JP2017507917A

JP2017507917A - 軟骨魚類由来の抗原認識ドメインを使用したキメラ抗原受容体

Info

Publication number: JP2017507917A
Application number: JP2016546437A
Authority: JP
Inventors: フィリップデュシャトー; ジュリアンヴァルトン
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2014-01-14
Filing date: 2015-01-14
Publication date: 2017-03-23
Also published as: AU2015206040A1; US20160333094A1; EP3094354B1; CA2936693C; WO2015107075A1; CA2936693A1; US10526406B2; EP3094354A1; AU2015206040B2; ES2701846T3

Abstract

本発明は、軟骨魚類に由来する単量体抗体に由来するVNARポリペプチドによって、所望の抗原に対する特異性が付与される、単鎖または多鎖の形態にあるキメラ抗原受容体（CAR）の新規生成に関する。選択された望まれない悪性細胞へ免疫細胞の特異性を向け直すことを目的としたそのようなCARは、コンパクトであり、従って、薬剤耐性細胞の表面に存在する排出ポンプのイオンチャネルのような中空抗原を標的とするのに特に適合している。本発明は、特に、免疫治療において使用するための、多鎖CARをコードするポリヌクレオチド、ベクター、およびそれらを表面に発現している単離された細胞を包含する。

Description

発明の分野
本発明は、細胞免疫治療の領域、より具体的には、軟骨魚類のモノクローナル抗体に由来するVNARポリペプチドによって特異性が付与される新世代のキメラ抗原受容体（CAR）に関する。本発明のCARは、特定の抗原、具体的には、薬剤耐性を悪性細胞へ付与するイオンチャネルおよび排出ポンプの成分のような中空抗原へ特異性を向け直すため、免疫細胞の表面に発現され得る。本発明は、特に、難治性癌型の処置のための、効率的な養子免疫治療戦略の道を開く。

発明の背景
エクスビボで生成された自己の抗原特異的T細胞の移入を含む養子免疫治療は、ウイルス感染および癌を処置するための有望な戦略である。養子免疫治療のために使用されるT細胞は、抗原特異的T細胞の増大または遺伝子操作を通したT細胞の向け直しのいずれかによって生成され得る（Park, Rosenberg et al. 2011）。ウイルス抗原特異的T細胞の移入は、移植に関連したウイルス感染および稀なウイルス関連悪性疾患の処置のために使用されている、よく確立された手法である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および移入は、黒色腫の処置において成功が示されている。

T細胞における新規特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体（CAR）の遺伝子移入を通して、成功裡に生成された（Jena, Dotti et al. 2010）。CARは、単一の融合分子として1つ以上のシグナリングドメインと会合したターゲティングモエティからなる合成受容体である。一般に、CARの結合モエティは、フレキシブルリンカーによって結合されたモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変断片を含む、単鎖抗体（scFv）の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドのドメインに基づく結合モエティも、成功裡に使用されている。第一世代CARのためのシグナリングドメインは、CD3ζ鎖またはFc受容体γ鎖の細胞質領域に由来する。第一世代CARは、T細胞の細胞傷害を成功裡に向け直すことが示されたが、より長期間の増大および抗腫瘍活性をインビボで提供することはできなかった。CARによって改変されたT細胞の生存を増強し、増殖を増加させるため、CD28、OX-40（CD134）、ICOS、および4-1BB（CD137）を含む共刺激分子に由来するシグナリングドメインが、単独で（第二世代）または組み合わせて（第三世代）付加された。CARは、リンパ腫および固形腫瘍を含む様々な悪性疾患に由来する腫瘍細胞の表面に発現された抗原に対して、T細胞が向け直されることを、成功裡に可能にしている（Jena,Dotti et al.2010）。しかしながら、例えば、タンパク質構造に埋め込まれたエピトープには、mAbが接近することができないため（例えば、多数の表面受容体がリガンド結合ポケットを含有している場合がある）、いくつかの表面抗原は、古典的な抗体によって効率的に標的とするのが困難であろう。さらに、単鎖抗体（scFv）、フレキシブルリンカーによって接合されたモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の可変断片を含むCARは、製造および効力の予測を困難にするサイズおよび構造の複雑さのため、限界を有する。

本発明において、本発明者らは、軟骨魚類に由来する可変抗原受容体（VNAR）を通して抗原特異性が媒介される新たなキメラ抗原受容体を作製することによって、これらの限界を和らげた。

成功にも関わらず、IgG分子は、現在のCAR構築物の一部として、実際的な限界を示した。具体的には、それらは、免疫反応を誘発しがちであり、開発が高コストである、大きい（およそ150 kDaの）四量体構造である。

VNAR（IgNARまたは新規抗原受容体（Novel Antigen Receptor）の可変ドメイン）は、軟骨魚類の血清中に同定されたタンパク質の独特のクラスを形成する。VNARは、12〜15 kDaのサイズ、即ち、IgGよりはるかに小さいサイズの単量体結合ドメインとして単離され得る。

VNARは、頑強さおよび可溶性、抗原間隙に結合し、酵素の活性部位を阻止する傾向、ならびに一連の抗原に対する高い結合親和性に基づき、可能性のある生物学的治療薬（biotherapeutics）として、数年間、同定されてきた。しかしながら、それらは、未だ、構造的にも生物物理学的にも、他のタイプの抗原受容体よりはるかに不十分にしか理解されていない。VNARドメインは、T細胞受容体VaおよびIgG Vk鎖と構造的特色を共有しているが、これらのドメインとの配列相同性は低い（およそ35％）。scFvとは対照的に、VNARポリペプチドは、CDR2（CDR＝相補性決定領域）を欠くという共通の特色を有している。それらは、一般的には、より短いCDR1ループ、およびドメインの主要な結合表面を生成するより長いCDR3ループを含有している。

これらの特色から、VNARが効率的なキメラ受容体の構築のために適当であることは予測可能でなかった。実際、CAR編成は、悪性細胞または感染細胞の表面に存在する抗原に到達するために、かなり拡張的な細胞外抗原認識ドメインを必要とすると従来考えられてきた。

本発明は、抗原認識ドメインとしてVNARポリペプチドを含むそのような新たなキメラ抗原受容体に関する。

本発明は、「VNAR-CAR」と呼ばれるこれらの新しいCARをコードするポリペプチド、および細胞ポリペプチドの発現によって、免疫細胞、具体的にはT細胞を操作する方法に関する。患者の生体は、これらの方法によって入手可能な免疫細胞に対して、より寛容であって、それらは免疫系によって、よりゆっくり破壊されるはずである。

より具体的な態様において、抗原認識の際の免疫細胞の相互作用および／または活性化のモジュレーションを可能にする、単鎖構造であるか多鎖構造であるかに依る、異なる編成が、本発明のVNAR-CARのために提唱される。VNARは、CARを発現するT細胞が受容生物（例えば、ヒト）からの免疫応答を引き起こさないよう、免疫原性がより低い配列を含有するようヒト化されていてもよい。VNAR CARを発現するT細胞を、例えば、T細胞受容体をコードする遺伝子の破壊（ΔTCR）によって、同種治療において使用するため、遺伝子操作することもできる。

抗原認識ドメインとして使用されるVNARポリペプチドの一般的な構造。 SEQ ID NO：1（E06）、SEQ ID NO：101（5A7）、SEQ ID NO：102（7e80）、およびSEQ ID NO：115（12A9）に相当するサメ由来の4種の代表的な例示的なVNAR足場の配列アライメント。（1）主要な抗原認識ドメインとして作用するCDR3を含むVNARポリペプチド、およびCD8由来のヒンジから構成された細胞外ドメイン、（2）4-1BB（共刺激ドメイン）およびCD3ζ（シグナリングドメイン）を含む膜貫通ポリペプチドを含む本発明による例示的な単鎖VNAR-CARの模式図。 FcεRI受容体の構造に基づく例示的な本発明による多鎖VNAR-CARの模式図。VNARポリペプチドがFcεRIα鎖に融合され、共刺激ドメインがFcεRIγ鎖に、シグナリングドメインがFcεRIβ鎖に融合されている。 FcεRIα鎖の膜貫通ドメインに融合されたCD8ストーク／ヒンジ領域に融合された細胞外VNARポリペプチドを含む本発明の多鎖CARの異なる例示的なバージョン（csm1〜csm10）の模式図。少なくとも1つの共刺激性の41BBドメイン、CD28ドメイン、および／またはCD3ζドメインが、FcεRIα鎖、β鎖、および／またはγ鎖のいずれかに融合されている。 FcεRIα鎖の膜貫通ドメインに融合されたCD8ストーク／ヒンジ領域に融合された細胞外VNARポリペプチドを含む本発明の多鎖CARの異なる例示的なバージョン（csm1〜csm10）の模式図。少なくとも1つの共刺激性の41BBドメイン、CD28ドメイン、および／またはCD3ζドメインが、FcεRIα鎖、β鎖、および／またはγ鎖のいずれかに融合されている。実施例1に記載される本発明による単鎖CAR（SEQ ID NO：110）の構造の模式図。実施例1に記載される本発明による多鎖CAR（SEQ ID NO：105）の構造の模式図。

発明の詳細な説明
本明細書において特に定義されない限り、使用される技術用語および科学用語は、全て、遺伝子治療、生化学、遺伝学、および分子生物学の領域の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。

本発明の実施は、他に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を利用するであろう。そのような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,(Sambrook et al,2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.,1984)；Mullisら、米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);the series,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York)、特に、第154巻および第155巻(Wu et al.eds.)および第185巻、"Gene Expression Technology"(D.Goeddel,ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986)；ならびにManipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)を参照されたい。

