito T humano genéticamente modificado que comprende en su genoma un gen de región constante alfa del receptor de linfocitos T modificado (TCR). Además, dicha célula no tiene expresión en la superficie celular del TCR endógeno en comparación con una célula de control no modificada. La presente invención también proporciona un procedimiento para producir la célula genéticamente modificada. La presente invención proporciona además la célula modificada genéticamente para uso en un procedimiento de inmunoterapia para tratar el cáncer.
Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona un linfocito T humano genéticamente modificado que comprende en su genoma un gen de región constante alfa de TCR humano modificado, en el que el gen de la región constante alfa del TCR humano modificado comprende de 5 'a 3': (a) una región 5 'del gen de la región constante alfa del TCR humano; (b) un polinucleótido exógeno; y (c) una región 3' del gen de la región constante alfa del TCR humano. Además, la célula genéticamente modificada no tiene expresión en la superficie celular del TCR endógeno en comparación con una célula de control no modificada.
El polinucleótido exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor antigénico quimérico, en el que el receptor antigénico quimérico comprende un dominio de unión al ligando extracelular, un dominio transmembrana, un dominio coestimulador intracelular y un dominio de señalización citoplasmática intracelular que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NÚM.:113.
En una de tales realizaciones, el receptor de antígeno quimérico comprende un dominio de unión a ligando extracelular que tiene al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o hasta 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NÚM.: 112, en la que el dominio de unión a ligando extracelular se une a CD19.
En otra de tales realizaciones, el receptor de antígeno quimérico comprende un dominio de señalización coestimuladora intracelular que comprende una secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID NÚM.: 114.
En otra de tales realizaciones, el receptor de antígeno quimérico comprende además un péptido señal. En algunas realizaciones, el péptido señal comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NÚM.:115.
En otra de tales realizaciones, el receptor de antígeno quimérico comprende además un dominio de bisagra. En algunas realizaciones, el dominio de bisagra comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NÚM.:116.
En algunas realizaciones, el dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NÚM.:117.
En una de tales realizaciones, el receptor de antígeno quimérico tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o hasta el 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NÚM.:111.
En otra realización, el polinucleótido exógeno comprende una secuencia de promotor que dirige la expresión del polinucleótido exógeno. En una de dichas realizaciones, la secuencia de promotor comprende una secuencia de aminoácidos como la establecida en la SEQ ID NÚM.:118.
El polinucleótido exógeno se inserta en el gen TCR entre las posiciones 13 y 14 de la SEQ ID NÚM.:3. En una de tales realizaciones, el gen de la región constante alfa del TCR humano modificado comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o hasta el 100 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:120.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una célula modificada genéticamente, tal como se describe en la presente memoria, y un vehículo aceptable para uso farmacéutico.
En otro aspecto, la invención proporciona una célula modificada genéticamente, tal como se describe en la presente memoria, para su uso como un medicamento. En uno de esos aspectos, el medicamento es útil en el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, el tratamiento del cáncer es la inmunoterapia.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de producción de un linfocito T humano modificado genéticamente que comprende un gen de la región constante alfa TCR humano modificado, comprendiendo el procedimiento: (a) introducir en un linfocito T humano una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una meganucleasa recombinante; en el que la meganucleasa recombinante produce un sitio de escisión en la secuencia de reconocimiento de SEQ ID NÚM.:3 dentro del gen de la región constante del TCR alfa humano; y (b) introducir en la célula una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico, en el que dicho receptor de antígeno quimérico comprende un dominio de unión al ligando extracelular, un dominio transmembrana,
un dominio coestimulador intracelular y un dominio de señalización citoplasmática intracelular que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NÚM.:113. La secuencia del polinucleótido exógeno se inserta en el gen de la región constante alfa del TCR humano en el sitio de escisión. Además, la célula genéticamente modificada no tiene expresión en la superficie celular del TCR endógeno en comparación con una célula de control no modificada.
En diversas realizaciones del procedimiento, la primera secuencia de ácido nucleico o la proteína meganucleasa recombinante se pueden introducir en la célula antes de introducir el segundo ácido nucleico, o después de introducir el segundo ácido nucleico.
En una realización del procedimiento, la segunda secuencia de ácido nucleico comprende de 5 'a 3': (a) un brazo de homología 5' que es homólogo a la secuencia 5' aguas arriba que flanquea el sitio de escisión; (b) el polinucleótido exógeno; y (c) un brazo de homología 3' que es homólogo a la secuencia 3' aguas abajo que flanquea el sitio de escisión. En tal realización, la secuencia del polinucleótido exógeno se inserta en el gen de la región constante alfa del TCR humano en el sitio de escisión por recombinación homóloga.
En otra realización del procedimiento, el segundo ácido nucleico carece de homología sustancial con el sitio de escisión, y la secuencia del polinucleótido exógeno se inserta en el gen de la región constante alfa del TCR humano mediante unión de extremo no homóloga.
En otra realización del procedimiento, el polinucleótido exógeno comprende una primera secuencia del promotor que dirige la expresión del polinucleótido exógeno.
En otra realización del procedimiento, el primer ácido nucleico que codifica la meganucleasa recombinante se introduce en la célula usando un ARNm. En algunas realizaciones, el ARNm puede ser un ARNm policistrónico que comprende una secuencia codificante para al menos una nucleasa diseñada genéticamente descrita en la presente memoria y una secuencia codificante para al menos una proteína adicional (por ejemplo, una segunda nucleasa). En realizaciones particulares, un ARNm policistrónico puede codificar dos o más nucleasas diseñadas descritas en la presente memoria que se dirigen a diferentes secuencias de reconocimiento dentro del mismo gen (por ejemplo, el gen de la región constante del receptor de linfocitos T alfa). En otras realizaciones, un ARNm policistrónico puede codificar una meganucleasa recombinante descrita en la presente memoria y una segunda nucleasa que reconoce y escinde una secuencia de reconocimiento diferente dentro del mismo gen (por ejemplo, el gen de región constante alfa del receptor de linfocitos T) o, como alternativa, reconoce y escinde una secuencia de reconocimiento diferente dentro de otro gen de interés en el genoma. En dichas realizaciones, las células genéticamente modificadas producidas usando dicho ARNm policistrónico pueden tener múltiples genes inactivados simultáneamente. En realizaciones adicionales, un ARNm policistrónico puede codificar al menos una meganucleasa recombinante descrita en el presente documento y una proteína adicional que es beneficiosa para la célula, mejora la eficacia de inserción de una secuencia exógena de interés en un sitio de escisión, y/o es beneficiosa en el tratamiento de una enfermedad.
En otra realización del procedimiento, al menos la segunda secuencia de ácido nucleico se introduce en la célula poniendo en contacto la célula con un vector vírico que comprende la segunda secuencia de ácido nucleico. En algunas realizaciones, tanto la primera secuencia de ácido nucleico como la segunda secuencia de ácido nucleico se introducen poniendo en contacto la célula con un único vector vírico que comprende tanto la primera secuencia de ácido nucleico como la segunda secuencia de ácido nucleico. Como alternativa, la célula se puede poner en contacto con un primer vector vírico que comprende la primera secuencia de ácido nucleico y un segundo vector vírico que comprende la segunda secuencia de ácido nucleico.
En dicha realización del procedimiento, en la que la segunda secuencia de ácido nucleico se introduce mediante un vector vírico, el segundo ácido nucleico puede comprender además una segunda secuencia promotora colocada en 5' corriente arriba del brazo de homología 5' o, como alternativa, colocada en 3' corriente abajo del brazo de homología 3'. En realizaciones en las que el segundo promotor se coloca en 3' aguas abajo del brazo de homología 3', el promotor se puede invertir.
En otra realización particular del procedimiento, al menos la segunda secuencia de ácido nucleico se introduce en la célula poniendo en contacto la célula con un vector de virus recombinante adenoasociado (AAV) que comprende la segunda secuencia de ácido nucleico. En algunas realizaciones, tanto la primera secuencia de ácido nucleico como la segunda secuencia de ácido nucleico se introducen poniendo en contacto la célula con un único AAV recombinante que comprende tanto la primera secuencia de ácido nucleico como la segunda secuencia de ácido nucleico. Como alternativa, la célula se puede poner en contacto con un primer AAV recombinante que comprende la primera secuencia de ácido nucleico y un segundo AAV recombinante que comprende la segunda secuencia de ácido nucleico.
En dicha realización del procedimiento, en la que la segunda secuencia de ácido nucleico es introducida por un vector de AAV recombinante, el segundo ácido nucleico puede comprender además una segunda secuencia promotora colocada en 5' corriente arriba del brazo de homología 5' o, como alternativa, colocada en 3' corriente abajo del brazo de homología 3'. En realizaciones en las que el segundo promotor se coloca en 3' aguas abajo del brazo de homología 3', el promotor se puede invertir.
En otra dicha realización del procedimiento, el vector de AAV recombinante es un vector de AAV autocomplementario.
En otra dicha realización del procedimiento, el vector de AAV recombinante puede tener cualquier serotipo. En una realización particular del procedimiento, el vector de AAV recombinante tiene un serotipo de AAV2. En otra realización particular del procedimiento, el vector de AAV recombinante tiene un serotipo de AAV6.
En otra realización del procedimiento, al menos la segunda secuencia de ácido nucleico se introduce en la célula usando un molde de ADN monocatenario.
En una realización particular del procedimiento, la primera secuencia de ácido nucleico que codifica una meganucleasa recombinante descrita en la presente memoria se introduce en la célula mediante un ARNm, y la segunda secuencia de ácido nucleico que comprende un polinucleótido exógeno se introduce en la célula usando un vector vírico, preferentemente un vector de AAV recombinante, en la que la célula es un linfocito T humano, y en la que la secuencia de interés codifica un receptor de antígeno quimérico. En tal realización, el procedimiento produce un linfocito T genéticamente modificado que comprende un receptor de antígeno quimérico y no tiene expresión en la superficie celular del receptor endógeno de linfocitos T en comparación con una célula de control.
La meganucleasa recombinante reconoce y escinde una secuencia de reconocimiento que consiste en la SEQ ID NÚM.:3. Tal meganucleasa recombinante comprende una primera subunidad y una segunda subunidad, en la que la primera subunidad se une a un primer semisitio de reconocimiento de la secuencia de reconocimiento y comprende una primera región hipervariable (HVR1), y en la que la segunda subunidad se une a un segundo semisitio de reconocimiento de la secuencia de reconocimiento y comprende una segunda región hipervariable (HVR2) región.
En otra dicha realización del procedimiento, la primera subunidad de meganucleasa comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, o al menos 95% de identidad de secuencia con residuos 198-344 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.:8-18 o los residuos 7-153 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 19-27, y/o la segunda subunidad puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o más, de identidad de secuencia con los residuos 198-344 de una cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 19-27.
En otra dicha realización del procedimiento, la región HVR1 comprende Y en una posición correspondiente a: (a) posición 215 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.:8-18; o (b) posición 24 de cualquiera de las SEQ ID N ú M . : 19-27. En otra de tales realizaciones, la región HVR1 comprende G en una posición correspondiente a: (a) posición 233 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.:8-18; o (b) posición 42 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 19-27. En otra de tales realizaciones, la región HVR1 comprende uno o más de Y y G en las posiciones correspondientes a (a) las posiciones 215 y 233, respectivamente, de cualquiera de las SEQ ID NO:8-18; o (b) las posiciones 24 y 42, respectivamente, de cualquiera de las SEQ ID NO: 19-27.
En otra dicha realización del procedimiento, la región HVR2 comprende T en una posición correspondiente a: (a) posición 26 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.:8-18; o (b) posición 217 de cualquiera de las SEQ ID N ú M . : 19-27. En otra de tales realizaciones, la región HVR2 comprende F o Y en una posición correspondiente a: (a) posición 28 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.:8-18; o (b) posición 219 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 19-27. En otra de tales realizaciones, la región HVR2 comprende F en una posición correspondiente a: (a) posición 38 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.:8-18; o (b) posición 229 de cualquiera de las SEQ i D NÚM.: 19-27. En otra de tales realizaciones, la región HVR2 comprende S en una posición correspondiente a: (a) posición 44 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.:8-18; o (b) posición 235 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 19-27. En otra de tales realizaciones, la región HVR2 comprende F o Y en una posición correspondiente a:
(a) posición 46 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.:8-18; o (b) posición 237 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 19-27. En otra de tales realizaciones, la región HVR2 comprende uno o más de T, F o Y, F, S, y F o Y, y R en las posiciones correspondientes a: (a) posiciones 26, 28, 38, 44 y 46, respectivamente, de cualquiera de las SEQ ID NÚM.:8-18; o (b) posiciones 217, 219, 229, 235 y 237, respectivamente, de cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 19-27.
En otra dicha realización del procedimiento, la región HVR1 comprende los residuos 215-270 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 8-18 o los residuos 24-79 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 19-27. En otra de tales realizaciones, la región HVR2 comprende los residuos 24-79 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 8-18 o los residuos 215-270 de cualquiera de las S e Q ID NÚM.: 19-27.
En otra dicha realización del procedimiento, la primera subunidad de meganucleasa comprende los residuos 198-344 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.:8-18 o los residuos 7-153 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 19-27. En otra de tales realizaciones, la segunda subunidad de meganucleasa comprende los residuos 7-153 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.:8-18 o los residuos 198-344 de cualquiera de las SEQ iD NÚM.: 19-27.
En otra dicha realización del procedimiento, la meganucleasa recombinante es una meganucleasa de cadena sencilla que comprende un enlazador, en la que el enlazador se une covalentemente a la primera subunidad y a la segunda subunidad.
En otra dicha realización del procedimiento, la meganucleasa recombinante comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NÚM.:8-27.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en un procedimiento de inmunoterapia para tratar el cáncer en un sujeto necesitado de dicho tratamiento, en el que dicha composición farmacéutica comprende una célula modificada genéticamente, tal como se describe en la presente memoria, y un vehículo aceptable para uso farmacéutico. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una célula modificada genéticamente producida de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otra realización del procedimiento, el cáncer que se va a tratar se selecciona del grupo que consiste en un cáncer de origen de linfocitos B, cáncer de mama, cáncer gástrico, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer de pulmón, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de colon, carcinoma de células renales, cáncer de ovario, sarcoma de rabdomio, leucemia y linfoma de Hodgkin.
En otra realización del procedimiento, el cáncer de origen de linfocitos B se selecciona del grupo que consiste en leucemia linfoblástica aguda de linaje B, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B y linfoma no Hodgkin de linfocitos B.
El CAR comprende un dominio de unión a antígeno extracelular. En algunas realizaciones, el dominio o resto de unión a ligando extracelular puede estar en forma de un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) que proviene de un anticuerpo monoclonal, que proporciona especificidad para un epítopo o antígeno particular (por ejemplo, un epítopo o antígeno presente preferentemente en la superficie de una célula, tal como una célula cancerosa u otra célula o partícula que causa enfermedades). El scFv se puede conectar a través de una secuencia de enlazador. El dominio de unión al ligando extracelular puede ser específico para cualquier antígeno o epítopo de interés. En algunas realizaciones, el scFv puede ser humanizado. El dominio extracelular de un receptor de antígeno quimérico también puede comprender un autoantígeno (véase, Payne y col. (2016), Science 353(6295): 179-184), que puede ser reconocido por los receptores de linfocitos B específicos de autoantígeno en linfocitos B, dirigiendo así a los linfocitos T al direccionamiento y la destrucción específica de los linfocitos B autorreactivos en enfermedades autoinmunes mediadas por anticuerpos. Dichos CAR se pueden denominar receptores de autoanticuerpos quiméricos (CAAR), y su uso está comprendido en la invención.
Los aspectos anteriores y otros aspectos y realizaciones de la presente invención se pueden comprender más completamente haciendo referencia a la siguiente descripción detallada y reivindicaciones. Determinadas características de la invención, que, en aras de la claridad, se han descrito en el contexto de realizaciones separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una única realización. Todas las combinaciones de las realizaciones están específicamente abarcadas por la presente invención y se desvelan en el presente documento como si todas y cada una de las combinaciones se desvelasen de manera individual y explícita. En cambio, diversas características de la invención que, por brevedad, se han descrito en el contexto de una única realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Todas las subcombinaciones de características enumeradas en las realizaciones también están específicamente abarcadas por la presente invención y se divulgan en el presente documento como si todas y cada una de las subcombinaciones se revelaran de manera individual y explícita en el presente documento. Las realizaciones de cada aspecto de la presente invención desveladas en el presente documento se aplican entre sí a cada aspecto de la invención mutatis mutandis.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Secuencias de reconocimiento de TRC en el gen de la región constante alfa de TRC humano. A) Cada secuencia de reconocimiento dirigida por una meganucleasa recombinante de la invención comprende dos semisitios de reconocimiento. Cada semisitio de reconocimiento comprende 9 pares de bases, separadas por una secuencia central de 4 pares de bases. La secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO:3) abarca los nucleótidos 187-208 de la región constante alfa de linfocitos T humanos (SEQ ID NO:1), y comprende dos semisitios de reconocimiento denominados TRC1 y TRC2. La secuencia de reconocimiento TRC 3-4 (SEQ ID NO:4) abarca los nucleótidos 93-114 de la región constante alfa de linfocitos T humanos (SEQ ID NO:1), y comprende dos semisitios de reconocimiento denominados TRC3 y TRC4. La secuencia de reconocimiento TRC 7-8 (SEQ ID NO:5) abarca los nucleótidos 118-139 de la región constante alfa de linfocitos T humanos (SEQ ID NO:1), y comprende dos semisitios de reconocimiento denominados TRC7 y TRC8. B) Las meganucleasas recombinantes de la invención comprenden dos subunidades, en las que la primera subunidad que comprende la región HVR1 se une a un primer semisitio de reconocimiento (por ejemplo, TRC1, TRC3 o TRC7) y la segunda subunidad que comprende la región HVR2 se une a un segundo semisitio de reconocimiento (por ejemplo, TRC2, TRC4 o TRC8). En realizaciones en las que la meganucleasa recombinante es una meganucleasa de cadena sencilla, la primera subunidad que comprende la región HVR1 se puede posicionar como subunidad N-terminal o C-terminal. Asimismo, la segunda subunidad que comprende la región HVR2 puede situarse ya sea como subunidad N-terminal o C-terminal.
Figura 2A-B. Alineación de aminoácidos de subunidades de unión a TRC1. A-B) Algunas meganucleasas recombinantes abarcadas por la invención comprenden una subunidad que se une al semisitio de
reconocimiento TRC1 de 9 pares de bases de la SEQ ID NO:3. Se proporcionan alineamientos de secuencia de aminoácidos para las subunidades de unión a TRC1 (SEQ ID NO: 33-52) de las meganucleasas recombinantes establecidas en las SEQ ID NO:8-27. Tal como se muestra, la subunidad de unión a TRC1 de las SEQ ID NÚM.: 8-18 comprende los residuos 198-344, mientras que la subunidad de unión a TRC1 de la SEQ ID NÚM.: 19-27 comprende los residuos 7-153. Cada subunidad de unión a TRC1 comprende una región hipervariable de 56 aminoácidos tal como se indica. Los restos variables dentro de la región hipervariable están sombreados, con los aminoácidos más frecuentes en cada posición más resaltados; los restos más frecuentes están en negrita, mientras que los segundos más frecuentes están en negrita y cursiva. Los restos fuera de la región hipervariable son idénticos en cada subunidad, con la excepción de un resto Q o E en la posición 80 o la posición 271 (véase, la Patente de los EE.UU. N.° 8.021.867). Todas las subunidades de unión a TRC1 proporcionadas en la Figura 2 comparten al menos el 90% de identidad de secuencia con la subunidad de unión a TRC1 (restos 198-344) de la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE (SEQ ID NO:33). Los números de restos que se muestran son los de las SEQ ID NO:8-27.
Figura 3A-B. Alineación de aminoácidos de subunidades de unión a TRC2. A-B) Algunas meganucleasas recombinantes abarcadas por la invención comprenden una subunidad que se une al semisitio de reconocimiento TRC2 de 9 pares de bases de la SEQ ID NO:3. Se proporcionan alineaciones de secuencias de aminoácidos para las subunidades de unión a TRC2 (SEQ ID NO: 58-77) de las meganucleasas recombinantes establecidas en las SEQ ID NO:8-27. Tal como se muestra, la subunidad de unión a TRC2 de las SEQ ID NÚM.: 8-18 comprende los residuos 7-153, mientras que la subunidad de unión a TRC2 de las SEQ ID NÚM.: 19-27 comprende los residuos 198-344. Cada subunidad de unión a TRC2 comprende una región hipervariable de 56 aminoácidos tal como se indica. Los restos variables dentro de la región hipervariable están sombreados, con los aminoácidos más frecuentes en cada posición más resaltados; los restos más frecuentes están en negrita, mientras que los segundos más frecuentes están en negrita y cursiva. Los restos fuera de la región hipervariable son idénticos en cada subunidad, con las excepciones de un resto Q o E en la posición 80 o la posición 271 (véase, la Patente de EE.UU. N.° 8.021.867), y un resto R en la posición 330 de las meganucleasas TRC 1-2x.87 EE, TRC 1-2x.87 QE, TRC 1-2x.87 EQ, TRC 1-2x.87 y TRC 1-2x.163 (sombreado en gris y subrayado). Todas las subunidades de unión a TRC2 proporcionadas en la Figura 3 comparten al menos un 90 % de identidad de secuencia con la subunidad de unión a TRC2 (restos 7-153) de la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE (SEQ ID NO:58). Los números de restos que se muestran son los de las SEQ ID NO:8-27.
Figura 4. Alineación de aminoácidos de las subunidades de unión a TRC3. Algunas meganucleasas recombinantes abarcadas por la invención comprenden una subunidad que se une al semisitio de reconocimiento de TRC3 de 9 pares de bases de la SEQ ID NO:4. Se proporcionan alineaciones de secuencias de aminoácidos para las subunidades de unión a TRC3 (SEQ ID NO:53 y 54) de las meganucleasas recombinantes establecidas en las SEQ ID NO: 28 y 29. Tal como muestra, la subunidad de unión a TRC3 de las SEQ ID NO: 28 y 29 comprende los restos 7-153. Cada subunidad de unión a TRC3 comprende una región hipervariable de 56 aminoácidos tal como se indica. Los restos variables dentro de la región hipervariable están sombreados. Los restos fuera de la región hipervariable son idénticos en cada subunidad, con las excepciones de un resto Q o E en la posición 80 (véase, la Patente de los EE.UU. N.° 8.021.867) . Las subunidades de unión a TRC3 de las meganucleasas TRC 3-4x.3 y TRC 3-4x.19 comparten una identidad de secuencia del 97 %. Los números de restos que se muestran son los de las SEQ ID NO: 28 y 29.
Figura 5. Alineación de aminoácidos de las subunidades de unión a TRC4. Algunas meganucleasas recombinantes abarcadas por la invención comprenden una subunidad que se une al semisitio de reconocimiento de TRC4 de 9 pares de bases de la SEQ ID NO:4. Se proporcionan alineaciones de secuencias de aminoácidos para las subunidades de unión a TRC4 (SEQ ID NO:78 y 79) de las meganucleasas recombinantes establecidas en las SEQ ID NO:28 y 29. Tal como muestra, la subunidad de unión a TRC4 de las SEQ ID NO: 28 y 29 comprende los restos 198-344. Cada subunidad de unión a TRC4 comprende una región hipervariable de 56 aminoácidos tal como se indica. Los restos variables dentro de la región hipervariable están sombreados. Los restos fuera de la región hipervariable son idénticos en cada subunidad, con las excepciones de un resto Q o E en la posición 80 (véase, la Patente de los EE.UU. N.° 8.021.867) . Las subunidades de unión a TRC4 de las meganucleasas TRC 3-4x.3 y TRC 3-4x.19 comparten una identidad de secuencia del 97 %. Los números de restos que se muestran son los de las SEQ ID NO: 28 y 29.
Figura 6A-B. Alineación de aminoácidos de subunidades de unión a TRC7. A-B) Algunas meganucleasas recombinantes abarcadas por la invención comprenden una subunidad que se une al semisitio de reconocimiento TRC7 de 9 pares de bases de la SEQ ID NO:5. Se proporcionan alineaciones de secuencias de aminoácidos para las subunidades de unión a TRC7 (SEQ ID NO: 55-57) de las meganucleasas recombinantes establecidas en las SEQ ID NO:30-32. Tal como muestra, la subunidad de unión a TRC7 de la SEQ ID NO: 30 comprende los restos 7-153, mientras que la subunidad de unión a TRC7 de las SEQ ID NO:31 y 32 comprende los restos 198-344. Cada subunidad de unión a TRC7 comprende una región hipervariable de 56 aminoácidos tal como se indica. Los restos variables dentro de la región hipervariable
están sombreados, con los aminoácidos más frecuentes en cada posición más resaltados; los restos más frecuentes están en negrita, mientras que los segundos más frecuentes están en negrita y cursiva. Los restos fuera de la región hipervariable son idénticos en cada subunidad, con la excepción de un resto Q o E en la posición 80 o la posición 271 (véase, la Patente de los EE.UU. N.° 8.021.867). Todas las subunidades de unión a TRC7 proporcionadas en la Figura 6 comparten al menos un 90 % de identidad de secuencia con la subunidad de unión a TRC7 (restos 7-153) de la meganucleasa TRC 7-8x.7 (SEQ ID NO:55). Los números de restos que se muestran son los de las SEQ ID NO:30-32.
