ES2701846T3 - Receptor de antígeno quimérico que usa dominios de reconocimiento de antígenos derivados de pez cartilaginoso - Google Patents

Receptor de antígeno quimérico que usa dominios de reconocimiento de antígenos derivados de pez cartilaginoso Download PDF

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Abstract

Receptor de antígeno quimérico (CAR) caracterizado porque comprende: i) un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que comprende un polipéptido de VNAR; y ii) un polipéptido transmembrana que comprende al menos un dominio de transducción de señales;

Description

DESCRIPCIÓN
Receptor de antígeno quimérico que usa dominios de reconocimiento de antígenos derivados de pez cartilaginoso Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la inmunoterapia celular y más particularmente a una nueva generación de receptores de antígenos quiméricos (CAR), cuya especificidad la confieren polipéptidos de VNAR derivados de anticuerpos monoméricos de pez cartilaginoso. El CAR de la invención puede expresarse en la superficie de células inmunitarias para redirigir su especificidad hacia antígenos específicos, en particular antígenos huecos, tales como componentes de canales iónicos y bombas de flujo de salida que confieren resistencia a fármacos frente a células malignas. La invención abre el camino a estrategias de inmunoterapia adoptiva eficaces, especialmente para el tratamiento de formas de cáncer resistentes a tratamiento.
Antecedentes de la invención
La inmunoterapia adoptiva, que implica la transferencia de células T específicas de antígeno autólogas generadas ex vivo, es una estrategia prometedora para tratar infecciones virales y cáncer. Las células T usadas para la inmunoterapia adoptiva pueden generarse o bien mediante expansión de células T específicas de antígeno o bien redirección de células T a través de ingeniería genética (Park, Rosenberg et al. 2011). La transferencia de células T específicas de antígenos virales es un procedimiento bien establecido usado para el tratamiento de infecciones virales asociadas a trasplantes y tumores malignos relacionados con virus poco comunes. De manera similar, el aislamiento y la transferencia de células T específicas de tumor han mostrado ser satisfactorios en el tratamiento de melanoma.
Se han generado satisfactoriamente especificidades novedosas en células T a través de la transferencia genética de receptores de células T transgénicos o receptores de antígenos quiméricos (CAR) (Jena, Dotti et al. 2010). Los CAR son receptores sintéticos que consisten en un resto de direccionamiento que está asociado con uno o más dominios de señalización en una única molécula de fusión. En general, el resto de unión de un CAR consiste en un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), que comprende los fragmentos variables ligero y pesado de un anticuerpo monoclonal unidos por un ligador flexible. También se han usado satisfactoriamente restos de unión basados en dominios de ligando o receptor. Los dominios de señalización para los CAR de la primera generación se derivan de la región citoplasmática de las cadenas gamma de receptor de Fc o de CD3zeta. Los CAR de la primera generación han mostrado redirigir satisfactoriamente la citotoxicidad de células T, sin embargo, no pudieron proporcionar expansión prolongada y actividad antitumoral in vivo. Se han añadido dominios de señalización de moléculas coestimuladoras incluyendo CD28, OX-40 (CD134), ICOS y 4-1BB (CD137) solos (segunda generación) o en combinación (tercera generación) para potenciar la supervivencia y aumentar la proliferación de células T modificadas con CAR. Los CAR han permitido satisfactoriamente que las células T se redirijan contra antígenos expresados en la superficie de células tumorales de diversos tumores malignos incluyendo linfomas y tumores sólidos (Jena, Dotti et al. 2010). Sin embargo, por ejemplo, será difícil seleccionar como diana eficazmente algunos antígenos de superficie con anticuerpos clásicos ya que los AcM no pueden acceder a epítopos incrustados en las estructuras proteicas (por ejemplo numerosos receptores de superficie pueden contener el bolsillo de unión a ligando). Además, en anticuerpos de cadena sencilla (scFv), CAR que comprenden los fragmentos variables ligero y pesado de un anticuerpo monoclonal unidos por un ligador flexible tienen limitaciones debido a su tamaño y complejidad estructural que los hace problemáticos de fabricar y predecir su eficacia.
En el presente documento, los inventores han aliviado estas limitaciones creando nuevos receptores de antígenos quiméricos en los que la especificidad de antígeno está mediada a través de receptores de antígenos variables (VNAR) derivados de pez cartilaginoso.
Sumario de la invención
A pesar de su éxito, las moléculas de IgG han mostrado limitaciones prácticas como parte de los constructos de cAr actuales. En particular son estructuras tetraméricas grandes (~150 kDa) propensas a provocar reacciones inmunitarias y caras de desarrollar.
VNAR (dominio variable del IgNAR, o receptor de antígeno novedoso) forma una clase única de proteína que se ha identificado en el suero de pez cartilaginoso. El VNAR puede aislarse como un dominio de unión monomérico de 12­ 15 kDa de tamaño, es decir, un tamaño mucho más pequeño que IgG.
Se han identificado VNAR durante varios años como posibles productos bioterapéuticos basándose en su robustez y solubilidad, propensión a unirse a hendiduras de antígenos y bloquear los sitios activos de enzimas, y altas afinidades de unión para una gama de antígenos. Sin embargo, siguen estando mucho peor entendidos estructural y biofísicamente que otros tipos de receptores de antígeno. El dominio VNAR comparte características estructurales con el receptor de células T Va y la cadena Vk de IgG, pero la homología de secuencia con estos dominios es baja (~35%). En contraposición a scFv, los polipéptidos de VNAR tienen la característica común de carecer de CDR2 (CDR = región determinante de complementariedad). Habitualmente contienen un bucle de CDR1 más corto pero un bucle de CDR3 más largo, que crean la superficie de unión principal del dominio.
Dadas estas características, no era predecible que los VNAR fueran adecuados para la construcción de receptores quiméricos eficaces. De hecho, se había considerado hasta la fecha que las arquitecturas de CAR requerían dominios de reconocimiento de antígenos extracelulares bastante extensos para alcanzar antígenos presentes en la superficie de células infectadas o malignas.
La invención se refiere a un nuevo receptor de antígeno quimérico de este tipo que incluye polipéptidos de VNAR como dominios de reconocimiento de antígenos.
La presente divulgación también se refiere a los polipéptidos que codifican para estos nuevos CAR denominados “VNAR-CAR” y a métodos de modificación por ingeniería genética de células inmunitarias, en particular células T, mediante expresión de dichos polipéptidos celulares. Las células inmunitarias que pueden obtenerse mediante estos métodos debe tolerarlas mejor el organismo del paciente y destruirse más lentamente por el sistema inmunitario. En realizaciones más específicas, se proponen diferentes arquitecturas para los VNAR-CAR de la invención dependiendo de su estructura de una única cadena o múltiples cadenas, lo que permite la modulación de la interacción y/o activación de la célula inmunitaria tras el reconocimiento del antígeno. El VNAR también puede humanizarse para que contenga secuencias menos inmunogénicas, de manera que las células T que expresan CAR no desencadenen una respuesta inmunitaria a partir del organismo receptor (por ejemplo ser humano). Las células T que expresan los VNAR CAR también pueden modificarse por ingeniería genética para uso terapéutico alogénico, por ejemplo, mediante alteración de los genes que codifican para receptores de células T (ATCR).
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Estructura general de polipéptidos de VNAR usados como dominios de reconocimiento de antígenos. Figura 2: Alineación de secuencias de cuatro armazones de VNAR a modo de ejemplo representativos de tiburón correspondientes a SEQ ID NO. 1 (E06), SEQ ID NO. 101 (5A7), SEQ ID NO. 102 (7e80) y SEQ ID NO. 115 (12A9). Figura 3: Representación esquemática de un VNAR-CAR de una única cadena a modo de ejemplo según la invención que comprende (1) un dominio extracelular compuesto por un polipéptido de VNAR que comprende una CDR3 que actúa como dominio de reconocimiento de antígeno principal y una bisagra de CD8, (2) un polipéptido transmembrana que comprende 4-1BB (dominio coestimulador) y CD3zeta (dominio de señalización).
Figura 4: Representación esquemática de un VNAR-CAR de múltiples cadenas a modo de ejemplo según la presente invención basado en la estructura del receptor de FceRI receptor. El polipéptido de VNAR se fusiona con la cadena alfa de FceRI, mientas que el dominio coestimulador se fusiona con la cadena gamma de FceRI y el dominio de señalización con la cadena beta de FceRI.
Figuras 5 y 6: Representaciones esquemáticas de diferentes versiones a modo de ejemplo de los CAR de múltiples cadenas de la presente invención (csm1 a csm10) que comprenden un polipéptido de VNAR extracelular fusionado con una región de tallo/bisagra de CD8 fusionada con el dominio transmembrana de la cadena alfa de FceRI, mientras que al menos unos dominios zeta de 41BB, CD28 y/o CD3 coestimuladores están fusionados con las cadenas alfa, beta y/o bien gamma de FceRI.
Figura 7: Representación esquemática de la estructura del CAR de una única cadena según la invención (SEQ ID NO. 110) tal como se describe en el ejemplo 1.
Figura 8: Representación esquemática de la estructura de un CAR de múltiples cadenas según la invención (SEQ ID NO. 105) tal como se describe en el ejemplo 1.