本発明は、第一に、
（i）VNARポリペプチドを含む1つの細胞外抗原認識ドメイン；および
（ii）少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含む1つの膜貫通ポリペプチド
を含むことを特徴とするキメラ抗原受容体（CAR）を焦点とする。

VNARポリペプチドは、具体的には、免疫グロブリンVHより免疫グロブリンVLドメインおよびT細胞受容体（TCR）Vドメインに対して高い構造的相同性を共有することから、典型的なIg VHおよびVLドメインとも、ラクダVHHドメインとも、区別される。

VNARポリペプチドの最も独特の特色は、CDR2ループ、ならびにそれに会合した2本のβ鎖、C'およびC''の欠如である。その代わりに、明瞭な「ベルト」がβサンドイッチ構造の中央付近に形成される（Kovalenko et al.,2013）。この領域は、上昇した体細胞変異率を示し、従って、超可変領域2（HV2）と名付けられている。変異頻度が増加している別の領域は、HV2とCDR3との間に位置し、TCR V鎖のものに類似しているβ鎖DおよびEを連結するループを含む；従って、この領域はHV4と名付けられた。構造的に、HV2は、CDR3に最も近位であり、HV4はCDR1に近接している。IgNAR可変ドメインのいくつかの構造的なタイプは、Ig折り畳みの正準システイン対（VLのCys-23/Cys-88、カバット命名法）以外の、CDR内およびフレームワーク（FW）内の追加のシステイン残基の数および位置に基づき分類されている。テンジクザメ（nurse sharks）に見出されたI型V-NARは、CDR3に2つのシステインを有し、フレームワーク（FW2およびFW4）にさらに2つ有している。より一般的なII型は、CDR1とCDR3とを連結する1つの追加のシステイン対を有している。新生仔サメ発達において主に検出されるIII型は、II型に類似しているが、CDR1に保存されたTrp残基を有し、限定されたCDR3多様性を有する。本発明者らがIV型と名付けたV-NARの別の構造的なタイプは、2つの正準システイン残基のみを有している。これまでのところ、このタイプは、小型のサメ（dogfish sharks）に主に見出されており、クモハダオオセ（wobbegong sharks）に由来する半合成V-NARライブラリーからも単離された。V-NARにおける単一ドメイン性およびCDR2の欠如は、将来の抗原との特異的な高親和性の結合を提供するためのCDR1およびCDR3の必要性を高める。配列、長さ、およびコンフォメーションに関してより可変性のCDR3が、抗原認識において重要な役割を果たす。

また、本発明によるCARの抗原認識ドメインは、好ましくは、CDR1およびCDR3と呼ばれる2つの相補性決定領域（CDR）のみを含み、より好ましくは、抗原認識ドメインは、1つの相補性決定領域（CDR3）のみを有する。

一般に、抗原に対するCARの認識の特異性は、CDR3によって決定される。大部分の場合、CDR3は、T細胞活性化において、50％以上、より一般には、70％以上、原因となる（即ち、CDR1が修飾されるかまたは除去される時、親和性は50％または30％しか低下しない）。T細胞活性化は、種々の手段によって、具体的には、Betts et al.(2003)によって記載された方法を使用することによって測定され得る。

VNARポリペプチドは、比較的小さいポリペプチド（12〜13kDa）であるという利点を有し、高い生物物理学的安定性、可溶性、および伝統的な抗体可変ドメインが接近不可能であったタンパク質表面上の間隙（例えば、酵素活性部位）に位置するエピトープを含む多様な抗原に結合する能力という利点を示す。

本発明の好ましい態様によると、しばしば、10〜25残基、好ましくは、15〜20残基の長さのCDR3領域は、VNAR表面から突出する。このCD3領域は、好ましくは、より突出する認識表面を入手するため、VNARポリペプチド由来の残基とのジスルフィド結合を生成する少なくとも2つのシステイン残基を含む。

「細胞外抗原認識ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンド、より具体的には、抗原に結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するよう選択され得る。従って、リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌、および寄生虫の感染、自己免疫疾患、ならびに癌細胞に関連したものが含まれる。具体的には、細胞外リガンド結合ドメインには、標的の抗原に対する抗体に由来する抗原結合ドメインが含まれ得る。

非限定的な例として、標的の抗原は、分化分子（例えば、CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123、およびCD138）の任意のクラスタ、ErbB2（HER2/neu）のような腫瘍関連表面抗原、癌胎児性抗原（CEA）、上皮細胞接着分子（EpCAM）、上皮増殖因子受容体（EGFR）、EGFRバリアントIII（EGFRvIII）、CD19、CD20、CD30、CD40、ジシアロガングリオシドGD2、腺管上皮ムチン、gp36、TAG-72、スフィンゴ糖脂質、神経膠腫関連抗原、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（AFP）、レクチン反応性AFP、チログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2（AS）、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスターゼ（prostase）、プロスターゼ特異抗原（PSA）、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、プロステイン（prostein）、PSMA、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原1（PCTA-1）、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン増殖因子（IGF1）-I、IGF-II、IGFI受容体、メソテリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合性複合体（MHC）分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンのエクストラドメインA（EDA）およびエクストラドメインB（EDB）ならびにテネイシンCのA1ドメイン（TnC A1）ならびに繊維芽細胞関連タンパク質（fap）；CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、GM-CSF、サイトカイン受容体のような系統特異的または組織特異的な抗原、エンドグリン、主要組織適合性複合体（MHC）分子、BCMA（CD269、TNFRSF 17）または（HIV gp120のような）HIV特異的な抗原のようなウイルス特異的な表面抗原；EBV特異的な抗原、CMV特異的な抗原、HPV特異的な抗原、ラッセ（Lasse）ウイルス特異的な抗原、インフルエンザウイルス特異的な抗原、ならびにこれらの表面マーカーの誘導体またはバリアントであり得る。抗原は、必ずしも、表面マーカー抗原でなく、細胞の表面にHLAクラスIによって提示された内在性の小さい抗原であってもよい。

細胞外リガンド結合ドメインには、標的の抗原に結合するペプチド、標的の抗原に結合する抗体に結合するペプチドまたはタンパク質、標的上の受容体に結合する非限定的な例としての増殖因子、サイトカイン、またはホルモンのようなペプチドリガンドまたはタンパク質リガンド、標的上のペプチドリガンドまたはタンパク質リガンドに結合する非限定的な例としての増殖因子受容体、サイトカイン受容体、またはホルモン受容体のような受容体に由来するドメインも含まれ得る。好ましくは、標的は、細胞であるが、ウイルスまたは微生物であってもよい。本発明の別の局面によると、本発明によるCARは、抗体またはFc免疫グロブリン鎖を含む他のCARに対するものであってもよい。

本発明によるキメラ抗原受容体は、他のタイプのリガンド結合ドメインより小さい細胞外ドメインを有するという利点を示す。一般に、この細胞外ドメインを形成するVNARポリペプチドは、150アミノ酸より短く、好ましくは、140アミノ酸より短く、より好ましくは、130アミノ酸より短く、さらに好ましくは、120アミノ酸より短い。いくつかの場合において、VNARポリペプチドは、110アミノ酸未満、時には、100アミノ酸未満であり得る。

本発明者らは、本発明によるより小さい細胞外ドメインのCARが、輸送機能に関与するポリペプチドのような、細胞の表面に存在する中空構造を有する抗原を標的とするのに特に効率的であり得ることを確立した。実際、白血病は、他の癌と同様に、点変異、転座、エピジェネティック修飾のような、腫瘍関連遺伝子のいくつかの遺伝子改変を保持しており、それは遺伝子の増幅または不活化をしばしば伴う。腫瘍関連遺伝子の同定は、白血病の生物学に対する相当の洞察を提供し、より特異的な薬理学的処置への道を開く。癌においては、体積調節、増殖、およびアポトーシスに関連した輸送機序がしばしば改変されるため、これらの遺伝子には、いくつかのイオンチャネルおよびポンプが含まれる。白血病細胞において、そのような変化は、早くも幹細胞段階で観察される。イオンチャネルは、分化の欠如、遊走表現型および侵襲表現型の増加、ならびに化学療法耐性のようなその他の悪性特色を制御することができる。多剤排出ATP結合カセット（ABC）トランスポーターによって媒介される多剤耐性（MDR）は、特に、急性白血病の処置において、重大な問題であり、透過性（P）-糖タンパク質（P-gp）、多剤耐性関連タンパク質1（MRP1）、および乳癌耐性タンパク質（BCRPまたはABCG2）が、細胞株研究において、MDRの重要なエフェクターであることが一貫して示されている。内因性のMDRが、特異的な遺伝子発現プロファイルによって発生する場合があること、そしてP-gpおよびその他のMDRタンパク質の薬物によって誘導された過剰発現が、獲得耐性をもたらす場合があることが、研究によって証明されており、急性白血病のための複数の薬物に対する耐性について選択された細胞株において、複数のABCトランスポーターが過剰発現されていることが示されている。σ受容体（σR）、即ち、σR（1）およびσR（2）のような他の受容体が、乳癌細胞において過剰発現されていることが見出されている。

従って、癌の発生への関与およびこの病理における過剰発現のため、本発明の一つの局面は、癌の養子免疫治療のため、本発明のCARを使用して、そのような型の膜孔またはポンプを標的とすることであろう。

下記表1は、化学療法に対して耐性の悪性細胞の処置のため、本発明のVNAR-CARによって標的とされ得るABCトランスポーターの例を提供する。

（表１）化学療法に対する細胞耐性に関与しているABCトランスポーター

本発明の具体的な態様によると、多重特異性を提供し、細胞外ドメインのサイズまたは分子のインビボ半減期を増加させるため、いくつかのVNARポリペプチドをタンデムに連結することができる。