Figura 7A-B. Alineación de aminoácidos de las subunidades de unión a TRC8. A-B) Algunas meganucleasas recombinantes abarcadas por la invención comprenden una subunidad que se une al semisitio de reconocimiento TRC8 de 9 pares de bases de la SEQ ID NO:5. Se proporcionan alineaciones de secuencias de aminoácidos para las subunidades de unión a TRC8 (SEQ ID NO: 80-82) de las meganucleasas recombinantes establecidas en las SEQ ID NO:30-32. Tal como muestra, la subunidad de unión a TRC8 de la SEQ ID NO:30 comprende los restos 198-344, mientras que la subunidad de unión a TRC8 de las SEQ ID NO:31 y 32 comprende los restos 7-153. Cada subunidad de unión a TRC8 comprende una región hipervariable de 56 aminoácidos tal como se indica. Los restos variables dentro de la región hipervariable están sombreados, con los aminoácidos más frecuentes en cada posición más resaltados; los restos más frecuentes están en negrita, mientras que los segundos más frecuentes están en negrita y cursiva. Los restos fuera de la región hipervariable son idénticos en cada subunidad, con la excepción de un resto Q o E en la posición 80 o la posición 271 (véase, la Patente de los EE.UU. N.° 8.021.867). Todas las subunidades de unión a TRC8 proporcionadas en la Figura 7 comparten al menos un 90% de identidad de secuencia con la subunidad de unión a TRC8 (restos 198-344) de la meganucleasa TRC 7-8x.7 (SEQ ID NO:80). Los números de restos que se muestran son los de las SEQ ID NO:30-32.
Figura 8. Esquema del ensayo indicador en células CHO para evaluar meganucleasas recombinantes dirigidas a secuencias de reconocimiento encontradas en la región constante alfa del receptor de linfocitos T (SEQ ID NO:1). Para las meganucleasas recombinantes descritas en la presente memoria, se produjo una línea celular CHO en la que un casete indicador se integró de forma estable en el genoma de la célula. El casete indicador comprendía, en orden de 5 'a 3': un Promotor Temprano de SV40; los 2/3 desde 5' del gen GFP; la secuencia de reconocimiento para una meganucleasa diseñada genéticamente de la invención (por ejemplo, la secuencia de reconocimiento TRC 1-2, la secuencia de reconocimiento TRC 3-4, o la secuencia de reconocimiento TRC 7-8); la secuencia de reconocimiento para la meganucleasa CHO-23/24 (documento WO/2012/167192); y los 2/3 desde 3' del gen GFP. Las células transfectadas de manera estable con este casete no expresaban GFP en ausencia de un agente inductor de ruptura de ADN. Las meganucleasas se introdujeron por transducción de ADN plasmídico o ARNm que codifica cada meganucleasa. Cuando se indujo una rotura de ADN en cualquiera de las secuencias de reconocimiento de la meganucleasa, las regiones duplicadas del gen GFP se recombinaron entre sí para producir un gen GFP funcional. El porcentaje de células que expresan GFP podría entonces determinarse mediante citometría de flujo como una medida indirecta de la frecuencia de escisión del genoma por las meganucleasas.
Figura 9. Eficiencia de meganucleasas recombinantes para reconocer y escindir secuencias de reconocimiento en la región constante alfa del receptor de linfocitos T humanos (SEQ ID NO:1) en un ensayo de indicador de células CHO. Cada una de las meganucleasas recombinantes establecidas en las SEQ ID NO:8-32 se diseñó genéticamente para apuntar a la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO: 3), la secuencia de reconocimiento TRC 3-4 (SEQ ID NO: 4), o la secuencia de reconocimiento TRC 7-8 (SEQ ID NO: 5), y se seleccionaron para determinar su eficacia en el ensayo de indicador de células CHO. Los resultados mostrados proporcionan el porcentaje de células que expresan GFP observadas en cada ensayo, que indica la eficacia de cada meganucleasa para escindir una secuencia de reconocimiento de TRC diana o la secuencia de reconocimiento CHO-23/24. Un control negativo (RHO 1-2 bs) se incluyó adicionalmente en cada ensayo. A)-C) Meganucleasas dirigidas a la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. D) Meganucleasas dirigidas a la secuencia de reconocimiento TRC 3-4. E)-F) Meganucleasas dirigidas a la secuencia de reconocimiento TRC 7-8. G) Variantes de la meganucleasa TRC 1-2x.87, en la que la Q en la posición 271 está sustituida con E (TRC 1-2x.87 QE), la Q en la posición 80 está sustituida con E (TRC 1-2x.87 EQ), o la Q en la posición 80 y la Q en la posición 271 están ambos sustituidos con E (TRC 1-2x.87 EE).
Figura 10. Curso temporal de la eficacia de la meganucleasa recombinante en el ensayo indicador de células CHO. Las meganuclesasas TRC 1-2x.87 QE, TRC 1-2x.87 EQ y TRC 1-2x.87 EE se evaluaron en el ensayo indicador CHO, con el porcentaje de células que expresan GFP determinado 1, 4, 6, 8 y 12 días después de la introducción de ARNm que codifica meganucleasa en las células indicadoras CHO.
Figura 11. Análisis de ADN genómico de células Jurkat después de la transfección con meganucleasas TRC 1-2. A las 72 horas después de la transfección con ARNm que codifica las meganucleasas TRC 1-2, se recolectó el ADN genómico y se realizó un ensayo de endonucleasa T7 para estimar la modificación genética en la secuencia de reconocimiento endógena de TRC 1-2.
Figura 12. Respuesta a la dosis de la expresión de meganucleasa TRC 1-2 en células Jurkat en la modificación genética en la secuencia de reconocimiento endógena de TRC 1-2. Las células Jurkat se transfectaron con 3 |jg o 1 |jg de un ARNm de meganucleasa TRC 1-2 dado. A las 96 horas, el ADN genómico se analizó usando un ensayo de endonucleasa T7.
Figura 13. Escisión de la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2 en linfocitos T humanos. A) Los linfocitos T CD3+ se estimularon con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 durante 3 días, luego se electroporaron con ARNm que codifica la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE. El ADN genómico se recogió a los 3 días y a los 7 días después de la transfección, y se analizó usando un ensayo de endonucleasa T7. B) Para determinar si las mutaciones en la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2 endógena fueron suficientes para eliminar la expresión superficial del receptor de linfocitos T, las células se analizaron por citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-CD3. Las células de control (transfectadas con agua) y las células transfectadas con TRC 1-2x.87 e E se analizaron el día 3 y el día 7 después de la transfección, y se determinó el porcentaje de linfocitos T CD3-positivos y CD3-negativos.
Figura 14. Secuencias de ácido nucleico de deleciones representativas que se observaron en la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2 en linfocitos T humanos después de la expresión de meganucleasas TRC 1 2.
Figura 15. Diagrama que ilustra elementos de secuencia de vectores de AAV recombinantes y su uso en combinación con una nucleasa diseñada genéticamente para insertar una secuencia de ácido nucleico exógeno en el gen endógeno de la región constante alfa del TCR.
Figura 16. Mapa del plásmido utilizado para producir el vector AAV405.
Figura 17. Mapa del plásmido utilizado para producir el vector AAV406.
Figura 18. Determinación del momento de la transfección de ARNm de meganucleasa y la transducción de AAV recombinante para mejorar la eficacia de transducción de AAV. Los linfocitos T CD3+ se electroporaron con ARNm que codifica la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE y a las 2, 4 u 8 horas después de la transfección, las células se transdujeron con un vector de AAV recombinante que codifica la GFP (GFP-AAV). La expresión de GFP en los linfocitos T se analizó por citometría de flujo a las 72 horas después de la transducción para determinar la eficiencia de la transducción.
Figura 19. Análisis de la inserción de una secuencia de ácido nucleico exógeno en linfocitos T humanos utilizando vectores de AAV recombinantes. Los linfocitos T CD3+ se transfectaron con ARNm de TRC 1-2x.87 EE y posteriormente se transdujeron (2 horas después de la transfección) con AAV405 o AAV406. Los controles de solo transducción se transfectaron de forma simulada (con agua) y se transdujeron con AAV405 o AAV406. Los controles de meganucleasa solo se transfectaron con TRC 1-2x.87 EE y luego se transdujeron de forma simulada (con agua) a las 2 horas después de la transfección. El ADN genómico se recolectó de los linfocitos T y el locus TRC 1-2 se amplificó por PCR usando cebadores que reconocieron secuencias más allá de la región de homología en los vectores de AAV. Los cebadores de PCR fuera de las regiones de homología solo permitieron la amplificación del genoma de linfocitos T, no de los vectores AAV. Los productos de PCR se purificaron y se digirieron con Eagl. Después se analizó la escisión de los productos de PCR.
Figura 20. Caracterización de la inserción de EagI en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 de linfocitos T humanos usando AAV405. A) El producto de PCR no digerido generado a partir de experimentos anteriores se clonó en un vector romo pCR. La PCR de colonias se realizó usando cebadores directos e inversos M13 y una porción de productos de PCR de células transfectadas con TRC 1-2x.87 EE y AAV405 se analizó por electroforesis en gel. El análisis muestra una mezcla de productos de PCR de longitud completa (aproximadamente 1600 pb), insertos más pequeños y plásmidos vacíos (aproximadamente 300 pb). B) En paralelo, otra porción de productos de PCR se digirió con EagI para determinar el porcentaje de clones que contienen el sitio de reconocimiento de EagI insertado en la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2. Los productos de PCR escindidos con EagI generaron fragmentos esperados de aproximadamente 700 y 800 pb.
Figura 21. Caracterización de la inserción de EagI en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 de linfocitos T humanos usando AAV406. A) El producto de PCR no digerido generado a partir de experimentos anteriores se clonó en un vector romo pCR. La PCR de colonias se realizó usando cebadores directos e inversos M13 y una porción de productos de PCR de células transfectadas con TRC 1-2x.87 EE y AAV406 se analizó por electroforesis en gel. El análisis muestra una mezcla de productos de PCR de longitud completa (aproximadamente 1600 pb), insertos más pequeños y plásmidos vacíos (aproximadamente 300 pb). B) En paralelo, otra porción de productos de PCR se digirió con EagI para determinar el porcentaje de clones que contienen el sitio de reconocimiento de EagI insertado en la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2. Los productos de PCR escindidos con EagI generaron fragmentos esperados de aproximadamente 700 y 800 pb.
Figura 22. A) Secuencias de ácido nucleico de deleciones e inserciones representativas (es decir, indel) que se observaron en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en linfocitos T humanos después de la expresión
de meganucleasas TRC 1-2. B) Secuencia de ácido nucleico de la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2 que confirma la inserción de la secuencia de ácido nucleico exógeno que comprende el sitio de restricción EagI.
Figura 23. Mejora de la eficiencia de transducción de AAV recombinante. La eficacia de la transducción se analizó además optimizando el momento de la transfección del ARNm de la meganucleasa y la posterior transducción del AAV. Los linfocitos T CD3+ humanos fueron electroporados con ARNm que codifica la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE y posteriormente transducidos con GFP-AAV inmediatamente después de la transfección o 2 horas después de la misma. Además, los linfocitos T restantes no estimulados se transdujeron con GFP-AAV. También se analizaron células transducidas de manera simulada. A las 72 horas tras la transducción, se analizó la expresión de GFP en las células por citometría de flujo para determinar la eficacia de transducción de AAV.
Figura 24. Mapa del plásmido utilizado para producir el vector AAV-CAR100 (AAV408).
Figura 25. Mapa del plásmido utilizado para producir el vector AAV-CAR763 (AAV412).
Figura 26. Inserción de la secuencia codificante del receptor de antígeno quimérico en el sitio de reconocimiento TRC 1-2 en linfocitos T humanos. Se desarrolló un ensayo basado en PCR para determinar si el molde de HDR AAV412 se utilizó para reparar roturas de doble cadena en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2.
Figura 27. Inserción de la secuencia codificante del receptor de antígeno quimérico en el sitio de reconocimiento TRC 1-2 en linfocitos T humanos. Se desarrolló un ensayo basado en PCR para determinar si el molde de HDR AAV408 se utilizó para reparar roturas de doble cadena en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. A) Productos de PCR generados usando un par de cebadores que solo amplifica un producto en el extremo 5' del locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 si el gen CAR se ha insertado en ese locus. B) Productos de PCR generados usando un par de cebadores que solo amplifica un producto en el extremo 3' del locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 si el gen CAR se ha insertado en ese locus.
Figura 28. PCR digital. A) Esquema de un ensayo de PCR digital desarrollado para determinar cuantitativamente la eficacia de inserción de la secuencia codificante del receptor de antígeno quimérico en el sitio de reconocimiento TRC 1-2 en linfocitos T humanos. B) Resultados de la PCR digital en ADN genómico de linfocitos T humanos electroporados con un ARN de meganucleasa TRC 1-2x.87EE y/o cantidades crecientes de AAV408.
Figura 29. Expresión en superficie celular del receptor de antígeno quimérico CD19 en linfocitos T humanos. El nivel de expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD 19 se determinó en células que tenían el gen CAR insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 usando AAV408 como molde de HDR. La expresión en la superficie celular se analizó por citometría de flujo. A) Células que fueron electroporadas y transducidas de manera simulada (MDI - 0), y células que fueron electroporadas y transducidas de manera simulada con cantidades crecientes de AAV408. B) Células que fueron electroporadas con TRC 1-2x.87EE y transducidas de manera simulada (MDI - 0), y células que fueron electroporadas con TRC 1-2x.87EE y transducidas con cantidades crecientes de AAV408.
Figura 30. Mapa del plásmido utilizado para producir el vector AAV421.
Figura 31. Mapa del plásmido utilizado para producir el vector AAV422.
Figura 32. Inserción de la secuencia codificante del receptor de antígeno quimérico. Se usaron procedimientos de PCR para determinar si la secuencia codificante del receptor de antígeno quimérico introducida por AAV421 o AAV422 se insertó en el sitio de reconocimiento TRC 1-2 escindido por la meganucleasa TRC 1-2x.87EE. A) Análisis de inserción después de la transducción con AAV421. B) Análisis de inserción después de la transducción con AAV422.
Figura 33. Expresión en superficie celular del receptor de antígeno quimérico CD19 en linfocitos T humanos. El nivel de expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD 19 se determinó en células que tenían el gen CAR insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 usando AAV421 como molde de HDR. La expresión en la superficie celular se analizó por citometría de flujo. A) Células que fueron electroporadas y transducidas de manera simulada (MDI - 0), y células que fueron electroporadas y transducidas de manera simulada con cantidades crecientes de AAV421. B) Células que fueron electroporadas con TRC 1-2x.87EE y transducidas de manera simulada (MDI - 0), y células que fueron electroporadas con TRC 1-2x.87EE y transducidas con cantidades crecientes de AAV421.
Figura 34. Expansión de linfocitos T humanos que expresan un receptor de antígeno quimérico de superficie celular. Se determinaron los procedimientos para expandir y enriquecer preferentemente una población de linfocitos T CD3VCAR+ después de la electroporación con ARNm para la meganucleasa TRC 1-2x.87EE y
transducción con AAV421. A) Suplementación con IL-7 (10 ng/ml) e IL-15 (10 ng/ml). B) Suplementación con IL-7 (10 ng/ml) e IL-15 (10 ng/ml), e incubación con células IM-9 inactivadas con mitomicina C. C) Suplementación con IL-7 (10 ng/ml) e IL-15 (10 ng/ml), y dos incubaciones con células IM-9 inactivadas con mitomicina C.
Figura 35. Expresión en superficie celular del receptor de antígeno quimérico CD19 en linfocitos T humanos. El nivel de expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD 19 se determinó en células que tenían el gen CAR insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 usando AAV422 como molde de HDR. La expresión en la superficie celular se analizó por citometría de flujo. A) Células que fueron electroporadas y transducidas de manera simulada (MDI - 0), y células que fueron electroporadas y transducidas de manera simulada con cantidades crecientes de AAV422. B) Células que fueron electroporadas con TRC 1-2x.87EE y transducidas de manera simulada (MDI - 0), y células que fueron electroporadas con TRC 1-2x.87EE y transducidas con cantidades crecientes de AAV422.
Figura 36. Expansión de linfocitos T humanos que expresan un receptor de antígeno quimérico de superficie celular. Se determinaron los procedimientos para expandir y enriquecer preferentemente una población de linfocitos T CD3VCAR+ después de la electroporación con ARNm para la meganucleasa TRC 1-2x.87EE y transducción con AAV422. A) Suplementación con IL-7 (10 ng/ml) e IL-15 (10 ng/ml). B) Suplementación con IL-7 (10 ng/ml) e IL-15 (10 ng/ml), e incubación con células IM-9 inactivadas con mitomicina C. C) Suplementación con IL-7 (10 ng/ml) e IL-15 (10 ng/ml), y dos incubaciones con células IM-9 inactivadas con mitomicina C.
Figura 37. Eficacia de inactivación de meganucleasas utilizando AAV de cadena sencilla. Se realizaron experimentos para examinar la eficacia de inactivación de dos meganucleasas en linfocitos T humanos cuando se transducían de manera simultánea con un vector de AAV monocatenario. A) Células electroporadas con ARNm para TRC 1-2x.87EE y transducidas con cantidades crecientes del AAV412 monocatenario. B) Células electroporadas con ARNm para una meganucleasa dirigida al gen de microglobulina beta-2 y transducidas con cantidades crecientes del AAV412 monocatenario. C) Células electroporadas con ARNm para TRC 1-2x.87EE y transducidas con cantidades crecientes del AAV422 monocatenario.
Figura 38. Actividad funcional de los linfocitos T CAR anti-CD19. A) Ensayo ELISPOT de IFN-gamma, en el que las células Raji CD19+ o las células U937 CD19' fueron la población diana. B) Ensayo de destrucción celular en el que las células CD19+ marcadas con luciferasa fueron la diana.
Figura 39. Expresión de receptores de antígeno quiméricos después de la transducción moldes de donantes de ADN linealizadas. Estos experimentos generaron plásmidos que contienen un gen CAR anti-CD19 flanqueado por brazos de homología que son homólogos al locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1 2. Se usaron diferentes promotores en algunos plásmidos, y los brazos de homología fueron "cortos" (200 pb en el brazo de homología de 5' y 180 pb en el brazo de homología de 3') o "largos" (985 pb en el brazo de homología de 5' y 763 pb en el brazo de homología de 3'). Los plásmidos donadores de c Ar se linealizaron en un sitio de restricción en la estructura principal del vector y se purificaron en gel. A) Tinción de fondo de CD37VCAR+. B) Células electroporadas con ARNm de TRC 1-2x.87EE solo. C) Células coelectroporadas con ARNm de TRC 1-2x.87EE y un vector de brazo de homología largo con un promotor central EF1a con un potenciador HTLV. D) Células coelectroporadas con ARNm de TRC 1-2x.87EE y un vector de brazo de homología corto con promotor central EF1a (sin potenciador). E) Células electroporadas con un vector de brazo de homología larga con un promotor central EF1a con un potenciador HTLV en ausencia de ARNm de TRC 1-2x.87EE. F) Células electroporadas con un vector de brazo de homología corto con promotor central EF1a (sin potenciador) en ausencia de ARNm de TRC 1-2x.87EE. G) Células electroporadas con una construcción de brazo de homología larga que contiene un promotor MND que impulsa la expresión del CAR y un intrón en el extremo 5' del gen CAR, así como ARNm de TRC 1-2x.87EE. H) Células electroporadas con una construcción de brazo de homología larga que contiene un promotor MND que dirige la expresión del CAR y sin intrón, así como ARNm de TRC 1-2x.87EE. I) Células electroporadas con un plásmido de brazo de homología corto con el promotor MND y sin intrón, así como ARNm de TRC 1-2x.87EE. J) Células electroporadas con una construcción de brazo de homología largo que contiene un promotor MND que dirige la expresión del CAR y un intrón en el extremo 5' del gen CAR, pero no ARNm de TRC 1-2x.87EE. K) Células electroporadas con una construcción de brazo de homología largo que contiene un promotor MND que dirige la expresión del CAR y sin intrón, pero no ARNm de TRC 1-2x.87EE. L) Células electroporadas con un plásmido de brazo de homología corto con el promotor MND y sin intrón, pero no ARNm de TRC 1-2x.87EE. M) Células electroporadas con una construcción de brazo de homología corto que contenía un promotor JeT, así como ARNm de TRC 1-2x.87EE. N) Células electroporadas con una construcción de brazo de homología largo que contenía un promotor de CMV, así como ARNm de TRC 1-2x.87EE. O) Células electroporadas con una construcción de brazo de homología corto que contenía un promotor JeT, pero no ARNm de TRC 1-2x.87EE. P) Células electroporadas con una construcción de brazo de homología largo que contenía un promotor de CMV, pero no ARNm de TRC 1-2x.87EE.
Figura 40. Análisis de PCR para determinar si la región codificante del receptor de antígeno quimérico administrada por construcciones de ADN linealizadas se insertó en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en linfocitos T humanos.
Figura 41. Mapa del plásmido utilizado para producir el vector AAV423.
Figura 42. Expresión en superficie celular del receptor de antígeno quimérico CD19 en linfocitos T humanos. El nivel de expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD 19 se determinó en células que tenían el gen CAR insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 usando AAV423 como molde de HDR. La expresión en la superficie celular se analizó por citometría de flujo. A) Células que fueron electroporadas y transducidas de manera simulada (MDI - 0), y células que fueron electroporadas y transducidas de manera simulada con cantidades crecientes de AAV423. B) Células que fueron electroporadas con TRC 1-2x.87EE y transducidas de manera simulada (MDI - 0), y células que fueron electroporadas con TRC 1-2x.87EE y transducidas con cantidades crecientes de AAV423.
Figura 43. Inserción de la secuencia codificante del receptor de antígeno quimérico. Se usaron procedimientos de PCR para determinar si la secuencia codificante del receptor de antígeno quimérico introducida por AAV423 se insertó en el sitio de reconocimiento TRC 1-2 escindido por la meganucleasa TRC 1-2x.87EE.
Figura 44. Análisis de fenotipo de linfocitos T con CAR anti-CD 19. A) Los linfocitos T con CAR se electroporaron con ARNm de TRC 1-2x.87 EE, luego se transdujo con un vector AAV6 que comprende un casete de expresión de CAR anti-CD 19 dirigido por un promotor JeT y flanqueado por brazos de homología. Después de 5 días de cultivo con IL-2 (10 ng/ml), se analizó la expresión de CD3 en la superficie celular de las células y de CAR anti-CD 19 por citometría de flujo. B) las células CD3' se enriquecieron por el agotamiento de células CD3+ usando perlas magnéticas anti-CD3. Las células agotadas se cultivaron durante 3 días en IL-15 (10 ng/ml) e IL-21 (10 ng/ml) y se volvieron a analizar para determinar la expresión en la superficie celular de CD3 y CAR anti-CD 19. C) La población purificada de linfocitos T CD3' CD19-CAR se analizó mediante citometría de flujo para determinar el porcentaje de células que eran CD4+ y CD8+. D) La población purificada de linfocitos T CD3' CD19-CAR se analizaron adicionalmente mediante citometría de flujo para determinar si eran linfocitos T de memoria central, linfocitos T de memoria de transición, o linfocitos T efectores de memoria mediante tinción para CD62L y CD45RO.
Figura 45. Modelo de linfoma diseminado de Raji. Células Raji que expresan establemente luciferasa de luciérnaga (ffLuc)44 se inyectaron por vía i.v. en ratones hembra NSG de 5-6 semanas de vida el día 1, a una dosis de 2,0 x 105 células por ratón. El día 4, se inyectó a los ratones por vía i.v. con PBS o PBS que contenían linfocitos T con TCR KO de control editado de genes de las PBMC del mismo donante sano o PBS que contenía las dosis indicadas de linfocitos T con CAR preparados a partir del mismo donante. En los días indicados, los ratones vivos fueron inyectados por vía i.p. con sustrato de Luciferina (150 mg/kg en solución salina), anestesiados, y la actividad de luciferasa se midió después de 7 minutos usando IVIS SpectrumCT® (Perkin Elmer, Waltham, MA). Los datos se analizaron y se exportaron con el programa informático Living Image 4.5.1 (Perkin Elmer, Waltham, MA). La intensidad de la señal de luminiscencia está representada por la radiación en p/seg/ cm2/sr.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS
La SEQ ID NÚM.: 1 establece la secuencia de nucleótidos del gen de la región constante alfa del receptor de linfocitos T humanos (gen del NCBI con ID NO. 28755).
La SEQ ID NÚM.: 2 establece la secuencia de aminoácidos codificada por la región constante alfa del receptor de linfocitos T humanos.
La SEQ ID NÚM.: 3 establece la secuencia de aminoácidos de la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2.
La SEQ ID NÚM.: 4 establece la secuencia de nucleótidos de la secuencia de reconocimiento de TRC 3-4.
La SEQ ID NÚM.: 5 establece la secuencia de nucleótidos de la secuencia de reconocimiento de TRC 7-8.
La SEQ ID NÚM.: 6 establece la secuencia de aminoácidos de I-CreI.
La SEQ ID NÚM.: 7 establece la secuencia de aminoácidos del motivo LAGLIDADG.
La SEQ ID NÚM.: 8 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.87.
La SEQ ID NÚM.: 9 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.87.
La SEQ ID NÚM.: 10 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.87.
La SEQ ID NÚM.: 11 establece la secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.87.
