ES2862127T3

ES2862127T3 - Mediador soluble

Info

Publication number: ES2862127T3
Application number: ES13855431T
Authority: ES
Inventors: Leonard Charles Harrison; Maryam Rashidi; Yuxia Zhang
Original assignee: Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research
Current assignee: Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research
Priority date: 2012-11-15
Filing date: 2013-03-25
Publication date: 2021-10-07
Anticipated expiration: 2033-03-25
Also published as: HK1215156A1; AU2013344807B2; AU2013344807A1; WO2014075125A1; EP2919799A4; EP2919799A1; US9778269B2; EP2919799B1; SG11201503843VA; US20150259412A1

Abstract

Cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más cualesquiera de entre: i) una glucoproteína CD52 soluble, ii) una proteína de fusión que comprende glucoproteína CD52 soluble como primera proteína, y una segunda proteína, iii) un polinucleótido codificante de la parte peptídica de la glucoproteína CD52 soluble de la parte i) o la proteína de fusión de la parte ii), iv) un vector que comprende el polinucleótido de la parte iii), v) una célula aislada que comprende el polinucleótido de la parte iii) o el vector de la parte iv), vi) una composición farmacéutica que comprende uno o más cualesquiera de i) a v) y un portador farmacéuticamente aceptable, para la utilización en el tratamiento o la prevención de la sepsis.

Description

DESCRIPCIÓN

Mediador soluble

Campo de la invención

La presente exposición se refiere de manera general a poblaciones celulares y mediadores solubles capaces de suprimir la activación de las células T, y a la utilización de dichas poblaciones celulares y mediadores solubles para suprimir la activación de las células T, tal como en el tratamiento de enfermedades o condiciones mediadas por la función de las células T efectoras. La exposición se refiere además a métodos de detección de la presencia de un marcador en un sujeto, en el que el marcador es indicativo de la susceptibilidad del sujeto a enfermedades o condiciones mediadas por la función de las células T efectoras.

Antecedentes de la invención

Las células T reguladoras (células Treg, también conocidas como células T supresoras) son subpoblaciones de células T que mantienen la homeostasis inmunitaria y ayudan a evitar enfermedades autoinmunes (Sakaguchi et al., 2008; Shevach, 2006; Vignali et al., 2008). El interés en las células Treg se centra predominantemente en las células Treg CD4+ CD25+ prototípicas que están programadas por el factor de transcripción FoxP3 (Fontenot et al., 2003; Hori et al., 2003). En poblaciones poliespecíficas en reposo, dichas células Treg se caracterizan en el ratón tanto como células 'naturales' derivadas del timo y 'adaptativas' inducidas que suprimen la activación, proliferación y funciones de otras células T (Sakaguchi et al., 2008; Shevach, 2006). Sin embargo, en la sangre humana, las células Treg CD4+ no se distinguen fiablemente a partir de la expresión de FoxP3 (Roncarolo y Gregori, 2008; Allan et al., 2007; Gavin et al., 2006). De esta manera, las células T CD4+ con marcadores de células no expuestas o de memoria se ha demostrado que presentan funciones supresoras similares a pesar de una expresión baja y elevada, respectivamente, de FoxP3 (Miyara et al., 2009). Otros marcadores de superficie de células Treg CD4+ CD25+ FoxP3+ humanas, tales como la expresión reducida del receptor de IL-7, CD127 (Liu et al., 2006; Seddiki et al., 2006), no son específicas para las células Treg.

Aparte de la escasez de marcadores de superficie celular específicos, los mecanismos subyacentes a la supresión por células Treg CD4+ CD25+ FoxP3+ siguen siendo controvertidos. En el ratón, la supresión ex vivo se ha demostrado que requiere el contacto célula-célula, aunque se ha atribuido a múltiples mecanismos (Vignali et al., 2008; Shevach, 2009; Sakaguchi et al., 2009); se conoce todavía menos de la función de células Treg humanas similares. Además, se han descrito otros tipos de células Treg tanto CD4+ como CD8+ que difieren en los mecanismos propuestos de función supresora en el contexto de diversos sitios de tejido o enfermedades (Vignali et al., 2008).

Las células Treg inducidas por la administración de autoantígenos se ha demostrado que protegen frente a algunas enfermedades autoinmunes en determinados modelos animales (revisión por von Herrath y Harrison, 2003). Por ejemplo, en el modelo de ratón diabético no obeso (NOD) de diabetes de tipo 1 (DT1), las células Treg CD4+ inducidas por autoantígenos de islote pancreático administrados, tales como la insulina (Bergerot et al., 1994) o la ácidoglutámico descarboxilasa 65 (GAD65) (Tisch et al., 1999), o la transferencia de células Treg CD4+ inducida por la proinsulina (Every et al., 2006) o un antígeno putativo de islote pancreático (Tang et al., 2004) se ha demostrado que protegen frente a la diabetes autoinmune. Sin embargo, en estos modelos, las células Treg se han estudiado en poblaciones poliespecíficas en reposo y no durante la respuesta del huésped a un antígeno particular. El documento n° WO2008/028229 identifica células T reguladoras CD52hi y da a conocer la utilización de las mismas para tratar enfermedades autoinmunitarias. Recientemente, se han generado clones de células T CD4+ humanas específicas de proinsulina y GAD65 y se han distinguido los clones de Treg a partir de su función supresora in vitro (Dromey et al., 2011). Se ha demostrado que la glucoproteína CD52 anclada a membrana de superficie celular se encuentra regulada positivamente en dichos clones Treg CD4+ expandidos. Sin embargo, el mecanismo de supresión inmunitaria no ha sido caracterizado hasta ahora.

Descripción resumida de la invención

Los presentes inventores han identificado un mediador soluble de la supresión de las células Treg que resulta particularmente eficaz en el tratamiento de la sepsis. De acuerdo con lo anterior, la presente exposición proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más cualesquiera de entre:

i) una glucoproteína CD52 soluble,

ii) una proteína de fusión que comprende glucoproteína CD52 soluble como primera proteína, y una segunda proteína,

iii) un polinucleótido codificante de la parte peptídica de la glucoproteína CD52 soluble de la parte i) o la proteína de fusión de la parte ii),

iv) un vector que comprende el polinucleótido de la parte iii),

v) una célula aislada que comprende el polinucleótido de la parte iii) o el vector de la parte iv),

vi) una composición farmacéutica que comprende uno o más cualesquiera de i) a v) y un portador farmacéuticamente aceptable, para la utilización en el tratamiento o la prevención de la sepsis.

En una realización, la glucoproteína CD52 soluble comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de uno o más cualesquiera de GQNDTSQTSSPS (SEC ID n° 3), SQNATSQSSPS (SEC ID n° 4), GQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKS (SEC ID n° 5), GQNSTAVTTPANKAATTAAATTKAAATTATKTTTAVRKTPGKPPKA (SEC ID n° 6) o GNSTTPRMTTKKVKSATPA (SEC ID n° 7) y un carbohidrato, en el que la parte carbohidrato de la glucoproteína CD52 soluble está unida a asparagina. Preferentemente, la glucoproteína comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica, o es 100% idéntica, a una o más cualesquiera de las secuencias de aminoácidos identificadas en SEC ID n° 3, n° 4, n° 5, n° 6 o n° 7.

En otra realización, una o más cualesquiera de entre la glucoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula o composición farmacéutica se encuentran presentes en una cantidad suficiente para suprimir la sepsis o para reducir o eliminar por lo menos un síntoma de la misma.

Preferentemente, la parte carbohidrato de la glucoproteína CD52 soluble está unida al residuo de asparagina (N) en la SEC ID n° 3.

La parte carbohidrato de la glucoproteína CD52 soluble puede ser cualquier carbohidrato que se conozca que se encuentra unido a la parte extracelular de la glucoproteína CD52 soluble en una célula huésped, tal como un linfocito huésped o una célula huésped del tracto genital.

En una realización, la parte carbohidrato de la glucoproteína CD52 soluble comprende uno o más azúcares biantenario, triantenario o tetraantenario, que pueden encontrarse terminalmente sialiladas.

La proteína de fusión puede comprender una segunda proteína que comprende un fragmento de anticuerpo. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede ser un Fc.

En otra realización, la glucoproteína CD52 soluble, proteína de fusión o composición se administra en un sitio mucosal o transdérmico. De esta manera, el medicamento puede formularse para la administración en un sitio mucosal o transdérmico.

La presente exposición proporciona además un método de diagnóstico de la susceptibilidad de un sujeto a desarrollar sepsis, en el que el método comprende:

detectar el nivel de glucoproteína CD52 soluble en una muestra obtenida del sujeto, y

comparar el nivel de glucoproteína CD52 soluble detectado en la muestra obtenida del sujeto con un nivel de referencia determinado a partir de uno o más sujetos sanos, en el que un nivel inferior de glucoproteína CD52 soluble detectado en la muestra obtenida del sujeto en comparación con el nivel de referencia indica que el sujeto presenta una susceptibilidad incrementada a desarrollar sepsis.

detectar la frecuencia de las células CD52hi en una muestra obtenida del sujeto, y

comparar la frecuencia de las células CD52hi en la muestra obtenida del sujeto con un nivel de referencia determinado a partir de uno o más sujetos sanos,

en la que una frecuencia inferior o una actividad reducida de células CD52hi detectada en la muestra obtenida del sujeto en comparación con el nivel de referencia indica que el sujeto presenta una susceptibilidad incrementada a desarrollar sepsis.

En una realización, se detecta la frecuencia de las células CD52hi mediante la detección del nivel de CD52 unido a membrana en la muestra, mediante la detección del nivel de expresión de proteína CD52 en la muestra y/o mediante detección del nivel de expresión de ARNm de CD52 en la muestra.

En una realización de los métodos dados a conocer en la presente memoria, la muestra se obtiene de un sujeto en el que se ha administrado un antígeno.

En otra realización, la muestra se obtiene de un sitio local de enfermedad en el sujeto.

La presente exposición proporciona además un método in vitro de identificación de un potencial agente terapéutico para el tratamiento o la prevención de la sepsis, en el que el método comprende poner en contacto un agente de ensayo con una célula CD52hi o una población de células CD52hi, y la detección de uno o más de entre el nivel de glucoproteína CD52 soluble producido por la célula o población celular, la frecuencia de células CD52hi y/o la actividad de células CD52hi, y la identificación del agente de ensayo como un potencial agente terapéutico para el tratamiento o la prevención de la sepsis, en el caso de que se incremente el nivel de glucoproteína CD52 soluble, la frecuencia de células CD52hi y/o la actividad de células CD52hi tras el contacto con el agente de ensayo.

En la presente memoria se describe además una composición farmacéutica que comprende una o más cualesquiera de:

i) una glucoproteína CD52 soluble,

iv) un vector que comprende el polinucleótido de la parte iii),

vi) una célula CD52hi aislada capaz de producir glucoproteína CD52 soluble,

vii) una población celular aislada que comprende una pluralidad de células CD52hi capaz de producir glucoproteína CD52 soluble,

viii) medio de cultivo celular, o una fracción del mismo que comprende glucoproteína CD52 soluble, aislada a partir de un cultivo celular que comprende la célula de la parte vi) o la población celular de la parte vii), y

ix) un agente capaz de incrementar el nivel de expresión de glucoproteína CD52 soluble por una célula, y un portador farmacéuticamente aceptable.

En algunos ejemplos, la glucoproteína CD52 soluble comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos de uno o más cualesquiera de GQNDTSQTSSPS (SEC ID n° 3), SQNATSQSSPS (SEC ID n° 4), GQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKS (SEC ID n° 5), GQNSTAVTTPANKAATTAAATTKAAATTATKTTTAVRKTPGKPPKA (SEC ID n° 6) o GNSTTPRMTTKKVKSATPA (SEC ID n° 7) y un carbohidrato. Más preferentemente, la glucoproteína comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95% idéntica o es 100% idéntica, a una o más cualesquiera de las secuencias de aminoácidos identificadas en SEC ID n° 3, n° 4, n° 5, n° 6 o n° 7.

En un ejemplo, la glucoproteína comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95% idéntica o es 100% idéntica, a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 3, que representa el fragmento CD52 soluble humano.

Preferentemente, una o más cualesquiera de entre glucoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector o célula, se encuentra presente en una cantidad suficiente para suprimir la función de células T efectoras y/o una respuesta inmunitaria.

En una realización adicional, la glucoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector o célula, se encuentra presente en una cantidad suficiente para que la supresión de la respuesta inmunitaria resulte en tolerancia a por lo menos un antígeno, tal como un autoantígeno.

En otra realización, una o más cualesquiera de entre la glucoproteína CD52 soluble, proteína de fusión o célula, es capaz de suprimir la función de las células T efectoras y/o es capaz de reducir la respuesta inmunitaria, tal como la respuesta inmunitaria a un autoantígeno.

En una realización, la composición comprende una o más de entre glucoproteína CD52 soluble o proteína de fusión, y se formula para la administración mucosal y/o transdérmica.

En una realización adicional, la composición comprende además insulina y/o un autoantígeno.

La presente exposición proporciona además una proteína de fusión que comprende glucoproteína CD52 soluble como primera proteína, y una segunda proteína,

Preferentemente, la glucoproteína CD52 soluble de la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica, por lo menos 95% idéntica, o es 100% idéntica, a una o más de las secuencias de aminoácidos identificadas en SEC ID n° 3, n° 4, n° 5, n° 6 o n° 7.

Preferentemente, la proteína de fusión es capaz de suprimir la función de las células T efectoras y/o es capaz de reducir la respuesta inmunitaria, tal como la respuesta inmunitaria a un autoantígeno. En una realización, la proteína de fusión reduce la respuesta inmunitaria en una medida que resulta en tolerancia a por lo menos un antígeno, tal como un autoantígeno.

La segunda proteína puede ser cualquier proteína capaz de incrementar la estabilidad y/o la solubilidad de la glucoproteína CD52 soluble, de potenciar el procedimiento de preparación de la glucoproteína CD52 soluble mediante métodos recombinantes, o de potenciar el efecto terapéutico de la glucoproteína CD52 soluble. En un ejemplo, la segunda proteína puede comprender un fragmento de anticuerpo, tal como un Fc.

Preferentemente, la proteína de fusión es soluble.

La presente exposición proporciona además un polinucleótido aislado o recombinante codificante de la proteína de fusión dada a conocer en la presente memoria.

La presente exposición proporciona además un vector que comprende el polinucleótido dado a conocer en la presente memoria.

La presente exposición proporciona además una célula aislada que comprende el polinucleótido y/o el vector dado a conocer en la presente memoria. La célula puede ser una célula de mamífero. En un ejemplo, la célula es una célula HEK293T. En otro ejemplo, la célula es una célula linfoblástica B Daudi.

En la presente memoria se describe además un método de producción de la proteína de fusión, que comprende expresar el polinucleótido o vector dado a conocer en la presente memoria bajo condiciones permisivas de glucosilación.

En una realización, las condiciones permisivas de glucosilación comprenden expresar la proteína de fusión en una célula huésped, tal como una célula de mamífero.

En la presente memoria se describe además la utilización de una o más cualesquiera de entre:

i) una glucoproteína CD52 soluble,

iv) un vector que comprende el polinucleótido de la parte iii),

vi) una célula CD52hi aislada capaz de producir glucoproteína CD52 soluble,

viii) medio de cultivo celular, o una fracción del mismo que comprende glucoproteína CD52 soluble, aislada a partir de un cultivo celular que comprende la célula de la parte vi) o la población celular de la parte vii),

ix) un agente capaz de incrementar el nivel de expresión de glucoproteína CD52 soluble por una célula, y x) la composición farmacéutica de la invención,

para suprimir la función de las células T efectoras y/o reducir la respuesta inmunitaria, tal como la respuesta inmunitaria a un autoantígeno.

En la presente memoria se describe además un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o condición mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis, en un sujeto, en el que el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más cualesquiera de entre:

i) una glucoproteína CD52 soluble,

iv) un vector que comprende el polinucleótido de la parte iii),

vi) una célula CD52hi aislada capaz de producir glucoproteína CD52 soluble,

en el sujeto.

En una realización, el medicamento se formula para la administración en un sitio mucosal o transdérmico.

En la presente memoria se describe además un método de diagnóstico de la susceptibilidad de un sujeto a desarrollar una enfermedad o condición mediada por la función de las células T efectoras, inflamación o sepsis, en el que el método comprende:

comparar el nivel de glucoproteína CD52 soluble detectado en la muestra obtenida del sujeto con un nivel de referencia determinado a partir de uno o más sujetos sanos, en el que un nivel inferior de glucoproteína CD52 soluble detectado en la muestra obtenida del sujeto en comparación con el nivel de referencia indica que el sujeto presenta una susceptibilidad incrementada a desarrollar una enfermedad o condición mediada por la función de las células efectoras, inflamación o sepsis.

en el que una frecuencia inferior de células CD52hi detectado en la muestra obtenida del sujeto en comparación con el nivel de referencia indica que el sujeto presenta una susceptibilidad incrementada a desarrollar una enfermedad o condición mediada por la función de las células T efectoras, inflamación o sepsis.

detectar la frecuencia de las células CD52hi en una muestra obtenida de un sujeto, y

comparar la actividad de las células CD52hi detectada en la muestra obtenida del sujeto con un nivel de referencia determinado a partir de uno o más sujetos sanos,

en el que una actividad reducida de células CD52hi detectada en la muestra obtenida del sujeto en comparación con el nivel de referencia indica que el sujeto presenta una susceptibilidad incrementada a desarrollar una enfermedad o condición mediada por la función de las células T efectoras, inflamación o sepsis.

En un ejemplo, se determina la frecuencia de las células CD52hi mediante la detección del nivel de CD52 unido a membrana en la muestra, mediante la detección del nivel de expresión de proteína CD52 en la muestra y/o mediante detección del nivel de expresión de ARNm de CD52 en la muestra.

En una realización, la muestra se obtiene de un sujeto en el que se ha administrado un antígeno.

En la presente memoria se describe además un método de determinación de la idoneidad del sujeto para la entrada en un ensayo de cribado de fármacos, que comprende llevar a cabo el método de la invención e identificar que el sujeto resulta más adecuado para la inclusión en un ensayo de cribado de fármacos en el caso de que el sujeto presente un nivel inferior de glucoproteína CD52 soluble, una frecuencia inferior de células CD52hi o una actividad reducida de células CD52hi en comparación con la muestra de referencia.

En la presente memoria se describe además un método de identificación de un agente capaz de mimetizar la supresión de las células T efectoras y/o la supresión de la respuesta inmunitaria, la función de una glucoproteína CD52 soluble, en el que el método comprende determinar si un agente de ensayo suprime la función de las células T efectoras y/o una respuesta inmunitaria.

En la presente memoria se describe además un método de identificación de un agente terapéutico potencial para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o condición mediada por la función de las células T efectoras, inflamación o sepsis, en el que el método comprende poner en contacto un agente de ensayo con una célula CD52hi o población de células CD52hi, y detectar una o más cualesquiera de entre el nivel de glucoproteína CD52 soluble producida por la célula o población celular, la frecuencia de células CD52hi y/o la actividad de las células CD52hi, e identificar el agente de ensayo como un potencial agente terapéutico para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o condición mediada por la función de las células T efectoras, inflamación o sepsis, en el caso de que el nivel de glucoproteína CD52 soluble, la frecuencia de células CD52hi y/o la actividad de las células CD52hi se encuentre incrementada tras el contacto con el agente de ensayo.

En toda la presente especificación, a menos que se indique específicamente lo contrario o el contexto requiera lo contrario, la referencia a una única etapa, composición de materia, grupo de etapas o grupo de composiciones de materia debe interpretarse que comprende una etapa y una pluralidad (es decir, una o más) de dichas etapas, composiciones de materia, grupos de etapas o grupos de composiciones de materia.

A continuación, en la presente memoria la invención se describe mediante los Ejemplos no limitativos siguientes y en referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripción de los dibujos adjuntos

Figura 1: los clones de células Tsupresoras CD4+ específicas de GAD65 muestran una expresión más elevada de CD52.

(A) Proliferación de un clon de células T específicas de GAD65 en presencia de un clon supresor autólogo. Se utilizó GAD65 como ácido-glutámico descarboxilasa 65 recombinante humana. Se cocultivó un número fijo (25.000) de células de clon no Treg específico de GAD65 (3.19) con un número creciente de un clon de Treg específico de GAD65 autólogo (1.4) en presencia o en ausencia de GAD65 y PBMC irradiadas (100.000) como células presentadoras de antígeno. Se midió la incorporación de 3H-timidina tras 72 h. Los resultados (medias±sem de réplicas por triplicado) son representativos de múltiples pares de clones supresores y no supresores, tal como se ha descrito anteriormente (Dromey et al., 2011). (B) Los clones supresores específicos de GAD65 activados presentan una expresión más levada de CD52. Histogramas de citometría de flujo de la expresión de CD52 por clones supresores (línea continua) y no supresores (línea discontinua) específicos de GAD65 autólogos tras la estimulación durante la noche por anticuerpo anti-CD3 unido a la placa. La tinción por anticuerpo de control de isotipo se muestra en gris. El resultado es representativo de 3 pares de clones de 3 individuos.

Figura 2: la expresión elevada de CD52 es un marcador de células T CD4+ sanguíneas activadas por antígeno con función supresora.

(A) Proliferación de células T CD4+ separadas mediante FACS estimuladas por toxoide tetánico (TT) en presencia de células CD4+ CD52hi o CD52lD activadas por GAD65 y separadas. Se generaron células CD4+ activadas mediante incubación de PBMC marcadas con CFSE, con GAD65 o TT durante 7 días (A1). A continuación, se aislaron mediante FACS células T CD4+ CD52hi y CD4+ CDS2lD activadas por GAD65 y células T CD4+ activadas por TT. En presencia de GAD65, la proliferación de células reactivadas por TT resulta suprimida por las células CD4+ CD52hi activadas por GAD65. Se midió la incorporación de timidina-3H durante las últimas 16 h de un cultivo de 3 días (A2). Los resultados (medias±sem de réplicas por triplicado) son representativos de experimentos independientes de células procedentes de 5 individuos.

(B) La secreción de IFN-y por células T CD4+ activadas por GAD65 y separadas, en ausencia y en presencia de GAD65. Se incubaron con GAD65, PBMC marcadas con CFSE, durante 7 días y se separaron en células T CD4+ CD52hi y CD52lD Las células separadas (5.000) se incubaron en placas ELISpot con Pb MC irradiadas (20.000). Los resultados (medias±sem de réplicas por triplicado) son representativas de experimentos múltiples independientes de células procedentes de 5 individuos.

(C) Secreción de IFN-y por células T CD4+ activadas por TT y separadas, en ausencia o en presencia de TT ± IL-2 (10 U/ml). Tal como en (B), excepto en que las poblaciones de CD4+ CD52hi y CD52lD se separaron de las PBMC marcadas con CFSE activadas con TT. Los resultados son medias±sem de réplicas por triplicado.

(D) Proliferación de PBMC inicialmente agotadas mediante FACS de células CD4+ CD52hi o CD52lD antes del marcaje de CFSE y la incubación en ausencia o en presencia de GAD65 durante 7 días. Los resultados son representativos de dos experimentos.

Figura 3: las células T CD4+ CD52hi no se derivan de células T CD4+CD25+ en reposo. Secreción de IFN-y por células T CD4+ activadas por TT y separadas en ausencia (columnas abiertas) o en presencia (columnas negras) de TT, tras agotar inicialmente las células CD25hi respecto de las PBMC.

Figura 4: las células T CD52hi CD4+ activadas por antígeno se distinguen por marcadores de células Treg CD4+CD25+ convencionales.

Expresión de citometría de flujo de (A) CD25, (B) FoxP3, (C) CTLA-4 de superficie y (D) intracelular, (E) GITR, (F) CD127, (G) CD24 y (H) CD59 en células T CD4+ CD52hi (línea negra) y CD52lD (línea gris), tras la incubación de PBMC con TT durante 7 días. La tinción con anticuerpo de control de isotipo se muestra como sombreado gris. Los resultados son representativos de 5 individuos.

Figura 5: la expresión génica de CD52 es más elevada en células T CD4+ CD52hi que en células T CD4+ CD52o. Expresión de genes en células T CD4+ CD52hi respecto a la expresión en células T CD4+ CD52lD Se llevó a cabo una RT-PCR cuantitativa en muestras de ARN por triplicado extraídas de células T CD4+ CD52hi y CD52lD marcadas con CFSE separadas procedentes de tres individuos, 7 días después de la activación con GAD65. Los resultados se expresan como medianas ± rango intercuartil.

Figura 6: la expresión de CD24 no delinea las células T CD4+ CD52hi con función supresora.

