BR112014029417B1

BR112014029417B1 - Método ex vivo para a preparação de células t para imunoterapia

Info

Publication number: BR112014029417B1
Application number: BR112014029417-8A
Authority: BR
Inventors: Roman Galetto; Agnes Gouble; Stephanie Grosse; Cecile Mannioui; Laurent Poirot; Andrew Scharenberg; Julianne Smith
Original assignee: Cellectis
Priority date: 2012-05-25
Filing date: 2013-05-13
Publication date: 2023-03-07
Also published as: US20200281979A1; US20210060080A1; US10517896B2; PL2855667T3; EP3276000A3; EP3279315A3; US20220177914A1; EP2855666A1; SG11201407802WA; KR102247979B1; US11891614B2; JP2018011603A; JP7257749B2; BR112014029417A2; US10426795B2; US20150203817A1; WO2013176916A1; EP3276000A2; JP2019058189A; MY180127A

Abstract

MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE CÉLULAS T PARA IMUNOTERAPIA, USO DAS DITAS CÉLULAS T, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, NUCLEASES TALE E POLINUCLEOTÍDEO QUE AS CODIFICAM. Métodos para desenvolver células T manipuladas para imunoterapia que não são alorreativas e resistentes a fármacos imunossupressores.A presente invenção refere-se a métodos para modificar células T pela inatialvo para endonucleases de corte raro, em particular nucleases TALE (endonuclease efetora TAL) e polinucleotídeos que codificam tais poli-peptídeos, para atingir precisamente uma seleção de genes importantes em células T, que são disponibilizados a partir de doadores ou de cultura de células primárias. A invenção abre caminho para estratégias padronizadas e acessíveis de imunoterapia adotadas para o tratamento de câncer e infecções virais.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Esse pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. 119(e) para o Pedido Provisório U.S. No. 61/651/993 depositado em 25 de maio de 2012; e para o Pedido Provisório U.S. No. 61/696.612 depositado em 4 de setembro de 2012, que estão incorporados aqui pela referência em suas totalidades.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se a métodos para desenvolver células T manipuladas para imunoterapia que são não alorreativas e resistentes a fármacos imunossupressores. A presente invenção refere-se a métodos para modificar as células T pela inativação de ambos os genes que codificam um alvo para um agente imunossupressor e receptor de célula T. Esse método envolve o uso de endonucleases de restrição de ação rara, em particular TALE nucleases (endonuclease efetora TAL) e polinucleotídeos que codificam tais polipeptídeos, para atingir precisamente uma seleção de genes-chave em células T, que são disponibilizadas a partir de doadores e de culturas de células primárias. A invenção também se refere a preTCRα ("pTalfa") e seus derivados funcionais, Receptor de antígeno Quimérico (CAR), de cadeia múltipla (CAR) e o uso desses para intensificar a eficiência da imuno- terapia. A invenção abre caminho para estratégias padronizadas e acessíveis de imunoterapia adotiva para o tratamento de câncer e infecções virais.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] A imunoterapia adotiva, que envolve a transferência de cé lulas T específicas para o antígeno autólogo geradas ex vivo, é uma estratégia promissora para tratar infecções virais e câncer. As células T usadas para imunoterapia adotiva podem ser geradas pela expansão de células T específicas para o antígeno ou redirecionamento de células T através da manipulação genética (Park, Rosenberg et al. 2011). A transferência de células T específicas para antígeno viral é um procedimento bem estabelecido usado para o tratamento de infecções virais associadas ao transplante e malignidades raras relacionadas com vírus. Similarmente, o isolamento e a transferência de células T específicas para o tumor tem mostrada ser bem sucedida no tratamento do melanoma.

[0004] Novas especificidades nas células T têm sido geradas com sucesso através da transferência genética de receptores de célula T transgênica ou receptores de antígeno quimérico (CARs) (Jena, Dotti et al. 2010). CARs são receptores sintéticos que consistem em uma porção de direcionamento que está associada com um ou mais domínios de sinalização em uma única molécula de fusão. Em geral, a porção de ligação de um CAR consiste em um domínio de ligação ao an- tígeno de um anticorpo de cadeia única (scFv), que compreende fragmentos leves e variáveis de um anticorpo monoclonal ligados por um ligante flexível. Porções de ligação baseadas em domínios do receptor ou do ligante também têm sido usadas com sucesso. Os domínios de sinalização para CARs de primeira geração são derivados da região citoplasmática de CD3zeta ou de cadeias gama do receptor Fc. CARs de primeira geração têm mostrado redirecionar com sucesso a citoto- xicidade de célula T, entretanto, eles falharam em fornecer expansão prolongada e atividade antitumor in vivo. Domínios de sinalização de moléculas coestimulatórias incluindo CD28, OX-40 (CD134) e 4-1BB (CD137) têm sido adicionadas sozinhas (segunda geração) ou em combinação (terceira geração) para intensificar a sobrevida e aumentar a proliferação de células T modificadas por CAR. CARs têm permitido com sucesso que as células T sejam redirecionadas contra antí- genos expressos na superfície das células tumorais de várias malignidades incluindo linfomas e tumores sólidos (Jena, Dotti et al. 2010).

[0005] As arquiteturas dos presentes CAR são construídas com um desenho no qual todos os domínios relevantes estão contidos dentro de um único polipeptídeo. Esse desenho necessita de anexação seriada de domínios de sinalização, necessitando assim mover alguns domínios a partir de suas posições justa-membrana naturais. Portanto, as arquiteturas nas quais os ligantes e os domínios de sinalização estão separados pode permitir uma função aperfeiçoada de domínios coestimulatórios colocados em cadeias diferentes em suas posições justa-membrana normais, ao invés de anexados juntos com alguns domínios posicionados distalmente da membrana plasmática. Um receptor natural, o receptor de alta afinidade para IgE (FcεRI) pode fornecer tal arquitetura. FcεRI presente em células mastocitárias e basófi- los se liga a IgE com alta afinidade. FcεRI é um complexo de receptor tetramérico que consiste em uma subunidade alfa que se liga ao ligan- te, uma subunidade beta e um homodímero que consiste em um domínio extracelular contém dois domínios semelhantes a Ig que se ligam a IgE, um domínio transmembrana e uma cauda citoplasmática curta. A subunidade contém quatro segmentos transmembrana que separam as caudas citoplasmáticas amino e carboxi terminais. A cadeia gama consiste essencialmente em uma região transmembrana e uma cauda citoplasmática que contém um motivo de ativação de imu- norreceptor baseado em tirosina (ITAM) (Cambier 1995). A cadeia zeta do complexo TCR é intimamente relacionada com a cadeia gama e pode substituir a cadeia gama de FcεRI (Howard, Rodewald et al. 1990).

[0006] O protocolo atual de tratamento de pacientes que usam a imunoterapia adotiva é baseado na transferência de célula autóloga. Nessa abordagem, os linfócitos T são recuperados de pacientes gene- ticamente modificados ou selecionados ex vivo, cultivados in vitro a fim de amplificar o número de células se necessário e finalmente infundidos no paciente. Em adição à infusão de linfócito, o hospedeiro pode ser manipulado de outras maneiras que apoiam o enxerto das células T ou sua participação em uma resposta imune, por exemplo, pré- condicionamento (com radiação ou quimioterapia) e administração de fatores de crescimento de linfócito (tal como IL-2). Cada paciente recebe um tratamento fabricado individualmente, usando os linfócitos do próprio paciente (isto é, uma terapia autóloga). As terapias autólogas enfrentam obstáculos técnicos e logísticos substanciais para aplicação clínica, sua geração requer instalações dedicadas caras e pessoal especializado, elas devem ser geradas em curto prazo depois do diagnóstico do paciente e, em muitos casos, o pré-tratamento do paciente resultou em função imune degradada, tal que os linfócitos do paciente podem ser funcionalmente deficientes e presentes em números muito baixos. Devido a esses obstáculos, cada preparação de célula autólo- ga do paciente é efetivamente um produto novo, que resulta em variações substanciais na eficácia e segurança. Idealmente, gostaríamos de usar uma terapia padronizada na qual as células terapêuticas alo- gênicas pudessem ser pré-fabricadas, caracterizadas em detalhes e disponíveis para administração imediata aos pacientes. Por alogênicas entende-se que as células são obtidas de indivíduos que pertencem a mesma espécie, mas que são geneticamente diferentes. Entretanto, o uso de células alogênicas atualmente apresenta várias desvantagens. Em hospedeiros imuno-incompetentes, as células alogênicas são capazes de enxertar, mas suas especificidades de TCR endógeno reconhecem o tecido hospedeiro como estranho, resultando na doença do enxerto versus hospedeiro (GvHD), o que pode levar a um sério dano tecidual e morte. A fim de usar efetivamente as células alogênicas, ambos problemas devem ser superados.

[0007] Em hospedeiros imunocompetentes, as células alogênicas são rapidamente rejeitadas pelo sistema imune do hospedeiro. Foi demonstrado que leucócitos alogênicos presentes em produtos sanguíneos não irradiados persistirão por não mais do que 5 a 6 dias (Boni, Muranski et al. 2008). Portanto, para evitar a rejeição das células alogênicas, o sistema imune do hospedeiro deve ser efetivamente suprimido. Os glicocorticoides são amplamente usados terapeuticamente para a imunossupressão (Coutinho e Chapman 2011). Essa classe de hormônios esteroides se liga ao receptor de glicocorticoide (GR) presente no citossol de células T, resultando na translocação para o núcleo e a ligação de motivos específicos de DNA que regulam a expressão de vários genes envolvidos no processo imunológico. O tratamento de células T com esteroides glicocorticoides resulta em níveis reduzidos de produção de citocina que leva a anergia de célula T e interfere na ativação de célula T. Alemtuzumab, também conhecido como CAMPATH1-H, é um anticorpo monoclonal humanizado que atinge CD52, uma glicoproteína ligada a glicosilfosfatidil-inositol (GPI) com 12 aminoácidos (Waldmann e Hale, 2005). CD52 é expresso em altos níveis em linfócitos T e B e em níveis mais baixos em monócitos, estando ausente em granulócitos e precursores da medula óssea. O tratamento com Alemtuzumab, um anticorpo monoclonal humanizado direcionado contra CD52, tem mostrado induzir uma depleção rápida de linfócitos e monócitos circulantes. Ele é usado frequentemente no tratamento de linfomas de célula T e em certos casos, como parte de um regime de condicionamento para o transplante. Entretanto, no caso da imunoterapia adotiva, o uso de fármacos imunossupressores também terá um efeito deletério sobre as células T terapêuticas introduzidas. Portanto, para usar efetivamente uma abordagem de imunoterapia adotiva nessas condições, as células introduzidas necessitarão ser resistentes ao tratamento imunossupressor.

[0008] Por outro lado, os receptores de célula T (TCR) são recep tores da superfície celular que participam na ativação de células T em resposta à apresentação do antígeno. O TCR é geralmente feito a partir de duas cadeias, alfa e beta, que se unem para formar um hetero- dímero e se associam com as subunidades que transduzem CD3 para formar o complexo do receptor de célula T presente sobre a superfície celular. Cada cadeia alfa e beta do TCR consiste em uma região variável (V) e constante (C) terminais semelhantes a imunoglobulina, um domínio transmembrana hidrofóbico e uma região citoplasmática curta. Como para as moléculas de imunoglobulina, a região variável das cadeias alfa e beta são geradas pela recombinação V(D)J, criando uma grande diversidade de especificidades antigênicas dentro da população de células T. Entretanto, em contraste com as imunoglobulinas que reconhecem o antígeno intacto, as células T são ativadas pelos fragmentos do peptídeo processado em associação com uma molécula MHC, introduzindo uma dimensão extra para o reconhecimento do antígeno pelas células T, conhecida como restrição com MHC. O reconhecimento de disparidades de MHC entre o doador e o receptor através do receptor da célula T leva a proliferação da célula T e o desenvolvimento potencial de GVHD. Foi mostrado que a expressão da superfície normal de TCR depende da síntese coordenada e montagem de todos os sete componentes (Ashwell e Klusner 1990). A inati- vação de TRCalfa ou TCRbeta pode resultar na eliminação de TCR da superfície das células T, evitando o reconhecimento do aloantígeno e assim GVHD. Entretanto, a quebra de TCR resulta na eliminação do componente de sinalização de CD3 e altera os meios de expansão da célula T.

[0009] Em células T normais, os receptores de célula T emanam dos receptores pre-célula T (pTCR) que são expressos pelos timócitos imaturos e são cruciais para o desenvolvimento da célula T dos está- gios duplo negativo (CD4- CD8-) ao duplo positivo (CD4+ CD8+). As pre-células T que têm sucesso em rearranjos produtivos do lócus TCRbeta expressam uma cadeia TCRbeta funcional que pareia com uma cadeia preTalfa invariante e componentes de sinalização de CD3 para formar o complexo pre-TCR. A expressão do preTCR na superfície celular é necessária para desencadear a seleção beta, um processo que induz a expansão do desenvolvimento de células T, obriga a exclusão alélica do lócus de TCRbeta e resulta na indução de rearran- jos no lócus TCRalfa (von Boehmer 2005). Depois dos rearranjos produtivos de TCRalfa e da substituição de pTalfa por TCRalfa para formar um TCR maduro, os timócitos sofrem uma segunda etapa de seleção, referida como positiva ou seleção TCRalfa/beta depois da ligação do próprio peptídeo de complexos MHC expressos sobre células epiteliais do timo. Portanto, as células T maduras reconhecem e respondem ao complexo antígeno/MHC através de seu TCR. A consequência mais imediata da ativação de TCR é a iniciação das vias de sinalização através das subunidades de CD3 associadas que resultam em múltiplos eventos que incluem a expansão clonal de células T, regulação positiva de marcadores de ativação sobre a superfície celular e indução de citotoxicidade ou secreção de citocina.

[00010] Devido à natureza da seleção de cadeias TCRbeta através do pareamento com preTalfa durante o desenvolvimento do timo, nas células T nas quais TCRalfa tenha sido inativada, a introdução heteró- loga do transgene pTalfa pode resultar na formação de um preTCR. Esse pTCR pode servir como um meio de ativação ou estimulação da célula T de uma permitindo maneira que não é dependente de MHC, por exemplo, permitindo assim a expansão continuada de células T alfa/beta que acompanham a inativação de TCRalfa. O complexo pTCR exibe uma composição bioquímica similar como o TCR em termos de subunidades de CD3 associadas (Carrasco, Ramiro et al. 2001). Em adição, em contraste com o TCR, a sinalização pre-TCR pode ocorrer em parte por um evento independente do ligante. A estrutura cristalina do domínio extracelular de pTCR tem fornecido uma base estrutural para a possível independência do ligante da sinalização de pTCR. O pTCR tem mostrado formar um dímero de cabeça para cauda onde dois heterodímeros de pTalfa-TCRbeta se associam (Pang, Berry et al 2010).

[00011] Na presente invenção, os inventores obtiveram a produção de células T geneticamente modificadas, que superam as limitações das presentes estratégias de imunoterapia, possibilitando que elas sejam não alorreativas e resistentes a agentes imunossupressores. Isso foi tornado possível pela inativação do gene usando TALE nucleases específicas direcionadas contra TCRalfa ou TCRbeta, acoplada com a inativação de genes que codificam alvos para agentes imunossupres- sores diferentes, em particular CD52 e GR.

[00012] Em particular, a inativação de TCRalfa ou TCRbeta acoplada com a inativação de CD52 ou o receptor de glicocorticoide em linfó- citos T derivados de um doador alogênico significativamente reduz o risco de GVHD, pela eliminação de TCR, responsável pelo reconhecimento de disparidades de MHC, enquanto permite a proliferação e a atividade dos linfócitos introduzidos na presença de fármacos imunos- supressores, tais como Alemtuzumab ou esteroides glicocorticóides, que evitam a rejeição dessas células. Portanto, essas células T alogê- nicas modificadas são esperadas expandir mais eficientemente no sangue do paciente, onde elas podem atingir células de tumor ou células infectadas.

[00013] Em adição à concepção acima de células T geneticamente modificadas, que podem ser não alorreativas e resistentes a imunos- supressores, os inventores, pelo uso e planejamento de TALE nucleases específicas, inativaram concomitantemente esses diferentes genes nas células T, obtendo dessa maneira mutantes duplos. Na realidade, a segmentação de gene duplo por DSB ainda não tinha sido obtida em células T devido à dificuldade de rendimento e manutenção de das células T em cultura ao longo do tempo, às suas baixas taxas de transformação e a perda durante os procedimentos de seleção. Essas dificuldades resultam em uma pequena probabilidade de sucesso para a obtenção de tais células.

[00014] Portanto, uma parte significativa da invenção é ter TALE nucleases específicas planejadas, que permitem taxas maiores de eventos de DSB dentro das células T, que são bem tolerados pelas células (especialmente depois da cotransfecção), capazes de atingir a seleção de genes de acordo com a invenção. Pelo uso de endonucleases de corte raro (rare cutting endonucleases), tais como as TALE nucleases aqui descritas, a probabilidade de obtenção de inativação dupla dos genes nas células T transfectadas foi significativamente aumentada, tal que agora parece possível produzir células T manipuladas disponibilizadas por doadores em uma base regular, usando procedimentos padronizados.

[00015] Adicionalmente, a presente invenção propõe uma modalidade onde as células T são manipuladas para possibilitar a proliferação quando TCRalfa está inativado. Um problema significativo com as células T que tenham sofrido inativação da subunidade TCR é que as células não podem mais ser expandidas através do complexo CD3. Para superar esse problema, os inventores fornecem de fato meios para expandir as células T, nos quais TCRalfa tenha sido inativado através do complexo CD3, pela expressão de preTalfa nas células, restaurando dessa maneira um complexo CD3 funcional na ausência de TCR alfa/beta funcional.

[00016] Finalmente, as células T são transformadas com CAR para redirecionar a especificidade de células alogênicas em direção a antí- genos associados com tumor independentes de MHC. Em particular, a invenção se refere a um CAR de cadeia múltipla, no qual domínios co- estimulatórios são colocados em suas posições justa-membrana normais para aperfeiçoar suas funções e assim intensificar a sobrevida e aumentar a proliferação das células T manipuladas. Como resultado, a invenção fornece métodos, polipeptídeos e polinucleotídeos que permitem a transformação eficaz de células T alogênicas para imunotera- pia adotiva e sua fácil expansão através do complexo CD3.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00017] Em um aspecto, a presente invenção descreve métodos para manipular células T, em particular células T alogênicas obteníveis de doadores, para torna-las adequadas para os propósitos de imunote- rapia. Os métodos da presente invenção permitem, mais particularmente, a modificação precisa do genoma de células relevantes para imunoterapia pela inativação ou substituição de genes envolvidos no reconhecimento de MHC e/ou de alvos de fármacos imunossupresso- res para o tratamento de câncer e/ou infecções virais. Em certas modalidades, as células modificadas relevantes para a imunoterapia compreendem, adicionalmente, polinucleotídeos recombinantes exógenos que codificam CARs para o reconhecimento celular específico. Os presentes CARs são moléculas de fusão únicas que necessitam de anexação seriada de domínios de sinalização. A mobilização dos domínios de sinalização de sua posição justa-membrana natural pode interferir com sua função. Portanto, para superar esse obstáculo, os inventores projetaram um CAR de cadeia múltipla derivado de FcεRI para permitir a posição justa-membrana normal de todos os domínios de sinalização. O domínio de ligação de alta afinidade a IgE da cadeia alfa de FcεRI é substituído por um domínio de ligação ao ligante extra- celular tal como scFv para redirecionar a especificidade da célula T para células alvo e as caudas N e/ou C terminais da cadeia FcεRI beta são usadas para colocar os sinais coestimulatórios nas posições justa- membrana normais.

[00018] Em outro aspecto, a fim de promover a ativação ou a estimulação de células T nas quais TCRalfa tenha sido inativado, pTalfa ou uma variante funcional desse são introduzidos nas células T manipuladas. pTalfa ou uma variante funcional usados podem ser pTalfa de extensão completa, uma variante de splice (Saint-Ruf, Lechner et al. 1998), uma versão truncada C terminal que tenha mostrado aumentar a expressão de preTCR na superfície celular (Carrasco, Ramiro et al. 2001). Outros truncamentos adicionais menores ou maiores do que descrito podem ser usados. Versões diferentes de preTalfa podem compreender adicionalmente porções de sinalização de outras moléculas (CD28, CD137, CD8, TCRalfa, etc.) para promover a proliferação e sobrevida ou compreender mutações que afetam sua habilidade em dimerizar, tal como as mutações D22A, R24A, R102A ou R117A previamente descritas em camundongos (Yamasaki, Ishikawa et al 2006) ou a mutação W46R descrita em humanos (Pang, Berry et al 2010) para diminuir o potencial de proliferação. A porção scFv de CAR também pode ser fundida ao domínio extracelular de um pTalfa ou uma variante funcional desse, acoplando assim a especificidade frente aos antígenos alvo diretamente com a atividade proliferativa de preTCR.

[00019] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a polipep- tídeos e polinucleotídeos que codificam as endonucleases de corte raro, para atingir precisamente os genes de interesse acima, em particular TCRalfa, TCRbeta, GR e CD52, possibilitando dessa maneira a modificação genética das células T para imunoterapia. A presente invenção fornece mais particularmente, sequências alvo específicas dentro desses genes e TALE nucleases designadas para atingir respectivamente esses genes.

[00020] A presente invenção também se refere a células isoladas ou linhagens celulares que compreendem qualquer uma das proteínas, polipeptídeos ou vetores aqui descritos. Em certas modalidades, as células T da presente invenção compreendem os genes inativados de TCRalfa, TCRbeta, Gr ou CD52 para uso em imunoterapia. As células isoladas da presente invenção ou linhagens celulares podem compreender polinucleotídeos recombinantes exógenos, em particular polinu- cleotídeos que codificam pTalfa ou uma variante funcional desse, CARs ou CARs de cadeia múltipla.

[00021] Em uma modalidade preferida, as células T modificadas são usadas como um produto terapêutico, idealmente como um produto "disponível no mercado".

[00022] Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para tratar ou prevenir o câncer ou infecções na paciente pela administração de uma célula T manipulada obtenível pelos métodos acima. DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS E TABELAS

[00023] Em adição às características precedentes, a invenção compreende adicionalmente outras características que emergirão da descrição a seguir, assim como das figuras em anexo. Uma apreciação mais completa da invenção e várias das vantagens em anexo serão rapidamente obtidas como as mesmas se tornam melhor compreendidas pela referência às Figuras a seguir em conjunto com a descrição detalhada abaixo.