本発明のさらなる局面によると、CAR構築に関与するVNARポリペプチドは、免疫原性を低下させ、かつ／または熱力学的安定性、折り畳み、および発現の特性を改善するため、ヒト化されてもよい。この主題分野においては、相当の専門知識が、特に、齧歯類mAbに関して蓄積されている。典型的には、関心対象のマウス抗体のCDRを、（配列類似性、発現特性、または両方について選択された）適切なヒト生殖系列フレームワークへ移植し、次いで、特定のCDRコンフォメーションを担い、従って、抗原結合を担う重要な位置に、逆変異を導入する。このアプローチは、多くのヒト化Abを与えており、その多くが臨床化されている。サメVNARは、ヒトVH/VL配列との構造的な違い（例えば、CDR2の欠如）および低い全体配列同一性（一般に、およそ30％）のため、ヒト化がより困難であるが、VNARドメインの入手可能な結晶構造は、ヒトIg可変ドメインに類似した重要フレームワーク領域の組織化を証明しており、従って、ヒト化の試みは可能である（Kovelenko et al.2013）。そのようなヒト化は、VNARポリペプチドとして使用された初期VNAR足場の初期全体アミノ酸配列の50％もの置換をもたらし得る。従って、本発明は、軟骨魚類に起因する報告されたVNARポリペプチドとの比較的低いアミノ酸同一性を有するが、SEQ ID NO：1〜100と呼ばれるポリペプチド配列との、好ましくは、少なくとも50％、より好ましくは、少なくとも75％、さらに好ましくは、少なくとも80％、最も好ましくは、少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を示すVNARポリペプチドの使用を包含する（表2）。これらの配列は、本発明に従って使用されヒト化され得るVNAR足場の非限定的な例として提供される。

本発明によるキメラ抗原受容体は、一般に、膜貫通領域と細胞外抗原認識ドメインとの間にヒンジ（ストーク）領域をさらに含む。

本明細書において使用される「ヒンジ領域」という用語は、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するよう機能するオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。具体的には、ストーク領域は、細胞外リガンド結合ドメインのために、より高い柔軟性および接近可能性を提供するために使用される。ストーク領域は、300個までのアミノ酸、好ましくは、10〜100個のアミノ酸、最も好ましくは、25〜50個のアミノ酸を含み得る。ストーク領域は、CD8、CD4、またはCD28の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部のような、天然に存在する分子の全部または一部に由来し得る。あるいは、ストーク領域は、天然に存在するストーク配列に相当する合成配列であってもよいし、または完全に合成のストーク配列であってもよい。好ましい態様において、ストーク領域は、ヒトCD8α鎖（例えば、NP_001139345.1）の一部である。

多鎖VNAR-CAR
本明細書の実施例1ならびに図3および7は、US 7,741,465に記載されるような単一ポリペプチド内に全ての関連するドメインが含有されているCARの古典的編成に対応する、単鎖CARに基づく本発明によるキメラ抗原受容体を例示する。

しかしながら、本発明は、実施例2ならびに図4、5、および8に示されるような多鎖編成も包含する。そのような編成によると、リガンド結合ドメインおよびシグナリングドメインは、別々のポリペプチドに存在する。異なるポリペプチドは、相互の相互作用を可能にするよう近接して膜に付着させられる。そのような編成において、シグナリングドメインおよび共刺激ドメインは、共刺激ドメインの改善された機能を可能にすると見なされる、膜近傍の位置にあり得る（即ち、内側で細胞膜に隣接していてよい）。マルチサブユニット編成は、より多くの柔軟性、およびT細胞活性化に対するより多くの調節を有するCARを設計する可能性も提示する。例えば、多重特異性CAR編成を入手するため、異なる特異性を有するいくつかの細胞外抗原認識ドメインを含めることが可能である。多鎖CAR内の異なるサブユニットの間の相対比を調節することも可能である。このタイプの編成は、最近、本出願人によってPCT/US2013/058005に記載された。

単一の多鎖CARの部分としての異なる鎖の集合は、例えば、シグナリングドメインおよび共刺激ドメインが融合される、IgEの高親和性受容体（FcεRI）の異なるα鎖、β鎖、およびγ鎖を使用することによって可能になる（Metzger,Alcaraz et al.1986）。γ鎖は、膜貫通領域および1つの免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含有している細胞質テールを含む（Cambier 1995）。

多鎖CARは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を強化するため、いくつかの細胞外リガンド結合ドメインを含んでいてもよい。一つの態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、同一の膜貫通ポリペプチドにタンデムに置かれていてよく、任意で、リンカーによって分離されていてよい。別の態様において、異なる細胞外リガンド結合ドメインは、多鎖CARを構成する異なる膜貫通ポリペプチドに置かれていてもよい。別の態様において、本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多鎖CARの集団に関する。具体的には、本発明は、免疫細胞を準備する工程、および細胞の表面に異なる細胞外リガンド結合ドメインを各々含む多鎖CARの集団を発現させる工程を含む、免疫細胞を操作する方法に関する。別の具体的な態様において、本発明は、免疫細胞を準備する工程、および異なる細胞外リガンド結合ドメインを各々含む多鎖CARの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞へ導入する工程を含む、免疫細胞を操作する方法に関する。具体的な態様において、免疫細胞を操作する方法は、シグナル伝達ドメインに融合したFcεRIβ鎖および／またはγ鎖の少なくとも一部、ならびに異なる細胞外リガンド結合ドメインに融合したFcεRIα鎖のいくつかの部分を、細胞の表面に発現させる工程を含む。より具体的な態様において、方法は、シグナル伝達ドメインに融合したFcεRIβ鎖および／またはγ鎖の一部ならびに異なる細胞外リガンド結合ドメインに融合したいくつかのFcεRIα鎖をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを細胞へ導入する工程を含む。多鎖CARの集団とは、異なる細胞外リガンド結合ドメインを各々含む少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、またはそれ以上の多鎖CARを意味する。本発明による異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を強化することができる。

本発明は、異なる細胞外リガンド結合ドメインを各々含む多鎖CARの集団を含む、単離された免疫細胞にも関する。

本発明の多鎖CARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合の後の細胞内シグナリングを担う。換言すると、シグナル伝達ドメインは、多鎖CARが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも1種の活性化を担う。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。

本出願において、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、専門の機能を果たすよう細胞に指図するタンパク質の部分をさす。

単鎖または多鎖CARにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するために協調的に作用するFc受容体またはT細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同一の機能的能力を有するこれらの配列の誘導体またはバリアントおよび合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインには、細胞質シグナリング配列の2種の別個のクラス（抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次的または共刺激的なシグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの）が含まれる。一次細胞質シグナリング配列には、ITAMの免疫受容体チロシン活性化モチーフとして公知であるシグナリングモチーフが含まれ得る。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼのための結合部位として役立つ、多様な受容体の細胞質内テールに見出される十分に定義されたシグナリングモチーフである。本発明において使用されるITAMの例には、非限定的な例として、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが含まれ得る。好ましい態様において、多鎖CARのシグナリング伝達ドメインには、CD3ζシグナリングドメインまたはFcεRIβもしくはγ鎖の細胞質内ドメインが含まれ得る。

具体的な態様において、本発明の多鎖CARのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子とは、効率的な免疫応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。

「共刺激リガンド」とは、T細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むが、これらに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されないが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83に特異的に結合するリガンドのような、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。

「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが、増殖のような、細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族結合パートナーをさす。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。共刺激分子の例には、CD27、CD28、CD8、4-1BB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83に特異的に結合するリガンド等が含まれる。

「共刺激シグナル」とは、本明細書において使用されるように、TCR/CD3ライゲーションのような一次シグナルと組み合わせて、T細胞増殖および／または重要分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションをもたらすシグナルをさす。

別の具体的な態様において、シグナル伝達ドメインは、TNFR関連因子2（TRAF2）結合モチーフ、共刺激TNFRメンバーファミリーの細胞質内テールである。共刺激TNFRファミリーメンバーの細胞質テールは、保存されたメジャーモチーフ（P/S/A)X(Q/E)E）またはマイナーモチーフ（PXQXXD）（Xは任意のアミノ酸である）からなるTRAF2結合モチーフを含有している。TRAFタンパク質は、受容体三量体化に応答して、多くのTNFRの細胞内テールにリクルートされる。好ましい態様において、本発明の多鎖CARのシグナル伝達ドメインは、4-1BB（GenBank：AAA53133.）およびCD28（NP_006130.1）からなる群より選択される共刺激シグナル分子の一部を含む。

適切な膜貫通ポリペプチドの特徴的な特色には、免疫細胞、具体的には、リンパ球またはナチュラルキラー（NK）細胞の表面に発現され、予め定義された標的細胞に対して免疫細胞の細胞応答を指図するために共に相互作用する能力が含まれる。細胞外リガンド結合ドメインおよび／またはシグナル伝達ドメインを含む本発明の多鎖CARの異なる膜貫通ポリペプチドは、標的リガンドとの結合の後、シグナル伝達に参加し、免疫応答を誘導するため、共に相互作用する。膜貫通ドメインは、天然起源に由来してもよいしまたは合成起源に由来してもよい。膜貫通ドメインは、膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、α、β、γ、または□のようなT細胞受容体のサブユニット、CD3複合体を構成するポリペプチド、IL2受容体p55（α鎖）、p75（β鎖）、またはγ鎖、Fc受容体のサブユニット鎖、具体的には、Fcγ受容体IIIまたはCDタンパク質であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、ロイシンおよびバリンのような疎水性残基を主に含んでいてもよい。