Secreción de IFN-y por células T CD4+ CD52l0 activadas por TT y separadas reestimuladas con TT en presencia de subpoblaciones de CD52 y CD24 estimuladas con TT y separadas. Los resultados son medias±sem de réplicas por triplicado.

Figura 7: el contacto célula-célula no resulta necesario para la supresión por células T CD4+ CD52hi.

Figura 8: la liberación de CD52 soluble explica la supresión por células T CD4+ CD52hi.

(A) Inmunotransferencia de medios acondicionados con células T CD4+ CD52hi o CD52'° activadas por GAD65 seguidamente reactivados con GAD65. Se incubaron con GAD65, PBMC marcadas con CFSE, durante 7 días y se separaron en células T CD4+ CD52hi y CD52te Las células separadas se reactivaron con GAD65 y los medios se recogieron tras 24 h. SE concentraron 10 veces los medios, se fraccionaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF con un anticuerpo policlonal de conejo contra CD52. Se indica el peso molecular aproximado de CD52 soluble nativo.

(B) Inmunotransferencia de medios acondicionados con PBMC activadas con TT /- el inhibidor de la fosfolipasa C U73122. Se incubaron con TT las PBMC marcadas con CFSE y los medios recogidos tras 1 h se procesaron tal como en (A).

(C) Efecto del inhibidor de la fosfolipasa C sobre la supresión por células T CD4+ CD52hi activadas con TT. Las PBMC marcadas con CFSE se incubaron con TT durante 7 días y se separaron en células T CD4+ CD52hi y CD52'° que después se incubaron juntas (5.000 de cada) en placas ELISpot con PBMC irradiadas (20.000) y TT ± inhibidor de fosfolipasa C U73122.11 Los resultados son medias±sem de réplicas por triplicado. No se produjo ningún efecto de U73l22 en ausencia de TT.

(D) Efecto del anticuerpo de la fracción carbohidrato de CD52 sobre la supresión por células T CD4+ CD52hi activadas con TT. Los procedimientos fueron tal como en (C), excepto en que las células en el ensayo ELISpot se incubaron con o sin t T y 10 pg/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD52 (CF1D12) o de control de isotipo (IgG3). Los resultados (medias±sem) son representativos de tres experimentos independientes.

Figura 9: CD52 soluble producido a partir de células Daudi suprime directamente la proliferación de las células T y la función efectora.

(A) Inmunotransferencia de medios acondicionados con líneas celulares. Los medios se concentraron 10 veces, se fraccionaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF con un anticuerpo policlonal conejo de CD52.

(B) Supresión de la proliferación de células T con medio acondicionado de células Daudi. Se cultivaron PBMC (200.000 células) durante 7 días en IMDM que contenía medio acondicionado con células Daudi al 20% con TT y anticuerpo anti-CD52 (CF1D12) o anticuerpo de control de isotipo (10 pg/ml). Para agotar el CD52 soluble, se incubó el medio Daudi durante la noche con anticuerpo policlonal anti-CD52 de conejo (medio 1 pg/ml) seguido de precipitación con proteína G-sefarosa durante 1 h a 4°C. Los resultados (medias±sem) son representativos de tres experimentos independientes.

Figura 10: constructos de ADN para la expresión en vector lentivirus.

SigP=péptido de señal; DEC=dominio extracelular; Strep2=etiqueta de purificación codificante de 8 aminoácidos que se une a Strep-Tactin, una estreptavidina específicamente manipulada.

Figura 11: la proteína de fusión de CD52 soluble suprime directamente la proliferación de las células T y la función efectora.

Supresión de la proliferación de células T con CD52-Fc recombinante. Se cultivaron PBMC (200.000) con TT durante 7 días (A) y células T CD4+ purificadas (20.000) con anticuerpo anti-CD3 (100 ng/ml) y anti-CD28 (200 ng/ml) durante 48 h (B) con 4 veces el número de PBMC irradiadas en pocillos de fondo redondo de 200 pl, en presencia de CD52-Fc recombinante o proteína de control Fc a las concentraciones indicadas. Se midió la incorporación de timidina-3H durante las 16 h finales de la incubación. Los resultados (medias±sem de réplicas por triplicado) son representativos de seis experimentos independientes.

(C) Supresión de la secreción de citoquinas por CD52-Fc recombinante. Los medios de PBMC activadas con TT en (C) ± CD52-Fc 3,3 pM o proteínas Fc se muestrearon tras una incubación de 48 h y se sometieron a ensayo para citoquinas mediante una matriz de perlas multiplex.

(D) Supresión defectuosa por CD52-Fc tras el corte del carbohidrato unido a N. Se incubó CD52-Fc (20 pg) con o sin PNGasa F (1.000 unidades) en 20 pl de PBS durante 1 h a 37°C y la reacción se determinó mediante calentamiento a 75°C durante 10 min. Se incubaron las PBMC con TT y CD52-Fc tratado o no tratado (final: 2,5 pM) durante 7 días a 37°C y a continuación se midió la incorporación de timidina-3H tal como en (C). El panel superior muestra la determinación mediante SDS-PAGE y tinción de Coomassie de la reducción del tamaño de CD52-Fc tras el tratamiento con PNGasa F.

Figura 12: la unión de carbohidrato CD52 a Siglec-10 resulta necesaria para la función efectora de CD52 soluble. (A) Supresión de la activación de las células T con CD52-Fc ± tratamiento con neuraminidasa. Se incubó CD52-Fc (3,3 pM) con neuraminidasa (1 unidad) o tampón portador solo en 20 pl durante 30 min a 37°C. A continuación, se incubaron las PBMC con TT ± CD52-Fc tratada con neuraminidasa o no tratada (final: 0,33 j M) en una placa de 48 pocilios durante 1 h a 37°C antes de transferir las células no adherentes a una placa ELISpot y revelarla tras 24 h a 37°C para manchas de IFN-y.

(B) Expresión de Siglec-10 sobre células T humanas tras la activación de las células T. Histogramas de citometría de flujo de la expresión de Siglec-10 sobre células T CD4+ tras la incubación de PBMC con TT o anticuerpo anti-CD3 soluble durante 4 días.

(C) Supresión de la función de las células T con CD52-Fc al coincubarlo con anticuerpo anti-Siglec-10. Se incubaron PBMC en una placa ELISpot con TT y CD52-Fc (3,4 j M) y diferentes concentraciones de anticuerpo de cabra afinidad por afinidad al dominio extracelular de Siglec-10 o Fc (0,34 j M) ± anticuerpo antes de transferir las células no adherentes a una placa ELISpot durante 24 h para el revelado de las manchas de IFN-y.

(D) Supresión de la función de las células T con CD52-Fc al coincubarlas con Siglec-10-Fc recombinante soluble. Se incubaron las PBMC en una placa de 48 pocillos con TT y CD52-Fc (3,4 j M) y diferentes concentraciones de Siglec-10-Fc recombinante antes de transferir las células no adherentes a una placa ELISpot durante 24 h para el revelado de las manchas de IFN-y.

(E) Bloqueo de Siglec-10, aunque no de otros Siglec, reduce la supresión de las células T con CD52-Fc. Se incubaron células T CD4+ (20.000) en pocillos de placa ELISpot por triplicado a 37°C con TT junto con CD52-Fc o Fc (3,4 j M cada uno) y anticuerpos anti-Siglec humano (10 jg/m l cada uno) o Siglec 2-Fc humano recombinante (20 jg/ml), tal como se indica. Tras 20 h, los pocillos se lavaron y revelaron para manchas de IFN-y.

Figura 13: CD52-Fc no afecta a la capacidad estimuladora de las células T de células dendríticas sanguíneas purificadas.

Se preincubaron DC CD1b/c+ sanguíneas humanas separadas mediante FACS con CD52-Fc o proteína Fc, se lavaron dos veces y se cocultivaron con células T CD4+ marcadas con CFSE alogénicas durante 6 días. La frecuencia de las células T CD4+ en división identificadas como CFSElD se determinó mediante citometría de flujo. El resultado es representativo de dos experimentos independientes con diferentes donantes. Se obtuvieron resultados similares para DC plasmacitoides CD304+ y para monocitos CD14+ (datos no mostrados).

Figura 14: la transferencia de esplenocitos con agotamiento de CD52hi induce la rápida aparición de diabetes en ratones NOD.SCID.

Se inyectaron i.v. esplenocitos totales procedentes de ratones NOD de tipo salvaje con agotamiento o agotamiento simulado de células CD52h en: (A) ratones RIP.B7/NOD.SCID de 8 semanas de edad (2*10® células) y (B) ratones NOD de 8 semanas irradiados (750 rad) (1,2*107 células). Los ratones se monitorizaron mediante la medición de la glucosa urinaria dos veces a la semana utilizando Diastix (Bayer) y se confirmó la diabetes mediante una medición de glucosa sanguínea >14 mM en días consecutivos. Los resultados muestran el porcentaje de supervivencia durante el tiempo tras la transferencia de las poblaciones celulares respectivas.

Figura 15: las células T CD3+ agotadas en CD52hi aceleran la aparición de la diabetes en ratones NOD irradiados. En ratones NOD macho de 8 semanas de edad irradiados (750 rad) se inyectaron 1,2*107 esplenocitos o esplenocitos agotados en CD3+CD52hi derivados de ratones NOD hembra no diabéticos de 10 semanas de edad. Los ratones se monitorizaron mediante la medición de la glucosa urinaria dos veces a la semana utilizando Diastix (Bayer) y se confirmó la diabetes mediante una medición de glucosa sanguínea >14 mM en días consecutivos. Los resultados muestran el (A) porcentaje de supervivencia durante el tiempo tras la transferencia de las poblaciones celulares respectivas y (B) la puntuación de insulitis (n=4/grupo) tras 4 semanas.

Figura 16: la frecuencia de las células T CD4+ CD52hi generadas en respuesta a la simulación por GAD65 es defectuosa en la diabetes de tipo 1.

La proporción de células T c D4+ CD52hi expandidas a partir de PBMC en respuesta a: (A) GAD65 y (B) TT se muestra para individuos en las categorías siguientes: Pre-DT 1 - en riesgo de diabetes de tipo 1; DT1 - con diabetes de tipo 1; saludable - adultos jóvenes HLA-DR3 y/o HLA-DR4; DT2 - diabetes de tipo 2. La barra horizontal es la mediana de cada grupo. Los valores de P globales para el análisis de la varianza mostrados se determinaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis; a continuación, la prueba de comparaciones múltiples de Dunn reveló diferencias significativas tanto pre-DT1 como DT1 comparando saludables o DT2 a P<0,05.

Figura 17: la supresión por células CD4+ CD52hi generada en respuesta a GAD65 es defectuosa en la DT1 preclínica.

Secreción de IFN-y por células T CD4+ activadas con TT o GAD65 y separadas en ausencia (blanco) o presencia (sombreado) del antígeno. Resultados (medias

Figura 18: el tratamiento con CD52-Fc revierte la hiperglucemia en ratones NOD con diabetes de aparición reciente.

Se monitorizaron los niveles de glucosa sanguínea en ratones NOD hembra mediante ensayos semanales para glucosa urinaria y se diagnosticó la diabetes en ratones con una prueba de orina positiva a partir de una concentración de glucosa sanguínea > 14 mM. En cuanto se confirmó la hiperglucemia, los ratones recibieron CD52-Fc o Fc, 20 jg i.p., seis dosis en días alternos, y a continuación se monitorizaron sus concentraciones de glucosa sanguínea dos veces a la semana. Los resultados se muestran para dos pares de ratones que recibieron CD52-Fc (A) o Fc de control (B).

Figura 19: desarrollo de diabetes en ratones NOD-SCID tras la transferencia desde ratones NOD diabéticos de esplenocitos tratados ex vivo con CD52_h-Fc o Fc.

Se inyectaron esplenocitos NOD diabéticos tratados con CD52 Fc humanos recombinantes o tratados con Fc en ratones NOD-SCID. Se aislaron esplenocitos de ratones diabéticos hembra y se incubaron con CD52_h-Fc o proteína Fc en 'tampón de CD52'. Las células se resuspendieron y se inyectaron en ratones NOD-SCID macho (6 en cada grupo; ver el Ejemplo de métodos 18).

Figura 20: CD52-Fc humano suprime la proliferación de células T CD4 (OT-II) transgénicas para TCR específicas para ovoalbúmina (Ova) de ratón.

Se incubaron esplenocitos (1 * 105) procedentes de ratones OT-II hembra de 10 semanas de edad durante 3 días en placas de 96 pocillos de fondo redondo en 200 ml de medio RPMI-1640 que contenía FCS al 5% y las concentraciones indicadas de proteína ova o péptido, o anticuerpo anti-CD3 (clon 2C-11) y CD52-Fc humano recombinante o proteína Fc. Se midió la incorporación de timidina-3H durante las 16 h finales del cultivo. Los resultados son de medias±sem de réplicas por triplicado.

Figura 21: identificación mediante ELISA de CD52 en muestras de semen humanas

La absorbancia a 450 nm se muestra para CD52 soluble en diluciones en serie de muestras de semen (n=26). Figura 22: CD52 derivada de semen suprime la proliferación de células Thumanas.

El efecto sobre la proliferación de las células T (índice de división celular, IDC) calculado a partir de la dilución de pigmento CFSE en respuesta al toxoide tetánico (TT, 5 ufL/ml) se muestra para dos muestras de semen (a una dilución 1:20) sin inmunoempobrecimiento o empobrecido con IgG de control ('Octagam') o IgG anti-CD52 (Campath).

Figura 23: proliferación de células T (dilución de pigmento CFSE) con toxoide tetánico: efecto de semen ± anticuerpo bloqueador de CD52.

El efecto sobre la proliferación de las células T (IDC, calculado a partir de la dilución del pigmento CFSE) en respuesta a toxoide tetánico (TT, 5 ufL/ml) se muestra para las muestras de semen (1:20) ± anticuerpo bloqueador CF1D12 (20 pg/ml).

Figura 24: CD52_h-Fc suprime la secreción de IL-1p por células THP1 en respuesta a LPS. Las células THP-1 se incubaron con diferentes dosis de CD52-Fc o Fc de control en presencia de LPS, se recogió el medio y la concentración de IL-1p se midió mediante ELISA.

Figura 25: CD52_h-Fc suprime la secreción de IL-1p por células THP1 en respuesta a Pam3CSK.

Se incubaron células THP-1 con diferentes dosis de CD52-Fc o de Fc de control en presencia del agonista de TLR-2, Pam3CSK, se recogió el medio y se midió la concentración de IL-1p mediante ELISA.

Figura 26: CD52_h-Fc (50 yg/ml) suprime la secreción de IL-Ip por células THP1 diferenciadas en respuesta a alúmina.

Las células THP-1 se diferenciaron con forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), se lavaron y se incubaron con CD52-Fc o Fc de control. Se recogió el medio y se midió la concentración de IL-1p mediante ELISA.

Figura 27: CD52_m-Fc suprime la secreción de IL-1P por células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón en respuesta a un abanico de estímulos inmunitarios innatos.

Se incubaron células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) de ratones C57/B6 con CD52-Fc de ratón o PBS (control) en presencia de LPS, CPG o Listeria monocytogenes, se sensibilizaron con LPS y después se estimularon con agonistas de inflamasoma conocidos, urato monosódico (UMS), alúmina y nigericina. Se midieron las concentraciones de citoquinas en los medios mediante ensayo de matriz multiplex de citoquinas.

Figura 28: el tratamiento con neuraminidasa de A. ureafaciens anula el efecto supresor de CD52_m-Fc sobre la producción de IL-1p inducida por LPS por células THP-1.

Las células THP-1 se incubaron con CD52_m-Fc tratado con neuraminidasa o tampón de reacción en presencia de LPS. Se recogieron los medios y la concentración de IL-1p se midió mediante ELISA.

Figura 29: el tratamiento con PNGasa-F para eliminar el oligosacárido unido a N anula el efecto supresor de CD52_h-Fc sobre la secreción de IL-1p inducida por LPS por células THP-1.

Se utilizó CD52 humana-Fc (300 pg) tratada con o sin PNGasa F para eliminar el oligosacárido unido a N para tratar las células THP-1 en presencia de LPS. Se recogieron los medios y se midió la concentración de IL-1p mediante ELISA.

Figura 30: CD52-Fc suprime in vivo las respuestas de citoquinas a LPS.

En ratones C57/B16 hembra de 10 semanas de edad se inyectaron i.p. 300 pg de LPS i.v. con 200 pg de CD52 de ratón-Fc. Tras 2 h, se muestreó la sangre del plexo venoso retroorbital (columnas negras) y del corazón (columnas blancas) (tras la asfixia inducida por CO²) para la medición de las citoquinas plasmáticas. Las columnas negras o blancas a la izquierda indican niveles de citoquinas en ratones en los que no se había administrado CD52-Fc; las columnas negras o blancas a la derecha indican niveles de citoquinas en ratones en los que se administró CD52-Fc.

Figura 31: el desarrollo de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) se acelera en ratone que no presentan CD52 sobre las células T.

Los ratones con células T deficientes en CD52 (fl/fl T/+) se inmunizaron con 200 |jg de glucoproteína de mielina de los oligodendrocitos (MGO) emulsionada en adyuvante de Freund completo (2,5 mg/ml de M. tuberculosis) mediante dos inyecciones subcutáneas de 100 j l en los flancos posteriores, reforzado con 300 ng de toxina pertussis mediante una inyección i.v. en el día de inmunización MOG seguido de una segunda inyección i.v. 2 días después. Se utilizaron como controles ratones CD52 (fl/fl) y ratones de tipo salvaje (WT) sometidos al mismo protocolo de inmunización. Se evaluaron las características clínicas de la EAE diariamente y se determinó una puntuación clínica. Se muestran las puntuaciones clínicas para cada uno de los 13 días sucesivos después de la inmunización.

Leyenda del listado de secuencias

SEC ID n° 1: transcrito de ARNm de CD52 humano (secuencia de referencia de NCBI. NM_001803.2)

SEC ID n° 2: secuencia de aminoácidos de CD52 humano.

SEC ID n° 3: péptido soluble de 12 aminoácidos de CD52 humano.

SEC ID n° 4: péptido CD52 soluble de mono ortólogo.

SEC ID n° 5: péptido CD52 soluble de ratón ortólogo.

SEC ID n° 6: péptido CD52 soluble de rata ortólogo.

SEC ID n° 7: péptido CD52 soluble de perro ortólogo.

SEC ID n° 8: cebador F de CD52.

SEC ID n° 9: cebador R de CD52.

SEC ID n° 10 cebador F de FOXP3.

SEC ID n° 11 cebador R de FOXP3.

SEC ID n° 12 cebador F de CTLA-4.

SEC ID n° 13 cebador R de CTLA-4.

SEC ID n° 14 cebador F de GITR.

SEC ID n° 15 cebador R de GITR.

SEC ID n° 16 cebador F de CD127.

SEC ID n° 17 cebador R de CD127.

SEC ID n° 18 cebador directo de IL-2a.

SEC ID n° 19 cebador inverso de IL-2a.

SEC ID n° 20 cebador directo de IL-27p.

SEC ID n° 21 cebador inverso de IL-27p.

SEC ID n° 22 cebador directo de IL-12a.

SEC ID n° 23 cebador inverso de IL-12a.

SEC ID n° 24 cebador de 1F1.

SEC ID n° 25 cebador de 1R1.

SEC ID n° 26 cebador de 1F2.

SEC ID n° 27 cebador de 1R2.

SEC ID n° 28 cebador de 2F.

SEC ID n° 29 cebador de 2R1.

SEC ID n° 30 cebador de 2R2.

SEC ID n° 31 cebador directo de CD52.

SEC ID n° 32 cebador inverso de CD52.

SEC ID n° 33 cebador directo de IL-2.

SEC ID n° 34 cebador inverso de IL-2.

SEC ID n° 35 cebador directo de IL-4.

SEC ID n° 36 cebador inverso de IL-4.

SEC ID n° 37 cebador directo de IL-10.

SEC ID n° 38 cebador inverso de IL-10.

SEC ID n° 39 cebador directo de IL-13.

SEC ID n° 40 cebador inverso de IL-13.

SEC ID n° 41 cebador directo de FoxP3.

SEC ID n° 42 cebador inverso de FoxP3.

SEC ID n° 43 cebador directo de CD127.

SEC ID n° 44 cebador inverso de CD127.

SEC ID n° 45 cebador directo de CTLA-4.

SEC ID n° 46 cebador inverso de CTLA-4.

SEC ID n° 47 cebador directo de FASLG.

SEC ID n° 48 cebador inverso de FASLG.

SEC ID n° 49 cebador directo de TGFb1.

SEC ID n° 50: cebador inverso de TGFbl.

SEC ID n° 51 cebador directo de TGFb2.

SEC ID n° 52: cebador inverso de TGFb2.

SEC ID n° 53: cebador directo de IFNg.

SEC ID n° 54: cebador inverso de IFNg.

SEC ID n° 55: cebador alfa directo de IL-12 alfa.

SEC ID n° 56: cebador inverso de IL-12 alfa.

SEC ID n° 57 cebador directo de Ebi3.

SEC ID n° 58: cebador inverso de Ebi3.

SEC ID n° 59: cebador directo de RARA.

SEC ID n° 60: cebador inverso de RARA.

SEC ID n° 61 cebador directo de GITR.

SEC ID n° 62: cebador inverso de GITR.

SEC ID n° 63: cebador directo de GRANZMB.

SEC ID n° 64: cebador inverso de GRANZMB.

SEC ID n° 65: cebador directo de ALDH1A2.

SEC ID n° 66: cebador inverso de ALDH1A2.

SEC ID n° 67: cebador directo de ACTIN.

SEC ID n° 68: cebador inverso de ACTIN.

SEC ID n° 69: secuencia de proteína Siglec-10 humana (n° de acceso de GenBank: AF310233.1).

Descripción detallada de la invención

Técnicas generales y definiciones

El alcance de la presente invención es el definido en las reivindicaciones.

A menos que se defina específicamente lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria debe considerarse que presentan el mismo significado que el entendido por el experto ordinario en la materia (p.ej., en el cultivo celular, genética molecular, inmunología, inmunohistoquímica, química de proteína y bioquímica). A menos que se indique lo contrario, la proteína recombinante, cultivo celular y técnicas inmunológicas utilizadas en la presente exposición son procedimientos estándares, bien conocidos por el experto en la materia. Dichas técnicas se describen y explican en toda la literatura, en fuentes tales como J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes 1 a 4, IRL Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel et al., (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley- Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta la actualidad), Ed Harlow y David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), y J.E. Coligan et al. (editores), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta la actualidad).

El término “y/o”, p.ej., “X y/o Y” debe entenderse que se refiere a “X e Y” o “X o Y” y debe considerarse que proporciona apoyo explícito de ambos significados o de cualquiera de los significados.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “aproximadamente”, a menos que se indique lo contrario, se refiere a /- 20%, más preferentemente /- 10%, más preferentemente /- 5%, del valor designado. Para evitar dudas, el término “aproximadamente” seguido de un valor designado debe interpretarse como que también comprende el valor designado exacto mismo (por ejemplo, “aproximadamente 10%” también comprende exactamente 10).

En toda la presente especificación, el término “comprende” o variaciones tales como “comprendiendo”, se entenderá que implica la inclusión de un elemento, número entero o etapa indicado, o grupo de elementos, números enteros o etapas, aunque sin excluir cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “respuesta inmunitaria” presenta su significado ordinario en la materia, e incluye tanto la inmunidad humoral como la inmunidad celular. Una respuesta inmunitaria puede estar mediada por uno o más de entre activación de las células T, activación de las células B, activación de las células asesinas naturales, activación de las células presentadoras de antígenos (p.ej., células B, DC, monocitos y/o macrófagos), producción de citoquinas, producción de quimioquinas, expresión de marcador de superficie celular específico, en particular la expresión de moléculas coestimuladoras. En una realización preferente, la respuesta inmunitaria que se encuentra suprimida es por lo menos la función de las células T efectoras mediante la reducción de la supervivencia, actividad y/o proliferación de dicho tipo celular. En otra realización preferente, la respuesta inmunitaria que se suprime es por lo menos uno o más de entre las funciones de monocitos, macrófagos o células dendríticas mediante la reducción de la supervivencia, actividad y/o proliferación de uno o más de dichos tipos celulares. En una realización preferente adicional, la respuesta inmunitaria se encuentra suprimida en la medida en que induce tolerancia un antígeno, tal como un autoantígeno.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “tolerancia” se refiere a un estado de falta de respuesta a un antígeno específico o grupo de antígenos al que un sujeto normalmente sí responde. La tolerancia inmunitaria se consigue bajo condiciones que suprimen la reacción inmunitaria y no es sólo la ausencia de una respuesta inmunitaria. Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos “tratando”, "tratar” o “tratamiento” incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente suficiente para reducir o eliminar por lo menos un síntoma de enfermedad.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos “previniendo”, “prevenir” o “prevención” incluye la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente suficiente para prevenir la manifestación de por lo menos un síntoma de enfermedad.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos “suprimir” o “suprimiendo” incluyen reducir en cualquier cantidad cuantificable.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “sujeto” se refiere a un animal, p.ej., un mamífero. En una realización preferente, el sujeto es un mamífero, por ejemplo un ser humano. Entre otras realizaciones preferentes se incluyen animales de ganadería, tales como caballos, vacas, ovejas y cabras, así como animales de compañía, tales como gatos y perros.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “huésped” se refiere a cualquier organismo a partir del cual puede aislarse CD52 soluble o en el que puede producirse CD52 soluble, por cualesquiera medios. El huésped puede ser un organismo completo o puede ser una célula derivada del mismo. El huésped puede ser un animal, p.ej., un mamífero. En una realización preferente, el huésped es un mamífero, por ejemplo un ser humano. Entre otros huéspedes preferentes se incluyen ratones, ratas, monos, hamsters, cobayas, conejos y cualquier animal o célula que puede servir como un huésped adecuado a partir del cual puede aislarse CD52 soluble o en el que puede producirse CD52 soluble.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos “enlazado”, “unido”, “conjugado”, “acoplado” o variaciones de los mismos se utilizan ampliamente para referirse a cualquier forma de asociación covalente o no covalente que une una entidad a otra durante cualquier periodo de tiempo.