Descripción detallada de la invención
A menos que se definan específicamente en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos usados tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica en los campos de terapia génica, bioquímica, genética y biología molecular.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, EE.UU.); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. patente estadounidense n.° 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); la serie, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson y M. Simon, eds.-en-chief, Academic Press, Inc., Nueva York), específicamente, los volúmenes 154 y 155 (Wu et al. eds.) y el vol. 185, “Gene Expression Technology” (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walquer, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); y Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
La presente invención se centra principalmente en un receptor de antígeno quimérico (CAR) caracterizado porque comprende:
i) un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que comprende un polipéptido de VNAR; y
ii) un polipéptido transmembrana que comprende al menos un dominio de transducción de señales;
los polipéptidos de VNAR son distintos de los dominios VH y VL de Ig típicos, así como de dominios VHH de camélidos, en particular al compartir homología estructural superior con dominios V de receptor de células T (TCR) y VL de inmunoglobulina que con VH de inmunoglobulina.
La característica más única de polipéptidos de VNAR es la ausencia de un bucle de CDR2 y de dos cadenas p, C' y C”, asociadas con el mismo. En su lugar, se forma una “cinta” definida alrededor del medio de la estructura de sándwich p (Kovalenko et al., 2013). Esta región muestra una elevada tasa de mutaciones somáticas y se ha denominado por tanto región hipervariable 2, HV2). Otra región de frecuencia de mutación aumentada se ubica entre HV2 y CDR3, que comprende un bucle que une las cadenas p D y E de manera similar a aquella en las cadenas V de TCR V; por tanto, esta región se denominó HV4. Estructuralmente, HV2 es la más proximal a CDR3, mientras que HV4 está en proximidad a CDR1. Varios tipos estructurales de dominios variables de IgNAR se han clasificado basándose en el número y la posición de residuos de cisteína extra en las CDR y regiones de marco (FW) además del par de cisteínas canónico (Cys-23/Cys-88 para VL, nomenclatura de Kabat) del pliegue de Ig. V-NAR de tipo I, encontrado en tiburones nodriza, tiene 2 cisteínas en CDR3 y 2 más en las regiones de marco (FW2 y FW4). El tipo II más común tiene un par de cisteínas extra que une CDR1 y CDR3. El tipo III, detectado principalmente en el desarrollo neonatal de tiburones, es similar al tipo II pero tiene un residuo de Trp conservado en CDR1 y diversidad de CDR3 limitada. Otro tipo estructural de V-NAR, que se ha denominado tipo IV, tiene 3 sólo dos residuos de cisteína canónicos. Hasta la fecha, este tipo se ha encontrado principalmente en tiburones cazón, y también se aisló de bibliotecas de V-NAR semisintéticas derivadas de tiburones alfombra. La naturaleza de un único dominio y la falta de CDR2 en V-NAR refuerza el requisito de CDR1 y CDR3 para proporcionar unión específica y de alta afinidad a antígenos prospectivos. CDR3, que es más variable en cuanto a secuencia, longitud y conformación, desempeña el papel clave en el reconocimiento de antígenos.
Además, el dominio de reconocimiento de antígeno del CAR según la invención comprende preferiblemente sólo dos regiones determinantes de complementariedad (CDR) denominadas CDR1 y CDR3, y más preferiblemente, dicho dominio de reconocimiento de antígeno tiene sólo una región determinante de complementariedad (CDR3).
En general, la especificidad de reconocimiento del CAR para dicho antígeno viene determinada por dicha CDR3. La mayoría de las veces, CDR3 explica más del 50%, y más generalmente más del 70% de la activación de células T (es decir, la afinidad sólo se reduce en un 50 o un 30% cuando se modifica o elimina CDR1). La activación de células T puede medirse por diferentes medios, en particular usando el método descrito por Betts et al. (2003).
Los polipéptidos de VNAR que tienen la ventaja de ser polipéptidos relativamente pequeños (12-13 kDa) demuestran la ventaja de alta estabilidad biofísica, solubilidad y capacidad de unión a una variedad de antígenos, incluyendo epítopos ubicados en hendiduras sobre superficies proteicas (por ejemplo sitios activos de enzimas) que no son accesibles para dominios variables de anticuerpos tradicionales.
Según una realización preferida de la invención, la región CDR3, que es a menudo larga de entre 10 y 25 residuos, pero preferiblemente entre 15 y 20, sobresale de la superficie de VNAR. Esta región CD3 comprende preferiblemente al menos dos residuos de cisteína que crean enlaces disulfuro con residuos del polipéptido de VNAR para obtener una superficie de reconocimiento más sobresaliente.
El término “dominio de reconocimiento de antígeno extracelular” tal como se usa en el presente documento se define como un oligo- o polipéptido que puede unirse a un ligando, más específicamente un antígeno. Preferiblemente, el dominio podrá interaccionar con una molécula de la superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión a ligando extracelular puede elegirse para reconocer un ligando que actúa como marcador de superficie celular en células diana asociadas con un estado patológico particular. Por tanto, los ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos incluyen los asociados con infecciones virales, bacterianas y parasitarias, enfermedad autoinmunitaria y células cancerosas. En particular, el dominio de unión a ligando extracelular puede comprender un dominio de unión a antígeno derivado de un anticuerpo contra un antígeno de la diana.
Como ejemplos no limitativos, el antígeno de la diana puede ser cualquier agrupación de moléculas de diferenciación (por ejemplo CD16, CD64, CD78, CD96, CLL1, CD116, CD117, CD71, CD45, CD71, CD123 y CD138), un antígeno de superficie asociado a tumor, tal como ErbB2 (HER2/neu), antígeno carcinoembrionario (CEA), molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), variante III de EGFR (EGFRvlll), CD19, CD20, CD30, CD40, disialogangliósido GD2, mucina ductal-epitelial, gp36, TAG-72, glicoesfingolípidos, antígeno asociado a glioma, gonadotropina coriónica humana p, alfafetoproteína (AFP), AFP reactiva con lectina, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, transcriptasa inversa de telomerasa humana, RU1, RU2 (AS), carboxilo esterasa intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, próstata, antígeno específico de próstata (PSA), PAP, NYESO-1, LAGA-1a, p53, prosteína, PSMA, supervivencia y telomerasa, antígeno de tumor de carcinoma de próstata-1 (PCTA-1), MaGE, ELF2M, elastasa de neutrófilos, efrina B2, CD22, factor de crecimiento de insulina (IGF1)-I, IGF-II, receptor de IGFI, mesotelina, una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) que presenta un epítopo peptídico específico de tumor, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2D, antígenos estromales tumorales, el dominio extra A (EdA) y dominio extra B (EDB) de fibronectina y el dominio A1 de tenascina-C (TnC A1) y proteína asociada a fibroblastos (fap); un antígeno específico de tejido o específico de linaje tal como CD3, CD4, cD8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD133, CD138, CTLA-4, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), GM-CSF, receptores de citocina, endoglina, una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), BCMA (CD269, TNFRSF 17), o un antígeno de superficie específico de virus tal como un antígeno específico de VIH (tal como gp120 de VIH); un antígeno específico de VEB, un antígeno especifico de CMV, un antígeno específico de VPH, un antígeno específico de virus de Lassa, un antígeno específico de virus influenza así como cualquier derivado o variante de estos marcadores de superficie. Los antígenos no son necesariamente antígenos marcadores de superficie si no que pueden ser también antígenos pequeños endógenos presentados por HLA de clase I en la superficie de las células.
El dominio de unión a ligando extracelular puede comprender también un péptido que se une a un antígeno de la diana, un péptido o una proteína que se une a un anticuerpo que se une a un antígeno de la diana, un ligando de péptido o proteína tal como un factor de crecimiento, una citocina o una hormona como ejemplos no limitativos que se unen a un receptor sobre la diana, o un dominio derivado de un receptor tal como un receptor de factor de crecimiento, un receptor de citocina o un receptor de hormona como ejemplos no limitativos, que se unen a un ligando de péptido o proteína sobre la diana. Preferiblemente la diana es una célula, pero también puede ser un virus o un microorganismo. Según otro aspecto de la invención, los CAR según la invención pueden estar dirigidos a anticuerpos u otros CAR que comprenden cadenas de inmunoglobulina de Fc.
Los receptores de antígenos quiméricos según la presente invención presentan la ventaja de tener un dominio extracelular más pequeño que otros tipos de dominios de unión a ligando. En general el polipéptido de VNAR que forma este dominio extracelular es más corto de 150 aminoácidos, preferiblemente más corto de 140, más preferiblemente más corto de 130, incluso más preferiblemente más corto de 120 aminoácidos. En algunos casos, el polipéptido de VNAR puede ser de menos de 110 aminoácidos y algunas veces menos de 100 aminoácidos.