[00024] Figura 1: Representação esquemática do relacionamento normal entre células T e célula que apresenta antígeno.

[00025] Figura 2: Representação esquemática de células T tera pêuticas geneticamente modificadas de acordo com a invenção e células tumorais do paciente.

[00026] Figura 3: Representação esquemática de CAR de cadeia múltipla.

[00027] Figura 4: Esquema de versões diferentes de CARs de cadeia múltipla. A. Esquema do receptor FcεRI. B-C. Versões diferentes de CARs de cadeia múltipla (csm1 a csm10) compreendendo um scFv e uma região da haste de CD8 fundidos ao domínio transmembrana da cadeia alfa de FcεRI. Pelo menos um dos domínios zeta de 41BB, CD28 e/ou CD3 podem ser fundidos a uma cadeia alfa, beta e/ou gama de FcεRI.

[00028] Figura 5: Representação esquemática de um exemplo do método de manipulação de células alogênicas para imunoterapia.

[00029] Figura 6: Concentração em células por mililitro de células positivas para CD52 ou negativas para CD52 vivas depois do tratamento com o anticorpo anti-CD52 (CAMPATH1-H) com complemento ou controles.

[00030] Figura 7: Comparação da distribuição da dispersão lateral e frontal (FSC), um indicador do tamanho celular, entre células positivas para TCR e células negativas para TCR ou entre células positivas para CD52 e negativas para CD52 e células não ativadas como controle.

[00031] Figura 8: Análise por citometria de fluxo da expressão de CD107a (marcador de degranulação) em células T inativadas direcionadas para CD52 e TCRalfa. A expressão de CD107 é analisada em células CD52+TCRαβ+ (primeira coluna), CD52-TCRαβ- (segunda coluna), CD52- TCRαβ+ (terceira coluna) e CD52+TCRαβ- (quarta coluna) antes (A) e depois da incubação com células Daudi (B); C) representa a Análise por citometria de fluxo de células T adicionalmente transfectadas com um CAR e incubadas com células Daudi; D) representa Análise por citometria de fluxo de células T adicionalmente transfectadas com um CAR, mas não incubadas com células Daudi e E) representa Análise por citometria de fluxo de células T transfecta- das com um CAR e tratadas com PMA/ionomicina (controle positivo).

[00032] Figura 9: Análise de sequenciamento de alta eficiência de alvos fora do sítio potencias de CD52 e Nucleases TRAC TALE.

[00033] Figura 10: Análise do lócus genômico de PDCD1 e CTLA-4 pelo ensaio da T7 endonuclease. As setas mostram os produtos digeridos de PCR.

[00034] Figura 11: Representação esquemática de alguns exemplos de construtos preTalfa.

[00035] Figura 12: Análise por citometria de fluxo da eficiência de transdução (% de células BFP+) e atividade dos construtos pTalfa FL, Δ18, Δ48 (% de expressão de CD3 na superfície) em células Jurkat com TCR alfa inativado.

[00036] Figura 13: Representação esquemática de um construto lentiviral que codifica a proteína pTalfa (preTCRα).

[00037] Figura 14: A. Representação do protocolo experimental. B. Análise por citometria de fluxo de TCR alfa/beta, expressão de CD3 e expressão de BFP sobre células T com TCRalfa inativado (KO) trans- duzidas com BFP-2A-pTalfaΔ48 (KO/Δ48) ou com o vetor lentiviral de BFP de controle (KO/BFP) antes e depois da purificação. C. Análise por citometria de fluxo de TCR alfa/beta e a expressão de CD3 sobre células com TCRalfa inativado transduzidas (BFPpos) ou não BFPneg) com o vetor lentiviral BFP-2A-pTalfaΔ48. NEP representa células não eletroporadas com Nucleases TRAC TALE.

[00038] Figura 15: A-B. Análise por citometria de fluxo da expressão do marcador de ativação precoce CD69 (A), marcador de ativação tardio CD25 (B) 24 e 48 horas depois da reativação com esferas anti- CD3/CD28, respectivamente, sobre células não eletroporadas (NEP) e células com TCRalfa inativado (KO) transduzidas com o vetor lentiviral BFP-2A-pTα-Δ48 (pTα-Δ48), vetor lentiviral BFP-2A-pTα-Δ48.41BB (pTα-Δ48.BB) e vetor BFP de controle (BFP). Os histogramas de pTα- Δ48 correspondem ao sinal detectado nas células com TCR inativado que expressam pTα-Δ48 (células BFP+) enquanto que os histogramas KO correspondem a células com TCRalfa inativado que não expressam pTα-Δ48.41BB (células BFP-). Histogramas NEP (não eletropora- das) correspondem ao sinal detectado em células não manipuladas. C. Análise por citometria de fluxo do tamanho de células 72 horas depois da reativação com esferas anti-CD3/CD28 sobre células não eletropo- radas (NEP) e células com TCRalfa inativado (KO) transduzidas com o vetor lentiviral BFP-2A-pTα-Δ48 (pTα-Δ48), vetor lentiviral BFP-2A- pTα-Δ48.41BB (pTα-Δ48.BB) e vetor BFP de controle (BFP). Os valores indicados na parte superior de cada gráfico correspondem à média geométrica da fluorescência de cada população.

[00039] Figura 16: Análise do crescimento celular de células com TCRalfa inativado (KO) transduzidas com pTalfa-Δ48 (pTα Δ48) ou vetor BFP de controle (BFP) mantidas em IL2 ou em IL2 com esferas anti-CD3/CD28 em diferentes pontos de tempo (eixo de x). O número de células BFP+ é avaliado em diferentes pontos de tempo para cada condição e a indução de duplicação dessas células (eixo de y) foi avaliado com relação ao valor obtido no dia 2 depois da reativação. Os resultados são obtidos a partir de dois doadores independentes. Para o segundo doador, o crescimento celular também foi determinado para células transduzidas com pTalfa-Δ48.41BB (pTα-Δ48.BB) e pTalfa (pTα-FL).

[00040] Figura 17: Análise por citometria de fluxo de células positivas para GFP em PBMCs eletroporadas com os cinco programas Cytopulse diferentes. A linha superior corresponde à transfecção de 6 x 106 células por cuveta, enquanto que a linha inferior corresponde a transfecção de 3 x 106 células por cuveta.

[00041] Figura 18: Análise por citometria de fluxo da mortalidade de célula T purificada usando o corante de viabilidade (eFluor-450) e de células positivas para GFP entre a população viável depois da ele- troporação com mRNA GFP, DNA GFP e pUC DNA de controle. NEP corresponde às células que foram mantidas em tampão de eletropora- ção, mas não foram eletroporadas e NT corresponde a células não eletroporadas mantidas em meio de cultura.

[00042] Figura 19: Análise por citometria de fluxo de TCR alfa/beta e expressão de CD3 em células T primárias humanas depois da ele- troporação com mRNA de TRAC TALE nuclease (alto). Análise do se- quenciamento de alto rendimento de DNA genômico extraído de células T primárias humanas depois da eletroporação com mRNA de TRAC TALE nuclease (embaixo).

[00043] Figura 20: A. Análise por citometria de fluxo da expressão de CAR (antiF(ab’)2) depois da eletroporação de células T com ou sem mRNA que codifica um CAR de cadeia simples. B. Análise por citometria de fluxo da expressão de CD107a (marcador de degranula- ção) em células T eletroporadas cocultivadas com células daudi.

[00044] Figura 21: A. Representação de mRNA que codifica um CAR de cadeia múltipla. B. Análise por citometria de fluxo da expressão de CAR (anti F(ab’)2) sobre células T viáveis eletroporadas com ou sem um mRNA policistrônico que codifica um CAR de cadeia múltipla. C. Análise por citometria de fluxo da expressão de CD107a (marcador de degranulação) em células T eletroporadas cocultivadas com células daudi.

[00045] Tabela 1: Descrição das GR TALE nucleases e sequências dos sítios-alvo de TALE nucleases no gene GR humano.

[00046] Tabela 2: Atividade de clivagem das GR TALE nucleases na levedura. Os valores estão compreendidos entre 0 e 1. O valor máximo é 1.

[00047] Tabela 3: Percentual de mutagênese direcionada em sítios- alvo de TALE nuclease endógena em células 293.

[00048] Tabela 4: Percentual de mutagênese direcionada em sítios alvo de TALE nuclease endógena em linfócitos T primários.

[00049] Tabela 5: Descrição de CD52, TRAC e TRBC TALE nucleases e sequências dos sítios-alvo de TALE nuclease nos genes humanos correspondentes.

[00050] Tabela 6: Sequências-alvo adicionais para TRAC e CD52 TALE nucleases.

[00051] Tabela 7: Percentual de indels para TALE nuclease que atinge os alvos CD52_T02, TRAC_T01, TRBC_T01 e TRBC_02.

[00052] Tabela 8: Percentuais de linfócitos T negativos para CD52, negativos para TCR e duplo negativos para CD52/TCR depois da transfecção dos polinucleotídeos que expressam TALE nuclease.

[00053] Tabela 9: Percentuais de linfócitos T negativos para TCR depois da Transfecção de polinucleotídeos que expressam nucleases TRBC TALE.

[00054] Tabela 10: Descrição das CTLA4 e PDCD1 TALE- nucleases e sequências dos sítios-alvo de TALE nucleases nos genes humanos correspondentes.

[00055] Tabela 11: Descrição de um subgrupo de construtos de pTalfa.

[00056] Tabela 12: Atividade dos diferentes construtos pTalfa em célula Jurkat com TCR alfa inativado. A atividade foi medida pela análise de citometria de fluxo da expressão de CD3 na célula Jurkat com TCR alfa inativado transfectada com diferentes construtos preTalfa.

[00057] Tabela 13: Programas de cytopulso diferentes usados para determinar a voltagem mínima necessária para a eletroporação em células T derivadas de PBMC.

[00058] Tabela 14: Programa de cytopulso usado nas células T ele- troporadas purificadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00059] A menos que especificamente definido aqui, todos os ter- mos técnicos e científicos usados possuem o mesmo significado como comumente conhecidos pelo técnico experiente nos campos da terapia com gene, bioquímica, genética e biologia molecular.

[00060] Todos os métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui podem ser usados na prática ou na experimentação da presente invenção, com métodos e materiais adequados estando aqui descritos. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas aqui estão incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo as definições, prevalecerá. Adicionalmente, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não são pretendidos ser limitantes a menos que especificado de outra maneira.

[00061] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra maneira, técnicas convencionais de biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, que estão dentro do conhecimento da técnica. Tais técnicas estão totalmente explicadas na literatura. Veja, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); a série, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds. -in-chief, Academic Press, Inc., New York), especificamente, Vols.154 e 155 (Wu et al. eds.) e Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); e Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

[00062] Em um aspecto geral, a presente invenção se refere a métodos para novas estratégias de imunoterapia adotiva no tratamento do câncer e de infecções. Células T resistentes não alorreativas e imunossupressoras:

[00063] Em um aspecto particular, a presente invenção se refere a um método de manipulação de células T especialmente para imunote- rapia. Em particular esse método compreende:

[00064] (a) modificar células T pela inativação de pelo menos:

[00065] - Um primeiro gene que expresse um alvo para um agente imunossupressor, e

[00066] - Um segundo gene que codifique um componente do re ceptor da célula T (TCR)

[00067] (b) Expandir as ditas células, opcionalmente na presença do dito agente imunossupressor.

[00068] Um agente imunossupressor é um agente que suprime a função imune por um de vários mecanismos de ação. Em outras palavras, um agente imunossupressor tem um papel desempenhado por um composto que é exibido pela capacidade de diminuir a extensão e/ou a voracidade de uma resposta imune. Como um exemplo não li- mitante, um agente imunossupressor pode ser um inibidor de calcineu- rina, um alvo de rapamicina, um bloqueador da cadeia α de interleuci- na-2, um inibidor inosino monofosfato desidrogenase, um inibidor de ácido di-hidrofólico redutase, um corticosteroide ou um antimetabolito imunossupressor. Imunossupressores citotóxicos clássicos atuam pela inibição da síntese do DNA. Outros atuam através da ativação de células T ou pela inibição da ativação de células auxiliares. O método de acordo com a invenção permite conferir resistência imunossupressora às células T para imunoterapia pela inativação do alvo do agente imu- nossupressor nas células T. Como exemplos não limitantes, alvos para o agente imunossupressor podem ser um receptor de agente imunos- supressor tal como: CD52, receptor de glicocorticoide (GR) um membro da família de gene FKBP e um membro da família de gene de ci- clofilina.

[00069] Em uma modalidade particular, a etapa de modificação genética do método recai sobre a inativação de um gene selecionado do grupo que consiste em CD52, GR, TCR alfa e TCR beta. Em outra modalidade, a etapa de modificação genética do método recai sobre a inativação de dois genes selecionados do grupo que consiste em CD52 e GR, CD52 e TCR alfa, CD52 e TCR beta, GR e TCR alfa, GR e TCR beta, TCR alfa e TCR beta. Em outra modalidade, a etapa de modificação genética do método recai sobre a inativação de mais do que dois genes. A modificação genética é preferivelmente operada ex- vivo.

[00070] Por inativação de gene é pretendido que o gene de interesse não seja expresso em forma de uma proteína funcional. Em uma modalidade particular, a modificação genética do método recai sobre a expressão, em células fornecidas para manipular, de uma endonuclease de corte raro tal que a endonuclease de corte raro catalise especificamente a clivagem de um gene objetivado, inativando dessa maneira o dito gene objetivado. As quebras da fita de ácido nucleico causadas pela endonuclease de corte raro são comumente reparadas através de mecanismos distintos de recombinação homóloga ou jun-ção de extremidades não homólogas (NHEJ). Entretanto, NHEJ é um processo de reparo imperfeito que geralmente resulta em alterações para a sequência de DNA no sítio de clivagem. Os mecanismos envolvem a religação do que resta das duas extremidades do DNA através da religação direta (Critchlow e Jackson 1998) ou através da assim chamada ligação da extremidade mediada por micro-homologia (Ma, Kim et al. 2003). O reparo através da junção de extremidade não homóloga (NHEJ) geralmente resulta em pequenas inserções ou dele- ções e pode ser usado para a criação de knockouts de gene específicos. A dita modificação pode ser uma substituição, deleção ou adição de pelo menos um nucleotídeo. As células nas quais um evento de mutagênese induzido pela clivagem, isto é, um evento de mutagênese consecutivo a um evento de NHEJ, ocorreu podem ser identificadas e/ou selecionadas por um método bem conhecido na técnica. Em uma modalidade particular, o dito método para manipular células compreende pelo menos uma das seguintes etapas:

[00071] (a) Fornecer uma célula T, preferivelmente de uma cultura celular ou de uma amostra de sangue;

[00072] (b) Selecionar um gene na dita célula T que expresse um alvo para um agente imunossupressor;

[00073] (c) Introduzir na dita célula T uma endonuclease de corte raro capaz de inativar seletivamente pela clivagem do DNA, preferivelmente pela quebra da fita dupla, respectivamente:

[00074] - do dito gene que codifica um alvo para o dito agente imu- nossupressor e

[00075] - pelo menos um gene que codifica um componente do re ceptor de célula T (TCR).

[00076] (d) Expandir as ditas células, opcionalmente na presença do dito agente imunossupressor.

[00077] Em uma modalidade mais preferida, o dito método compreende:

[00078] (a) Fornecer uma célula T, preferivelmente de uma cultura celular ou de uma amostra de sangue;

[00079] (b) Selecionar um gene na dita célula T que expresse um alvo para um agente imunossupressor;

[00080] (c) Transformar a dita célula T com um ácido nucleico que codifique uma endonuclease de corte raro capaz de inativar seletivamente pela clivagem do DNA, preferivelmente pela quebra da fita dupla, respectivamente

[00081] - do dito gene que codifica um alvo para o dito agente imu- nossupressor e

[00082] - pelo menos um gene que codifica um componente do re ceptor de célula T (TCR).

[00083] (d) Expressar as ditas endonucleases de corte raro nas di tas células T;

[00084] (e) Selecionar as células T transformadas que não expres sam TCR sobre sua superfície celular;

[00085] (f) Expandir as ditas células, opcionalmente na presença do dito agente imunossupressor.

[00086] Em uma modalidade particular, a dita endonuclease de corte raro atinge especificamente um gene selecionado do grupo que consiste em CD52, GR, TCR alfa e TCR beta. Em outra modalidade, a modificação genética do método recai sobre a expressão, nas células fornecidas para manipular, de duas endonucleases de corte raro tal que cada uma das ditas endonucleases de corte raro catalisa especificamente e respectivamente a clivagem em cada um dos pares de genes selecionados do grupo que consiste em CD52 e GR, CD52 e TCR alfa, CD52 e TCR beta, GR e TCR alfa, GR e TCR beta, TCR alfa e TCR beta, inativando dessa maneira os ditos genes atingidos. Em outra modalidade, mais do que duas endonucleases de corte raro podem ser expressas em células para manipular a fim de atingir e/ou inativar mais do que dois genes.

[00087] Em outra modalidade, o dito gene da etapa (b), específico para um tratamento imunossupressor, é CD52 e o tratamento imunos- supressor da etapa (d) ou (e) compreende um anticorpo humanizado que atinge o antígeno CD52.

[00088] Em outra modalidade, o dito gene da etapa (b), específico para um tratamento imunossupressor, é um receptor de glicocorticoide (GR) e o tratamento imunossupressor da etapa (d) ou (e) compreende um corticosteroide tal como dexametasona.

[00089] Em outra modalidade, o dito gene da etapa (b), específico para um tratamento imunossupressor, é um membro da família de gene de FKBP ou uma variante desse e o tratamento imunossupressor da etapa (d) ou (e) compreende FK506 também conhecido como Tacrolimus ou fujimicina. Em outra modalidade, o dito membro da família de gene de FKBP é FKBP12 ou uma variante desse.

[00090] Em outra modalidade, o dito gene da etapa (b), específico para um tratamento imunossupressor, é um membro da família de gene de ciclofilina ou uma variante desse e o tratamento imunossupres- sor da etapa (d) ou (e) compreende ciclosporina.

[00091] Em outra modalidade, a dita endonuclease e corte raro pode ser uma meganuclease, uma nuclease dedo de zinco ou TALE nucleases. Em uma modalidade preferida, a dita endonuclease de corte raro é uma TALE nuclease. Por TALE nuclease é pretendido uma proteína de fusão que consiste em um domínio de ligação de DNA derivado de um Efetor Semelhante ao Ativador da Transcrição ("Transcription Activator Like Effector" (TALE) e um domínio catalítico de nuclease para clivar uma sequência alvo de ácido nucleico. (Boch, Scho- lze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009)(Deng, Yan et al. 2012; Mak, Bradley et al. 2012)(Christian, Cermak et al. 2010; Cermak, Doyle et al. 2011 ; Geissler, Scholze et al. 2011; Huang, Xiao et al. 2011 ; Li, Huang et al. 201 1; Mahfouz, Li et al. 2011 ; Miller, Tan et al. 2011 ; Morbitzer, Romer et al. 2011; Mussolino, Morbitzer et al. 2011 ; Sander, Cade et al. 2011 ; Tesson, Usal et al. 2011; Weber, Gruetzner et al. 2011 ; Zhang, Cong et al. 2011; Li, Piatek et al. 2012; Mahfouz, Li et al. 2012). Na presente invenção, novas TALE nucleases foram projetadas para atingir precisamente os genes relevantes para estratégias de imunoterapia adotiva.

[00092] TALE nucleases preferidas de acordo com a invenção são aquelas que reconhecem e clivam a sequência alvo selecionada do grupo que consiste em:

[00093] - SEQ ID NO: 1 a 6 (GR),

[00094] - SEQ ID NO: 37, 57 a 60 (TRCalfa)

[00095] - SEQ ID NO: 38 ou 39 (TCRbeta) e

[00096] -SEQ ID NO: 40,61 a 65 (CD52)

[00097] As ditas TALE nucleases preferivelmente compreendem uma sequência de polipeptídeo selecionada entre SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO:41 a SEQ ID NO: 48, a fim de clivar as respectivas sequências alva SEQ ID NO: 1 a 6 e SEQ ID NO: 37 a 40.

[00098] Em outra modalidade, o domínio catalítico adicional pode ser introduzido na célula com a dita endonuclease de corte raro para aumentar a mutagênese a fim de intensificar sua capacidade para ina- tivar genes alvo. Em particular, o dito domínio catalítico adicional é uma enzima que processa a terminação do DNA. Exemplos não limi- tantes de enzimas que processam a terminação do DNA incluem 5-3’ exonucleases, 3-5’ exonucleases, 5-3’ exonucleases alcalinas, 5’ flap endonucleases, helicases, fosfatase, hidrolases e DNA polimerases independentes de modelo. Exemplos não limitantes de tal domínio catalítico compreende um domínio de proteína ou um derivado cataliti- camente ativo do domínio de proteína selecionado do grupo que consiste em hExoI (EX01_HUMAN), Exol de Levedura (EX01_YEAST), Exol de E.coli, TREX2 Humana, TREX1 de Camundongo, TREX1 Humana, TREX1 Bovina, TREX1 de Rato, TdT (desoxinucleotidil transferase terminal) DNA2 Humana, DNA2 de Levedura (DNA2 _YEAST). Em uma modalidade preferida, o dito domínio catalítico adicional tem uma atividade de 3’-5’-exonuclease e, em uma modalidade mais preferida, o dito domínio catalítico adicional é TREX, mais preferivelmente o domínio catalítico TREX2 (WO2012/058458). Em outra modalidade preferida, o dito domínio catalítico é codificado por um polipeptídeo TREX de cadeia simples. O dito domínio catalítico adicional pode ser fundido a uma proteína de fusão de nuclease ou uma proteína quimérica de acordo com a invenção opcionalmente por um ligante peptídi- co.