CD52 soluble

La presente exposición describe, por primera vez, la supresión de las células inmunitarias, tales como células T efectoras, monocitos y células dendríticas por un fragmento de glucoproteína de CD52 soluble. CD52 es una glucoproteína anclada a glucosilfosfatidilinositol (GPI) de superficie presente sobre la mayoría de células linfoides, inicialmente reconocidas como la diana de anticuerpos monoclonales CAMPATH de unión al complemento utilizados terapéuticamente para agotar los linfocitos (Treumann et al., 1995; Xia et al., 1991; Hale, 2001). El transcrito de ARNm del gen de CD52 humano se muestra en la SEC ID n° 1 y la secuencia de aminoácidos traducida se muestra en la SEC ID n° 2. CD52 maduro anclado por su ancla de GPI comprende únicamente 12 aminoácidos y un carbohidrato terminal unido mediante asparagina (N).

A menos que se indique lo contrario, las expresiones “glucoproteína de CD52 soluble”, “CD52 soluble”, “glucoproteína soluble” y variaciones de las mismas se utilizan intercambiablemente en la presente memoria.

CD52 anclado a membrana puede cortarse (por ejemplo, enzimáticamente) para liberar un fragmento de péptido soluble que comprende la secuencia de aminoácidos GQNDTSQTSSPS (SEC ID n° 3). La glucoproteína de CD52 soluble dada a conocer en la presente memoria puede comprender una secuencia de aminoácidos por lo menos 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 3 o por lo menos 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos de otras secuencias de fragmento soluble de CD52 ortólogo conocido. De esta manera, las secuencias ortólogas del fragmento de péptido CD52 soluble se encuentran comprendidas en la presente exposición. Entre dichas secuencias se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la secuencia de mono SQNATSQSSPS (SEC ID n° 4), la secuencia de ratón GQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKS (SEC ID n° 5), la secuencia de rata GQNSTAVTTPANKAATTAAATTKAAATTATKTTTAVRKTPGKPPKA (SEC ID n° 6), la secuencia de perro GNSTTPRMTTKKVKSATPA (SEC ID n° 7), y otras secuencias ortólogas fácilmente identificables de secuencias conocidas de polipéptido y polinucleótido de CD52.

El porcentaje de identidad respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos o polinucleótidas dadas a conocer en la presente memoria puede determinarse mediante métodos conocidos de la técnica. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos y polinucleótidas pueden compararse manualmente o mediante la utilización de herramientas de comparación e identificación de secuencias de base informática que utilizan algoritmos, tales como BLAST (herramienta de búsqueda de alineaciones locales básicas; Altschul et al., 1993); ver también www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), el método Clustal de alineación (Higgins y Sharp, 1989) y otros, en el que los parámetros apropiados para cada comparación de secuencia específica pueden seleccionarse tal como entenderá el experto en la materia. La secuencia de aminoácidos de la parte peptídica de la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria puede presentar una identidad de por lo menos 65%, de por lo menos 70%, de por lo menos 75%, de por lo menos 80%, de por lo menos 85%, de por lo menos 90%, de por lo menos 95% o de por lo menos 99% respecto a una o más cualesquiera de las secuencias de aminoácidos identificadas en las SEC ID n° 3, n° 4, n° 5, n° 6 o n° 7. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la parte peptídica de la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria puede ser 100% idéntica a una cualquiera de las secuencias de aminoácidos identificadas en las SEC ID n° 3, n° 4, n° 5, n° 6 o n° 7.

Puede utilizarse glucoproteína CD52 soluble aislada para producir composiciones farmacéuticas de la invención. El término “aislado” se utiliza en la presente memoria para definir el aislamiento de la glucoproteína CD52 soluble de manera que se encuentre presente en una forma adecuada para la aplicación en una composición farmacéutica. De esta manera, la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria se aísla a partir e otros componentes de una célula, líquido o sistema de expresión huésped en la medida que resulten necesarios para la formulación posterior de la glucoproteína en forma de una composición farmacéutica. Por lo tanto, la glucoproteína aislada se proporciona en una forma que se encuentra sustancialmente libre de otros componentes de la célula huésped (por ejemplo, proteínas) que pueden perjudicar el efecto farmacéutico de la glucoproteína. De esta manera, la glucoproteína aislada puede encontrarse libre, o sustancialmente libre, de material con el que se encuentra asociado naturalmente, tal como otras glucoproteínas, polipéptidos o ácidos nucleicos con los que se encuentra en su medio natural, o el medio en el que se prepara (p.ej., el cultivo celular) en el caso de que dicha preparación se lleve a cabo mediante tecnología de ADN recombinante realizada in vitro o in vivo. La glucoproteína soluble puede aislarse a partir de una célula huésped o líquido o sistema de expresión mediante métodos conocidos de la técnica.

El término "soluble" se utiliza en la presente memoria para definir un péptido o glucoproteína que no se une a la membrana celular. El péptido o glucoproteína soluble puede ser capaz de moverse libremente en cualquier solvente o líquido, tal como un líquido corporal. Por ejemplo, el péptido o glucoproteína soluble puede ser capaz de circular en la sangre.

El carbohidrato puede ser cualquier fracción carbohidrato unida al fragmento de péptido CD52 soluble. Por ejemplo, el carbohidrato puede ser cualquier fracción carbohidrato que se observe que se encuentra unida a la parte extracelular de la proteína CD52 en un huésped. De esta manera, el carbohidrato puede ser cualquier carbohidrato capaz de unirse a la parte extracelular de la proteína CD52 mediante una reacción de glucosilación que es conocido que tenga lugar en un huésped.

Las fracciones carbohidrato presentes en una glucoproteína CD52 natural pueden identificarse mediante métodos conocidos, tales como los descritos en Schroter et al. (1999). Dichas fracciones carbohidrato pueden identificarse de entre las glucoproteínas CD52 presentes en cualquier célula huésped que exprese CD52, y particularmente linfocitos, tales como células T CD4+ o CD8+, monocitos o células del tracto genital, tales como células espermáticas o células del conducto epididimario. De esta manera, la estructura precisa de la fracción carbohidrato puede determinarse mediante la aplicación de métodos tales como la espectrometría de masas (p.ej., con desorción/ionización mediante láser asistida por matriz acoplada a analizador de tiempo de vuelo (MALDI-TOF), cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento (HPAEC-PAD), análisis de metilación, digestión con endo-p-galactosidasa y otros métodos). Los N-glicanos pueden separarse de una glucoproteína CD52 natural utilizando enzimas de corte conocidos, tales como la péptido-N4-(N-acetil-p-D-glucosaminil)asparagina amidasa F ('PNGasa F' de Flavobacterium meningosepticum, recombinante de Escherichia coli; obtenible de proveedores comerciales tales como Roche). Los N-glicanos pueden aislarse para la caracterización adicional mediante la utilización de métodos cromatográficos conocidos, tales como cromatografía de fase inversa C8. En un ejemplo, el carbohidrato puede comprender uno o más azúcares biantenarios, triantenarios o tetraantenarios, que pueden encontrarse terminalmente sialilados. Por ejemplo, el carbohidrato puede comprender uno o más azúcares tetra-antenarios. Los azúcares pueden encontrarse ramificados o no ramificados. Los azúcares pueden comprender una fucosa proximal. De esta manera, el carbohidrato puede encontrarse fucosilado. Los azúcares pueden comprender una o más repeticiones de acetil-lactosamina. De esta manera, los azúcares pueden comprender unidades de polilactosamina. Además, los azúcares pueden comprender un núcleo de manosa.

El carbohidrato puede presentar una o más cualesquiera de las estructuras indicadas en Treumann et al. (1995). De esta manera, por ejemplo, el carbohidrato puede presentar cualquiera de las estructuras siguientes:

A

C

De esta manera, el carbohidrato puede comprender uno o más ácidos siálicos. El ácido o ácidos siálicos pueden estar localizados en cualquier parte del carbohidrato. Por ejemplo, el ácido o ácidos siálicos pueden ser ácidos siálicos terminales. En un ejemplo particular, el carbohidrato puede comprender ácidos a2-6 siálicos terminales. De esta manera, el carbohidrato puede comprender uno o más grupos a2-6-sialil-lactosa de superficie. El ácido o ácidos siálicos pueden encontrarse unidos a la galactosa en enlace |31-4 con N-acetilglucosamina.

La presente exposición demuestra que la glucoproteína CD52 soluble ejerce su efecto supresor por lo menos en parte mediante la unión al ácido siálico de unión a lectina-10 de tipo Ig (Siglec-10), un receptor transmembranal de superficie celular y miembro de superfamilia de inmunoglobulinas que porta dos motivos inhibidores basados en tirosina de inmunorreceptor citoplasmático (ITIM) (Munday et al., 2001; Crocker et al., 2007). De esta manera, la glucoproteína soluble dada a conocer en la presente memoria puede ser capaz de unirse a Siglec-10. Por ejemplo, la glucoproteína soluble dada a conocer en la presente memoria puede comprender una fracción carbohidrato capaz de unión a Siglec-10. En un ejemplo, la fracción carbohidrato comprende uno o más grupos a2-6- o a2-3-sialil-lactosa de superficie que son capaces de unirse a Siglec-10. Alternativamente, la fracción carbohidrato puede comprender cualesquiera otros grupos de superficie capaces de unión a Siglec-10.

La glucoproteína soluble dada a conocer en la presente memoria puede ser capaz de unirse a Siglec-10 derivada de cualquier especie. Por ejemplo, la glucoproteína soluble dada a conocer en la presente memoria puede ser capaz de unirse a Siglec-10 derivada de cualquier especie de mamífero. Preferentemente, la glucoproteína soluble dada a conocer en la presente memoria es capaz de unirse a Siglec-10 humana. La secuencia polipeptídica de Siglec-10 humana se define en Munday et al. (2001), en GenBank n° de acceso AF310233.1, y en la SEC ID n° 69.

La glucoproteína soluble dada a conocer en la presente memoria puede ser capaz de llevar a cabo la señalización mediante el receptor de Siglec-10. De esta manera, la glucoproteína soluble dada a conocer en la presente memoria puede ser capaz de unirse a Siglec-10 en cualquier medida suficiente para producir la señalización mediante el receptor de Siglec-10. De esta manera, el nivel preciso de unión a Siglec-10 puede variar. Los métodos para determinar si una glucoproteína dada es capaz de unirse a Siglec-10 y para determinar si una glucoproteína dada es capaz de producir la señalización mediante el receptor de Siglec-10 son conocidos de la técnica.

Los ejemplos adicionales del carbohidrato de CD52 unido a N que puede comprender la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria son los derivados o derivables de las glucoproteínas CD52 de linfocito huésped o de glucoproteínas CD52 de células del tracto genital.

Debido a la compleja naturaleza de muchas fracciones carbohidrato naturales que es conocido que están unidas a la parte de proteína extracelular de CD52 humana y las múltiples variaciones en dichas estructuras que pueden aparecer de variar los patrones de glucosilación, se entenderá que la naturaleza precisa de la fracción carbohidrato presente en la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria puede variar. Tal como se ha indicado anteriormente, se encuentran disponibles métodos para identificar con precisión las fracciones carbohidrato de glucoproteínas CD52 naturales. Además, pueden añadirse varias fracciones carbohidrato diferentes al fragmento de péptido soluble de CD52 mediante la expresión de CD52 bajo condiciones de glucosilación variables. Por ejemplo, la glucoproteína soluble dada a conocer en la presente memoria puede expresarse y/o aislarse a partir de células linfocitarias o monocitos del huésped, o células del tracto genital del huésped (p.ej., células espermáticas o células del conducto epididimario) o líquido seminal y, por lo tanto, puede comprender en consecuencia diferentes grupos carbohidrato. Los inventores han mostrado que CD52 soluble presente en el semen humano, de manera similar al CD52 soluble liberado por linfocitos, tales como células B Daudi, es capaz de suprimir la función de las células T y/o la respuesta inmunitaria. Pueden seleccionarse células huésped alternativas que proporcionan diferentes condiciones de glucosilación para la expresión de CD52 soluble a fin de proporcionar formas alternativas de carbohidrato en la glucoproteína soluble.

El carbohidrato puede unirse a uno o más aminoácidos cualesquiera en el péptido que es capaz de presentar una fracción carbohidrato unida al mismo. Por ejemplo, el carbohidrato puede unirse a uno o más residuos de entre asparagina, serina, treonina, tirosina, hidroxilisina, hidroxiprolina, fosfoserina o triptófano en caso de que se encuentren presentes en la secuencia de aminoácidos. En un ejemplo, el carbohidrato se une al residuo de asparagina (N) en una parte peptídica que presenta una secuencia que es por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95% idéntica o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEC ID n° 3.

La presente exposición proporciona además variantes, mutantes, fragmentos biológicamente activos, modificaciones, análogos y/o derivados de la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria. Dichos compuestos pueden identificarse mediante cribado para compuestos que imitan la estructura y/o la función del polipéptido dado a conocer en la presente memoria, mediante la utilización de métodos que incluyen cualesquiera de los métodos dados a conocer en la presente memoria.

Función de CD52 soluble

La glucoproteína dada a conocer en la presente memoria es preferentemente capaz de suprimir la actividad ("función") de las células inmunitarias, incluyendo los linfocitos (tales como las células T) y los monocitos. Por ejemplo, la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria es capaz de suprimir uno o más de entre las funciones de células T efectoras, monocitos, macrófagos y células dendríticas. Las células T efectoras, monocitos, macrófagos y células dendríticas y sus funciones son bien conocidas por el experto en la materia.

Las células T pueden ser fácilmente identificadas a partir de la presencia de uno o más cualesquiera de los marcadores de células T conocidos de la técnica. La glucoproteína dada a conocer en la presente memoria es capaz de reducir la proliferación de las células T en respuesta al reto antigénico y/o es capaz de reducir la producción de citoquinas de las células T (tal como la producción de uno o más cualesquiera de entre IFN-y, IL-2, lL-10, IL-17, G-CSF, TNF-a y otras citoquinas que es conocido que son secretadas por células T activadas). Por ejemplo, CD52 soluble es capaz de reducir la producción de IFN-y por las células T.

En otro ejemplo, CD52 soluble es capaz de reducir la secreción de IL-1/S por monocitos, macrófagos y células dendríticas.

De acuerdo con lo anterior, la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria es capaz de reducir la respuesta inmunitaria en el huésped. Los inventores han mostrado que la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria es capaz de reducir la función de las células T efectoras en respuesta al reto con cualquier antígeno. La función supresora no es dependiente del antígeno particular utilizado en el reto. De esta manera, la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria es capaz de reducir la respuesta inmunitaria a cualquier antígeno. En un ejemplo, el antígeno es un autoantígeno.

Pueden utilizarse cualesquiera métodos conocidos de determinación de la supresión de la función de las células T y/o una respuesta inmunitaria, tal como (aunque sin limitación) los indicados en los ejemplos en la presente memoria. De esta manera, los métodos pueden comprender la determinación del efecto de la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria sobre la proliferación de uno o más de entre células T efectoras, monocitos, macrófagos y células dendríticas y/o sobre la producción de uno o más cualesquiera de entre IFN-y, IL-2, IL-10, IL-17, G-CSF, TNF-a y otras citoquinas que es conocido que resultan secretadas por células T activadas, monocitos, macrófagos o células dendríticas.

Proteínas de fusión

La parte peptídica de la glucoproteína CD52 dada a conocer en la presente memoria puede, por ejemplo, conjugarse con una segunda proteína en forma de una proteína de fusión. La segunda proteína puede ser cualquier proteína capaz de incrementar la estabilidad y/o la solubilidad de la glucoproteína, de potenciar el procedimiento de preparación de la glucoproteína mediante métodos recombinantes, o de potenciar el efecto terapéutico de la glucoproteína. De esta manera, la segunda proteína puede ser capaz de incrementar la semivida de la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria.

La segunda proteína puede ser de cualquier longitud adecuada. En una realización, la segunda proteína puede ser relativamente corta. Por ejemplo, la segunda proteína puede consistir en cualquiera de entre 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos. La segunda proteína puede comprender por lo menos 1, por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7, por lo menos 8, por lo menos 9 o por lo menos 10 aminoácidos. La segunda proteína puede comprender además más de 10 aminoácidos. Por ejemplo, la segunda proteína puede comprender por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 25, por lo menos 30 o por lo menos 50 aminoácidos.

En un ejemplo, la segunda proteína es un fragmento de anticuerpo. Entre los fragmentos de anticuerpo adecuados se incluyen cualquier fragmento de anticuerpo que sea capaz de activar el sistema inmunitario. El fragmento de anticuerpo puede ser una región de fragmento cristalizable (Fc) (que puede ser un único polipéptido) o una o más cualesquiera de entre los dominios constantes de cadena pesada (p.ej., los dominios Ch 2, 3 y/o 4) de una región Fc. En un ejemplo, la segunda proteína es un fragmento Fc.

En otro ejemplo, la segunda proteína puede ser una etiqueta de purificación. Se conocen muchos ejemplos de etiquetas de purificación, y entre ellos se incluyen (aunque sin limitación), una etiqueta His, una etiqueta T7, una etiqueta FLAG, una etiqueta S, una etiqueta HA, una etiqueta c-Myc, DHFR, un dominio de unión a quitina, un dominio de unión a calmodulina, un dominio de unión a celulosa, una etiqueta Strep 2 (una etiqueta de purificación codificante de ocho aminoácidos que se une a Strep-Tactina, una estreptavidina específicamente construida (Schmidt y Skerra, 2007), y otras.

La segunda proteína puede incrementar la solubilidad de la proteína expresada. Entre dichas proteínas se incluyen (aunque sin limitación), NusA, tiorredoxina, modificador pequeño de tipo ubiquitina (SUMO), ubiquitina y otras conocidas de la técnica.

La segunda proteína puede incrementar la solubilidad de la proteína expresada, así como potenciar métodos de purificación. Entre dichas proteínas se incluyen (aunque sin limitación), g St , MBP, gen 10 de T7, y otras conocidas de la técnica.

La etiqueta de purificación puede eliminarse opcionalmente de la proteína de fusión después de su producción. Los métodos adecuados de eliminar una etiqueta de purificación de una proteína de fusión variarán dependiendo de la etiqueta de purificación particular utilizada. Dichos métodos son generalmente conocidos de la técnica.

La proteína de fusión dada a conocer en la presente memoria puede comprender una o más de entre cualquiera de las segundas proteínas indicadas anteriormente, en cualquier combinación. De esta manera, la proteína de fusión puede comprender un fragmento de anticuerpo (tal como un Fc) y una etiqueta de purificación (tal como una etiqueta Strep 2).

Polinucleótidos

La presente exposición proporciona además polinucleótidos aislados o recombinantes codificantes del componente proteína de la glucoproteína CD52 soluble o la proteína de fusión. Las secuencias de dichos polinucleótidos son derivables de las secuencias de aminoácidos de la proteína CD52 y el fragmento peptídico CD52 soluble indicado en la presente memoria y de la segunda proteína comprendida dentro de la proteína de fusión. Los polinucleótidos dados a conocer en la presente memoria también pueden codificar una proteína CD52 de longitud completa, que puede ser, por ejemplo, una forma madura de la misma, o un precursor de la misma.

La expresión "polinucleótido aislado" pretende significar un polinucleótido que ha sido generalmente separado de las secuencias polinucleótidos con las que se encuentra asociado o unido en su estado nativo. Preferentemente, el polinucleótido aislado se encuentra por lo menos 60% libre, más preferentemente por lo menos 75% libre, y más preferentemente por lo menos 90% libre de otros componentes con los que se encuentra naturalmente asociado. Además, el término "polinucleótido" se utiliza intercambiablemente en la presente memoria con las expresiones "molécula de ácidos nucleicos", "gen" y "ARNm".

El término "recombinante" en el contexto de un polinucleótido se refiere al polinucleótido en el caso de que se encuentre presente en una célula, o en un sistema de expresión sin células, en una cantidad alterada en comparación con su estado nativo. En una realización, la célula es una célula que no comprende naturalmente el polinucleótido. Sin embargo, la célula puede ser una célula que comprenda un polinucleótido no endógeno que resulta en una cantidad alterada, preferentemente incrementada, de producción del polipéptido codificado. Un polinucleótido recombinante de la invención incluye polinucleótidos que no han sido separados de otros componentes de la célula transgénica (recombinante) o sistema de expresión sin células, en el que se encuentra presente, y polinucleótidos producidos en dichas células o sistemas sin células que se purifican posteriormente separándolos de por lo menos algunos otros componentes.

El término "polinucleótido" se refiere a un oligonucleótido, un polinucleótido o cualquier fragmento de los mismos. Puede ser ADN o ARN de origen genómico o sintético, de doble cadena o de cadena sencilla, y encontrarse combinado con carbohidratos, lípidos, proteínas u otros materiales para llevar a cabo una actividad particular definida en la presente memoria.

Los polinucleótidos dados a conocer en la presente memoria pueden poseer, en comparación con moléculas naturales (tales como polinucleótidos genómicos codificantes de CD52 o un fragmento soluble de los mismos), una o más mutaciones que son deleciones, inserciones o sustituciones de residuos nucleótidos. Los mutantes pueden ser naturales (es decir, aislados a partir de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo, producidos mediante la realización de mutagénesis dirigida a sitio o técnicas de reorganización del ADN, tal como se describen en términos generales en Harayama, 1998). De esta manera, resulta evidente que los polinucleótidos de la invención pueden ser naturales o recombinantes.

La secuencia particular del polinucleótido puede determinarse a partir de la secuencia peptídica. Debido a la redundancia del código genético, pueden utilizarse diferentes secuencias para codificar el mismo péptido. Además, la secuencia polinucleótida puede alterarse específicamente de manera que se potencie su expresión en una célula huésped particular. Dicho procedimiento es bien conocido de la técnica como "optimización de codones". De esta manera, el polinucleótido dado a conocer en la presente memoria puede optimizarse para sus codones a fin de potenciar la expresión en una célula huésped.

Vectores

El polinucleótido dado a conocer en la presente memoria puede insertarse en un vector nucleótido a fin de facilitar la expresión del componente proteína de la glucoproteína o de la proteína de fusión. De acuerdo con lo anterior, la presente exposición proporciona un vector que comprende un polinucleótido codificante del componente proteína de la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria o la proteína de fusión dada a conocer en la presente memoria. El vector puede ser ARN o ADN, procariótico o eucariótico, y puede ser un transposón (tal como se describe en la patente n° US 5.792.294), un virus o un plásmido.

Preferentemente, el polinucleótido codificante del componente proteína de la glucoproteína o la proteína de fusión se encuentra operablemente ligado a un promotor que es capaz de expresar el péptido bajo condiciones adecuadas. La expresión "operablemente ligado" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de ácidos nucleicos (p.ej., ADN). Típicamente, se refiere a la relación funcional de un elemento regulador transcripcional y una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor se liga operablemente a una secuencia codificante, tal como un polinucleótido definido en la presente memoria, en el caso de que estimule o module la transcripción de la secuencia codificante en una célula o sistema de expresión sin células apropiado. Generalmente, los elementos reguladores de la transcripción promotores que están operablemente ligados a una secuencia transcrita son físicamente contiguos a la secuencia transcrita, es decir, actúan en cis. Sin embargo, algunos elementos reguladores de la transcripción, tales como intensificadores, no necesitan ser físicamente contiguos o encontrarse situados en estrecha proximidad a las secuencias codificantes cuya transcripción potencian.