Los inventores han establecido que los CAR de dominios extracelulares más pequeños según la presente invención podrían ser particularmente eficaces para seleccionar como diana antígenos con una estructura hueca presentes en la superficie de las células, tales como polipéptidos implicados en una función de transporte. De hecho, las leucemias, como otros cánceres, soportan varias alteraciones genéticas de genes relacionados con tumores, tales como mutaciones puntuales, translocaciones, modificaciones epigenéticas, a menudo acompañadas por amplificación o inactivación génica. La identificación de genes relacionados con tumores proporciona una comprensión considerable sobre la biología de las leucemias y abre el camino a tratamientos farmacológicos más específicos. Estos genes comprenden varios canales iónicos y bombas, ya que los mecanismos de transporte asociados con control del volumen, proliferación y apoptosis están a menudo alterados en los cánceres. En células leucémicas, tales cambios se observan de manera tan temprana como el estadio de célula madre. Los canales iónicos pueden regular otras características malignas, tales como falta de diferenciación, fenotipo invasivo y migratorio aumentado y quimiorresistencia. La resistencia a múltiples fármacos (MDR), mediada por múltiples transportadores de casete de unión a ATP (ABC) de flujo de salida de fármacos, es un problema crítico, particularmente en el tratamiento de leucemia aguda, mostrándose de manera sistemática que glicoproteína de permeabilidad (P) (P-gp), proteína asociada a resistencia a múltiples fármacos 1 (MRP1) y proteína de resistencia de cáncer de mama (BCRP o ABCG2) son los factores clave de MDR en estudios con líneas celulares. Estudios han demostrado que puede surgir MDR intrínseca debido a perfiles de expresión génica específicos, y que la sobreexpresión inducida por fármacos de P-gp y otras proteínas de MDR puede dar como resultado resistencia adquirida, habiéndose mostrado que múltiples transportadores de ABC están sobreexpresados en líneas celulares seleccionadas para la resistencia a múltiples fármacos para leucemia aguda. Se ha encontrado que otros receptores tales como receptores sigma (sigmaR)(S), concretamente sigmaR(1) y sigmaR(2), están sobreexpresados en células de cáncer de mama.
Por tanto, debido a su implicación en la génesis del cáncer y su sobreexpresión en esta patología, un aspecto de la presente invención sería seleccionar como diana tal tipo de bombas o poros de membrana usando el CAR de la presente invención para terapia inmunoadoptiva del cáncer.
La tabla 1 a continuación proporciona ejemplos de transportadores de ABC, que podrían seleccionarse como diana con el VNAR-CAR de la presente invención para el tratamiento de células malignas resistentes a quimioterapia.
Tabla 1: Transportadores de ABC implicados en la resistencia celular a la quimioterapia
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Según una realización particular de la invención, varios polipéptidos de VNAR pueden unirse en tándem para proporcionar multiespecificidad, el aumento del tamaño del dominio extracelular o semivida in vivo de la molécula.
Según un aspecto adicional de la invención, el polipéptido de VNAR implicado en la construcción del CAR puede humanizarse con el fin de reducir la inmunogenicidad y/o mejorar las propiedades de estabilidad termodinámica, plegamiento y expresión. Se ha acumulado una experiencia considerable en esta área temática, particularmente con AcM de roedor. Normalmente, se injertan CDR de un anticuerpo murino de interés sobre una región de marco de línea germinal humana apropiada (seleccionada por similitud de secuencia, propiedades de expresión, o ambas) y luego se introducen retromutaciones en posiciones clave responsables de una conformación de CDR particular y por tanto de la unión al antígeno. Este enfoque ha producido muchos Ac humanizados, utilizándose varios de ellos en la práctica clínica. Aunque los VNAR de tiburón representan un desafío mayor para la humanización debido a las diferencias estructurales (por ejemplo, falta de CDR2) y la baja identidad de secuencia global (generalmente ~30%) con secuencias de VH/VL humanas, las estructuras cristalinas disponibles de dominios de VNAR demuestran una organización similar de regiones de marco clave a dominios variables de Ig humana, haciendo posible por tanto el intento de humanización (Kovelenko et al. 2013). Tal humanización puede conducir al reemplazo de hasta el 50% de la secuencia de aminoácidos global inicial del armazón de VNAR inicial usado como polipéptido de VNAR. Por consiguiente, la presente invención abarca el uso de polipéptidos de VNAR que tienen una identidad de aminoácidos relativamente baja con cualquier polipéptido de VNAR notificado que se origina a partir de pez cartilaginoso, aunque presentan preferiblemente al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 75%, incluso más preferiblemente al menos el 80%, lo más preferiblemente al menos el 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias de polipéptido denominadas SEQ ID NO. 1 a 100 (tabla 2). Estas secuencias se proporcionan como ejemplos no limitativos del armazón de VNAR que pueden usarse y humanizarse según la invención.
Los receptores de antígenos quiméricos según la presente invención comprenden además generalmente una región de bisagra (tallo) entre su región transmembrana y el dominio de reconocimiento de antígeno extracelular.
El término “región de bisagra” usado en el presente documento significa generalmente cualquier oligo- o polipéptido que funciona uniendo el dominio transmembrana al dominio de unión a ligando extracelular. En particular, se usa una región de tallo para proporcionar más flexibilidad y accesibilidad para el dominio de unión a ligando extracelular. Una región de tallo puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 100 aminoácidos y lo más preferiblemente de 25 a 50 aminoácidos. La región de tallo puede derivarse en su totalidad o en parte de moléculas que se producen de manera natural, tales como en su totalidad o en parte de la región extracelular de CD8, CD4 o CD28, o en su totalidad o en parte de una región constante de anticuerpo. Alternativamente la región de tallo puede ser una secuencia sintética que corresponde a una secuencia de tallo que se produce de manera natural, o puede ser una secuencia de tallo completamente sintética. En una realización preferida dicha región de tallo es una parte de la cadena alfa de CD8 humana (por ejemplo NP_001139345.1).
VNAR-CAR de múltiples cadenas
El ejemplo 1 y las figuras 3 y 7 de la presente memoria descriptiva ilustran receptores de antígenos quiméricos según la invención basados en un CAR de una única cadena, correspondientes a la arquitectura clásica de los CAR, en los que todos los dominios relevantes están contenidos dentro de un único polipéptido tal como se describe en el documento US 7.741.465.
Sin embargo, la presente invención abarca también arquitecturas de múltiples cadenas tal como se muestra en el ejemplo 2 y las figuras 4, 5 y 8. Según tales arquitecturas, se portan dominios de unión a ligando y dominios de señalización en polipéptidos diferenciados. Los diferentes polipéptidos están anclados en la membrana en una proximidad estrecha que permite interacciones entre sí. En tales arquitecturas, los dominios de señalización y coestimuladores pueden estar en posiciones en yuxtamembrana (es decir, adyacentes a la membrana celular en el lado interno de la misma), lo que se considera que permite una función mejorada de dominios coestimuladores. La arquitectura de múltiples subunidades también ofrece más flexibilidad y posibilidades de diseño de CAR con más control sobre la activación de células T. Por ejemplo, es posible incluir varios dominios de reconocimiento de antígenos extracelulares que tienen especificidad diferente para obtener una arquitectura de CAR multiespecífica. También es posible controlar la razón relativa entre las diferentes subunidades en el CAR de múltiples cadenas. Este tipo de arquitectura la ha descrito recientemente el solicitante en el documento PCT/US2013/058005.
El ensamblaje de las diferentes cadenas como parte de un único CAR de múltiples cadenas se hace posible, por ejemplo, usando las diferentes cadenas alfa, beta y gamma del receptor de alta afinidad para IgE (FceRI) (Metzger, Alcaraz et al. 1986) a las que se fusionan los dominios de señalización y coestimuladores. La cadena gamma comprende una región transmembrana y una cola citoplasmática que contienen un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM) (Cambier 1995).
Los CAR de múltiples cadenas pueden comprender varios dominios de unión a ligando extracelulares, para unirse simultáneamente a diferentes elementos en la diana aumentando de ese modo la activación y función de células inmunitarias. En una realización, los dominios de unión a ligando extracelulares pueden colocarse en tándem sobre el mismo polipéptido transmembrana, y opcionalmente pueden estar separados por un ligador. En otra realización, dichos dominios de unión a ligando extracelulares diferentes pueden colocarse en diferentes polipéptidos transmembrana que componen el CAR de múltiples cadenas. En otra realización, la presente divulgación se refiere a una población de CAR de múltiples cadenas que comprenden cada uno diferentes dominios de unión a ligando extracelulares. Se da a conocer además un método de modificación por ingeniería genética de células inmunitarias que comprende proporcionar una célula inmunitaria y expresar en la superficie de dicha célula una población de CAR de múltiples cadenas comprendiendo cada uno dominios de unión a ligando extracelulares diferentes. La presente divulgación se refiere además a un método de modificación por ingeniería genética de una célula inmunitaria que comprende proporcionar una célula inmunitaria e introducir en dicha célula polinucleótidos que codifican para polipéptidos que componen una población de CAR de múltiples cadenas comprendiendo cada uno dominios de unión a ligando extracelulares diferentes. En un ejemplo particular, el método de modificación por ingeniería genética de una célula inmunitaria comprende expresar en la superficie de la célula al menos una parte de la cadena beta y/o gamma de FceRI fusionada a un dominio de transducción de señales y varias partes de las cadenas alfa de FceRI fusionadas a dominios de unión a ligando extracelulares diferentes. En un ejemplo más particular, dicho método comprende introducir en dicha célula al menos un polinucleótido que codifica para una parte de la cadena beta y/o gamma de FceRI fusionada a un dominio de transducción de señales y varias cadenas alfa de FceRI fusionadas a dominios de unión a ligando extracelulares diferentes. Por población de CAR de múltiples cadenas, quiere decirse al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o más CAR de múltiples cadenas comprendiendo cada uno dominios de unión a ligando extracelulares diferentes. Los dominios de unión a ligando extracelulares diferentes según la presente invención pueden unirse de manera preferiblemente simultánea a diferentes elementos en la diana aumentando de ese modo la activación y función de células inmunitarias.