La SEQ ID NUM.: 12 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.6. La SEQ ID NÚM.: 13 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.20. La SEQ ID NÚM.: 14 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.55. La SEQ ID NÚM.: 15 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.60. La SEQ ID NÚM.: 16 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.105. La SEQ ID NUM.: 17 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.163. La SEQ ID NÚM.: 18 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.113_3. La SEQ ID NÚM.: 19 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.5. La SEQ ID NÚM.: 20 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.8. La SEQ ID NÚM.: 21 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.25. La SEQ ID NÚM.: 22 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.72. La SEQ ID NÚM.: 23 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.80. La SEQ ID NÚM.: 24 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.84. La SEQ ID NÚM.: 25 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.120. La SEQ ID NÚM.: 26 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1 -2x.113_1. La SEQ ID NÚM.: 27 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 1-2x.113_2. La SEQ ID NÚM.: 28 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 3-4x.3. La SEQ ID NÚM.: 29 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 3-4x.19. La SEQ ID NÚM.: 30 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 7-8x.7. La SEQ ID NÚM.: 31 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 7-8x.9. La SEQ ID NÚM.: 32 establece a secuencia de aminoácidos de la meganucleasa TRC 7-8x.14. La SEQ ID NÚM.: 33 establece os restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE.
La SEQ ID NÚM.: 34 establece os restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.87 QE.
La SEQ ID NÚM.: 35 establece os restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.87 EQ.
La SEQ ID NÚM.: 36 establece os restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.87.
La SEQ ID NÚM.: 37 establece os restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.6.
La SEQ ID NÚM.: 38 establece os restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.20.
La SEQ ID NÚM.: 39 establece os restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.55.
La SEQ ID NÚM.: 40 establece os restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.60.
La SEQ ID NÚM.: 41 establece os restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.105.
La SEQ ID NÚM.: 42 establece os restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.163.
La SEQ ID NÚM.: 43 establece os restos 198-344 de la meganucleasa TRC 1-2x.113_3.
La SEQ ID NÚM.: 44 establece os restos 7-153 de la meganucleasa TRC 1-2x.5.
La SEQ ID NÚM.: 45 establece os restos 7-153 de la meganucleasa TRC 1-2x.8.
La SEQ ID NÚM.: 46 establece os restos 7-153 de la meganucleasa TRC 1-2x.25.
La SEQ ID NÚM.: 47 establece os restos 7-153 de la meganucleasa TRC 1-2x.72.
La SEQ ID NÚM.: 83 establece la
reconocimiento de TRC 1-2.
La SEQ ID NÚM.: 84 establece la secuencia de nucleótidos de la cadena antisentido de la secuencia de reconocimiento de TRC 3-4.
La SEQ ID NÚM.: 85 establece la secuencia de nucleótidos de la cadena antisentido de la secuencia de reconocimiento de TRC 7-8.
La SEQ ID NÚM.: 86 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO:1.
La SEQ ID NÚM.: 87 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una deleción que es resultado de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 88 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una deleción que es resultado de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 89 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una deleción que es resultado de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 90 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una deleción que es resultado de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 91 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una deleción que es resultado de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 92 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una deleción que es resultado de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 93 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una deleción que es resultado de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 94 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO:1 que comprende una inserción resultante de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 95 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO:1 que comprende una inserción resultante de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 96 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una deleción que es resultado de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 97 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una deleción que es resultado de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 98 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una deleción que es resultado de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 99 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una deleción que es resultado de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 100 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una deleción que es resultado de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 101 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una deleción que es resultado de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 102 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una deleción que es resultado de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 103 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una deleción que es resultado de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 104 establece los nucleótidos 162-233 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una deleción que es resultado de la escisión y NHEJ.
La SEQ ID NÚM.: 105 establece los nucleótidos 181-214 de la SEQ ID NO:1.
La SEQ ID NÚM.: 106 establece los nucleótidos 181-214 de la SEQ ID NO: 1 que comprende una secuencia de ácido nucleico exógeno insertada mediante recombinación homóloga.
La SEQ ID NÚM.: 107 establece la secuencia de nucleótidos de un plásmido usado para generar el vector AAV405.
La SEQ ID NÚM.: 108 establece la secuencia de nucleótidos de un plásmido usado para generar el vector AAV406.
La SEQ ID NÚM.: 109 establece la secuencia de nucleótidos de un plásmido usado para generar el vector AAV-CAR100 (AAV408).
La SEQ ID NÚM.: 110 establece la secuencia de nucleótidos de un plásmido usado para generar el vector AAV-CAR763 (AAV412).
La SEQ ID NÚM.: 111 establece la secuencia de aminoácidos de un receptor de antígeno quimérico anti-CD 19.
La SEQ ID NÚM.: 112 establece la secuencia de aminoácidos de un dominio de unión a ligando extracelular anti-CD 19.
La SEQ ID NÚM.: 113 establece la secuencia de aminoácidos de un dominio de señalización citoplasmática intracelular del receptor de antígeno quimérico.
La SEQ ID NÚM.: 114 establece la secuencia de aminoácidos de un dominio coestimulador intracelular del receptor de antígeno quimérico.
La SEQ ID NÚM.: 115 establece la secuencia de aminoácidos de un dominio de péptido señal del receptor de antígeno quimérico.
La SEQ ID NÚM.: 116 establece la secuencia de aminoácidos de una región de bisagra del receptor de antígeno quimérico.
La SEQ ID NÚM.: 117 establece la secuencia de aminoácidos de un dominio transmembrana del receptor de antígeno quimérico.
La SEQ ID NÚM.: 118 establece la secuencia de nucleótidos de un promotor de núcleo EF-1 alfa.
La SEQ ID NÚM.: 119 establece la secuencia de nucleótidos de un inserto de polinucleótido exógeno. La SEQ ID NÚM.: 120 establece la secuencia de nucleótidos del gen de la región constante alfa del TCR humano que comprende una secuencia de ácido nucleico exógeno insertada dentro de la secuencia de reconocimiento t Rc 1-2.
La SEQ ID NÚM.: 121 establece la secuencia de nucleótidos del gen de la región constante alfa del TCR humano que comprende una secuencia de ácido nucleico exógeno insertada dentro de la secuencia de reconocimiento t Rc 3-4.
La SEQ ID NÚM.: 122 establece la secuencia de nucleótidos del gen de la región constante alfa del TCR humano que comprende una secuencia de ácido nucleico exógeno insertada dentro de la secuencia de reconocimiento TRC 7-8.
La SEQ ID NÚM.: 123 establece la secuencia de ácido nucleico de un plásmido usado para generar el vector AAV421.
La SEQ ID NÚM.: 124 establece la secuencia de ácido nucleico de un plásmido usado para generar el vector AAV422.
La SEQ ID NÚM.: 125 establece la secuencia de ácido nucleico de un plásmido usado para generar el vector AAV423.
Descripción detallada de la invención
1.1 Referencias y definiciones
La presente invención puede plasmarse en diferentes formas y no debe interpretarse como limitada a las realizaciones expuestas en el presente documento. Más bien, estas realizaciones se proporcionan para que esta divulgación sea exhaustiva y completa, y transmita plenamente el alcance de la invención a los expertos en la técnica. Por ejemplo, las características ilustradas con respecto a una realización pueden ser incorporadas a otras realizaciones, y las características ilustradas con respecto a una realización particular pueden ser eliminadas de esa realización.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta invención. La terminología utilizada en la descripción de la presente invención tiene el único propósito de describir realizaciones particulares y no pretende ser limitativa de la invención.
Tal y como se utiliza en el presente documento, "un", "una" o "el/la" puede significar uno o más de uno. Por ejemplo, "una" célula puede significar una sola célula o una multiplicidad de células.
Tal como se utiliza en el presente documentos, a menos que se indique específicamente lo contrario, la palabra "o" se utiliza en el sentido inclusivo de "y/o" y no en el sentido exclusivo de "ya sea/o"
Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "meganucleasa" se refiere a una endonucleasa que se une al ADN de doble cadena en una secuencia de reconocimiento que es superior a 12 pares de bases. Preferentemente, la secuencia de reconocimiento para una meganucleasa de la invención es de 22 pares de bases. Una meganucleasa puede ser una endonucleasa que proviene de I-Crel, y puede referirse a una variante diseñada genéticamente de I-Crel que se ha modificado en relación con la I-Crel natural con respecto a, por ejemplo, la especificidad de unión al ADN, la actividad de escisión del ADN, la afinidad de unión al ADN o propiedades de dimerización. Los procedimientos de producción de tales variantes modificadas de I-Crel son conocidos en la técnica (por ejemplo, el documento WO 2007/047859).
Una meganucleasa tal como se usa en el presente documento se une al ADN bicatenario como un heterodímero o como una "meganucleasa de cadena sencilla" en la que un par de dominios de unión a ADN se unen en un polipéptido único usando un enlazador peptídico. La expresión "endonucleasa autoguiada" es sinónimo del término "meganucleasa". Las meganucleasas de la invención son sustancialmente no tóxicas cuando se expresan en células, particularmente en linfocitos T humanos, de tal manera que las células se pueden transfectar y mantener a 37 °C sin observar efectos nocivos sobre la viabilidad celular o reducciones significativas en la actividad de escisión de meganucleasa cuando se mide usando los procedimientos descritos en el presente documento.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "meganucleasa de cadena sencilla" se refiere a un polipéptido que comprende un par de subunidades de nucleasa unidas por un enlazador. Una meganucleasa de cadena única tiene la organización: Subunidad N-terminal - Enlazados- Subunidad C-terminal. Las dos subunidades de meganucleasa serán generalmente no idénticas en la secuencia de aminoácidos y reconocerán secuencias de ADN no idénticas. Así, las meganucleasas de cadena única suelen escindir secuencias de reconocimiento pseudopalindrómicas o no palindrómicas. Una meganucleasa de cadena sencilla se puede denominar "heterodímero de cadena sencilla" o "meganucleasa heterodimérica de cadena sencilla" aunque no es, de hecho, dimérica. Por propósitos de claridad, a menos que se especifique lo contrario, la expresión "meganucleasa" se puede referir a una meganucleasa dimérica o monocatenaria.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "enlazador" se refiere a una secuencia de péptidos exógenos usada para unir dos subunidades de meganucleasa en un solo polipéptido. Un enlazador puede tener una secuencia que se encuentra en las proteínas naturales, o puede ser una secuencia artificial que no se encuentra en ninguna proteína natural. Un enlazador puede ser flexible y carecer de estructura secundaria o puede tener una propensión a formar una estructura tridimensional específica bajo condiciones fisiológicas. Un enlazador puede incluir, sin limitación, los abarcados por la Patente de Estados Unidos N.° 8.445.251. En algunas realizaciones, un enlazador puede tener una secuencia de aminoácidos que comprende los restos 154-195 de cualquiera de las SEQ ID NO:
Tal como se usa en la presente memoria, el término "TALEN" se refiere a una endonucleasa que comprende un dominio de unión a ADN que comprende 16-22 repeticiones de dominio TAL fusionadas a cualquier porción del dominio de nucleasa FokI.
Tal como se usa en el presente documento, el término "TALEN compacto" se refiere a una endonucleasa que comprende un dominio de unión a ADN con 16-22 repeticiones de dominio TAL fusionadas en cualquier orientación a cualquier porción catalíticamente activa del dominio de nucleasa de la endonucleasa autoguiada I-TevI.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "CRISPR" se refiere a una endonucleasa basada en caspasa que comprende una caspasa, como Cas9, y un ARN guía que dirige la escisión del ADN de la caspasa mediante hibridación con un sitio de reconocimiento en el ADN genómico.
Tal como se usa en el presente documento, el término "megaTAL" se refiere a una nucleasa de cadena sencilla que comprende un dominio de unión al ADN efector de tipo activador de la transcripción (TALE) con una endonucleasa autoguiada diseñada genéticamente, específica de secuencia.
Tal como se usa en el presente documento, con respecto a una proteína, el término "recombinante" significa que tiene una secuencia de aminoácidos alterada como resultado de la aplicación de técnicas de ingeniería genética a los ácidos nucleicos que codifican la proteína y a las células u organismos que expresan la proteína. Con respecto a un ácido nucleico, el término "recombinante" significa que tiene una secuencia de ácido nucleico alterada como resultado de la aplicación de técnicas de manipulación genética. Las técnicas de ingeniería genética incluyen, pero no se limitan a, las tecnologías de PCR y de clonación de ADN; la transfección, la transformación y otras tecnologías de transferencia de genes; la recombinación homóloga; la mutagénesis dirigida al sitio; y la fusión de genes. De acuerdo con esta definición, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a una proteína de origen natural, pero producida por clonación y expresión en un huésped heterólogo, no se considera recombinante.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "tipo silvestre" se refiere al alelo natural más común (es decir, secuencia polinucleotídica) en la población de alelos del mismo tipo de gen, en el que un polipéptido codificado por el alelo de tipo silvestre tiene sus funciones originales. El término "tipo silvestre" también se refiere a un polipéptido codificado por un alelo de tipo silvestre. Los alelos (es decir, polinucleótidos) y polipéptidos de tipo silvestre se distinguen de alelos y polipéptidos mutantes o variantes, que comprenden una o más mutaciones y/o sustituciones relativas a la secuencia o secuencias de tipo silvestre. Mientras que un alelo o polipéptido de tipo silvestre puede conferir un fenotipo normal en un organismo, un alelo o polipéptido mutante o variante puede, en algunos casos, conferir un fenotipo alterado. Las nucleasas de tipo silvestre se distinguen de las nucleasas recombinantes o no naturales.
Tal como se usa en la presente memoria con respecto a las proteínas recombinantes, el término "modificación" significa cualquier inserción, deleción o sustitución de un residuo de aminoácido en la secuencia recombinante con respecto a una secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia de tipo silvestre o natural).
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "secuencia de reconocimiento" se refiere a una secuencia de ADN que está unida y escindida por una endonucleasa. En el caso de una meganucleasa, una secuencia de reconocimiento comprende un par de "semisitios" invertidos de 9 pares de bases que están separados por cuatro pares de bases. En el caso de una meganucleasa de cadena sencilla, el dominio N-terminal de la proteína contacta con un primer semisitio y el dominio C-terminal de la proteína contacta con un segundo semisitio. La escisión por parte de una meganucleasa produce cuatro "salientes" 3' de pares de bases. Los "salientes" o "extremos pegajosos" son segmentos cortos de ADN de una sola cadena que pueden producirse por la escisión de una endonucleasa de una secuencia de ADN de doble cadena. En el caso de las meganucleasas y las meganucleasas de cadena única derivadas de I-CreI, el saliente comprende las bases 10-13 de la secuencia de reconocimiento de 22 pares de bases. En el caso de un TALEN compacto, la secuencia de reconocimiento comprende una primera secuencia CNNNGN que es reconocida por el dominio I-TevI, seguida de un espaciador inespecífico de 4-16 pares de bases de longitud, seguido de una segunda secuencia de 16-22 pb de longitud que es reconocida por el dominio del efector TAL (esta secuencia suele tener una base 5' T). La escisión por un TALEN compacto produce dos pares de bases 3' en salientes. En el caso de una CRISPR, la secuencia de reconocimiento es la secuencia, típicamente de 16-24 pares de bases, a la que el ARN guía se une a la escisión directa de Cas9. La escisión mediante CRISPR produjo extremos romos.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "sitio diana" o "secuencia diana" se refiere a una región del ADN cromosómico de una célula que comprende una secuencia de reconocimiento para una nucleasa.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "afinidad de unión al ADN" o "afinidad de unión" significa la tendencia de una meganucleasa a asociarse de manera no covalente con una molécula de ADN de referencia (por ejemplo, una secuencia de reconocimiento o una secuencia arbitraria). La afinidad de unión se mide por una constante de disociación, Kd. Tal como se usa en el presente documento, una nucleasa tiene afinidad de unión "alterada" si la Kd de la nucleasa para una secuencia de reconocimiento de referencia aumenta o disminuye mediante un cambio porcentual estadísticamente significativo con respecto a una nucleasa de referencia.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "recombinación homóloga" o "HR" se refiere al procedimiento celular natural en el que se repara una rotura de ADN de doble cadena utilizando una secuencia de ADN homóloga como plantilla de reparación (véase, por ejemplo Cahill et al. (2006), Front. Biosci. 11:1958-1976). La secuencia de ADN homóloga puede ser una secuencia cromosómica endógena o un ácido nucleico exógeno que fue entregado a la célula.
Como se usa en el presente documento, el término "unión final no homóloga" o "NHEJ" se refiere al proceso celular natural en el que se repara una rotura de ADN de doble cadena mediante la unión directa de dos segmentos de ADN no homólogos (véase, por ejemplo, Cahill et al. (2006), Front. Biosci. 11:1958-1976). La reparación del ADN mediante la unión de extremos no homólogos es propensa a los errores y con frecuencia da lugar a la adición o eliminación no prevista de secuencias de ADN en el lugar de la reparación. En algunos casos, la escisión en una secuencia de reconocimiento diana que da como resultado NHEJ en un sitio de reconocimiento diana. La escisión inducida por nucleasas de un sitio diana en la secuencia codificante de un gen seguido de reparación de ADN por NHEJ puede introducir mutaciones en la secuencia codificante, tales como las mutaciones de desplazamiento de marco, que alteran la función del gen. Por lo tanto, las nucleasas diseñadas genéticamente se pueden usar para inactivar eficazmente un gen en una población de células.
Tal como se usa en la presente memoria, un "receptor de antígeno quimérico" o "CAR" se refiere a un receptor diseñado genéticamente que confiere o injerta especificidad para un antígeno en una célula inmunitaria efectora (por ejemplo, un linfocito T humano). Un receptor de antígeno quimérico comprende típicamente un dominio o resto de unión al ligando extracelular y un dominio intracelular que comprende uno o más dominios estimuladores que transducen las señales necesarias para la activación de los linfocitos T. En algunas realizaciones, el dominio o resto de unión al ligando extracelular puede estar en forma de fragmentos variables de cadena única (scFvs) derivados de un anticuerpo monoclonal, que proporcionan especificidad para un epitopo o antígeno particular (por ejemplo, un epitopo o antígeno presente preferentemente en la superficie de una célula cancerosa u otra célula o partícula causante de la enfermedad). El dominio de unión al ligando extracelular puede ser específico para cualquier antígeno o epítopo de interés. En una realización particular, el dominio de unión al ligando es específico para CD19.
El dominio extracelular de un receptor de antígeno quimérico también puede comprender un autoantígeno (véase, Payne y col. (2016), Science 353 (6295): 179-184), que puede ser reconocido por los receptores de células B específicos de autoantígeno en linfocitos B, dirigiendo así a los linfocitos T al direccionamiento y la destrucción específica de los linfocitos B autorreactivos en enfermedades autoinmunes mediadas por anticuerpos. Dichos CAR se pueden denominar receptores de autoanticuerpos quiméricos (CAAR), y su uso está comprendido en la invención.
Los scFv se pueden conectar a través de una secuencia de enlazador. El dominio de estimulación intracelular puede incluir uno o más dominios de señalización citoplasmáticos que transmiten una señal de activación a la célula efectora inmunitaria después de la unión al antígeno. Dichos dominios de señalización citoplasmática pueden incluir, sin limitación, CD3-zeta. El dominio estimulante intracelular también puede incluir uno o más dominios coestimuladores intracelulares que transmiten una señal proliferativa y/o de supervivencia celular después de la unión del ligando. Dichos dominios coestimuladores intracelulares pueden incluir, sin limitación, un dominio CD28, un dominio 4-1BB, un dominio OX40, o una de sus combinaciones. Un receptor de antígeno quimérico puede incluir además elementos estructurales adicionales, incluyendo un dominio transmembrana que está unido al dominio de unión al ligando extracelular a través de una bisagra o secuencia espaciadora.
Tal como se usa en la presente memoria, un "receptor de linfocitos T exógeno" o "TCR exógeno" se refiere a un TCR cuya secuencia se introduce en el genoma de una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, un linfocito T humano) que puede o no expresar endógenamente el TCR. La expresión de un TCR exógeno en una célula efectora inmunitaria puede conferir especificidad para un epitopo o antígeno específico (por ejemplo, un epitopo o antígeno presente preferentemente en la superficie de una célula cancerosa u otra célula o partícula causante de la enfermedad). Dichos receptores de linfocitos T exógenos pueden comprender cadenas alfa y beta o, como alternativa, pueden comprender cadenas gamma y delta. Los TCR exógenos útiles en la invención pueden tener especificidad para cualquier antígeno o epítopo de interés.
Tal como se usa en el presente documento, el término "expresión reducida" se refiere a cualquier reducción en la expresión del receptor de linfocitos T endógeno en la superficie celular de una célula genéticamente modificada en comparación con una célula de control. El término reducido también se puede referir a una reducción en el porcentaje de células en una población de células que expresan un polipéptido endógeno (es decir, un receptor endógeno de linfocitos T) en la superficie celular cuando se compara con una población de células de control. Tal reducción puede ser de hasta un 5 %, un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 %, o hasta un 100 %. En consecuencia, el término "reducido" abarca tanto una atenuación génica parcial y una atenuación génica completa del receptor endógeno de linfocitos T.
Tal como se usa en el presente documento con respecto tanto a las secuencias de aminoácidos como a las secuencias de ácidos nucleicos, la expresiones "porcentaje de identidad", "identidad de secuencia", "porcentaje de similitud", "similitud de secuencia" y similares se refieren a una medida del grado de similitud de dos secuencias basándose en una alineación de las secuencias que maximiza la similitud entre restos de aminoácidos alineados o nucleótidos, y que es una función del número de restos o de nucleótidos idénticos o similares, el número de restos o de nucleótidos totales, y la presencia y longitud de espacios en la alineación de la secuencia. Una variedad de algoritmos y programas informáticos están disponibles para determinar la similitud de secuencia utilizando parámetros estándar. Como se utiliza en el presente documento, la similitud de la secuencia se mide utilizando el programa BLASTp para las secuencias de aminoácidos y el programa BLASTn para las secuencias de ácidos nucleicos, ambos disponibles a través del National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/), y que se describen, por ejemplo, en, Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410 Gish y States (1993), Nature Genet. 3:266-272 Madden et al. (1996), Meth. Enzymol.266:131-141 Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) Zhang et al. (2000), J. Comput. Biol. 7(1-2):203-14. Tal como se usa en el presente documento, el porcentaje de similitud de dos secuencias de aminoácidos es la puntuación basada en los siguientes parámetros para el algoritmo BLASTp: tamaño de palabra=3; penalización por apertura de hueco=-11; penalización de extensión de hueco=-1; y matriz de puntuación=BLOSUM62. Tal como se usa en la presente memoria, el porcentaje de similitud de dos secuencias de ácido nucleico es la puntuación basada en los siguientes parámetros para el algoritmo BLASTn: tamaño de palabra=11; penalización por apertura de hueco=-5; penalización por extensión de hueco=-2; recompensa de coincidencia = 1; y penalización por falta de coincidencia=-3.
Tal como se usa en la presente memoria con respecto a las modificaciones de dos proteínas o secuencias de aminoácidos, la expresión "correspondiente a" se usa para indicar que una modificación especificada en la primera proteína es una sustitución del mismo residuo de aminoácido que en la modificación en la segunda proteína, y que la posición del aminoácido de la modificación en las primeras proteínas corresponde o se alinea con la posición de aminoácidos de la modificación en la segunda proteína cuando las dos proteínas se someten a alineamientos de secuencia estándar (por ejemplo, usando el programa BLASTp). Por lo tanto, la modificación del residuo "X" al aminoácido "A" en la primera proteína se corresponderá con la modificación del residuo "Y" al aminoácido "A" en la segunda proteína si los residuos X e Y se corresponden entre sí en una secuencia de alineación, y a pesar de que X e Y pueden ser números diferentes.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "semisitio de reconocimiento", "semisitio de secuencia de reconocimiento", o simplemente "semisitio" significa una secuencia de ácido nucleico en una molécula de ADN bicatenario que es reconocida por un monómero de una meganucleasa homodimérica o heterodimérica, o por una subunidad de una meganucleasa de cadena sencilla.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "región hipervariable" se refiere a una secuencia localizada dentro de un monómero o subunidad de meganucleasa que comprende aminoácidos con una variabilidad relativamente alta. Una región hipervariable puede comprender aproximadamente 50-60 residuos contiguos, aproximadamente 53-57 residuos contiguos, o preferentemente aproximadamente 56 residuos. En algunas realizaciones, los residuos de una región hipervariable se pueden corresponder a las posiciones 24-79 o 215-270 de cualquiera de las SEQ ID NÚM.:8-32. Una región hipervariable puede comprender uno o más residuos que entran en contacto con bases de ADN en una secuencia de reconocimiento y pueden ser modificados para alterar la preferencia de bases del monómero o subunidad. Una región hipervariable también puede comprender uno o más residuos que se unen a la columna vertebral del ADN cuando la meganucleasa se asocia con una secuencia de reconocimiento de ADN de doble cadena. Dichos residuos pueden modificarse para alterar la afinidad de unión de la meganucleasa con el esqueleto del ADN y la secuencia de reconocimiento objetivo. En diferentes realizaciones de la invención, una región hipervariable puede comprender entre 1-20 restos que presentan variabilidad y se pueden modificar para influir en la preferencia de base y/o la afinidad de unión al ADN. En realizaciones particulares, una región hipervariable comprende entre aproximadamente 15-18 restos que presentan variabilidad y se pueden modificar para influir en la preferencia de base y/o la afinidad de unión al ADN. En algunas realizaciones, los restos variables dentro de una región hipervariable se corresponden con una o más de las posiciones 24, 26, 28, 29, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 66, 68, 70, 72, 73, 75 y 77 de cualquiera de las SEQ ID NO:8-32. En otras realizaciones, los restos variables dentro de una región hipervariable se corresponden con una o más de las posiciones 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231,233, 235, 237, 248, 257, 259, 261,263, 264, 266 y 268 de cualquiera de las SEQ ID NO:8-32.
Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "gen de región constante alfa del receptor de linfocitos T" y "gen de región constante alfa del TCR" se usan indistintamente y se refieren al gen humano identificado por el gen con ID del NCBI NO. 28755 (SEQ ID NO:1).
Las expresiones "construcción de ADN recombinante", "construcción recombinante", "casete de expresión", "construcción de expresión", "construcción quimérica", "construcción", y "fragmento de ADN recombinante" se usan indistintamente en el presente documento y son polinucleótidos monocatenarios o bicatenarios. Una construcción recombinante comprende una combinación artificial de polinucleótidos monocatenarios o bicatenarios, entre ellos, sin limitación, secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por ejemplo, una construcción de ADN recombinante puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que provienen de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes que provienen de la misma fuente y se disponen de manera diferente a la encontrada en la naturaleza. Este constructo puede utilizarse por sí mismo o junto con un vector.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "vector" o "vector de ADN recombinante" puede ser un constructo que incluye un sistema de replicación y secuencias que son capaces de transcribir y traducir una secuencia codificadora de polipéptidos en una célula anfitriona determinada. Si se utiliza un vector, la elección del mismo depende del procedimiento que se utilizará para transformar las células anfitrionas, como es bien sabido por los expertos en la técnica. Los vectores pueden incluir, sin limitación, vectores plasmídicos y vectores AAV recombinantes, o cualquier otro vector conocido en esa técnica adecuada para entregar un gen que codifica una meganucleasa de la invención a una célula diana. La persona experta conoce bien los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector para transformar, seleccionar y propagar con éxito las células anfitrionas que comprenden cualquiera de los nucleótidos aislados o secuencias de ácido nucleico de la invención.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "vector" también puede referirse a un vector viral. Los vectores virales pueden incluir, sin limitación, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores adenovirales y vectores virales adenoasociados (AAV).
Tal como se usa en la presente memoria, un ARNm "policistrónico" se refiere a un solo ARN mensajero que comprende dos o más secuencias codificantes (es decir, cistrones) y codifica más de una proteína. Un ARNm policistrónico puede comprender cualquier elemento conocido en la técnica que permita la traducción de dos o más genes de la misma molécula de ARNm, incluidos, pero sin limitación, un elemento IRES, un elemento T2A, un elemento P2A, un elemento E2A y un elemento F2A.
Tal como se usa en la presente memoria, un "linfocito T humano" o "linfocito T" se refiere a un linfocito T aislado de un donante humano. Los linfocitos T humanos, y las células que provienen de los mismos, incluyen linfocitos T aislados que no se han pasado en cultivo, linfocitos T que han sido pasados y mantenidos en condiciones de cultivo celular sin inmortalización, y linfocitos T que han sido inmortalizados y se pueden mantener en condiciones de cultivo celular indefinidamente.
Tal como se usa en la presente memoria, un "control" o "célula de control" se refiere a una célula que proporciona un punto de referencia para medir cambios en el genotipo o fenotipo de una célula modificada genéticamente. Una célula
de control puede comprender, por ejemplo: (a) una célula de tipo silvestre, es decir, del mismo genotipo como material de partida para la alteración genética que dio como resultado la célula modificada genéticamente; (b) una célula del mismo genotipo que la célula modificada genéticamente pero que se ha transformado con una construcción nula (es decir, con una construcción que no tiene ningún efecto conocido sobre el rasgo de interés); o, (c) una célula genéticamente idéntica a la célula modificada genéticamente pero que no está expuesta a condiciones o estímulos o modificaciones genéticas adicionales que inducirían la expresión de un genotipo o fenotipo alterado.
Tal como se usa en la presente memoria, la mención de un intervalo numérico para una variable pretende transmitir que la invención se puede poner en práctica con la variable igual a cualquiera de los valores dentro de ese intervalo. Por lo tanto, para una variable que es inherentemente discreta, la variable puede ser igual a cualquier valor entero dentro del intervalo numérico, incluyendo los puntos finales del intervalo. De manera similar, para una variable que es inherentemente continua, la variable puede ser igual a cualquier valor real dentro del intervalo numérico, incluyendo los puntos finales del intervalo. Como ejemplo, y sin limitación, una variable que se describe que tiene valores entre 0 y 2 puede tomar los valores 0, 1 o 2 si la variable es inherentemente discreta, y puede tomar los valores 0,0, 0,1, 0,01, 0,001 o cualquier otro valor real >0 y <2 si la variable es inherentemente continua.
2.1 Principio de la invención
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención está basada parcialmente en el hallazgo de que las nucleasas diseñadas genéticamente pueden utilizarse para reconocer y escindir las secuencias de reconocimiento que se encuentran dentro del gen de la región constante alfa TCR humana (SEQ ID NÚM.: 1), de modo que NHEJ en el sitio de escisión interrumpe la expresión de la subunidad de la cadena alfa del TCR y, en última instancia, la expresión del receptor de linfocitos T en la superficie celular. Además, de acuerdo con la invención, se inserta una secuencia de polinucleótidos exógena en el gen de la región constante alfa del TCR en el sitio de escisión de la nucleasa, por ejemplo por recombinación homóloga, de tal manera que una secuencia de interés se expresa de manera simultánea en la célula. Dichas secuencias exógenas codifican un receptor de antígeno quimérico.
Por lo tanto, la presente invención permite tanto la desactivación del receptor de linfocitos T endógenos como la expresión de un receptor de antígeno quimérico que se dirige a un único sitio de reconocimiento con una única nucleasa modificada. La invención proporciona un procedimiento simplificado de producción de un linfocito T alogénico que expresa un CAR específico de antígeno y tiene una inactivación completa del TCR endógeno. Dichas células pueden presentar una inducción reducida o nula de la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) cuando se administra a un sujeto alogénico.
2.2 Nucleasas para reconocer y escindir secuencias de reconocimiento dentro del gen de región constante alfa del receptor de linfocitos T
Es sabido en la técnica que es posible usar una nucleasa específica del sitio para hacer una ruptura de ADN en el genoma de una célula viva, y que dicha ruptura de ADN puede dar como resultado una modificación permanente del genoma mediante la reparación de NHEJ mutagénico o mediante recombinación homóloga con una secuencia de ADN transgénico. NHEJ puede producir mutagénesis en el sitio de escisión, que da como resultado la inactivación del alelo. La mutagénesis asociada a NHEJ puede inactivar un alelo mediante la generación de codones de parada temprana, mutaciones de desplazamiento de marco que producen proteínas no funcionales anómalas, o podrían desencadenar mecanismos tales como la desintegración de ARNm mediada sin sentido. El uso de nucleasas para inducir mutagénesis a través de NHEJ se puede usar para que se dirija a una mutación específica o una secuencia presente en un alelo de tipo silvestre. Se sabe que el uso de nucleasas para inducir una rotura de doble cadena en un locus diana estimula la recombinación homóloga, en particular de las secuencias de ADN transgénicas flanqueadas por secuencias homólogas a la diana genómica. De este modo, se pueden insertar secuencias de ácido nucleico exógenas en un locus objetivo. Dichos ácidos nucleicos exógenos pueden codificar, por ejemplo, un receptor antigénico quimérico, un t Cr exógeno o cualquier secuencia o polipéptido de interés.
La invención se pone en práctica usando meganucleasas recombinantes.
En realizaciones preferidas, las nucleasas utilizadas para poner en práctica la invención son meganucleasas de cadena sencilla. Una meganucleasa de cadena sencilla comprende una subunidad N-terminal y una subunidad C-terminal unidas por un péptido enlazador. Cada uno de los dos dominios reconoce la mitad de la secuencia de reconocimiento (es decir, un semi-sitio de reconocimiento) y el sitio de escisión del ADN se encuentra en el centro de la secuencia de reconocimiento, cerca de la interfaz de las dos subunidades. Las roturas de la cadena de ADN se compensan con cuatro pares de bases, de modo que la escisión del ADN por una meganucleasa genera un par de salientes de cadena sencilla de cuatro pares de bases en 3'.
Las meganucleasas recombinantes de la invención se han diseñado genéticamente para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO:3). Tales meganucleasas recombinantes se denominan colectivamente en el presente documento como "meganucleasas TRC 1-2". Se proporcionan ejemplos de meganucleasas TRC 1-2 en las SEQ ID NO:8-27.
También se desvelan meganucleasas recombinantes que reconocen y escinden la secuencia de reconocimiento TRC 3-4 (SEQ ID NÚM.:4). Tales meganucleasas recombinantes se denominan colectivamente en el presente documento como "meganucleasas TRC 3-4". Se proporcionan ejemplos de meganucleasas TRC 3-4 en las SEQ ID NO:28 y 29.
También se desvelan meganucleasas recombinantes que reconocen y escinden la secuencia de reconocimiento TRC 7-8 (SEQ ID NÚM.:5). Tales meganucleasas recombinantes se denominan colectivamente en el presente documento como "meganucleasas TRC 7-8". Se proporcionan ejemplos de meganucleasas TRC 7-8 en las SEQ ID NO:30-32.
Las meganucleasas recombinantes de la divulgación comprenden una primera subunidad, que comprende una primera región hipervariable (HVR1) y una segunda subunidad, que comprende una segunda región hipervariable (HVR2). Además, la primera subunidad se une a un primer semisitio de reconocimiento en la secuencia de reconocimiento (por ejemplo, el semisitio TRC1, TRC3 o TRC7), y la segunda subunidad se une a un segundo semisitio de reconocimiento en la secuencia de reconocimiento (por ejemplo, el semisitio TRC2, TRC4, o TRC8). En realizaciones en las que la meganucleasa recombinante es una meganucleasa monocatenaria, la primera y la segunda subunidades se pueden orientar de manera que la primera subunidad, que comprende la región HVR1 y se une al primer semisitio, se posiciona como la subunidad N-terminal, y la segunda subunidad, que comprende la región HVR2 y se une al segundo semisitio, se posiciona como la subunidad C-terminal. En realizaciones alternativas, la primera y la segunda subunidades están orientadas de tal manera que la primera subunidad, que comprende la región HVR1 y se une al primer medio sitio, se posiciona como la subunidad C-terminal, y la segunda subunidad, que comprende la región HVR2 y se une al segundo medio sitio, se posiciona como la subunidad N-terminal. Los ejemplos de meganucleasas TRC 1-2 de la invención se proporcionan en la Tabla 1. Se proporcionan ejemplos de meganucleasas TRC 3-4 en la Tabla 2. Se proporcionan ejemplos de meganucleasas TRC 7-8 en la Tabla 3.
Tabla 1. Meganucleasas recombinantes ejemplares diseñadas genéticamente para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO:3)
Tabla 2. Meganucleasas recombinantes ejemplares diseñadas genéticamente para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 3-4 (SEQ ID NO:4)
Tabla 3. Meganucleasas recombinantes ejemplares diseñadas genéticamente para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 7-8 (SEQ ID NO:5)
2.3 Procedimientos para producir células genéticamente modificadas
La invención proporciona procedimientos de producción de células modificadas genéticamente usando nucleasas diseñadas genéticamente que reconocen y escinden las secuencias de reconocimiento que se encuentran dentro del gen de la región constante alfa TCR humana (SEQ ID NÚM.: 1). La escisión en tales secuencias de reconocimiento puede permitir NHEJ en el sitio de escisión y la expresión alterada de la subunidad de la cadena alfa del receptor de linfocitos T humanos, lo que lleva a una expresión y/o función reducida del receptor de linfocitos T en la superficie celular. Además, la escisión en tales secuencias de reconocimiento puede permitir además la recombinación homóloga de secuencias de ácido nucleico exógenas directamente en el gen de la región constante alfa de TCR.
Las meganucleasas recombinantes de la invención se pueden administrar a una célula en forma de proteína o, preferentemente, como un ácido nucleico que codifica la meganucleasa recombinante. Dicho ácido nucleico puede ser ADN (por ejemplo, ADN plasmídico circular o linealizado o productos de PCR) o ARN. Para realizaciones en las que la secuencia codificante de meganucleasa recombinante se administra en forma de ADN, debería estar operativamente unido a un promotor para facilitar la transcripción del gen de la meganucleasa. Los promotores de mamíferos adecuados para la invención incluyen promotores constitutivos tales como el promotor temprano de citomegalovirus (CMV) (Thomsen y col. (1984), Proc Natl Acad Sci USA. 81(3):659-63) o el promotor temprano del SV40 (Benoist y Chambon (1981), Nature. 290(5804):304-10) así como promotores inducibles como el promotor inducible por tetraciclina (Dingermann et al. (1992), Mol Cell Biol. 12(9):4038-45).
En algunas realizaciones, el ARNm que codifica la meganucleasa recombinante se administra a la célula porque esto reduce la probabilidad de que el gen que codifica la meganucleasa recombinante se integre en el genoma de la célula. Tal ARNm que codifica una meganucleasa recombinante se puede producir usando procedimientos conocidos en la técnica tales como transcripción in vitro. En algunas realizaciones, el ARNm se tapa usando 7-metil-guanosina. En algunas realizaciones, el ARNm puede estar poliadenilado.
En realizaciones particulares, un ARNm que codifica una meganucleasa recombinante de la invención puede ser un ARNm policistrónico que codifica dos o más nucleasas que se expresan simultáneamente en la célula. Un ARNm policistrónico puede codificar dos o más nucleasas de la invención que se dirigen a diferentes secuencias de
reconocimiento en el mismo gen diana. Como alternativa, un ARNm policistrónico puede codificar al menos una nucleasa descrita en el presente documento y al menos una nucleasa adicional que se dirige a una secuencia de reconocimiento separada posicionada en el mismo gen, o que se dirige a una segunda secuencia de reconocimiento posicionada en un segundo gen de modo que se produzcan sitios de escisión en ambos genes. Un ARNm policistrónico puede comprender cualquier elemento conocido en la técnica que permita la traducción de dos o más genes (es decir, cistrones) de la misma molécula de ARNm, incluidos, pero sin limitación, un elemento IRES, un elemento T2A, un elemento P2A, un elemento E2A y un elemento F2A.
En algunas realizaciones, las proteínas meganucleasas recombinantes, o ADN/ARNm que codifica las meganucleasas recombinantes, se acoplan a un péptido penetrante celular o un ligando de direccionamiento para facilitar la captación celular. Los ejemplos de péptidos penetrantes de células conocidos en la técnica incluyen poliarginina (Jearawiriyapaisarn, y col. (2008) Mol Ther. 16:1624-9), el péptido TAT del virus del VIH (Hudecz et al. (2005), Med. Res. Rev. 25: 679-736), MPG (Simeoni, et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2717-2724), Pep-1 (Deshayes et al. (2004) Biochemistry 43: 7698-7706y HSV-1 VP-22 (Deshayes et al. (2005) Cell Mol Life Sci. 62:1839-49. En una realización alternativa, meganucleasas recombinantes, o ADN/ARNm que codifica meganucleasas recombinantes, se acoplan de forma covalente o no covalente a un anticuerpo que reconoce un receptor específico de la superficie celular expresado en las células diana de manera que la proteína nucleasa/ADN/ARNm se une a las células diana e internaliza. Como alternativa, la proteína/ADN/ARNm de meganucleasa recombinante se puede acoplar covalentemente o no covalentemente al ligando natural (o una porción del ligando natural) para dicho receptor de superficie celular. (McCall, y col. (2014) Tissue Barriers. 2(4):e944449; Dinda, y col. (2013) Curr Pharm Biotechnol. 14:1264-74 Kang, et al. (2014) Curr Pharm Biotechnol. 15(3):220-30 Qian et al. (2014) Expert Opin DrugMetab Toxicol. 10(11): 1491-508).
En algunas realizaciones, las proteínas meganucleasas recombinantes, o ADN/ARNm que codifica las meganucleasas recombinantes, están acoplados covalentemente o, preferentemente, no covalentemente a una nanopartícula o encapsulado dentro de dicha nanopartícula utilizando procedimientos conocidos en la técnica (Sharma y col. (2014) Biomed Res Int. 2014). Una nanopartícula es un sistema de suministro a nanoescala cuya escala de longitud es <1 |jm, preferentemente <100 nm. Dichas nanopartículas se pueden diseñar utilizando un núcleo compuesto de metal, lípido, polímero, o macromolécula biológica, y se pueden unir o encapsular múltiples copias de las proteínas, ARNm o ADN de la meganucleasa recombinante con el núcleo de nanopartículas. Esto aumenta el número de copias de la proteína/ARNm/ADN que se administra a cada célula y, por lo tanto, aumenta la expresión intracelular de cada meganucleasa recombinante para maximizar la probabilidad de que se corten las secuencias de reconocimiento diana. La superficie de tales nanopartículas se puede modificar adicionalmente con polímeros o lípidos (por ejemplo, quitosán, polímeros catiónicos, o lípidos catiónicos) para formar una nanopartícula de núcleo revestido cuya superficie confiere funcionalidades adicionales para mejorar el suministro celular y la absorción de la carga útil (Jian y col. (2012) Biomaterials. 33(30): 7621-30). Además, las nanopartículas pueden acoplarse ventajosamente a moléculas de orientación para dirigir la nanopartícula al tipo de célula apropiado y/o aumentar la probabilidad de captación celular. Los ejemplos de tales moléculas de direccionamiento incluyen anticuerpos específicos para los receptores de la superficie celular y los ligandos naturales (o porciones de los ligandos naturales) para los receptores de la superficie celular.
En algunas realizaciones, las meganucleasas recombinantes o el ADN/ARNm que codifica las meganucleasas recombinantes, están encapsulados dentro de los liposomas o forman complejos con lípidos catiónicos (véase, por ejemplo, Lipofectamine™, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA; Zuris y col. (2015) Nat Biotechnol. 33: 73-80; Mishra y col. (2011) J Drug Deliv. 2011:863734). Las formulaciones de liposomas y lipoplex pueden proteger la carga útil de la degradación y facilitar la absorción celular y la eficiencia de la administración a través de la fusión y/o la alteración de las membranas celulares de las células.
En algunas realizaciones, las proteínas meganucleasas recombinantes, o ADN/ARNm que codifica las meganucleasas recombinantes, se encapsulan dentro de armazones poliméricos (por ejemplo, PLGA) o forman complejos usando polímeros catiónicos (por ejemplo, PEI, PLL) (Tamboli y col. (2011) Ther Deliv. 2(4): 523-536).
En algunas realizaciones, las proteínas meganucleasas recombinantes, o ADN/ARNm que codifica las meganucleasas recombinantes, se combinan con moléculas anfifílicas que se autoensamblan en micelas (Tong y col. (2007) J Gene Med. 9(11): 956-66). Las micelas poliméricas pueden incluir una cubierta micelar formada con un polímero hidrófilo (por ejemplo, polietilenglicol) que puede prevenir la agregación, enmascarar las interacciones de carga y reducir las interacciones inespecíficas fuera de la célula.
En algunas realizaciones, las proteínas meganucleasas recombinantes, o ADN/ARNm que codifica las meganucleasas recombinantes, se formulan en una emulsión o una nanoemulsión (es decir, que tiene un diámetro de partícula promedio de <1 nm) para la administración a la célula. El término "emulsión" se refiere a, sin limitación, cualquier dispersión o gotitas de aceite en agua, agua en aceite, agua en aceite en agua o aceite en agua en aceite, incluidas las estructuras lipídicas que se pueden formar como resultado de fuerzas hidrófobas que llevan los restos apolares (por ejemplo, largas cadenas de hidrocarburos) lejos del agua y los grupos de cabeza polar hacia el agua, cuando una fase inmiscible en agua se mezcla con una fase acuosa. Estas otras estructuras lipídicas incluyen, pero sin limitación, vesículas lipídicas unilamelares, paucilamelares y multilamelares, micelas y fases lamelares. Las emulsiones están compuestas por una fase acuosa y una fase lipofílica (que suele contener un aceite y un disolvente orgánico). Las emulsiones también suelen contener uno o más tensioactivos. Las formulaciones en nanoemulsión son bien
conocidas, por ejemplo, las descritas en la Solicitud de Patente de EE. UU. Núm.
2002/0045667 y 2004/0043041y Patente de EE. UU. Núm. 6.015.832, 6.506.803, 6.635.676, y 6.559.189.
En algunas realizaciones, las proteínas meganucleasas recombinantes, o ADN/ARNm que codifica las meganucleasas recombinantes, están unidos covalentemente o asociados no covalentemente a, conjugados poliméricos multifuncionales, dendrímeros de ADN y dendrímeros poliméricos (Mastorakos y col. (2015) Nanoscale. 7(9): 3845 56; Cheng y col. (2008) J Pharm Sci. 97(1): 123-43). La generación de dendrímeros puede controlar la capacidad y el tamaño de la carga útil, y puede proporcionar una alta capacidad de carga útil. Además, la presentación de múltiples grupos de superficie se puede aprovechar para mejorar la estabilidad y reducir las interacciones inespecíficas.
En algunas realizaciones, los genes que codifican una meganucleasa recombinante se introducen en una célula utilizando un vector vírico. Tales vectores son conocidos en la técnica e incluyen vectores lentivíricos, vectores adenovíricos y vectores de virus adenoasociados (AAV) (revisados en Vannucci, y col. (2013 New Microbiol. 36:1-22). Los vectores de AAV recombinantes útiles en la invención pueden tener cualquier serotipo que permita la transducción del virus en la célula y la inserción del gen de la nucleasa en el genoma celular. En realizaciones particulares, los vectores de AAV recombinantes tienen un serotipo de AAV2 o AAV6. En particular, los vectores AAV recombinantes tienen un serotipo de AAV2 o AAV6. Los vectores AAV recombinantes también pueden ser autocomplementarios, de modo que no requieren la síntesis de ADN de segunda cadena en la célula huésped (McCarty, et al. (2001) Gene Ther. 8:1248-54).
Si los genes de la meganucleasa recombinante se administran en forma de ADN (por ejemplo, plásmido) y/o a través de un vector vírico (por ejemplo, AAV) deben estar operativamente enlazados a un promotor. AAV) deben estar vinculados de forma operativa a un promotor. En algunas realizaciones, este puede ser un promotor vírico tal como promotores endógenos del vector vírico (por ejemplo, el LTR de un vector lentivírico) o los promotores tempranos conocidos de citomegalovirus o virus SV40. En una realización preferente, los genes de nucleasa están operativamente unidos a un promotor que dirige la expresión génica preferentemente en la célula diana (por ejemplo, un linfocito T humano).
La invención proporciona además la introducción de un ácido nucleico exógeno en la célula, de tal manera que la secuencia de ácido nucleico exógeno se inserta en el gen de la región constante de TRC alfa en un sitio de escisión de nucleasa. En algunas realizaciones, el ácido nucleico exógeno comprende un brazo de homología en 5' y un brazo de homología en 3' para promover la recombinación de la secuencia de ácido nucleico en el genoma celular en el sitio de escisión de la nucleasa.
Los ácidos nucleicos exógenos de la invención se pueden introducir en la célula por cualquiera de los medios tratados anteriormente. En una realización particular, los ácidos nucleicos exógenos se introducen por medio de un vector vírico, tal como un lentivirus, retrovirus, adenovirus, o preferentemente un vector de AAV recombinante. Los vectores de AAV recombinantes útiles para introducir un ácido nucleico exógeno pueden tener cualquier serotipo que permita la transducción del virus en la célula y la inserción de la secuencia de ácido nucleico exógeno en el genoma celular. En particular, los vectores AAV recombinantes tienen un serotipo de AAV2 o AAV6. Los vectores AAV recombinantes también pueden ser autocomplementarios, de modo que no requieren la síntesis de ADN de segunda cadena en la célula huésped.
En otra realización particular, se puede introducir un ácido nucleico exógeno en la célula usando un molde de ADN monocatenario. El ADN monocatenario puede comprender el ácido nucleico exógeno y, en realizaciones preferidas, puede comprender brazos de homología en 5' y 3' para promover la inserción de la secuencia de ácido nucleico en el sitio de escisión de nucleasa por recombinación homóloga. El ADN monocatenario puede comprender además una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de 5' de AAV en la secuencia 5' aguas arriba del brazo de homología de 5', y una secuencia ITR de 3' de AAV en la secuencia 3' aguas abajo del brazo de homología de 3'.
En otra realización particular, los genes que codifican una endonucleasa de la invención y/o una secuencia exógena de ácido nucleico de la invención se pueden introducir en la célula mediante transfección con un molde de ADN linealizado. En algunos ejemplos, un ADN plasmídico que codifica una endonucleasa y/o una secuencia de ácido nucleico exógeno puede ser digerido por una o más enzimas de restricción de modo que el ADN plasmídico circular se linealice antes de la transfección en la célula.
Cuando se administra a una célula, un ácido nucleico exógeno de la invención se puede unir operativamente a cualquier promotor adecuado para la expresión del polipéptido codificado en la célula, incluyendo aquellos promotores de mamíferos y promotores inducibles tratados anteriormente. Un ácido nucleico exógeno de la invención también se puede unir operativamente a un promotor sintético. Los promotores sintéticos pueden incluir, sin limitación, el promotor JeT (WO 2002/012514).
Los linfocitos T humanos pueden requerir activación antes de la introducción de una meganucleasa y/o una secuencia de ácido nucleico exógeno. Por ejemplo, los linfocitos T se pueden poner en contacto con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 que son solubles o conjugados con un soporte (es decir, perlas) durante un período de tiempo suficiente para activar las células.