El vector es preferentemente un vector de expresión. Tal como se utiliza en la presente memoria, un vector de expresión es un vector de ADN o ARN que es capaz de transformar una célula huésped y de producir la expresión de una molécula polinucleótida especificada. Preferentemente, el vector de expresión también es capaz de replicarse dentro de la célula huésped. Los vectores de expresión pueden ser procarióticos o eucarióticos, y típicamente son virus o plásmidos. Entre los vectores de expresión dados a conocer en la presente memoria se incluyen cualesquiera vectores que funcionan (es decir, dirigen la expresión génica) en las células recombinantes dadas a conocer en la presente memoria (incluyendo en células animales) o en un sistema de expresión sin células adecuado.

En particular, los vectores de expresión dados a conocer en la presente memoria pueden contener secuencias reguladoras, tales como secuencias de control de la transcripción, secuencias de control de la traducción, orígenes de replicación y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula recombinante o sistema de expresión sin células y que controlan la expresión de las moléculas polinucleótidas dadas a conocer en la presente memoria. En particular, los vectores dados a conocer en la presente memoria pueden incluir secuencias de control de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción son secuencias que controlan el inicio, elongación y terminación de la transcripción. Son secuencias de control de la transcripción particularmente importantes aquellas que controlan el inicio de la transcripción, tales como secuencias de promotor, intensificador, operador y represor. Entre las secuencias de control de la transcripción adecuadas se incluyen cualquier secuencia de control de la transcripción que pueda funcionar en por lo menos una de las células recombinantes o sistemas de expresión sin células indicadas en la presente memoria. El experto en la materia conoce una diversidad de dichas secuencias de control de la transcripción.

Los vectores dados a conocer en la presente memoria pueden contener, además: (a) señales secretorias (es decir, secuencias de segmento de ácidos nucleicos de señal) para permitir que una proteína o péptido expresado sea secretado de una célula que produce el péptido y/o (b) secuencias de fusión que conducen a la expresión de péptidos dados a conocer en la presente memoria en forma de proteínas de fusión. Entre los ejemplos de segmentos de señal adecuados se incluyen cualquier segmento de señal capaz de dirigir la secreción de una glucoproteína o proteína de fusión dada a conocer en la presente memoria. Los vectores pueden incluir además secuencias intermedias y/o no traducidas circundantes y/o interiores a la secuencia o secuencias de ácidos nucleicos codificantes del péptido dado a conocer en la presente memoria.

El polinucleótido o vector puede expresarse en una célula huésped o en un sistema de expresión sin células a fin de producir la glucoproteína o proteína de fusión dado a conocer en la presente memoria. Dicha expresión puede llevarse a cabo, por ejemplo, en una célula de mamífero, un sistema de expresión baculovírico, un sistema de expresión fúngica (que puede seleccionarse de manera que permita la glucosilación de la proteína expresada).

La célula huésped puede ser cualquier célula capaz de producir la glucoproteína o proteína de fusión dada a conocer en la presente memoria. De esta manera, en un ejemplo, la célula huésped es capaz de permitir la glucosilación del componente proteína de la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria. Las células huésped adecuadas podrán ser fácilmente identificadas por el experto en la materia, y entre ellas se incluyen, por ejemplo, células animales, tales como células de mamífero. En un ejemplo, la célula huésped es una célula CHO, una célula de mieloma (tal como el mieloma NS-O de ratón o las células SP2-O) o una célula HEK293T. En otro ejemplo, la célula huésped es una célula linfoblástica B Daudi (Hu et al., 2009).

Además, el polinucleótido o vector puede introducirse en una célula huésped para la administración en un sujeto. De esta manera, la composición farmacéutica dada a conocer en la presente memoria puede comprender una célula que comprende el polinucleótido o vector dado a conocer en la presente memoria. La célula puede ser una célula aislada. La célula es preferentemente una célula recombinante. De esta manera, la célula preferentemente se transfecta con un polinucleótido o vector dado a conocer en la presente memoria. Puede utilizarse cualquier célula huésped adecuada para la administración en un sujeto. En un ejemplo, la célula puede ser una célula obtenida del sujeto que debe tratarse. De esta manera, la célula puede ser una célula autóloga. De acuerdo con lo anterior, puede obtenerse una o más células del sujeto, puede introducirse un polinucleótido o vector tal como se da a conocer en la presente memoria en la célula del sujeto y la célula a continuación puede administrarse en el mismo sujeto. En un ejemplo, la célula puede ser un linfocito, tal como una célula T, tal como una célula T CD4+. Los métodos para obtener una muestra celular adecuada de un sujeto a este respecto son conocidos de la técnica. En el caso de que la célula que deba utilizarse sea un linfocito, entre los métodos pueden incluirse la linfocitaféresis. Otras células huésped adecuadas, que no necesitan derivarse necesariamente del sujeto que debe tratarse, pueden utilizarse igualmente. La expresión del polinucleótido o vector en la célula preferentemente resulta en la producción y/o secreción de la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria.

La transformación de un polinucleótido en una célula huésped puede llevarse a cabo mediante cualquier método adecuado conocido de la técnica. Entre las técnicas de transformación se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, transfección, electroporación, microinyección, infección y adsorción. Una célula recombinante puede seguir siendo unicelular o puede crecer formando un tejido, órgano o un organismo muticelular. Las moléculas de polinucleótido transformadas tal como se dan a conocer en la presente memoria pueden mantenerse extracromosómicas o pueden integrarse en uno o más sitios dentro de un cromosoma de la célula transformada (es decir, recombinante) de manera que se conserve su capacidad de expresarse.

Entre las células huésped adecuadas para la transformación se incluye cualquier célula que pueda transformarse con un polinucleótido tal como se da a conocer en la presente memoria. Las células huésped pueden ser capaces endógenamente (es decir, naturalmente) de producir polipéptidos de la presente invención o pueden convertirse en capaces de producir dichos polipéptidos tras ser transformadas con por lo menos una molécula de polinucleótido tal como se da a conocer en la presente memoria.

Pueden utilizarse tecnologías de ADN recombinante para mejorar la expresión de una molécula de polinucleótido transformada mediante la manipulación, por ejemplo, del número de copias de la molécula de polinucleótido dentro de una célula huésped, la eficiencia con la que dichas moléculas de polinucleótido se transcriben, la eficiencia con la que se traducen los transcritos resultantes, y la eficiencia de las modificaciones post-traduccionales. Entre las técnicas recombinantes útiles para incrementar la expresión de las moléculas de polinucleótido tal como se dan a conocer en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la unión operativa de moléculas de polinucleótido a plásmidos de elevado número de copia, la integración de la molécula de polinucleótido en uno o más cromosomas de la célula huésped, la adición de secuencias de estabilidad del vector en plásmidos, las sustituciones o modificaciones de las señales de control de la transcripción (p.ej., promotores, operadores e intensificadores), las sustituciones o modificaciones de señales de control traduccional (p.ej., sitios de unión ribosómica y secuencias de Shine-Dalgarno), la modificación de moléculas de polinucleótido tal como se da a conocer en la presente memoria para que correspondan al uso de los codones de la célula huésped, y la deleción de secuencias que desestabilizan los transcritos.

La célula huésped puede cultivarse bajo condiciones eficaces para producir la glucoproteína o proteína de fusión. Una vez expresada en la célula huésped, la glucoproteína o proteína de fusión puede aislarse mediante métodos convencionales conocidos de la técnica. De esta manera, en una realización, una glucoproteína o proteína de fusión aislada tal como se indica en la presente memoria se produce mediante cultivo de la célula capaz de expresar la glucoproteína o proteína de fusión bajo condiciones eficaces para producir la glucoproteína o proteína de fusión, y aislamiento de la glucoproteína o proteína de fusión. Entre las condiciones de cultivo eficaces se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, medios eficaces, el biorreactor, la temperatura, el pH y condiciones de oxígeno que permitan la producción de glucoproteína o proteína de fusión, y en particular, que permitan la glucosilación. Un medio eficaz se refiere a cualquier medio en el que se cultiva una célula para producir una glucoproteína o proteína de fusión tal como se da a conocer en la presente memoria. Dicho medio típicamente comprende un medio acuoso que presenta fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y fosfato, y sales, minerales, metales y otros nutrientes, tales como vitaminas, apropiados. Las células huésped pueden cultivarse en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, probetas, placas de microtitulación y placas Petri. El cultivo puede llevarse a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiados para una célula recombinante. Dichas condiciones de cultivo se encuentran comprendidas en los conocimientos del experto ordinario en la materia.

También puede utilizarse cualquier sistema de expresión sin células adecuado para la expresión del polinucleótido dado a conocer en la presente memoria. Entre los sistemas de expresión sin célula adecuados se incluyen aquellos que permiten la glucosilación del componente proteína de la glucoproteína o proteína de fusión. Dichas condiciones pueden ser determinadas por el experto en la materia.

La glucoproteína dada a conocer en la presente memoria también puede producirse mediante inducción de la expresión de CD52 en una célula huésped aislada y aislamiento de la glucoproteína CD52 soluble producida por la célula huésped. De esta manera, la glucoproteína puede producirse utilizando una célula que produce naturalmente CD52 soluble. El experto en la materia podrá identificar las células adecuadas y entre ellas se incluyen (aunque sin limitación), linfocitos, células de la zona del tracto genital (tales como células espermáticas), células linfoblásticas B Daudi (Hu et al., 2009), células K562 y otras. Pueden identificarse líneas celulares adicionales capaces de producir naturalmente CD52 soluble mediante el cribado para la secreción de CD52 soluble. De esta manera, pueden cribarse células de cáncer para su capacidad de secretar CD52 soluble.

Los métodos de producción de la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria a partir de una célula huésped adecuada que produce naturalmente CD52 soluble pueden comprender la estimulación de la célula huésped para producir niveles más elevados de CD52 soluble. Lo anterior puede conseguirse, por ejemplo, mediante el contacto de la célula huésped con un antígeno. Puede utilizarse cualquier antígeno. En un ejemplo, el antígeno es un autoantígeno, tal como GAD65. En otro ejemplo, el antígeno es toxoide tetánico.

Los métodos de producción de la glucoproteína dada a conocer en la presente memoria a partir de una célula huésped aislada que produce naturalmente CD52 soluble pueden comprender además la selección de una célula que expresa naturalmente CD52 y el contacto de la célula con un enzima capaz de cortar la parte extracelular de c D52 unido a membrana para liberar CD52 soluble. Los enzimas adecuados son conocidos de la técnica y entre ellos se incluyen fosfolipasas tales como la fosfolipasa C.

Los métodos descritos en la presente memoria pueden llevarse a cabo en células o poblaciones celulares aisladas de un tamaño suficiente para producir la cantidad deseada de CD52 soluble.

Células CD52hi

La presente exposición proporciona además células aisladas y poblaciones celulares que muestran niveles elevados de expresión de CD52. La palabra "elevado" significa que los niveles de expresión de CD52 son relativamente elevados en comparación con los niveles de expresión de CD52 en una población dada de células. La población dada de células puede ser, por ejemplo, una población de linfocitos. La población de linfocitos puede comprender células Treg y células no Treg. Además, la población de linfocitos puede haber estado en contacto con un antígeno a fin de estimular la actividad de los linfocitos. Alternativamente, la población de células puede ser de células del tracto genital, tal como células espermáticas. En contraste, las células CD52lD muestran niveles relativamente bajos de CD52 en comparación con una población de células dada.

En un ejemplo, puede determinarse que una célula es una célula CD52hi en el caso de que el nivel de expresión de CD52 en esa célula caiga dentro del 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% o 50% superior de los niveles de expresión de CD52 en una población de células. Preferentemente, una célula CD52hi presenta un nivel de expresión dentro del 10% superior de expresión de CD52 observado en una población de células.

En un ejemplo, puede determinarse que una célula es una célula CD52lD en el caso de que el nivel de expresión de CD52 en esa célula caiga dentro del 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% o 50% inferior de los niveles de expresión de CD52 en una población de células. Preferentemente, una célula CD52lD presenta un nivel de expresión dentro del 10% inferior de expresión de CD52 observado en una población de células.

La célula CD52hi puede aislarse a partir de la población de células a partir de la que se identifica. Alternativamente, puede aislarse una población de células CD52hi a partir de la población celular inicial a partir e la que se han identificado las células CD52hi. De esta manera, las poblaciones celulares dadas a conocer en la presente memoria pueden encontrarse enriquecidas en células CD52hi.

Por lo tanto, la presente exposición proporciona una población celular aislada que comprende una pluralidad de células CD52hi. Las células CD52hi pueden comprender por lo menos 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de la población celular enriquecida total.

Las células CD52hi aisladas y las poblaciones de células CD52hi dadas a conocer en la presente memoria son capaces de producir la glucoproteína CD52 soluble dada a conocer en la presente memoria.

Dichas células aisladas y poblaciones celulares pueden definirse adicionalmente a partir de la presencia de uno o más marcadores celulares adicionales. En un ejemplo, las células CD52hi son células CD4+ CD52hi. Alternativamente, las células CD52hi son células CD8+CD52hi. Entre los marcadores adicionales que caracterizan dichas células se incluyen una o más cualesquiera de proteína relacionada con el receptor del factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoide (GITR), CD127, ligando Fas (FasL o CD95L), el receptor de esfingosina-1-fosfato (S1PR), la glucoproteína CD24 anclada a GPI, CD25, FoxP3, CTLA-4, y otros marcadores, en cualquier combinación. Los inventores han encontrado que los niveles de expresión de GITR, CD127, Fas L, S1PR y CD24 pueden ser más elevados en las células Treg CD52hi que en las células CD52lD Por lo tanto, dichos marcadores pueden utilizarse para definir adicionalmente una célula CD52hi o una población de células CD52hi tal como se indica en la presente memoria. Además, la función de una célula dada puede utilizarse para definir una célula CD52hi o una población de células CD52hi tal como se indica en la presente memoria. Por ejemplo, la capacidad de una célula que expresa CD52 de reducir la función de las células T efectoras tal como se indica en la presente memoria puede utilizarse para identificar una célula CD52hi o una población de células CD52hi.

Medio de cultivo celular

Las células CD52hi o una población de células CD52hi tal como se indica en la presente memoria pueden cultivarse de manera que produzcan medio que comprende la glucoproteína soluble dada a conocer en la presente memoria. Las condiciones de cultivo adecuadas resultarán evidentes para el experto en la materia. Las células en cultivo pueden inducirse adicionalmente para incrementar su nivel de expresión de CD52 soluble mediante cualquier método adecuado, incluyendo mediante el contacto de las células con antígeno.

Tratamiento de las células ex vivo

En la presente memoria se describe además una composición farmacéutica que comprende células, preferentemente células inmunitarias, y un portador farmacéuticamente aceptable, en el que las células han sido tratadas ex vivo con uno o más cualesquiera de entre:

i) una glucoproteína CD52 soluble,

iv) un vector que comprende el polinucleótido de la parte iii),

vi) una célula CD52hi aislada capaz de producir glucoproteína CD52 soluble,

ix) un agente capaz de incrementar el nivel de expresión de glucoproteína CD52 soluble por una célula, Las células de la composición pueden ser, por ejemplo, sangre completa o una fracción celular e la misma, tal como células mononucleares de sangre periférica (PBMC).

Dichas células tratadas ex vivo pueden utilizarse, por ejemplo, para tratar o prevenir una enfermedad o condición mediada por la función de células T efectoras, inflamación o sepsis.

En una realización, las células son autólogas con respecto al sujeto en el que se administran. En otra realización, las células son alogénicas.

Composiciones farmacéuticas

La presente exposición proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más cualesquiera de entre la glucoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula, poblaciones celulares y medio celular indicado en la presente memoria, y cualquier agente capaz de incrementar el nivel de expresión de CD52 en la célula, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Un portador farmacéuticamente aceptable incluye un portador adecuado para la utilización en la administración en animales, tales como mamíferos, y por lo menos preferentemente seres humanos. En un ejemplo, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a autorizado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o listada en la Farmacopea US u otra farmacopea generalmente reconocida para la utilización en animales, y más particularmente en seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el terapéutico. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de petróleo, origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares.

Pueden prepararse composiciones terapéuticas mediante la mezcla de los compuestos deseados que presentan el grado apropiado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas, soluciones acuosas o suspensiones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables preferentemente resultan no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones, tales como Tris, HEPES, PIPES, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos, tales como metilparabeno o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio y/o surfactantes no iónicos, tales como TWEENTM, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Entre los ejemplos adicionales de dichos portadores se incluyen intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias de tampón, tales como glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro sódico, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona y sustancias a base de celulosa.

Se formula una composición farmacéutica tal como se da a conocer en la presente memoria para que resulte compatible con su vía de administración pretendida. Entre los ejemplos de vías de administración se incluyen parenteral (p.ej., intravenosa, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal e intratecal), mucosal (p.ej., oral, rectal, intranasal, bucal, vaginal y respiratoria), entérica (p.ej., oral, tal como mediante tabletas, cápsulas o gotas, y rectal) y transdérmica (tópica, p.ej., epicutánea, por inhalación, intranasal, gotas oculares y vaginal). Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica, entérica o subcutánea pueden incluir los componentes siguientes: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerol, propilenglicol u otros solventes sintéticos, agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metilparabenos, antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico, agentes quelantes tales como ácido etilén-diamina tetraacético, tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis preparados en vidrio o plástico.

La administración transdérmica se lleva a cabo mediante exposición del agente terapéutico a la piel del paciente durante un periodo de tiempo prolongado. Los parches transdérmicos presentan la ventaja añadida de proporcionar la administración controlada de un agente farmacéutico en el cuerpo (ver, por ejemplo, Transdermal and Topical Drug Delivery: From Theory to Clinical Practice, Williams (ed), Pharmaceutical Press, Reino Unido, 2003; Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft y Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., 1989). Por ejemplo, puede prepararse un parche adhesivo simple a partir de un material de refuerzo y un adhesivo de acrilato. El agente terapéutico y cualquier potenciador se formulan en la solución de moldeo adhesiva y se deja que se mezclen a fondo. La solución se moldea directamente sobre el material de refuerzo y el solvente de moldeo se evapora en un horno, dejando una película adhesiva. El papel soporte puede unirse para completar el sistema.

Alternativamente, puede utilizarse un parche de matriz de poliuretano para administrar el agente terapéutico. Las capas de dicho parche comprenden un refuerzo, una matriz de poliuretano de fármaco/potenciador, una membrana, un adhesivo y un papel soporte. La matriz de poliuretano se prepara utilizando un prepolímero de poliuretano de curado a temperatura ambiente. La adición de agua, alcohol y complejo al prepolímero resulta en la formación de un elastómero firme pegajoso que puede moldearse directamente sobre el material de refuerzo.

Una realización adicional de la presente invención utiliza un parche de matriz de hidrogel. Típicamente, la matriz de hidrogel comprende alcohol, agua, fármaco y varios polímeros hidrofílicos. Dicha matriz de hidrogel puede incorporarse en un parche transdérmico entre el refuerzo y la capa adhesiva.

Para los sistemas de administración pasiva, la tasa de liberación típicamente se control mediante una membrana situada entre el reservorio y la piel, mediante difusión a partir de un dispositivo monolítico, o por la piel misma, que sirve como barrera de control de la velocidad en el sistema de administración (ver las patentes US n° 4.816.258, n° 4.927.408, n° 4.904.475, n° 4.588.580 y n° 4.788.062). La velocidad de la administración será dependiente, en parte, de la naturaleza de la membrana. Por ejemplo, la velocidad de administración a través de las membranas dentro del cuerpo es generalmente más elevada que a través de barreras dérmicas.

Los materiales de membrana permeable adecuados pueden seleccionarse basándose en el grado deseado de permeabilidad, la naturaleza del complejo y consideraciones mecánicas relacionadas con la construcción del dispositivo. Entre los materiales de membrana permeable ejemplares se incluyen una amplia diversidad de polímeros naturales y sintéticos, tales como polidimetilsiloxanos (cauchos de silicona), copolímero de etilenvinilacetato (EVA), poliuretanos, copolímeros de poliuretano-poliéter, polietilenos, poliamidas, cloruros de polivinilo (PVC), polipropilenos, policarbonatos, politetrafluoroetilenos (PTFE), materiales celulósicos, p.ej., triacetato de celulosa y nitrato/acetato de celulosa, e hidrogeles, p.ej., 2-hidroxietilmetacrilato (HEMA).

Otros ítems pueden encontrarse contenidos en el dispositivo, tales como otros componentes convencionales de productos terapéuticos, dependiendo de las características deseadas del dispositivo. Por ejemplo, las composiciones según la invención pueden incluir además uno o más conservantes o agentes bacteriostáticos, p.ej., hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, clorocresol, cloruros de benzalconio y similares. Dichas composiciones farmacéuticas pueden contener además otros ingredientes activos, tales como agentes antimicrobianos, particularmente antibióticos, anestésicos, analgésicos y agentes antipruríticos.

Otra realización de la presente invención proporciona la administración tópica de la composición farmacéutica. Dicho régimen de tratamiento resulta adecuado para la administración sistémica del agente farmacéutico o para la terapia localizada, es decir, directamente en tejido patológico o enfermo. Pueden prepararse preparaciones tópicas mediante combinación del complejo de agente farmacéutico-modificador químico con diluyentes y portadores farmacéuticos convencionales utilizados comúnmente en formulaciones tópicas secas, líquidas, de crema y de aerosol. Las pomadas y cremas pueden, por ejemplo, formularse con una base acuosa o aceitosa con la adición de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Entre dichas bases pueden incluirse agua y/o un aceite, tal como parafina líquida, o un aceite vegetal, tal como aceite de cacahuete o aceite de ricino. Entre los agentes espesantes que pueden utilizarse según la naturaleza de la base se incluyen parafina blanda, estearato de aluminio, alcohol cetoestearílico, propilenglicol, polietilenglicoles, lanolina, lanolina hidrogenada, cera de abeja y similares. Las lociones pueden formularse con una base acuosa o aceitosa y en general contendrán además uno o más de los siguientes: agentes estabilizadores, agentes emulsionantes, agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, agentes colorantes, perfumes y similares. Pueden formarse polvos con la ayuda de cualquier base de polvos adecuada, p.ej., talco, lactosa, almidón y similares. Pueden formularse gotas con una base acuosa o una base no acuosa, comprendiendo además uno o más agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes solubilizadores, y similares.

Entre las formas de dosis para la administración tópica se incluyen polvos, sprays, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo puede mezclarse bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable, y con cualesquiera conservantes, tampones o propelentes que puedan resultar necesarios. Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener además excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, talco y óxido de cinc, o mezclas de los mismos. Los polvos y sprays pueden contener además excipientes, tales como lactosa, talco, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvos de poliamida, o mezclas de dichas sustancias. Los sprays pueden contener adicionalmente propelentes habituales, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos no sustituidos volátiles, tales como butano y propano.

La administración de fármaco mucosal (por ejemplo, por membranas gastrointestinal, sublingual, bucal, nasal, pulmonar, vaginal, corneal y ocular) proporciona una entrada eficiente de sustancias activas en la circulación sistémica y reduce el metabolismo inmediato por el hígado y la flora de la pared intestinal (ver, por ejemplo, Lee, 2001; Song et al., 2004; Hearnden et al., 2012). Las formas de dosis de fármaco transmucosales (p.ej., tabletas, supositorios, pomadas, geles, ungüentos, cremas, pesarios, membranas y polvos) típicamente se mantienen en contacto con la membrana mucosal y se desintegran y/o disuelven rápidamente para permitir la absorción sistémica inmediata.

Para la administración en las membranas bucal o sublingual, típicamente se utiliza una formulación oral, tal como una pastilla, tableta o cápsula. El método de fabricación de dichas formulaciones es conocido de la técnica, e incluye, aunque sin limitación, la adición del complejo de agente farmacéutico-modificador químico a una tableta prefabricada; la compresión en frío de un relleno inerte, un ligante y un complejo de agente farmacéutico-modificador químico o una sustancia que contiene el complejo (tal como se indica en la patente US n° 4.806.356) y el encapsulado.

Entre las composiciones orales generalmente se incluyen un portador diluyente inerte o un portador comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en tabletas. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo se incorpora con excipientes y se utiliza en la forma de tabletas, trociscos o cápsulas. También se preparan composiciones orales mediante la utilización de un portador líquido, tal como un enjuague bucal, en el que el compuesto en el portador líquido se aplica oralmente, se enjuaga la boca y se expectora o se traga. Los agentes de unión y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles pueden incluirse como parte de la composición. Las tabletas, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los ingredientes siguientes, o compuestos de una naturaleza similar: un ligante, tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente, tal como almidón o lactosa; un agente desintegrante, tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante, tal como estearato de magnesio o Sterotes; un glidante, tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante, tal como menta piperita, salicilato de metilo o saborizante naranja.