好ましい態様において、Fcε受容体鎖またはそのバリアントに由来する膜貫通ポリペプチドは、具体的には、FcεRIα鎖、β鎖、および／もしくはγ鎖、またはそれらの機能的な断片もしくはバリアントを含む。「に由来する」という用語は、Fcε受容体の配列の1つ以上のアミノ酸修飾を含む、Fcε受容体のものと等価なアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。そのようなアミノ酸修飾は、アミノ酸の置換、欠失、付加、またはそれらの修飾のいずれかの組み合わせを含んでいてよく、Fc受容体のものと比べて、Fc結合領域の生物学的活性を改変してもよい。他方、特定のFc受容体に由来するFc結合領域は、Fc受容体のものと比べて、Fc結合領域の生物学的活性を実質的に改変しない1つ以上のアミノ酸修飾を含んでいてもよい。この種のアミノ酸修飾には、典型的には、保存的アミノ酸置換が含まれるであろう。

より具体的な態様において、多鎖CARは、FcεRI鎖が自然に二量体化して二量体キメラ抗原受容体を形成するよう、FcεRIα鎖の一部およびFcεRIβ鎖の一部またはそれらのバリアントを含んでいてよい。別の態様において、多鎖キメラ抗原は、FcεRI鎖が自然に三量体化して三量体キメラ抗原受容体を形成するよう、FcεRIα鎖の一部およびFcεRIγ鎖の一部またはそれらのバリアントを含んでいてもよく、別の態様において、多鎖キメラ抗原受容体は、FcεRIが自然に四量体化して四量体キメラ抗原受容体を形成するよう、FcεRIα鎖の一部、FcεRIβ鎖の一部、およびFcεRIγ鎖の一部、またはそれらのバリアントを含んでいてもよい。

換言すると、多鎖CARは、異なるポリペプチドが自然に多量体化して二量体、三量体、または四量体のCARを形成するよう、以下の成分のうちの少なくとも2種を含む：
（a）FcεRIα鎖の一部および細胞外リガンド結合ドメインを含む1つのポリペプチド、
（b）FcεRIβ鎖の一部を含む1つのポリペプチド、および／または
（c）FcεRIγ鎖の一部を含む1つのポリペプチド。

本明細書において使用される「機能的断片」という用語は、完全なタンパク質の活性の少なくとも50％を保持しているタンパク質のサブセットをさす。あるいは、「機能的バリアント」という用語は、例えば、初期タンパク質と比べてアミノ酸の欠失または挿入または置換を含むが、初期タンパク質の活性の少なくとも50％を保持しているポリペプチドをさす。そのような機能的バリアントは、ポリペプチドをコードするDNAにおける変異によって調製され得る。

所望の抗原に対する本発明のCARの機能性は、実験パートに記載されるように、表面上に抗原を発現しているDaudi細胞との結合によってアッセイされ得る。標的とされた細胞によるカルシウムイオン放出、細胞内チロシンリン酸化、イノシトールリン酸ターンオーバー、またはインターロイキン（IL）2、インターフェロンγ、GM-CSF、IL-3、IL-4の産生の増加の測定を含む、当技術分野において公知の他のアッセイが利用可能である。

ポリヌクレオチド、ベクター
具体的な態様において、2Aペプチドをコードする配列のようなリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む一つのポリヌクレオチドまたはベクターに、異なる核酸配列を含めることができる。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された2Aペプチドは、コドンによってコードされた2つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007)を参照されたい）。従って、ポリペプチドが、インフレームにある2Aオリゴペプチド配列によって隔てられている時、mRNA内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、2つのポリペプチドが合成され得る。そのようなリボソームスキップ機序は、当技術分野において周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされた数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。非限定的な例として、本発明において、2Aペプチドは、細胞内で多鎖CARの様々なポリペプチドを発現するのに使用されている。

FcεRといった膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へ差し向けるためには、（リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても公知の）分泌シグナル配列が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列の中に提供される。分泌シグナル配列は、FcεRのものであってもよく、または別の分泌されたタンパク質（例えばt-PA）に由来してもよく、または新たに合成されてもよい。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的に連結される。即ち、2種の配列は、正確なリーディングフレームにおいて結合され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路へ差し向けられるよう位置付けられる。分泌シグナル配列は、一般的には、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列の5'に位置するが、ある種の分泌シグナル配列は、関心対象の核酸配列の他の場所に位置し得る（例えば、Welchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照されたい）。好ましい態様において、シグナルペプチドは、FcεRIα鎖（NP_001992.1）の残基1〜25を含む。

当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子において相当の配列変動が可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のため、コドン最適化される。コドン最適化とは、関心対象の配列において、所定の種の高発現遺伝子において一般に稀であるコドンを、そのような種の高発現遺伝子において一般に高頻度であるコドンへ交換することをさす。そのようなコドンは、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードする。

ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として、細胞においてインサイチューで合成され得る。あるいは、ポリペプチドは、細胞外で作製され、次いで、細胞へ導入されてもよい。ポリヌクレオチド構築物を動物細胞へ導入する方法は、当技術分野において公知であり、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれる安定的形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルスによって媒介される方法を非限定的な例として含む。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソーム等によって細胞へ導入され得る。例えば、一過性形質転換法には、例えば、微量注入、電気穿孔、または微粒子銃が含まれる。ポリヌクレオチドは、細胞における発現を考慮して、ベクター、より具体的には、プラスミドまたはウイルスに含まれ得る。

修飾および操作したT細胞
本発明は、細胞を操作する方法によって入手可能な単離された細胞または細胞株にも関する。具体的には、単離された細胞は、少なくとも1種の上記の多鎖CARを含む。別の態様において、単離された細胞は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多鎖CARの集団を含む。具体的には、単離された細胞は、少なくとも1種の多鎖CARを含むポリペプチドをコードする外因性のポリヌクレオチド配列を含む。前記細胞はまた、CD52、GR、TCRα、TCR β、HLA遺伝子、免疫チェックポイント遺伝子（PD1およびCTLA-4など）からなる群より選択される少なくとも1種の不活性化された遺伝子をさらに含むことができるか、またはpTαトランスジーンを発現することができる。

既に記載された方法のいずれか一つによって入手された単離された免疫細胞、好ましくはT細胞も、本発明の範囲に包含される。免疫細胞とは、自然免疫応答および／または適応免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞をさす。本発明による免疫細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞はCD34+細胞である。単離された細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、B細胞、または炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、もしくはヘルパーTリンパ球からなる群より選択されるT細胞であってもよい。別の態様において、細胞は、CD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球からなる群に由来し得る。本発明の細胞の増大および遺伝子改変の前に、細胞の起源は、多様な非限定的な方法を通して対象から入手され得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な起源から入手され得る。本発明のある種の態様において、当業者に入手可能であり公知である多数のT細胞株が使用され得る。別の態様において、細胞は、健常ドナー、癌を有すると診断された患者、または感染を有すると診断された患者に由来し得る。別の態様において、細胞は、異なる表現型的特徴を提示する細胞の混合集団の一部である。既に記載された方法によって形質転換されたT細胞から入手された細胞株も、本発明の範囲に包含される。免疫抑制処置に対して抵抗性であり、以前の方法によって入手可能である改変された細胞は、本発明の範囲に包含される。

別の態様において、本発明による単離された細胞は、CD52、GR、PD1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、HLA、TCRα、およびTCRβからなる群より選択される1種の不活化された遺伝子を含み、かつ／またはCAR、多鎖CAR、および／もしくはpTαトランスジーンを発現する。別の具体的な態様において、単離された細胞は、既に記載されたような本発明のCARを構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

別の態様において、本発明による単離された細胞は、CD52およびGR、CD52およびTCRα、CDR52およびTCRβ、GRおよびTCRα、GRおよびTCRβ、TCRαおよびTCRβ、PD1およびTCRα、PD1およびTCRβ、CTLA-4およびTCRα、CTLA-4およびTCRβ、LAG3およびTCRα、LAG3およびTCRβ、Tim3およびTCRα、Tim3およびTCRβ、BTLAおよびTCRα、BTLAおよびTCRβ、BY55およびTCRα、BY55およびTCRβ、TIGITおよびTCRα、TIGITおよびTCRβ、B7H5およびTCRα、B7H5およびTCRβ、LAIR1およびTCRα、LAIR1およびTCRβ、SIGLEC10およびTCRα、SIGLEC10およびTCRβ、2B4およびTCRα、2B4およびTCRβからなる群より選択される2種の不活化された遺伝子を含み、かつ／またはCAR、多鎖CAR、および／もしくはpTαトランスジーンを発現する。

さらなる態様において、TCRは、TCRα遺伝子および／またはTCRβ遺伝子を不活化することによって、本発明による細胞において非機能性にされる。上記の戦略は、より具体的には、GvHDを回避するために使用される。本発明の具体的な局面は、主要組織適合性複合体シグナリング経路と無関係に増殖することができる、個体に由来する修飾された細胞を入手する方法である。この方法は、以下の工程を含む：
（a）個体から細胞を得る工程；
（b）TCRα遺伝子またはTCRβ遺伝子を不活化することによって、エクスビボで該細胞を遺伝子修飾する工程；
（c）遺伝子修飾されたT細胞を、該細胞を増幅するために適切な条件でインビトロで培養する工程。

この方法によって入手することが可能な、主要組織適合性複合体シグナリング経路と無関係に増殖することができる修飾された細胞は、本発明の範囲に包含される。修飾された細胞は、宿主対移植片（HvG）拒絶および移植片対宿主病（GvHD）に対してその必要のある患者を処置するため、本発明の具体的な局面において使用され得；従って、不活化されたTCRα遺伝子および／またはTCRβ遺伝子を含む修飾された細胞を有効量で患者へ投与することによって、患者を処置する工程を含む、宿主対移植片（HvG）拒絶および移植片対宿主病（GvHD）に対してその必要のある患者を処置する方法は、本発明の範囲内にある。