El dominio de transducción de señales o dominio de señalización intracelular del CAR de múltiples cadenas de la invención es responsable de la señalización intracelular tras la unión del dominio de unión a ligando extracelular a la diana que da como resultado la activación de la célula inmunitaria y la respuesta inmunitaria. En otras palabras, el dominio de transducción de señales es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se expresa el CAR de múltiples cadenas. Por ejemplo, la función efectora de una célula T puede ser una actividad citolítica o actividad auxiliar incluyendo la secreción de citocinas.
En la presente solicitud, el término “dominio de transducción de señales” se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de función de señal efectora y dirige a la célula a realizar una función especializada.
Ejemplos preferidos de dominio de transducción de señales para su uso en CAR de una única cadena o de múltiples cadenas pueden ser las secuencias citoplasmáticas del receptor de Fc o el receptor de células T y correceptores que actúan conjuntamente para iniciar la transducción de señales tras el acoplamiento al receptor de antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tiene la misma capacidad funcional. El dominio de transducción de señales comprende dos clases distintas de secuencia de señalización citoplasmática, las que inician la activación primaria dependiente de antígeno, y las que actúan de una manera independiente de antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora. La secuencia de señalización citoplasmática primaria puede comprender motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina inmunorreceptora de ITAM. Los ITAM son motivos de señalización bien definidos que se encuentran en la cola intracitoplasmática de una variedad de receptores que sirven como sitios de unión para tirosina cinasas de la clase syk/zap70. Los ejemplos de ITAM usados en la invención pueden incluir como ejemplos no limitativos los derivados de TCRzeta, FcRgamma, FcRbeta, FcRépsilon, CD3gamma, CD3delta, CD3épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En una realización preferida, el dominio de transducción de señalización del CAR de múltiples cadenas puede comprender el dominio de señalización de CD3zeta, o el dominio intracitoplasmático de las cadenas beta o gamma de FceRI.
En una realización particular el dominio de transducción de señales del CAR de múltiples cadenas de la presente invención comprende una molécula señal coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para lograr una respuesta inmunitaria eficaz.
“Ligando coestimulador” se refiere a una molécula sobre una célula presentadora de antígeno que se une específicamente a una molécula coestimuladora relacionada sobre una célula T, proporcionando de ese modo una señal que, además de la señal primaria proporcionada por, por ejemplo, la unión de un complejo de TCR/CD3 con una molécula del CMH cargada con péptido, media en una respuesta de células T, incluyendo, pero sin limitarse a, activación de la proliferación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir pero no se limita a CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une a receptor de ligando Toll y un ligando que se une específicamente a B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente a una molécula coestimuladora presente sobre una célula T, tal como pero sin limitarse a, CD27, cD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno asociado a función de linfocitos-1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente a CD83.
Una “molécula coestimuladora” se refiere a la pareja de unión relacionada sobre una célula T que se une específicamente a un ligando coestimulador, mediando de ese modo en una respuesta coestimuladora por la célula, tal como, pero sin limitarse a proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a una molécula de CMH de clase I, BTLA y receptor de ligando Toll. Los ejemplos de moléculas coestimuladoras incluyen CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno asociado a función de linfocitos-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente a CD83 y similares.
Una “señal coestimuladora” tal como se usa en el presente documento se refiere a una señal que, en combinación con una señal primaria, tal como ligación de TCR/CD3, conduce a proliferación de células T y/o regulación por incremento o regulación por disminución de moléculas clave.
En otra realización particular, dicho dominio de transducción de señales son motivos de unión a factor 2 asociado a TNFR (TRAF2), cola intracitoplasmática de la familia de miembros de TNFR coestimuladores. La cola citoplasmática de miembros de la familia de TNFR coestimuladores contiene motivos de unión a TRAF2 que consisten en el motivo conservado principal (P/S/A)X(Q/E)E) o el motivo secundario (PXQXXD), en los que X es cualquier aminoácido. Las proteínas tRaF se reclutan a las colas intracelulares de muchos TNFR en respuesta a la trimerización del receptor. En una realización preferida, el dominio de transducción de señales del CAR de múltiples cadenas de la presente invención comprende una parte de la molécula señal coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en 4-1BB (GenBank: AAA53133.) y CD28 (NP_006130.1).
Las características distintivas de polipéptidos transmembrana apropiados comprenden la capacidad de expresarse en la superficie de una célula inmunitaria, en particular células de linfocitos o células citolíticas naturales (Nk), y de interaccionar entre sí para dirigir la respuesta celular de la célula inmunitaria contra una célula diana predefinida. Los diferentes polipéptidos transmembrana del CAR de múltiples cadenas de la presente invención que comprenden un dominio de unión a ligando extracelular y/o un dominio de transducción de señales interaccionan entre sí para tomar parte en la transducción de señales tras la unión con un ligando diana e inducen una respuesta inmunitaria. El dominio transmembrana puede derivarse o bien de una fuente natural o bien de una fuente sintética. El dominio transmembrana puede derivarse de cualquier proteína transmembrana o unida a la membrana. Como ejemplos no limitativos, el polipéptido transmembrana puede ser una subunidad del receptor de células T tal como a, p, y o □, un polipéptido que constituye un complejo de CD3, receptor de IL2 p55 (cadena a), p75 (cadena p) o cadena y, una cadena de subunidad de receptores de Fc, en particular receptor de Fcy III o proteínas CD. Alternativamente el dominio transmembrana puede ser sintético y puede comprender predominantemente residuos hidrófobos tales como leucina y valina.
En una realización preferida, el polipéptido transmembrana derivado de las cadenas del receptor de Fcg o variante del mismo, en particular comprende las cadenas a, p y/o y de FcgRI o un fragmento funcional o variante de las mismas. El término “derivado de” significa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es equivalente a la de un receptor de Fcg que incluye una o más modificaciones de aminoácidos de la secuencia del receptor de Fcg. Tal(es) modificación/modificaciones de aminoácidos puede(n) incluir sustitución/sustituciones, deleción/deleciones, adición/adiciones de aminoácidos o una combinación de cualquiera de esas modificaciones, y puede(n) alterar la actividad biológica de la región de unión a Fc en relación con la de un receptor de Fc. Por otro lado, las regiones de unión a Fc derivadas de un receptor de Fc particular pueden incluir una o más modificación/modificaciones de aminoácidos que no alteran sustancialmente la actividad biológica de la región de unión a Fc en relación con la de un receptor de Fc. La(s) modificación/modificaciones de aminoácidos de esta clase comprenderá(n) normalmente sustitución/sustituciones de aminoácidos conservativa(s).
En una realización más particular, dicho CAR de múltiples cadenas puede comprender una parte de la cadena alfa de FcgRI y una parte de la cadena beta de FcgRI o una variante de las mismas de manera que dichas cadenas de FcgRI se dimerizan espontáneamente entre sí formando un receptor de antígeno quimérico dimérico. En otra realización, el antígeno quimérico de múltiples cadenas puede comprender una parte de la cadena alfa de FcgRI y una parte de la cadena gamma de FcgRI o variante de las mismas de manera que dichas cadenas de FcgRI se trimerizan espontáneamente entre sí formando un receptor de antígeno quimérico trimérico, y en otra realización el receptor de antígeno quimérico de múltiples cadenas puede comprender una parte de la cadena alfa de FcgRI, una parte de la cadena beta de FcgRI y una parte de la cadena gamma de FcgRI o variantes de las mismas de manera que dichas cadenas de FcgRI se tetramerizan espontáneamente entre sí formando un receptor de antígeno quimérico tetramérico.
En otras palabras, el CAR de múltiples cadenas que comprende al menos dos de los siguientes componentes:
a) un polipéptido que comprende una parte de la cadena alfa de FcgRI y un dominio de unión a ligando extracelular,
b) un polipéptido que comprende una parte de la cadena beta de FcgRI y/o
c) un polipéptido que comprende una parte de la cadena gamma de FcgRI, mediante lo cual diferentes polipéptidos se multimerizan entre sí espontáneamente formando CAR dimérico, trimérico o tetramérico.
El término “fragmento funcional” usado en el presente documento se refiere a cualquier subconjunto de una proteína, que conserva al menos el 50% de la actividad de la proteína completa. Alternativamente, el término “variantes funcionales” se refiere a un polipéptido que puede incluir, por ejemplo, deleciones o inserciones o sustituciones de aminoácidos con respecto a una proteína inicial, al tiempo que conserva al menos el 50% de la actividad de dicha proteína inicial. Tales variantes funcionales pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN que codifica para el polipéptido.
La funcionalidad de los CAR de la invención con respecto a un antígeno deseado puede someterse a ensayo tras la unión a células Daudi que expresan dicho antígeno sobre su superficie tal como se describe en la parte experimental. Están disponibles otros ensayos conocidos en la técnica que implican la medición del aumento de la liberación de iones de calcio, la fosforilación de tirosina intracelular, el recambio de fosfato de inositol o la producción de interleucina (IL) 2, interferón y, GM-CSF, IL-3, IL-4 por las células seleccionadas como diana.