Otra formulación oral es una que puede aplicarse con un adhesivo, tal como el derivado de celulosa, hidroxipropilcelulosa, en la mucosa oral, por ejemplo tal como se indica en la patente US n° 4.940.587. Dicha formulación adhesiva bucal, al aplicarla en la mucosa bucal, permite la liberación controlada del complejo de agente farmacéutico-modificador químico en la boca y a través de la mucosa bucal.

Para la administración en las membranas nasal y/o pulmonar, típicamente se utilizará una formulación de aerosol. El término "aerosol" incluye cualquier fase suspendida transportada en un gas del complejo de agente farmacéuticomodificador químico que sea capaz de resultar inhalado en los bronquiolos o vías nasales. Específicamente, el aerosol incluye una suspensión transportada en un gas de gotas de los compuestos de la presente invención, tal como pueden producirse en un inhalador de dosis medida o nebulizador, o en un pulverizador de niebla. El aerosol incluye además una composición de polvos secos del complejo de agente farmacéutico-modificador químico suspendido en aire u otro gas portador, que puede administrarse mediante inhalación a partir de un dispositivo inhalador.

Para la administración mucosal o transdérmica, pueden utilizarse en la formulación penetrantes apropiados a la barrera que debe permearse. Dichos penetrantes son generalmente conocidos de la técnica y entre ellos se incluyen, por ejemplo, la administración mucosal, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico.

Entre las composiciones farmacéuticas adecuadas para la utilización inyectable se incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (en donde sean solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, entre los portadores adecuados se incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser líquida en la medida en que exista una fácil jeringabilidad. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador es un medio solvente o de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p.ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez correcta, por ejemplo mediante la utilización de un recubrimiento, tal como la lecitina, mediante el mantenimiento de un tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante la utilización de surfactantes. La prevención de la acción de los microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico y similares. En muchos casos, resulta preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol y sorbitol, y cloruro sódico, en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo mediante la inclusión en la composición de un agente que retarde la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes indicados anteriormente, según se requiera, seguido de la esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos de entre los indicados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferentes de preparación son el secado al vacío y la liofilización, que rinde unos polvos del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada a esterilidad del mismo.

Se entiende que un vehículo farmacéuticamente aceptable designa un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica sin provocar reacciones secundarias y que permite, por ejemplo, la facilitación de la administración del compuesto activo, un incremento en su tiempo de vida y/o de su eficacia en el cuerpo, para incrementar su solubilidad en solución o alternativamente, para potenciar su conservación. Dichos vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y serán adaptados por el experto en la materia según la naturaleza y el modo de administración del compuesto activo seleccionado.

Las composiciones farmacéuticas que deben utilizarse para la administración in vivo deben ser estériles. Lo anterior se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la liofilización y reconstitución. La composición puede almacenarse en forma liofilizada o en solución en el caso de que se administre sistémicamente. En el caso de que se encuentre en forma liofilizada, típicamente se formula en combinación con otros ingredientes para la reconstitución con un diluyente apropiado en el momento de la utilización. Un ejemplo de una formulación líquida es una solución no conservada incolora, transparente y estéril en un vial monodosis para la inyección subcutánea.

Las composiciones farmacéuticas generalmente se introducen en un envase que presenta una abertura de acceso estéril, por ejemplo una bolsa o vial de solución intravenosa que presenta un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica. Las composiciones preferentemente se administran por vía parenteral, por ejemplo, inyecciones o infusiones intravenosas, o se administran en una cavidad corporal.

Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en la presente memoria pueden comprender además un agente terapéutico adicional para suprimir la función de las células T efectoras y/o una respuesta inmunitaria.

En una realización, la composición comprende además insulina.

En otra realización, la composición comprende además un autoantígeno. Entre los ejemplos de autoantígenos útiles en las composiciones de la invención se incluyen, aunque sin limitación, los indicados en la Tabla 1 (Lemmark, 2001).

Tabla 1. Autoantígenos recombinantes o purificados reconocidos por autoanticuerpos asociados a trastornos autoinmunes humanos.

Métodos de tratamiento

La glucoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula, poblaciones celulares, medio celular y composición farmacéutica indicadas en la presente memoria y cualquier agente capaz de incrementar el nivel de expresión de CD52 en una célula, puede utilizarse para suprimir la función de las células T efectoras, la inflamación o la sepsis. De esta manera, la glucoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula, poblaciones celulares, medio celular y composición farmacéutica indicadas en la presente memoria y cualquier agente capaz de incrementar el nivel de expresión de CD52 en una célula, pueden utilizarse para tratar cualquier enfermedad o condición mediada por células T efectoras, o cualquier enfermedad o condición que implique inflamación o sepsis.

En un ejemplo, la enfermedad o condición mediada por células T efectoras puede ser una enfermedad autoinmune, rechazo de aloinjerto, una reacción de injerto contra el huésped o una reacción alérgica. La expresión "enfermedad autoinmune" se refiere a cualquier enfermedad en la que el cuerpo produce una respuesta inmunogénica (es decir, del sistema inmunitario) a algún constituyente de su propio tejido. Las enfermedades autoinmunes pueden clasificarse en aquellas en las que se ve afectado predominantemente un órgano (p.ej., anemia hemolítica y tiroiditis autoinmune) y aquellas en las que el proceso de la enfermedad autoinmune es difuso en muchos tejidos (p.ej., el lupus eritematoso sistémico). La enfermedad autoinmune puede ser (aunque sin limitación) una o más cualesquiera de entre diabetes mellitus dependiente de insulina (o diabetes de tipo 1), síndrome autoinmune por insulina, artritis reumatoide, artritis psoriásica, artritis de Lyme crónica, lupus, esclerosis múltiple, enfermedad intestinal inflamatoria, incluyendo la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad celíaca, enfermedad tiroidea autoinmune, miocarditis autoinmune, hepatitis autoinmune, pénfigo, enfermedad de la membrana basal antitubular (renal), cardiomiopatía dilatada hereditaria, síndrome de Goodpasture, síndrome de Sjogren, miastenia grave, insuficiencia poliendocrina, vitíligo, neuropatía periférica, síndrome poliglandular autoinmune de tipo I, glomerulonefritis aguda, hipoparatiroidismo idiopático de aparición adulta (HIAa ), alopecia total, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, enfermedad de Addison, síndrome del berilio crónico, espondilitis anquilosante, dermatomiositis juvenil, policondritis, escleroderma, enteritis regional, ileítis distal, enteritis granulomatosa, ileítis regional e ileítis terminal, esclerosis lateral amiotrófica, espondilitis anquilosante, anemia aplásica autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, enfermedad de Behcet, enfermedad celíaca, hepatitis activa crónica, síndrome CREST, dermatomiositis, cardiomiopatía dilatada, síndrome eosinofílico-mialgia, epidermolisis bullosa adquirida (EBA), arteritis de células gigantes, síndrome de Goodpasture, síndrome de Guillain-Barr, hemocromatosis, púrpura de Henoch-Schonlein, nefropatía de IgA idiopática, síndrome autoinmune por insulina, artritis reumatoide juvenil síndrome de Lambert-Eaton, dermatosis de IgA lineal, miocarditis, narcolepsia, vasculitis necrotizante, síndrome de lupus neonatal (SLN), síndrome nefrótico, penfigoide, pénfigo, polimiositis, colangitis esclerosante primaria, soriasis, glomerulonefritis de progresión rápida (GNPR), síndrome de Reiter, síndrome del hombre rígido, enfermedad intestinal inflamatoria, osteoartritis, tiroiditis y otros. En un ejemplo, la enfermedad autoinmune es la diabetes de tipo 1. En otro ejemplo, la enfermedad autoinmune es la artritis reumatoide. En otro ejemplo, la condición es un rechazo del aloinjerto o una reacción del injerto contra el huésped. De esta manera, los métodos dados a conocer en la presente memoria pueden comprender la administración de una o más cualesquiera de entre glucoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula, poblaciones celulares, medio celular, agente y composición farmacéutica en un receptor de trasplante.

La enfermedad alérgica puede ser (aunque sin limitación) una o más cualesquiera de entre una alergia alimentaria, alergia aerotransportada, alergia a los ácaros domésticos, alergia a los gatos o alergia al veneno de abeja, u otras alergias.

La inflamación puede aparecer como una respuesta a una lesión o estimulación anormal causada por un agente físico, químico o biológico. Una reacción de inflamación puede incluir las reacciones locales y cambios morfológicos resultantes, la destrucción o eliminación de material injurioso, tal como un organismo infeccioso y respuestas que conducen a la reparación y cicatrización.

Se produce inflamación en los trastornos inflamatorios. El término "inflamatorio" utilizado en referencia a un trastorno se refiere a un proceso patológico que está causado, que resulta de, o que resulta en, inflamación que es inapropiada o que no se resuelve de una manera normal. Los trastornos inflamatorios pueden ser sistémicos o localizados en tejidos u órganos particulares. Es conocido que se produce inflamación en muchos trastornos (algunos de los cuales son enfermedades autoinmunes), entre ellos se incluyen, aunque sin limitación, la respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), enfermedad de Alzheimer (y condiciones y síntomas asociados, incluyendo: neuroinflamación crónica, activación glical, microglía incrementada, formación de placas neuríticas, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), artritis (y condiciones y síntomas asociados, incluyendo, aunque sin limitación: inflamación articular aguda, artritis inducida por antígeno, artritis asociada a tiroiditis linfocítica crónica, artritis inducida por el colágeno, artritis juvenil, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis de pronóstico e inducida por estreptococos, espondiloartropatías y artritis gotosa), asma (y condiciones y síntomas asociados, entre ellos: asma bronquial, enfermedad crónica obstructiva de las vías respiratorias, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma juvenil y asma ocupacional); enfermedades cardiovasculares (y condiciones y síntomas asociados, incluyendo ateroesclerosis, miocarditis autoinmune, hipoxia cardiaca crónica, insuficiencia cardiaca congestiva, enfermedad arterial coronaria, cardiomiopatía y disfunción de las células cardiacas, incluyendo: activación celular del músculo liso aórtico, apoptosis de células cardiacas e inmunomodulación de la función de las células cardiacas), diabetes (y condiciones asociadas, incluyendo diabetes autoinmune, diabetes dependiente de insulina (tipo 1), periodontitis diabética, retinopatía diabética y nefropatía diabética), inflamaciones gastrointestinales (y condiciones y síntomas relacionados, incluyendo la enfermedad celíaca, osteopenia asociada, colitis crónica, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria y colitis ulcerosa), úlceras gástricas, inflamaciones hepáticas, tales como hepatitis vírica y otros tipos de hepatitis, cálculos biliares de colesterol y fibrosis hepática, infección por VIH (y condiciones asociadas, incluyendo respuestas degenerativas, respuestas neurodegenerativas y enfermedad de Hodgkin asociada a VIH), síndrome de Kawasaki (y enfermedades y condiciones asociadas, incluyendo síndrome de ganglios linfáticos mucocutáneos, linfoadenopatía cervical, lesiones de arterias coronarias, edema, fiebre, leucocitos incrementados, anemia leve, descamación de la piel, enrojecimiento de las conjuntivas y trombocitosis), nefropatías (y enfermedades y condiciones asociadas, incluyendo nefropatía diabética, enfermedad renal de estadio terminal, glomerulonefritis aguda y crónica, nefritis intersticial aguda y crónica, nefritis del lupus, síndrome de Goodpasture, supervivencia de la hemodiálisis y lesión por reperfusión isquémica renal), enfermedades neurodegenerativas o condiciones neuropatológicas (y enfermedades y condiciones asociadas, incluyendo neurodegeneración aguda, inducción de IL-1 en el envejecimiento y la enfermedad neurodegenerativa, plasticidad inducida por IL-1 de neuronas hipotalámicas e hiperresponsividad por estrés crónico y mielopatía), oftalmopatías (y enfermedades y condiciones asociadas, incluyendo retinopatía diabética, oftalmopatía de Graves, inflamación asociada a lesión corneal infección, incluyendo ulceración corneal y uveítis), osteoporosis (y enfermedades y condiciones asociadas, incluyendo pérdida ósea alveolar, femoral, radial, vertebral o de la muñeca o incidencia de fractura, pérdida ósea postmenopáusica, incidencia de fractura o tasa de pérdida ósea), otitis media (adulta o pediátrica), pancreatitis o acinitis pancreática, enfermedad periodontal (y enfermedades y condiciones asociadas, incluyendo adulta, de aparición temprana y diabética), enfermedades pulmonares, incluyendo enfermedad pulmonar crónica, sinusitis crónica, enfermedad de la membrana hialina, hipoxia y enfermedad pulmonar en el síndrome de muerte súbita infantil (SMSI), restenosis de injertos coronarios u otros injertos vasculares, reumatismo, incluyendo artritis reumatoide, cuerpos de Aschoff reumáticos, enfermedades reumáticas y miocarditis reumática, tiroiditis, incluyendo tiroiditis linfocítica crónica, infecciones del tracto urinario, incluyendo prostatitis crónica, síndrome del dolor pélvico crónico y urolitiasis, trastornos inmunitarios, incluyendo enfermedades autoinmunes, tales como alopecia aerata, miocarditis autoimmune, enfermedad de Graves, oftalmopatía de Graves, liquen escleroso, esclerosis múltiple, soriasis, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, enfermedad del tiroides (p.ej., gota y struma linfomatoso (tiroiditis de Hashimoto y gota linfadenoidal), lesión pulmonar (lesión pulmonar hemorrágica aguda, síndrome de Goodpasture y reperfusión isquémica aguda), disfunción miocárdica, causada por contaminantes ocupacionales y ambientales (p.ej., susceptibilidad al síndrome del aceite tóxico y silicosis), traumatismo de radiación y eficiencia de las respuestas de cicatrización de heridas (p.ej., heridas por quemadura o térmicas, heridas crónicas, heridas quirúrgicas y lesiones de la médula espinal), septicemia, respuesta de fase aguda (p.ej., respuesta febril), respuesta inflamatoria general, respuesta de distrés respiratorio agudo, respuesta inflamatoria sistémica aguda, cicatrización de heridas, adherencia, respuesta inmunoinflamatoria, respuesta neuroendocrina, desarrollo y resistencia a la fiebre, respuesta de fase aguda, respuesta al estrés, susceptibilidad a enfermedades, estrés por movimientos repetidos, codo de tenista y control y respuesta al dolor.

La glucoproteína CD52 soluble indicada en la presente memoria también se ha demostrado que resulta particularmente eficaz en el tratamiento de la esclerosis múltiple. De acuerdo con lo anterior, en otro ejemplo, la glucoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula, poblaciones celulares, medio celular, agente y/o composición farmacéutica dados a conocer en la presente memoria pueden utilizarse para tratar la esclerosis múltiple.

La sepsis es conocida como un síndrome clínico multiestadio, multifactorial y potencialmente letal que aparece por la respuesta innata a la infección y puede aparecer como una complicación en condiciones como traumatismos, cáncer, cirugía y otros.

Los métodos de tratamiento pueden comprender la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más cualesquiera de entre glucoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula, poblaciones celulares, medio celular o composición farmacéutica indicados en la presente memoria, o cualquier agente capaz de incrementar el nivel de expresión de CD52 en la célula, en un sujeto que lo necesita.

La "cantidad terapéuticamente eficaz" puede ser determinada por un médico y puede variar de un paciente a otro, según factores tales como la edad, el peso, el género y otros factores.

Métodos diagnósticos

Basándose en el resultado de los inventores de que CD52 soluble es un mediador de la función de las Treg, en la presente memoria también se describen métodos para determinar la susceptibilidad de un sujeto a cualquier enfermedad o condición mediada por células T efectoras, inflamación o sepsis tal como se indica en la presente memoria. Los métodos diagnósticos pueden estar basados en la detección de uno o más cualesquiera de entre el nivel de CD52 soluble, la frecuencia de células CD52hi y la función de las células CD52hi en una muestra obtenida del sujeto.

El nivel de CD52 soluble puede determinarse mediante cualquier método adecuado conocido de la técnica. Por ejemplo, el nivel de CD52 soluble puede determinarse mediante inmunoensayo, utilizando anticuerpos que se unen a CD52 soluble. Entre los anticuerpos adecuados se incluyen el anticuerpo monoclonal de rata humanizado CAMPATH-1G, los anticuerpos monoclonales de ratón marcados fluorescentemente de CD52 humano (tales como CF1D12), el anticuerpo policlonal de conejo de CD52 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) y otros.

La frecuencia de las células CD52hi puede detectarse mediante la detección del nivel de CD52 unido a membrana en la muestra, mediante la detección del nivel de expresión de proteína CD52 en la muestra y/o mediante detección del nivel de expresión de ARNm de CD52 en la muestra.

La función de las células CD52hi puede determinarse utilizando cualquier método adecuado, incluyendo cualquiera de los métodos dados a conocer en la presente memoria.

Los métodos diagnósticos pueden llevarse a cabo en cualquier muestra adecuada obtenida del sujeto. En un ejemplo, la muestra se obtiene de un sujeto mamífero, tal como un sujeto humano, y puede originarse a partir de varias fuentes, incluyendo, por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), leucoféresis o aféresis de productos sanguíneos, médula ósea, sangre del cordón, hígado, timo, biopsia tisular, tumor, tejido de ganglios linfáticos, tejido linfoide asociado al intestino, tejido de ganglio linfático asociado a mucosa, tejido del bazo o cualquier otro tejido linfoide, o de cualquier sitio de enfermedad, incluyendo el páncreas. En una realización preferente, la muestra celular se origina en PBMC de una muestra de sangre obtenida de la sangre periférica de un sujeto.

Los métodos diagnósticos pueden comprender la detección del nivel de uno o más cualesquiera de entre el nivel de CD52 soluble, la frecuencia de células CD52hi y la función de las células CD52hi en una muestra que comprende PBMC que se han puesto en contacto con un antígeno. De esta manera, los métodos pueden comprender una etapa de puesta en contacto de la muestra con un antígeno. En un ejemplo, el antígeno puede ser un autoantígeno.

En una aplicación particular de los métodos diagnósticos dados a conocer en la presente memoria, el nivel de CD52 soluble, la frecuencia de células CD52hi y/o la función de las células CD52hi pueden determinarse a fin de identificar la idoneidad de un sujeto para la inclusión en un ensayo de cribado farmacológico. De esta manera, en el caso de que el sujeto muestre un nivel más bajo de glucoproteína CD52 soluble, una frecuencia más baja de células CD52hi y/o una función reducida de las células CD52hi, ese sujeto puede identificarse como particularmente adecuado para la inclusión en un ensayo de cribado para un fármaco destinado a la utilización en el tratamiento de cualquier enfermedad o condición mediada por células T efectoras, inflamación o sepsis, tal como se indica en la presente memoria. En un ejemplo, el cribado puede llevarse a cabo a fin de identificar putativos fármacos antidiabéticos (en particular, fármacos anti-diabetes tipo 1).

Los métodos diagnósticos indicados en la presente memoria pueden comprender además una etapa de determinación de un nivel de referencia de CD52 soluble, de la frecuencia de células CD52hi y/o de la función de las células CD52hi a partir de una muestra obtenida de uno o más sujetos sanos. Alternativamente, el nivel de referencia puede estar predeterminado. La comparación del nivel de CD52 soluble, la frecuencia de células CD52hi y/o la función de las células CD52hi en una muestra obtenida del sujeto con el nivel de referencia puede indicar la susceptibilidad del sujeto a cualquier enfermedad o condición mediada por células T efectoras, inflamación o sepsis, tal como se indica en la presente memoria. Por ejemplo, en el caso de que el nivel de CD52 soluble, la frecuencia de células CD52hi y/o la función de las células CD52hi en la muestra obtenida del sujeto sea inferior al nivel de referencia, ese sujeto puede considerarse que es más susceptible a desarrollar una enfermedad o condición mediada por células T efectoras, inflamación o sepsis, tal como se indica en la presente memoria. Una mayor diferencia entre el nivel de la muestra y el nivel de referencia puede indicar una mayor susceptibilidad del sujeto a desarrollar una enfermedad o condición mediada por células T efectoras, inflamación o sepsis, tal como se indica en la presente memoria. Se apreciará que los valores exactos que indican un riesgo incrementado de que un sujeto desarrolle una enfermedad o condición mediada por células T efectoras, inflamación o sepsis variará según varios factores, entre ellos la enfermedad o condición particular que se diagnostica, la muestra utilizada para el diagnóstico, la población de individuos sanos utilizada para generar el nivel de referencia, y otros factores, tal como entenderá el experto en la materia.

En la presente memoria también se describe un método de cribado de un agente capaz de suprimir la función de las células T efectoras y/o la respuesta inmunitaria, en el que el método comprende poner en contacto una célula o población celular indicada en la presente memoria (por ejemplo, una célula o población celular CD52hi) con un agente de ensayo y posteriormente detectar el nivel de c D52 soluble, la frecuencia de células CD52hi y/o la función de las células CD52hi, en donde un nivel más elevado de glucoproteína CD52 soluble, una frecuencia más elevada de células CD52hi y/o una función potenciada de las células CD52hi después del contacto con el agente de ensayo indican que éste podría resultar potencialmente adecuado para la utilización como un agente capaz de suprimir la función de las células T efectoras y/o la respuesta inmunitaria.

Tal como se indica en la presente memoria, la presente exposición proporciona además un método de identificación de un agente capaz de imitar la función de supresión de las células T efectoras y/o de supresión del sistema inmunitario de la glucoproteína CD52 soluble, en el que el método comprende poner en contacto una célula o población celular indicada en la presente memoria (por ejemplo, una célula o población celular CD52hi) con un agente de ensayo y posteriormente detectar el nivel de CD52 soluble, la frecuencia de células CD52hi y/o la función de las células CD52hi, en donde un nivel más bajo de glucoproteína CD52 soluble, una frecuencia más baja de células CD52hi y/o una función reducida de las células CD52hi después del contacto con el agente de ensayo indican que éste podría resultar potencialmente adecuado para imitar la función de supresión de las células T efectoras y/o de supresión del sistema inmunitario de la glucoproteína CD52 soluble.

A continuación, se describe la invención en mayor detalle en referencia a los ejemplos no limitativos siguientes. Ejemplos

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES

Donantes de sangre

Se obtuvo sangre venosa extraída en tubos de heparina sódica con consentimiento informado y aprobación del Comité de ética de investigación humana, a partir de 5 adultos jóvenes sanos (3 hombres, 2 mujeres) y un adulto hombre joven en riesgo de DT1, todos con respuestas conocidas de las células T sanguíneas a GAD65. Todos los donantes habían sido vacunados contra el toxoide tetánico. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) sobre Ficoll/Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia), se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspendieron en medio de Dulbecco modificado por Iscove (Gibco, Melbourne, Australia) que contenía suero humano inactivado por calor agrupado al 5%, aminoácidos no esenciales 100 mM, glutamina 2 mM y 2-mercaptoetanol 5x10-5 M (medio de Dulbecco modificado por Iscove [IMDM, por sus siglas en inglés]).

Anticuerpos y otros reactivos

Los reactivos y proveedores eran los siguientes: anticuerpos monoclonales de ratón marcados fluorescentemente contra CD52 (clon CF1D12) y CD24 (clon SN3) humanos (Caltag), FoxP3, GITR, ICOS, CD25,CD127 y Siglec-10 (clon 5G6) humano (Biolegend, San Diego, CA, EE.UU.); IgG3 de ratón (Caltag); anticuerpo policlonal de conejo contra CD52 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.); anticuerpo de caballo anti-IgG de conejo conjugado con HRP e IgG antirratón (Cell Signaling, Arundal, QLD, Australia); reactivo ECL (GE Healthcare, Rydalmere, NSW, Australia), anticuerpo monoclonal de rata humanizado (CAMPATH-1G) de CD52 (Bayer Healthcare, Pymble, NSW, Australia), anticuerpos monoclonales de ratón de IFN-y humana (Mabtech, Sydney, NSW, Australia) e IL-10Ra (clon 37607), anticuerpo de cabra anti-TGF-pRII humano y anticuerpo de cabra purificado por afinidad de Siglec-10 humano y Fc de Siglec-10 humano recombinante (R & D Systems, Minneapolis, MN); IL-2 (NCIBRB Preclinical Repository, Rockville, MD); péptido CD52 humano sintético (GL Biochem, Shanghai); indometacina, metil-éster de nitro-L-arginina, 1-metil-DL-triptófano, SCH58261 (antagonista de receptor de adenosina A2A) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.); succinimidil-éster de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.); neuraminidasa (de C. perfringens tipo V) (Sigma-Aldrich, Castle Hill, Australia); 3H-timidina (ICN, Sydney, Australia); transpocillos Cornig Coster de 0,4 pm (Crown Scientific, Minto, NSW, Australia); proteína G y A-Sefarosa (WEHI Monoclonal Lab, Bundoora, Victoria, Australia), inhibidores de fosfolipasa C (U7322) y D (1,10-fenantrolina) (Sigma-Aldrich Pty. Ltd. NSW, Australia), fosfolipasa C (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.Uu .), PNGasa F (New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.), sefarosa Strep-Tactin (IBA GmbH Gottingen, Alemania). El toxoide tetánico (TT) fue generosamente proporcionado por CSL (Parkville, Victoria, Australia). GAD65 recombinante producido en baculovirus y purificado tal como se encuentra descrito ((Bach et al., 1997) fue adquirido de Dr Peter Van Endert, Hopital Necker, Paris. La concentración de endotoxina de la solución madre de GAD65, medida mediante el ensayo de lisado de Limulus (BioWhittaker, Walkerville, MD, EE.UU.) era de 1,2 EU/mg/ml. Se utilizó TT y GAD65 a concentraciones de 10 unidades de floculación de Lyons (ufL)/ml y 5 pg/ml, respectivamente, a menos que se indique lo contrario. Se sometieron a ensayo citoquinas y receptor-a de IL-2 soluble (CD25) en medio mediante matrices de perlas MAP de Milliplex (Abacus ALS, Brisbane, Australia).