免疫抑制耐性T細胞
具体的な局面において、細胞を遺伝子修飾する工程のうちの一つは、以下を含む方法であってよい：
（a）免疫抑制剤の標的を発現する少なくとも1種の遺伝子を不活化することによって、T細胞を修飾する工程、および
（b）任意で、免疫抑制剤の存在下で、該細胞を増大させる工程。

免疫抑制剤は、いくつかの作用機序のうちの一つによって免疫機能を抑制する薬剤である。換言すると、免疫抑制剤は、免疫応答の程度および／または強度を減じる能力によって示される、化合物が果たす役割である。非限定的な例として、免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、TOR、インターロイキン2α鎖ブロッカー、イノシン一リン酸脱水素酵素の阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤、副腎皮質ステロイド、または免疫抑制代謝拮抗薬であり得る。古典的な細胞傷害性免疫抑制剤は、DNA合成を阻害することによって作用する。他のものは、T細胞の活性化を通してまたはヘルパー細胞の活性化を阻害することによって作用し得る。本発明による方法は、T細胞において免疫抑制剤の標的を不活化することによって、免疫治療のためのT細胞に免疫抑制耐性を付与することを可能にする。非限定的な例として、免疫抑制剤の標的は、CD52、グルココルチコイド受容体（GR）、FKBPファミリー遺伝子メンバー、およびシクロフィリンファミリー遺伝子メンバーのような免疫抑制剤の受容体であり得る。

遺伝子の不活化とは、関心対象の遺伝子が機能的なタンパク質の形態で発現されないことを表す。具体的な態様において、方法の遺伝子修飾は、低頻度切断エンドヌクレアーゼが、標的とされた1種の遺伝子において特異的に切断を触媒し、それによって、標的とされた遺伝子を不活化するよう、操作すべき準備された細胞において、低頻度切断エンドヌクレアーゼを発現させることによる。具体的な態様において、細胞を操作する方法は、以下の工程のうちの少なくとも一つを含む：
（a）好ましくは、細胞培養物からまたは血液試料から、T細胞を準備する工程；
（b）免疫抑制剤の標的を発現しているT細胞において遺伝子を選択する工程；
（c）DNA切断によって、好ましくは、二本鎖破壊によって、免疫抑制剤の標的をコードする遺伝子を選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをT細胞へ導入する工程、および
（d）任意で、免疫抑制剤の存在下で、該細胞を増大させる工程。

より好ましい態様において、方法は、以下の工程を含む：
（a）好ましくは、細胞培養物からまたは血液試料から、T細胞を準備する工程；
（b）免疫抑制剤の標的を発現しているT細胞において遺伝子を選択する工程；
（c）DNA切断によって、好ましくは、二本鎖破壊によって、免疫抑制剤の標的をコードする遺伝子を選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸によってT細胞を形質転換する工程、および
（d）T細胞において低頻度切断エンドヌクレアーゼを発現させる工程；
（e）任意で、免疫抑制剤の存在下で、該細胞を増大させる工程。

具体的な態様において、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、CD52、GRからなる群より選択される1種の遺伝子を特異的に標的とする。別の態様において、免疫抑制処置に対して特異的な工程（b）の遺伝子は、CD52であり、工程（d）または（e）の免疫抑制処置は、CD52抗原を標的とするヒト化抗体を含む。

別の態様において、免疫抑制処置に対して特異的な工程（b）の遺伝子は、グルココルチコイド受容体（GR）であり、工程（d）または（e）の免疫抑制処置は、デキサメタゾンのような副腎皮質ステロイドを含む。

別の態様において、免疫抑制処置に対して特異的な工程（b）の標的遺伝子は、FKBPファミリー遺伝子メンバーまたはそのバリアントであり、工程（d）または（e）の免疫抑制処置は、タクロリムスまたはフジマイシンとしても公知のFK506を含む。別の態様において、FKBPファミリー遺伝子メンバーは、FKBP12またはそのバリアントである。

別の態様において、免疫抑制処置に対して特異的な工程（b）の遺伝子は、シクロフィリンファミリー遺伝子メンバーまたはそのバリアントであり、工程（d）または（e）の免疫抑制処置は、シクロスポリンを含む。

免疫治療のための高活性T細胞
具体的な局面において、細胞を遺伝子修飾する一つの具体的な工程は、以下を含む方法であってよい：
（a）少なくとも1種の免疫チェックポイント遺伝子を不活化することによって、T細胞を修飾する工程；および
（b）該細胞を増大させる工程。

T細胞によって媒介される免疫は、抗原特異的な細胞のクローン選択、二次リンパ組織における活性化および増殖、抗原および炎症の部位への運搬、直接エフェクター機能の実行、ならびに多数のエフェクター免疫細胞のための（サイトカインおよび膜リガンドを通した）支援の提供を含む、複数の連続する工程を含む。これらの工程の各々は、応答を微調整する刺激シグナルと阻害シグナルとの平衡をとることによって制御される。「免疫チェックポイント」という用語は、T細胞によって発現された分子の群を意味することが、当業者には理解されるであろう。これらの分子は、免疫応答をダウンモジュレートするかまたは阻害するための「ブレーキ」として効果的にはたらく。免疫チェックポイント分子には、免疫細胞を直接阻害する、プログラム死（Programmed Death）1（PDCD1またはCD279としても公知のPD-1、アクセッション番号：NM_005018）、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CD152としても公知のCTLA-4、GenBankアクセッション番号AF414120.1）、LAG3（CD223としても公知、アクセッション番号：NM_002286.5）、Tim3（HAVCR2としても公知、GenBankアクセッション番号：JX049979.1）、BTLA（CD272としても公知、アクセッション番号：NM_181780.3）、BY55（CD160としても公知、GenBankアクセッション番号：CR541888.1）、TIGIT（VSTM3としても公知、アクセッション番号：NM_173799）、B7H5（C10orf54、マウスビスタ（vista）遺伝子のホモログとしても公知、アクセッション番号：NM_022153.1）、LAIR1（CD305としても公知、GenBankアクセッション番号：CR542051.1）、SIGLEC10（GeneBankアクセッション番号：AY358337.1）、2B4（CD244としても公知、アクセッション番号：NM_001166664.1）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、CTLA-4は、ある種のCD4 T細胞およびCD8 T細胞において発現される細胞表面タンパク質であり；抗原提示細胞上のリガンド（B7-1およびB7-2）と会合した時、T細胞の活性化およびエフェクター機能が阻害される。従って、本発明は、免疫チェックポイントに関与する少なくとも1種のタンパク質、具体的には、PD1および／またはCTLA-4を不活化することによって、T細胞を遺伝子修飾する工程を含む、具体的には、免疫治療のため、T細胞を操作する方法に関する。

具体的な態様において、細胞を操作する方法は、以下の工程のうちの少なくとも一つを含む：
（a）好ましくは、細胞培養物からまたは血液試料から、T細胞を準備する工程；
（b）DNA切断によって、好ましくは二本鎖破壊によって、免疫チェックポイントタンパク質をコードする1種の遺伝子を選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをT細胞へ導入する工程、
（c）該細胞を増大させる工程。

より好ましい態様において、方法は以下を含む：
（a）好ましくは、細胞培養物からまたは血液試料から、T細胞を準備する工程；
（b）DNA切断によって、好ましくは二本鎖破壊によって、免疫チェックポイントタンパク質をコードする遺伝子を選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子によってT細胞を形質転換する工程；
（c）T細胞において低頻度切断エンドヌクレアーゼを発現させる工程；
（d）該細胞を増大させる工程。

具体的な態様において、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、PD1、CTLA-4、LAG3、Tim3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、TCRα、およびTCRβからなる群より選択される1種の遺伝子を特異的に標的とする。別の態様において、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEヌクレアーゼ、またはCAS9/CRISPRエンドヌクレアーゼ複合体であり得る。好ましい態様において、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼである。TALEヌクレアーゼとは、TAL（Transcription Activator Like）エフェクター（TALE）に由来するDNA結合ドメインと核酸標的配列を切断する1つのヌクレアーゼ触媒ドメインとからなる融合タンパク質である（Boch,Scholze et al.2009；Moscou and Bogdanove 2009；Christian,Cermak et al.2010；Cermak,Doyle et al.2011；Geissler,Scholze et al.2011；Huang,Xiao et al.2011；Li,Huang et al.2011；Mahfouz,Li et al.2011；Miller,Tan et al.2011；Morbitzer,Romer et al.2011；Mussolino,Morbitzer et al.2011；Sander,Cade et al.2011；Tesson,Usal et al.2011；Weber,Gruetzner et al.2011；Zhang,Cong et al.2011；Deng,Yan et al.2012；Li,Piatek et al.2012；Mahfouz,Li et al.2012；Mak,Bradley et al.2012）。

非アロ反応性T細胞
別の態様において、本発明は、同種免疫治療のために特に適当であり得る。この場合、細胞を遺伝子修飾する工程のうちの一つは、以下の工程を含む方法であり得る：
（a）T細胞受容体（TCR）の成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を不活化することによって、T細胞を修飾する工程、
（b）該細胞を増大させる工程。