Las células modificadas genéticamente de la invención se pueden modificar adicionalmente para expresar uno o más genes suicidas inducibles, cuya inducción provoca la muerte celular y permite la destrucción selectiva de las células in vitro o in vivo. En algunos ejemplos, un gen suicida puede codificar un polipéptido citotóxico, un polipéptido que tiene la capacidad de convertir un profármaco no tóxico en un fármaco citotóxico, y/o un polipéptido que activa una vía de genes citotóxicos dentro de la célula. Es decir, un gen suicida es un ácido nucleico que codifica un producto que causa la muerte celular por sí mismo o en presencia de otros compuestos. Un ejemplo representativo de dicho gen suicida es uno que codifica la timidina quinasa del virus del herpes simple. Ejemplos adicionales son genes que codifican la timidina quinasa del virus varicela zóster y el gen bacteriano de la citosina desaminasa que puede convertir la 5-fluorocitosina en el compuesto altamente tóxico 5-fluorouracilo. Los genes suicidas también incluyen como ejemplos no limitantes genes que codifican caspasa-9, caspasa-8 o citosina desaminasa. En algunos ejemplos, la caspasa-9 se puede activar utilizando un inductor químico específico de dimerización (CID, por sus siglas en inglés). Un gen suicida también puede codificar un polipéptido que se expresa en la superficie de la célula que las hace sensibles a los anticuerpos monoclonales terapéuticos y/o citotóxicos. En ejemplos adicionales, un gen suicida puede codificar un polipéptido antigénico recombinante que comprende un motivo antigénico reconocido por el mAb anti-CD20 Rituximab y un epítopo que permite la selección de células que expresan el gen suicida. Véase, por ejemplo, el polipéptido RQR8 descrito en el documento WO2013153391, que comprende dos epítopos de unión a Rituximab y un epítopo de unión a QBEnd10. Para tal gen, se puede administrar Rituximab a un sujeto para inducir el agotamiento celular cuando sea necesario.
2.4 Composiciones farmacéuticas
En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una célula modificada genéticamente de la invención, o una población de células modificadas genéticamente de la invención, y un vehículo farmacéutico. Dichas composiciones farmacéuticas se pueden preparar de acuerdo con técnicas conocidas. Véase, por ejemplo Remington, The Science And Practice of Pharmacy (21sted. 2005). En la fabricación de una formulación farmacéutica de acuerdo con la invención, las células se mezclan típicamente con un vehículo farmacéuticamente aceptable y la composición resultante se administra a un sujeto. El vehículo debe, por supuesto, ser aceptable en el sentido de ser compatible con cualquier otro ingrediente en la formulación y no debe ser perjudicial para el sujeto. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender además uno o más agentes adicionales útiles en el tratamiento de una enfermedad en el sujeto. En realizaciones adicionales, cuando la célula modificada genéticamente es un linfocito T humano modificado genéticamente (o una célula que se obtiene del mismo), las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir además moléculas biológicas, tales como las citocinas (por ejemplo, IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21), que promueven la proliferación celular y el injerto in vivo. Las composiciones farmacéuticas que comprenden células genéticamente modificadas de la invención se pueden administrar en la misma composición que un agente adicional o molécula biológica o, como alternativa, se pueden coadministrar en composiciones separadas.
Las composiciones farmacéuticas de la divulgación son útiles para el tratamiento de cualquier estado de enfermedad al que se dirige la inmunoterapia adoptiva de linfocitos T. En una realización particular, las composiciones farmacéuticas de la divulgación son útiles en el tratamiento del cáncer. Dichos cánceres pueden incluir, sin limitación, carcinoma, linfoma, sarcoma, blastomas, leucemia, cánceres de origen de células B, cáncer de mama, cáncer gástrico, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer de pulmón, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de colon, carcinoma de células renales, cáncer de ovario, sarcoma de rabdomio, leucemia y linfoma de Hodgkin. En determinadas realizaciones, los cánceres de origen de células B incluyen, sin limitación, leucemia linfoblástica aguda de linaje B, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B y linfoma no Hodgkin de linfocitos B.
2.5 Procedimientos de producción de vectores de AAV recombinantes
También se desvelan vectores de AAV recombinantes para su uso en los procedimientos de la invención. Los vectores de AAV recombinantes se producen típicamente en líneas celulares de mamíferos tales como HEK-293. Dado que los genes víricos cap y rep se eliminan del vector para evitar que su autorreplicación deje espacio para que se administren los genes terapéuticos (por ejemplo, el gen de endonucleasa), es necesario proporcionar estos en trans en la línea celular de empaquetamiento. Además, es necesario proporcionar los componentes "auxiliares" (por ejemplo, adenovíricos) necesarios para soportar la replicación (Cots D, Bosch A, Chillon M (2013) Curr. Gene Ther. 13(5): 370 81). Con frecuencia, los vectores AAV recombinantes se producen utilizando una triple transfección en la que una línea celular se transfecta con un primer plásmido que codifica los componentes "ayudantes", un segundo plásmido que comprende los genes cap y rep, y un tercer plásmido que comprende los ITR virales que contienen la secuencia de ADN intermedia que se empaquetará en el virus. Las partículas víricas que comprenden un genoma (ITR y genes intervinientes de interés) encerrado en una cápside se aíslan de las células mediante ciclos de congelacióndescongelación, ultrasonidos, detergente u otros medios conocidos en la técnica. A continuación, las partículas se purifican mediante centrifugación en gradiente de densidad con cloruro de cesio o cromatografía de afinidad y, posteriormente, se entregan a losgenes de interés en células, tejidos u organismo, tal como un paciente humano.
Debido a que las partículas de AAV recombinantes generalmente se producen (fabrican) en las células, se deben tomar precauciones al poner en práctica la presente invención para garantizar que la endonucleasa específica del sitio NO se exprese en las células de empaquetamiento. Debido a que los genomas víricos de la invención comprenden una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa, cualquier endonucleasa expresada en la línea celular de
empaquetamiento será capaz de escindir el genoma vírico antes de que se pueda empaquetar en partículas víricas. Esto dará como resultado una eficacia de empaquetamiento reducida y/o el empaquetamiento de genomas fragmentados. Se pueden usar varios enfoques para prevenir la expresión de endonucleasa en las células de empaquetamiento, que incluyen:
1. La endonucleasa se puede colocar bajo el control de un promotor específico de tejido que no está activo en las células de empaquetamiento. Por ejemplo, si se desarrolla un vector vírico para la administración de (un) gen (o genes) de endonucleasa al tejido muscular, se puede utilizar un promotor específico del músculo. Entre los ejemplos de promotores específicos para el músculo se encuentran el C5-12 (Liu, et al. (2004) Hum Gene Ther. 15:783-92), el promotor de la creatina quinasa específica del músculo (MCK) (Yuasa, et al. (2002) Gene Ther. 9:1576-88), o el promotor del músculo liso 22 (SM22) (Haase, et al. (2013) BMC Biotechnol.
13:49-54). Algunos ejemplos de promotores específicos del SNC (neuronas) son los promotores de NSE, Synapsin y MeCP2 (Lentz, et al. (2012) Neurobiol Dis. 48:179-88). Los ejemplos de promotores específicos del hígado incluyen los promotores de la albúmina (tal como Palb), la a1-antitripsina humana (como Pa1AT) y la hemopexina (tal como Phpx) (Kramer, MG et al., (2003) Mol. Therapy 7:375-85). Los ejemplos de promotores específicos para el ojo incluyen la opsina y los promotores K12 específicos para el epitelio corneal (Martin KRG, Klein RL y Quigley HA (2002) Methods (28): 267-75) (Tong Y, et al., (2007) J Gene Med, 9:956-66). Estos promotores u otros promotores específicos de tejido conocidos en la técnica, no son altamente activos en las células HEK-293 y, por lo tanto, no se espera que produzca niveles significativos de expresión del gen de endonucleasa en células de empaquetamiento cuando se incorporan a los vectores víricos de la presente invención. De manera similar, los vectores víricos de la presente invención contemplan el uso de otras líneas celulares con el uso de promotores específicos de tejido incompatibles (es decir, la conocida línea celular HeLa (célula epitelial humana) y que utiliza el promotor de hemopexina específico del hígado). Otros ejemplos de promotores específicos de tejidos incluyen: sarcomas sinoviales PDZD4 (cerebelo), C6 (hígado), ASB5 (músculo), PPP1R12B (corazón), SLC5A12 (riñón), regulación del colesterol ApOM (hígado), ADPRHL1 (corazón) y síndromes de malformación monogénica TP73L (músculo). (Jacox E, et al., (2010) PLoS One v.5(8):e12274).
2. Como alternativa, el vector se puede empaquetar en células de una especie diferente en la que no es probable que se exprese la endonucleasa. Por ejemplo, las partículas virales pueden producirse en células microbianas, de insectos o de plantas utilizando promotores de mamíferos, tales como los bien conocidos promotores tempranos del citomegalovirus o del virus SV40, que no son activos en las células de empaquetamiento no mamíferas. En una realización preferente, las partículas virales se producen en células de insectos utilizando el sistema de baculovirus descrito por Gao, et al. (Gao, H., et al. (2007) J. Biotechnol.
131(2): 138-43). Es poco probable que una endonucleasa bajo el control de un promotor de mamífero se exprese en estas células (Airenne, KJ, et al. (2013) Mol. Ther. 21(4):739-49). Además, las células de los insectos utilizan motivos de empalme de ARNm diferentes a los de las células de los mamíferos. Así, es posible incorporar un intrón de mamífero, como el intrón de la hormona del crecimiento humano (HGH) o el intrón del antígeno T grande del SV40, en la secuencia de codificación de una endonucleasa. Dado que estos intrones no se empalman eficazmente a partir de los transcritos de pre-ARNm en las células de los insectos, éstas no expresarán una endonucleasa funcional y empaquetarán el genoma completo. Por el contrario, las células de mamífero a las que se administran las partículas de AAV recombinantes resultantes empalmarán adecuadamente el pre-ARNm y expresarán la proteína endonucleasa funcional. Haifeng Chen ha informado del uso de los intrones del antígeno HGH y del antígeno T grande del SV40 para atenuar la expresión de las proteínas tóxicas barnasa y fragmento A de la toxina de la difteria en células de empaquetamiento de insectos, lo que permite la producción de vectores AAV recombinantes que portan estos genes de toxinas (Chen, H (2012) Mol Ther Nucleic Acids. 1(11): e57).
3. El gen de la endonucleasa se puede unir operativamente a un promotor inducible de modo que se requiera un inductor de molécula pequeña para la expresión de la endonucleasa. Algunos ejemplos de promotores inducibles son el sistema Tet-On (Clontech Chen H., et al., (2015) BMC Biotechnol. 15(1):4)) y el sistema RheoSwitch (Intrexon Sowa G., et al., (2011) Spine, 36(10): E623-8). Ambos sistemas, al igual que otros similares conocidos en la técnica, se basan en factores de transcripción inducibles por ligando (variantes del represor Tet y del receptor Ecdysone, respectivamente) que activan la transcripción en respuesta a un activador de molécula pequeña (Doxiciclina o Ecdysone, respectivamente). La práctica de la presente invención utilizando dichos activadores de transcripción inducibles por ligando incluye: 1) colocar el gen de la endonucleasa bajo el control de un promotor que responde al factor de transcripción correspondiente, el gen de endonucleasa tiene (un) sitio (o sitios) de unión para el factor de transcripción; y 2) incluir el gen que codifica el factor de transcripción en el genoma vírico empaquetado. El último paso es necesario porque la endonucleasa no se expresará en las células o tejidos diana después del suministro de AAV recombinante si el activador de la transcripción no se proporciona también a las mismas células. El activador de la transcripción induce entonces la expresión del gen de la endonucleasa sólo en las células o tejidos que son tratados con el activador de molécula pequeña afín. Este enfoque es ventajoso porque permite regular la expresión del gen de la endonucleasa de forma espacio-temporal, seleccionando cuándo y a qué tejidos se administra el inductor de moléculas pequeñas. Sin embargo, el requisito de incluir el inductor en el genoma viral, que tiene una capacidad de carga significativamente limitada, crea un inconveniente para este enfoque.
4. En otra realización preferida, las partículas AAV recombinantes se producen en una línea celular de mamífero que expresa un represor de la transcripción que impide la expresión de la endonucleasa. Los represores de la transcripción son conocidos en la técnica e incluyen el represor Tet, el represor Lac, el represor Cro y el represor Lambda. Muchos receptores hormonales nucleares, tales como el receptor de la ecdisona, también actúan como represores de la transcripción en ausencia de su ligando hormonal correspondiente. Para poner en práctica la invención actual, las células de empaquetamiento se transfectan/transducen con un vector que codifica un represor de la transcripción y el gen de la endonucleasa en el genoma vírico (vector de empaquetamiento) está operativamente unido a un promotor que se modifica para que comprenda sitios de unión para el represor de manera que el represor silencia al promotor. El gen que codifica el represor de la transcripción se puede colocar en una variedad de posiciones. Se puede codificar en un vector separado; puede incorporarse al vector de empaquetamiento fuera de las secuencias ITR; puede incorporarse al vector cap/rep o al vector auxiliar adenoviral; o, lo más preferentemente, puede integrarse de manera estable en el genoma de la célula de empaquetamiento de manera que se exprese de manera constitutiva. Los procedimientos para modificar promotores comunes de mamíferos para incorporar sitios represores de la transcripción son conocidos en la técnica. Por ejemplo, Chang y Roninson modificaron los promotores fuertes y constitutivos del CMV y del RSV para que incluyeran operadores para el represor Lac y demostraron que la expresión génica de los promotores modificados estaba muy atenuada en las células que expresaban el represor (Chang BD, y Roninson IB (1996) Gene 183:137-42). El uso de un represor de la transcripción no humano garantiza que la transcripción del gen de la endonucleasa se reprimirá sólo en las células de empaquetamiento que expresan el represor y no en las células o tejidos diana transducidos con el vector AAV recombinante resultante.
2.6 Variantes de nucleasa diseñadas genéticamente
Se desvelan nucleasas diseñadas genéticamente, y particularmente las meganucleasas recombinantes, y sus variantes. Además se desvelan polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica las meganucleasas recombinantes descritas en el presente documento, y variantes de tales polinucleótidos.
Tal como se usa en la presente memoria, "variantes" pretende significar secuencias sustancialmente similares. Por polipéptido "variante" se entiende un polipéptido derivado del polipéptido "nativo" por deleción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios internos de la proteína nativa y/o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios del polipéptido nativo. Tal y como se utiliza aquí, un polinucleótido o polipéptido "nativo" comprende una secuencia parental de la que se derivan variantes. Las variantes de los polipéptidos comprendidas en las realizaciones son biológicamente activas. Es decir, continúan poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína natural; es decir, la capacidad de reconocer y escindir secuencias de reconocimiento que se encuentran en la región constante alfa del receptor de linfocitos T humanos (SEQ ID NÚM.:1), que incluyen, por ejemplo, la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (Se Q ID NÚM.:3), la secuencia de reconocimiento TRC 3-4 (Se Q ID NÚM.:4) y la secuencia de reconocimiento TRC 7-8 (SEQ ID NÚM.:5). Dichas variantes pueden, por ejemplo, ser resultado de la manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de un polipéptido natural (por ejemplo, las SEQ ID NÚM.:8-32), o las variantes biológicamente activas de las subunidades de unión del semisitio de reconocimiento descritas en la presente memoria (por ejemplo, la SEQ ID NÚM.:33-82), tendrán al menos aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 91 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 93 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 % o aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos del polipéptido natural o de la subunidad natural, según lo determinado por los programas de alineación de secuencia y los parámetros descritos en otra parte de la presente memoria. Una variante biológicamente activa de un polipéptido 0 subunidad puede diferir de ese polipéptido o subunidad en tan solo unos 1-40 restos de aminoácidos, tan poco como alrededor de 1-20, tan poco como alrededor de 1-10, tan poco como alrededor de 5, tan poco como 4, 3, 2 o incluso 1 resto de aminoácido.
Los polipéptidos se pueden alterar de varias maneras, incluidas las sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los procedimientos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de la secuencia de aminoácidos se pueden preparar mediante mutaciones en el ADN. Los procedimientos para mutagénesis y alteraciones de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382 Pat. de EE.Uu . Núm. 4.873.192 Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) y las referencias allí citadas. Se pueden encontrar directrices sobre las sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan a la actividad biológica de la proteína de interés en el modelo de Dayhoff y col. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.). Las sustituciones conservadoras, tales como el cambio de un aminoácido por otro con propiedades similares, pueden ser óptimas.
Se ha identificado previamente un número sustancial de modificaciones de aminoácidos en el dominio de reconocimiento de a Dn de la meganucleasa I-CreI de tipo silvestre (por ejemplo, el documento US 8.021.867) que, individualmente o en combinación, da como resultado meganucleasas recombinantes con especificidades alteradas
en bases individuales dentro del semisitio de la secuencia de reconocimiento de ADN, de tal modo que las meganucleasas resultantes diseñadas racionalmente tienen especificidades de semisitio diferentes de la enzima de tipo silvestre. La Tabla 4 proporciona posibles sustituciones que se pueden realizar en un monómero o subunidad de meganucleasa recombinante para mejorar la especificidad basada en la base presente en cada posición del semisitio (-1 a -9) de un semisitio de reconocimiento.
Tabla 4.
En el caso de los polinucleótidos, una "variante" comprende una deleción y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios dentro del polinucleótido nativo. Un experto en la materia reconocerá que las variantes de los ácidos nucleicos desveladas en el presente documento se construirán de manera que se mantenga el marco de lectura abierto. Para los polinucleótidos, las variantes de conservación incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos desvelados en la presente memoria. Las variantes de polinucleótidos incluyen polinucleótidos que se obtienen sintéticamente, tales como los generados, por ejemplo, usando mutagénesis de sitio dirigido pero que todavía codifican una meganucleasa recombinante desvelada en el presente documento. En general, las variantes de un polinucleótido particular desvelado en el presente documento tendrán al menos aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 91 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 93 %, aproximadamente el 94 %,
aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o más de identidad de secuencia para ese polinucleótido particular según lo determinado por los programas de alineación de secuencia y los parámetros descritos en otra parte del presente documento. Las variantes de un polinucleótido particular (es decir, el polinucleótido de referencia) también se pueden evaluar mediante la comparación del porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por una variante de polinucleótido y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia.
No se espera que las deleciones, inserciones y sustituciones de las secuencias de proteínas incluidas en la presente memoria produzcan cambios radicales en las características del polipéptido. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, deleción o inserción antes de hacerlo, un experto en la materia apreciará que el efecto se evaluará mediante el cribado del polipéptido para determinar su capacidad de reconocer y escindir preferentemente secuencias de reconocimiento que se encuentran dentro del gen de la región constante del receptor de linfocitos T humanos (SEQ ID NO: 1).
Ejemplos
Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes. Los ejemplos que no están dentro del ámbito de las reivindicaciones se proporcionan solo con fines ilustrativos.
Ejemplo 1
Caracterización de meganucleasas que reconocen y escinden secuencias de reconocimiento de TRC
1. Meganucleasas que reconocen y escinden la secuencia de reconocimiento TRC 1-2
Las meganucleasas recombinantes (SEQ ID NO: 8-27), denominadas colectivamente en el presente documento como "meganucleasas TRC 1-2" se diseñaron genéticamente para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO: 3), que está presente en la región constante alfa del receptor de linfocitos T humanos. Cada meganucleasa recombinante TRC 1-2 comprende una señal de localización de nucleasa N-terminal que proviene del SV40, una primera subunidad de meganucleasa, una secuencia de enlazador y una segunda subunidad de meganucleasa. Una primera subunidad en cada meganucleasa TRC 1-2 se une al semisitio de reconocimiento TRC1 de la SEQ ID NO: 3, mientras que una segunda subunidad se une al semisitio de reconocimiento de TRC2 (véase la Figura 1A).
Tal como se ilustra en las Figuras 2 y 3, las subunidades de unión a TRC1 y las subunidades de unión a TRC2 comprenden, cada una, una región hipervariable de 56 pares de bases, denominadas HVR1 y HVR2, respectivamente. Las subunidades de unión a TRC1 son idénticas fuera de la región HVR1 excepto en la posición 80 o la posición 271 (que comprende un resto Q o E), y están altamente conservadas dentro de la región HVR1. De manera similar, las subunidades de unión a TRC2 también son idénticas fuera de la región HVR2, excepto en la posición 80 o la posición 271 (que comprende un resto Q o E), y en la posición 330 de las meganucleasas TRC 1-2x.87 EE, TRC 1-2x.87 QE, TRC 1-2x.87 EQ, TRC 1-2x.87 y TRC 1-2x.163, que comprenden un resto R (gris sombreado y subrayado). Al igual que la región HVR1, la región HVR2 también está altamente conservada.
Las regiones de unión a TRC1 de la SEQ ID NO:8-27 se ilustran en la Figura 2 y se proporcionan como las SEQ ID NO: 33-52, respectivamente. Cada una de las SEQ ID NO:33-52 comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:33, que es la región de unión a TRC1 de la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE (SEQ ID NO:8). Las regiones de unión a TRC2 de la SEQ ID NO:8-27 se ilustran en la Figura 3 y se proporcionan como las SEQ ID NO:58-77, respectivamente. Cada una de las SEQ ID NO:58-77 comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:58, que es la región de unión a TRC2 de la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE (SEQ ID NO:8).
2. Meganucleasas que reconocen y escinden la secuencia de reconocimiento TRC 3-4
Las meganucleasas recombinantes (SEQ ID NO: 28 y 29), denominadas colectivamente en el presente documento "TRC 3-4 meganucleasas", se diseñaron genéticamente para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 3-4 (SEQ ID NO: 4), que está presente en la región constante alfa del receptor de linfocitos T humanos. Cada meganucleasa recombinante TRC 3-4 comprende una señal de localización de nucleasa N-terminal que proviene del SV40, una primera subunidad de meganucleasa, una secuencia de enlazador y una segunda subunidad de meganucleasa. Una primera subunidad en cada meganucleasa TRC 3-4 se une al semisitio de reconocimiento TRC3 de la SEQ ID NO: 4, mientras que una segunda subunidad se une al semisitio de reconocimiento de TRC4 (véase la Figura 1A).
Tal como se ilustra en las Figuras 4 y 5, las subunidades de unión a TRC3 y las subunidades de unión a TRC4 comprenden, cada una, una región hipervariable de 56 pares de bases, denominadas HVR1 y HVR2, respectivamente. Las subunidades de unión a TRC3 son idénticas fuera de la región HVR1 excepto en la posición 80 o la posición 271 (que comprende un resto Q o E), y están altamente conservadas dentro de la región HVR1. De manera similar, Las subunidades de unión a TRC4 también son idénticas fuera de la región HVR2 excepto en la posición 80 o la posición 271 (que comprende un resto Q o E), y están altamente conservadas dentro de la región HVR2.
Las regiones de unión a TRC3 de las SEQ ID NO:28 y 29 se ilustran en la Figura 4 y se proporcionan como las SEQ ID NO:53 y 54, respectivamente. Las SEQ ID NÚM.:53 y 54 comparten el 96,6 % de identidad de secuencia. Las regiones de unión a TRC3 de las SEQ ID NÚM.:28 y 29 se ilustran en la Figura 5 y se proporcionan como las SEQ ID NÚM.:78 y 79, respectivamente. Las SEQ ID NÚM.:78 y 79 comparten el 96,6 % de identidad de secuencia.
3. Meganucleasas que reconocen y escinden la secuencia de reconocimiento TRC 7-8
Las meganucleasas recombinantes (SEQ ID NO: 30-32), denominadas colectivamente en el presente documento como "meganucleasas TRC 7-8" se diseñaron genéticamente para reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 7-8 (SEQ ID NO: 5), que está presente en la región constante alfa del receptor de linfocitos T humanos. Cada meganucleasa recombinante TRC 7-8 comprende una señal de localización de nucleasa N-terminal que proviene del SV40, una primera subunidad de meganucleasa, una secuencia de enlazador y una segunda subunidad de meganucleasa. Una primera subunidad en cada meganucleasa TRC 7-8 se une al semisitio de reconocimiento TRC7 de la SEQ ID NO: 5, mientras que una segunda subunidad se une al semisitio de reconocimiento de TRC8 (véase la Figura 1A).
Tal como se ilustra en las Figuras 6 y 7, las subunidades de unión a TRC7 y las subunidades de unión a TRC8 comprenden, cada una, una región hipervariable de 56 pares de bases, denominadas HVR1 y HVR2, respectivamente. Las subunidades de unión a TRC7 son idénticas fuera de la región HVR1 excepto en la posición 80 o la posición 271 (que comprende un resto Q o E), y están altamente conservadas dentro de la región HVR1. De manera similar, las subunidades de unión a TRC8 también son idénticas fuera de la región HVR2 excepto en la posición 80 o la posición 271 (que comprende un resto Q o E), y están altamente conservadas dentro de la región HVR2.
Las regiones de unión a TRC7 de la SEQ ID NO:30-32 se ilustran en la Figura 6 y se proporcionan como las SEQ ID NO:55-57, respectivamente. Cada una de las SEQ ID NO:55-57 comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ iD NO:55, que es la región de unión a TRC7 de la meganucleasa TRC 7-8x.7 (SEQ ID NO:30). Las regiones de unión a TRC8 de las SEQ ID NO:30-32 se ilustran en la Figura 7 y se proporcionan como las SEQ ID NO: 80-82, respectivamente. Cada una de las SEQ ID NO:80-82 comparte al menos un 90 % de identidad de secuencia con la Se Q ID NO:80, que es la región de unión a TRC8 de la meganucleasa TRC 7-8x.7 (SEQ ID NO:30).