[00099] As quebras endonucleotíticas são conhecidas por estimular a taxa de recombinação homóloga. Portanto, em outra modalidade, a etapa de modificação genética do método compreende adicionalmente uma etapa de introdução nas células de um ácido nucleico exógeno que compreende pelo menos uma sequência homóloga a uma porção da sequência de ácido nucleico alvo e o ácido nucleico exógeno. Em modalidades particulares, o dito ácido nucleico exógeno compreende uma primeira e segunda porções que são homólogas a região 5’ e 3’ da sequência de ácido nucleico alvo, respectivamente. Tal ácido nu- cleico exógeno nessas modalidades também compreende uma terceira porção posicionada entre a primeira e a segunda porção que não compreende homologia com as regiões 5’ e 3’ da sequência de ácido nucleico alvo. Depois da clivagem da sequência de ácido nucleico alvo, um evento de recombinação homóloga é estimulado entre a sequência de ácido nucleico alvo e o ácido nucleico exógeno. Preferivelmente, as sequências homólogas de pelo menos 50 pb, preferivelmente mais do que 100 pb e mais preferivelmente mais do que 200 pb são usadas dentro da matriz doadora. Portanto, o ácido nucleico exó- geno tem preferivelmente entre 200 pb a 6000 pb, mais preferivelmente entre 1000 pb a 2000 pb. De fato, as homologias compartilhadas de ácido nucleico estão localizadas nas regiões de flanco a montante e a jusante do sitio de quebra e a sequência de ácido nucleico a ser introduzida deve estar localizada entre os dois braços.

[000100] Em particular, a dita sequência de ácido nucleico exógeno compreende sucessivamente uma primeira região de homologia com a sequência a montante da dita clivagem, uma sequência para inativar um gene alvo selecionado do grupo que consiste em CD52, GR, TCR alfa e TCR beta e uma segunda região de homologia com sequências a jusante da clivagem. A dita etapa de introdução do polinucleotídeo pode ser simultânea, antes ou depois da introdução ou expressão da dita endonuclease de corte raro. Dependendo da localização da sequência de ácido nucleico alvo, em que o evento de quebra ocorreu, tal ácido nucleico exógeno pode ser usado para inativar um gene, por exemplo, quando o ácido nucleico exógeno está localizado dentro da fase de leitura aberta do dito gene ou para introduzir novas sequências ou genes de interesse. As inserções de sequência pelo uso de tal ácido nucleico exógeno podem ser usadas para modificar um gene alvo existente, pela correção ou substituição do dito gene (troca de gene como um exemplo não limitante) ou para regular positivamente ou negativamente a expressão do gene alvo (troca de promotor como exemplo não limitante), a dita correção ou substituição de gene alvo. Em uma modalidade preferida, a inativação de genes do grupo que consiste em CD52, GR, TCR alfa e TCR beta pode ser feita em uma localização genômica precisa atingida por uma TALE nuclease específica, em que a dita TALE nuclease específica catalisa uma clivagem e em que o dito ácido nucleico exógeno compreende sucessivamente pelo menos uma região de homologia e uma sequência para inativar um gene alvo selecionado do grupo que consiste em CD52, GR, TCR alfa e TCR beta que é integrado pela recombinação homóloga. Em outra modalidade, vários genes podem ser, sucessivamente ou ao mesmo tempo, inativados pelo uso de várias TALE nucleases que atingem, respectivamente e especificamente, um gene definido e vários polinu- cleotídeos específicos para a inativação específica do gene.

[000101] Por etapa de modificação genômica adicional também pode ser pretendida a inativação de outro gene selecionado do grupo que consiste em CD52, GR, TCR alfa e TCR beta. Como mencionado acima, a dita etapa de modificação genômica adicional pode ser uma etapa de inativação que compreende:

[000102] (a) introduzir nas ditas células pelo menos uma endonu clease de corte raro tal que a dita endonuclease de corte raro catalise especificamente a clivagem em uma sequência alvo do genoma da dita célula.

[000103] (b) Opcionalmente, introduzir nas ditas células um ácido nucleico exógeno que compreenda sucessivamente uma primeira região de homologia com a sequência a montante da dita clivagem, uma sequência a ser inserida no genoma da dita célula e uma segunda região de homologia com as sequências a jusante da dita clivagem,

[000104] em que o dito ácido nucleico exógeno inativa um gene e integre pelo menos uma sequência exógena de polinucleotídeo que codifica pelo menos uma proteína recombinante de interesse. Em outra modalidade, a dita sequência exógena de polinucleotídeo está integrada dentro de um gene selecionado do grupo que consiste em CD52, GR, TCR alfa e TCR beta.

[000105] Em uma modalidade particular, o dito método para manipular uma célula compreende uma etapa de modificação genômica adicional. Por etapa de modificação genômica adicional pode ser compreendida a introdução nas células a serem manipuladas de uma proteína de interesse. A dita proteína de interesse pode ser, como exemplos não limitantes, pTalfa ou uma variante funcional dessa, um Receptor de Antígeno quimérico (CAR), um CAR de cadeia múltipla, um anticorpo biespecífico ou uma endonuclease de corte raro que atinge PDCD1 ou CTLA-4 como descrito na presente descrição.

[000106] A invenção também se refere a TALE nucleases. Geralmente, a invenção se refere a TALE nuclease que compreende:

[000107] (a) um domínio de ligação ao DNA de um Efetor Semelhan te ao Ativador da Transcrição (TALE) que tenha sido manipulado para se ligar a uma sequência alvo dentro dos genes selecionados do grupo que consiste em CD52, GR, TCR alfa e TCR beta;

[000108] (b) um domínio de clivagem ou um hemi-domínio de cliva gem.

[000109] As TALE nucleases preferidas de acordo com a invenção são aquelas que reconhecem e clivam a sequência alvo selecionada do grupo que consiste em:

[000110] - SEQ ID NO: 1 a 6 (GR),

[000111] - SEQ ID NO: 37,57 a 60 (TCR alfa),

[000112] - SEQ ID NO: 38 ou 39 (TCR beta) e

[000113] - SEQ ID NO: 40, 61 a 65 (CD52)

[000114] As ditas TALE nucleases compreendem preferivelmente uma sequência de polipeptídeos selecionada entre SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO:18 e SEQ ID NO:41 a SEQ ID NO:48, a fim de clivar as respectivas sequências alvo SEQ ID NO: 1 a 6 e SEQ ID NO: 37 a 40.

[000115] Como alguma variabilidade pode surgir dos dados genômi- cos a partir dos quais esses polipeptídeos derivam e também levando em consideração a possibilidade de substituir alguns dos aminoácidos presentes nesses polipeptídeos sem perda significativa de atividade (variantes funcionais), a invenção abrange variantes de polipeptídeos dos polipeptídeos acima que compartilham pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% e até mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade com as sequências fornecidas nesse pedido de patente.

[000116] O presente pedido é então direcionado para polipeptídeos que compreendem uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:7 a SEQ ID NO:18 e SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:48.

[000117] Também estão compreendidos no escopo da presente invenção polinucleotídeos, vetores que codificam as endonucleases de corte raro acima descritas de acordo com a invenção.

[000118] No escopo da presente invenção também estão abrangidas células isoladas ou linhagens celulares suscetíveis a serem obtidas pelo dito método para manipular células, em particular células T, nas quais pelo menos um gene selecionado do grupo que consiste em CD52, GR, TCR alfa e TCR beta tenha sido inativado. Preferivelmente, dois genes selecionados do grupo que consiste em CD52 e GR, CD52 e TCR alfa, CD52 e TCR beta, GR e TCR alfa, GR e TCR beta, TCR alfa e TCR beta foram inativados.

[000119] De acordo com a invenção, esses genes são preferivelmente inativados por pelo menos uma endonuclease de corte raro. Foi mostrado pelos inventores que o uso das TALE nucleases foi particularmente vantajoso para obter a dupla inativação nas células T. A invenção abrange uma célula T isolada que compreende pelo menos dois polinucleotídeos, os ditos polinucleotídeos codificando pelo menos uma primeira e uma segunda TALE nucleases, preferivelmente e primeira TALE nuclease sendo direcionada contra um gene que codifica TCR e a segunda sendo direcionada contra um gene que codifica um receptor para um agente imunossupressor, tal como CD52 ou GR.

[000120] Em outra modalidade, a dita célula isolada compreende adicionalmente uma modificação genômica adicional. Em outra modalidade, a dita modificação genômica adicional é a integração de pelo menos uma sequência exógena de polinucleotídeo. Em outra modalidade, a dita sequência exógena está integrada em um gene selecionado do grupo que consiste em CD52, GR, TCR alfa e TCR beta. PreTalfa

[000121] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para expandir a célula T deficiente em TCR alfa compreendendo introduzir na dita Célula T, pTalfa (também chamado de preTCRα) ou uma variante funcional desse e expandir as ditas células, opcionalmente através da estimulação do complexo de CD3. Em uma modalidade preferida, o método compreende:

[000122] a) Transformar as ditas células com um ácido nucleico que codifique pelo menos um fragmento de pTalfa para suportar a expressão de CD3 na superfície

[000123] b) Expressar o dito pTalfa nas ditas células

[000124] c) Expandir as ditas células, opcionalmente através da estimulação do complexo de CD3.

[000125] A invenção também se refere a um método de preparação de células T para imunoterapia compreendendo as etapas do método para a expansão de célula T.

[000126] Em uma modalidade particular, a sequência de nucleotí- deos de pTalfa pode ser introduzida aleatoriamente ou também através da recombinação homóloga, em particular a inserção pode estar associada com a inativação do gene de TCRalfa.

[000127] De acordo com a invenção, diferentes variantes funcionais de pTalfa são usadas. Uma "variante funcional" do peptídeo se refere a uma molécula substancialmente similar ao polipeptídeo inteiro ou a um fragmento desse. Um "fragmento" de pTalfa ou uma variante funcional desse da presente invenção se refere a qualquer subgrupo da molécula, ou seja, um peptídeo mais curto. pTalfa ou variantes funcionais preferidos podem ser pTalfa de extensão completa ou uma versão de pTalfa truncada C terminal. pTalfa truncado C terminal carece na extremidade C terminal de um ou mais resíduos. Como exemplos não limitantes, a versão truncada C terminal de pTalfa carece dos resíduos 18, 48, 62, 78, 92, 110 ou 114 da terminação C da proteína (SEQ ID NO: 107 a SEQ ID NO:114). Além disso, variantes da sequência de aminoácidos do peptídeo podem ser preparadas pelas mutações no DNA que codifica o peptídeo. Tais variantes funcionais incluem, por exemplo, deleções ou inserções ou substituições de resíduos dentro da sequência de aminoácidos. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição também pode ser feita para se chegar ao cons- truto final, desde que o construto final possua a atividade desejada, em particular a restauração de um complexo funcional de CD3. Em uma modalidade preferida, pelo menos uma mutação é introduzida nas diferentes versões de pTalfa como descrito acima para afetar a dimeriza- ção. Como exemplo não limitante, um resíduo mutado pode ter pelo menos W64R, D22A, K24A, R102A ou R117A da proteína pTalfa humana ou posições alinhadas pelo método CLUSTALW na família de pTalfa ou membro homólogo. Preferivelmente, pTalfa ou sua variante como descrito acima compreendem o resíduo mutado W46R (SEQ ID NO:123) ou os resíduos mutados D22A, K24A, R102A e R117A (SEQ ID NO:124). Em uma modalidade particular, o dito pTalfa ou variantes são também fundidos com um domínio de transdução do sinal tal como CD28, OX40, ICOS, CD27, CD137 (4-1BB) e CD8 como exemplos não limitantes (SEQ ID NO: 115 a SEQ ID NO: 120). O domínio extra- celular de pTalfa ou variantes como descrito acima pode ser fundido a um fragmento da proteína TCRalfa, particularmente o domínio trans- membrana e intracelular de TCRalfa (SEQ ID NO:122). Variantes de pTalfa também podem ser fundidas ao domínio de TCRalfa (SEQ ID NO:121).

[000128] Em outra modalidade, as ditas versões de pTalfa são fundidas a um domínio de ligação ao ligante extracelular e mais preferivelmente pTalfa ou sua variante funcional é fundido a um fragmento de anticorpo de cadeia simples (scFv) que compreende o fragmento variável leve (VL) e pesado (VH) de um anticorpo monoclonal específico para o antígeno alvo ligados por um ligante flexível. Como um exemplo não limitante, a sequência de aminoácidos de pTalfa ou uma variante funcional desse é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:107 a SEQ ID NO:124.

[000129] Como alguma variabilidade pode surgir dos dados genômi- cos a partir dos quais esses polipeptídeos derivam e também levando em consideração a possibilidade de substituir alguns dos aminoácidos presentes nesses polipeptídeos sem perda significativa de atividade (variantes funcionais), a invenção abrange variantes de polipeptídeos dos polipeptídeos acima que compartilham pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90% e até mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade com as sequências fornecidas nesse pedido de patente.

[000130] O presente pedido é então direcionado para polipeptídeos que compreendem uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:107 a SEQ ID NO:124.

[000131] Por célula T deficiente em TCR alfa é pretendida uma célula T isolada que carece da expressão de uma cadeia TCR alfa funcional. Isso pode ser obtido por diferentes meios, como exemplos não limitantes, pela manipulação de uma célula T tal que ela produza muito pouca cadeia TCR alfa funcional sobre sua superfície ou pela manipu- lação de uma célula T para expressar uma forma mutada ou truncada da cadeia de TCR alfa.

[000132] Células deficientes em TCR alfa não podem mais ser expandidas através do complexo de CD3. Portanto, para superar esse problema e possibilitar a proliferação de células deficientes em TCR alfa, pTalfa ou uma variante funcional desse é introduzido nas ditas células, restaurando assim um complexo de CD3 funcional. Em uma modalidade preferida, o método compreende adicionalmente introduzir na dita célula T endonucleases de corte raro capaz de inativar seletivamente pela clivagem do DNA um gene que codifica um componente do receptor de célula T (TCR). Em uma modalidade particular, a dita endonuclease de corte raro é uma TALE nuclease. Como exemplos não limitantes, a TALE nuclease é direcionada contra uma das se-quências do gene-alvo de TCRalfa, selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO:37 e SEQ ID NO:57 a 60. Preferivelmente, as TALE nucleases são selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:42.

[000133] Em uma modalidade particular, o dito método para a expansão de células T deficientes em TCR alfa compreende uma etapa de modificação genômica adicional. Por etapa de modificação genômi- ca adicional pode ser pretendida a introdução nas células a serem manipuladas de uma proteína de interesse. A dita proteína de interesse pode ser, como exemplos não limitantes, um Receptor de Antígeno Quimérico (CAR), particularmente um CAR que compreenda a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:73, um CAR de cadeia múltipla, particularmente um CAR de cadeia múltipla que compreenda a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:125, um anticorpo biespecí- fico, endonucleases de corte raro dirigidas para PDCD1 ou CTLA-4, atingindo particularmente uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:74 a SEQ ID NO:78 ou uma endonuclease de corte raro que atinja um alvo para um agente imunossupressor como descrito na presente descrição.

[000134] Também estão abrangidos na presente invenção polipeptí- deos que codificam pTalfa, particularmente as variantes funcionais descritas acima. Em uma modalidade preferida, a invenção se refere a um pTalfa ou variante funcional desse fundido a um domínio de trans- dução do sinal tal como CD28, OX40, ICOS, CD137 e CD8. Mais particularmente, a invenção se refere a uma variante funcional de pTalfa que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 107 a SEQ ID NO: 124. Também são abrangidos na presente invenção, polinucleotídeos, vetores que codificam pTalfa ou suas variantes funcionais descritas acima.

[000135] No escopo da presente invenção também estão abrangidas células isoladas ou linhagens celulares suscetíveis a serem obtidas pelo dito método. Em particular, as ditas células isoladas ou linhagens celulares são obtidas pela introdução nas ditas células de um pTalfa ou uma variante funcional desse, para auxiliar na expressão de CD3 na superfície. Em uma modalidade preferida, a dita célula isolada ou linhagem celular são geneticamente modificadas pela inativação do gene TCRalfa. Esse gene é preferivelmente inativado por pelo menos uma endonuclease de corte raro. Em uma modalidade preferida, a dita endonuclease de corte raro é uma TALE nuclease. Receptor de Antígeno Quimérico de Cadeia Múltipla (CAR)

[000136] Em outra modalidade, a invenção se refere a um receptor de antígeno quimérico de cadeia múltipla (CAR), particularmente adaptado para a produção e expansão de células T manipuladas da presente invenção. O CAR de cadeia múltipla compreende pelo menos dois dos seguintes componentes:

[000137] a) um polipeptídeo que compreenda o domínio transmem- brana da cadeia alfa de FcεRI e um domínio de ligação ao ligante ex- tracelular,

[000138] b) um polipeptídeo que compreenda uma parte da cauda citoplasmática N e C terminal e o domínio transmembrana da cadeia beta de FcεRI e/ou

[000139] c) dois polipeptídeos que compreendam cada um uma parte da cauda intracitoplasmática e o domínio transmembrana da cadeia gama de FcεRI, através do que polipeptídeos diferentes multimerizam juntos espontaneamente para formar CAR dimérico, trimérico ou te- tramérico.

[000140] Um exemplo de CAR tetramérico está ilustrado na Figura 3. Versões diferentes de CARs de cadeia múltipla estão representados na Figura 4. Um exemplo de CAR de cadeia múltipla compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:125. A expressão "uma parte de" usada aqui, se refere a qualquer subgrupo da molécula, ou seja um peptídeo mais curto. Alternativamente, variantes funcionais da sequência de aminoácidos do polipeptídeo podem ser preparadas pelas mutações no DNA que codifica o polipeptídeo. Tais variantes funcionais incluem, por exemplo, deleções, ou inserções ou substituições de resíduos dentro da sequência de aminoácidos. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição também pode ser feita para se chegar ao construto final, desde que o construto final possua a atividade desejada, especialmente exibir uma atividade imune específica an-tialvo celular,

[000141] Em uma modalidade preferida, o dito domínio de ligação ao ligante extracelular é um scFv. Outro domínio de ligação diferente de scFv também pode ser usado para o direcionamento pré-definido de linfócitos, tais como fragmentos de anticorpo de domínio único de camelídeo, um peptídeo que se ligue a integrina, heregulina ou uma mu- teína IL-13, domínios de ligação ao anticorpo, alças hipervariáveis de anticorpo ou CDRs como exemplos não limitantes.

[000142] Em uma modalidade preferida, o dito polipeptídeo de a) compreende adicionalmente uma região da haste entre o dito domínio de ligação ao ligante extracelular e o dito domínio transmembrana. A expressão "região da haste" usada aqui, significa geralmente qualquer oligo ou polipeptídeo que funcione para ligar o domínio transmembra- na ao domínio de ligação ao ligante extracelular. Em particular, a região da haste é usada para fornecer mais flexibilidade e acessibilidade para o domínio de ligação ao ligante extracelular. Uma região da haste pode compreender até 300 aminoácidos, preferivelmente 10 a 100 aminoácidos e o mais preferivelmente 25 a 50 aminoácidos. A região da haste pode ser derivada a partir de toda ou de parte das moléculas que ocorrem naturalmente, tal como toda ou parte da região extracelu- lar de CD8, CD4 ou CD28 ou toda ou parte da uma região constante do anticorpo. Alternativamente, a região da haste pode ser uma sequência sintética que corresponde a uma sequência de haste que ocorre naturalmente ou pode ser uma sequência de haste totalmente sintética.

[000143] Em uma modalidade preferida, o dito polipeptídeo de a), b) e/ou c) compreende adicionalmente pelo menos um domínio de trans- dução do sinal. Em uma modalidade mais preferida, o dito domínio de transdução do sinal é selecionado do grupo que consiste em CD28, OX40, ICOS, CD137 e CD8.

[000144] Em uma modalidade preferida, o dito fragmento da cauda citoplasmática da cadeia alfa, beta e/ou gama de FcεRI compreende adicionalmente motivos de ligação do fator 2 associados a TNFR (TRAF2). Em uma modalidade mais preferida, a dita cauda citoplasmá- tica C terminal da cadeia alfa, beta e/ou gama de FcεRI é substituída pela cauda intracitoplasmática do membro da família coestimulatória de TNFR. A cauda citoplasmática do membro da família coestimulató- ria TNFR contém os motivos de ligação TRAF2 que consistem do mo- tivo conservado principal (P/S/A)X(Q/E)E) ou o motivo secundário (PXQXXD), em que X é qualquer aminoácido. As proteínas TRAF são recrutadas para as caudas intracelulares de vários TNFRs em resposta a trimerização do receptor.

[000145] Em outra modalidade preferida, o dito domínio intracito- plasmático da cadeia alfa, beta e/ou gama de FcεRI é substituída pelo domínio intracitoplasmático da cadeia zeta de TCR (também denominada CD3 zeta). Em outra modalidade preferida, o dito domínio intraci- toplasmático da cadeia alfa, beta e/ou gama de FcεRI compreende pelo menos um motivo adicional de ativação de imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM). ITAMs são motivos de sinalização bem definidos encontrados na cauda intracitoplasmática de uma variedade de receptores que servem como sítios de ligação para as tirosina quinases da classe syk/zap70. Exemplos de ITAM usados na invenção incluem aqueles derivados de TCRzeta, FCRgama, FCRbeta, CD3gama, CD3delta, CD3epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b e CD66d.

[000146] Como um exemplo não limitante, diferentes versões de CAR de cadeia múltipla estão ilustradas na Figura 4. Em uma modalidade preferida, o CAR de cadeia múltipla compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:125. A presente invenção se refere a poli- peptídeos que compreendem uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:125.

[000147] Também estão compreendidos no escopo da presente invenção, polinucleotídeos, vetores que codificam o CAR de cadeia múltipla descrito acima de acordo com a invenção.

[000148] Em uma modalidade particular abrangida, a invenção se refere a um método de preparação de células T para imunoterapia, compreendendo introduzir nas ditas células T os diferentes polipeptí- deos que compõem o dito CAR de cadeia múltipla e expandindo as ditas células.

[000149] Em outra modalidade, o dito método compreende uma etapa de modificar geneticamente as ditas células pela inativação de pelo menos um gene que expresse um componente de TCR e/ou um alvo para um agente imunossupressor. Em uma modalidade preferida, o dito gene é selecionado do grupo que consiste em TCRalfa, TCRbeta, CD52 e GR. Em uma modalidade preferida, o dito método compreende introduzir nas ditas células T uma endonuclease de corte raro capaz de inativar seletivamente os ditos genes pela clivagem do DNA. Em uma modalidade mais preferida, a dita endonuclease de corte raro é uma TALE nuclease. TALE nucleases preferidas de acordo com a invenção são aquelas que reconhecem e clivam a sequência alvo selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1 a 6 (GR), SEQ ID NO:37, 57 a 60 (TCRalfa), SEQ ID NO:38 ou 39 (TCRbeta) e SEQ ID NO:40, SEQ ID NO: 61 a SEQ ID NO:65 (CD52).