Polinucleótidos, vectores:
En una realización particular, las diferentes secuencias de ácido nucleico pueden incluirse en un polinucleótido o vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de salto ribosómico tal como una secuencia que codifica para un péptido 2A. Los péptidos 2a, que se identificaron en el subgrupo de Aphthovirus de los picornavirus, provocan un “salto” ribosómico desde un codón hasta el siguiente sin la formación de un enlace peptídico entre los dos aminoácidos codificados por los codones (véase Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. Y. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007)). Por tanto, pueden sintetizarse dos polipéptidos a partir de un único marco de lectura abierto contiguo dentro de un ARNm cuando los polipéptidos están separados por una secuencia de oligopéptido 2A que está en marco. Tales mecanismos de salto ribosómico se conocen bien en la técnica y se sabe que los usan varios vectores para la expresión de varias proteínas codificadas por un único ARN mensajero. Como ejemplo no limitativo, se han usado péptidos 2A para expresar en la célula los diferentes polipéptidos del CAR de múltiples cadenas.
Para dirigir el polipéptido transmembrana tal como FcgR a la ruta secretora de una célula huésped, se proporciona una secuencia de señal secretora (también conocida como secuencia líder, preprosecuencia o presecuencia) en la secuencia de polinucleótido o secuencia de vector. La secuencia de señal secretora puede ser la de FcgR, o puede derivarse de otra proteína secretada (por ejemplo, t-PA) o sintetizarse de novo. La secuencia de señal secretora está operativamente unida a la secuencia transmembrana de ácido nucleico, es decir, las dos secuencias se unen en el marco de lectura correcto y se sitúan para dirigir el polipéptido recién sintetizado a la ruta secretora de la célula huésped. Las secuencias de señal secretora están situadas comúnmente en 5' con respecto a la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de interés, aunque determinadas secuencias de señal secretora puede situarse en cualquier lugar en la secuencia de ácido nucleico de interés (véase, por ejemplo, Welch et al., patente estadounidense n.° 5.037.743; Holland et al., patente estadounidense n.° 5.143.830). En una realización preferida el péptido señal comprende los residuos 1 a 25 de la cadena alfa de FceRI (NP_001992.1).
Los expertos en la técnica reconocerán que, en vista de la degeneración del código genético, es posible una considerable variación de secuencia entre estas moléculas de polinucleótido. Preferiblemente, las secuencias de ácido nucleico tienen codones optimizados para su expresión en células de mamífero, preferiblemente para su expresión en células humanas. La optimización de codones se refiere al intercambio en una secuencia de interés de codones que son generalmente poco comunes en genes altamente expresados de una especie dada por codones que son generalmente frecuentes en genes altamente expresados de tal especie, codificando tales codones para los aminoácidos como los codones que están intercambiándose.
Los polipéptidos pueden sintetizarse in situ en la célula como resultado de la introducción de polinucleótidos que codifican para dichos polipéptidos en la célula. Alternativamente, dichos polipéptidos podrían producirse fuera de la célula y luego introducirse en la misma. Se conocen en la técnica métodos para introducir un constructo de polinucleótido en células animales e incluyen como ejemplos no limitativos métodos de transformación estable en los que el constructo de polinucleótido se integra en el genoma de la célula, métodos de transformación transitoria en los que el constructo de polinucleótido no se integra en el genoma de la célula y métodos mediados por virus. Dichos polinucleótidos pueden introducirse en una célula mediante, por ejemplo, vectores virales recombinantes (por ejemplo retrovirus, adenovirus), liposomas y similares. Por ejemplo, los métodos de transformación transitoria incluyen por ejemplo microinyección, electroporación o bombardeo de partículas. Dichos polinucleótidos pueden incluirse en vectores, más particularmente plásmidos o virus, en vista de expresarse en células.
Células T modificadas y modificadas por ingeniería genética
La presente invención también se refiere a células inmunitarias aisladas susceptibles de obtenerse mediante dicho método para modificar células por ingeniería genética. En particular dicha célula inmunitaria aislada comprende al menos un CAR de múltiples cadenas tal como se describió anteriormente. En otra realización, dicha célula inmunitaria aislada comprende una población de CAR de múltiples cadenas cada uno de los cuales comprende diferentes dominios de unión a ligando extracelulares. En particular, dicha célula inmunitaria aislada comprende secuencias de polinucleótido exógenas que codifican para polipéptidos que componen al menos un CAR de múltiples cadenas. Dichas células también pueden comprender además al menos un gen inactivado seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR, t Cr alfa, TCR beta, gen de HLA, genes de punto de comprobación inmunitario tales como PD1 y CTLA-4, o pueden expresar un transgén de pTalfa.
Dicha célula inmunitaria se refiere a una célula de origen hematopoyético implicada funcionalmente en el inicio y/o la ejecución de respuesta inmunitaria innata y/o adaptativa. Dicha célula inmunitaria según la presente invención puede derivarse de una célula madre. Las células madre pueden ser células madre adultas, células madre embrionarias, más particularmente células madre no humanas, células madre de sangre de cordón umbilical, células progenitoras, células madre de médula ósea, células madre pluripotentes inducidas, células madre totipotentes o células madre hematopoyéticas. Células humanas representativas son células CD34+. Dicha célula aislada puede ser también una célula dendrítica, célula dendrítica citolítica, un mastocito, una célula NK, una célula B o una célula T seleccionada del grupo que consiste en linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T auxiliares. En otra realización, dicha célula puede derivarse del grupo que consiste en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Antes de la expansión y modificación genética de las células de la invención, puede obtenerse una fuente de células de un sujeto a través de una variedad de métodos no limitativos. Pueden obtenerse células de varias fuentes no limitativas, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, sangre de cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, efusión pleural, tejido del bazo y tumores. En determinadas realizaciones de la presente invención, puede usarse cualquiera de varias líneas de células T disponibles y conocidas por los expertos en la técnica. En otra realización, dicha célula puede derivarse de un donante sano, de un paciente al que se le ha diagnosticado cáncer o de un paciente al que se le ha diagnosticado una infección. En otra realización, dicha célula es parte de una población mixta de células que presentan diferentes características fenotípicas. En el alcance de la presente invención también se abarca una línea celular obtenida a partir de una célula T transformada según el método previamente descrito. Células modificadas resistentes a un tratamiento inmunosupresor y susceptibles a obtenerse mediante el método previo se abarcan en el alcance de la presente invención.
En otra realización, dicha célula aislada según la presente invención comprende un gen inactivado seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR, PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, HLA, TCR alfa y TCR beta y/o expresa un transgén de CAR, de CAR de múltiples cadenas y/o de pTalfa. En otra realización particular, dicha célula aislada comprende polinucleótidos que codifican para dichos polipéptidos que componen el CAR de la invención tal como se describió anteriormente.
En otra realización, dicha célula aislada según la presente invención comprende dos genes inactivados seleccionados del grupo que consiste en CD52 y GR, CD52 y TCR alfa, CDR52 y TCR beta, GR y TCR alfa, GR y TCR beta, TCR alfa y TCR beta, PD1 y TCR alfa, PD1 y TCR beta, CTLA-4 y TCR alfa, CTLA- 4 y TCR beta, LAG3 y TCR alfa, LAG3 y TCR beta, Tim3 y TCR alfa, Tim3 y TCR beta, BTLA y TCR alfa, BTLA y TCR beta, BY55 y TCR alfa, BY55 y TCR beta, TIGIT y TCR alfa, TIGIT y TCR beta, B7H5 y TCR alfa, B7H5 y TCR beta, LAIR1 y TCR alfa, LAIR1 y TCR beta, SIGLEC10 y TCR alfa, SIGLEC10 y TCR beta, 2B4 y TCR alfa, 2B4 y TCR beta y/o expresa un transgén de CAR, de CAR de múltiples cadenas y/o de pTalfa.
En una realización adicional, TCR se vuelve no funcional en las células según la invención inactivando el gen de TCR alfa y/o el/los gen(es) de TCR beta. Las estrategias anteriores se usan más particularmente para evitar GvHD. En un aspecto particular de la presente divulgación es un método para obtener células modificadas derivadas de un individuo, en el que dichas células pueden proliferar independientemente de la ruta de señalización del complejo mayor de histocompatibilidad. Dicho método comprende las siguientes etapas:
(a) recuperar células de dicho individuo;
(b) modificar genéticamente dichas células ex vivo inactivando los genes de TCR alfa o TCR beta;
(c) cultivar células T modificadas genéticamente in vitro en condiciones apropiadas para amplificar dichas células. En el alcance de la presente invención se abarcan células modificadas, que pueden proliferar independientemente de la ruta de señalización del complejo mayor de histocompatibilidad, susceptibles de obtenerse mediante este método. Dichas células modificadas son para su uso en el tratamiento de pacientes que lo necesitan frente al rechazo de huésped contra injerto (HvG) y enfermedad de injerto contra huésped (GvHD); por tanto se da a conocer en el presente documento un método de tratamiento de pacientes que lo necesitan frente a rechazo de huésped contra injerto (HvG) y enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) que comprende tratar a dicho paciente administrando a dicho paciente una cantidad eficaz de células modificadas que comprenden genes de TCR alfa y/o TCR beta inactivados.
- Células T resistentes inmunosupresoras:
En un aspecto particular, una de las etapas de modificación genética de células puede ser un método que comprende:
(a) modificar células T inactivando al menos un gen que expresa una diana para un agente inmunosupresor, y (b) expandir dichas células, opcionalmente en presencia de dicho agente inmunosupresor.