具体的な態様において、方法の遺伝子修飾は、低頻度切断エンドヌクレアーゼが、1種の標的とされた遺伝子において特異的に切断を触媒し、それによって、標的とされた遺伝子を不活化するよう、操作すべき準備された細胞において、低頻度切断エンドヌクレアーゼを発現させることによる。具体的な態様において、細胞を操作する方法は、以下の工程のうちの少なくとも一つを含む：
（a）好ましくは、細胞培養物からまたは血液試料から、T細胞を準備する工程；
DNA切断によって、好ましくは二本鎖破壊によって、T細胞受容体（TCR）の成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをT細胞へ導入する工程、
（b）該細胞を増大させる工程。

より好ましい態様において、方法は、以下の工程を含む：
（a）好ましくは、細胞培養物からまたは血液試料から、T細胞を準備する工程；
（b）DNA切断によって、好ましくは二本鎖破壊によって、T細胞受容体（TCR）の成分をコードする少なくとも1種の遺伝子を選択的に不活化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼによってT細胞を形質転換する工程；
（c）T細胞において低頻度切断エンドヌクレアーゼを発現させる工程；
（d）細胞表面上にTCRを発現していない形質転換されたT細胞を分取する工程；
（e）該細胞を増大させる工程。

修飾された高活性免疫細胞を遺伝子操作するため、本発明は、PD1およびCTLA-4のような遺伝子の発現の欠如によって免疫チェックポイントが阻止される方法も提供する。

本願は、生存している生物へそのような免疫細胞を投与することによって、医薬として、より具体的には癌を処置するかまたは防止するために使用される、操作された免疫細胞、具体的にはT細胞をさらに開示する。

本発明による養子免疫治療のために使用されるT細胞は、抗原特異的なT細胞の増大または遺伝子操作を通したT細胞の向け直しのいずれかによって生成され得る（Park,Rosenberg et al.2011）。ウイルス抗原特異的なT細胞の移入は、移植に関連したウイルス感染および稀なウイルス関連悪性疾患の処置のために使用されている、よく確立されている手法である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および移入は、黒色腫の処置において成功が示されている。

T細胞の活性化および増大
T細胞は、例えば、米国特許第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号；および米国特許出願公開第20060121005号に記載されるような方法に概ねしたがって、遺伝子改変の前であっても後であっても活性化させることができ、インビトロまたはインビボで増大させることができる。通常、これらは、T細胞の表面上のCD3 TCR複合体および共刺激分子を刺激してT細胞のための活性化シグナルを生成する薬剤との接触によって増大する。例えば、カルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）、またはフィトヘマグルチニン（PHA）のような分裂促進性レクチンのような化学物質が、T細胞のための活性化シグナルを生成するために使用され得る。非限定的な例として、T細胞集団は、例えば、表面に固定された抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片もしくは抗CD2抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼC活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、インビトロで刺激され得る。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のため、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞の集団は、T細胞の増殖を刺激するために適切な条件の下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。CD4+T細胞またはCD8+T細胞のいずれかの増殖を刺激するためには、抗CD3抗体および抗CD28抗体。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中に存在してもよいし、または表面にカップリングされていてもよい。当業者が容易に認識し得るように、粒子と細胞との比は、標的細胞と比べた粒子サイズに依存し得る。本発明のさらなる態様において、T細胞のような細胞を、薬剤によってコーティングされたビーズと組み合わせ、その後、ビーズと細胞とを分離し、次いで、細胞を培養する。別の態様において、培養前に、薬剤によってコーティングされたビーズと細胞とを分離せず、共に培養する。T細胞培養のために適切な条件には、血清（例えば、ウシ胎仔血清もしくはヒト胎児血清）、インターロイキン2（IL-2）、インスリン、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、およびTNF-、または当業者に公知の細胞の増殖のためのその他の添加剤を含む、増殖および生存可能性のために必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo 5（Lonza））が含まれる。細胞の増殖のためのその他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート（plasmanate）、ならびにN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールのような還元剤が含まれるが、これらに限定されない。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加されており、無血清であるか、または適切な量の血清（もしくは血漿）もしくはホルモンの定義されたセットおよび／もしくはT細胞の増殖および増大のために十分な量のサイトカインが補足されている、RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1、およびX-Vivo 20、Optimizerが含まれ得る。抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養にのみ含まれ、対象へ注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気＋5％C02）で維持される。様々な刺激時間に曝されたT細胞は、異なる特徴を示し得る。

別の具体的な態様において、細胞は、組織または細胞との共培養によって増大させることができる。細胞は、細胞を対象へ投与した後、インビボで、例えば対象の血液中で増大させてもよい。

治療的適用
既に記載されたような操作され単離された免疫細胞は、特に、その必要のある患者において癌または感染症を処置するための医薬として使用され得る。本発明はより具体的には、以下の工程のうちの少なくとも一つを含む、患者を処置する方法に関する：
（a）既に記載された方法のいずれかによって入手可能な免疫細胞を準備する工程；
（b）形質転換された免疫細胞を患者へ投与する工程。

本発明のT細胞を投与する前に、これらの細胞は、頑強なインビボT細胞増大を受けて、より長時間にわたる持続性を得ることができる。

処置は、寛解的、治癒的、または予防的であり得る。それは、自己免疫治療の一部または同種異系免疫治療処置の一部のいずれかであり得る。

自己とは、患者を処置するために使用される細胞、細胞株、または細胞の集団が、患者またはヒト白血球抗原（HLA）適合性ドナーに起因することを意味する。同種異系とは、患者を処置するために使用される細胞または細胞の集団が、患者ではなく、ドナーに起因することを意味する。

本発明は、T細胞、典型的には、ドナーから入手されたT細胞の非アロ反応性細胞への形質転換を可能にする限り、同種免疫治療のために特に適している。これは、標準的なプロトコルの下で行われ、必要とされる回数、再現され得る。得られた修飾されたT細胞は、プールされ、「既製の」治療用生成物として利用可能となり、1人または数人の患者へ投与され得る。

開示された方法によって使用され得る細胞は、以前のセクションに記載されている。処置は、癌、ウイルス感染、自己免疫障害、または移植片対宿主病（GvHD）を有すると診断された患者を処置するために使用され得る。処置され得る癌には、血管新生されていないか、または未だ実質的に血管新生されていない腫瘍も含まれるし、血管新生された腫瘍も含まれる。癌は、（血液腫瘍、例えば、白血病およびリンパ腫のような）非固形腫瘍を含んでいてもよいし、または固形腫瘍を含んでいてもよい。本発明の多鎖CARによって処置される癌のタイプには、癌腫、芽細胞腫、および肉腫、ならびにある種の白血病またはリンパ系悪性疾患、良性腫瘍および悪性腫瘍、ならびに悪性疾患、例えば、肉腫、癌腫、および黒色腫が含まれる。成人の腫瘍／癌および小児科の腫瘍／癌も含まれる。

処置は、抗体治療、化学療法、サイトカイン治療、樹状細胞治療、遺伝子治療、ホルモン治療、レーザー光線治療、および放射線治療の群より選択される、癌に対する1種または複数種の治療との組み合わせで、患者に投与してもよい。

本発明の好ましい態様によると、処置は、免疫抑制処置または化学療法を受けている患者に施すことができ、これは、本発明が、好ましくは、そのような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化または化学療法処置に対して抵抗性にすることに起因して、少なくとも1種の免疫抑制剤および／または化学療法剤に対して抵抗性にされた細胞または細胞の集団を提供するためである。この局面において、免疫抑制または化学療法処置は、患者における本発明によるT細胞の選択および増大を支援するべきである。

本発明による細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口、輸液、植え込み、または移植を含む、便利な様式で実施され得る。本明細書に記載された組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈注射もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に、患者へ投与され得る。一つの態様において、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈注射によって投与される。

細胞または細胞の集団の投与は、これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む、体重1kg当たり10⁴〜10⁹個の細胞、好ましくは、体重1kg当たり10⁵〜10⁶個の細胞の投与からなり得る。細胞または細胞の集団は、単回投与されてもよいしまたは複数回投与されてもよい。別の態様において、有効量の細胞が、単回投与される。別の態様において、有効量の細胞が、ある期間にわたり複数回投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断にあり、患者の臨床状態に依る。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーのような任意の起源から入手され得る。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態のための所定の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内にある。有効量とは、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存するであろう。

別の態様において、有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。投与は、静脈内投与であり得る。投与は、腫瘍内への注射によって直接行われてもよい。

本発明のある種の態様において、細胞は、抗ウイルス治療、シドホビル、およびインターロイキン2、シタラビン（ARA-Cとしても公知）のような薬剤による処置、またはMS患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはPML患者のためのその他の処置を含むが、これらに限定されない、多数の関連する処置モダリティと共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者へ投与される。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびFK506のような免疫抑制剤、抗体、またはCAMPATH、抗CD3抗体、もしくはその他の抗体治療のようなその他の免疫除去（immunoablative）剤、シトキシン（cytoxin）、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせて使用されてもよい。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または増殖因子によって誘導されるシグナリングにとって重要なp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Liu et al., Cell 66:807-815, 1 1; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93）。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外部照射治療（XRT）、シクロホスファミドのような化学療法剤、またはOKT3もしくはCAMPATHのような抗体のいずれかを使用したT細胞除去治療と共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者へ投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなB細胞除去治療の後に投与される。例えば、一つの態様において、対象は、高用量化学療法による標準的な処置を受けた後、末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある種の態様において、移植の後、対象は、増大させた本発明の免疫細胞の注入を受ける。付加的な態様において、増大させた細胞は、手術の前または後に投与される。本明細書に記載された方法のいずれかによって入手される修飾された細胞は、本発明の具体的な局面において、宿主対移植片（HvG）拒絶および移植片対宿主病（GvHD）に対して、その必要のある患者を処置するために使用され得る；従って、不活化されたTCRα遺伝子および／またはTCRβ遺伝子を含む修飾された細胞を、有効量、患者へ投与することによって、患者を処置する工程を含む、宿主対移植片（HvG）拒絶および移植片対宿主病（GvHD）に対して、その必要のある患者を処置する方法は、本発明の範囲内である。