Análisis estadístico

Las réplicas se expresan como medias ± sem. Se determinó la significancia entre grupos mediante pruebas t de Student (de 2 colas) no apareadas utilizando GraphPad Prism versión 3.0cx para Macintosh (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

Ejemplo 1: análisis de los clones de células T CD4+ específicos de GAD65

Métodos

Los clones de células T CD4+ específicos de GAD65, generados y cribados previamente para la función supresora específica de GAD65, se descongelaron y cultivaron tal como se ha descrito (Dromey et al., 2011). Inicialmente, se cribaron clones supresores y no supresores para marcadores de superficie contra una matriz de anticuerpos en fase sólida (Medsaic Ptd Ltd., Sydney, Australia) (Belov et al., 2003). Los clones (1x106) se obtuvieron directamente del cultivo y se analizaron en reposo o tras la estimulación durante 24 h con anti-CD3 unido a la placa (5 pg/ml). Para el fenotipado mediante citometría de flujo, las células se tiñeron sobre hielo con las concentraciones apropiadas de anticuerpos marcados. Se agruparon las tinciones de FoxP3 intracelular y CTLA-4 intracelular.

Resultados

Los pares de cribado de clones supresor y no supresor autólogos para diferencias de fenotipo superficial utilizando una matriz de anticuerpos de CD revelaron que los clones supresores activados consistentemente mostraban una expresión más elevada de CD52, un resultado que se confirmó mediante citometría de flujo (ver la figura 1). De esta manera, se identificó CD52 como un marcador potencial de las células Treg.

Ejemplo 2: análisis de células T CD4+CD52hi sanguíneas

Métodos

Las PBMC teñidas con succinimidil-éster de carboxifluoresceína (CFSE) se cultivaron en IMDM en placas de fondo redondo de 96 pocillos con o sin GAD65 o TT, a razón de 2*105 en 200 pl en réplicas de seis. Tras 7 días, se agruparon las réplicas, se lavaron en BSA al 0,1%-PBS y se tiñeron sobre hielo con anticuerpos anti-CD4-PE, -PECy7 o -CPA y CD52-PE (clon CF1D12). Se clasificaron células CD4+ CFSEdim viables (negativas para yoduro de propidio) que habían experimentado división en respuesta a GAD65, en un FACSAria (BD Biosciences, North Ryde, n Sw , Australia) en fracciones con la expresión más alta a más baja de CD52, y se clonaron células individuales tal como se ha descrito (Dromey et al., 2011). Posteriormente, en respuesta a GAD65 o TT, las poblaciones CD52hi y CD52lD correspondientes, respectivamente, al 10% superior y al 10% inferior de expresión de CD52 en células CD4+ no divididas se clasificaron para estudio adicional. Dichos cortes se seleccionaron debido a que la mayoría de clones supresores específicos de GAD65 generados eran del 10% superior de células CD52+ (ver la Tabla 1).

Mediante la utilización de PBMC del mismo donante durante 4 semanas consecutivas, el coeficiente inter-ensayo de variación de la proporción CD52hi a CD52lD en respuesta a GAD65 era de 21,8%. Las PBMC en reposo se clasificaron en células CD4+ CD52hi y CD52lD y también se recogieron sin clasificar a modo de control. En experimentos separados, antes del marcaje con CFSE, las PBMC estaban empobrecidas en células CD25+ por la selección de AutoMACS (Miltenyi Biotec); se utilizaron anticuerpos monoclonales de isotipo correspondiente para el control de los 'empobrecimientos'.

La función de las células CD4+ CD25hi y CD52lD activadas por GAD65 o TT se analizó de dos maneras. En primer lugar, se cocultivaron células CD52hi o CD52lD separadas, con células T CD4+ activadas por TT en una proporción 1:1 (1x io 4/pocillo) en 6 pocillos de una placa de 96 pocillos. Cada pocillo también contenía 5*104 PBMC autólogas irradiadas como células presentadoras de antígenos (CPA) y TT para estimular la proliferación de las células T CD4+ activadas por TT autólogas. Se añadió GAD65 a 3 de los 6 pocillos para estimular nuevamente las células separadas. A modo de control, las PBMC irradiadas también se cultivaron con o sin GAD65. Tras 48 h, se añadió 3H-timidina (37 kBq) a cada pocillo y se recolectaron las células 16 h después. En segundo lugar, las células CD4+ CD52hi o CD52lD separadas (5-20.000 de cada una) se cultivaron solas o en combinación en una proporción 1:1 en 6 pocillos réplicas de una placa ELISpot de 96 pocillos (Millipore PVDF MultiScreen HTS) que contenía anticuerpo anti-IFN-Y preunido. Cada pocillo también contenía cuatro veces el número de PBMC autólogas irradiadas a modo de células presentadoras de antígenos (CPA). Se añadió GAD65 o TT a 3 de los 6 pocillos para estimular nuevamente las células separadas. Tras 24 h, se eliminaron las células mediante lavado y se desarrollaron manchas mediante incubación con segundo anticuerpo biotinilado, seguido de estreptavidina-fosfatasa alcalina y reactivo de color BCIP/NBT. Los resultados se expresaron como manchas de IFN-y/5.000 células CD4+.

Resultados

Se encontró que una mayoría (22/29, 76%) de clones supresores específicos de GAD65 se derivaba de células T CD4+ activadas por GAD65 con la expresión de CD52 más elevada (10% superior) (Tabla 1). De esta manera, los clones supresores aparentemente se derivan de células T CD4+ CD52hi de sangre primaria y no un artefacto de las condiciones de clonación.

Tabla 1: clones supresores derivados de células T CD4+ activadas por GAD65 fraccionadas según la expresión de

CD52*

Debido a que la mayoría de los clones supresores CD4+ específicos de GAD65 se deriva de células divididas con expresión de CD52 correspondiente al 10% superior en célula CD4+ no divididas, dicho umbral podría utilizarse para definir una población c D4+ CD52hi después de la activación. Al reactivarlas con GAD65, las células CD4+ CD52hi separadas, pero no las CD52lD suprimieron la proliferación de las células T CD4+ específicas de TT autólogas (figura 2A). Para garantizar que la supresión era específica para las células CD52hi y no debido al método de su selección, las células CD4+ activadas por GAD65 se clasificaron para la expresión elevada de dos otras glucoproteínas ancladas a GPI, CD24 y CD59, así como CD62L, HLA-DR, CD80 e ICOS, aunque dichas poblaciones no suprimieron la proliferación de las células T específicas de TT (datos no mostrados).

También se demostraron diferencias funcionales entre las células T CD52hi y CD52lD separadas, tras la reactivación con GAD65, mediante ensayo ELISpot. Una proporción más baja de CD52hi que CD52lD secretaba IFN-y y la adición de células CD52hi a células CD52lD redujo el número de células secretoras de IFN-y en respuesta a la reactivación [comparar las células CD52hi CD52lD (p< 0,002) con las células CD52lD CD52lD (p<0,0002) en la figura 2B]. La supresión no era única de las células T CD4+ CD52hi activadas por GAD65 y también se observó al utilizar toxoide tetánico (TT) como el antígeno activador (figura 2C). Debido a que las respuestas de las células T a TT eran más fuertes, los estudios posteriores utilizaron mayoritariamente TT como antígeno. La suplementación con una concentración baja de IL-2 (10 U/ml) incrementó el número de células secretoras de IFN-y tanto CD52hi como CD52lD en respuesta a la reactivación, aunque no alteró la supresión por células CD52hi (figura 2C). Las células CD4+ CD52hi que se separaron de las PBMC poliespecíficas no activadas mostraron una supresión débil, habitualmente significativa de las células T activadas por GAD65 o TT (datos no mostrados). Sin embargo, tras la activación con antígeno, las células CD4+ CD52hi supresoras se derivaban más probablemente de células CD4+ CD52hi preexistentes debido a que el empobrecimiento en estas células a partir de PBMC en reposo incrementó la respuesta de las células T residuales a Ga D65 (figura 2D).

Ejemplo 3: las células T CD4+ CD52h¡ son diferentes de las células T reg CD4+CD25+

Métodos

Se marcaron PBMC con anticuerpo anti-CD25a y se empobrecieron en células CD25hi en una columna AutoMACS (84% en comparación con el 'empobrecimiento' de anticuerpo de control de isotipo). A continuación, las células se marcaron con CFSE y se incubaron con TT durante 7 días antes de separarlas en células CD52hi y CD52lD, se reactivaron con TT y se analizaron mediante ensayo ELISpot.

Resultados

Tras el empobrecimiento en células CD25hi, la proporción de células CD4+ CD25hi divididas en respuesta a TT incrementó (18,1% frente a 11,8% con empobrecimiento de control), aunque su función supresora tras la reactivación con TT se mantuvo sin cambios (figura 3). De esta manera, las células c D4+ CD52hi supresoras aparentemente no se derivan de la población de células T CD4+ CD25+.

Ejemplo 4: análisis fenotípico de las células T CD4+ CD52hi

Métodos

La expresión de citometría de flujo de (A) CD25a, (B) FoxP3, (C) superficie y (D) intracelular CTLA-4, (E) GITR, (F) CD127, (G) CD24 y (H) CD59 sobre células T CD4+ CD52hi (línea negra) y Cd 52ID (línea gris), tras la incubación de PBMC con TT durante 7 días. La tinción con anticuerpo de control de isotipo se muestra como sombreado gris. Los resultados son representativos de 5 individuos.

Resultados

Las células Treg CD4+CD25+ presentan una expresión elevada de CD25, FoxP3, CTLA-4 y proteína relacionad con el factor de necrosis tumoral inducido por glucocorticoide (GITR) (Sakaguchi et al., 2008; Shevach, 2006) y baja expresión de CD127 (Seddiki et al., 2006; Liu et al., 2006). En contraste, excepto para la expresión más elevada de GITR, las células T CD4+ CD52hi presentaban una expresión similar de CD25, FoxP3 y CTLA-4, y una expresión consistentemente más elevada de CD127, en comparación con las células T CD4+ CD52lD (figura 4). La expresión de la glucoproteína anclada con GPI, CD24, relacionada estructuralmente con CD52 (Tone et al., 1999), era más elevada sobre las células T CD4+ CD52hi, aunque éste no era el caso para CD59 anclada en GPI (figura 4) o CD73, o para CD103, CD40, integrina p7, ICOS y p D-1 (datos no mostrados). De esta manera, las células T CD4+ CD52hi son una nueva población de células supresoras que no se caracteriza por la expresión de marcadores utilizados para definir células Treg CD4+CD25+ humanas, y que se detectan en el contexto de la activación con antígeno, implicando que contribuyen a la homeostasis de las células durante la división de las células T.

Ejemplo 5: análisis de expresión génica de las células T CD4+ CD52hi

Métodos

La expresión del gen de CD52 y de los genes para proteínas que se encontró que presentaban una expresión incrementada sobre las células T CD4+ CD52hi se investigó mediante RT-PCR en tiempo real cuantitativa. Se separaron las células T CD4+ CD52hi y CD52lD marcadas con CFSE procedentes de tres individuos 7 días después de la activación con GAD65. Se extrajo el ARN total de las células con el minikit RNAeasy (Qiagen, Melbourne, Australia) tratadas con ADNasa libre de ARNasa (Qiagen) y se cuantificó con el bioanalizador Agilent 2100. El ADNc se transcribió inversamente a partir de 10 ng de ARN/reacción. Los cebadores para la PCR, diseñados con el software PrimerExpress y sintetizados por Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia) eran:

La mezcla maestra de PCR SYBR Green era de Applied Biosystems. Se sometieron muestras por triplicado de ADNc a 40 ciclos de amplificación en un instrumento ABI Prism 7900, siguiendo el protocolo del fabricante. Se cuantificó la expresión de ARNm, normalizada respecto a la expresión endógena de p-actina, mediante el método del umbral crítico (Ct) comparativo según la fórmula 2-AACt, tal como se indica en el boletín 2 del usuario de ABI (docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf).

Resultados

En consistencia con el análisis de expresión de citometría de flujo, los transcritos de CD52, CD127 y GITR eran más elevados en células CD52hi que en células CD52lD (figura 5).

Ejemplo 6: la supresión por las células CD52hi no se ve influenciada por el nivel de expresión de CD24.

Métodos

Con el fin de analizar la expresión de la glucoproteína anclada a GPI CD24 estructuralmente relacionada, se incubaron con TT PBMC marcadas con CFSE durante 7 días y se clasificaron en células T CD4+ CD52hiCD24l°, CD52hiCD24hi, CD52loCD24lD y CD52loCD24hi. Cada población (5.000 células) se incubó con células respondedoras CD52te separadas (5.000) y PBMC irradiadas (20.000) y se analizaron mediante un ensayo ELISpot. Los resultados son medias±sem de réplicas por triplicado.

Resultados

la expresión de la glucoproteína anclada a GPI, CD24, relacionada estructuralmente con CD52 (Tone et al., 1999) era más elevada sobre las células T CD4+ CD52hi. Aunque las células T CD4+ CD24hi activadas por antígeno, al contrario que las células T CD4+ CD52hi, no eran supresoras, era importante determinar si CD24 delimitaba mejor las células T CD4+ CD52hi con función supresora. Las PBMC activadas con TT se separaron en cuatro poblaciones CD4+ diferentes según la expresión de CD52 y CD24 y después se sometieron a ensayo para la función supresora tras la reactivación con TT. Lo anterior reveló que la supresión por células CD52hi no se vio influenciada por la expresión de CD24 (figura 6).

Ejemplo 7: la función de Treg CD52hi no requiere el contacto célula-célula.

Métodos

la incorporación de 3H-timidina (cpm) por células CD4+ CD52hi y CD52te separadas y activadas con TT se combinó o se separó mediante un transpocillo de 0,4 pm semipermeable y se reactivó con TT. Se incubaron con TT las PBMC marcadas con CFSE durante 7 días y se separaron en células CD4 CD52hi y CD52te Las células separadas (100.000 cada una) se incubaron con PBMC autólogas irradiadas (400.000) y TT en placas de 48 pocillos, en presencia del transpocillo ambos compartimientos contenían PBMC irradiadas y TT. La incorporación de 3H-timidina por las células en el comportamiento del fondo se midió después de 48 h.

Resultados

La función supresora de las células T CD4+ CD52hi activadas por antígeno se conservó a través de un transpocillo sin contacto célula-célula (figura 7). De esta manera, la presente exposición muestra que la supresión de las Treg CD4+ CD52hi está mediada por lo menos en parte por un mediador soluble. Tal como se comenta en Vignali et al. (2008), se han investigado anteriormente citoquinas inhibidoras como posibles mediadores solubles de la supresión de Treg, aunque los resultados no han sido concluyentes y la percepción general sigue siendo que el contacto célula-célula resulta esencial para la función supresora de Treg. Los resultados dados a conocer en la presente memoria sugieren que las células T CD4+ CD52hi eliminaron un factor soluble requerido para la función de las células T respondedoras o produjeron un factor soluble que suprimió las células T respondedoras.

Ejemplo 8: análisis de IL-2 en la función de las Treg CD52hi.

Métodos

Se investigó el papel de IL-2 en varios experimentos, incluyendo la utilización de RT-PCR en tiempo real cuantitativa para determinar los niveles de expresión. En el análisis de RT-PCR cuantitativa, se extrajo el ARN total de las células con el minikit RNAeasy (Qiagen, Melbourne, Australia) tratadas con ADNasa libre de ARNasa (Qiagen) y se cuantificó con el bioanalizador Agilent 2100. El ADNc se transcribió inversamente a partir de 10 ng de ARN/reacción. Los cebadores para la PCR, diseñados con el software PrimerExpress y sintetizados por Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia) eran:

IL-2a '5 TACAGGATGCAACTCCTGTCTT (SEC ID n° 18),

'3 GCTCCAGTTGTAGCTGTGTTTT (SEC ID n° 19),

IL-27P '5 GCTGTTCTCCATGGCTCCCTAC (SEC ID n° 20),

'3 GTCGGGCTTGATGATGTGCT (SEC ID n° 21),

IL-12a '5 CTCCAGAAGGCCAGACAAACTC (SEC ID n° 22),

'3 CCAATGGTAAACAGGCCTCCAC (SEC ID n° 23).

La mezcla maestra de PCR SYBR Green era de Applied Biosystems. El ADNc se sometió a 40 ciclos de amplificación en un instrumento ABI Prism 7900, siguiendo el protocolo del fabricante. Se cuantificó la expresión de ARNm, normalizada respecto a la expresión endógena de p-actina, mediante el método del umbral crítico (Ct) comparativo según la fórmula 2-AACt, tal como se indica en el boletín 2 del usuario de ABI (docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf).

Resultados

El consumo o degradación de IL-2 por células T CD4+ CD52hi se consideró un mecanismo improbable de supresión por varios motivos: i) IL-2 exógeno no superó la supresión (figura 2C); ii) la RT-PCR cuantitativa reveló que la expresión génica de IL-2 era realmente más elevada en células CD52hi; de esta manera, 24 h después de la reactivación con GAD65, la expresión de ARNm de IL-2a en células CD52hi respecto a las células CD52lD era de 1,54±0,15 (media±sem, n=3); iii) la concentración de IL-2 en el medio de las células CD52hi era más elevada que para las células CD52lD, tanto en reposo (89,5±4,82 v 64,9±3,10 pg/ml) como después de la reactivación con GAD65 (138,7±4,16 v 82,4±1,78 pg/ml) (medias±sem, n=3; P=0,02, prueba de Kruskal-Wallis); iv) en los medios en los que se midió IL-2, el receptor a de IL-2 soluble (CD25) no era detectable (datos no mostrados). De esta manera, la eliminación de IL-2 se cree que es un mecanismo improbable de supresión de las Treg CD52hi.

Ejemplo 9: análisis de otros mediadores putativos de la función de las Treg CD52hi.

A continuación, se encontró que la supresión de Treg no experimentaba cambios en presencia de agentes que bloquean la acción o la producción de factores que se informa que median en la supresión por células Treg c D4+ (Sakaguchi et al., 2008, 2009; Shevach, 2006, 2009; Vignali et al., 2008). Entre ellos se incluían anticuerpos monoclonales neutralizadores de IL-10Ra o TGF-pRII individualmente o en combinación (10 pg/ml cada uno), el inhibidor de ciclooxigenasa-2 (COX-2) indometacina (20 pM) (que bloquea la producción de la prostaglandina E2), el inhibidor pan-óxido nítrico sintasa N(G)-monometil-L-arginina (800 pM) (que bloquea la producción del óxido nítrico), el inhibidor de indolamín-2,3-dioxigenasa (IDO), 1-metil-DL-triptófano (200 pM) (que bloquea la producción de metabolitos de triptófano inhibidores) y el antagonista de receptor de adenosina A2A, SCH58261 (20 pM) (que bloquea la acción de la adenosina) (datos no mostrados). Recientemente, una nueva citoquina supresora, IL-35, un heterodímero de las subunidades IL-27p (EBi3) e IL-12a (p35), se ha mostrado que es secretada por las células Treg CD4+CD25+ (que también requieren el contacto célula-célula para la supresión) (Collison et al., 2007). IL-35 no podía medirse directamente debido a que los anticuerpos de IL-35 o su receptor no se encuentran disponibles. Sin embargo, 24 h después de la reactivación con GAD65, la expresión del ARNm de IL-27p e IL-12a era inferior en células CD4+ CD52hi que en células CD4+ CD52lD (0,423±0,188 vs 1,38±0,224; medias±sem, n=3), indicando que IL-35 es improbable que explique la supresión por las células T CD4+ CD52hi.

Ejemplo 10: CD52 soluble es un mediador de la supresión de las Treg CD52hi

Métodos

Se incubaron con GAD65 las PBMC marcadas con CFSE durante 7 días y se separaron en células T CD4+ CD52hi y CD52lD Las células separadas se reactivaron con GAD65 y los medios se recogieron tras 24 h. Se concentraron los medios 10 veces, se fraccionaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PDVF con un anticuerpo policlonal de conejo de CD52 a fin de detectar la presencia de CD52 soluble en el medio.

A continuación, se analizó el inhibidor de fosfolipasa C, U73122, como un potencial inhibidor de la producción de CD52 soluble. Se incubaron con TT las PBMC marcadas con CFSE durante 7 días y se separaron en células CD4 CD52hi. Las células separadas se reactivaron con TT y los medios se recogieron después de 24 h y se sometieron a inmunotransferencia tal como anteriormente. Por separado se incubaron con TT, PBMC marcadas con CFSE, durante 7 días, y se separaron en células T CD4+ CD52hi y CD52lD, que después se incubaron juntas (5.000 de cada una) en placas ELISpot con PBMC irradiadas (20.000) y TT ± inhibidor de fosfolipasa C, U73122. Los resultados son medias±sem de réplicas por triplicado.

Además, el anticuerpo de la fracción carbohidrato de CD52 se analizó como otro potencial inhibidor de la supresión por células T CD4+ CD52hi activadas por TT. Los procedimientos fueron los indicados para el inhibidor de fosfolipasa C, U73122, anteriormente, excepto en que las células en el ensayo ELISpot se incubaron con o sin TT y 10 pg/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD52 (CF1D12) o control de isotipo (IgG3). Los resultados (medias±sem) son representativos de tres experimentos independientes.

Resultados

La inmunotransferencia reveló que CD52 se encontraba presente en el medio de las células T CD4+ CD52hi que se habían dividido en respuesta a GAD65 y se incrementaron en cantidad tras su reactivación con GAD65 (figura 8A). Se encontró el mismo resultado con TT como antígeno y el inhibidor de fosfolipasa C, U73122, añadido antes de la reactivación con TT redujo la cantidad de CD52 en el medio (figura 8B). Además, la inhibición de fosfolipasa C revertió la supresión por células T CD4+ CD52hi de una manera dependiente de la dosis (figura 8C). El anticuerpo monoclonal CF1D12, que interactúa con el carbohidrato terminal en el péptido CD52 (Hale, 2001) evitó la supresión por las células T CD4+ CD52hi o CD52lD (figura 8D). Juntos, estos resultados indican que la supresión por células T CD4+ CD52hi se debía a CD52 soluble liberado por la escisión por fosfolipasa en respuesta a la estimulación con antígeno.

Ejemplo 11: análisis adicional de la función efectora de CD52 soluble

Al considerar una fuente más abundante de CD52 soluble nativo, se postuló que CD52 podría liberarse espontáneamente a partir de algunas líneas celulares, tales como la línea celular linfoblástica B Daudi en la que la biosíntesis de GPI es defectuosa debido a una deficiencia de producto del gen PIGY (Hu et al., 2009).

Métodos

Se recogieron los medios de células CD4+ CD52hi y CD52lD separados 24 h después de la reactivación de las células con GAD65 o TT. Se recogieron los medios de las líneas celulares (Daudi, Raji, Jurkat y K562) y se concentraron 10 veces mediante liofilización. Se fraccionaron las muestras mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF. Tras el bloqueo con leche desnatada al 5%, la membrana se incubó con anticuerpo policlonal de conejo de CD52 (1 |jg/ml), se lavó, se incubó con anticuerpo de cabra anticonejo-peroxidasa de rábano picante y se visualizó mediante quimioluminiscencia potenciada.

Por separado, se cultivaron PBMC (200.000 células) durante 7 días en IMDM que contenía medio condicionado de células Daudi al 20% con TT y anticuerpo anti-CD52 (CF1D12) o de control de isotipo (10 jg/ml). Para agotar el CD52 soluble, se incubó el medio Daudi durante la noche con anticuerpo policlonal anti-CD52 de conejo (medio 1 jg/m l) seguido de precipitación con proteína G-sefarosa durante 1 h a 4°C. Los resultados (medias±sem) son representativos de tres experimentos independientes.