Un agente inmunosupresor es un agente que suprime la función inmunitaria mediante uno de varios mecanismos de acción. En otras palabras, un agente inmunosupresor es un papel desempeñado por un compuesto que se presenta mediante una capacidad de disminuir el grado y/o la voracidad de una respuesta inmunitaria. Como ejemplo no limitativo, un agente inmunosupresor puede ser un inhibidor de calcineurina, una diana de rapamicina, un bloqueante de cadena a de interleucina-2, un inhibidor de inosina monofosfato deshidrogenasa, un inhibidor de ácido dihidrofólico reductasa, un corticosteroide o un antimetabolito inmunosupresor. Los inmunosupresores citotóxicos clásicos actúan inhibiendo la síntesis de ADN. Otros pueden actuar a través de la activación de células T o inhibiendo la activación de células auxiliares. El método dado a conocer en el presente documento permite conferir resistencia inmunosupresora a células T para inmunoterapia inactivando la diana del agente inmunosupresor en células T. Como ejemplos no limitativos, las dianas para un agente inmunosupresor pueden ser un receptor para un agente inmunosupresor tal como: CD52, receptor de glucocorticoides (GR), un miembro de gen de la familia de FKBP y un miembro de gen de la familia de ciclofilina.
Al inactivar un gen se pretende que el gen interés no se exprese en una forma de proteína funcional. En un ejemplo particular, la modificación genética del método se basa en la expresión, en células proporcionadas para su modificación por ingeniería genética, de una endonucleasa de corte poco común de manera que dicha endonucleasa de corte poco común cataliza específicamente la escisión en un gen seleccionado como diana inactivando de ese modo dicho gen seleccionado como diana. En un ejemplo particular, dicho método para modificar células por ingeniería genética comprende al menos una de las siguientes etapas:
(a) proporcionar una célula T, preferiblemente a partir de un cultivo celular o a partir de una muestra de sangre; (b) seleccionar un gen en dicha célula T que expresa una diana para un agente inmunosupresor;
(c) introducir en dicha célula T una endonucleasa de corte poco común que puede inactivar selectivamente mediante escisión de ADN, preferiblemente mediante rotura de la doble hebra dicho gen que codifica para una diana para dicho agente inmunosupresor, y
(d) expandir dichas células, opcionalmente en presencia de dicho agente inmunosupresor.
En un ejemplo más preferido, dicho método comprende:
(a) proporcionar una célula T, preferiblemente a partir de un cultivo celular o a partir de una muestra de sangre; (b) seleccionar un gen en dicha célula T que expresa una diana para un agente inmunosupresor;
(c) transformar dicha célula T con ácido nucleico que codifica para una endonucleasa de corte poco común que puede inactivar selectivamente mediante escisión de ADN, preferiblemente mediante rotura de la doble hebra dicho gen que codifica para una dicha para dicho agente inmunosupresor, y
(d) expresar dichas endonucleasas de corte poco común en dichas células T;
(e) expandir dichas células, opcionalmente en presencia de dicho agente inmunosupresor.
En un ejemplo particular, dicha endonucleasa de corte poco común selecciona como diana específicamente un gen seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR. En otra realización, dicho gen de la etapa (b), específico para un tratamiento inmunosupresor, es CD52 y el tratamiento inmunosupresor de la etapa (d) o (e) comprende un anticuerpo humanizado que selecciona como diana el antígeno CD52.
En otro ejemplo, dicho gen de la etapa (b), específico para un tratamiento inmunosupresor, es un receptor de glucocorticoides (GR) y el tratamiento inmunosupresor de la etapa d) o (e) comprende un corticosteroide tal como dexametasona.
En otro ejemplo, dicho gen diana de la etapa (b), específico para un tratamiento inmunosupresor, es un miembro de gen de la familia de FKBP o una variante del mismo y el tratamiento inmunosupresor de la etapa (d) o (e) comprende FK506 también conocido como tacrolimus o fujimicina. En otra realización, dicho miembro de gen de la familia de FKBP es FKBP12 o una variante del mismo.
En otro ejemplo, dicho gen de la etapa (b), específico para un tratamiento inmunosupresor, es un miembro de gen de la familia de ciclofilina o una variante del mismo y el tratamiento inmunosupresor de la etapa (d) o (e) comprende ciclosporina.
- Células T altamente activas para inmunoterapia
En un aspecto particular, una etapa particular de modificación por ingeniería genética de una célula puede ser un método que comprende:
(a) modificar células T inactivando al menos un gen de punto de comprobación inmunitaria; y
(b) expandir dichas células.
La inmunidad mediada por células T incluye múltiples etapas secuenciales que implican la selección clonal de células específicas de antígeno, su activación y proliferación en tejido linfoide secundario, su transporte a sitios de antígeno e inflamación, la ejecución de la función efectora directa y la provisión de ayuda (a través de citocinas y ligandos de membrana) para una multitud de células inmunitarias efectoras. Cada una de estas etapas se regula compensando señales estimuladoras e inhibidoras que ajustan de manera fina la respuesta. Los expertos habituales en la técnica entenderán que el término “puntos de comprobación inmunitaria” significa un grupo de moléculas expresadas por células T. Estas moléculas sirven eficazmente como “frenos” para modular por disminución o inhibir una respuesta inmunitaria. Las moléculas de punto de comprobación inmunitaria incluyen, pero no se limitan a muerte programada 1 (PD-1, también conocida como PDCD1 o CD279, número de registro: NM_005018), antígeno de linfocitos T citotóxicos 4 (CTLA-4, también conocido como CD152, número de registro de GenBank AF414120.1), LAG3 (también conocida como CD223, número de registro: NM_002286.5), Tim3 (también conocida como HAVCR2, número de registro de GenBank: JX049979.1), BTLA (también conocida como CD272, número de registro: NM_181780.3), BY55 (también conocida como CD160, número de registro de GenBank: CR541888.1), TIGIT (también conocida como VSTM3, número de registro: NM_173799), B7H5 (también conocida C10orf54, homólogo del gen vista de ratón, número de registro: NM_022153.1), LAIR1 (también conocida como CD305, número de registro de GenBank: CR542051.1), SIGLEC10 (número de registro de GeneBank: AY358337.1), 2B4 (también conocido como CD244, número de registro: NM_001166664.1), que inhiben directamente células inmunitarias. Por ejemplo, CTLA-4 es una proteína de superficie celular expresada en determinadas células T CD4 y CD8; cuando se acopla con sus ligandos (B7-1 y B7-2) en células presentadoras de antígenos, se inhiben la activación de células T y la función efectora. Por tanto, se da a conocer en el presente documento un método de modificación por ingeniería genética de células T, especialmente para inmunoterapia, que comprende modificar genéticamente células T inactivando al menos una proteína implicada en el punto de comprobación inmunitaria, en particular PD1 y/o CTLA-4.
Dicho método para modificar células por ingeniería genética puede comprender al menos una de las siguientes etapas:
(a) proporcionar una célula T, preferiblemente a partir de un cultivo celular o a partir de una muestra de sangre; (b) introducir en dicha célula T una endonucleasa de corte poco común que puede inactivar selectivamente mediante escisión de ADN, preferiblemente mediante rotura de la doble hebra un gen que codifica para una proteína de punto de comprobación inmunitaria,
(c) expandir dichas células.
Más específicamente, dicho método puede comprender:
(a) proporcionar una célula T, preferiblemente a partir de un cultivo celular o a partir de una muestra de sangre; (b) transformar dicha célula T con ácido nucleico que codifica para una endonucleasa de corte poco común que puede inactivar selectivamente mediante escisión de ADN, preferiblemente mediante rotura de la doble hebra un gen que codifica para una proteína de punto de comprobación inmunitaria;
(c) expresar dichas endonucleasas de corte poco común en dichas células T;
(d) expandir dichas células.
Particularmente, dicha endonucleasa de corte poco común selecciona como diana específicamente un gen seleccionado del grupo que consiste en: PD1, CtLa-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, TCR alfa y TCR beta. En otra realización, dicha endonucleasa de corte poco común puede ser una meganucleasa, una nucleasa de dedos de zinc, una TALE-nucleasa o complejo de endonucleasa CAS9/CRISPR. En una realización preferida, dicha endonucleasa de corte poco común es una TALE-nucleasa. Por TALE-nucleasa está previsto una proteína de fusión que consiste en un dominio de unión a ADN derivado de un efector de tipo activador de la transcripción (TALE) y un dominio catalítico de nucleasa para escindir una secuencia diana de ácido nucleico. (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou y Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Cermak, Doyle et al. 2011; Geissler, Scholze et al. 2011; Huang, Xiao et al. 2011; Li, Huang et al. 2011; Mahfouz, Li et al. 2011; Miller, Tan et al.
2011; Morbitzer, Romer et al. 2011; Mussolino, Morbitzer et al. 2011; Sander, Cade et al. 2011; Tesson, Usal et al.
2011; Weber, Gruetzner et al. 2011; Zhang, Cong et al. 2011; Deng, Yan et al. 2012; Li, Piatek et al. 2012; Mahfouz, Li et al. 2012; Mak, Bradley et al. 2012).
- Células T no alorreactivas:
En otra realización, la presente invención puede ser particularmente adecuada para inmunoterapia alogénica. En este caso, una de las etapas de modificación genética de células puede ser un método que comprende:
(a) modificar células T inactivando al menos un gen que codifica para un componente del receptor de células T (TCR)
(b) expandir dichas células.