他の定義
ポリペプチド配列内のアミノ酸残基は、1文字コードによって本明細書において表記され、例えば、QはGln、すなわちグルタミン残基を意味し、RはArg、すなわちアルギニン残基を意味し、DはAsp、すなわちアスパラギン酸残基を意味する。

アミノ酸置換とは、あるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への交換を意味し、例えば、ペプチド配列内のアルギニン残基のグルタミン残基への交換は、アミノ酸置換である。

ヌクレオチドは以下のように表記される：1文字コードがヌクレオシドの塩基を表記するために使用される：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドのため、rはgまたはa（プリンヌクレオチド）を表し、kはgまたはtを表し、sはgまたはcを表し、wはaまたはtを表し、mはaまたはcを表し、yはtまたはc（ピリミジンヌクレオチド）を表し、dはg、a、またはtを表し、vはg、a、またはcを表し、bはg、t、またはcを表し、hはa、t、またはcを表し、nはg、a、t、またはcを表す。

本明細書において使用されるように、「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）のようなヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片をさす。核酸分子は、（DNAおよびRNAのような）天然に存在するヌクレオチド、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性体）、または両方の組み合わせであるモノマーから構成され得る。修飾型ヌクレオチドは、糖モエティおよび／またはピリミジン塩基モエティもしくはプリン塩基モエティに変化を有し得る。糖修飾には、例えば、1つ以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基への交換が含まれ、または糖がエーテルもしくはエステルとして官能化されていてもよい。さらに、糖モエティ全体が、アザ糖および炭素環式糖類似体のような立体的かつ電子的に類似した構造に交換されてもよい。塩基モエティの修飾の例には、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、またはその他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体によって連結され得る。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。

キメラ抗原受容体（CAR）とは、特異的な抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するため、標的細胞上に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体に基づく特異性を、T細胞受容体を活性化する細胞内ドメインと組み合わせた分子を表す。先行技術では、CARは、細胞外単鎖抗体（scFvFc）がT細胞抗原受容体複合体ζ鎖の細胞内シグナリングドメインに融合したもの（scFvFc:ζ）を含む単鎖ポリペプチドからなり、T細胞において発現された時に、モノクローナル抗体の特異性に基づき、抗原認識を向け直す能力を有している。先行技術において使用されたCARの一例は、CD19抗原に対するCARである（）。本発明によるCARは、単鎖または多鎖の編成で存在する。その細胞外ドメインは、既に定義されたようなVNARポリペプチドを含む単鎖抗原認識ドメインからなる。この細胞外ドメインは、膜貫通ドメインとの融合によって、細胞膜に付着させられる。CARは単鎖または多鎖の編成を採用することができる。CARが単鎖である時、膜貫通ドメインは、独特のポリペプチドを形成するため、シグナリングドメインに融合されるか、またはシグナリングドメインを含む。CARが多鎖CARである時、シグナリングドメインは、VNARポリペプチドを含む融合ポリペプチドと共に集合するであろう別のポリペプチドに存在し得る。

「送達ベクター」とは、本発明において必要とされる薬剤／化学物質および分子（タンパク質または核酸）を、細胞と接触させるため（即ち、「接触」）、または細胞もしくは細胞内区画へ送達するため（即ち、「導入」）、本発明において使用され得る送達ベクターを表す。それには、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学的担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、微小気泡（超音波造影剤）、ナノ粒子、乳濁液、またはその他の適切な移入ベクターが含まれるが、これらに限定されない。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、高分子（遺伝子、タンパク質）、またはプラスミド、Diatosによって開発されたペプチドのようなその他のベクターの送達を可能にする。これらのケースにおいて、送達ベクターは分子担体である。「送達ベクター」とは、トランスフェクションを実施するための送達方法も表す。

「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子をさす。本発明における「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸、もしくは合成核酸からなり得る直鎖状もしくは環状のDNA分子もしくはRNA分子が含まれるが、これらに限定されない。好ましいベクターは、それらが連結された核酸の自律複製が可能なもの（エピソームベクター）および／または発現が可能なもの（発現ベクター）である。多数の適当なベクターが、当業者に公知であり、市販されている。

ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）のようなマイナス鎖RNAウイルス、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスのようなプラス鎖RNAウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス）を含む二本鎖DNAウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる（Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,Third Edition,B.N.Fields,et al.,Eds.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996）。

「レンチウイルスベクター」とは、比較的大きいパッケージング能力、低下した免疫原性、および広範囲の異なる細胞型を高い効率で安定的に形質導入する能力のため、遺伝子送達のために極めて有望である、HIVに基づくレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、一般的には、3種（パッケージング、エンベロープ、および移入）またはそれ以上のプラスミドを産生細胞に一過性トランスフェクションした後、生成される。HIVと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質の細胞表面上の受容体との相互作用を通して標的細胞に侵入する。侵入後、ウイルスRNAが、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、感染細胞のDNAへのウイルス組み込みのための基質となる二本鎖の直鎖状ウイルスDNAである。「組込みレンチウイルスベクター（またはLV）」とは、非限定的な例として、標的細胞のゲノムに組み込まれ得るそのようなベクターを意味する。反対に、「非組込みレンチウイルスベクター（またはNILV）」とは、ウイルスインテグラーゼの作用を通して標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。

送達ベクターおよびベクターは、ソノポレーション（sonoporation）もしくは電気穿孔のような細胞透過処理技術、またはこれらの技術の変法と関連しているかまたは組み合わせられていてよい。

細胞とは、真核生物の生存細胞、初代細胞、およびインビトロ培養のためのこれらの生物に由来する細胞株を表す。

「初代細胞」とは、集団倍化をほとんど受けておらず、従って、腫瘍形成性の連続細胞株または人為的に不死化された細胞株と比較して、それが由来した組織の主な機能的成分および特徴をよりよく表している、生存組織（即ち、生検材料）から直接採取され、インビトロでの増殖のために確立された細胞を表す。

非限定的な例として、細胞株は、CHO-K1細胞；HEK293細胞；Caco2細胞；U2-OS 細胞；NIH 3T3細胞；NSO細胞；SP2細胞；CHO-S細胞；DG44細胞；K-562細胞、U-937細胞；MRC5細胞；IMR90細胞；ジャーカット細胞；HepG2細胞；HeLa細胞；HT-1080細胞；HCT-116細胞；Hu-h7細胞；Huvec細胞；Molt 4細胞からなる群より選択される。

これらの細胞株は、全て、関心対象の遺伝子またはタンパク質を作製し、発現させ、定量化し、検出し、研究するための細胞株モデルを提供するため、本発明の方法によって改変され得；これらのモデルは、研究および作製、ならびに非限定的な例としての化学物質、生物燃料、治療薬、および農学のような様々な領域において、関心対象の生理活性分子をスクリーニングするためにも使用され得る。

「変異」とは、ポリヌクレオチド（cDNA、遺伝子）またはポリペプチドの配列における1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、20個、25個、30個、40個、50個、またはそれ以上までのヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を表す。変異は、遺伝子のコード配列またはその制御配列に影響を与える場合がある。また、ゲノム配列の構造またはコードされたmRNAの構造／安定性に影響を与える場合もある。

「バリアント」とは、親分子のアミノ酸配列における少なくとも1つの残基の変異または交換によって入手されたリピートバリアント、バリアント、DNA結合バリアント、TALEヌクレアーゼバリアント、ポリペプチドバリアントを表す。

「機能的バリアント」とは、タンパク質またはタンパク質ドメインの触媒活性変異体を表し；そのような変異体は、その親のタンパク質またはタンパク質ドメインと比較して、同一の活性、または付加的な特性、またはより高いかもしくはより低い活性を有し得る。

「遺伝子」とは、特定のタンパク質またはタンパク質のセグメントをコードする染色体に沿って直鎖状に配置されたDNAのセグメントからなる遺伝の基本単位を意味する。遺伝子は、典型的には、プロモーター、5'非翻訳領域、1つ以上のコード配列（エクソン）、任意で、イントロン、3'非翻訳領域を含む。遺伝子は、ターミネーター、エンハンサー、および／またはサイレンサーをさらに含み得る。

「融合タンパク質」とは、別々のタンパク質またはそれらの一部を最初にコードする2種以上の遺伝子の接合からなる当技術分野における周知の過程の結果を表し、「融合遺伝子」の翻訳は、最初のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドをもたらす。

「同一性」とは、2種の核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性をさす。同一性は、比較の目的のために整列化され得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列のある位置が同一の塩基によって占有される時、それらの分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列が共有している位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージ（University of Wisconsin,Madison,Wis.）の一部として入手可能であるFASTAまたはBLASTを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが、2種の配列の間の同一性を計算するために使用され得、例えば、デフォルト設定で使用され得る。例えば、本明細書に記載された特定のポリペプチドとの少なくとも70％、85％、90％、95％、98％、または99％の同一性を有しており、好ましくは、実質的に同一の機能を示すポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、企図される。

「類似性」とは、2種以上のポリペプチドのアミノ酸配列の間の関係を記載する。BLASTPも、BLOSUM45、BLOSUM62、またはBLOSUM80のような類似性マトリックスを使用して、参照アミノ酸配列との少なくとも70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、97.5％、98％、99％の配列類似性を有するアミノ酸配列を同定するために使用され得る。他に示されない限り、類似性スコアは、BLOSUM62の使用に基づくであろう。BLASTPが使用される時、パーセント類似性は、BLASTP陽性スコアに基づき、パーセント配列同一性は、BLASTP同一性スコアに基づく。BLASTP「同一性」は、同一である高スコア配列対における全残基の数および画分を示し；BLASTP「陽性」は、アライメントスコアが正の値を有しており、相互に類似している残基の数および画分を示す。本明細書に開示されたアミノ酸配列との同一性もしくは類似性のこれらの程度または同一性もしくは類似性の中間の程度を有するアミノ酸配列が、本開示によって企図され包含される。