Resultados

el cribado de varias líneas celulares reveló la presencia de CD52 en medios de cultivo de células Daudi y K562 (figura 9A). El medio de Daudi suprimió la proliferación activada por TT de las PBMC y la supresión se revertió con anticuerpo CF1D12 o mediante inmunoempobrecimiento (confirmada mediante inmunotransferencia) de CD52 (figura 9B), demostrando que la supresión de las células T se debía a CD52 en el medio. CD52 era soluble y no se encontraba presente en exosomas o partículas membranales debido a que la supresión no resultaba afectada por la centrifugación del medio a 100.000xg durante 30 min (datos no mostrados).

Ejemplo 12: replicación de función efectora de CD52 soluble con CD52-Fc

Métodos

Con el fin de explorar adicionalmente, la función inmunosupresora de CD52 soluble, se clonó CD52 maduro de superficie celular en un vector lentivírico como una proteína de fusión en el mismo marco que el fragmento Fc de inmunoglobulina G y una secuencia C-terminal de etiqueta Strep para la purificación. A modo de control se clonó un constructo de solo Fc. Los constructos se expresaron establemente en células Daudi o transitoriamente en células HEK293T y proteínas recombinantes solubles purificadas a partir del medio mediante elución con destiobiotina desde la resina de Streptactina.

El esquema de construcción de los ADN codificantes de proteínas de fusión se muestra en la figura 10. Se generó mediante PCR un fragmento Fc de IgG1 humana mutada (Armour et al., 2003) unido a la secuencia del péptido de señal (SigP) de CD52. Lo anterior incluía un conector GGSGG flexible y dos sitios de corte para las proteasas Precission y Factor Xa entre SigP y el fragmento Fc, y una secuencia de etiqueta Strep II para la purificación (Schmidt y Skerra, 2007) en el extremo del fragmento Fc. Los cebadores, tal como se designan en la figura 10, utilizados para generar y clonar los constructos de Fc, eran:

1F1: GAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCATCGAAGGTCGTGGTG (SEC ID n° 24),

1R1: TCATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGGCGCTTTTACCCGGAGACAG (SEC ID n° 25),

1F2: GGGGGTTCCGGGGGACTGGAAGTTCTGTTC (SEC ID n° 26),

1R2: CTTGATATCGAATTCTCATTTTTCGAACTG (SEC ID n° 27),

2F: CGCTGTTACGGATCCCCACCATGAAGCGCTTCCTC (SEC ID n° 28),

2R1: TCCACCGCTACCTCCTGAGGGGCTGCTGGT (SEC ID n° 29),

2R2: TCCACCGCTACCTCCTGAGAGTCCAGTTTG (SEC ID n° 30).

Se generó mediante PCR un constructo CD52-Fc que comprendía CD52 SigpY dominio extracelular (DEC) unidos al fragmento Fc. Los cebadores utilizados eran: 2F, 2R1, 1F2 y 1R2. Los productos de PCR se digirieron con BamHI/EcoRI y se ligaron en el vector lentivirus FTGW (Herold M.J. et al., 2008). Los clones también se verificaron mediante secuenciación. Las partículas de lentivirus se produjeron mediante transfección mediada por CaPO4 de células HEK293T sembradas en placas de 6 cm con 10 |jg de ADN de vector junto con tres plásmidos ayudante (pMDLRRE, pRSV-REV y pVSV-g). Se recogió el medio de cultivo celular que contenía virus 48 h después de la transfección y se pasaron a través de un filtro de 0,45 jm . Se utilizó un mililitro para transducir 1*106 células Daudi cultivadas en medio DME complementado con FCS al 10%, aminoácidos no esenciales 100 mM, glutamina 2 mM y 2-mercaptoetanol 5*10-5 M. Las células se cribaron para la expresión más elevada de proteína mediante tinción intracelular y citometría de flujo. Se purificaron proteínas CD52-Fc o Fc de control a partir del medio mediante cromatografía de afinidad de una sola etapa en resina Streptactina y elución con destiobiotina 2,5 mM en Tris-HCl 100 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la diálisis, la SDS-PAGE reveló bandas individuales con tinción de azul de Coomassie de tamaño predicho cuya especificidad se confirmó mediante transferencia de Western.

Ensayos para los efectos de las proteínas de fusión de Fc recombinantes

Se incubaron PBMC (2*105 célula/pocillo) o células T CD4+ purificadas (5*104 células/pocillo) en medio IMDM completo-suero humano agrupado inactivado por calor al 5%, en placas de 96 pocillos de fondo redondo con o sin 10 ufL/ml de TT y diferentes concentraciones de proteínas CD52-Fc o Fc, en un volumen total de 200 jl, a 37°C en 5% de CO²-aire durante hasta 7 días. Se añadió 3H-timidina (1 jCi/pocillo) y tras 18 h adicionales, se recolectaron las células y la radioactividad incorporada en el ADN se midió mediante recuento de centelleo. El medio se muestreó para el ensayo de las citoquinas tras 48 h de incubación. Se aislaron las células dendríticas (CD) a partir de las PBMC tal como se ha descrito (Mittag et al., 2011). Brevemente; las PBMC en primer lugar se enriquecieron para las CD mediante empobrecimiento de las perlas magnéticas marcadas con anticuerpos de marcadores de linaje (CD3, CD19 y CD56). A continuación, las células se tiñeron con los anticuerpos fluorescentes de HLA-DR, CD11c, CD1b/c, CD304 y CD14 y se separaron mediante flujo para purificar CD convencionales CD1b/c+HLA-DR+CD11c+, CD plasmacitoides CD304+HLA-DR+CD11c- y monocitos c D14+CD16-CD11c+. Las CD purificadas se preincubaron con CD52-Fc o proteína Fc a una concentración de 3,3 jM durante 30 min a 37°C y se lavaron dos veces. A continuación, se diluyeron en serie a partir de 6000 célula/pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y se incubaron con células T CD4+ marcadas con CFSE (5*104/pocillo) aisladas de un donante diferente. Tras 6 días, la respuesta de células T alogénicas se midió como frecuencia de células CFSElD en división determinada mediante citometría de flujo.

Tal como se ha indicado anteriormente, se cultivaron PBMC (200.000) con TT durante 7 días y las células T CD4+ purificadas (20.000) con anticuerpo anti-CD3 (100 ng/ml) y anti-CD28 (200 ng/ml) durante 48 h, con 4 veces el número de PBMC irradiadas en pocillos de fondo redondo de 200 jl, en presencia de proteína recombinante CD52-Fc o proteína de control Fc a las concentraciones indicadas. Se midió la incorporación de timidina-3H durante las 16 h finales de la incubación. Los resultados (medias±sem de réplicas por triplicado) son representativos de seis experimentos independientes.

Los medios de PBMC activadas con TT ± proteínas CD52-Fc o Fc 3,3 jM se muestrearon tras 48 h de incubación y se sometieron a ensayo para citoquinas mediante matriz de perlas multiplex.

Se incubó CD52-Fc (20 jg ) con o sin PNGasa F (1.000 unidades) en 20 j l de PBS durante la noche a 37°C a fin de escindir el carbohidrato unido a N, y la reacción se terminó mediante calentamiento a 75°C durante 10 min. Específicamente, la PNGasa F escinde los oligosacáridos unidos a asparagina entre dos subunidades de N-acetilglucosamina inmediatamente contiguas al residuo de asparagina para generar un carbohidrato truncado con un residuo N-acetilglucosamina remanente en la asparagina. Las PBMC se incubaron con TT y CD52-Fc tratadas o no tratadas (2,5 jM final) durante 7 días a 37°C y a continuación se midió la incorporación de timidina-3H tal como anteriormente.

Resultados

Con las PBMC, la respuesta proliferativa de las células T frente a TT se suprimió con CD52-Fc de una manera dependiente de la dosis (figura 11A), y CD52-Fc suprimió la secreción de las citoquinas tipificadoras de los diferentes linajes de células T (figura 11C). El efecto de CD52-Fc sobre la función de las células T era directo debido a que suprimió la proliferación de las células T CD4+ purificadas en respuesta al entrecruzamiento de receptores de las células T con el anticuerpo anti-CD3 y la coestimulación con el anticuerpo anti-CD28 (figura 11B). Se obtuvo evidencia de que CD52-Fc no requería células presentadoras de antígenos para la supresión de las células T mostrando que la exposición de las células dendríticas purificadas a CD52-Fc no afecta a su capacidad de inducir una respuesta de células T alogénicas (figura 13).

Tal como se muestra (figura 8D), la capacidad del anticuerpo CF1D12 de bloquear la supresión por CD52 nativo implica que la supresión podría estar mediada por la fracción carbohidrato de CD52. Con el fin de examinar su papel en CD52-Fc recombinante, el carbohidrato unido a N se escindió con la endoglucosidasa PNGasa F. Esto redujo el peso molecular de CD52-Fc de ~48 a -30 kDa tal como predecía la pérdida del carbohidrato y redujo su efecto supresor (figura 11D), confirmando el papel de la fracción carbohidrato en la mediación del efecto supresor de CD52 soluble. Ejemplo 13: análisis adicional de la función del carbohidrato de CD52

M étodos

A fin de explorar adicionalmente el papel de la fracción carbohidrato CD52 en la mediación de la supresión de las células T, se incubó CD52-Fc (3,3 j M) con neuraminidasa (1 unidad) o tampón portador únicamente en 20 j l durante 30 min a 37°C según recomendación del proveedor. A continuación, las PBMC se incubaron con TT ± CD52-Fc tratada con neuraminidasa o no tratada (3,4 j M final) en una placa ELISpot y se revelaron tras 24 h a 37°C para manchas de IFN-y.

Por separado, se incubaron PBMC en una placa ELISpot con TT y CD52-Fc (3,4 j M) y diferentes concentraciones de anticuerpo de cabra purificado por afinidad del dominio extracelular de Siglec-10 o Fc (3,4 j M) ± anticuerpo, o diferentes concentraciones de Siglec-10-Fc recombinante antes de transferir las células no adherentes a una placa ELISpot durante 24 h antes del revelado de las manchas de IFN-y.

Con el fin de investigar la posibilidad de que CD52 soluble pueda actuar mediante otros receptores de Siglec diferentes de Siglec-10, se incubaron células T c D4+ (20.000) en pocillos de placa ELISpot por triplicado a 37°C con TT, junto con CD52-Fc o Fc (3,4 j M cada uno) y anticuerpo anti-Siglec humano (10 jg/m l cada uno) o Siglec 2-Fc humano recombinante (20 jg/ml), tal como se indica en la figura 12E. Tras 20 h, se lavaron los pocillos y se revelaron para manchas de IFN-y.

Resultados

El tratamiento con neuraminadasa para eliminar los ácidos siálicos terminales redujo la supresión por CD52-Fc (figura 12A). La estructura compleja de polilactosamina del carbohidrato CD52 se propone que termina en ácidos siálicos a2-6 y posiblemente a2-3 que decoran la galactosa en enlace (31-4 con N-acetilglucosamina (Treumann et al., 1995). Dicha secuencia de sialósido resulta reconocida por el ácido siálico de unión a lectina-10 de tipo Ig (Siglec-10), un receptor transmembranal de superficie celular y miembro de superfamilia de inmunoglobulinas que porta dos motivos inhibidores basados en tirosina de inmunorreceptor citoplasmático (ITIM) (Munday et al., 2001; Crocker et al., 2007). Aunque Siglec-10 no ha sido detectado sobre las células T del ratón (Crocker et al., 2007) y algunas otras Siglec no se expresan sobre las células T humanas (Nguyen et al., 2006), los presentes inventores han encontrado que Siglec-10 se expresa sobre las células T CD4+ y se encuentra regulado positivamente mediante activación (figura 12B). Notablemente, la supresión de la función de las células T por CD52-Fc se vio reducida por el anticuerpo del dominio extracelular de Siglec-10 (figuras 12C-12E) o por Siglec-10-Fc recombinante soluble (figura 12D). Las mismas concentraciones de Siglec-10-Fc también redujeron la supresión por células T CD4+ CD52hi (datos no mostrados), indicando que tanto CD52 recombinante como nativo reconocen Siglec-10. La supresión de células T por CD52-Fc no se redujo en la misma medida por anticuerpos de otros Siglec diferentes de Siglec-10 o por Siglec-2-Fc humano recombinante. Estos resultados muestran que la supresión por CD52 podía explicarse, como mínimo en parte, por su interacción con Siglec-10.

Ejemplo 14: las células T CD52hi protegen frente a la enfermedad autoinmune.

Materiales y métodos:

Ratones

Se criaron ratones C57/B16, NODLt y RIP.B7/ NODSCID y se mantuvieron en el Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. Los ratones transgénicos TCR de clase I restringida específicos de OVA (Hogquist et al., 1993) y transgénicos TCR de clase II restringida específicos de OVA (Bamden et al., 1998) han sido descritos anteriormente. Los ratones informadores Foxp3GFP fueron proporcionados por el Dr Yifan Zhang.

Reactivos, anticuerpos y citometría de flujo

Se cultivaron células en medio RPMI suplementado con FCS al 10%, 1:100, suplemento GIBCO™ GlutaMAX™-I (Invitrogen), 1:1000 2-mercaptoetanol (Sigma), 1:100 NEAA (Gibco). Se obtuvieron anticuerpos monoclonales anti-CD52 de MBL International, clon BTG-2, conjugados con PE o no marcados. El anticuerpo policlonal anti-CD52 obtenido de Santa Cruz Biotechnology, Inc (sc27555) se utilizó para el análisis de transferencia western. Los anticuerpos monoclonales anti-CD4 (L3T4, clon GK1.5) y anti-CD8a (Ly-2, clon 53-6.7) se obtuvieron de eBiosciences. El anticuerpo anti-CD25 (clon 3c7) se obtuvo de BioLegend. El kit de tinción FoxP3 de anticuerpo de CD3-FITC se obtuvo de eBioscience. Los anticuerpos monoclonales anti-CD3 (clon 2c11), anti-CD28 (clon 37.51) y de control de isotipo eran de WEHI Monoclonal Antibody Lab. Los análisis de citometría de flujo se llevaron a cabo en un FACSAria con el software FACS Diva. Las células se separaron con un separador celular MoFlow (Cytomation, Fort Collins, CO). Aislamiento de células

Se recolectaron bazos y se pasaron por una malla de 70 jm , se trataron con tampón de lisis de eritrocitos y se lavaron. Para la activación de las células, se cultivaron esplenocitos en anti-CD3 unido a placa (2 jg/m l) más anti-CD28 soluble (1 jg/m l) durante 3 días. Se incubaron esplenocitos OTI o OTII con 0,5 jg/m l de péptido OTI o 5 jg/m l de OTII durante 4 días antes de los análisis. Para los experimentos de separación celular, se marcaron esplenocitos no expuestos o esplenocitos activados procedentes de ratones C57/B16, OTI u OTII, NODLt o Foxp3-GFP, con CD3-FITC (eBioscience), CD4-APc (eBioscience), CD8-APC (eBioscience) y CD52-PE (MBL International). Las células marcadas se separaron con un citómetro MoFlow y la pureza era de ~95%. Las células aisladas se utilizaron para la purificación del ARN, para ensayos de proliferación de células T o para experimentos in vivo.

Ensayos de proliferación

Se cultivaron células T CD4+CD52hi o CD8+CD52hi no expuestas o activadas (2*104, en experimentos de transpocillos, 1*105) con células T CD4+CD52lD o CD8+CD52lD en una proporción de 1:1 y se estimularon con 1 pg/ml de anti-CD3 soluble (2c11) más (8*104, e experimentos de transpocillos, 4*105) células T irradiadas empobrecidas en APC (dosis de radiación de 2000 rad). Se introdujeron transpocillos de 0,4 pM (Corning, insertos transpocillo de membrana de policarbonato, n° de cat. 3413) entre celdas. En experimentos de bloqueo, se añadieron 15 pg/ml de anti-CD52 (IgG2a de rata, MBL International) o control de isotipo. Se llevaron a cabo ensayos de proliferación durante 72 h en placas de fondo redondo de 96 pocilios en un volumen final de 200 pl de medio RpMI que contenía suero de feto bovino al 10%. Se añadió 1 pCi/pocillo de timidina-[3H] durante las últimas 10 horas del experimento y se midió la incorporación de timidina mediante recuento de centelleo. Alternativamente, se utilizaron células respondedoras marcadas con CFSE como lectura de proliferación. Se resuspendieron esplenocitos no expuestos o células T CD4+CD52lD o CD8+CD52lD en PBS caliente BSA al 0,1% en un número de células de 10*10® por ml. Se añadió CFSE 5 pM y se resuspendieron rápidamente. Las células se incubaron a 37°C durante 5 min antes de lavarlas 3 veces con tampón frío que contenía por lo menos BSA al 10% o FCS. Las células respondedoras incubadas con CFSE se incubaron con células T CD4+CD52hi o CD8+CD52hi (más controles adicionales) durante hasta 7 días y se analizaron mediante FACS Aria.

Ensayo de dos colores

Se tiñeron células T CD4+CD52hi o CD8+CD52hi con el marcador de división celular PKH.26 (Sigma) siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. Brevemente, hasta 1x107 células se resuspendieron en Diluyente C (proporcionado por el kit) y se mezclaron con PKH.26 2 pM durante 4 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con tampón que contenía por lo menos FCS al 10%. Las células T CD4+CD52hi o CD8+CD52hi respondedoras se tiñeron con CFSE tal como se ha indicado anteriormente. Las células se cultivaron solas o juntas durante 4 a 6 días.

RT-PCR en tiempo real

Se preparó ARN total a partir células T separadas utilizando el kit RNeasy de Qiagen. Se sintetizó el ADNc utilizando cebadores oligo-dT (Qiagen, 0,4 pg/pl) y transcriptasa inversa M-MLV (4000 U, Applied Biosystems), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se llevó a cabo una RT-PCR en tiempo real en un ciclador ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems) utilizando un kit de PCR Quantitect SYBR Green (Qiagen, n° de cat. 204143) y cebadores específicos optimizados para amplificar fragmentos de 100 a 150 pb de diferentes genes. Se fijó un umbral en la parte lineal de la curva de amplificación y se calculó el número de ciclos necesario para alcanzar el umbral para cada gen. Se determinó la expresión relativa de ARNm mediante normalización respecto a un gen de referencia (b-actina o RPS9).

Las secuencias de cebador eran:

CD52

FORW- GTT GTG ATT CAG ATA CAA ACA GGA (SEC ID n° 31)

REV- AGG TAT TGG CAA AGA AGA GGA A (SEC ID n° 32)

IL-2

FORW - TCA AGC TCC ACT TCA AGC TCT AC (SEC ID n° 33)

REV- CCT GTA ATT CTC CAT CCT GCT C (SEC ID n° 34)

IL-4

FORW - TGA GAG AGA TCA TCG GCA TTT T (SEC ID n° 35)

REV- CTC TCT GTG GTG TTC TTC GTT G (SEC ID n° 36)

IL10

FORW - TCG GAA ATG ATC CAG TTT TAC C (SEC ID n° 37)

REV- ATC CTG AGG GTC TTC AGC TTC (SEC ID n° 38)

IL-13

FORW - GAG-CTG-AGC-AAC-ATC-ACA-CAA (SEC ID n° 39)

REV - AATCCAGGGCTACACAGAACC (SEC ID n° 40)

FoxP3

FORW - ATG-TTC-GCC-TAC-TTC-AGA-AAC-C (SEC ID n° 41)

REV - CAA-ATT- CAT- CTA- CGG-TCC-ACA-C (SEC ID n° 42)

CD127

FORW - GCC CAC CAG AAA CAG TTA GAA G (SEC ID n° 43)

REV - AGT CAG GGG ACC TAG AGG AAA G (SEC ID n° 44)

CTLA-4

FORW - AGT TTC CTG GTC ACT GCT GTT T (SEC ID n° 45)

REV - TTT TCA CAT TCT GGC TCT GTT G (SEC ID n° 46)

FASLG FORW - CGG-TGG-TAT-TTT-TCA-TGG-TTC-T (SEC ID n° 47)

REV - TGA-TAC-TTT-AAG-GCT-TTG-GTT-GG (SEC ID n° 48)

TGFbl

FORW - TAT TGC TTC AGC TCC ACA GAG A (SEC ID n° 49)

REV - CAG ACA GAA GTT GGC ATG GTA G (SEC ID n° 50)

TGFb2.

FORW - TAA GAG GGA TCT TGG ATG GAA A (SEC ID n° 51)

REV - CTG AGG ACT TTG GTG TGT TGA G (SEC ID n° 52)

IFNg

FORW - CAA-AAG-GAT-GGT-GAC-ATG-AAA-A (SEC ID n° 53)

REV - TTG CTG TTG CTG AAG AAG GTA G (SEC ID n° 54)

IL-12alfa

FORW - TCA CGC TAC CTC CTC TTT TTG G (SEC ID n° 55)

REV - CAT CTG TGG TCT TCA GCA GGT TT (SEC ID n° 56)

Ebi3

FORW - CCT TCC CGG ACA TCT TCT CTC T (SEC ID n° 57)

REV - GCA ATA CTT GGC ATG GGG TTT (SEC ID n° 58)

RARA FORW - GGA CAA GAA CTG CAT CAT CAA C (SEC ID n° 59)

REV - GCT TGG GTG CCT CTT TCT TC (SEC ID n° 60)

GITR FORW - CCT-AGG-TCA-GCC-GAG-TGT-AGT-T (SEC ID n° 61)

REV - CAC-ATA-TGC-ACC-TTT-CTT-TTG-G (SEC ID n° 62)

GRANZMB FORW - TCC TTA TTC GAG AGG ACT TTG TG (SEC ID n° 63)

REV - CTG GGT CTT CTC CTG TTC TTT G (SEC ID n° 64)

ALDH1A2

FORW - ACA GGA GAG CAA GTG TGT GAA G (SEC ID n° 65)

REV - TCC ACA CAG AAC CAA GAG AGA A (SEC ID n° 66)

ACTINA FORW - GAT CTG GCA CCA CAC CTT CT (SEC ID n° 67)

REV - GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA (SEC ID n° 68)

Transferencia adoptiva de esplenocitos empobrecidos en CD52hl a NOD receptores

Se inyectaron i.v. en ratones receptores, esplenocitos totales empobrecidos en CD52hi o esplenocitos empobrecidos en células T CD3+, CD4+ o CD8+CD52hi. Los ratones receptores eran ratones NOD macho irradiados (ratones NOD macho de 8 semanas de edad, dosis de irradiación: 750 rad, 4 horas antes de la transferencia de 1 a 1,2x107 células) o ratones RIP.B7/NOD.SCID de 8 semanas de edad que recibieron 2x106 células. Se monitorizaron los ratones para signos de diabetes, midiendo la glucosa en orina 3 veces a la semana utilizando Diastix de Bayer. En el caso de que la glucosa urinaria exceda de 20 mM, se mide la glucosa en sangre. Los ratones se consideran diabéticos en el caso de que lecturas consecutivas de glucosa en sangre sean superiores a 20 mM de glucosa.

Puntuación de insulitis

Se sacrificaron ratones 4 semanas después de la transferencia adoptiva de células. Se recolectaron los páncreas y se fijaron durante la noche en solución de bouin y después se transfirieron a etanol al 70%. Los páncreas fijados se incluyeron en bloques de parafina, se cortó un mínimo de 12 secciones de 8 pm separadas por lo menos por 150 pm. Las secciones se tiñeron con hematoxilina-eosina y se evaluaron para la incidencia y severidad de la insulitis bajo microscopía óptica de manera independiente por dos investigadores. Se observó un mínimo de 10 islotes de cada ratón y se puntuó el grado de infiltración de células mononucleares utilizando la clasificación siguiente: 0=infiltración nula; 1=infiltrado periductal; 2=infiltrado peri-islote; 3=infiltrado intraislote; 4=destrucción de células beta.

Resultados

La transferencia de linfocitos esplénicos empobrecidos en CD52hi procedentes de ratones NOD de 8 semanas de edad en ratones NOD-sci condujo a la rápida aparición de diabetes; las células no empobrecidas no presentaron ningún efecto (figura 14). La transferencia de células T CD3+ empobrecidas en CD52hi aceleró la aparición de la diabetes, aunque no resultó tan eficiente como el empobrecimiento de los linfocitos totales en células CD52hi (figura 15). De esta manera, se mostró que los linfocitos CD52hi protegen frente a la diabetes autoinmune.

Ejemplo 15: la frecuencia de las células T CD52hi CD4+ generadas en respuesta a la estimulación por GAD65 es deficiente en la diabetes de tipo 1.