[000150] Em uma modalidade particular, o dito método para manipular uma célula compreende uma etapa de modificação genômica adicional. Por etapa de modificação genômica adicional pode ser compreendida a introdução nas células a serem manipuladas de uma proteína de interesse. A dita proteína de interesse pode ser, como exemplos não limitantes, um anticorpo biespecífico, uma endonuclease de corte raro que atinge PDCD1 ou CTLA-4, pTalfa ou uma variante desses como descrito na presente descrição.

[000151] A presente invenção também se refere a células isoladas ou linhagens celulares a serem obtidas pelo método para manipular as células. Em particular, a dita célula isolada compreende sequências exógenas de polinucleotídeo que codificam polipeptídeos que compõem o dito CAR de cadeia múltipla.

Células T com PDCD1 ou CTLA4 Inativados

[000152] Uma outra abordagem para ativar a imunidade terapêutica antitumor é o bloqueio de checkpoints imunes. A resposta da imunidade é regulada pelo equilíbrio do sinal estimulante e inibitório. A expressão de proteínas imunes de checkpoint pode ser desregulada pelos tumores e pode ser um importante mecanismo de resistência imune. Reguladores negativos de da função da célula T incluem moléculas tais como CTLA-4, uma molécula-chave regulatória negativa que regula negativamente as vias de ativação da célula T e da morte progra- mada-1 (PD1), também conhecida como PDCD1, um receptor trans- membrana regulado positivamente em células T ativadas que quando ligado ao seu ligante (ligante 1 de morte programada, PD-L1) leva a produção diminuída de citocina e proliferação de células T (Pardoll 2012). Portanto, antagonistas do sinal inibitório resultam na amplificação da resposta da célula T específica para o antígeno.

[000153] Portanto, a presente invenção se refere a um método de manipulação de células T, especialmente para imunoterapia, compreendendo células T geneticamente modificadas pela inativação de pelo menos uma proteína envolvida no checkpoint imune, em particular PDCD1 e/ou CTLA-4.

[000154] Em uma modalidade particular, o método compreende uma das seguintes etapas:

[000155] (a) fornecer uma célula T,

[000156] (b) introduzir na dita célula T uma endonuclease de corte raro capaz de inativar seletivamente pela clivagem do DNA, o gene de PDCD1 ou o gene de CTLA-4; e

[000157] (c) expandir as ditas células.

[000158] Em uma modalidade preferida, a dita endonuclease de corte raro é uma TALE nuclease. Na presente invenção, novas TALE nucleases foram designadas para atingir precisamente genes relevantes para estratégias de imunoterapia adotiva. TALE nucleases preferidas de acordo com a invenção são aquelas que reconhecem e clivam a sequência-alvo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 77 e SEQ ID NO: 78 (PDCD-1), SEQ ID NO: 74 a SEQ ID NO: 76 (CTLA- 4). A presente invenção também se refere a polipeptídeos de TALE nuclease que compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 79 a SEQ ID NO: 88.

[000159] A presente invenção também se refere a polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:79 a SEQ ID NO:88. Também estão compreendidos no escopo da presente invenção, polinucleotídeos, vetores que codificam as endonucleases de corte raro descritas acima de acordo com a invenção. Esse método pode estar associado com qualquer um dos diferentes métodos descritos na presente descrição.

Anticorpos biespecíficos

[000160] De acordo com uma modalidade adicional, as células T manipuladas obtidas pelos diferentes métodos como descrito previamente podem ser expostas posteriormente a anticorpos biespecíficos. As ditas células T podem ser expostas a anticorpos biespecíficos ex vivo antes da administração a um paciente ou in vivo depois da administração a um paciente. Os ditos anticorpos biespecíficos compreendem duas regiões variáveis com propriedades antigênicas distintas que permitem colocar as células manipuladas em proximidade com um antígeno-alvo. Como um exemplo não limitante, o dito anticorpo bies- pecífico é direcionado contra um marcador tumoral e um antígeno lin- focítico tal como CD3 e tem o potencial para redirecionar e ativar quaisquer células T circulantes contra tumores. Métodos de liberação

[000161] Os diferentes métodos descritos acima envolvem a introdução de pTalfa ou variantes funcionais desse, endonucleases de corte raro, TALE nuclease, CAR ou CAR de cadeia múltipla opcionalmente com uma enzima que processa a extremidade do DNA ou ácido nu- cleico exógeno em uma célula.

[000162] Como exemplo não limitante, a dita pTalfa ou sua variante funcional, endonucleases de corte raro, TALE nuclease, CAR ou CAR de cadeia múltipla opcionalmente com uma enzima que processa a extremidade do DNA ou ácido nucleico exógeno podem ser introduzidos como transgenes codificados por um ou diferentes vetores plas- mídicos. Transgenes diferentes podem ser incluídos em um vetor que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de salto ribossômico, tal como uma sequência que codifica o peptídeo 2A. Peptídeos 2A, que foram identificados no subgrupo Aphthovirus de picornavírus, causam um "salto" ribossômico de um códon para o próximo se a formação de uma ligação peptídica entre os dois aminoácidos codificados pelos códons (veja Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007)). Por "códon" é entendido três nucleotídeos sobre um mRNA (ou sobre a fita senso de uma molécula de DNA) que são traduzidos por um ribossomo em um resíduo de aminoácido. Portanto, dois polipeptídeos podem ser sintetizados a partir de uma única fase de leitura aberta contígua dentro de um mRNA quando os polipeptídeos são separados por uma sequência de oligopeptídeo 2A que está em fase. Tais mecanismos de salto ribossômico são bem conhecidos na técnica e são conhecidos por serem usados por vários vetores para a expressão de várias proteínas codificadas por um único RNA mensageiro. Como um exemplo não limitante, na presente invenção, peptídeos 2A têm sido usados para expressar na célula a endonuclease de corte raro e uma enzima que processe a extremidade do DNA ou os diferentes polipeptídeos de CAR de cadeia múltipla.

[000163] O dito vetor de plasmídeo pode conter um marcador de seleção que fornece a identificação e/ou a seleção das células que receberam o dito vetor.

[000164] Os polipeptídeos podem ser sintetizados in situ na célula como resultado da introdução de polinucleotídeos que codificam os ditos polipeptídeos na célula. Alternativamente, os ditos polipeptídeos podem ser produzidos fora da célula e depois introduzidos nela. Métodos para a introdução de um construto de polinucleotídeo em células de animais são conhecidos na técnica e incluem como exemplos não limitantes, métodos de transformação estável em que o construto de polinucleotídeo é integrado no genoma da célula, métodos de transformação transitória em que o construto de polinucleotídeo não é integrado no genoma da célula e métodos mediados por vírus. Os ditos polinucleotídeos podem ser introduzidos em uma célula, por exemplo, por vetores recombinantes virais (por exemplo, retrovírus, adenovírus), lipossoma e semelhantes. Por exemplo, os métodos de transformação transitória incluem, por exemplo, microinjeção, eletroporação ou bombardeio de partícula. Os ditos polinucleotídeos podem ser incluídos em vetores, mais particularmente plasmídeos ou vírus, com o objetivo de serem expressos nas células.

- Eletroporação

[000165] Uma modalidade mais preferida da invenção, polinucleotí- deos que codificam polipeptídeos de acordo com a presente invenção podem ser de mRNA que é introduzido diretamente nas células, por exemplo, por eletroporação. Os inventores determinaram a condição ótima para a eletroporação de mRNA na célula T.

[000166] Os inventores usaram a tecnologia cytoPulse que permite, pelo uso de campos elétricos pulsados, permeabilizar transitoriamente células vivas para a liberação de material nas células. A tecnologia, baseada no uso de formas de onda de eletroporação PulseAgile (propriedade de Cellectis) garante o controle preciso da duração, intensidade do pulso assim como o intervalo entre os pulsos (Patente U.S. 6.010.613 e pedido internacional PCT WO2004083379). Todos esses parâmetros podem ser modificados a fim de alcançar as melhores condições para a alta eficiência de transfecção com mortalidade mínima. Basicamente, os primeiros pulsos altos do campo elétrico permitem a formação do poro, enquanto que pulsos menores do campo elétrico permitem a mobilização do polinucleotídeo para dentro da célula. Em um aspecto da presente invenção, o inventor descreve etapas que levam a obtenção de > 95% de eficiência de transfecção de mRNA em células T e o uso do protocolo de eletroporação para expressar transitoriamente diferentes tipos de proteínas nas células T. Em particular, a invenção se refere a um método de transformação de uma célula T, compreendendo contatar a dita célula T com RNA e aplicar à célula T uma sequência de pulsos ágil, que consiste em:

[000167] (a) um pulso elétrico com uma faixa de voltagem de 2250 a 3000 V por centímetro com uma amplitude de pulso de 0,1 ms e um intervalo de pulso de 0,2 a 10 ms entre os pulsos elétricos da etapa (a) e (b);

[000168] (b) um pulso elétrico com uma faixa de voltagem de 2250 a 3000 V por centímetro com uma amplitude de pulso de 100 ms e um intervalo de pulso de 100 ms entre o pulso elétrico da etapa (b) e o primeiro pulso elétrico da etapa (c); e

[000169] (c) 4 pulsos elétricos com uma voltagem de 325 V com uma amplitude de pulso de 0,2 ms e um intervalo de pulso de 2 ms entre cada um dos pulsos elétricos.

[000170] Em uma modalidade particular, o método de transformação da célula T compreende contatar a dita célula T com RNA e aplicar à célula T uma sequência de pulso ágil que consiste em:

[000171] (a) um pulso elétrico com uma voltagem de 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 ou 3000 V por centímetro, uma amplitude de pulso de 0,1 ms e um intervalo de pulso de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ms entre os pulsos elétricos da etapa (a) e (b);

[000172] (b) um pulso elétrico com uma voltagem de 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 ou 3000 V com uma amplitude de pulso de 100 ms e um intervalo de pulso de 100 ms entre o pulso elétrico da etapa (b) e o primeiro pulso elétrico da etapa (c); e

[000173] (c) 4 pulsos elétricos com uma voltagem de 325 V com uma amplitude de pulso de 0,2 ms e um intervalo de pulso de 2 ms entre cada um dos pulsos elétricos.

[000174] Quaisquer valores incluídos na faixa de valor descrita acima estão descritos no presente pedido. O meio de eletroporação pode ser qualquer meio adequado conhecido na técnica. Preferivelmente, o meio de eletroporação tem condutividade em uma faixa que abrange 0,01 a 1,0 miliSiemens.

[000175] Em modalidades particulares, como exemplos não limitan- tes, o dito RNA codifica uma endonuclease de corte raro, um monôme- ro da endonuclease de corte raro tal como Half-TALE nuclease, um Receptor de Antígeno Quimérico, pelo menos um componente do receptor de antígeno quimérico de cadeia múltipla, um pTalfa ou uma variante funcional desse, um ácido nucleico exógeno, um domínio catalítico adicional.

Ativação e expansão de células T

[000176] As células T podem ser ativadas e expandidas antes ou depois da modificação genética das células T usando métodos descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; e Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 20060121005. As células T podem ser expandidas in vitro ou in vivo.

[000177] Geralmente, as células T da invenção são expandidas pelo contato com uma superfície que tenha acoplado a ela um agente que estimule um complexo CD3 TCR associado a um sinal e um ligante que estimule uma molécula coestimulatória sobre a superfície das células T.

[000178] Em particular, as populações de célula T podem ser estimuladas in vitro tal como pelo contato com um anticorpo anti-CD3 ou um fragmento de ligação ao antígeno desse ou um anticorpo anti-CD2 imobilizado sobre uma superfície ou pelo contato com um ativador da proteína quinase C (por exemplo, briostatina) em conjunto com um io- nóforo de cálcio. Para a coestimulação de uma molécula acessória sobre a superfície das células T, é usado um ligante que liga a molécula acessória. Por exemplo, uma população de células T pode ser contatada com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, sob condições apropriadas para estimular a proliferação das células T. Para estimular a proliferação de células T CD4+ ou células T CD8+, um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD8. Por exemplo, os agentes que fornecem cada sinal podem estar em solução ou acoplados a uma superfície. Como aqueles versados na técnica poderão apreciar, a proporção de partículas para células pode depender do tamanho da partícula em relação ao da célula-alvo. Em modalidades da presente invenção, as células, tal como as células T, são combinadas com esferas revestidas com o agente, as esferas e as células são subsequentemente separadas e depois as células são cultivadas. Em uma moda- lidade alternativa, antes da cultura, as esferas revestidas com o agente e as células não são separadas, mas são cultivadas juntas. As proteínas da superfície celular podem ser ligadas permitindo que as esferas paramagnéticas, as quais anti-CD3 e anti-CD28 estão acoplados (esferas 3x28), contatem as células T. Em uma modalidade, as células (por exemplo, 4 a 10 células) e as esferas (por exemplo, esferas pa- ramagnéticas DYNABEADS® M450 CD3/CD28 T em uma proporção de 1:1) são combinadas em um tampão, preferivelmente PBS (sem cátions divalentes tais como cálcio e magnésio). Novamente, aqueles versados na técnica apreciarão que qualquer concentração pode ser usada. A mistura pode ser cultivada por várias horas (cerca de 3 horas) a cerca de 14 dias ou qualquer valor inteiro de hora em hora. Em outra modalidade, a mistura pode ser cultivada por 21 dias. Condições apropriadas para a cultura de célula T incluem um meio apropriado (por exemplo, Meio Mínimo Essencial ou Meio RPMI 1640 ou X-vivo 5 (Lonza)) que pode conter fatores necessários para a proliferação e viabilidade, incluindo soro (por exemplo, soro fetal bovino ou humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, -2, 1L- 15, TGFp e TNF ou quaisquer outros aditivos para o crescimento de células conhecidos pelo técnico experiente. Outros aditivos para o crescimento de células incluem, mas não são limitados a um tensoati- vo, plasmanato e agentes de redução tais como N-acetil-cisteína e 2- mercaptoetanol. Meios podem incluir RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 e X-Vivo 20, Optimizer com aminoácidos adicionados, piruvato de sódio e vitaminas, sem soro ou suplementados com uma quantidade apropriada de soro (ou plasma) ou um conjunto definido de hormônios e/ou citocinas suficientes para o crescimento e expansão das células T. Antibióticos, por exemplo, penicilina e estreptomicina, estão incluídos apenas nas culturas experimentais, não em culturas de células que são para serem infundidas em um indi- víduo. As células-alvo são mantidas sob condições necessárias para apoiar o crescimento, por exemplo, uma temperatura apropriada (por exemplo, 37°C) e atmosfera (por exemplo, ar mais CO2 5%). As células T que tenham sido expostas a tempos de estimulação variados podem exibir características diferentes.

[000179] Em outra modalidade particular, as ditas células podem ser expandidas pela cocultura com tecido ou células. As ditas células também podem ser expandidas in vivo, por exemplo, no sangue do indivíduo depois de administrar a dita célula ao indivíduo.

Células T modificadas

[000180] No escopo da presente invenção também está abrangida uma célula T isolada, obtida de acordo com um dos métodos previamente descritos. A dita célula T de acordo com a presente invenção pode ser derivada de uma célula-tronco. As células-tronco podem ser células-tronco adultas, células-tronco embrionárias, células-tronco da medula óssea, células-tronco pluripotentes induzidas, células-tronco totipotentes ou células-tronco hematopoiéticas. Células humanas representativas são células CD34+. A dita célula isolada também pode ser uma célula dendrítica, uma célula NK, uma célula B ou uma célula T selecionada do grupo que consiste em linfócitos T inflamatórios, lin- fócitos T citotóxicos, linfócitos T regulatórios ou linfócitos T auxiliares. Em outra modalidade, a dita célula pode ser derivada do grupo que consiste em linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+. Antes da expansão e da modificação genética das células da invenção, uma fonte de células pode ser obtida de um indivíduo através de uma variedade de métodos não limitantes. As células T podem ser obtidas a partir de várias fontes não limitantes, incluindo células mononucleares do sangue periférico, medula óssea, tecido do linfonodo, cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um local de infecção, ascite, efusão pleural, tecido do baço e tumores. Em certas modalidades da presente invenção, qual- quer número de linhagens de célula T disponíveis e conhecidas daqueles versados na técnica pode ser usada. Em outra modalidade, a dita célula pode ser derivada de um doador saudável, de um paciente diagnosticado com câncer ou de um paciente diagnosticado com uma infecção. Em outra modalidade, a dita célula é parte de uma população mista de células que apresentam características fenotípicas diferentes. No escopo da presente invenção também está abrangido uma linhagem celular obtida a partir de uma célula T transformada de acordo com o método previamente descrito. Células modificadas resistentes a um tratamento imunossupressor e suscetíveis a serem obtidas pelo método prévio são abrangidas no escopo da presente invenção.

[000181] Em outra modalidade, a dita célula isolada de acordo com a presente invenção compreende um gene inativado selecionado do grupo que consiste em CD52, GR, TCRalfa e TCRbeta e/ou expressa um transgene de CAR, CAR de cadeia múltipla e/ou pTalfa. Em outra modalidade, a dita célula isolada de acordo com a presente invenção compreende dois genes inativados selecionados do grupo que consiste em CD52 e GR, CD52 e TCR alfa, CD52 e TCR beta, GR e TCR alfa, GR e TCR beta, TCR alfa e TCR beta e/ou expressa um transgene de CAR, CAR de cadeia múltipla e/ou pTalfa.

[000182] Em outra modalidade, TCR é tornado não funcional nas células de acordo com a invenção pela inativação do gene de TCR alfa e/ou gene de TCR beta. As estratégias acima são usadas mais particularmente para evitar GvHD. Em um aspecto particular da presente invenção está um método para obter células modificadas derivadas de um indivíduo, em que as ditas células podem proliferar independentemente da via de sinalização do Complexo Principal de Histocompatibi- lidade. O dito método compreende as seguintes etapas:

[000183] (a) Recuperar as células do dito indivíduo;

[000184] (b) Modificar geneticamente as ditas células ex vivo pela inativação dos genes de TCR alfa ou TCR beta;

[000185] (c) Cultivar as células T geneticamente modificadas in vitro em condições apropriadas para amplificar as ditas células.

[000186] Células modificadas, que podem proliferar independentemente da via de sinalização do Complexo Principal de Histocompatibi- lidade, suscetíveis de serem obtidas por esse método estão abrangidas no escopo da presente invenção. As ditas células modificadas podem ser usadas em um aspecto particular da invenção para tratar pacientes necessitados contra a rejeição do Hospedeiro versus Enxerto (HvG) e a Doença Enxerto versus Hospedeiro (GvHD); portanto, está no escopo da presente invenção um método de tratamento de pacientes necessitados contra a rejeição do Hospedeiro versus Enxerto (HvG) e a Doença Enxerto versus Hospedeiro (GvHD), compreenden-do tratar o dito paciente pela administração ao dito paciente de uma quantidade eficaz de células modificadas que compreendem genes inativados TCRalfa e/ou TCR beta.

APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS

[000187] Em outra modalidade, a célula isolada obtida pelos diferentes métodos ou a linhagem celular derivada da dita célula isolada como previamente descrito podem ser usadas como um medicamento. Em outra modalidade, o dito medicamento pode ser usado para tratar câncer ou infecções em um paciente necessitado. Em outra modalidade, a dita célula isolada de acordo com a invenção ou linhagem celular derivada da dita célula isolada podem ser usadas na fabricação de um medicamento para o tratamento de um câncer ou uma infecção viral em um paciente necessitado.

[000188] Em outro aspecto, a presente invenção recai em métodos para tratar pacientes necessitados, o dito método compreendendo pelo menos uma das seguintes etapas:

[000189] (a) fornecer uma célula T obtenível por qualquer um dos métodos previamente descritos;

[000190] (b) administrar as ditas células T transformadas ao dito pa ciente.

[000191] Em uma modalidade, as ditas células T da invenção podem sofrer uma robusta expansão de célula T in vivo e podem persistir por uma prolongada quantidade de tempo.

[000192] O dito tratamento pode ser melhorador, curativo ou profilático. Ele pode ser parte de uma imunoterapia autóloga ou parte de um tratamento de imunoterapia alogênica. Por autólogo entende-se que as células, linhagem celular ou população de células usada para tratar os pacientes são originadas do dito paciente ou de um doador compatível de Antígeno Leucocitário Humano (HLA). Por alogênico entende-se que as células ou população de células usadas para tratar os pacientes não se originam do disto paciente, mas de um doador.

[000193] A invenção é particularmente adequada para imunoterapia alogênica, na medida em que ela possibilita a transformação de células T, tipicamente obtidas de doadores, em células não alorreativas. Isso pode ser feito sob protocolos padronizados e reproduzido quantas vezes forem necessárias. Aas células T modificadas resultantes podem ser agrupadas e administradas a um ou vários pacientes, sendo tornadas disponíveis como um produto terapêutico "de prateleira".

[000194] Células que podem ser usadas com os métodos divulgados estão descritas na seção anterior. O dito tratamento pode ser usado para tratar pacientes diagnosticados com câncer, infecção viral, distúrbios autoimunes ou Doença do Enxerto versus Hospedeiro (GvHD). Canceres que podem ser tratados incluem tumores que não são vas- cularizados ou ainda não substancialmente vascularizados, assim como tumores vascularizados. Os canceres podem compreender tumores não sólidos (tais como tumores hematológicos, por exemplo, leucemias e linfomas) ou podem compreender tumores sólidos. Os tipos de canceres a serem tratados com os CARs da invenção incluem, mas não são limitados a carcinoma, blastoma e sarcoma e certas leucemias e malignidades linfoides, tumores benignos e malignos e malignidades, por exemplo, sarcomas, carcinomas e melanomas. Tumo- res/canceres do adulto e tumores/canceres pediátricos também estão incluídos.

[000195] Pode ser um tratamento em combinação com uma ou mais terapias contra o câncer selecionadas do grupo de terapia com anticorpo, quimioterapia, terapia com citocinas, terapia com célula dendrí- tica, terapia com gene, terapia com hormônio, terapia com laser e terapia com radiação.