Particularmente, la modificación genética del método se basa en la expresión, en células proporcionadas para su modificación por ingeniería genética, de una endonucleasa de corte poco común de manera que dicha endonucleasa de corte poco común cataliza específicamente la escisión en un gen seleccionado como diana inactivando de ese modo dicho gen seleccionado como diana. En un ejemplo particular, dicho método para modificar células por ingeniería genética comprende al menos una de las siguientes etapas:
(a) proporcionar una célula T, preferiblemente a partir de un cultivo celular o a partir de una muestra de sangre; introducir en dicha célula T una endonucleasa de corte poco común que puede inactivar selectivamente mediante escisión de ADN, preferiblemente mediante rotura de la doble hebra al menos un gen que codifica para un componente del receptor de células T (TCR).
(b) expandir dichas células.
En un ejemplo más preferido, dicho método comprende:
(a) proporcionar una célula T, preferiblemente a partir de un cultivo celular o a partir de una muestra de sangre; (b) transformar dicha célula T con ácido nucleico que codifica para una endonucleasa de corte poco común que puede inactivar selectivamente mediante escisión de ADN, preferiblemente mediante rotura de la doble hebra al menos un gen que codifica para un componente del receptor de células T (TCR);
(c) expresar dichas endonucleasas de corte poco común en dichas células T;
(d) clasificar las células T transformadas, que no expresan TCR en su superficie celular;
(e) expandir dichas células.
Con el fin de modificar por ingeniería genética células inmunitarias modificadas altamente activas, la divulgación también proporciona métodos en los que se bloquean puntos de comprobación inmunitaria mediante la falta de expresión de genes tales como PD1 y CTLA-4.
La presente solicitud da a conocer además células inmunitarias modificadas por ingeniería genética en células T particulares para su uso como medicamento, más particularmente, para tratar o prevenir cáncer administrando tales células inmunitarias a un organismo vivo.
Las células T para su uso en inmunoterapia adoptiva según la presente invención pueden generarse o bien mediante expansión de células T específicas de antígeno o bien redirección de células T a través de modificación por ingeniería genética (Park, Rosenberg et al. 2011). La transferencia de células T específicas de antígenos virales es un procedimiento bien establecido usado para el tratamiento de infecciones virales asociadas a trasplantes y tumores malignos relacionados con virus poco comunes. De manera similar, el aislamiento y la transferencia de células T específicas de tumor han mostrado ser satisfactorios en el tratamiento de melanoma.
Activación y expansión de células T
Las células T pueden activarse antes de o después de la modificación genética y expandirse in vitro o in vivo generalmente según los métodos descritos, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; y publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 20060121005. En general, se expanden mediante contacto con un agente que estimula un complejo de CD3 TCR y una molécula coestimuladora en la superficie de las células T para crear una señal de activación para la célula T. Por ejemplo, pueden usarse productos químicos tales como ionóforo de calcio A23187, 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA) o lectinas mitogénicas como fitohemaglutinina (PHA) para crear una señal de activación para la célula T. Como ejemplos no limitativos, pueden estimularse poblaciones de células T in vitro tal como mediante contacto con un anticuerpo anti-CD3, o fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado sobre una superficie, o mediante contacto con un activador de proteína cinasa C (por ejemplo, briostatina) conjuntamente con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se usa un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, puede ponerse en contacto una población de células T con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Para estimular la proliferación de o bien células T CD4+ o bien células T CD8+, un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada señal pueden estar en disolución o acoplados a una superficie. Tal como pueden apreciar fácilmente los expertos habituales en la técnica, la razón de partículas con respecto a células puede depender del tamaño de partícula en relación con la célula diana. Las células, tales como células T, pueden combinarse con perlas recubiertas con agente, las perlas y las células se separan posteriormente, y luego se cultivan las células. En un ejemplo alternativo, antes del cultivo, las perlas recubiertas con agente y las células no se separan sino que se cultivan juntas. Las condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, medio esencial mínimo o medio RPMI 1640 o X-vivo 5, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y viabilidad, incluyendo suero (por ejemplo, suero bovino o humano fetal), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, - 2, 1L-15, TGFp y TNF- o cualquier otro aditivo para el crecimiento de células conocido por el experto en la técnica. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, pero no se limitan a, tensioactivo, plasmanato y agentes reductores tales como N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos, piruvato de sodio y vitaminas añadidos, o bien libres de suero o bien complementados con una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocina(s) suficiente para el crecimiento y la expansión de células T. Antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen sólo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que van a infundirse en un sujeto. Las células diana se mantienen en condiciones necesarias para soportar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura (por ejemplo, 37°C) y atmósfera (por ejemplo, aire más el 5% de CO2) apropiadas. Las células T que se han expuesto a tiempos de estimulación variados pueden presentar diferentes características.
En otro ejemplo particular, dichas células pueden expandirse mediante cocultivo con tejido o células.
Aplicaciones terapéuticas
La célula inmunitaria aislada modificada por ingeniería genética tal como se describió anteriormente puede usarse como medicamento, en particular para el tratamiento de cánceres o infecciones en un paciente que lo necesita. Se dan a conocer en el presente documento métodos para tratar pacientes que comprenden al menos una de las siguientes etapas:
(a) proporcionar una célula inmunitaria que puede obtenerse mediante uno cualquiera de los métodos descritos anteriormente;
(b) administrar dichas células inmunitarias transformadas a dicho paciente.
Antes de la administración de las células T de la invención, las células pueden someterse a expansión de células T in vivo robusta para obtener persistencia durante una cantidad de tiempo prolongada. Dicho tratamiento puede ser de mejora, curativo o profiláctico. Puede ser o bien parte de una inmunoterapia autóloga o bien parte de un tratamiento de inmunoterapia alogénica.
Por autólogo, quiere decirse que las células, la línea celular o la población de células usadas para tratar pacientes se originan a partir de dicho paciente o a partir de un donante compatible para antígeno leucocitario humano (HLA). Por alogénico quiere decirse que las células o la población de células usadas para tratar pacientes no se originan de dicho paciente sino de un donante.
La invención es particularmente adecuada para inmunoterapia alogénica, en cuanto que permite la transformación de células T, normalmente obtenidas de donantes, para dar células no alorreactivas. Esto puede realizarse con protocolos convencionales y reproducirse tantas veces como sea necesario. Las células T modificadas resultantes pueden agruparse y administrarse a uno o varios pacientes, poniéndose a disposición como un producto terapéutico “disponible en el mercado”.
Las células que pueden usarse con los métodos dados a conocer se describen en la sección previa. Dicho tratamiento puede usarse para tratar pacientes a los que se les ha diagnosticado cáncer, infección viral, trastornos autoinmunitarios o enfermedad de injerto contra huésped (GvHD). Los cánceres que pueden tratarse incluyen tumores que no están vascularizados, o aún no sustancialmente vascularizados, así como tumores vascularizados. Los cánceres pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hematológicos, por ejemplo, leucemias y linfomas) o pueden comprender tumores sólidos. Los tipos de cánceres que van a tratarse con los CAR de múltiples cadenas de la invención incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, blastoma y sarcoma, y determinados tumores malignos linfoides o de leucemia, tumores benignos y malignos, y tumores malignos, por ejemplo, sarcomas, carcinomas y melanomas. También se incluyen tumores/cánceres de adultos y tumores/cánceres pediátricos.
El tratamiento puede administrarse a pacientes en combinación con una o más terapias contra el cáncer seleccionadas del grupo de terapia con anticuerpos, quimioterapia, terapia con citocinas, terapia con células dendríticas, terapia génica, terapia hormonal, terapia con luz láser y radioterapia.
Dicho tratamiento puede administrarse a pacientes que se someten a un tratamiento inmunosupresor o quimioterapia puesto que la presente invención proporciona preferiblemente células, que se han hecho resistentes a al menos un agente inmunosupresor y/o de quimioterapia debido a la inactivación de un gen que codifica para un receptor para tal agente inmunosupresor o que la hace resistente al tratamiento de quimioterapia. En este aspecto, el tratamiento inmunosupresor o de quimioterapia puede ayudar a la selección y expansión de las células T según la invención dentro del paciente.
La administración de las células o población de células puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, incluyendo mediante inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, mediante inyección intravenosa o intralinfática o por vía intraperitoneal. Las composiciones de células pueden administrarse preferiblemente mediante inyección intravenosa.
La administración de las células o población de células puede consistir en la administración de 104-109 células por kg de peso corporal, preferiblemente de 105 a 106 células/kg de peso corporal incluyendo todos los valores de números enteros de números de células dentro de esos intervalos. Las células o población de células pueden administrarse en una o más dosis. En otra realización, dicha cantidad eficaz de células se administra como una única dosis. En otra realización, dicha cantidad eficaz de células se administra como más de una dosis a lo largo de un periodo de tiempo. El momento de administración está dentro del criterio del médico encargado y depende del estado clínico del paciente. Las células o población de células pueden obtenerse de cualquier fuente, tal como un banco de sangre o un donante. Aunque las necesidades individuales varían, la determinación de intervalos óptimos de cantidades eficaces de un tipo celular dado para una enfermedad o estados particulares está dentro de la experiencia de la técnica. Una cantidad eficaz significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico. La dosificación administrada dependerá de la edad, la salud y el peso del receptor, la clase de tratamiento simultáneo, si lo hay, la frecuencia de tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.