M étodos

Se cultivaron con GAD65 o TT, PBMC teñidas con CFSE, durante 7 días antes de determinar la frecuencia de las células T CD4+ CD52hi mediante análisis de citometría de flujo.

Resultados

Los individuos con diabetes de tipo 1 o en riesgo de sufrirla presentan menos células T CD4+ CD52hi que individuos sanos en respuesta a GAD65, pero no a TT (figura 16). La barra horizontal es la mediana de cada grupo. Los valores de P globales de análisis de la varianza se determinaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis; a continuación, las pruebas de comparaciones múltiples de Dunn revelaron diferencias significativas entre tanto pre-DT1 como DT1 en comparación con sanos o DT2 con P<0,05.

Ejemplo 16: supresión de células T por células T CD4+ CD52hi generadas en respuesta a GAD65 es deficiente en la diabetes de tipo 1 preclínica.

Métodos

Se incubaron con GAD65 durante 7 días PBMC marcadas con CFSE de individuos con autoanticuerpos de células de los islotes en riesgo de diabetes de tipo 1 y se separaron en células T CD4+ CD52hi y CD52lD siguiendo los métodos descritos en la presente memoria. Las células separadas (5.000) se incubaron en placas ELISpot con PBMC irradiadas (20.000).

Resultados

Tal como se muestra en la figura 17, la función supresora de las células CD4+ CD52hi generada en respuesta a GAD65 es deficiente en comparación con la función supresora de las células CD4+ CD52hi generada en respuesta a TT. Los resultados son representativos de 6 individuos en riesgo. De esta manera, la función supresora de las células CD4+ CD52hi es deficiente en DT1 preclínica.

Ejemplo 17: CD52 soluble reduce drásticamente los niveles de glucosa en sangre en ratones NOD.

Métodos

Se monitorizaron ratones NOD hembra mediante ensayos semanales para glucosa urinaria y se diagnosticó diabetes en los ratones con una prueba en orina positiva con una concentración de glucosa en sangre >14 mM. En cuanto se confirmó la hiperglucemia, los ratones recibieron CD52-Fc o Fc, 20 |jg i.p., seis dosis en días alternos, y a continuación se monitorizaron sus concentraciones de glucosa sanguínea dos veces a la semana.

Resultados

Se mostró que CD52-Fc soluble reducía los niveles de glucosa en sangre (figura 18). Tal como se muestra, la administración de CD52-Fc presentó un efecto rápido y significativo de reducción de los niveles sanguíneos de glucosa, demostrando la idoneidad de CD52 soluble como terapéutico para el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como la diabetes de tipo 1.

Ejemplo 18: desarrollo de diabetes en ratones NOD-SCID tras la transferencia desde ratones NOD diabéticos de esplenocitos tratados ex vivo con CD52_h-Fc o Fc.

Métodos

Se inyectaron 5x106 esplenocitos NOD diabéticos tratados con CD52_rh Fc- o Fc en ratones NOD.SCID. Los esplenocitos procedentes de ratones diabéticos hembra se aislaron y se incubaron con 50 jg/m l de CD52 recombinante humana-Fc o proteína Fc durante 1,5 h en 'tampón de CD52' (solución salina tamponada con Tris 2 mM de MgCh, CaCh y MnCh 5 mM de glucosa suero de ratón al 1%). Las células se resuspendieron en PBS y se inyectaron 1x107 células en ratones NOD-SCID macho (12 en cada grupo).

Resultados

El tratamiento de los esplenocitos procedentes de ratones NOD diabéticos ex vivo con CD52-Fc resultó en un incremento de la supervivencia sin diabetes en ratones NOD.SCID en los que se habían implantado esplenocitos tratados (figura 19). Hay evidencia todavía adicional de la utilización terapéutica de CD52 soluble para el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como la diabetes de tipo 1.

Ejemplo 19: CD52-Fc humana suprime las células OT-II de ratón.

M étodos

Las células T CD4 (OT-II) transgénicas para TCR específicas para ovoalbúmina (Ova) de ratón son un modelo conveniente para el ensayo de la supresión inmunitaria, ya que aproximadamente la mitad de las células T CD4 son específicas para la ovoalbúmina y, por lo tanto, las respuestas de células T son fuertes y predecibles. Se incubaron esplenocitos (1*105) procedentes de ratones OT-II hembra de 10 semanas de edad durante 3 días en placas de 96 pocillos de fondo redondo en 200 ml de medio RPMI-1640 que contenía FCS al 5% y las concentraciones indicadas en la figura 20 de proteína o péptido ova, o anticuerpo anti-CD3 (clon 2C-11) y CD52 humano recombinante-Fc o proteína Fc. Se midió la incorporación de timidina-3H durante las 16 h finales del cultivo. Los resultados son de medias±sem de réplicas por triplicado.

Resultados

Tal como se muestra en la figura 20, CD52-Fc redujo significativamente la proliferación de las células T en respuesta a la estimulación con proteína o péptido ova de una manera dependiente de la dosis, proporcionando evidencia adicional del potencial terapéutico de CD52 soluble en el tratamiento de las enfermedades autoinmunes.

Ejemplo 20: CD52 soluble derivado de líquido seminal suprime la proliferación de las células T humanas.

Métodos

Se identificó CD52 en muestras de semen humano mediante la utilización del protocolo de ELISA siguiente. Inicialmente, se centrifugó líquido seminal (LS) a 500g durante 5 min para sedimentar el esperma, confirmado mediante inspección microscópica del sobrenadante. Se utilizó anticuerpo anti-CD52 humano (Biolegend n° 338202) como el agente de captura (1:100 en PBS; 50 pl/pocillo durante la noche, 4°C). Los pocillos se lavaron 3 veces en PBS-Tween al 0,01%, seguido de 3 veces en Pb S. Se utilizó una solución de BsA al 5%/PBS (BSA, Sigma A7906) para bloquear los pocillos (200 pl/pocillo, 1 h a temperatura ambiente (TA)). El lavado se llevó a cabo tal como anteriormente. Se incluyeron pocillos de blanco a modo de controles. Las muestras de semen se diluyeron en BSA al 5%/PBS y se añadieron a razón de 50 pl/pocillo. Las muestras se incubaron en los pocillos durante 3 h a TA. El lavado se llevó a cabo tal como anteriormente. Para la detección, se utilizó mAb-HRP Campath en una proporción 1:1000 en BSA al 5%/PBS (100 pl/pocillo, 1 h a TA). El lavado se llevó a cabo tal como anteriormente. Se añadió 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) y las placas se luyeron a 450 nm.

Se llevó a cabo el inmunoempobrecimiento de CD52 siguiendo el protocolo siguiente. Se prepararon alícuotas de 200 pl de proteína G-sefarosa en 2 tubos Eppendorf, seguido de lavado x2 con 1 ml de PBS; se descartó el sobrenadante. Se añadieron 5 mg de mAb Campath a un Eppendorf y 5 mg de 'Octagam' (inmunoglobulina humana agrupada) al otro. Los tubos se hicieron girar durante 1,5 h a 4°C, seguido de lavado x3 con 1 ml de PBS cada vez. Se descartaron los sobrenadantes. Se añadieron 500 pl de PBS, se mezclaron bien y las muestras se dividieron uniformemente en 5x tubos Eppendorf para cada muestra. Los tubos que contenía Campath y Octagam se centrifugaron y se descartaron los sobrenadantes. Se añadieron las muestras de semen a los tubos apropiados (5x diferentes muestras de semen), es decir, semen 160 pl 160 pl de PBS, seguido de rotación durante la noche a 4°C. Se centrifugaron los tubos y se recogieron los sobrenadantes para la utilización en ensayos de células T a razón de 1:20 (ya diluido 1:2; por lo tanto, 1:10 en el ensayo).

Se midió la proliferación de las células T en respuesta al antígeno (TT) en PBMC procedentes de donantes sanos, mediante dilución del pigmento CFSE (Mannering et al., 2003). Las células marcadas con CFSE (2x105/pocillo, 100 pl) se cultivaron en placas de 96 pocillos de fondo redondo en réplicas de 6 con medio solo o con TT ± mAb anti-CD52 CF1D12 (concentración final: 20 pg/ml). El último se añadió a 0 o 20 h; el último tiempo permitió el inicio de la activación de las células T, dado que el receptor de CD52 soluble, Siglec-10, se demostró que se regulaba positivamente con la activación (figura 12B). También se incluyeron células no teñidas y se utilizaron para fijar las compensaciones en el citómetro de flujo. Se calculó el índice de división celular (IDC) como la proporción entre el número de células CD4+ CFSEdim divididas por cada 20.000 células CD4+ CFSEbright no divididas en presencia de antígeno respecto al número de células CD4+ CFSEdim divididas por cada 20.000 células CD4+ CFSEbright no divididas en ausencia del antígeno.

Resultados

La figura 21 ilustra la presencia de CD52 soluble en 26 muestras de muestra en las diluciones en serie. Generalmente, el semen contiene niveles elevados de CD52 soluble que se redujeron a cero tras varias diluciones log.

Tal como se muestra en la figura 22, el antígeno (TT) por sí solo incrementó drásticamente la proliferación de las células T (ver la columna de 'Sin semen' en la figura 22). Sin embargo, dicho efecto se redujo significativamente en presencia de semen (ver 'TT' para las muestras de semen n° 1 y n° 5 en la figura 22). Una sola ronda de inmunoempobrecimiento de CD52 utilizando el anticuerpo anti-CD52 Campath revertió parcialmente el efecto inhibidor del semen (ver las columnas 'Campath TT' para las muestras de semen n° 1 y n° 15 en la figura 22). No se observó una reversión significativa con las muestras inmunoempobrecidas de IgG de control.

Tal como se muestra en la figura 23, el antígeno (TT) por sí solo incrementó drásticamente la proliferación de las células T (ver ls columna de 'Sin semen' en la figura 23). La adición del anticuerpo anti-CD52 CF1D12 incrementó adicionalmente la proliferación de células T. Sin embargo, en presencia de semen, la proliferación de las células T se redujo drásticamente (ver 'TT' en las muestras de semen n° 14, n° 20 y n° 22 en la figura 23). De esta manera, el semen incrementa la proliferación no estimulada por antígeno y reduce la proliferación estimulada por antígeno. La adición del anticuerpo anti-CD52 CF1D12 revierte parcialmente el efecto inhibidor del semen.

De esta manera, CD52 soluble derivado de semen consiguió el mismo efecto supresor de la función de las células T efectoras (ejemplificado en el presente ejemplo mediante la proliferación de las células T) como CD52 soluble derivado de linfocitos, demostrando que pueden encontrarse presentes fracciones carbohidrato alternativas en la glucoproteína soluble dada a conocer en la presente memoria sin reducir su función inhibidora.

Ejemplo 21: efectos de CD52-Fc sobre los monocitos.

Métodos y resultados

Se cultivaron células THP-1 (línea celular de leucemia monocítica aguda humana) en medio RPMI-1640 suplementado con FCS al 10%, glutamina 2 mM y 2-mercaptoetanol 50 pM. Las células se sembraron a razón de 2 x l05/pocillo en IMDM que contenía 5% de suero humano inactivado por calor agrupado, aminoácidos no esenciales 100 mM, glutamina 2 mM y 2-mercaptoetanol 50 pM (medio IP5) a 37°C bajo 5% de CO².

Las células se incubaron con dosis diferentes de CD52-Fc o Fc de control en presencia de LPS (100 ng/ml) durante 24 h. Se recogió el medio y se midió la concentración de IL-1p mediante ELISA. El resultado de este experimento se resume en la figura 24:

En un experimento adicional, las células se incubaron con dosis diferentes de CD52-Fc o Fc de control en presencia de agonista de TLR-2 Pam3CSK (100 ng/ml) durante 24 h. A continuación, se recogieron los medios y se midió la concentración de IL-1p mediante ELISA. El resultado de este experimento se resume en la figura 25:

Las células THP-1 también se diferenciaron durante 3 h con forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) 500 nM. A continuación, las células se lavaron y se sembraron a razón de 2 x 105/pocillo en medio IP-5 y se incubaron durante la noche a 37°C bajo 5% de CO². A la mañana siguiente, se cambió el medio y las células se incubaron con CD52-Fc o Fc de control (50 pg/ml) en presencia de alúmina (100 pg/ml) durante 16 horas. Se recogió el medio y se midió la concentración de IL-1p mediante ELISA. El resultado de este experimento se resume en la figura 26:

Se diferenció médula ósea de ratones C57/B6 de 10 semanas de edad durante 7 días en factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (10 ng/ml) en medio KDS-RPMI-FCS al 10%. Se recogieron las células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC), se lavaron y se sembraron a razón de 2x104/pocillo en una placa de 96 pocillos. Las células se incubaron con 40 pg/ml de CD52-Fc o PBS de ratón (control) en presencia de LPS (800 ng/ml), CPG (0,8 pM) o Listeria monocytogenes (8x106/pocillo). Además, las células se sensibilizaron durante 3 h con LPS (100 ng/ml) y después se estimularon con los agonistas del inflamasoma conocidos, urato monosódico (MSU) (150 pg/ml), alúmina (150 pg/ml) y nigericina (1 pM). Tras 24 h, se recogieron los medios y se midieron las concentraciones de las citoquinas mediante ensayo de matriz de citoquinas multiplex. Los resultados de este experimento con IL-1 p se resumen en la figura 27. Se obtuvieron resultados similares para IL-1 a, TNF-a, MCP-1, IL-6, IL-9 e IL-12 (datos no mostrados).

Se incubó CD52-Fc de ratón (250 pg) con neuraminidasa de Arthrobacter ureafaciens (2 unidades) o tampón de reacción (fosfato sódico 250 mM, pH 6,0) a 37°C durante la noche y la reacción se terminó mediante calentamiento a 75°C durante 5 minutos. Se incubaron las células THP-1 con CD52_m-Fc tratada con tampón de reacción o neuraminadasa (final: 12,5 pg/ml) en presencia de LPS (100 ng/ml) durante 24 h. Se recogieron los medios y la concentración de IL-1p se midió mediante ELISA. El resultado de este experimento se resume en la figura 28:

Se trató CD52-Fc de ratón (300 pg) con o sin PNGasa-F bajo las mismas condiciones, siguiendo las instrucciones del fabricante (BioLabs Inc.). La eliminación del oligosacárido unido a N con reducción del peso molecular de CD52-Fc se confirmó mediante SDS-PAGE y tinción de azul de Coomassie. A continuación, las soluciones de proteínas se desalaron mediante diálisis frente a agua estéril pura. Las células THP-1 se sembraron a razón de 2x105/pocillo en medio IP5 y se incubaron con CD52-Fc tratado (final: 30 pg/ml) o CD52 glucosilado-Fc en presencia de 100 ng/ml de LPS durante 24 h. Se recogieron los medios y la concentración de IL-1p se midió mediante ELISA. El resultado de este experimento se resume en la figura 29:

Comentario

En respuesta a un abanico de estímulos inflamatorios, CD52-Fc suprime de manera dependiente de la dosis la secreción de IL-1p por la línea de monocitos THP1 humana y por células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón. Además, tal como se muestra para las células T, dicho efecto supresor de CD52-Fc depende de su fracción oligosacárido debido a que resultó anulada por el tratamiento previo de CD52-Fc con neuraminidasa para eliminar los ácidos siálicos terminales con PNGasa-Fc para eliminar el oligosacárido unido a N mismo. Estos resultados demuestran que los efectos supresores de CD52-Fc mostrados para las células T se extienden a otros tipos celulares que participan en la inmunidad innata y, nuevamente de manera similar a las células T, presumiblemente se encuentran mediados por un receptor de Siglec.

Ejemplo 22: CD52-Fc mejora la sepsis in vivo.

Métodos y resultados

Una única inyección de endotoxina, o lipopolisacárido (LPS), es el modelo más comúnmente utilizado de choque séptico en animales experimentales. En general, la inyección de un bolo de LPS induce un incremento muy rápido, aunque transitorio, de las concentraciones sistémicas de citoquinas que alcanza un máximo tras 1,5 a 4,5 h y después cae. La inyección de un bolo de dosis baja de LPS en voluntarios humanos sanos produce alteraciones fisiopatológicas similares a las observadas en pacientes con sepsis.

A fin de determinar su potencial terapéutico en la sepsis, se administró CD52-Fc de ratón (200 |jg i.v.) en ratones C57B1/6 hembra de 10 semanas de edad simultáneamente o después de LPS (300 jg i.p.). Dos horas después, se muestreó sangre a partir del plexo venoso retroorbital y/o el corazón (tras asfixia inducida por CO²) para la medición de las citoquinas plasmáticas mediante ensayo de matriz de perlas Luminex®.

Tal como se muestra en la figura 30, la administración de CD52-Fc de ratón suprime significativamente las concentraciones plasmáticas de múltiples citoquinas/quimioquinas en respuesta a LPS.

En ratones C57/B1 hembra de 10 semanas de edad se inyectó LPS (300 jg ) i.p. en 0 min. Se inyectó CD52-Fc (200 jg ) i.v. en 0 min o en 30, 60 o 90 min. A los 120 min, los ratones fueron asfixiados con CO²y se muestreó su sangre del corazón para la medición de IL-6 plasmático mediante el ensayo de matriz de perlas Luminex®. Para IL-6 (resultados no mostrados), todavía se observó un efecto supresor al retrasar la administración de CD52-Fc durante hasta 60 min después de la administración de LPS. De esta manera, se ha mostrado que CD52 produce un efecto terapéutico exitoso en el tratamiento de la sepsis in vivo.

Ejemplo 23: CD52 protege frente al desarrollo de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE)

Métodos y resultados

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es na enfermedad inflamatoria dependiente de las células T inducida por la inmunización contra la glucoproteína de la mielina de oligodendrocitos (MOG), reforzada por la toxina "pertussis". Se utilizan las características clínicas para gradar la gravedad de la enfermedad (produciendo una puntuación clínica) tras la inmunización. Se utilizan comúnmente los modelos de ratón de EAE como modelos de esclerosis múltiple en seres humanos. En la presente memoria, se utilizaron ratones C57BL/6 para generar una inactivación condicional de CD52 mediante recombinación homóloga dirigida de sitios lox-p (CD52m) flanqueantes del exón 2 del gen de CD52, con un constructo proporcionado por Ozgene (Australia). Paragenerar una inactivación selectiva de células T, se criaron ratones CD52m hasta la heterocigosidad con el transgén Cre bajo el control del promotor específico de las células T, Ick, a fin de generar la cepa CD52mlckJI+. Como controles se utilizaron ratones CD52m y de tipo salvaje. Los ratones fueron inmunizados con MOG 35-5 (dosis total: 200 jg/ratón; proporcionado por Mimotopes (Australia)) emulsionado en adyuvante de Freund completo (2,5 mg/ml de M. tuberculosis, proporcionados por Sigma Pharmaceuticals (Australia)) mediante dos inyecciones subcutáneas de 100 j l en los flancos posteriores. Los ratones también recibieron 300 ng de toxina Pertussis (proporcionada por Sigma Pharmaceuticals (Australia)) mediante una inyección i.v. el día de inmunización con MOG mediante una segunda inyección i.v. 2 días después. Tal como se muestra en la figura 31, los ratones con células T deficientes en CD52 (fl/fl T/+) mostraban una enfermedad clínica más grave que los ratones de control. Este resultado demuestra que CD52 presente sobre células T (o secretado a partir de las mismas) regula las respuestas inmunitarias in vivo y que, por lo tanto, puede utilizarse una composición farmacéutica que comprende CD52 tal como se indica en la presente memoria para regular negativamente las respuestas inmunitarias en un contexto terapéutico. Por ejemplo, puede utilizarse una composición farmacéutica que comprende CD52 tal como se indica en la presente memoria para tratar los trastornos inflamatorios dependientes de células T, tales como EAE y la esclerosis múltiple.

REFERENCIAS

Allan et al. (2007). Int. Immunol. 19: 345-354.

Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215: 403410

Armour (2003) Mol. Immunol. 40: 585-93.

Bach et al (1997) J Autoimmun 10:375-386.

Barnden et al. (1998) Immunol. Cells Biol. 76: 34.

Belov et al. (2003) Proteomics 3: 2147-2154.

Bergerot et al. (1994) J. Autoimmun. 7: 655-663.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más cualesquiera de entre:

i) una glucoproteína CD52 soluble,

ii) una proteína de fusión que comprende glucoproteína CD52 soluble como primera proteína, y una segunda proteína,

iii) un polinucleótido codificante de la parte peptídica de la glucoproteína CD52 soluble de la parte i) o la proteína de fusión de la parte ii),

iv) un vector que comprende el polinucleótido de la parte iii),

v) una célula aislada que comprende el polinucleótido de la parte iii) o el vector de la parte iv), vi) una composición farmacéutica que comprende uno o más cualesquiera de i) a v) y un portador farmacéuticamente aceptable,

para la utilización en el tratamiento o la prevención de la sepsis.
2. Glucoproteína CD52 soluble, proteína d efusión, polinucleótido, vector, célula o composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 1, en la que la glucoproteína CD52 soluble comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de uno o más cualesquiera de entre GQNDTSQTSSPS (SEC ID n° 3), SQNATSQSSPS (SEC ID n° 4), GQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKS (SEC ID n° 5), GQNSTAVTTPANKAATTAAATTKAAATTATKTTTAVRKTPGKPPKA (SEC ID n° 6) o GNSTTPRMTTKKVKSATPA (SEC ID n° 7) y un carbohidrato, en el que la parte carbohidrato de la glucoproteína CD52 soluble está unida a asparagina.
3. Glucoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula o composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 1 o 2, en la que la parte carbohidrato de la glucoproteína CD52 soluble se une al residuo de asparagina (N) en la SEC ID n° 3.
4. Glucoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula o composición farmacéutica para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la parte carbohidrato de la glucoproteína CD52 soluble es cualquier carbohidrato que es conocido que se una a la parte extracelular de la glucoproteína CD52 soluble en una célula huésped, tal como un linfocito huésped o una célula del tracto genital del huésped.
5. Glucoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula o composición farmacéutica para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la parte carbohidrato de la glucoproteína CD52 soluble comprende uno o más azúcares biantenarios, triantenarios o tetraantenarios, que pueden encontrarse terminalmente sialilados.
6. Proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula o composición farmacéutica para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la proteína de fusión comprende una segunda proteína que comprende un fragmento de anticuerpo, opcionalmente en la que el fragmento de anticuerpo es un Fc.
7. Glucoproteína CD52 soluble, proteína de fusión o composición farmacéutica para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la glucoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, medio de cultivo celular, agente o composición se administra en un sitio mucosal o transdérmico.
8. Método de diagnóstico de la susceptibilidad de un sujeto a desarrollar sepsis, en el que el método comprende:

detectar el nivel de glucoproteína CD52 soluble en una muestra obtenida del sujeto, y

comparar el nivel de glucoproteína CD52 soluble detectado en la muestra obtenida del sujeto con un nivel de referencia determinado a partir de uno o más sujetos sanos, en el que un nivel inferior de glucoproteína CD52 soluble detectado en la muestra obtenida del sujeto en comparación con el nivel de referencia indica que el sujeto presenta una susceptibilidad incrementada a desarrollar sepsis.
9. Método de diagnóstico de la susceptibilidad de un sujeto a desarrollar sepsis, en el que el método comprende:

detectar la frecuencia o actividad de las células CD52hi en una muestra obtenida del sujeto, y comparar la frecuencia o actividad de las células CD52hi detectada en la muestra obtenida del sujeto con un nivel de referencia determinado a partir de uno o más sujetos sanos, en el que una frecuencia inferior o una actividad reducida de las células CD52hi detectada en la muestra obtenida del sujeto en comparación con el nivel de referencia indica que el sujeto presenta una susceptibilidad incrementada a desarrollar sepsis.
10. Método según la reivindicación 9, en el que la frecuencia de células CD52hi se detecta mediante la detección del nivel de CD52 unido a membrana en la muestra, mediante la detección del nivel de expresión de proteína CD52 en la muestra y/o mediante detección del nivel de expresión de ARNm de CD52 en la muestra.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la muestra se obtiene de un sujeto en el que se ha administrado un antígeno, y/o en el que la muestra se obtiene de un sitio de enfermedad local en el sujeto.
12. Método in vitro de identificación de un potencial agente terapéutico para el tratamiento o la prevención de la sepsis, en el que el método comprende poner en contacto un agente de ensayo con una célula CD52hi o una población de células CD52hi, y la detección de uno o más de entre el nivel de glucoproteína CD52 soluble producido por la célula o población celular, la frecuencia de células CD52hi y/o la actividad de células CD52hi, y la identificación del agente de ensayo como un potencial agente terapéutico para el tratamiento o la prevención de la sepsis, en el caso de que se incremente el nivel de glucoproteína c D52 soluble, la frecuencia de células CD52hi y/o la actividad de células CD52hi tras el contacto con el agente de ensayo.