[000196] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, o dito tratamento pode ser administrado em pacientes que estão sendo submetidos a um tratamento imunossupressor. De fato, a presente invenção preferivelmente recai sobre células ou populações de células que tenham sido tornadas resistentes a pelo menos um agente imu- nossupressor devido à inativação de um gene que codifica um receptor para tal agente imunossupressor. Nesse aspecto, o tratamento imunossupressor deve auxiliar a seleção e a expansão das células T de acordo com a invenção dentro do paciente.

[000197] A administração das células ou população de células de acordo com a presente invenção pode ser realizada de qualquer maneira conveniente, incluindo a inalação por aerossol, injeção, ingestão, transfusão, implantação ou transplante. As composições descritas aqui podem ser administradas a um paciente por via subcutânea, intradér- mica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, por injeção intravenosa ou intralinfática ou intraperitoneal. Em uma modalidade, as composições de célula da presente invenção são preferivelmente administradas por injeção intravenosa.

[000198] A administração das células ou população de células pode consistir na administração de 104 a 109 células por kg de peso corporal, preferivelmente 105 a 106 células por kg de peso corporal incluindo todos os valores inteiros de número de células dentro dessas faixas. As células ou população de células podem ser administradas em uma ou mais doses. Em outra modalidade, a dita quantidade eficaz de células é administrada como uma dose única. Em outra modalidade, a dita quantidade eficaz de células é administrada como mais do que uma dose durante um período de tempo. A periodicidade da administração está dentro do julgamento do médico assistente e depende da condição clínica do paciente. As células ou população de células podem ser obtidas a partir de qualquer fonte, tal como um banco de sangue ou um doador. Apesar das necessidades individuais variarem, a determinação de faixas ótimas de quantidades eficazes de um tipo celular para uma doença ou condições particulares está dentro da experiência na técnica. Uma quantidade eficaz significa uma quantidade que fornece um benefício terapêutico ou profilático. A dosagem administrada dependerá da idade, saúde e peso do receptor, tipo de tratamento concomitante, se houver, frequência de tratamento e a natureza do efeito desejado.

[000199] Em outra modalidade, a dita quantidade eficaz de células ou da composição compreende aquelas células que são administradas parenteralmente. A dita administração pode ser uma administração intravenosa. A dita administração pode ser diretamente feita pela injeção dentro de um tumor.

[000200] Em certas modalidades da presente invenção, as células são administradas a um paciente em conjunto com (por exemplo, simultaneamente ou depois) qualquer número de modalidades relevantes de tratamento, incluindo, mas não limitado a tratamento com agentes tais como a terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, Citarabine (também conhecido como ARA-C) ou tratamento com nataliziimab pa- ra o tratamento de pacientes com MS ou o tratamento com efaliztimab para pacientes com psoríase ou outros tratamentos para pacientes com PML. Em modalidades adicionais, as células T da invenção podem ser usadas em combinação com a quimioterapia, radiação, agentes imunossupressores, tais como ciclosporina, azatioprina, metotrexa- te, micofenolato e FK506, anticorpos ou outros agentes imuno- ablativos tais como CAMPATH, anticorpos anti-CD3 ou outras terapias com anticorpo, citotoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiação. Esses fármacos inibem a fosfatase calcineurina dependente de cálcio (ciclosporina e FK506) ou inibem a p70S6 quinase que é importante para a sinalização induzida por fator de crescimento (rapamicina) (Liu et al., Cell 66:807-815, 11; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93). Em uma modalidade adicional, as composições celulares da presente invenção são administradas a um paciente em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou depois) o transplante de medula óssea, terapia ablativa com célula T usando agentes quimioterápicos tais como a flu- darabina, terapia com radiação externa (XRT), ciclofosfamida ou anticorpos tais como OKT3 ou CAMPATH. Em outra modalidade, as composições celulares da presente invenção são administradas depois da terapia ablativa de célula B, tal como agentes que reagem com CD20, por exemplo, Rituxan. Por exemplo, em uma modalidade, os indivíduos podem ser submetidos ao tratamento padronizado com alta dose de quimioterapia seguida pelo transplante de célula-tronco do sangue periférico. Em certas modalidades, depois do transplante, os indivíduos recebem uma infusão de células imunes expandidas da presente invenção. Em uma modalidade adicional, as células expandidas são administradas antes ou depois da cirurgia. As ditas células modificadas obtidas por qualquer um dos meios aqui descritos podem ser usa- das em um aspecto particular da invenção para tratar pacientes necessitados contra a rejeição do Hospedeiro versus Enxerto (HvG) e Doença Enxerto versus Hospedeiro (GvHD); portanto, no escopo da presente invenção está um método de tratamento de pacientes necessitados contra a rejeição do Hospedeiro versus Enxerto (HvG) e Doença Enxerto versus Hospedeiro (GvHD), compreendendo tratar o dito paciente pela administração ao dito paciente de uma quantidade eficaz de células modificadas que compreendem genes inativados de TCR alfa e/ou TCR beta.

Exemplo de um método para manipular células humanas alogêni- cas para imunoterapia

[000201] Para uma melhor compreensão da invenção, um exemplo do método para manipular células alogênicas humanas para imunote- rapia está ilustrado na Figura 5. O método compreende a combinação de uma ou mais das seguintes etapas:

[000202] 1. Fornecer células T de uma cultura celular ou de uma amostra de sangue de um paciente individual ou de um banco de sangue e ativar as ditas células T usando esferas ativadoras anti- CD3/CD28. As esferas fornecem ambos os sinais primário e coestimu- latório que são necessários para ativação e expansão das células T.

[000203] 2. a) Transduzir as ditas células com o transgene pTalfa ou uma variante funcional desse para auxiliar a expressão de CD3 na superfície e permitir a expansão celular através da estimulação do complexo de CD3. A ruptura de TCR é esperada para a eliminação do complexo de TCR e remoção da alorreatividade (GvHD), mas pode alterar a expansão das células alogênicas devido a perda do componente de sinalização de CD3. As células transduzidas são esperadas expressar a cadeia pTalfa ou uma variante funcional dessa. Esse par de cadeias de pTalfa com TCRbeta e componentes da sinalização de CD3 para formar o complexo preTCR e, assim, restaurar um complexo CD3 funcional e auxiliar na ativação ou estimulação de células TCRal- fa inativadas. A transdução de células T com um vetor lentiviral de pTalfa pode ser realizada antes ou depois da inativação de TCRalfa.

[000204] b) Transduzir as ditas células com CARs de cadeia múltipla permite redirecionar as células T contra antígenos expressos na superfície de células alvo de várias malignidades incluindo linfomas e tumores sólidos. Para aperfeiçoar a função do domínio coestimulatório, os inventores designaram um CAR de cadeia múltipla derivado de FcεRI como descrito previamente. A transdução pode ser realizada antes ou depois da inativação dos genes de TCRalfa e CD52.

[000205] 3. Manipulação de células T não alorreativas e resistentes a imunossupressão:

[000206] a) É possível inativar TCR alfa nas ditas células para eliminar TCR da superfície da célula e evitar o reconhecimento do tecido do hospedeiro como estranho por TCR de alogênico e assim evitar GvHD.

[000207] b) É possível inativar também um gene que codifica um alvo para um agente imunossupressor para tornar as células resistentes ao tratamento imunossupressor para prevenir a rejeição do enxerto sem afetar as células T transplantadas. Nesse exemplo, o alvo de agentes imunossupressores é CD52 e o agente imunossupressor é um anticorpo monoclonal humanizado anti-CD52.

[000208] Foi mostrado pelos inventores que o uso de TALE nuclease, que permite maiores taxas de eventos de DSB dentro das células T, foi particularmente vantajoso para obter a dupla inativação acima nas células T. Preferivelmente, os genes TCRalfa e CD52 são ina- tivados pela eletroporação das células T com mRNA que codifica a TALE nuclease que atinge os ditos genes. Foi descoberto pelos inventores que o uso de mRNA que resultou em alta taxa de transformação foi menos prejudicial para as células T e assim, foi crítico no processo de manipulação das células T. Depois, as células T inativadas são classificadas usando esferas magnéticas. Por exemplo, as células T que expressam CD52 são removidas pela fixação sobre uma superfície sólida e as células inativadas não são expostas ao estresse de serem passadas através de uma coluna. Esse método cuidadoso aumenta a concentração de células T apropriadamente manipuladas.

[000209] 4. Expansão in vitro de células T manipuladas antes da administração a um paciente ou in vivo depois da administração ao paciente através da estimulação do complexo CD3. Antes da etapa de administração, os pacientes são submetidos a um tratamento imunos- supressor tal como CAMPATH1-H, um anticorpo monoclonal humanizado anti-CD52.

[000210] 5. Opcionalmente, expor as ditas células a anticorpos bies- pecíficos ex vivo antes da administração a um paciente ou in vivo depois da administração a um paciente para colocar as células manipuladas em proximidade com um antígeno alvo.

OUTRAS DEFINIÇÕES

[000211] - Resíduos de aminoácidos em uma sequência de polipep- tídeo são designados aqui de acordo com o código de uma letra no qual, por exemplo, Q significa Gln ou um resíduo de Glutamina, R significa Arg ou um resíduo de Arginina e D significa Asp ou um resíduo de Ácido Aspártico.

[000212] - Substituição de aminoácido significa a substituição de um resíduo de aminoácido por outro, por exemplo, a substituição de um resíduo de Arginina por um resíduo de Glutamina em uma sequência de peptídeo é uma substituição de aminoácido.

[000213] - Nucleotídeos são designados como a seguir: o código de uma letra é usado para designar a base de um nucleotídeo: a é adeni- na, t é timina, c é citosina e g é guanina. Para os nucleotídeos degenerados, r representa a ou t, m representa a ou c, y representa t ou c (nucleotídeos de pirimidina), d representa g, a ou t, v representa g, a ou c, b representa g, t ou c, h representa a, t ou c e n representa g, a, t ou c.

[000214] - Como usado aqui, "ácido nucleico" ou "polinucleotídeos" se referem a nucleotídeos e/ou polinucleotídeos, tais como ácido de- soxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA), oligonucleotí- deos, fragmentos gerados pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e fragmentos gerados por qualquer ligação, cisão, ação de nuclease e ação de exonuclease. As moléculas de ácido nucleico podem ser compostas por monômeros que são nucleotídeos que ocorrem naturalmente (tal como DNA e RNA) ou análogos de nucleotídeos que ocorrem naturalmente (por exemplo, formas enantioméricas de nucleo- tídeos que ocorrem naturalmente) ou uma combinação de ambos. Nu- cleotídeos modificados podem ter alterações em porções de açúcar e/ou nas porções da base de pirimidina ou purina. Modificações de açúcar incluem, por exemplo, a substituição de um ou mais grupos hi- droxila com halogênios, grupos alquila, aminas e grupos azido ou os açúcares podem ser funcionalizados como éteres ou ésteres. Além disso, a porção açúcar inteira pode ser substituída com estruturas es- tericamente e eletronicamente similares, tais como aza-açúcares e análogos carbocíclicos de açúcar. Exemplos de modificações em uma porção de base incluem purinas e pirimidinas alquiladas, purinas e pi- rimidinas aciladas ou outros heterocíclicos bem conhecidos. Monôme- ros de ácido nucleico podem ser ligados pelas ligações de fosfodiéster ou análogos de tais ligações. Os ácidos nucleicos podem ser de fita simples ou fita dupla.

[000215] - Por "polinucleotídeo que compreende sucessivamente uma primeira região de homologia com sequências a montante da dita ruptura da fita dupla, uma sequência a ser inserida no genoma da dita célula e uma segunda região de homologia com sequências a jusante da dita ruptura da fita dupla" é pretendido significar um construto de DNA ou uma matriz que compreenda uma primeira e uma segunda porção que sejam homólogas às regiões 5’ e 3’ de um DNA alvo in situ. O construto de DNA também pode compreender uma terceira porção posicionada entre a primeira e a segunda porções que compreende alguma homologia com a sequência de DNA correspondente in situ ou compreende alternativamente nenhuma homologia com as regiões 5’ e 3’ de um DNA alvo in situ. Depois da clivagem do DNA alvo, um evento de recombinação homóloga é estimulado entre o genoma que contém o gene objetivado compreendido no lócus de interesse e essa matriz, em que a sequência genômica que contém o DNA alvo é substituído pela terceira porção da matriz e uma parte variável da primeira e segunda porções da dita matriz.

[000216] - Por "DNA alvo", "sequência de DNA alvo", "sequência alvo de DNA", "sequência alvo de ácido nucleico", "sequência alvo" ou "sítio de processamento" é pretendida uma sequência de polinucleotídeos que pode ser direcionada e processada por uma endonuclease de corte raro de acordo com a presente invenção. Essas expressões se referem a uma localização específica do DNA, preferivelmente uma localização genômica em uma célula, mas também uma porção de material genético que pode existir independentemente do corpo principal do material genético tal como plasmídeos, epissomas, vírus, transposons ou em organelas tais como mitocôndrias como exemplo não limitante. Como exemplos não limitantes de alvos de TALE nuclease, as sequências genômicas atingidas geralmente consistem em sequências com 17 pb de comprimento (chamadas de meios alvos) separadas por um espaçador de 15 pb. Cada meio alvo é reconhecido pelas repetições de TALE nucleases listadas nas tabelas 1, 5, 6 e 10 como exemplos não limitantes, codificados em plasmídeos, sob o controle do promotor EF1-alfa ou promotor T7. A sequência alvo de ácido nucleico é definida pela sequência 5’ para 3’ de uma fita do dito alvo, como in- dicado nas tabelas 1, 5, 6 e 10.

[000217] - Por receptor de antígeno quimérico (CAR) entende-se mo léculas que combinam um domínio de ligação contra um componente presente sobre a célula alvo, por exemplo, uma especificidade baseada em anticorpo por um antígeno desejado (por exemplo, antígeno tumoral) com um domínio intracelular que ativa o receptor de célula T para gerar uma proteína quimérica que exibe uma atividade imune célula antialvo específica. Geralmente, CAR consiste em um anticorpo de cadeia simples extracelular (scFvFc) fundido ao domínio de sinalização intracelular da cadeia zeta do complexo de receptor de antígeno de célula T (scFvFc:Z) e tem a habilidade, quando expressa em células T, de redirecionar o reconhecimento do antígeno com base na especi-ficidade do anticorpo monoclonal. Um exemplo de CAR usado na presente invenção é um CAR direcionado contra o antígeno de CD19 e pode compreender como exemplo não limitante a sequência de ami- noácido: SEQ ID NO:73.

[000218] - Por "vetor de liberação" ou "vetores de liberação" é pre tendido qualquer vetor de liberação que possa ser usado na presente invenção para colocar em contato com a célula (isto é, "contatar") ou liberar dentro das células ou compartimentos subcelulares (isto é, introduzir) agentes/químicos e moléculas (proteínas ou ácidos nucleicos) necessários na presente invenção. El inclui, mas não está limitado a vetores de liberação lipossomais, vetores de liberação viral, vetores de liberação de fármaco, veículos químicos, veículos poliméricos, lipople- xos, poliplexos, dendrímeros, microbolhas (agentes de contraste de ultrassom), nanopartículas, emulsões ou outros vetores de transferência adequados. Esses vetores de liberação permitem a liberação de moléculas, químicos, macromoléculas (genes, proteínas) ou outros vetores tais como plasmídeos, peptídeos desenvolvidos por Diatos. Nesses casos, vetores de liberação são veículos moleculares. Por "ve- tor de liberação" ou "vetores de liberação" também é pretendido métodos de liberação para realizar a transfecção.

[000219] - As expressões "vetor" ou "vetores" referem-se a uma mo lécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ele tenha sido ligado. Um "vetor" na presente invenção inclui, mas não está limitado a um vetor viral, um plasmídeo, um vetor de RNA ou um DNA linear ou circular ou molécula de RNA que pode consistir em ácidos nucleicos cromossômicos, não cromossômicos, semi-sintéticos ou sintéticos. Vetores preferidos são aqueles capazes de replicação autônoma (vetor epissomal) e/ou expressão de ácidos nucleicos aos quais eles estão ligados (vetores de expressão). Grandes números de vetores adequados são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[000220] Vetores virais incluem retrovírus, adenovírus, parvovírus (por exemplo, vírus adenoassociados), coronavírus, vírus RNA de fita negativa tal como ortomixovírus (por exemplo, vírus influenza), rabdo- vírus (por exemplo, vírus da raiva e da estomatite vesicular), parami- xovírus (por exemplo, sarampo e Sendai), vírus RNA de fita positiva tais como picornavírus e alfavírus, e vírus DNA de fita dupla incluindo adenovírus, herpesvírus (por exemplo, vírus do Herpes Simplex tipos 1 e 2, vírus de Epstein-Barr, citomegalovírus), e poxvírus (por exemplo, varíola, fowlpox e canaripox). Outros vírus incluem o vírus Norwalk, togavírus, flavivírus, reovírus, papovavírus, hepadnavírus, e vírus da hepatite, por exemplo. Exemplos de retrovírus incluem: vírus da leuco- se-sarcoma aviário, vírus de mamífero tipo C, tipo B, tipo D, grupo HTLV- BLV, lenti vírus, espumavírus (Coffin, J. M., Retro viridae: The víruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott- Raven Publishers, Philadelphia, 1996).

[000221] - Por "vetor lentiviral" entende-se vetores lentivirais basea dos em HIV que são muito promissores para a liberação de gene devi do a sua capacidade de envelopamento relativamente grande, imuno- genicidade reduzida e sua habilidade para transduzir estavelmente com alta eficiência uma grande faixa de diferentes tipos celulares. Os vetores lentivirais são geralmente gerados depois da transfecção transitória de três (embalagem, envelope e transferência) ou mais plasmí- deos em células produtoras. Como o HIV, os vetores lentivirais entram na célula-alvo através da interação de glicoproteínas da superfície viral com receptores sobre a superfície celular. Na entrada, o RNA viral sofre transcrição reversa, que é mediada pelo complexo da transcriptase reversa viral. O produto da transcrição reversa é um DNA viral linear de fita dupla, que é o substrato para a integração viral no DNA das células infectadas. Por "vetores lentivirais integrativos (ou LV)" entende- se tais vetores como exemplo não limitante, que são capazes de integrar o genoma de uma célula alvo. Ao contrário, por "vetores lentivirais não integrativos (ou NILV)" entende-se vetores para liberação de gene eficientes que não integram o genoma de uma célula-alvo através da ação da integrase viral.

[000222] - Vetores de liberação e vetores podem estar associados ou combinados com quaisquer técnicas de permeabilização celular tal como a sonoporação ou a eletroporação ou derivadas dessas técnicas.

[000223] - Por célula ou células é pretendido qualquer célula viva eu- cariótica, células primárias e linhagens celulares derivadas desses or-ganismos para culturas in vitro.

[000224] - Por "célula primária" ou "células primárias" são pretendi das células retiradas diretamente de tecido vivo (isto é, material de biópsia) e estabelecidas para o crescimento in vitro, que foram submetidas a um número muito reduzido de duplicações populacionais e são portanto mais representativas dos componentes funcionais principais e características dos tecidos a partir dos quais elas são derivadas, em comparação com linhagens celulares contínuas tumorigênicas ou arti-ficialmente imortalizadas.

[000225] Como exemplos não limitantes, as linhagens celulares podem ser selecionadas do grupo que consiste em células CHO-K1; células HEK293; células Caco2; células U2-OS; células NIH 3T3; células NSO; células SP2; células CHO-S; células DG44; células K-562, células U-937; células MRC5; células IMR90; células Jurkat; células HepG2; células HeLa; células HT-1080; células HCT-116; células Hu- h7; células Huvec; células Molt 4.

[000226] Todas essas linhagens celulares podem ser modificadas pelo método da presente invenção para fornecer modelos de linhagem celular para produzir, expressar, quantificar, detectar, estudar um gene ou uma proteína de interesse; esses modelos também podem ser usados para rastrear moléculas biologicamente ativas de interesse em pesquisa e produção e vários campos tais como químicos, biocombus- tíveis, terapêuticos e agronomia como exemplos não limitantes.

[000227] - Por "mutação" é pretendida a substituição, deleção, inser ção de até um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, vinte, vinte e cinco, trinta, quarenta, cinquenta ou mais nucleotídeos/aminoácidos em uma sequência de polinucleotídeo (cDNA, gene) ou de polipeptídeo. A mutação pode afetar a sequência codificadora de um gene ou sua sequência regulatória. Ela também pode afetar a estrutura da sequência genômica ou a es- trutura/estabilidade do mRNA codificado.

[000228] - Por "variante" entende-se uma variante de repetição, uma variante, uma variante de ligação ao DNA, uma TALE nuclease variante, um polipeptídeo variante obtido pela mutação ou substituição de pelo menos um resíduo na sequência de aminoácidos da molécula parental.

[000229] - Por "variante funcional" é pretendido um mutante cataliti- camente ativo de uma proteína ou de um domínio de proteína; tal mutante pode ter a mesma atividade comparada com sua proteína ou domínio de proteína parental ou propriedades adicionais ou maior ou menor atividade.

[000230] - Por "gene" entende-se a unidade básica de hereditarieda de, que consiste em um segmento de DNA arranjado de uma maneira linear ao longo de um cromossomo, que codifica uma proteína específica ou segmento de proteína. Um gene inclui tipicamente um promotor, uma região 51 não traduzida, uma ou mais sequências codificadoras (exons), opcionalmente íntrons, uma região 3’ não traduzida. O gene pode compreende adicionalmente um terminador, intensificado- res e/ou silenciadores.

[000231] - Como usado aqui, a expressão "lócus" é a localização fí sica específica de uma sequência de DNA (por exemplo, de um gene) sobre um cromossomo. A expressão "lócus" pode se referir à localização física específica de uma sequência alvo de uma endonuclease de corte raro sobre um cromossomo. Tal lócus pode compreender uma sequência-alvo que é reconhecida e/ou clivada por uma endonuclease de corte raro de acordo com a invenção. É compreendido que o lócus de interesse da presente invenção pode qualificar não apenas uma sequência de ácido nucleico que existe no corpo principal do material genético (isto é, em um cromossomo) de uma célula, mas também uma porção do material genético que pode existir independentemente do dito corpo principal do material genético, tal como plasmídeos, epissomas, vírus, transposons ou em organelas tais como mitocôndri- as como exemplos não limitantes.