4. Escisión de secuencias de reconocimiento de región constante alfa del receptor de linfocitos T humanos en un ensayo de indicador de células CHO
Para determinar si las meganucleasas TRC 1-2, TRC 3-4 y TRC 7-8 podrían reconocer y escindir sus respectivas secuencias de reconocimiento (las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente), cada meganucleasa recombinante se evaluó usando el ensayo de indicador de células CHO descrito previamente (véase el documento WO/2012/167192 y la Figura 8). Para realizar los ensayos, se produjeron líneas indicadoras de células CHO que portaban un casete de expresión génica de proteína verde fluorescente no funcional (GFP) integrado en el genoma de las células. El gen de la GFP en cada línea celular fue interrumpido por un par de secuencias de reconocimiento de tal manera que la escisión intracelular de cualquiera de las secuencias de reconocimiento por una meganucleasa estimularía un evento de recombinación homóloga que daría lugar a un gen funcional de la GFP.
En las líneas celulares indicadoras CHO desarrolladas para este estudio, una secuencia de reconocimiento insertada en el gen GFP fue la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (SEQ ID NO: 3), la secuencia de reconocimiento TRC 3 4 (SEQ ID NO: 4) o la secuencia de reconocimiento TRC 7-8 (SEQ ID NO:5). La segunda secuencia de reconocimiento insertada en el gen GFP fue una secuencia de reconocimiento CHO-23/24, que es reconocida y escindida por una meganucleasa de control llamada "CHO-23/24". Las células indicadoras de CHO que comprenden la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2 y la secuencia de reconocimiento de CHO-23/24 se denominan en el presente documento "células TRC 1-2". Las células indicadoras de CHO que comprenden la secuencia de reconocimiento de TRC 3-4 y la secuencia de reconocimiento de CHO-23/24 se denominan en el presente documento "células TRC 3-4". Las células indicadoras de CHO que comprenden la secuencia de reconocimiento de TRC 7-8 y la secuencia de reconocimiento de CHO-23/24 se denominan en el presente documento "células TRC 7-8".
Las células indicadoras de CHO se transfectaron con ADN plasmídico que codifica sus correspondientes meganucleasas recombinantes (por ejemplo, las células TRC 1-2 se transfectaron con ADN plasmídico que codifica las meganucleasas TRC 1-2) o que codifica la meganucleasa CHO-23/34. En cada ensayo, las células indicadoras 4e5 CHO se transfectaron con 50 ng de ADN plasmídico en una placa de 96 pocillos usando Lipofectamina 2000 (ThermoFisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A las 48 horas después de la transfección, las células se evaluaron mediante citometría de flujo para determinar el porcentaje de células positivas para GFP en comparación con un control negativo no transfectado (TRC 1-2bs). Tal como se muestra en la Figura 9, se descubrió que las meganucleasas TRC 1-2, TRC 3-4 y TRC 7-8 producen células positivas para GFP en líneas celulares que comprenden su secuencia de reconocimiento correspondiente a frecuencias que exceden significativamente el control negativo.
La eficacia de las meganucleasas TRC 1-2x.87 QE, TRC 1-2x.87 EQ, y TRC 1-2x.87 EE también se determinó de una manera dependiente del tiempo. En este estudio, las células TRC 1-2 (1e6) se electroporaron con 1e6 copias de ARNm de meganucleasa por célula usando un BioRad Gene Pulser Xcell de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A
los 1, 4, 6, 8 y 12 días posteriores a la transfección, las células se evaluaron mediante citometría de flujo para determinar el porcentaje de células positivas para GFP. Tal como se muestra en la Figura 10, cada meganucleasa TRC 1-2 exhibió una alta eficiencia a los 2 días después de la transfección, con más del 50 % de células positivas para GFP observadas. Este efecto persistió durante el período de 12 días, sin evidencia de toxicidad celular observada.
5. Conclusiones
Estos estudios demostraron que las meganucleasas TRC 1-2, las meganucleasas TRC 3-4 y las meganucleasas TRC 7-8 abarcadas por la invención pueden dirigirse y escindir de manera eficaz sus respectivas secuencias de reconocimiento en las células.
Ejemplo 2
Escisión de secuencias de reconocimiento de TRC en linfocitos T y supresión de la expresión de receptor de linfocitos T de superficie celular
1. Escisión de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en células Jurkat
Este estudio demostró que las meganucleasas TRC 1-2 abarcadas por la invención podrían escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en las células Jurkat (una línea celular de linfocitos T humanos inmortalizados). Se electroporaron 1e6 células Jurkat con 8e6 copias de un ARNm de meganucleasa TRC 1-2 dado por célula usando un BioRad Gene Pulser Xcell de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A las 72 horas después de la transfección, se recolectó ADN genómico (ADNg) de las células y se realizó un ensayo de endonucleasa I T7 (T7E) para estimar la modificación genética en la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2 endógena (Figura 11). En el ensayo T7E, el locus TRC 1-2 se amplifica por PCR usando cebadores que flanquean la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Si hay indels (inserciones o deleciones aleatorias) dentro del locus t Rc 1-2, el producto de PCR resultante consistirá en una mezcla de alelos de tipo silvestre y alelos mutantes. El producto de PCR se desnaturaliza y se deja que se vuelva a hibridar lentamente. La rehibridación lenta permite la formación de heterodúplex que consisten en alelos mutantes y de tipo silvestre, que dan como resultado en bases y/o abultamientos no coincidentes. La enzima T7E1 se escinde en sitios que no coinciden, dando como resultado productos de escisión que se pueden visualizar mediante electroforesis en gel. La Figura 11 demuestra claramente que trece versiones diferentes de las meganucleasas TRC 1-2 generaron resultados positivos en el ensayo T7E1, que indica la generación eficaz de indels en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 endógena.
Para examinar más a fondo las propiedades de escisión de las meganucleasas TRC 1-2, se realizó un experimento de dosis-respuesta en células Jurkat. Se electroporaron 1e6 células Jurkat con 3 |jg o 1 |jg de un ARNm de meganucleasa TRC 1-2 dado por célula usando un BioRad Gene Pulser Xcell de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A las 96 horas tras la transfección, se recolectó el ADNg y el ensayo T7E1 se realizó tal como se describió anteriormente. Tal como se observa en la Figura 12, quince diferentes meganucleasas TRC 1-2 mostraron escisión en el sitio de reconocimiento endógeno de TRC 1-2, incluyendo tres versiones diferentes de la meganucleasa TRC 1-2x.87. La TRC 1-2x.87 EE funcionó especialmente bien, generando una señal fuerte en el ensayo T7E1 con poca o ninguna toxicidad en las células Jurkat.
2. Escisión de la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2 en linfocitos T humanos
Este estudio demostró que las meganucleasas de TRC 1-2 abarcadas por la invención podrían escindir la secuencia de reconocimiento de t Rc 1-2 en linfocitos T humanos obtenidos de un donante. Los linfocitos T CD3 se estimularon con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 durante 3 días, luego se electroporaron con ARNm que codifica la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE utilizando el Amaxa 4D-Nucleofector (Lonza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A los 3 días y 7 días después de la transfección, se recolectó el ADNg y el ensayo T7E1 se realizó tal como se describió anteriormente. La Figura 13A demuestra que TRC 1-2x.87 EE introdujo eficazmente mutaciones en la secuencia de reconocimiento endógena de TRC 1-2 en linfocitos T humanos, lo que indica que la meganucleasa reconoció y escindió la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. La intensidad de los productos de escisión no parece cambiar entre el día 3 y el día 7 después de la transfección, lo que sugiere poca o ninguna toxicidad debido a la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE. Para determinar si las mutaciones en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 endógena fueron suficientes para eliminar la expresión superficial del receptor de linfocitos T, las células se analizaron por citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-CD3. La Figura 13B muestra que aproximadamente el 50% de las linfocitos T transfectados se tiñeron de forma negativa para CD3, lo que indica un knockout del receptor de linfocitos T. La Figura 13B muestra que aproximadamente el 50 % de los linfocitos T transfectados se tiñeron negativamente para CD3, lo que indica la desactivación del receptor de linfocitos T. La población CD3 negativa no cambió significativamente entre el día 3 y el día 7 después de la transfección, lo que indica además toxicidad escasa o nula asociada con la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE, o la pérdida de la expresión del receptor de linfocitos T.
Para verificar que la pérdida de expresión de CD3 se debió a mutaciones en el sitio de reconocimiento TRC 1-2, el ADNg se recogió de linfocitos T transfectados y el locus del sitio de reconocimiento TRC 1-2 se amplificó por PCR. Los productos de PCR se clonaron en el vector pCR-romo usando el kit de clonación de PCR Zero Blunt (Thermo Fisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se recogieron colonias individuales y se secuenciaron los
plásmidos mini-preparados. La Figura 14 muestra secuencias de varias deleciones representativas que se observaron en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Las secuencias observadas son típicas de deleciones resultantes de la reparación de unión de extremos no homólogos de roturas de doble cadena de ADN generadas por endonucleasas.
Además de TRC 1-2x.87 EE, otras meganucleasas TRC 1-2 pudieron inactivar receptor de linfocitos T en linfocitos T humanos, incluidas TRC 1-2x.55 y TRC 1-2x.72, aunque en menor medida que la inactivación observada previamente para TRC 1-2x.87 EE (Tablas 5 y 6). TRC 1-2x.72 Q47E lleva una mutación en el sitio activo de la meganucleasa (aminoácido 47) y sirve como control negativo.
Tabla 5.
Tabla 6.
3. Conclusiones
Estos estudios demostraron que las meganucleasas TRC 1-2 abarcadas por la invención pueden reconocer y escindir la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en ambas células Jurkat (una línea celular de linfocitos T inmortalizados) y en linfocitos T obtenidos de un donante humano. Además, estos estudios demostraron que NHEJ ocurre en el sitio de escisión de meganucleasa, tal como lo demuestra la aparición de indels. Además, Se demostró que las meganucleasas TRC 1-2 reducen la expresión en la superficie celular del receptor de linfocitos T en linfocitos T humanos obtenidos de un donante.
Ejemplo 3
Vectores de AAV recombinantes para introducir ácidos nucleicos exógenos en linfocitos T humanos
1. Vectores AAV recombinantes
En el presente estudio, se diseñaron dos vectores de AAV recombinantes (denominados AAV405 y AAV406) para introducir una secuencia de ácido nucleico exógena, que comprende un sitio de restricción EagI, en el genoma de los linfocitos T humanos en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 mediante recombinación homóloga. Cada vector de AAV recombinante se preparó usando un protocolo de triple transfección, en el que una línea celular se transfecta con un primer plásmido que codifica componentes "auxiliares" (por ejemplo, adenovíricos) necesarios para dar soporte a la replicación, un segundo plásmido que comprende los genes cap y rep, y un tercer plásmido que comprende las repeticiones terminales invertidas víricas (ITR) que contienen la secuencia de ADN de intervención que se va a empaquetar en el virus (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico exógena) (véase, Cots D, Bosch A, Chillon M (2013) Curr. Gene Ther. 13(5): 370-81). La Figura 15 ilustra el enfoque general para usar vectores de AAV recombinantes para introducir una secuencia de ácido nucleico exógena en el genoma celular en el sitio de escisión de la nucleasa.
El AAV405 se preparó usando el plásmido ilustrado en la Figura 16 (SEQ ID NÚM.: 107). Tal como muestra, el plásmido AAV405 generalmente comprende secuencias para una 5' ITR, una secuencia potenciadora y promotora de CMV, un brazo de homología de 5', una secuencia de ácido nucleico que comprende el sitio de restricción de EagI, una secuencia de señal de poli(A) SV40, un brazo de homología de 3' y una ITR de 3'. El AAV406 se preparó usando el plásmido ilustrado en la Figura 17 (SEQ ID NÚM.: 108). Tal como muestra, el plásmido AAV406 comprende secuencias similares a las de AAV405, pero carece de las secuencias potenciadoras y promotoras de CMV aguas arriba del brazo de homología de 5'. Los estudios actuales de AAV incluyeron además el uso de un vector de AAV que codifica GFP (GFP-AAV), que se incorporó como control positivo para la eficacia de transducción de AAV.
2. Introducción de secuencias de ácido nucleico exógenas en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2
Para probar si los moldes de AAV serían adecuados para la reparación dirigida por homología (HDR, por sus siglas en inglés) después de la generación de una ruptura de doble cadena con meganucleasas TRC 1-2, se realizaron una serie de experimentos utilizando linfocitos T humanos. En el primer experimento, se determinó el momento de la electroporación con ARN de TRC 1-2 y la transducción con vectores AAV recombinantes. Los linfocitos T CD3+ humanos se estimularon con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 durante 3 días, luego se electroporaron con ARNm que codifica la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE (1 |jg) usando el Amaxa 4D-Nucleofector (Lonza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A las 2, 4 u 8 horas después de la transfección, se transdujo a las células con GFP-AAV (1e5 genomas víricos por célula). Las células se analizaron por citometría de flujo para la expresión de GFP a las 72 horas después de la transducción. Tal como se muestra en la Figura 18, la mayor eficacia de transducción se observó cuando las células se transdujeron a las 2 horas después de la transfección (88 % de células positivas para GFP). La eficacia de la transducción disminuyó significativamente a medida que aumentó el tiempo entre la transfección y la transducción, con el 78 % de células positivas para GFP a las 4 horas y el 65 % de células positivas para GFP a las 8 horas.
Habiendo determinado que se produjo una transducción vírica eficaz cuando las células se transdujeron 2 horas después de la transfección, los vectores AAV405 y AAV406 se usaron como moldes de HDR en linfocitos T humanos. Los linfocitos T CD3+ se estimularon y se transfectaron con 1 jg de ARNm de TRC 1-2x.87 EE tal como se describió anteriormente. A las 2 horas después de la transfección, las células se transdujeron con AAV405 o AAV406 (1e5 genomas víricos por célula). Como controles de solo transducción, las células se transfectaron por simulación (con agua) y se transdujeron con AAV405 o AAV406 (1e5 genomas víricos por célula). Para un control de meganucleasa solo, las células se transfectaron con TRC 1-2x.87 EE y luego se transdujeron de forma simulada (con agua) a las 2 horas después de la transfección.
Para determinar si los vectores AAV sirvieron como moldes de HDR, el ADNg se recolectó de las células y el locus TRC 1-2 se amplificó por PCR usando cebadores que reconocieron secuencias más allá de la región de homología en los vectores de AAV. Los cebadores de PCR fuera de las regiones de homología solo permitieron la amplificación del genoma de linfocitos T, no de los vectores AAV. Los productos de PCR se purificaron y se digirieron con EagI. La Figura 19 muestra la escisión de los productos de PCR amplificados a partir de células que se transfectaron con TRC 1-2x.87 EE y se transdujeron con cualquier vector AAV (véase las flechas), lo que indica la inserción del sitio EagI en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. EagI no escinde los productos de PCR de todas las poblaciones de células de control, lo que demuestra que la inserción del sitio EagI requiere la creación de una ruptura de doble cadena de ADN por una meganucleasa TRC 1-2.
Para definir mejor la inserción del sitio EagI en los linfocitos T humanos, se examinaron productos individuales del producto de PCR a granel. El producto de PCR no digerido generado a partir del experimento anterior se clonó en el vector pCR-romo usando el kit de clonación de PCR Zero Blunt (Thermo Fisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La PCR de colonias se realizó usando cebadores M13 directos e inversos (el pCR contundente contiene sitios de cebado M13 directo e inverso que flanquean el inserto) y una porción de productos de PCR de células transfectadas con TRC 1-2x.87 EE y AAV405 o AAV406 se analizaron mediante electroforesis en gel (Figuras 20A y 21A, respectivamente). En ambos casos, hay una mezcla de productos de PCR de longitud completa (aproximadamente 1600 pb), insertos más pequeños y algunos plásmidos vacíos (aproximadamente 300 pb). En este ensayo, las bandas más pequeñas que las de longitud completa pero más grandes que los plásmidos vacíos son a menudo secuencias que contienen grandes deleciones dentro de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. En paralelo, otra porción de productos de PCR se digirió con EagI para determinar el porcentaje de clones que contienen el sitio de reconocimiento de EagI insertado en la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2. Las Figuras 20B y 21B muestran que varios productos de PCR se escindieron con EagI (por ejemplo, Figura 20B, segunda fila, 6 carriles desde la izquierda), generando los fragmentos esperados de aproximadamente 700 y 800 pb. Estos geles permiten que la estimación de la inserción de EagI sea aproximadamente del 25 % y del 6 % para AAV405 y AAV406, respectivamente (ajustado para vectores vacíos).
Para confirmar las observaciones de la electroforesis en gel de productos de PCR sin cortar y digerir con EagI, se secuenció la porción restante de cada producto de PCR. La Figura 22A muestra secuencias de varias deleciones e inserciones representativas que se observaron en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Estas secuencias son típicas de secuencias resultantes de la reparación de unión de extremos no homólogos de roturas de doble cadena de ADN generadas por endonucleasas. Todos los productos de PCR que se escindieron con EagI contenían un sitio EagI insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (Figura 22B).
3. Eficacia de transducción de AAV mejorada
A la luz de la observación de que la transducción de AAV fue más eficaz cuando se llevó a cabo 2 horas después de la transfección que cuando se llevó a cabo más tarde, se realizó un experimento para optimizar el tiempo de transfección y transducción. Los linfocitos T CD3+ humanos se estimularon con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 durante 3 días, luego se electroporó con la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE (1 |jg) usando el Amaxa 4D-Nucleofector (Lonza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Inmediatamente después de la transfección o 2 horas después de la transfección, se transdujo a las células con GFP-AAV (1e5 genomas víricos por célula). Además, las células no estimuladas se transdujeron con GFP-AAV (1e5 genomas víricos por célula). A las 72 horas tras la transducción, la expresión de GFP en las células se analizó mediante citometría de flujo. La Figura 23 muestra que la transducción de GFP-AAV realizada 2 horas después de la transfección dio como resultado un 90 % de células positivas para GFP, pero esa transducción inmediatamente después de la transfección dio como resultado un 98 % de células positivas para GFP. Los linfocitos T restantes parecían refractivos a la transducción de AAV, con aproximadamente el 0 % de células positivas para GFP. Las células no transducidas también mostraron aproximadamente el 0 % de células positivas para GFP.
4. Sumario
Estos estudios demuestran que los vectores de AAV se pueden usar junto con meganucleasas recombinantes para incorporar una secuencia de ácido nucleico exógena en un sitio de escisión en la región constante alfa de TCR mediante recombinación homóloga.
Ejemplo 4
Vectores de AAV recombinantes para introducir ácidos nucleicos exógenos que codifican un receptor de antígeno quimérico en linfocitos T humanos
1. Vectores AAV recombinantes
En el presente estudio, se diseñaron dos vectores de AAV recombinantes (denominados AAV-CAR100 y AAV-CAR763) para introducir una secuencia de ácido nucleico exógena, que codifica un receptor de antígeno quimérico, en el genoma de los linfocitos T humanos en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 mediante recombinación homóloga. Cada vector de AAV recombinante se preparó usando el protocolo de triple transfección descrito anteriormente.
El AAV-CAR100 (también denominado en la presente memoria AAV408) se preparó usando el plásmido ilustrado en la Figura 24 (SEQ ID NÚM.: 109). Tal como muestra, el AAV-CAR100 (AAV408) está diseñado para producir un vector de AAV autocomplementario, y generalmente comprende secuencias para un 5' ITR, un brazo de homología de 5', una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico anti-CD 19, una secuencia de señal de poli(A) SV40, un brazo de homología de 3' y una iTr de 3'. El AAV-CAR763 (también denominado en la presente memoria AAV412) se preparó usando el plásmido ilustrado en la Figura 25 (SEQ ID NÚM.: 110). Tal como muestra, el plásmido AAV-CAR763 (AAV412) generalmente comprende las mismas secuencias que AAV-CAR100 (AAV408), pero está diseñado para producir un vector de AAV monocatenario. Debido a que un vector de AAV monocatenario puede acomodar una carga útil más grande, el brazo de homología de 5' y el brazo de homología de 3' son más largos en AAV-CAR763 (AAV412) que en AAV-CAR100 (AAV408). Los estudios actuales de AAV incluirán además el uso de un vector de AAV que codifica la GFP (GFP-AAV), que se incorporará como un control positivo para la eficiencia de transducción de AAV.
2. Introducción de una secuencia del receptor de antígeno quimérico en la secuencia de reconocimiento TRC 12
Se realizarán estudios para determinar la eficacia del uso de vectores de AAV recombinantes para insertar una secuencia de receptor de antígeno quimérico en el gen de la región constante de TCR alfa mientras, simultáneamente, se inactiva la expresión en la superficie celular del receptor TCR endógeno.
Para confirmar la eficacia de la transducción, se obtendrán linfocitos T CD3 humanos y se estimularán con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 durante 3 días, luego se electroporaron con ARNm que codifica la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE (1 jg ) usando el Amaxa 4D-Nucleofector (Lonza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células serán transducidas con GFP-AAV (1e5 genomas víricos por célula) inmediatamente después de la transfección tal como se describió anteriormente. La expresión de GFP en las células se analizará por citometría de flujo a las 72 horas después de la transducción para determinar la eficacia de la transducción.
Los vectores AAV-CAR100 (AAV408) y AAV-CAR763 (AAV412) se usarán luego como moldes de HDR en linfocitos T humanos para la inserción de la secuencia del receptor de antígeno quimérico anti-CD 19. Los linfocitos T CD3+ humanos se estimularán y se transfectarán con 1 jg de ARNm de TRC 1-2x.87 EE tal como se describió anteriormente. Después, las células se transducirán con AAV-c Ar 100 (AAV408) o AAV-CAR763 (AAV412) (1e5 genomas víricos por célula) ya sea inmediatamente después de la transfección o en 0-8 horas de la transfección. Como controles de solo transducción, las células serán transfectadas por simulación (con agua) y transducidas con AAV-CAR100 (AAV408) o
AAV-CAR763 (AAV412) (1e5 genomas víricos por célula). Para un control de meganucleasa solo, las células se transfectarán con ARNm que codifica TRC 1-2x.87 EE y luego se transducidas por simulación (con agua) inmediatamente después de la transfección.
La inserción de la secuencia del receptor de antígeno quimérico se confirmará mediante la secuenciación del sitio de escisión en el gen de región constante alfa de TCR. La expresión en la superficie celular del receptor de antígeno quimérico se confirmará mediante citometría de flujo, utilizando un anticuerpo anti-Fab o anti-CD19. La inactivación del receptor de linfocitos T endógeno en la superficie celular se determinará mediante citometría de flujo tal como se describió anteriormente.
Ejemplo 5
Inserción y expresión del receptor de antígeno quimérico
1. Inserción de la secuencia del receptor de antígeno quimérico en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2
En el presente estudio, los presentes inventores probaron si AAV puede proporcionar moldes de HDR que se pueden usar para insertar una secuencia de receptor de antígeno quimérico en el gen de la región constante alfa de TCR y, simultáneamente, inactivar la expresión en la superficie celular del receptor TCR endógeno. En el primer experimento, se estimularon linfocitos T CD3+ humanos (1e6 células) y se electroporaron con ARNm que codifica la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE (2 |jg) tal como se describe anteriormente, luego se transdujeron inmediatamente con AAV412 (1e5 genomas víricos/célula). Como controles, las células fueron electroporadas de manera simulada, luego se transdujeron con AAV412 o se electroporaron con ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE, luego se transdujeron de manera simulada. Se incluyó un control adicional de células electroporadas de manera simulada y transducidas de manera simulada.
Se desarrolló un ensayo basado en PCR para determinar si el molde de HDR de AAV se utilizó para reparar roturas de doble cadena en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Se usaron tres conjuntos de pares de cebadores para el análisis por PCR. El primer conjunto fue diseñado para amplificar una región con los brazos de homología de AAV412. Dado que este primer conjunto de cebadores (denominado "región de brazos homólogos internos/CAR" en la Tabla 7) se encuentra dentro de la región de homología, amplificará el locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 no modificado del genoma (349 pb), la entrada del vector AAV412 (2603 pb) o la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en la que se insertó el gen CAR (2603 pb). El segundo conjunto de cebadores (denominado "brazo de homología externo de 5'" en la Tabla 7) incluye un cebador que hibrida dentro de la región CAR del molde de HDR de AAV412, un cebador que hibrida en el genoma humano, fuera del brazo de homología de 5' del molde de HDR de AAV412 y amplificará un fragmento de 1872 pb solo si el gen CAR se insertó con éxito en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. El tercer conjunto de cebadores (denominado "brazo de homología externo de 3'" en la Tabla 7) incluye un cebador que hibrida dentro de la región CAR del molde de HDR de AAV412, y un cebador que hibrida en el genoma humano, fuera del brazo de homología de 3' del molde de HDR de AAV412. De manera similar al segundo conjunto de cebadores, el tercer conjunto de cebadores amplificará un fragmento de 1107 pb solo si el gen CAR se insertó con éxito en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Tomados en conjunto, los productos de PCR de los tres conjuntos de cebadores indicarán si la secuencia CAR está presente en las células (grupo de cebadores 1) y si se ha insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 (grupos de cebadores 2 y 3).
El día 4 después de la transducción, las células se analizaron usando los pares de cebadores de PCR descritos anteriormente. Brevemente, se recolectaron aproximadamente 3.000 células, se sedimentaron, se lisaron y se realizó una PCR para determinar si el gen CAR se insertó en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Los productos de PCR se redisolvieron en un gel de agarosa, se muestra en la Figura 26 (las descripciones de los carriles se pueden encontrar en la Tabla 7). Los carriles 1-3 son productos de PCR de la muestra que fue electroporada con ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE y transducida de manera simulada.