「シグナル伝達ドメイン」または「共刺激リガンド」とは、T細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むがこれらに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されないが、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンドのような、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。

「二重特異性抗体」とは、単一の抗体分子内に2種の異なる抗原のための結合部位を有する抗体をさす。正準抗体構造に加えて、他の分子が、2つの結合特異性を含んで構築され得ることは、当業者によって認識されるであろう。二重特異性抗体による抗原結合は、同時であってもよいしまたは連続であってもよいことが、さらに認識されるであろう。全てそれ自体公知である、化学的技術（例えば、Kranz et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,5807を参照すること）、「ポリドーマ（polydoma）」技術（米国特許第4,474,893号を参照すること）、または組換えDNA技術によって、二重特異性抗体を作製することができる。非限定的な例として、各結合ドメインは、抗体重鎖に由来する少なくとも1つの可変領域（「VHまたはH領域」）を含み、第1の結合ドメインのVH領域はCD3のようなリンパ球マーカーに特異的に結合し、第2の結合ドメインのVH領域は腫瘍抗原に特異的に結合する。

「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するよう選択され得る。従って、リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌、および寄生虫の感染、自己免疫疾患、ならびに癌細胞に関連したものが含まれる。

「対象」または「患者」という用語には、本明細書において使用されるように、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界の全てのメンバーが含まれる。

本明細書において数的な限度または範囲が記述される場合、その終点が含まれる。数的な限度または範囲に含まれる全ての値および部分範囲も、明示的に記載されたかのごとく、具体的に含まれる。

以下の実施例は、例示の目的のため本明細書に提供されるに過ぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。

単鎖および多鎖の抗CD19キメラ抗原受容体（CAR）をそれぞれコードするmRNAによるT細胞の電気穿孔
図6および7にそれぞれ例示された以下の転写物を用いて同一のプロトコルに従った：
−CD19抗原に対するVNAR-CAR単鎖ポリペプチドをコードするSEQ ID NO：110の単シストロン転写物。この転写物は、共刺激ドメイン4-1BB、およびITAMを含むシグナリングドメインCD3ζにそれ自体が融合した、CD8α由来の膜貫通ドメインに融合した、足場SEQ ID NO：1に由来するVNARポリペプチド抗CD19を含む単鎖ポリペプチドをコードする。
−CD19抗原に対するマルチサブユニットCARをコードするSEQ ID NO：105の多シストロン転写物。翻訳された配列を異なる鎖へ分割するため、T2A配列およびF2A配列が導入されている。第1の鎖は、FcεRIα鎖の膜貫通ドメインに連結された外部VNARポリペプチド抗CD19（単鎖CARと同一物）をコードする。

CD8α鎖のヒンジ領域は、形質転換されたT細胞の表面におけるPEコンジュゲートヤギ抗体染色を通して検出可能であるため、両方の編成において、それを使用した。

転写物は、細胞膜への効率的な接近を可能にするため、T細胞特異的なαシグナルペプチド配列も含有していた。

VNAR一次構造の異なる構造的な要素（即ち、主としてCDR3領域およびCDR1領域の外部に位置するもの）を、構造的に類似したヒト抗体に見出されるアミノ酸配列に交換することによって、CD19を標的とするために使用されるVNARポリペプチドのヒト化を行うことができる。一例として、そのようなアプローチは、可変κサブグループ1（Vk1）のメンバー、ヒト抗体DPK9をフレームワークとして使用して、5A7 VNARをヒト化するため、成功裡に使用されている。

抗CD3/CD28によってコーティングされたビーズおよびIL2によって数日（3〜5日）予め活性化された5×10⁶個のT細胞を、サイトポレーション（cytoporation）バッファーTに再懸濁させ、mRNAなしで、または単鎖VNAR-CAR（SEQ ID NO：110）および多鎖VNAR-CAR（SEQ ID NO：105）をそれぞれコードする10μgのmRNAによって、0.4cmキュベットにおいて電気穿孔した。

電気穿孔の24時間後、生存細胞上のCARの細胞表面発現を査定するため、fixable viability dye eFluor-780およびPEコンジュゲートヤギ抗CD8によって細胞を染色した。

電気穿孔の24時間後、T細胞を6時間Daudi（CD19⁺）細胞と共培養し、表面における脱顆粒マーカーCD107aの発現を検出するため、フローサイトメトリーによって分析した（Betts,Brenchley et al.2003）。

結果は、上記のような単シストロンmRNAまたは多シストロンmRNAのいずれかによって電気穿孔された細胞の大部分が、CD19を発現している標的細胞の存在下で脱顆粒することを示した。これらの結果は、電気穿孔されたT細胞の表面において発現されたVNAR-CARが、単鎖および多鎖の編成の両方で活性であったことを明白に証明している。

（表２）本明細書にリストされた配列

参照のリスト：

Claims

（i）VNARポリペプチドを含む1つの細胞外抗原認識ドメイン；および
（ii）少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含む1つの膜貫通ポリペプチド
を含むことを特徴とするキメラ抗原受容体（CAR）。
抗原認識ドメインが、CDR1およびCDR3と呼ばれる2つの相補性決定領域（CDR）のみを含む、請求項1記載のキメラ抗原受容体。
抗原認識ドメインが1つの相補性決定領域（CDR3）のみを有する、請求項1記載のキメラ抗原受容体。
抗原に対するCARの認識の特異性がCDR3によって決定される、請求項1〜3のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
CDR3が、VNARポリペプチドに由来する残基とのジスルフィド結合を生成する少なくとも2つのシステイン残基を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
膜貫通領域と細胞外抗原認識ドメインとの間にヒンジ領域をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
細胞外ドメイン全体が150アミノ酸より短い、請求項1〜6のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
VNARポリペプチドがSEQ ID NO：1〜100のいずれかとの少なくとも50％の配列同一性を有する、請求項1〜7のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
VNARポリペプチド配列がヒト化されている、請求項8記載のキメラ抗原受容体。
CARの膜貫通領域が、TCRζ鎖、Fc受容体鎖、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）からなる群より選択されるシグナル伝達ドメインを含む、請求項1〜9のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
CD28、OX40、ICOS、CD137、およびCD8からなる群より選択される共刺激分子をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
単鎖（single-chain）CARの形態にある、請求項1〜11のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
多鎖（multi-chain）CARの形態にある、請求項1〜12のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体。
CARのシグナル伝達ドメインおよび細胞外抗原認識ドメインが、同一の鎖に存在せず、二量体または多量体のキメラ抗原受容体を形成するために相互作用する少なくとも2本の異なる鎖に存在する、請求項13記載の多鎖キメラ抗原受容体。
FcεRI鎖が、合わせて多量体CARを形成するために二量体化するか、三量体化するか、または四量体化するよう、異なる鎖が、FcεRIα鎖、FcεRIβ鎖、および／もしくはFcεRIγ鎖の一部分、またはそれらのバリアントを含む、請求項14記載の多鎖キメラ抗原受容体。
共刺激ドメインまたはシグナル化ドメインが膜近傍の位置にあるよう、異なる多量体が集合する、請求項14または15記載の多鎖キメラ抗原受容体。
請求項1〜13のいずれか一項記載のCARをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
請求項14〜16のいずれか一項記載の多鎖CARを構成する2種以上の膜貫通ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
請求項17または18記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（a）免疫細胞を準備する工程；
（b）請求項1〜16のいずれか一項記載の少なくとも1種のキメラ抗原受容体を該細胞の表面に発現させる工程
を含む、免疫細胞を操作する方法。
（a）免疫細胞を準備する工程；
（b）請求項17または18記載の少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程；
（c）ポリヌクレオチドを該細胞において発現させる工程
を含む、請求項20記載の免疫細胞を操作する方法。
請求項20または21のいずれか一項記載の方法から入手可能な単離された免疫細胞。
請求項1〜16のいずれか一項記載の少なくとも1種のキメラ抗原受容体を含む単離された免疫細胞。
炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球に由来する、請求項22または23のいずれか一項記載の単離された細胞。
医薬として使用するための、請求項22〜24のいずれか一項記載の単離された免疫細胞。
癌または自己免疫疾患を処置するための医薬として使用するための、請求項22〜24のいずれか一項記載の単離された免疫細胞。
液性腫瘍を処置するための医薬として使用するための、請求項22〜24のいずれか一項記載の単離された免疫細胞。
B細胞悪性疾患を処置するための医薬として使用するための、請求項22〜24のいずれか一項記載の単離された免疫細胞。
単独でまたは化学療法と組み合わせて、表面上に排出ポンプのイオンチャネルを発現している薬剤耐性細胞を標的とするための医薬として使用するための、請求項22〜24のいずれか一項記載の単離された免疫細胞。
養子免疫治療において使用するための、請求項22〜24のいずれか一項記載の単離された免疫細胞。
（a）請求項1〜16のいずれか一項記載のキメラ抗原受容体を含む免疫細胞を準備する工程；
（b）該免疫細胞を患者へ投与する工程
を含む、その必要のある患者を処置するための方法。
（a）の免疫細胞がドナーから得られる（同種モード）、請求項31記載の患者を処置するための方法。
（a）の免疫細胞がその必要のある患者から得られる（自己モード）、請求項31記載の患者を処置するための方法。