[000232] - A expressão "endonuclease" se refere a qualquer enzima de tipo selvagem ou variante capaz de catalisar a hidrólise (clivagem) de ligações entre ácidos nucleicos dentro de uma molécula de DNA ou de RNA, preferivelmente uma molécula de DNA. As endonucleases não clivam a molécula de DNA ou de RNA independente de sua sequência, mas reconhecem e clivam a molécula de DNA ou de RNA em sequências de polinucleotídeos específicos, referidas posteriormente como "sequências-alvo" ou "sítios-alvo". As endonucleases podem ser classificadas como endonucleases de corte raro quando possuem tipicamente um sítio de reconhecimento de polinucleotídeo maior do que 12 pares de base (pb) de extensão, mais preferivelmente de 14 a 55 pb. As endonucleases de corte raro aumentam significativamente HR pela indução de quebras de DNA de fita dupla (DSBs) em um lócus definido (Rouet, Smih et al. 1994; Choulika, Perrin et al. 1995; Pingoud and Silva 2007). As endonucleases de corte raro podem, por exemplo, ser uma endonuclease de migração (Paques e Duchateau 2007), uma nuclease Dedo de Zinco quimérica (ZFN) que resulta da fusão de do-mínios de dedo de zinco manipulados com o domínio catalítico de uma enzima de restrição tal como FokI (Porteus and Carroll 2005) ou uma endonuclease química (Eisenschmidt, Lanio et al. 2005; Arimondo, Thomas et al. 2006). Em endonucleases químicas, um clivador químico ou peptídico é conjugado a um polímero de ácidos nucleicos ou a outro DNA que reconhece uma sequência-alvo específica, atingindo dessa maneira a atividade de clivagem para uma sequência específica. Endonucleases químicas também abrangem nucleases sintéticas como conjugados de ortofenantrolina, uma molécula que cliva o DNA e oiligonucleotídeos que formam tríplex (TFOs), conhecidos por se ligar a sequências de DNA específicas (Kalish e Glazer 2005). Tais endonucleases químicas estão compreendidas na expressão "endonuclease" de acordo com a presente invenção.

[000233] Endonucleases de corte raro também podem ser, por exemplo, TALE nucleases, uma nova classe de nucleases quiméricas que usam um domínio catalítico de FokI e um domínio de ligação ao DNA derivado de um Efetor Semelhante ao Ativador da Transcrição (Transcription Activator Like Effector (TALE)), uma família de proteínas usada no processo de infecção por patógenos de planta do gênero de Xantomonas (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al.). A disposição funcional de uma TALE nuclease baseada em FokI (TALE nuclease) é essencialmente aquela de um ZFN, com o domínio de ligação ao dedo de Zinco do DNA sendo substituído pelo domínio TALE. Como tal, a clivagem do DNA pela TALE nuclease requer duas regiões de reconhecimento do DNA que flanqueiam uma região central inespecífica. As endonucleases de corte raro abrangidas na presente invenção também podem ser derivadas de TALE nucleases.

[000234] A endonuclease de corte raro pode ser uma endonuclease de migração, também conhecida sob o nome de meganuclease. Tais endonucleases de migração reconhecem uma sequência-alvo de DNA e geram uma quebra da fita simples ou dupla. Endonucleases de migração são altamente específicas, reconhecendo sítios-alvo de DNA que variam de 12 a 45 pares de bases (pb) de extensão, variando geralmente entre 14 a 40 pb de extensão. A endonuclease de migração de acordo com a invenção pode, por exemplo, corresponder a uma endonuclease LAGLIDADG, a uma endonuclease HNH ou a uma endonuclease GIY-YIG. A endonuclease de migração preferida de acordo com a presente invenção pode ser uma variante I-CreI.

[000235] - Por "TALE nuclease" (TALEN) é pretendida uma proteína de fusão que consiste em um domínio de ligação de ácido nucleico derivado tipicamente de um Efetor Semelhante ao Ativador da Transcrição (TALE) e um domínio catalítico de nuclease para clivar uma sequência-alvo de ácido nucleico. O domínio catalítico é preferivelmente um domínio de nuclease e mais preferivelmente um domínio que possui atividade de endonuclease como, por exemplo, I-TevI, ColE7, NucA e Fok-I. Em particular, o domínio TALE pode ser fundido a uma meganuclease como, por exemplo, I-CreI e I-OnuI ou uma variante funcional dessa. Em uma modalidade mais preferida, a dita nuclease é uma TALE nuclease monomérica. Uma TALE nuclease monomérica é uma TALE nuclease que não requer a dimerização para o reconhecimento específico e clivagem, tal como as fusões de repetições TAL manipulada com o domínio catalítico de I-TevI descrito no WO2012138927. Efetor como Ativador da Transcrição (TALE) 'é uma proteína da espécie bacteriana Xanthomonas que compreende uma pluralidade de sequências repetidas, cada repetição compreendendo dirresíduos nas posições 12 e 13(RVD) que são específicas para cada base de nucleotídeo da sequência alvo de ácido nucleico. Os domínios de ligação com propriedades de ligação de ácido nucleico base por base modular similares (MBBBD) também pode ser derivado de novas proteínas modulares recentemente descobertas pelo requerente em uma espécie bacteriana diferente. As novas proteínas modulares possuem a vantagem de exibir mais variabilidade de sequência do que as repetições TAL. Preferivelmente, RVDs associados com o reconhecimento dos diferentes nucleotídeos são HD para o reconhecimento de C, NG para o reconhecimento de T, NI para o reconhecimento de A, NN para o reconhecimento de G ou A, NS para o reconhecimento de A, C, G ou T, HG para o reconhecimento de T, IG para o reconhecimento de T, NK para o reconhecimento de G, NA para o reconhecimento de G, SN para o reconhecimento de G ou A e YG para o reco-nhecimento de T, TL para o reconhecimento de A, VT para o reconhecimento de A ou G e SW para o reconhecimento de A. Em outra modalidade, os aminoácidos críticos 12 e 13 podem ser mutados frente outros resíduos de aminoácidos a fim de modular sua especificidade frente aos nucleotídeos A, T, C e G e em particular para intensificar essa especificidade. A TALE nuclease já foi descrita e usada para estimular o direcionamento do gene e as modificações de gene (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al.). TAL -nucleases manipuladas estão comercialmente disponíveis sob o nome comercial de TALEN™ (Cellec- tis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France).

[000236] - A expressão "clivagem" se refere a ruptura do arcabouço covalente de um polinucleotídeo. A clivagem pode ser iniciada por uma variedade de métodos incluindo, mas não limitados a hidrólise enzimá- tica ou química de uma ligação fosfodiéster. A clivagem da fita simples e a clivagem da fita dupla são possíveis e a clivagem da fita dupla pode ocorrer como resultado de dois eventos distintos de clivagem de fita simples. A clivagem de DNA, RNA ou híbrido de DNA/RNA de fita dupla pode resultar na produção de ambas extremidades cegas ou extremidades coesivas.

[000237] - Por "proteína de fusão" é pretendido o resultado de um processo bem conhecido na técnica que consiste na união de dois ou mais genes que originalmente codificam proteínas separadas ou parte delas, a tradução do dito "gene de fusão" resultando em um único poli- peptídeo com propriedades funcionais derivadas de cada uma das proteínas originais.

[000238] - "Identidade" refere-se à identidade de sequência entre duas moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeos. A identidade pode ser determinada pela comparação de uma posição em cada sequência que pode estar alinhada com propósito de comparação. Quando uma posição na sequência comparada está ocupada pela mesma base, então as moléculas são idênticas naquela posição. Um grau de similaridade ou identidade entre sequências de ácido nucleico ou aminoáci- dos é uma função do número de nucleotídeos idênticos ou pareados nas posições compartilhadas pelas sequências de ácido nucleico. Vários algoritmos de alinhamento e/ou programas podem ser usados para calcular a identidade entre duas sequências, incluindo FASTA ou BLAST que estão disponíveis como parte do pacote de análise de sequência GCG (University of Wisconsin, Madison, Wis.) e podem ser usados com, por exemplo, configuração padronizada. Por exemplo, são contemplados polipeptídeos que possuem pelo menos 70%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade com polipeptídeos específicos aqui descritos e que exibem preferivelmente substancialmente as mesmas funções, assim como o polinucleotídeo que codifica tais poli- peptídeos.

[000239] - "Similaridade" descreve o relacionamento entre as se quências de aminoácidos de dois ou mais polipeptídeos. BLASTP também pode ser usado para identificar uma sequência de aminoáci- dos que possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% de similaridade de sequência com uma sequência de aminoácidos de referência usando uma matriz de similaridade tal como BLOSUM45, BLOSUM62 ou BLOSUM80. A menos que indicado de outra maneira, um escore de similaridade será baseado no uso de BLOSUM62. Quando BLASTP é usado, o percentual de similaridade é baseado nos escores positivos de BLASTP e o percentual de identidade é baseado no escore de identidade de BLASTP. As "identidades" de BLASTP mostram o número e a fração do total de resíduos nos pares de sequências com maior escore que sejam idênticas; e "positivos" em BLASP mostram o número e a fração de resíduos para os quais os escores de alinhamento têm valores positivos e que são similares um com o outro. As sequências de aminoácidos que possuem graus de identidade ou de similaridade ou qualquer grau intermediário de identidade ou similaridade com as sequências de ami- noácidos aqui descritas são contempladas e englobadas por essa descrição. As sequências de polinucleotídeo de polipeptídeos similares são deduzidas usando o código genético e podem ser obtidas por meios convencionais. Por exemplo, uma variante funcional de pTalfa pode ter 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% de similaridade de sequência com uma sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO:107. Um polinucleotídeo que codifica tal variante funcional pode ser produzida pela tradução reversa de sua sequência de aminoácidos usando o código genético.

[000240] - "Domínio de transdução do sinal" ou "ligante coestimulató- rio" se referem a uma molécula sobre uma célula que apresenta antí- geno que se liga especificamente a uma molécula coestimulatória cognata sobre uma célula T, fornecendo dessa maneira um sinal que, em adição ao sinal primário fornecido, por exemplo, pela ligação de um complexo TCR/CD3 com uma molécula de MHC carregada com o peptídeo, medeia a resposta da célula T incluindo, mas não limitado a ativação da proliferação, diferenciação e semelhantes. Um ligante co- estimulatório pode incluir, mas está limitado a CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD- LI, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligante coestimulatório induzí- vel (ICOS-L), molécula de adesão intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, um agonista ou anticorpo que se liga ao receptor do ligante de Toll e um ligante que se ligue especificamente com B7- H3. Um ligante coestimulatório também abrange, inter alia, um anticorpo que se ligue especificamente com uma molécula coestimulatória presente sobre uma célula T, tal como, mas não limitado a CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD- 1, ICOS, antígeno-1 associado a função do linfócito (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, um ligante que se ligue especificamente a CD83.

[000241] Uma "molécula coestimulatória" refere-se ao parceiro de ligação cognato sobre uma célula T que se ligue especificamente com um ligante coestimulatório, mediando dessa\ maneira uma resposta coestimulatória pela célula tal como, mas não limitada a proliferação. As moléculas coestimulatórias incluem, mas não são limitadas a uma molécula de MHC classe I, BTLA e um receptor do ligante de Toll.

[000242] Um "sinal coestimulatório" como usado aqui refere-se a um sinal que em combinação com o sinal primário, tal como a ligação de TCR/CD3, leva a proliferação e/ou regulação positiva da célula T ou a regulação negativa de moléculas-chave.

[000243] - Um "anticorpo biespecífico" refere-se a um anticorpo que tem sítios de ligação para dois antígenos diferentes dentro de uma única molécula de anticorpo. Será apreciado por aqueles versados na técnica que outras moléculas em adição à estrutura canônica do anticorpo podem ser construídas com duas especificidades de ligação. Será apreciado posteriormente que a ligação ao antígeno pelos anticorpos biespecíficos pode ser simultânea ou sequencial. Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos pelas técnicas químicas (veja, por exemplo, Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5807), pelas técnicas do "polioma" (Veja Pat. U.S. No. 4.474.893) ou pelas técnicas de DNA recombinante, que são todos conhecidos per se. Como um exemplo não limitante, cada domínio de ligação compreende pelo menos uma região variável a partir de uma cadeia pesada de anticorpo ("VH ou região H"), em que a região VH do primeiro domínio de ligação se liga especificamente ao marcador linfocítico tal como CD3 e a região VH do segundo domínio de ligação se liga especificamente ao antí- geno do tumor.

[000244] - A expressão "domínio de ligação ao ligante extracelular" como usada aqui é definida como um oligo ou polipeptídeo que é capaz de se ligar ao ligante. Preferivelmente, o domínio será capaz de interagir com uma molécula da superfície celular. Por exemplo, o domínio de ligação ao ligante extracelular pode ser escolhido para reconhecer um ligante que atua como um marcador da superfície celular sobre células-alvo associadas com um estado de doença em particular. Portanto, exemplos de marcadores da superfície celular que po- dem atuar como ligantes incluem aqueles associados com infecções virais, bacterianas e parasitárias, doença autoimune e células de câncer.

[000245] A expressão "indivíduo" ou "paciente" como usada aqui inclui todos os membros do reino animal incluindo primatas não humanos e humanos.

[000246] A descrição acima da invenção fornece uma maneira e um processo para fazê-la e usá-la tal que qualquer pessoa versada na técnica está capacitada para fazer e usar a mesma, essa capacitação sendo fornecida em particular para o assunto em questão das reivindicações em anexo, que fazem parte da descrição original.

[000247] Onde um limite ou faixa numérica é estabelecida, os pontos finais estão incluídos. Todos os valores e subfaixas dentro de um limite ou faixa numérica também estão especificamente incluídas como se explicitamente descritas.

[000248] A descrição acima é apresentada para capacitar uma pessoa experiente na técnica a fazer e usar a invenção e é fornecida no contexto de uma aplicação particular e seus requisitos. Várias modificações para as modalidades preferidas ficarão aparentes para aqueles versados na técnica e os princípios genéricos definidos aqui podem ser aplicados a outras modalidades e aplicações sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Portanto, essa invenção não é pretendida estar limitada às modalidades mostradas, mas é para ser reconhecida com a mais ampla coerência consistente com os princípios e características aqui descritos.

[000249] Tendo descrito essa invenção genericamente, uma compreensão adicional pode ser obtida pela referência a certos exemplos específicos, que são fornecidos aqui com propósitos ilustrativos apenas e não são pretendidos ser limitantes a menos que especificado de outra maneira.

EXEMPLOS Exemplo 1: TALE nucleases que clivam o gene GR humano

[000250] 6 TALE nucleases heterodiméricas que atingem éxons do gene GR humano foram planejadas e produzidas. A Tabela 1 abaixo indica as sequências-alvo clivadas por cada TALE nuclease. GR TALE nuclease era composta por duas entidades independentes (chamadas hemi-TALE nucleases) cada uma contendo uma sequência de repetição manipulada para se ligar e clivar as sequências-alvo de GR que consistem em duas sequências com 17 pb de comprimento (chamadas de hemialvos) separadas por um espaçador com 15 pb.

TABELA 1: Descrição das TALE nucleases e sequências dos sítios-alvo das TALE nucleases no gene GR humano.

[000251] As sequências de aminoácidos dos domínios N terminal, C terminal e repetições são baseadas em AvrBs3 TALE (ref: GenBank: X161130.1). Os domínios C terminal e N terminal são separados por dois sítios de restrição BsmBI. Os arranjos de repetição (SEQ ID NO: 7 a 18), que atingem as sequências desejadas (SEQ ID NO: 1 a 6) foram sintetizados usando um método com suporte sólido composto por etapas consecutivas de restrição/ligação/lavagem (pedido Internacional PCT WO2013/017950). Em resumo, o primeiro bloco (codificado por uma dirrepetição (foi imobilizado sobre um suporte sólido através da interação de biotina/estreptavidina, o segundo bloco (tri-repetição) foi então ligado ao primeiro e depois da digestão com SfaNI, um terceiro bloco (tri-repetição) foi acoplado. O processo foi repetido usando blocos de tri ou dirrepetição depois da obtenção do arranjo de repetição desejado. O produto foi então clonado em um plasmídeo de clonagem pAPG10 clássico para amplificação em E. coli e sequenciado. As sequências do arranjo de repetição assim obtidas foram subclonadas em um vetor TALE de expressão em levedura usando as enzimas de restrição tipo IIS BsmBI para o plasmídeo receptor e BbvI e SfaNI para a sequência de repetição inserida. O DNA que codifica a hemi-TALE nuclease, que contém um domínio de ligação ao DNA derivado de TALE fundido ao domínio catalítico da enzima de restrição FokI, foi amplificado em E. coli, recuperado pelas técnicas miniprep padronizadas e sequenciado para avaliar a integridade do inserto. Atividade de GR TALE nucleases em levedura:

[000252] A atividade de nuclease das seis GR-TALE-nucleases foi testada a 37°C e 30°C em nosso ensaio SSA em levedura previamente descrito (Pedidos Internacionais PCT WO 2004/067736 e em (Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006) sobre alvos contendo as duas sequências-alvo de TALE voltadas uma para outra sobre a fita de DNA separadas por um espaçador de 15 pb resultando na SEQ ID NO: 1 a 6. Todos os plasmídeos repórter-alvo de levedura contendo as sequências-alvo de DNA de TALE nuclease foram construídos como previamente descrito (Pedido Internacional PCT WO 2004/067736 e em (Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006). Os níveis de atividade de clivagem de TALE nuclease, em levedura, de clones individuais sobre os alvos são apresentados na tabela 2.

TABELA 2: Atividade de clivagem das GR TALE nucleases em levedura. Os valores estão compreendidos entre 0 e 1. O valor máximo é 1. Atividade de GR TALE nucleases em células HEK293:

[000253] Cada construto de TALE nuclease foi subclonado usando a digestão com enzima de restrição em um vetor de expressão de mamífero sob o controle de um promotor longo pEF1alfa.

[000254] Um milhão de células HEK293 foram semeadas um dia antes da transfecção. As células foram cotransfectadas com 2,5 μg de cada um dos dois plasmídeos que codificam a metade esquerda e direita de TALE nuclease GRex2, GRex3T2, GRex3T4, GRex5T1, GRex5T2 ou GRex5T3 que reconhecem as duas metades das sequências genômicas-alvo de interesse no gene de GR sob o controle do promotor EF1alfa usando 2,5 μL de lipofectamina (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Como controle, as células foram transfectadas com 2,5 μg de cada um dos dois plasmídeos que codificam a metade esquerda e direita de TALE nucleases que atingem o sítio-alvo da região da cadeia constante alfa do receptor da célula T (TRAC_T01) ((TALE nuclease TRAC_T01-L e -R (SEQ ID NO:41 e SEQ ID NO:42, sítio-alvo TRAC_T01 (SEQ ID NO:37)) sob o controle do promotor EF1lafa. A ruptura da fita dupla gerada pelas TALE nucleases na sequência codificadora de GR induz a união de ex- tremidade não homóloga (NHEJ), que é um mecanismo propenso a erro.

[000255] A atividade das TALE nucleases é medida pela frequência das inserções ou deleções no lócus genômico atingido.

[000256] 2 a 7 dias depois da transfecção, as células foram coleta das e PCRs específicas para o lócus foram realizadas no DNA genô- mico extraído usando os seguintes iniciadores: 5'- CCATCT- CATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3' (sequência adaptadora adiante)- 10N (TAG)- sequência adiante específica para o lócus para o éxon 2 de GR: 5'-GGTTCATTTAACAAGCTGCC-3' (SEQ ID NO: 31), para o éxon 3 de GR: 5' -GCATTCTGACTATGAAGTGA-3' (SEQ ID NO: 32) e para o éxon 5 de GR: 5'- TCAGCAGGCCACTACAGGAGTCTCACAAG-3' (SEQ ID NO: 33) e o iniciador reverso 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-3' (sequência adaptadora reversa)- sequência adiante específica para o lócus para o éxon 2 de GR: 5'-AGCCAGTGAGGGTGAAGACG-3' (SEQ ID NO: 34), para o éxon 3 de GR: 5'- GGGCTTTGCATATAA- TGGAA-3 ' (SEQ ID NO: 35) e para o éxon 5 de GR: 5'- CTGAC- TCTCCCCTTCATAGTCCCCAGAAC-3' (SEQ ID NO: 36).

[000257] Os produtos de PCR foram sequenciados por um sistema de sequenciamento 454 (454 Life Sciences). Aproximadamente 10.000 sequências foram obtidas por produto de PCR e depois analisadas quanto a presença da inserção específica para o sítio de eventos de inserção ou deleção. A Tabela 3 indica o percentual das sequências que mostra inserções ou deleções no sítio-alvo da TALE nuclease entre o número total de sequências na amostra. Na Tabela 3 estão listados os resultados de um experimento representativo de GRex2, GRex3T2 e GRex3T4.

[000258] Em todos os casos, o % de mutagênese foi similar no dia 7 comparado com aquele da amostra no dia 2 pós-transfecção. A natu- reza dos eventos mutagênicos também foi analisada, revelando uma maioria de deleções em todos os casos comparadas com as inserções.

TABELA 3: Percentual de mutagênese direcionada em sítios-alvo de TALE nuclease em células HEK293. Atividade de GR TALE nucleases em linfócitos T primários:

[000259] Cada construto de TALE nuclease foi subclonado usando a digestão com uma enzima de restrição em um vetor de expressão sob o controle de um promotor T7.

[000260] mRNA que codificam TALE nucleases que clivam as sequências genômicas de GR foram sintetizados a partir de cada plas- mídeo que carrega as sequências codificadoras a jusante do promotor T7. Linfócitos T isolados do sangue periférico foram ativados por 5 dias usando esferas ativadoras anti-CD3/CD28 (Life technologies) e 5 milhões de células foram transfectadas por eletroporação com 10 μg de cada um dos 2 mRNAs que codificam ambas as metades das TALE nucleases usando um instrumento CytoLVT-P (aparelho BTX- Harvard). As células T transfectadas com 10 μg de cada um dos 2 mRNAs que codificam ambas as metades das TALE nucleases que atingem o gene CD52 (CD52_T02-L e -R TALEN (SEQ ID NO: 55 e 56), sequência-alvo de CD52_T02 SEQ ID NO:40) são usadas como controle.