Como cabía esperar, el primer par de cebadores ("región de brazos homólogos internos/CAR") amplificó el locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 no modificado, generando una banda de 349 pb que se muestra en el carril 1. Los carriles 2 y 3 se corresponden con pares de cebadores que solo generan un producto si el gen CAR se ha insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2, y no muestran productos. Los carriles 7-9 representan muestras que fueron electroporadas y transducidas de manera simulada y muestran las mismas bandas que el control de ARNm de TRC 1-2x.87EE solo descrito anteriormente. Los carriles 4-6 muestran productos de PCR de la muestra que se electroporó con ARNm de TRC 1-2x.87EE y se transdujo con AAV412. El carril 4 muestra dos bandas generadas por el primer par de cebadores ("región de brazos homólogos internos/CAR"), lo que indica que la amplificación del locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 no modificado del genoma (349 pb) y la entrada del vector AAV412 (2603 pb) o la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 en la que se insertó el gen c Ar (2603 pb). Los carriles 5 y 6 muestran productos generados por los pares de cebadores que solo amplifican productos si la secuencia de ácido nucleico CAR se ha insertado en el sitio de reconocimiento TRC 1-2x.87EE. Ambas bandas tienen el tamaño previsto (1872 y 1107 pb, respectivamente). Los carriles 10-12 representan la muestra que se sometió a electroporación de manera simulada y se transdujo con AAV412. El carril 10 muestra dos bandas generadas por el primer par de cebadores ("región de brazos homólogos internos/CAR"), lo que indica la amplificación del locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1 2 no modificada del genoma (349 pb) y la entrada del vector AAV412 (2603 pb). Los carriles 11 y 12 se corresponden con pares de cebadores que solo generan un producto si el gen CAR se ha insertado en la secuencia de
reconocimiento TRC 1-2, y no muestran productos. La ausencia de bandas en los carriles 11 y 12 (que incluyen cebadores fuera del brazo de homología) indica que la banda de 2603 pb en el carril 10 se generó a partir de la amplificación de la entrada de AAV412.
Tomados en conjunto, el análisis de PCR demuestra claramente que los genes CAR se introducen en el sitio de reconocimiento TRC 1-2x.87EE cuando tanto el ARNm de TRC 1-2x.87EE como el AAV412 están presentes en las células. Por lo tanto, los presentes inventores concluyen que AAV412 sirve para producir moldes de HDR adecuados que se pueden usar para insertar un gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2x.87EE.
En un segundo experimento, los linfocitos T CD3+ humanos se estimularon y se electroporaron con ARNm que codifica la meganucleasa TRC 1-2x.87 EE tal como se describe anteriormente, luego se transdujeron inmediatamente con cantidades crecientes de AAV408 (0 pl, 3,125 pl, 6,25 pl, 12,5 plo 25 pl, que se corresponde con aproximadamente 0, 3,125e3, 6,250e3, 1,25e4y 2,5e4 genomas víricos/célula). Como controles, las células fueron electroporadas de manera simulada, luego se transdujeron con cantidades crecientes de AAV408. Los controles adicionales incluyeron células que fueron electroporadas por simulación y transducidas por simulación, así como las células que se electroporaron con ARNm de TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron por simulación. En el día 4 después de la transducción, las células se recolectaron y se analizaron tal como se describe anteriormente, pero solo usando los pares de cebadores que amplificaron un producto solo si el gen CAR se ha insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Los productos de PCR se redisolvieron en geles de agarosa, tal como se muestra en la Figura 27. La Figura 27A muestra los productos de PCR generados usando el par de cebadores descrito anteriormente ("brazo de homología externo de 5'") que solo amplifica un producto en el extremo 5' del locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 si el gen CAR se ha insertado en ese lugar. La Figura 27B muestra los productos de PCR generados usando el par de cebadores descrito anteriormente ("brazo de homología externo de 3'") que solo amplifica un producto en el extremo 3' del locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 si el gen CAR se ha insertado en ese lugar. Las descripciones de los carriles se pueden encontrar en la Tabla 8. Los carriles 1-5 en las Figuras 27A y 27B representan las muestras que fueron electroporadas de manera simulada o electroporadas de manera simulada y luego transducidas de manera simulada. No se ven productos de PCR en células electroporadas de manera simulada, lo que indica que los moldes de HDR producidos por AAV408 no pueden insertar el gen CAR en la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2 en ausencia de ARNm de TRC 1-2x.87EE. El carril 6 representa la muestra que se sometió a electroporación con ARNm de TRC 1-2x.87EE y se transdujo de manera simulada. No hay productos de PCR visibles, lo que indica que el gen CAR no se había insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Los carriles 7-10 representan muestras que se electroporaron con ARNm de TRC 1-2x.87EE y se transdujeron con cantidades crecientes de AAV408. Las bandas de tamaño apropiado para cada PCR son evidentes, lo que indica que AAV408 puede producir donantes de HDR para reparar la secuencia de reconocimiento TRC 1-2, lo que da como resultado la inserción del gen CAR.
Tabla 7.
Tabla 8.
Los ensayos basados en PCR descritos anteriormente son útiles para determinar si el gen CAR se había insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2, pero no dan información sobre eficacia. Para determinar la eficacia de la inserción de CAR, los presentes inventores desarrollaron un ensayo digital basado en PCR (el esquema se muestra en la Figura 28A). En este ensayo, se utilizan dos conjuntos de cebadores. El primer conjunto amplifica una secuencia de genes irrelevante y sirve como una secuencia de referencia para controlar el número de molde. El segundo conjunto consiste en un cebador que se hibrida dentro del gen CAR y un cebador que se hibrida fuera del brazo de homología de 3', de modo que un producto solo se amplifica si el gen CAR se ha insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Una sonda marcada con VIC hibrida dentro del amplicón generado a partir del primer conjunto de cebadores y la sonda marcada con FAM hibrida dentro del amplicón generado por el segundo conjunto de cebadores. Al dividir el número de amplicones detectados por la sonda marcada con FAM entre el número de amplicones de secuencia de referencia detectados por la sonda marcada con VIC, es posible cuantificar con precisión el porcentaje de loci de la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2 que se modificaron mediante la inserción del gen c A r .
La Figura 28B muestra los resultados del ensayo de PCR digital para muestras que fueron electroporadas por simulación y luego transducidas, electroporada con ARNm de TRC 1-2x.87EE luego transducidas por simulación, o electroporadas con ARNm de TRC 1-2x.87EE luego transducidas con cantidades en aumento de AAV408. La PCR digital se realizó usando ADN genómico aislado de células aproximadamente 1 semana después de la transducción. De acuerdo con las observaciones de la PCR descrita en la Figura 27, se descubrió que ambas muestras de control (solo transducción o solo electroporación) tenían un gen CAR insertado al 0% en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2x.87EE. Se descubrió que las muestras se electroporaron con ARNm que codificaba TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron con cantidades en aumento de AAV408 tenían entre aproximadamente el 1,5 % y el 7 %. El ensayo se realizó en dos instrumentos diferentes (marcados QX200 y QS3D) y mostró una concordancia notable, que demuestra la sensibilidad y la precisión de este ensayo basado en PCR digital.
2. Expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD 19 en linfocitos T
Además de determinar si la inserción de CAR se produjo a nivel molecular, los presentes inventores buscaron determinar el nivel de expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD 19 en células que tenían el gen CAR insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 usando AAV408 como molde de HDR. Además, se ha examinado la eficiencia con la que la inserción del CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2x.87EE daba lugar al knockout del receptor de linfocitos T. Las muestras descritas anteriormente y analizadas en las Figuras 32A también se analizaron para la expresión de CAR y CD3 por citometría de flujo. Aproximadamente 4 días después de la transducción, las células se marcaron con anticuerpos que reconocen el CAR anti-CD 19 (anti-Fab-Alexa647) o CD3 (CD3'BB515) y se analizaron por citometría de flujo. La Figura 29A muestra gráficos de citometría de flujo, con el etiquetado anti-CAR mostrado en el eje Y y el etiquetado anti-CD3 mostrado en el eje X. Las células que se
electroporaron por simulación y se transdujeron por simulación (MDI-0) fueron abrumadoramente CD3+/CAR' (el cuadrante inferior derecho, 98,7 %). Las células que se electroporaron de manera simulada y luego se transdujeron con cantidades en aumento de AAV408 parecían esencialmente idénticas a las células de control, con las poblaciones de CD3+/CAR' al 98,8 %, 99,99 % y 99,1 %. Por lo tanto, los presentes inventores concluyen que el virus Aa V408 solo no está dirigiendo la expresión de niveles detectables de CAR, ni es capaz de alterar la expresión del receptor de linfocitos T.
La Figura 29B muestra gráficos de citometría de flujo para muestras que se electroporaron con ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron de manera simulada o las células que se electroporaron con TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron con cantidades crecientes de AAV408. Las células que fueron electroporadas y luego transducidas de forma simulada muestran un 47,1% de células CD3-, lo que indica una eliminación eficaz del complejo de receptores de linfocitos T. El marcaje de fondo con el CAR anti-CD19 fue muy bajo, con un 0,6% en la población CD3- y un 0,78% en la población CD3+. Las muestras que se electroporaron con ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron con cantidades crecientes de AAV408 mostraron marcaje de CAR en la población CD3-, que variaba del 2,09 % al 5,9 %. También hubo un ligero aumento en el marcaje de c Ar en la población CD3+, que variaba del 1,08 % al 1,91 %. Los presentes inventores no determinaron la causa del aumento de células CAR+ en la población CD3+, aunque es posible que el CAR se haya insertado en el alelo del receptor de linfocitos T no expresado (solo un alelo de la cadena alfa del receptor de linfocitos T se expresa y se incorpora al complejo del receptor de linfocitos T).
Estos datos se correlacionaron bien con el ensayo cuantitativo basado en PCR digital descrito anteriormente. Por ejemplo, a la MDI más alta de AAV408 (2,5e4 genomas víricos/célula), el ensayo de PCR digital mostró aproximadamente el 6 % de inserción de CAR, y el ensayo de citometría de flujo mostró el 5,9 % de células CAR+/CD3' . Si se tiene en cuenta la población de CAR+/ CD3+, los datos siguen siendo bastante comparables, con el ensayo de citometría de flujo que muestra aproximadamente el 7,8 % de CAR+ en comparación con el 6 % por PCR digital.
Ejemplo 6
Caracterización de vectores AAV adicionales
1. Inserción de una secuencia del receptor de antígeno quimérico en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2
Habiendo demostrado que los vectores AAV podrían proporcionar moldes de HDR adecuados para insertar genes CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2x.87EE, los presentes inventores buscaron optimizar la configuración del vector AAV. Los presentes inventores generaron un vector que se podría usar para producir genomas de AAV autocomplementarios que incluían el casete de expresión del gen CAR dirigido por un promotor JeT, flanqueado por regiones cortas de homología con el locus de secuencia de reconocimiento TRC 1-2 y las ITR de AAV. Este vector es referido como AAV421 (Figura 30; SEQ ID NÚM.: 123). Se necesitaron brazos de homología cortos debido a la capacidad de empaquetado limitada del AAV autocomplementario. Además, los presentes inventores generaron un vector que se podría usar para producir genomas de AAV de cadena simple que incluyen el casete de expresión del gen CAR dirigido por un promotor CMV, flanqueado por largos brazos de homología y las ITR de AAV. Este vector es referido como AAV422 (Figura 31; SEQ ID Nú M.: 124). Dado que los genomas de AAV monocatenarios tienen una mayor capacidad de carga, los presentes inventores pudieron utilizar brazos de homología más largos que en el vector autocomplementario.
Para probar si AAV421 y AAV422 fueron útiles para dirigir la inserción del gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2, se llevaron a cabo varios experimentos similares a los descritos anteriormente en linfocitos T CD3+ humanos. En un primer experimento, los linfocitos T CD3+ humanos (1e6 células) se electroporaron de forma simulada y luego se transdujeron con cantidades crecientes de AAV421 o 422, o se electroporaron con ARNm de TRC 1-2x.87EE (2 |jg) y luego se transdujeron con cantidades crecientes de AAV421 o AAV422. Las MDI AAV422 fueron significativamente más altas que las de AAV421 en este experimento que en los experimentos descritos anteriormente (las MDI aproximadas fueron de 1.25e4, 2,5e4, 5e4 y 1e5 genomas víricos/célula) porque los experimentos anteriores con AAV408 sugirieron que las MDI más altas darían como resultado una inserción de CAR más eficaz. El reservorio de virus AAV421 no se concentró lo suficiente como para permitir títulos significativamente más altos que en los experimentos descritos anteriormente. Como controles, las células fueron electroporadas (de manera simulada o con ARNm de TRC 1-2x.87EE) y luego transducidas de manera simulada. Como componente adicional de este experimento, se realizó una condición de "gran escala", en la que se electroporaron 10e6 células (10 veces más que un experimento típico) con ARNm de TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron con AAV422 (2,5e4 genomas víricos/célula). Finalmente, los presentes inventores también probaron un segundo reservorio de virus de AAV421 para compararlo con el reservorio de virus primario.
La inserción del CAR se determinó por PCR tal como se describe anteriormente, utilizando pares de cebadores que solo amplifican productos si el gen CAR se ha insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2x.87EE. La PCR se resolvió mediante gel de agarosa, se muestra en la Figura 32A y 32B (las descripciones de los carriles se pueden encontrar en las Tablas 9 y 10). La muestra 1 en la Figura 32A se electroporó de manera simulada y luego se transdujo de manera simulada, y las muestras 2-5 se electroporaron de manera simulada y luego se transdujeron con AAV421. El gel muestra que ninguna de estas muestras generó productos de PCR, lo que indica que AAV421, en ausencia de ARNm de TRC 1-2x.87EE, no puede impulsar la inserción del gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2.
Además, la muestra de control que se sometió a electroporación con ARNm de TRC 1-2x.87EE y luego se transdujo de manera simulada (muestra 6), no mostró ningún producto de PCR. Las muestras 7-10 en la Figura 32A se electroporaron con ARNm de TRC 1-2x.87EE, luego se transdujeron con cantidades crecientes de AAV421. El gel muestra bandas de PCR para productos que se extienden más allá del brazo de homología de 5' y de 3' (las dos bandas debajo de cada número de muestra), lo que demuestra la integración del gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Por último en la Figura 32A, los carriles 11 y 12 representan muestras que se electroporaron con ARNm de TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron con AAV422, ya sea comenzando con 1e6 o 10e6 células/muestra, respectivamente. La presencia de ambas bandas de PCR (más grande en el primer conjunto, debido a que se utilizó un cebador diferente para dar cuenta de un brazo de homología más largo) indica la inserción exitosa del gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2.
La muestra 1 en la Figura 32B se electroporó de manera simulada y luego se transdujo de manera simulada, y las muestras 2-5 se electroporaron de manera simulada y luego se transdujeron con cantidades crecientes de AAV422 (Tabla 10). El gel muestra que ninguna de estas muestras generó productos de PCR, lo que indica que AAV422, en ausencia de ARNm de TRC 1-2x.87EE, no puede impulsar la inserción del gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Las muestras 7-10 en la Figura 32B se electroporaron con ARNm de TRC 1-2x.87EE, luego se transdujeron con cantidades crecientes de AAV422. El gel muestra bandas de PCR para productos que se extienden más allá del brazo de homología de 5' y 3', lo que demuestra la integración del gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Finalmente, la muestra 11 representa la muestra que se electroporó con ARNm de TRC 1-2x.87EE y luego se transdujo con un AAV421 de un reservorio de virus diferente al de las muestras que se muestran en la Figura 32A. La presencia de bandas indica la inserción del gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 y confirma la reproducibilidad entre diferentes reservorios de virus. Tomados en conjunto, la Figura 32 demuestra claramente que tanto AAV421 como AAV422 son capaces de generar moldes de HDR adecuados para insertar el gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2.
Tabla 9.
Tabla 10.
2. Expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD 19 en linfocitos T usando AAV421
En este caso, los presentes inventores buscaron determinar el nivel de expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD 19 en células que tenían el gen CAR insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 usando AAV421. Las muestras descritas anteriormente y analizadas en las Figuras 32A también se analizaron para la expresión de CAR y CD3 por citometría de flujo. Aproximadamente 4 días después de la transducción, las células se marcaron con anticuerpos que reconocen el CAR anti-CD 19 o CD3 y se analizaron por citometría de flujo. La Figura 33A muestra gráficos de citometría de flujo para células que fueron electroporadas y transducidas con AAV421, junto con células de control que fueron electroporadas de manera simulada y transducidas de manera simulada. Las células que se electroporaron por simulación y se transdujeron por simulación (MDI-0) fueron abrumadoramente CD3+/CAR' (el cuadrante inferior derecho, 98,8 %). Las células que se electroporaron de manera simulada y luego se transdujeron con cantidades en aumento de AAV421 parecían esencialmente idénticas a las células de control, con las poblaciones de CD3+/CAR' al 98,8 %, 98,6 %, 98,8 % y 97,9 %. Por lo tanto, los presentes inventores concluyen que el virus AAV421 por sí solo no está dirigiendo la expresión de niveles detectables de CAR, ni es capaz de alterar la expresión del receptor de linfocitos T.
La Figura 33B muestra gráficos de citometría de flujo para muestras que se electroporaron con ARNm TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron de manera simulada o las células que se electroporaron con TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron con cantidades crecientes de AAV421. Las células que fueron electroporadas y luego transducidas de forma simulada muestran un 56,7% de células CD3', lo que indica una eliminación eficaz del complejo de receptores de linfocitos T. El marcaje de fondo con el CAR anti-CD19 fue muy bajo, con un 0,48% en la población CD3' y un 0,36% en la población CD3+. Las muestras que se electroporaron con ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron con cantidades crecientes de AAV412 mostraron cantidades significativas de marcaje de CAR en la población CD3', que variaba del 4,99% al 13,4%. También hubo un ligero aumento en el marcaje de CAR en la población CD3+, que variaba del 1,27 % al 3,95 %. Tal como se ha mencionado anteriormente, es posible que el gen CAR se haya insertado en el alelo del receptor de linfocitos T no expresado. También en contraste con los experimentos con AAV408, la población CAR+ estaba mucho mejor definida, con una intensidad de fluorescencia media más alta, lo que sugiere que el promotor JeT promueve una mayor expresión que el promotor central eF1a.
Al evaluar la inserción del gen CAR utilizando AAV421 junto con TRC 1-x.87EE, los presentes inventores buscaron determinar un procedimiento que les permitiese expandir y enriquecer preferentemente la población CD3VCAR+. Del experimento descrito anteriormente y mostrado en la Figura 33, los presentes inventores utilizaron células que se electroporaron con ARNm de TRC 1-2x.87EE (2 |jg) y luego se transdujeron con AAV421 (3,13e4 genomas
víricos/célula). Las muestras de control fueron electroporadas de manera simulada y transducidas de manera simulada, electroporadas de manera simulada y transducidas con AAV421, o electroporadas con TRC 1-2x.87EE y transducidas de manera simulada, tomadas del experimento descrito anteriormente y mostrado en la Figura 33. Como un procedimiento de enriquecimiento y expansión de control, estas células se incubaron durante 6 días en medio de crecimiento completo suplementado con IL-7 e IL-15 (ambas a 10 ng/ml). Luego, las células se marcaron con anticuerpos contra el anti-CD 19 CAR y CD3 y se analizaron por citometría de flujo (Figura 34A). Las células que fueron electroporadas de manera simulada y transducidas de manera simuladas mostraron bajos niveles de tinción de fondo en el cuadrante de CD3'/CAR+ (0,13 %). La población CD3YCAR+ era esencialmente la misma en muestras que se electroporaron de manera simulada y luego se transdujeron con AAV o se electroporaron con ARNm de TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron de manera simulada (0,16 % y 0,55 %, respectivamente). Las células que se electroporaron con ARNm de TRC 1-2x.87EE y se transdujeron de manera simulada tenían una población CD3YCAR' del 53,2 %, muy cerca de la cantidad teñida en la primera parte de este experimento que se muestra en la Figura 33B (56,7 %). Las células que se electroporaron con TRC 1-2x.87EE y se transdujeron con AAV mostraron 12,6 % de células CD3VCAR+, casi idéntico al marcaje original de estas células que se muestra en la Figura 33 (13,4 %), lo que demuestra que la mezcla de IL-7 e IL-15 es insuficiente para enriquecer o expandir la población específica de células CD3VCAR+.
Los inventores de la presente buscaron a continuación enriquecer la población CD3~/CAR+ de una manera específica de antígeno incubando las 4 muestras descritas anteriormente con células IM-9, que presentan CD19 en la superficie celular. Las células IM-9 se inactivaron mediante pretratamiento con mitomicina C y se incubaron con muestras a una proporción de 1:1 durante 6 días en presencia de IL-7 e IL-15 (10 ng/ml). Las células se marcaron entonces con anticuerpos contra CD3 y el CAR anti-CD 19 y se analizaron por citometría de flujo (Figura 34B). Las células que fueron electroporadas de manera simulada y transducidas de manera simulada mostraron bajos niveles de tinción de fondo en el cuadrante de CD3' /CAR+ (0,2 %). La población CD3VCAR+ fue la misma en muestras que fueron electroporadas de manera simulada y luego transducidas con AAV (0,2 %) y ligeramente más altas en células que fueron electroporadas con TRC 1-2x.87EE y transducidas de manera simulada (1,24 %). El aumento en las células CD3~/CAR+, el control de TRC 1-2x.87EE solo se considera de fondo ya que nunca se introdujo ácido nucleico de CAR en el sistema. Las células que se electroporaron con ARNm de TRC 1-2x.87EE y se transdujeron de manera simulada tenían una población CD3YCAR' del 42,5 %, que es significativamente menor de lo que era antes de la expansión (56,7 %, Figura 33) lo que sugiere que las células CD+ pueden tener una ventaja de crecimiento en este sistema. Sin embargo, las células que fueron electroporadas con t Rc 1-2x.87EE y transducidas con AAV mostraron el 49,9 % de células CD3YCAR+, un aumento considerable en comparación con el marcaje original de esta células que se muestra en la Figura 33 (13,4 %), lo que demuestra que la incubación de esta muestra con células IM-9 en presencia de IL-7 e IL-15 es bastante eficaz para enriquecer y expandir la población CD3YCAR+. La población CD3+/CAR+ también se expandió bajo estas condiciones, con la muestra electroporada de manera simulada/transducida con AAV y la muestra electroporada con TRC 1-2x.87EE/ transducida con AV que muestra el 2,53 % y el 15,3 % de CD3+/CAR+, respectivamente.
En las células que se electroporaron con TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron con AAV421, el 24,2 % de la población CD3' era CAR+ antes de la expansión (Figura 33B). Después de la incubación en medio suplementado con IL-7 e IL-15, ese 25,3 % de las células c D3‘ eran CAR+ (Figura 34A), lo que indica que la proporción entre la activación genética y la desactivación genética no cambió. Sin embargo, después de la incubación con células IM-9 además de IL-7 e IL-15, más del 80 % (80,35 %, Figura 34B) de las células c D3‘ eran CAR+, lo que demuestra que la incubación con células IM-9 dio como resultado un enriquecimiento específico de antígeno.
Dado que la mitomicina C inactiva las células de manera muy potente y las células IM-9 no persistieron por mucho tiempo en el cultivo mixto, los presentes inventores razonaron que una segunda infusión de células iM-9 podría aumentar aún más el enriquecimiento de células CD3YCAR+. Algunas de las células descritas anteriormente y mostradas en la Figura 34B se mezclarían con células IM-9 recientes (pretratadas con mitomicina C) en medio que contenía IL-7 e IL-15 y se incubaron otros 6 días. Luego, las células se tiñeron para CD3 y CAR anti-CD 19 y se analizaron por citometría de flujo (Figura 34C). El porcentaje de células CD3YCAR+ en cualquiera de las muestras de control permanecieron esencialmente sin cambios en comparación con la primera ronda de enriquecimiento en las células IM-9.
Sin embargo, las células que se electroporaron con TRC 1-2x.87EE y se transdujeron con AAV421 mostraron un enriquecimiento significativo de la población de CD3YCAR+, aumentando desde el 49,9 % (después de la primera ronda si la incubación con células IM-9, Figura 34B) al 65,7 % (Figura 34C). Cabe destacar que, el 93,75 % de la población CD3' era CAR+, lo que indica mayor expansión específica de antígeno.
3. Expresión del receptor de antígeno quimérico anti-CD 19 en linfocitos T usando AAV422
También se ha examinado la expresión del CAR anti-CD19 a partir de células en las que se usó AAV422 para proporcionar el molde de HDR (descrito anteriormente, resultados de PCR mostrados en la Figura 32B). Aproximadamente 4 días después de la transducción, las células se marcaron con anticuerpos que reconocen el CAR anti-CD 19 o CD3 y se analizaron por citometría de flujo. La Figura 35A muestra gráficos de citometría de flujo para células que fueron electroporadas y transducidas con cantidades crecientes de AAV422, junto con células de control que fueron electroporadas de manera simulada y transducidas de manera simulada. Las células que se electroporaron
por simulación y se transdujeron por simulación (MDI-0) fueron abrumadoramente CD3+/CAR' (el cuadrante inferior derecho, 98,8 %). Las células que se electroporaron de manera simulada y luego se transdujeron con cantidades en aumento de AAV422 parecían esencialmente idénticas a las células de control, con las poblaciones de CD3+/CAR' al 98,6 %, 98,6 %, 98,9 % y 98,4 %. Por lo tanto, el vector AAV422 solo no está impulsando niveles detectables de expresión de CAR, ni es capaz de alterar la expresión del receptor de linfocitos T.