[000261] 3 a 7 dias depois da transfecção, o DNA genômico foi iso lado das células transfectadas e PCRs específicas para o lócus foram realizadas usando iniciadores previamente descritos. Os produtos de PCR foram sequenciados por um sistema de sequência 454 (454 Life Sciences). Aproximadamente, 10.000 sequências foram obtidas por produto de PCR e analisadas depois quanto a presença de eventos de inserção ou deleção específicos para o sítio; resultados na Tabela 4.

TABELA 4: Percentual de mutagênese direcionada em sítios-alvo endógenos de TALE nuclease em linfócitos T primários. Exemplo 2: TALE nucleases que clivam o gene CD52 humano, a cadeia constante alfa do receptor de célula T (TRAC) e as cadeias constantes beta 1 e 2 do receptor de célula T (TRBC).

[000262] Como descrito no Exemplo 1, TALE nucleases heterodimé- ricas que atingem respectivamente os genes CD52, TRAC e TRBC foram designadas e produzidas. As sequências genômicas atingidas consistem em duas sequências de 17 pb de comprimento (chamadas de hemialvos) separadas por um espaçador com 11 ou 15 pb. Cada hemialvo é reconhecido pelas repetições das hemi-TALE nucleases listadas na Tabela 5. O genoma humano contém duas cadeias beta do receptor da célula T funcional (TRBC1 e TRBC2). Durante o desenvolvimento dos linfócitos T alfa/beta, uma dessas duas cadeias constantes é selecionada em cada célula para ser ligada com a região variável de TCR beta e formar uma cadeia beta de extensão completa funcional. Os 2 alvos de TRBC foram escolhidos em sequências conservadas entre TRBC1 e TRBC2, tal que a TALE nuclease correspondente poderá clivar ambos TRBC1 e TRBC2 ao mesmo tempo.

TABELA 5: Descrição das CD52, TRAC e TRBC TALE nucleases e sequências dos sítios-alvo das TALE nucleases nos genes huma- nos correspondentes.

[000263] Outras sequências-alvo nos genes de TRAC e CD52 foram designadas e estão mostradas na Tabela 6.

TABELA 6: Sequências-alvo adicionais para TRAC e CD52 TALE- nucleases. Atividade de CD52-TALE nuclease, TRAC-TALE-nuclease e TRBC- TALE nuclease em células HEK293

[000264] Cada construto de TALE nuclease foi subclonado usando a digestão com uma enzima de restrição em um vetor de expressão de mamífero sob o controle do promotor pEF1 alfa longo. Um milhão de células HEK293 foram semeadas um dia antes da transfecção. As células foram cotransfectadas com 2,5 μg de cada um dos dois plasmí- deos que reconhecem as duas metades-alvo na sequência genômica de interesse no gene de CD52, região da cadeia constante alfa do receptor de célula T (TRAC) ou região constante beta do receptor de célula T (TRBC) sob o controle do promotor EF1alfa ou 5μg de um vetor pUC de controle (pCLS0003) usando 25 μL de lipofectamina (Invitro- gen) de acordo com as instruções do fabricante. A clivagem da fita dupla gerada pelas TALE nucleases nas sequências codificadoras de CD52 ou TRAC é reparada nas células vivas pela união de extremidade não homóloga (NHEJ), que é um mecanismo propenso a erro. A atividade das TALE nucleases é medida pela frequência das inserções ou deleções no lócus genômico atingido. 48 horas depois da transfec- ção, o DNA genômico foi isolado das células transfectadas e PCRs específicas para o lócus foram realizadas usando os seguintes iniciadores: 5'-CCATCTC ATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG (sequência adaptadora adiante)-10N (TAG)-sequência adiante específica para o lócus para CD52: 5'- CAGATCTGCAGAAAGGAAGC-3' (SEQ ID NO: 66), para TRAC: 5'- ATCACTGGC ATCTGGACTCCA-3' (SEQ ID NO: 67), para TRBC1 : 5'- AGAGCCCCTACCAGAACCAGAC-3' (SEQ ID NO: 68), ou para TRBC2: 5'-GGACCTAGTAACATAATTGTGC-3' (SEQ ID NO: 69), e o iniciador reverso 5'- CCTATCCCCTGTGTGCCTTGG- CAGTCTCAG (sequência adaptadora reversa)- sequência endógena reversa específica para o lócus para CD52: 5'-CCTGTTGGAGTCC ATCTGCTG-3' (SEQ ID NO: 70), para TRAC: 5'- CCTCATGTCTAGCACAGTTT-3' (SEQ ID NO: 71), para TRBC1 e TRBC2: 5'- ACC AGCTCAGCTCC ACGTGGT-3' (SEQ ID NO: 72). Os produtos de PCR foram sequenciados por um sistema de sequencia- mento 454 (454 Life Sciences). Aproximadamente 10.000 sequências foram obtidas por produto de PCR e depois analisadas quanto a presença de eventos de inserção ou deleção; os resultados estão na Tabela 7.

TABELA 7: Percentuais de indels para TALE nuclease que atinge os alvos CD52_T02, TRAC_T01, TRBC_T01 e TRBC_T02. Atividade de CD52-TALE-nuclease, TRBC-TALE-nuclease e TRAC- TALE-nuclease em linfócitos T primários

[000265] Cada construto de TALE nuclease foi subclonado usando a digestão com enzima de restrição em um vetor de expressão em mamífero sob o controle do promotor T7.

[000266] O mRNA que codifica a TALE nuclease que cliva a sequência genômica de TRAC e TRBC de CD52 foi sintetizado a partir de um plasmídeo que carrega as sequências codificadoras a jusante do promotor T7. Linfócitos T isolados do sangue periférico foram ativados por 5 dias usando esferas ativadoras anti-CD3/CD28 (Life technologies) e 5 milhões de células foram transfectadas por eletroporação com 10 μg de cada um dos 2 mRNAs que codificam ambas as metades das TALE nucleases (ou RNA não codificador como controle) usando um instrumento CytoLVT-P. Como consequência das inserções e deleções induzidas por NHEJ, a sequência codificadora para CD52 e/ou TRAC estará fora do painel em uma fração das células resultando em genes não funcionais. 5 dias depois da eletroporação, as células foram mar-cadas com um anticorpo anti-CD52 conjugado com um fluorocromo ou anticorpo antitCR por citometria de fluxo quanto a presença de CD52 ou TCR na superfície celular. Como todos os linfócitos T expandidos do sangue periférico normalmente expressam CD52 e TCR, a proporção de células negativas para CD52 ou negativas para TCR é uma medida direta da atividade de TALE nuclease. Na tabela 8 estão listados os resultados de um experimento representativo. A Tabela 9 mostra os resultados de um experimento representativo que testa a eficiência das TRBC TALE nucleases.

TABELA 8: Percentuais de linfócitos T negativos para negativos CD52, negativos para TCR e duplo negativos para CD52/TCR depois da transfecção de polinucleotídeos que expressam TALE nucleasse cor-respondente.

TABELA 9: Percentuais de linfócitos T negativos para TCR depois da transfecção de polinucleotídeos que expressam TRBC TALE nuclease. Análise funcional de células T com gene de CD52 direcionado

[000267] A meta da inativação do gene de CD52 é tornar os linfócitos T resistentes à imunossupressão mediada pelo anticorpo anti-CD52. Como descrito no parágrafo anterior, os linfócitos T foram transfecta- dos com mRNA que codifica TALE nuclease que cliva CD52. 7 dias depois da transfecção, as células foram tratadas com 50 μg/ml de anticorpo monoclonal anti-CD52 (ou IgG de rato de controle) com ou sem complemento de coelho 30% (Cedarlane). Depois de 2 horas de incubação a 37°C, as células foram marcadas com um anticorpo anti-CD52 conjugado com fluorocromo junto com um corante de viabilidade fluorescente (eBioscience) e analisadas por citometria de fluxo para medir a frequência de células positivas para CD52 e células negativas para CD52 entre as células vivas. A Figura 6 mostra o resultado de um experimento representativo, que demonstra que as células negativas para CD52 são completamente resistentes à toxicidade do anticorpo anti- CD52 mediada pelo complemento. Análise funcional de células T com o gene de TRAC direcionado

[000268] O objetivo da inativação do gene de TRAC é tornar os linfó- citos T não responsivos à estimulação do receptor de célula T. Como descrito no parágrafo prévio, os linfócitos T foram transfectados com mRNA que codifica uma TALE nuclease que cliva TRAC ou CD52. 16 dias depois da transfecção, as células foram tratadas com até 5 μg/ml de fito-hemaglutinina (PHA, Sigma-Aldrich), um mitógeno de célula T que atua através do receptor de célula T. As células com um receptor de célula T funcional devem aumentar de tamanho depois do tratamento com PHA. Depois de três dias de incubação, as células foram marcadas com um anticorpo anti-Cd52 ou antitCR conjugados com um fluorocromo e analisadas por citometria de fluxo para comparar a distribuição de tamanho celular entre células positivas para TCR e negativas para TCR ou entre células positivas para CD52 e negativas para CD52. A Figura 7 mostra que as células positivas para TCR aumentam de tamanho significativamente depois do tratamento com PHA, enquanto que as células negativas para TCR têm o mesmo tamanho como as células não tratadas, indicando que a inativação de TRAC tornou-as não responsivas à sinalização de TCR. Ao contrário, as células positivas para CD52 e negativas para CD52 aumentam de tamanho na mesma extensão. Análise funcional de células T com genes de CD52 e TRAC direcionados

[000269] Para verificar que a manipulação do genoma não afeta a habilidade das células T em apresentar atividade antitumor quando fornecidas com um receptor de antígeno quimérico (CAR), nós trans- fectamos células T que tenham sido atingidas com CD52-TALE nuclease e TRAC-TALE nuclease com 10 μg de RNA que codifica um CAR anti-CD19 (SEQ ID NO:73). 24 horas mais tarde, as células T foram incubadas por 4 horas com células Daudi que expressam CD19. A regulação positiva da superfície celular de CD107a, um marcador da liberação de grânulo citotóxico pelos linfócitos T (chamada de degra- nulação) foi medida pela análise de citometria de fluxo (Betts, Brench- ley et al. 2003). Os resultados estão incluídos na Figura 8 e mostram que células negativas para CD52 negativas /negativas para TCRαβ e células positivas para CD52/positivas para TCRαβ possuem a mesma habilidade de degranulação em resposta a PMA/ionomicina (controle positivo) ou células Daudi CD19+. A regulação positiva de CD107 é dependente da presença de um CD19+. Esses dados sugerem que a manipulação do genoma não tem impacto negativo sobre a habilidade das células T de montar uma resposta controlada antitumor. Segurança genômica de CD52-TALE nuclease e TRAC-TALE nuclease em linfócitos T primários.

[000270] Como os construtos incluem subunidades de nuclease, uma questão importante é se múltiplas transfecções de TALE nuclease podem levar a genotoxicidade de uma clivagem fora do alvo em sequências-alvo que quase combinam ou pelo pareamento deficiente de hemi-TALE nucleases. Para avaliar o impacto de TRAC-TALE nuclease e CD52-TALE nuclease sobre a integridade dos genomas celulares, nós listamos sequências no genoma humano que apresentaram o potencial da clivagem fora do sítio. Para gerar essa lista, nós identificamos todas as sequências no genoma com até 4 substituições comparadas com os hemialvos originais e depois identificamos os pares de hemialvos potenciais em uma orientação cabeça a cabeça com um espaçador de 9 a 30 pb entre uma e outra. Essa análise incluiu sítios potencialmente atingidos pelos homodímeros de uma molécula de hemi-TALE nuclease ou heterodímeros formados por uma hemi-TALE nuclease de CD52 e uma hemi-TALE nuclease de TRAC. Nós classificamos os alvos fora do sítio potenciais com base nos dados da especificidade, levando em consideração o custo de substituições individuais e a posição das substituições (onde os não pareamentos são mais bem tolerados para bases na extremidade 3’ do hemialvo). Nós obtivemos 173 sequências únicas com um escore que reflete uma avaliação da probabilidade de clivagem. Nos selecionamos os 15 melhores escores e analisamos pelo sequenciamento de alta eficiência a fre- quência de mutações encontradas nesses loci em células T simultaneamente transfectadas com CD52 e TRAC TALE nuclease e purificadas pela separação magnética como negativas para CD52, negativas para TCRαβ. Os resultados estão na Figura 9. A maior frequência de inser- ção/deleção é de 7 x 10-4. Esses resultados tornam o alvo fora do sítio putativo pelo menos 600 vezes menos provável de ser mutado do que os alvos pretendidos. Os reagentes de TALE nuclease usados nesse estudo parecem, entretanto, extremamente específicos. Exemplo 3: TALE nucleases que clivam o gene de CTLA4 humano e o gene de PDCD1 humano.

[000271] Como descrito no Exemplo 1, TALE nucleases heterodimé- ricas que atingem respectivamente os genes de PDCD1 e CTLA4 foram planejados e produzidos. As sequências genômicas direcionadas consistem em duas sequências com 17 pb de extensão (chamadas de hemialvos) separadas por um espaçador com 11 ou 15 pb. Cada hemialvo é reconhecido pelas repetições de hemi-TALE nucleases listadas na Tabela 10.

TABELA 10: Descrição de CTLA4 e PDCD1 TALE nucleases e se- quencias dos sítios-alvo de TALE nucleases nos genes humanos correspondentes. Atividade de CTLA4-TALE nuclease e PDCD1-TALE nuclease em células HEK293

[000272] Cada construto de TALE nuclease foi subclonado usando a digestão com uma enzima de restrição em um vetor de expressão de mamífero sob o controle do promotor pEF1 alfa longo. Um milhão de células HEK293 foram semeadas um dia antes da transfecção. As células foram cotransfectadas com 2,5 μg de cada um dos dois plasmí- deos que codificam as TALE nucleases que reconhecem as duas metades-alvo na sequência genômica de interesse no gene de PDCD1 e CTLA-4 sob o controle do promotor EF1alfa ou 5μg de um vetor pUC de controle (pCLS0003) usando 25 μL de lipofectamina (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. A clivagem da fita dupla gerada pelas TALE nucleases nas sequências codificadoras de PDCD1 e CTLA-4 é reparada nas células vivas pela união de extremidade não homóloga (NHEJ), que é um mecanismo propenso a erro. A atividade das TALE nucleases nas células vivas é medida pela frequência das inserções ou deleções no lócus genômico atingido. 48 horas depois da transfecção, o DNA genômico foi isolado das células transfectadas e PCRs específicas para o lócus foram realizadas usando os seguintes iniciadores: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG (se quência adaptadora adiante)- 10N (TAG)- sequência adiante específica para o lócus de CTLA4_T01: 5'-CTCTACTTCCTGAAGACCTG-3 ' (SEQ ID NO: 99) , para CTLA4 T03/T04: 5'- AC AGTTGAGAGATG- GAGGGG-3 ' (SEQ ID NO: 100), para PDCD1_T01 : 5'- CCACAGAGGTAGGTGCCGC-3' (SEQ ID NO: 101) ou para PDCD1_T03: 5'- GAC AGAGATGCCGGTCACCA-3 ' (SEQ ID NO: 102) e o iniciador reverso 5'- CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG (sequência adaptadora reversa)- sequência endógena reversa específica para o lócus para CTLA4 T01: 5'-TGGAATACAGAGCCAGCCAA-3' (SEQ ID NO:103), para CTLA4_T03/T04: 5'-GGTGCCCGTGCAGATGGAAT-3' (SEQ ID NO: 104), para PDCD1_T01: 5'-GGCTCTGC AGTGGAGGCC AG-3 ' (SEQ ID NO: 105) ou para PDCDl_T03: 5'- GGACAACGCCACCTTCACCT-3' (SEQ ID NO: 106).

[000273] Os produtos de PCR foram analisados pelo ensaio de T7- endonuclease: resumidamente, depois da desnaturação e reanela- mento do produto de PCR, a T7 endonuclease digerirá especificamente DNA não pareado composto por fitas de tipo selvagem e mutadas. O produto de digestão é então resolvido pela eletroforese em gel de poliacrilamida. A presença de um produto digerido é indicativa de sequências mutadas induzidas pela atividade de TALE nuclease. Os resultados são mostrados na Figura 10, onde as setas apontam para os produtos de PCR digeridos. Eles demonstram que PDCD1_T1, PDCD1_T3, CTLA4_T1 e CTLA4_T4 TALE nucleases exibem todas as atividades mutagênicas de nuclease em seus sítios-alvo. Exemplo 4: pTalfa permite a expressão na superfície de CD3 em linfócitos T com TCR alfa inativado: Descrição das diferentes versões de preTalfa:

[000274] O gene de pTalfa humano codifica uma glicoproteína transmembrana que compreende um domínio semelhante a Ig extrace- lular, um domínio transmembrana hidrofóbico e uma grande cauda in- tracitoplasmática C terminal. Diferentes versões derivadas da glicopro- teína pTalfa humana foram planejadas e estão descritas na Tabela 11 e representadas na figura 11.

TABELA 11: Descrição de um subgrupo de construtos pTalfa

[000275] Os diferentes construtos de preTalfa testados incluem:

[000276] 1) mutantes por deleção de pTalfa: Diferentes deleções foram geradas na cauda citoplasmática intracelular da proteína pTalfa humana (que compreende 114 aminoácidos) (SEQ ID NO:107). Os construtos testados incluem a versão de extensão completa da proteína (FL) e os mutantes nos quais os aminoácidos 18, 48, 62, 78, 92, 110 e 114 foram deletados da terminação C da proteína (SEQ ID NO: 108 a SEQ ID NO: 114).

[000277] 2) mutantes de pTalfa que contêm domínios de ativação intracelular: As variantes FL e Δ48 foram fundidas aos domínios de ativação intracelular de CD8, CD28 ou 41BB nas suas terminações C (SEQ ID NO:115 a SEQ ID NO:120).

[000278] 3) mutantes quiméricos de pTalfa/TCRα: Em um dos construtos, o domínio intracelular (IC) de TCRα foi fundido a uma versão sem a cauda (Δ114) de pTalfa (SEQ ID NO:121). Um segundo construto também foi gerado no qual o domínio extracelular de pTalfa foi fundido aos domínios transmembrana (TN) e IC de TCRα (SEQ ID NO:122).

[000279] 4) mutantes por dimerização de pTalfa: Algumas muta ções foram descritas na literatura como sendo capazes de alterar a habilidade de oligomerização/dimerização do complexo preTCR. Esses mutantes são propostos permitir a expressão de preTCR na superfície celular, sem induzir a sinalização constitutiva (suposta ser induzida depois da oligomerização de preTCR). As mutações foram introduzidas na variante pTalfaΔ48 e são:

[000280] - 1xMUT: W46R (SEQ ID NO: 123)

[000281] - 4xMUT: D22A, K24A, R102A, R117A (SEQ ID NO:124) Atividade de diferentes construtos de preTalfa em células Jurkat com TRAC inativado:

[000282] A fim de rastrear as diferentes variantes de pTalfa quanto a sua habilidade de restaurar a expressão de CD3 na superfície em células com TCR alfa inativado, uma linhagem celular foi gerada no qual o gene de TCR alfa foi rompido usando TALEN que atinge TRAC. Células Jurkat (uma linhagem celular de célula T de leucemia) foram transfectadas com plasmídeos que codificam TALEN que cliva TRAC usando a eletroporação com CytoPulse e as células KO (TCRα/βNEG; CD3NEG) foram então purificadas pela seleção negativa usando esferas magnéticas CD3. A população KO (células JKT_KOx3) foi amplificada e usada para rastrear as diferentes variantes de pTalfa. O rastreamen- to foi realizado pela transfecção de um milhão de células JKT_KOx3 com 15 μg de plasmídeo que codifica as diferentes variantes de pTalfa sob o controle de um promotor EF1α, seguido pela análise de citome- tria de fluxo da expressão da superfície celular de CD3 48 h depois da transfecção. A Figura 12 é um exemplo representativo das eficiências de transfecção (%células BFP+) e a atividade dos construtos de FL, Δ18, Δ48 pTalfa em células JKT_KOx3, com base no % de células CD3+, determinado pela citometria de fluxo. Os resultados dos diferentes construtos são agrupados na Tabela 12.

TABELA 12: Atividade dos diferentes construtos em células Jurkat com TCR alfa inativado. A atividade foi medida pela análise de citometria de fluxo em células Jurkat com TCR alfa inativado transfectadas com diferentes construtos de preTalfa.

Atividade de pTalfa-FL e pTalfa-Δ48 em linfócitos T primários com TCR alfa inativada

[000283] A fim de testar a habilidade das versões de pTalfa-FL e pTalfa-Δ48 em induzir a expressão de CD3 na superfície em linfócitos T com TCRalfa inativado, sequências codificadoras de pTalfa-FL e pTalfa-Δ48 foram clonadas em um vetor lentiviral que se auto inativa pLV-SFFV-BFP-2A-PCTRA que codifica a proteína Blue Fluorescent (BFP) sob o promotor SSFV seguida pela auto-clivagem do peptídeo T2A (figura 13).

[000284] Os linfócitos T isolados do sangue periférico foram ativados por 72 horas usando esferas ativadoras anti-CD3/CD28 (Life Technologies) e 4,5 milhões de células foram transfectadas por eletroporação com 10 μg de mRNA que codifica a TALE nuclease que atinge a região constante da cadeia de TCR alfa (TRAC) usando um instrumento CytoLVT-S (BTX-Harvard Harbour). Dois dias depois da eletroporação, as células T foram transduzidas com os vetores lentivirais LV-SFFV- BFP-2A-pTalfa-Δ48 ou LC-SFFV-BFP-2A-controle. Células T CD3 negativas e CD3low foram então purificadas usando esferas magnéticas anti-CD3 (Miltenyi Biotech). Esse protocolo experimental está representado na Figura 14A.

[000285] A Figura 14B representa a análise de citometria de fluxo de TCRalfa/beta, expressão de CD3 na superfície celular e expressão de BFP em células T com TCRalfa inativado (KO) transduzidas com o vetor lentiviral BFP-2A-pTalfaΔ48 (KO/ Δ48) ou BFP de controle (KO/BFP) antes e depois da purificação com esferas CD3. As células com TCRalfa inativado transduzidas com o vetor BFP-2A-pTalfaΔ48 (células BFP+) mostram maiores níveis de CD3 comparadas com células não transduzidas (células BFP-). Nenhuma diferença foi observada entre as células transduzidas com o vetor BFP de controle. Esses resultados indicam que pTalfa medeia a restauração da expressão de CD3 na superfície celular de células com TCRalfa inativado. Em contraste, a coloração de TCRalfa/beta permanece, como esperado, inal- terada nas células transduzidas ou não com o vetor que expressa pTalfa-Δ48.

Expressão de CD3 mediada por pTalfa suporta a ativação de células T deficientes de TCR

[000286] Para determinar a capacidade de pTalfa de transduzir sinais de ativação celular, a expressão de marcadores de ativação precoce e tardio foi analisado sobre as células T com TCR alfa inativado transduzidas como pTalfa-Δ48 e pTalfa-Δ48.41BB. Células T com TCRalfa inativado transduzidas pTalfa-Δ48 e pTalfa-Δ48.41BB foram geradas a partir de células T primárias humanas como descrito na seção anterior e na Figura 14A.

[000287] Para detectar a sinalização através de CD3, as células foram reativadas usando esferas revestidas anti-CD3/CD28 3 dias depois da purificação de células T com TCRalfa inativada com esferas CD3 (Figura 14A). As células foram coradas com um anti-CD69 (marcador de ativação precoce) e anti-CD25 (marcador de ativação tardia) conjugados com fluorocromo, 24 e 48 horas depois da reativação, respectivamente e analisadas pela citometria de fluxo (Figura 15A-B). Como representado na Figura 15A-B. as células com TCR alfa inativa- do que expressam pTalfa-Δ48 (KO/pTα-Δ48) ou pTalfa-Δ48.41BB (KO/pTα-Δ48.BB) mostram regulação positiva dos marcadores de ativação, para níveis similares aqueles observados em células que expressam TCRalfa/beta (NEP: células não eletroporadas).

[000288] Outro indicador da ativação de célula T é um aumento no tamanho celular que às vezes é referido como "blasting". A capacidade dos complexos preTCR para induzir "blasting" foi medida pela análise de citometria de fluxo do tamanho celular 72 horas depois da reativação usando esferas anti-CD3/anti-CD28 (Figura 15C). A estimulação com esferas anti-CD3/CD28 induziu aumentos comparáveis no tamanho celular em células que expressam complexos TCRalfa/beta vs. células que expressam pTalfa-Δ48 ou pTalfa-Δ48.41BB. Juntos, esses resultados sugerem que os complexos preTCR são competentes para transduzir sinais que acoplam eficientemente com os mecanismos que medeia a regulação positiva do marcador de ativação.

[000289] Expressão de CD3 mediada por pTalfa suporta a expansão de células T primárias deficientes em TCR usando anticorpos anti- CD3/CD28 estimulantes

[000290] Para avaliar a capacidade dos complexos preTCR em apoiar a proliferação celular em longo prazo, a proliferação das células geradas como descrito previamente foi medida. Dez dias depois da ativação inicial, as células foram mantidas em IL2 (non-Re-act) ou em IL2 com esferas anti-CD3/CD28 (Re-act). Para cada condição, as células foram contadas e analisadas por citometria de fluxo em diferentes pontos de tempo para avaliar o número de células BFP+. O crescimento de células com TCRalfa inativado (KO) transduzidas com os vetores BFP ou BFP-T2A-preTCRα-Δ48 foi comparado e a indução da multiplicação dessas células foi avaliada com relação ao valor obtido no dia 2 pós-reativação. A Figura 16 mostra os resultados obtidos com dois doadores independentes. Em ambos os casos, as células com TCR inati- vado que expressam pTalfa-Δ48 exibiram expansão maior do que as células com TCR inativado que expressam apenas o vetor BFP de controle. Para o segundo doador, as células com TCR inativado que expressam que expressam pTalfa-Δ48.41BB ou pTalfa de extensão completa também foram incluídas, exibindo também maior expansão do que as células com TCR inativado que expressam apenas o vetor BFP de controle.

Exemplo 5: Otimização da transfecção de mRNA em células T usando a Tecnologia Cytopulse Determinação do programa cytopulse otimizado

[000291] Um primeiro grupo de experimentos foi realizado em PBMCs não ativadas a fim de determinar uma faixa de voltagem na qual as células pudessem ser transfectadas. Cinco programas diferentes foram testados como descrito na Tabela 13.

TABELA 13: Diferentes programas cytopulse usados para determinar a voltagem mínima necessária para a eletropo- ração em células T derivadas de PBMC.

[000292] 3 a 6 milhões de células foram eletroporadas em uma cuve- ta com gap (30 ou 15x106 células/ml) com 20 μg de plasmídeos que codificam GFP e plasmídeos pUC de controle usando diferentes pro-gramas Cytopulse. 24 horas depois da eletroporação, a expressão de GFP foi analisada em células eletroporadas pela citometria de fluxo para determinar a eficiência da transfecção. Os dados mostrados na Figura 17 indicam a voltagem mínima necessária para a eletroporação do plasmídeo em células derivadas de PBMC. Esses resultados de-monstram que o programa cytopulse 3 e 4 permitem uma transformação eficiente das células T (EP#3 e #4).

Eletroporação de mRNA de células T ativadas purificadas

[000293] Depois de determinar o melhor programa cytopulse que permita uma eletroporação eficiente do DNA de células T, nós testamos se esse método era aplicável à eletroporação do mRNA.

[000294] 5 x 106 células T purificadas pré-ativadas por 6 dias com PHA/IL2 foram resuspensas em tampão T de citoporação (aparelho BTX-Harvard) e eletroporadas em cuvetas de 0,4 cm com 10 μg de mRNA que codifica GFP ou 20 μg de plasmídeos que codificam GFP ou pUC usando o programa cytopulse preferido como determinado na seção prévia (Tabela 14).

TABELA 14: Programa cytopulse usado para eletroporar células T purificadas. Petição 870220100462, de 31/10/2022, pág. 103/119

[000295] 48 h depois da transfecção, as células foram coradas com corante de viabilidade (eFluor-450) e a viabilidade celular e o % de cé-lulas GFP+ viáveis foram determinados pela análise de citometria de fluxo (Figura 18).

[000296] Os dados mostrados na Figura 18 indicam que a eletropo- ração de RNA com a condição ótima determinada aqui não é tóxica e permite a transfecção de mais do que 95% das células viáveis.

[000297] Em síntese, o grupo de dados completo mostra que as células T podem ser eficientemente transfectadas com DNA ou RNA. Em particular, a transfecção com RNA não tem impacto sobre a viabilidade celular e permite níveis de expressão uniformes do gene de interesse transfectado na população celular.

[000298] A transfecção eficiente pode ser obtida precocemente depois da ativação celular, independentemente do método de ativação usado (PHA/IL-2 ou esferas revestidas CD3/CD28). Os inventores foram bem sucedidos na transfecção de células a partir de 72 h depois da ativação com eficiência de >95%. Em adição, a transfecção eficiente das células T depois do descongelamento e a ativação também podem ser obtidas usando o mesmo protocolo de eletroporação. Eletroporação de mRNA em células T primárias humanas para expressão de TALE nuclease funcional

[000299] Depois de demonstrar que a eletroporação do mRNA permite a expressão eficiente de GFP em células T primárias humanas, nós testamos se esse método era aplicável à expressão de outras proteínas de interesse. As nucleases efetoras semelhantes ao ativador da transcrição (TALE nuclease) são nucleases específicas para o sítio geradas pela fusão de um domínio de ligação de TAL DNA a um domínio de clivagem do DNA. Elas são ferramentas poderosas de edição do genoma já que elas induzem quebras na fita dupla em particularmente qualquer sequência de DNA desejada. Essas quebras de fita dupla ativam a união de extremidade não homóloga (NHEJ), um me-canismo de reparo do DNA propenso a erro, que leva potencialmente a inativação de qualquer gene de interesse desejado. Alternativamente, se qualquer modelo de reparo adequado é introduzido nas células ao mesmo tempo, as quebras de DNA induzidas pela TALE nuclease podem ser reparadas pela recombinação homóloga, oferecendo dessa maneira a possibilidade de modificar à vontade a sequência de gene.

[000300] Foi usada a eletroporação do mRNA para expressar uma TALE nuclease designada para clivar especificamente uma sequência no gene humano que codifica a cadeia alfa do receptor de antígeno da célula T (TRAC). Mutações induzidas nessa sequência são esperadas resultar na inativação do gene e perda do complexo TCRαβ da superfície celular. RNA de TRAC TALE nuclease ou RNA não codificador como controle são transfectados em linfócitos T humanos primários ativados usando a tecnologia Cytopulse. A sequência de eletroporação consistiu em 2 pulsos de 1200 V seguidos por quatro pulsos de 130 V como descrito na Tabela 14.

[000301] Pela análise da citometria de fluxo da expressão de TCR na superfície 7 dias depois da eletroporação (Figura 19, painel superior), nós observamos que 44% das células T perderam a expressão de TCRαβ. Nós analisamos o DNA genômico das células transfectadas pela amplificação por PCR do lócus de TRAC seguida pela sequência de alta eficiência 454. 33% dos alelos sequenciados (727 de 2153) continham uma inserção ou deleção no sítio de clivagem de TALE nuclease. A Figura 19 (painel inferior) mostra os exemplos dos alelos mu- tados.

[000302] Esses dados indicam que a eletroporação de mRNA usando a tecnologia cytopulse resulta em expressão funcional de TRAC TALE nuclease.

[000303] Eletroporação de células T com um mRNA monocistrônico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) de cadeia simples anti-CD19:

[000304] 5x106 células T pré-ativadas por vários dias (3 a 5) com esferas revestidas anti-CD3/CD28 e IL2 foram re-suspensas no tampão T de citoporação e eletroporadas em cuvetas de 0,4 cm sem mRNA ou com 10 μg de mRNA que codifica um CAR de cadeia simples (SEQ ID NO:73) usando o programa descrito na Tabela 14.

[000305] 24 horas depois da eletroporação, as células foram coradas com um corante de viabilidade fixável eFluor-780 e um fragmento F(ab’)2 de IgG de cabra anticamundongo conjugado com PE específico para avaliar a expressão na superfície celular de CAR em células vivas. Os dados são mostrados na Figura 20. A indica que a grande maioria das células vivas eletroporadas com o RNA monocistrônico previamente descrito expressa o CAR em sua superfície. 24 horas depois da eletroporação, as células T foram cocultivadas com células Daudi (CD19+) por 6 horas e analisadas pela citometria de fluxo para detectar a expressão do marcador de degranulação CD107a em suas superfícies (Betts, Brenchley et al. 2003).

[000306] Os dados mostrados na figura 20 indicam que a maioria das células eletroporadas com o mRNA monocistrônico descrito previamente, degranularam na presença das células-alvo que expressam CD19. Esses resultados demonstram claramente que o CAR expresso na superfície das células T eletroporadas é ativo.

[000307] Eletroporação de células T com um mRNA policistrônico que codifica um receptor de antígeno quimérico (CAR) de multi- subunidade anti-CD19

[000308] 5x106 células T pré-ativadas por vários dias (3 a 5) com esferas revestidas anti-CD3/CD28 e IL2 foram re-suspensas no tampão T de citoporação e eletroporadas em cuvetas de 0,4 cm sem mRNA ou com 45 μg de mRNA que codifica um CAR de cadeia múltipla (SEQ ID NO:125, codificada pela SEQ ID NO: 126, Figura 21A e figura 21B (csm4)) usando o programa descrito na Tabela 14.

[000309] 24 horas depois da eletroporação, as células foram coradas com um corante de viabilidade fixável eFluor-780 e um fragmento F(ab’)2 de IgG de cabra anticamundongo conjugado com PE específico para avaliar a expressão na superfície celular de CAR em células vivas. Os dados mostrados na Figura 21 indicam que a grande maioria das células T vivas eletroporadas com o RNA policistrônico previamente descrito expressa o CAR em sua superfície.

[000310] 24 horas depois da eletroporação, as células T foram cocul- tivadas com células Daudi (CD19+) por 6 horas e analisadas pela cito- metria de fluxo para detectar a expressão do marcador de degranula- ção CD107a em suas superfícies. Os dados mostrados na figura 21 indicam que a maioria das células eletroporadas com o mRNA policis- trônico descrito previamente, degranularam na presença das células- alvo que expressam CD19. Esses resultados demonstram claramente que o CAR expresso na superfície das células T eletroporadas é ativo. LISTA DE REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Arimondo, P. B., C. J. Thomas, et al. (2006). "Exploring the cellular activity of camptothecin- triple-helix-forming oligonucleotide conjugates." Mol Cell Biol 26(1): 324-33. Arnould, S., P. Chames, et al. (2006). "Engineering of large numbers of highly specific homing endonucleases that induce recom-bination on novel DNA targets." J Mol Biol 355(3): 443-58. Ashwell, J. D. and R. D. Klusner (1990). "Genetic and muta-tional analysis of the T-cell antigen receptor." Annu Rev Immunol 8: 139-67. Betts, M. R., J. M. Brenchley, et al. (2003). "Sensitive and viable identification of antigen- specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation." J Immunol Methods 281(1-2): 65-78. Boch, J., H. Scholze, et al. (2009). "Breaking the code of DNA binding specificity of TAL- type III effectors." Science 326(5959): 1509-12. Boni, A., P. Muranski, et al. (2008). "Adoptive transfer of al-logeneic tumor-specific T cells mediates effective regression of large tumors across major histocompatibility barriers." Blood 112(12): 474654. Cambier, J. C. (1995). "Antigen and Fc receptor signaling. The awesome power of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)." J Immunol 155(7): 3281-5. Carrasco, Y. R., A. R. Ramiro, et al. (2001). "An endoplasmic reticulum retention function for the cytoplasmic tail of the human pre-T cell receptor (TCR) alpha chain: potential role in the regulation of cell surface pre-TCR expression levels." J Exp Med 193(9): 1045-58. Cermak, T., E. L. Doyle, et al. (201 1). "Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting." Nucleic Acids Res 39(12): e82. Chames, P., J. C. Epinat, et al. (2005). "In vivo selection of engineered homing endonucleases using double-strand break induced homologous recombination." Nucleic Acids Res 33(20): el78. Choulika, A., A. Perrin, et al. (1995). "Induction of homologous recombination in mammalian chromosomes by using the I-Scel system of Saccharomyces cerevisiae." Mol Cell Biol 15(4): 1968-73. Christian, M., T. Cermak, et al. (2010). "Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases." Genetics 186(2): 757-61. Coutinho, A. E. and K. E. Chapman (2011). "The anti-inflammatory and immunosuppressive effects of glucocorticoids, recent developments and mechanistic insights." Mol Cell Endocrinol 335(1): 213. Critchlow, S. E. and S. P. Jackson (1998). "DNA endjoining: from yeast to man." Trends Bjochem Sci 23(10): 394-8. Deng, D., C. Yan, et al. (2012). "Structural basis for se-quence-specific recognition of DNA by TAL effectors." Science 335(6069): 720-3. Eisenschmidt, K., T. Lanio, et al. (2005). "Developing a pro-grammed restriction endonuclease for highly specific DNA cleavage." Nucleic Acids Res 33(22): 7039-47. Epinat, J. C, S. Arnould, et al. (2003). "A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mam-malian cells." Nucleic Acids Res 31(11): 2952- 62. Geissler, R., H. Scholze, et al. (2011). "Transcriptional acti-vators of human genes with programmable DNA-specificity." PLoS One 6(5): el9509. Howard, F. D., H. R. Rodewald, et al. (1990). "CD3 zeta subunit can substitute for the gamma subunit of Fc epsilon receptor type I in assembly and functional expression of the high- affinity IgE receptor: evidence for interreceptor complementation." Proc Natl Acad Sci U S A 87(18): 7015-9. Huang, P., A. Xiao, et al. (2011). "Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs." Nat Biotechnol 29(8): 699700. Jena, B., G. Dotti, et al. (2010). "Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor- specific chimeric antigen receptor." Blood 116(7): 1035-44. Kalish, J. M. and P. M. Glazer (2005). "Targeted genome modification via triple helix formation." Ann N Y Acad Sci 1058: 151-61. Li, L., M. J. Piatek, et al. (2012). "Rapid and highly efficient construction of TALE-based transcriptional regulators and nucleases for genome modification." Plant Mol Biol 78(4-5): 407-16. Li, T., S. Huang, et al. (2011). "TAL nucleases (TALNs): hy-brid proteins composed of TAL effectors and Fokl DNA-cleavage do-main." Nucleic Acids Res 39(1): 359-72. Li, T., S. Huang, et al. (2011). "Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes." Nucleic Acids Res 39(14): 6315-25. Ma, J. L., E. M. Kim, et al. (2003). "Yeast Mrel 1 and Radl proteins define a Ku-independent mechanism to repair double-strand breaks lacking overlapping end sequences." Mol Cell Biol 23(23): 8820-8. Mahfouz, M. M., L. Li, et al. (2012). "Targeted transcriptional repression using a chimeric TALE-SRDX repressor protein." Plant Mol Biol 78(3): 31 1-21. Mahfouz, M. M., L. Li, et al. (2011). "De novo-engineered transcription activator-like effector (TALE) hybrid nuclease with novel DNA binding specificity creates double-strand breaks." Proc Natl Acad Sci U S A 108(6): 2623-8. Mak, A. N., P. Bradley, et al. (2012). "The crystal structure of TAL effector PthXol bound to its DNA target." Science 335(6069): 716-9. Metzger, H., G. Alcaraz, et al. (1986). "The receptor with high affinity for immunoglobulin E." Annu Rev Immunol 4: 419-70. Miller, J. C, S. Tan, et al. (2011). "A TALE nuclease archi-tecture for efficient genome editing." Nat Biotechnol 29[Gamma]2 : 143-8. Morbitzer, R., P. Romer, et al. (201 1). "Regulation of se lected genome loci using de novo- engineered transcription activatorlike effector (TALE)-type transcription factors." Proc Natl Acad Sci U S A 107(50): 21617-22. Moscou, M. J. and A. J. Bogdanove (2009). "A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors." Science 326(5959): 1501. Mussolino, C, R. Morbitzer, et al. (201 1). "A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity." Nucleic Acids Res 39(21): 9283- 93. Pang, S. S., R. Berry, et al. (2010). "The structural basis for autonomous dimerization of the pre-T-cell antigen receptor." Nature 467(7317): 844-8. Paques, F. and P. Duchateau (2007). "Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy." Curr Gene Ther 7(1): 49-66. Pardoll, D. M. (2012). "Immunology beats cancer: a blueprint for successful translation." Nat Immunol (\2. 1129-32. Park, T. S., S. A. Rosenberg, et al. (2011). "Treating cancer with genetically engineered T cells." Trends Biotechnol 29(11): 550-7. Pingoud, A. and G. H. Silva (2007). "Precision genome sur-gery." Nat Biotechnol 25(7): 743- 4. Porteus, M. H. and D. Carroll (2005). "Gene targeting using zinc finger nucleases." Nat Biotechnol 23(8): 967-73. Rouet, P., F. Smih, et al. (1994). "Introduction of doublestrand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare- cutting endonuclease." Mol Cell Biol 14(12): 8096-106. Saint-Ruf, C, O. Lechner, et al. (1998). "Genomic structure of the human pre-T cell receptor alpha chain and expression of two mRNA isoforms." Eur J Immunol 28(11): 3824-31. Sander, J. D., L. Cade, et al. (201 1). "Targeted gene dis-ruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs." Nat Bio- technol 29(8): 697-8. Smith, J., S. Grizot, et al. (2006). "A combinatorial approach to create artificial homing endonucleases cleaving chosen sequences." Nucleic Acids Res 34(22): el49. Stoddard, B. L. (2005). "Homing endonuclease structure and function." Q Rev Biophys 38(1): 49-95. Tesson, L., C. Usal, et al. (201 1). "Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs." Nat Biotechnol 29(8): 695-6. von Boehmer, H. (2005). "Unique features of the pre-T-cell receptor alpha-chain: not just a surrogate." Nat Rev Immunol 5(7): 5717. Waldmann, H. and G. Hale (2005). "CAMPATH: from concept to clinic." Philos Trans R Soc LondJiBiol Sci 360(1461): 1707-1 1. Weber, E., R. Gruetzner, et al. (2011). "Assembly of designer TAL effectors by Golden Gate cloning." PLoS One 6(5): el 9722. Yamasaki, S., E. Ishikawa, et al. (2006). "Mechanistic basis of pre-T cell receptor-mediated autonomous signaling critical for thy-mocyte development." Nat Immunol 7(1): 67-75. Zhang, F., L. Cong, et al. (201 1). "Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcrip-tion." Nat Biotechnol 29(2): 149-53.

Claims

1. Método ex vivo para a preparação de células T para imu- noterapia, caracterizado pelo fato de que compreende (a) modificar as células T ex vivo pela inativação de pelo menos dois genes: - um primeiro gene que expresse CD52, e - um segundo gene que codifique TCRalfa (b) expandir as referidas células T modificadas; em que a etapa (a) é realizada introduzindo na referida célula T, por eletroporação de RNA, RNAs que codificam TALE- nucleases de corte raro direcionadas contra os referidos genes, em que as TALE-nucleases direcionadas contra RNAs CD52 são codificadas pelas SEQ ID NOs: 55-56 e as TALE-nucleases direcionadas contra o TCRalpha são codificadas pelas SEQ ID NOs: 49-50.

2. Método ex vivo, de acordo com a reivindicação 1, carac-terizado pelo fato de que as referidas células T são células primárias.

3. Método ex vivo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as referidas células T são células hu-manas.

4. Método ex vivo, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as referidas células T modificadas são expandidas na presença de alemtuzumabe.

5. Método ex vivo, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as endonucleases de corte raro são codificadas por RNAm.

6. Método ex vivo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir nas referidas células T um Receptor de Antígeno Quimérico (CAR), em que a sequência do referido Receptor de Antígeno Quimérico é SEQ ID NO: 73.

7. Método ex vivo, de acordo com a reivindicação 6, carac-terizado pelo fato de que o referido Receptor de Antígeno Quimérico é um Receptor de Antígeno Quimérico de cadeia múltipla.

8. Método ex vivo, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que as referidas células T na etapa (a) são derivadas de linfócitos T inflamatórios, linfócitos T ci- totóxicos, linfócitos T reguladores ou linfócitos T auxiliares.

9. Método ex vivo, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que as referidas células T na etapa (a) são derivadas de linfócitos T CD4+ e/ou linfócitos T CD8+.