La Figura 35B muestra gráficos de citometría de flujo para muestras que se electroporaron con ARNm TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron de manera simulada o las células que se electroporaron con TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron con cantidades crecientes de AAV422. Las células que fueron electroporadas y luego transducidas de forma simulada muestran un 59,3% de células CD3- lo que indica una eliminación eficaz del complejo de receptores de linfocitos T. El marcaje de fondo con el CAR anti-CD19 fue muy bajo, con un 1,47% en la población CD3- y un 0,52% en la población CD3+. Las muestras que se electroporaron con ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron con cantidades crecientes de AAV422 mostraron cantidades significativas de marcaje de CAR en la población CD3-, que variaba del 14,7% al 20,3%. También hubo un ligero aumento en el marcaje de CAR en la población CD3+, que variaba del 2,3 % al 2,7 %.
Sorprendentemente, los presentes inventores observaron un aumento notable en la eficiencia de inactivación del receptor de linfocitos T en presencia de AAV422. La eficacia total de inactivación de CD3 con el aumento de AAV422 fue del 71,6 %, 74,9 %, 77,8 % y del 74,4 % en comparación con el 59,3 % en la electroporación de TRC 1-2x.87EE solo. Por el contrario, la eficacia total de eliminación de CD3 con el aumento de AAV421 fue del 56,99 %, 56,62 %, 57,4 % y del 55,4 % en comparación con el 57,18 % en la electroporación de TRC 1-2x.87EE solo (Figura 33B). Por lo tanto, parece que la electroporación con TRC 1-2x.87EE en presencia de genomas de AAV monocatenarios, pero no genomas de AAV autocomplementarios, da como resultado un aumento en la eficacia global de inactivación de la nucleasa TRC 1-2x.87EE. Debido a este aumento, el porcentaje de células CD3- que son CAR+ no es significativamente diferente entre las células transducidas con AAV421 y AAV422 a pesar de los números más altos de células CD3YCAR+. El porcentaje más alto de células CD3- que eran CAR+ usando AAV421 fue del 24,18% (MDI = 3,13e4 genomas víricos/célula) en comparación con el 26,48 % con AAV422 (MDI = 1e5 genomas víricos/célula). Esta observación es particularmente interesante considerando la gran diferencia en MDI entre AAV421 y AAV422.
El concepto de utilizar células IM-9 para enriquecer específicamente las células CD3VCAR+ se probó usando células de este experimento. De nuevo, en lugar de probar todo el panel, los presentes inventores solo intentaron enriquecer cualquiera de las células electroporadas de manera simulada y luego transducidas con AAV422 o electroporadas con TRC 1-2x.87EE y luego transducidas con AAV422 (2,5e4 genomas víricos/célula) en un nuevo experimento. La Figura 36A muestra gráficos de citometría de flujo aproximadamente el día 4 después de la transducción. Las células electroporadas/transducidas de manera simulada mostraron tinción de fondo de células CD3YCAR+ al 0,13 %. En comparación, las células electroporadas con TRC 1-2x.87EE y transducidas con AAV422 mostraron el 4,44 % de células CD3YCAR+. Las células se incubaron con células IM-9 (pretratadas con mitomicina) en presencia de IL-7 e IL-15 durante 6 días tal como se describió anteriormente, luego se analizaron por citometría de flujo. La Figura 36B muestra que la incubación con células IM-9 aumentó considerablemente la población de CD3YCAR+ en células transducidas con AAV422 a 35,8 %. Las células CAR+ constituyen el 45,2 % del total de la población CD3- en comparación con el 6,69 % antes del enriquecimiento (Figura 36A). Como en el caso anterior, los presentes inventores lo enriquecieron con una segunda adición de células IM-9 (Figura 36C). Dos rondas de incubación con células IM-9 dieron como resultado el 65,1 % de células CD3YCAR+. Las células CAR+ constituyen el 78,25% del total de la población CD3', lo que indica un enriquecimiento significativo dependiente de antígeno de células CD3YCAR+.
Estos datos, junto con los datos presentados anteriormente, demuestran claramente que las células que han tenido un gen CAR anti-CD 19 insertado en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2 se pueden enriquecer con éxito mediante incubación con células IM-9 en presencia de IL-7 e IL-15, y pueden dar como resultado una población CD3' que supera el 90 % de CAR+ en tan solo 12 días de cultivo.
4. Aumento de la eficacia de inactivación observada cuando se utilizan vectores AAV de cadena sencilla
En el presente estudio, los presentes inventores siguen la observación de que los vectores AAV monocatenarios aumentaron la eficacia de inactivación de la nucleasa TRC 1-2x.87EE. En un primer experimento, las células se electroporaron con TRC 1-2x.87EE (2 |jg) y se transdujeron de manera simulada o se transdujeron con cantidades crecientes de AAV412 (6,25e4, 1,25e4, 2,5e4 o 5e4 genomas víricos/célula). En el día 4 después de la transducción, las células se marcaron con un anticuerpo contra CD3 y se analizaron por citometría de flujo (Figura 37A). En las células transducidas de manera simulada, el 20,7 % son CD3' en comparación con el 21,6 %, 23,7 %, 25,5 % y el 25 % con AAV412 en aumento, lo que indica que la eficiencia de inactivación de TRC 1-2x.87EE es hasta un 23 % mayor en presencia de AAV412 (el 25,5 % en comparación con el 20,7 %).
Para determinar si este aumento en la eficiencia de inactivación fue específica de la nucleasa, en un experimento adicional, las células se electroporaron con ARNm (2 jg ) que codifica una nucleasa dirigida al gen de la p2-microglobulina y se transdujeron de manera simulada o se transdujeron con cantidades en aumento de AAV412. Las células se tiñeron para p2-microglobulina en el día 4 después de la transducción y se analizaron por citometría de flujo (Figura 37B). En las células transducidas de manera simulada, La eficiencia de inactivación de p2-microglobulina fue del 64,5% y aumentó en las células transducidas al 68,6%, 70,7 %, 77,2 % y al 82,5 % con cantidades crecientes de
AAV412, lo que demuestra un aumento en la eficacia de eliminación de hasta el 27,9 % (el 82,5 % en comparación con el 64,5 %).
En un experimento paralelo, las células se electroporaron con ARNm de TRC 1-2x.87EE y se transdujeron de manera simulada o se transdujeron con AAV422 (usando las mismas MDI que AAV412). Las células se marcaron con un anticuerpo contra CD3 y las células se analizaron por citometría de flujo (Figura 37C). Las células transducidas de manera simulada mostraron un 62,2 % de inactivación del receptor de linfocitos T, y con cantidades en aumento de AAV, la frecuencia de inactivación del receptor de linfocitos T aumentó al 72,6 %, 75,5 %, 78,3 % y 75,1 %. En este caso, la presencia de AAV422 aumenta la eficacia de inactivación de TRC 1-2x.87EE hasta en un 25,8 % (el 78,3 % en comparación con el 62,2 %). Llama la atención que el aumento en el porcentaje de eficacia de inactivación es casi idéntico entre estos tres experimentos, usando dos nucleasas diferentes y dos vectores AAV diferentes. Tomados en conjunto, estos datos indican fuertemente que la transducción de células con vectores AAV de cadena sencilla aumenta la eficacia de inactivación de nuestras nucleasas, independientemente de la carga de nucleasa o AAV.
5. Actividad de los linfocitos T que expresan receptor de antígeno quimérico anti-CD 19
Los experimentos anteriores demuestran claramente la generación de linfocitos T con CAR mediante electroporación de células con ARNm de TRC 1-2x.87EE, después, transducción inmediatamente de las células con AAV421, y que estas células se pueden enriquecer para una población CD3VCAR+ por cocultivo con células IM-9 que expresan CD19. A continuación, los presentes inventores examinaron la actividad de estos linfocitos T con CAR contra las células diana. En el primer experimento, las células descritas anteriormente y mostradas en la Figura 34C se usaron en un ensayo ELISpOT de IFN-gamma, en el que las células Raji CD19+ o las células U937 CD19'fueron la población diana. Tal como se muestra en la Figura 38A, cuando los linfocitos T con CAR anti-CD 19 se incubaron con células U937, no secretaron IFN-gamma independientemente de la proporción dianas:efectoras. La incubación de linfocitos T con CAR con células Raji, sin embargo, dio como resultado altos niveles de secreción de IFN-gamma, de manera dependiente de la dosis, lo que indica que la secreción de IFN-gamma es específica de antígeno.
Estos linfocitos T con CAR también se usaron en un ensayo de destrucción celular en el que las células Raji marcadas con luciferasa eran la diana. Brevemente, los linfocitos T con CAR se incubaron con células Raji marcadas con luciferasa en una proporción de 10:1. En varios puntos de tiempo, las células se lavaron y se lisaron para medir la actividad de luciferasa como una medida de cuántas células quedaban. Las células de control mostraron una actividad de luciferasa mayor de 5500 unidades arbitrarias (Figura 38B). La incubación conjunta durante 2, 3, 4 y 5 horas dio como resultado una disminución de la actividad de luciferasa a 4598, 3292, 2750 y 1932 unidades arbitrarias, respectivamente. Por lo tanto, dentro de las 5 horas de la coincubación, la actividad de luciferasa se redujo aproximadamente un 65 %, lo que indica una fuerte actividad citolítica de los linfocitos T con CAR.
Tomados en conjunto, estos datos demuestran que los linfocitos T con CAR anti-CD 19 generados de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente memoria son eficaces para destruir las células CD19+.
Ejemplo 7
ADN plasmídico linealizado
1. Expresión del receptor de antígeno quimérico a partir de ADN plasmídico linealizado
Dado que los moldes de HDR producidos por AAV son moléculas de ADN lineales, los presentes inventores hipotetizan que el ADN lineal de cualquier fuente puede ser un molde de HDR adecuado para insertar un gen de c Ar en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Para probar esto, los inventores de la presente generaron varios plásmidos que contienen un gen de CAR anti-CD 19 flanqueado por brazos de homología que son homólogos al locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2. Se usaron diferentes promotores en algunos plásmidos, y los brazos de homología fueron "cortos" (200 pb en el brazo de homología 5' y 180 pb en el brazo de homología 3') para imitar los vectores AAV autocomplementados, o "largos" (985 pb en el brazo de homología 5' y 763 pb en el brazo de homología 3') para imitar los vectores AAV de cadena sencilla. Los plásmidos con brazos de homología cortos están marcados como "pDS" y aquellos con brazos de homología largos están marcados como "pDI". Además, algunos plásmidos contenían un intrón aguas arriba del gen CAR.
Los plásmidos donadores de CAR se linealizaron en un sitio de restricción en el esqueleto del vector y se purificaron en gel. Los linfocitos T CD3+ se electroporaron con el plásmido donador de CAR linealizado solo (cantidades variables entre 500 ng y 1000 ng, dependiendo de la concentración del plásmido linealizado purificado), o se coelectroporaron con ARNm de TRC 1-2.87EE (2 |jg). Como controles, las células se electroporaron de forma simulada o se electroporaron con TRC 1-2x.87EE solo. Los gráficos en la Figura 39 están marcados con descripciones para todas las electroporaciones. Aproximadamente 4 días después de la electroporación, las células se marcaron con anticuerpos contra CD3 y el CAR anti-CD 19 y se analizaron por citometría de flujo (Figura 39). La Figura 39A muestra la tinción de fondo de CD3VCAR+ del 0,15 %. Cabe señalar que la tinción de fondo de CD3+/CAR+ fue inusualmente alta al 4,31 %. La Figura 39B muestra células que se electroporaron con ARNm de TRC 1-2x.87EE solo, lo que demuestra un 60,8 % de inactivación de CD3. Las Figuras 39C y 39D representan muestras que se coelectroporaron con ARNm de TRC 1-2x.87EE y el vector de brazo de homología larga con un promotor central EF1a con un
potenciador HTLV o el vector de brazo de homología corto con promotor de núcleo EF1a (sin potenciador). Resulta interesante que, el donante de CAR linealizado con el promotor central EF1a solo generó una población de CD3YCAR+ del 2,38 %, mientras que el vector que alberga el promotor central EF1a con el potenciador HTLV no generó un porcentaje significativo de células CD3VCAR+. Las células que se electroporaron con estos dos vectores en ausencia de ARNm de TRC 1-2x.87EE no mostraron un aumento significativo en la población de CD3- /CAR+ (Figura 39E y 39F). El aumento en la población CD3-/CAR+ con el vector promotor central EF1a en presencia de TRC 1-2x.87EE sugirió que un plásmido linealizado podría servir como molde de HDR para reparar roturas de doble cadena en la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2.
Las Figuras 39G y 39H muestran dos construcciones de brazo de homología largo que contienen un promotor MND que impulsa la expresión del CAR. Una de estas construcciones, mostrada en la Figura 39G, también contiene un intrón en el extremo 5' del gen CAR. Sorprendentemente, el plásmido del brazo de homología larga con un promotor MND e intrón mostró una expresión CAR significativa (Figura 39G, 4,14 % de CD3-/CAR+) mientras que la construcción sin intrón (Figura 39H) no mostró una expresión CAR detectable cuando se electroelevó con ARNm de TRC 1-2x.87EE. Un plásmido del brazo de homología corto con el promotor MND, pero sin intrón, también se probó con ARNm de TRC 1-2x.87EE y no demostró ninguna expresión de CAR (Figura 391). Ninguna de las construcciones que contienen promotores MND generó células CAR+ en ausencia de ARNm TRC 1-2x.87EE (Figuras 39J, 39K y 39L).
Por último en este experimento, los presentes inventores probaron una construcción de brazo de homología corto que contenía un promotor JeT que impulsaba la expresión del CAR y una construcción de brazo de homología "largo" con un promotor CMV que impulsaba la expresión del CAR. Solo, ninguno de estos plásmidos linealizados dio como resultado células CAR+ significativas (Figura 39O y 39P). Cuando las células se coelectroporaron con ARNm de TRC 1-2x.87EE, la construcción que contiene JeT mostró el 2,69 % de células CD3-CAR+ y la construcción que contiene CMV produjo el 2,7 % de células CD3-/CAR+.
Los gráficos de flujo que se muestran en la Figura 39 demuestran claramente que el ADN plasmídico linealizado que codifica el CAR, flanqueado por brazos de homología, puede servir como moldes de HDR para reparar roturas de ADN causadas por TRC 1-2x.87EE, dando como resultado la inserción del ácido nucleico CAR. Está claro que la fuerza del promotor juega un papel importante en la expresión del CAR, y algunos promotores impulsan una expresión más eficaz cuando hay un intrón en el gen.
Para confirmar que la inserción del CAR utilizando construcciones de ADN linealizadas era específica del locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2, los presentes inventores analizaron las células tal como se describió anteriormente utilizando cebadores que se ubicaron dentro del CAR y fuera de los brazos de homología (Figura 40, Tabla 11). Las muestras 1 y 2 son productos de PCR de células que se electroporaron de manera simulada o se electroporaron con solo ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE. De acuerdo con los resultados que se muestran anteriormente, no hay bandas de PCR presentes que indiquen la falta de gen CAR en el sitio de reconocimiento TRC 1-2. Las muestras 3, 4 y 5 provienen de células que se coelectroporaron con TRC 1-2x.87EE y un plásmido de homología de CAR linealizado (nombres de muestras en la Figura 40). Cada muestra presenta dos bandas de PCR del tamaño predicho que indica la inserción del casete de expresión del gen CAR en el sitio de reconocimiento TRC 1-2. Las muestras 6, 7 y 8 son de células que se electroporaron con los mismos plásmidos de homología de CAR linealizados que las muestras 3, 4 y 5 pero sin ARNm de TRC 1-2x.87EE. Como cabía esperar, no hay bandas de PCR presentes. Las muestras 9 y 10 son productos de PCR de células que fueron electroporadas de forma simulada o electroporadas con solo ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE y no muestran bandas de PCR. Las muestras 11, 12, 13 y 14 provienen de células que se coelectroporaron con t Rc 1-2x.87EE y un plásmido de homología de CAR linealizado (nombres de muestras en la Figura 40). Cada muestra presenta dos bandas de PCR del tamaño predicho que indica la inserción del gen CAR en el sitio de reconocimiento t Rc 1-2. Las muestras 15, 16, 17 y 18 son de células que se electroporaron con los mismos plásmidos de homología CAR linealizados que las muestras 11, 12, 13 y 14 pero sin ARNm de TRC 1-2x.87EE. Como cabía esperar, no hay bandas de PCR presentes.
Las Figuras 39 y 40 demuestran claramente que la coelectroporación de los linfocitos T CD3+ humanos con ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE y un plásmido de homología CAR linealizado es un procedimiento eficaz para insertar el gen CAR en la secuencia de reconocimiento TRC 1-2.
Tabla 11.
Ejemplo 8
Caracterización de vectores AAV adicionales
1. Uso de AAV con promotor JeT y brazos largos de homología
Conjuntamente, los datos mostrados anteriormente indican que los vectores que utilizan el promotor JeT tienen una expresión alta y consistente del CAR y que los brazos de homología más largos pueden aumentar la eficacia de inserción de genes. Se ha diseñado y generado el vector mostrado en la Figura 41 (SEQ ID NÚM.: 125), que se usó para hacer AAV de cadena sencilla con brazos de homología largos, y un promotor JeT que impulsa la expresión del
CAR anti-CD19 (denominado en la presente memoria AAV423). Se electroporaron linfocitos T CD3+ humanos con ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE y se transdujeron con cantidades crecientes de AAV423. Dado que los datos mostrados anteriormente sugieren que las MDI más altas pueden dar como resultado una mayor eficacia de inserción, los presentes inventores utilizaron títulos que van desde 1,875e4 a 1,5e5 Como controles, las células se electroporaron con ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron de manera simulada o se electroporaron de manera simulada y se transdujeron con cantidades en aumento de AAV423. En el día 6 después de la transducción, las células se marcaron con anticuerpos que reconocen CD3 o el CAR anti-CD19 y se analizaron por citometría de flujo. Tal como se muestra en la Figura 42, las células que fueron electroporadas de manera simulada y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV423 son abrumadoramente CD3+/CAR' (que van del 96,6 % al 98,5 %). Las células que fueron electroporadas con ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE y transducidas de manera simulada fueron el 39 % CD3-, lo que indica la inactivación eficaz del receptor de linfocitos T. En estas células, la tinción de fondo de CAR era muy baja (aproximadamente 2%). Las células que se electroporaron con ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE y luego se transdujeron con cantidades crecientes de AAV423 mostraron una tinción CAR espectacular junto con la inactivación de CD3. Las poblaciones CD3YCAR+ variaron del 21,6 % al 22,7 %, mientras que las poblaciones CD3+/CAR+ fueron de alrededor del 2 %. Tal como se ha descrito anteriormente, la presencia de AAV de cadena simple aumentó la eficacia general de modificación génica en el sitio de reconocimiento TRC 1-2, con un total de las poblaciones CD3- que aumentan del 41,44 % en las células de control al 57,6 %, 59,2 %, 58,7 % y 56,1 % en células que fueron electroporadas y luego transducidas con cantidades crecientes de AV423. El porcentaje de células CD3-que eran CAR+ varió del 37,5 % al 39,9 %, lo que indica un aumento considerable en la eficacia de inserción en comparación con los datos descritos anteriormente.
Para confirmar que la inserción del CAR usando AAV423 era específica del locus de la secuencia de reconocimiento TRC 1-2, los presentes inventores analizaron las células tal como se describió anteriormente utilizando cebadores que se ubicaron dentro del CAR y fuera de los brazos de homología (Figura 43, Tabla 12).
Tabla 12.
Las muestras 1 y 2 son productos de PCR de células que se sometieron a electroporación de manera simulada. De acuerdo con los resultados que se muestran anteriormente, no hay bandas de PCR presentes que indiquen la falta de gen CAR en el sitio de reconocimiento TRC 1-2. Las muestras 3-6 son de células que fueron electroporadas de manera simulada y luego transducidas con cantidades crecientes de AAV423. De acuerdo con los resultados anteriores, no hay bandas de PCR presentes. La muestra 7 es de células electroporadas con ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE, y luego transducidas de manera simulada y no muestra bandas de PCR. Las muestras 8-11 son de células electroporadas con ARNm que codifica TRC 1-2x.87EE y luego se transducen con cantidades crecientes de AAV423, y muestran las bandas de PCR esperadas si el CAR se inserta en la secuencia de reconocimiento de TRC 1-2.
Claims (15)
1. Un linfocito T humano genéticamente modificado que comprende en su genoma un gen de región constante alfa del receptor de linfocitos T humano (TCR) modificado, en el que el gen de la región constante alfa del TCR humano modificado comprende de 5' a 3':
(a) una región 5' del gen de la región constante alfa del TCR humano;
(b) un polinucleótido exógeno que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR); y
(c) una región 3' del gen de la región constante alfa del TCR humano;
en el que el polinucleótido exógeno se inserta en dicho gen de la región constante alfa del TCR entre las posiciones 13 y 14 de la SEQ ID NÚM.: 3;
en el que dicho CAR comprende un dominio de unión al ligando extracelular, un dominio transmembrana, un dominio coestimulador intracelular, y un dominio de señalización citoplasmática intracelular que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NÚM.: 113; y en el que dicho linfocito T humano modificado genéticamente no expresa un TCR endógeno en la superficie celular.
2. El linfocito T humano modificado genéticamente de la reivindicación 1, en el que dicho dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NÚM.: 117.
3. El linfocito T humano modificado genéticamente de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que dicho CAR comprende un dominio bisagra que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NÚM.: 116.
4. El linfocito T humano modificado genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho dominio coestimulador comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NÚM.: 114.
5. El linfocito T humano modificado genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho CAR comprende un péptido señal que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NÚM.: 115.
6. El linfocito T humano modificado genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho polinucleótido exógeno comprende una secuencia de promotor que promueve la expresión de dicho receptor de antígeno quimérico, preferentemente en el que dicha secuencia de promotor está establecida en la SEQ ID NÚM.: 118.
7. Un procedimiento de producción de un linfocito T humano modificado genéticamente que comprende un gen de la región constante alfa de TCR humano modificado y que codifica un CAR, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) introducir en un linfocito T humano una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una meganucleasa recombinante, en el que dicha meganucleasa recombinante tiene especificidad para una secuencia de reconocimiento dentro de dicho gen de la región constante alfa de TCR humano, en el que dicha secuencia de reconocimiento consiste en la SEQ ID NÚM.: 3, en el que dicha meganucleasa recombinante comprende una primera subunidad y una segunda subunidad, en el que dicha primera subunidad se une a un primer semisitio de reconocimiento de dicha secuencia de reconocimiento y comprende una primera región hipervariable (HVR1) y dicha segunda subunidad se une a un segundo semisitio de reconocimiento de dicha secuencia de reconocimiento y comprende una segunda región hipervariable (HVR2), y en el que dicha meganucleasa recombinante produce un sitio de escisión en dicha secuencia de reconocimiento; y
(b) introducir en dicho linfocito T humano una segunda secuencia de ácido nucleico que comprende un polinucleótido exógeno que codifica un CAR;
en el que dicho polinucleótido exógeno se inserta en dicho gen de la región constante alfa de TCR humano en dicho sitio de escisión,
en el que dicho CAR comprende un dominio de unión al ligando extracelular, un dominio transmembrana, un dominio coestimulador intracelular, y un dominio de señalización citoplasmática intracelular que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NÚM.: 113; y en el que dicho linfocito T humano modificado genéticamente no expresa un TCR endógeno en la superficie celular.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicha segunda secuencia de ácido nucleico comprende de 5' a 3':
(a) un brazo de homología 5' que es homólogo a la secuencia 5' aguas arriba que flanquea dicho sitio de escisión;
(b) dicho polinucleótido exógeno codificando dicho CAR; y
(c) un brazo de homología 3' que es homólogo a la secuencia 3' corriente abajo que flanquea dicho sitio de escisión; en el que dicho polinucleótido exógeno se inserta en dicho gen de la región constante del TCR alfa humano en dicho sitio de escisión por recombinación homóloga.
9. El procedimiento de la reivindicación 7 o reivindicación 8, en el que dicho dominio transmembrana comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NÚM.: 117.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que dicho CAR comprende un dominio bisagra que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ iD NÚM.: 116.
11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en el que dicho CAR comprende un dominio coestimulador que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NÚM.: 114.
12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en el que dicho CAR comprende un péptido señal que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID Nú M.: 115.
13. El linfocito T humano modificado genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 7-12, en el que dicho polinucleótido exógeno comprende una secuencia de promotor que promueve la expresión de dicho CAR, preferentemente en el que dicha secuencia de promotor está establecida en la SEQ ID NÚM.: 118.
14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7-13, en el que dicha primera secuencia de ácido nucleico es un ARNm, y en el que dicha segunda secuencia de ácido nucleico se introduce en dicho linfocito T humano poniendo en contacto dicho linfocito T humano con un vector de virus adenoasociado (AAV) recombinante que comprende dicha segunda secuencia de ácido nucleico, opcionalmente en el que dicho vector de AAV recombinante tiene un serotipo de AAV2 o AAV6.
15. Una composición farmacéutica para su uso en un procedimiento de inmunoterapia para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesite, comprendiendo dicha composición farmacéutica dicho linfocito T humano genéticamente modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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