Dicha cantidad eficaz de células o composición que comprenden esas células puede administrarse por vía parenteral. Dicha administración puede ser una administración intravenosa. Dicha administración puede realizarse directamente mediante inyección dentro de un tumor.
Pueden administrarse células a un paciente conjuntamente con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) cualquiera de varias modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo pero sin limitarse a tratamiento con agentes tales como terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, citarabina (también conocida como ARA-C) o tratamiento con nataliziimab para pacientes con MS o tratamiento con efaliztimab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con PML. Las células T de la invención pueden ser para su uso en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato, y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunosupresores tales como CAM PATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Estos fármacos inhiben o bien la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o bien inhiben la cinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por factores de crecimiento (rapamicina) (Liu et al., Cell 66:807-815, 11; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93). En un ejemplo adicional, las composiciones de células se administran a un paciente conjuntamente con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) el trasplante de médula ósea, terapia supresora de células T usando o bien agentes quimioterápicos tales como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. Las composiciones de células pueden administrarse tras la terapia supresora de células B tal como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, los sujetos pueden someterse a tratamiento convencional con quimioterapia a dosis alta seguido por trasplante de células madre de sangre periférica. En determinadas ocasiones, tras el trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas. En una ocasión adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía. Dichas células modificadas obtenidas mediante uno cualquiera de los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para tratar pacientes que lo necesitan contra el rechazo de huésped contra injerto (HvG) y la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD); por tanto se da a conocer en el presente documento un método de tratamiento de pacientes que lo necesitan frente a rechazo de huésped contra injerto (HvG) y enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) que comprende tratar dicho paciente administrando a dicho paciente una cantidad eficaz de células modificadas que comprenden genes de TCR alfa y/o TCR beta inactivados.
Otras definiciones
- Se designan residuos de aminoácido en una secuencia de polipéptido en el presente documento según el código de una letra, en el que, por ejemplo, Q significa residuo de Gln o glutamina, R significa residuo de Arg o arginina y D significa residuo de Asp o ácido aspártico.
- Sustitución de aminoácido significa el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro, por ejemplo el reemplazo de un residuo de arginina por un residuo de glutamina en una secuencia peptídica es una sustitución de aminoácido. - Se designan nucleótidos tal como sigue: se usa el código de una letra para designar la base de un nucleósido: a es adenina, t es timina, c es citosina y g es guanina. Para los nucleótidos degenerados, r representa g o a (nucleótidos de purina), k representa g o t, s representa g o c, w representa a o t, m representa a o c, y representa t o c (nucleótidos de pirimidina), d representa g, a o t, v representa g, a o c, b representa g, t o c, h representa a, t o c, y n representa g, a, t o c.
-Tal como se usa en el presente documento, “ácido nucleico” o “polinucleótidos” se refiere a nucleótidos y/o polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (RNA), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquiera de ligación, escisión, acción de endonucleasas y acción de exonucleasas. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas por monómeros que son nucleótidos que se producen de manera natural (tales como ADN y RNA), o análogos de nucleótidos que se producen de manera natural (por ejemplo, formas enantioméricas de nucleótidos que se producen de manera natural), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en restos de azúcar y/o en restos de base de pirimidina o purina. Las modificaciones de azúcar incluyen, por ejemplo, reemplazo de uno o más grupos hidroxilo por halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o pueden funcionalizarse azúcares como éteres o ésteres. Además, todo el resto de azúcar puede reemplazarse por estructuras estérica y electrónicamente similares, tales como aza-azúcares y análogos de azúcar carbocíclicos. Los ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden unirse mediante enlaces fosfodiéster o análogos de tales uniones. Los ácidos nucleicos pueden ser o bien monocatenarios o bien bicatenarios.
- Por receptor de antígeno quimérico (CAR) está previsto moléculas que combinen un dominio de unión contra un componente presente en la célula diana, por ejemplo una especificidad basada en anticuerpo para un antígeno deseado (por ejemplo, antígeno tumoral) con un dominio intracelular de activación de receptor de células T para generar una proteína quimérica que presenta una actividad inmunitaria celular anti-diana específica. En la técnica anterior, los CAR consistían en polipéptidos de una única cadena que comprendían un anticuerpo de cadena sencilla (scFvFc) extracelular fusionado con el dominio de señalización intracelular de la cadena zeta de complejo de receptor de antígeno de células T (scFvFc:Z) y tenían la capacidad, cuando se expresaban en células T, de redirigir el reconocimiento de antígeno basándose en la especificidad del anticuerpo monoclonal. Un ejemplo de CAR usado en la técnica anterior son CAR dirigidos contra el antígeno CD19 ( ). Los CAR según la presente invención se presentan con arquitecturas de una única cadena o de múltiples cadenas. El/los dominio(s) extracelular(es) de los mismos consisten en dominio de reconocimiento de antígeno de una única cadena que comprende un polipéptido de VNAR tal como se definió anteriormente. Este dominio extracelular está anclado a la membrana celular mediante fusión con un dominio transmembrana. El CAR puede adoptar una arquitectura de una única cadena o de múltiples cadenas. Cuando el CAR tiene una única cadena, dicho dominio transmembrana se fusiona con o incluye el dominio de señalización para formar un único polipéptido. Cuando el CAR es un CAR de múltiples cadenas, el dominio de señalización puede estar presente en otro polipéptido que se ensamblará con el polipéptido de fusión que comprende el polipéptido de VNAR.
- Por “vector de suministro” o “vectores de suministro” está previsto cualquier vector de suministro que pueda usarse según la presente divulgación para poner en contacto celular (es decir, “contactar”) o suministrar dentro de las células o compartimentos subcelulares (es decir, “introducir”) agentes/productos químicos y moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) necesarios según la presente divulgación. Incluye, pero no se limita a vectores de suministro liposomales, vectores de suministro virales, vectores de suministro de fármacos, portadores químicos, portadores poliméricos, lipoplejos, poliplejos, dendrímeros, microburbujas (agentes de contraste de ultrasonidos), nanopartículas, emulsiones u otros vectores de transferencia apropiados. Estos vectores de suministro permiten el suministro de moléculas, productos químicos, macromoléculas (genes, proteínas) u otros vectores tales como plásmidos, péptidos desarrollados por Diatos. En estos casos, los vectores de suministro son portadores de moléculas. Por “vector de suministro” o “vectores de suministro” también está previsto métodos de suministro para realizar la transfección.
- Los términos “vector” o “vectores” se refieren a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un “vector” según la presente divulgación incluye, pero no se limita a, un vector viral, un plásmido, un vector de ARN o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede consistir en ácidos nucleicos cromosómicos, no cromosómicos, semisintéticos o sintéticos. Vectores preferidos son los que pueden producir replicación autónoma (vector episomal) y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos (vectores de expresión). Los expertos en la técnica conocen grandes números de vectores adecuados y están disponibles comercialmente.
Los vectores virales incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa tales como ortomixovirus (por ejemplo, virus influenza), rhabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia y de la estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo virus del sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN bicatenario incluyendo adenovirus, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus), y poxvirus (por ejemplo, virus vaccinia, viruela aviar y viruela del canario). Otros virus incluyen virus Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Los ejemplos de retrovirus incluyen: leucosis-sarcoma aviar, virus de tipo C, tipo B, virus de tipo D de mamíferos, grupo de VLTH-VLB, lentivirus, espumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, en Fundamental Virology, tercera edición, B. N. Campos, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).
- Por “vector lentiviral” quiere decirse vectores lentivirales basados en VIH que son muy prometedores para suministro de genes debido a su capacidad de empaquetamiento relativamente grande, reducida inmunogenicidad y su capacidad para transducir de manera estable con alta eficacia una gama grande de diferentes tipos de células. Se generan habitualmente vectores lentivirales tras la transfección transitoria de tres (empaquetamiento, envuelta y transferencia) o más plásmidos en células productivas. Como el VIH, los vectores lentivirales entran en la célula diana a través de la interacción de glicoproteínas de la superficie viral con receptores en la superficie celular. Al entrar, el ARN viral experimenta transcripción inversa, que está mediada por el complejo de transcriptasa inversa viral. El producto de la transcripción inversa es un ADN viral lineal bicatenario, que es el sustrato de la integración viral en el ADN de células infectadas. Por “vectores lentivirales integrativos (o LV)”, quiere decirse tales vectores como ejemplo no limitativo, que pueden integrarse en el genoma de una célula diana. En contraposicion, por “vectores lentivirales no integrativos (o NILV)” quiere decirse vectores de suministro génico eficaces que no se integran en el genoma de una célula diana a través de la acción de la integrasa del virus.
- Los vectores de suministro y vectores pueden asociarse o combinarse con cualquier técnica de permeabilización celular tal como sonoporación o electroporación o derivados de estas técnicas.
- Por célula o células está previsto cualquier célula viva eucariota, célula primaria y línea celular derivada de estos organismos para cultivos in vitro.
- Por “célula primaria” o “células primarias” está previsto células tomadas directamente de tejido vivo (es decir, material de biopsia) y establecidas para crecimiento in vitro, que han experimentado muy pocas duplicaciones de la población y son por tanto más representativas de los componentes funcionales principales y características de tejidos de los que se derivan, en comparación con líneas celulares inmortalizadas artificialmente o tumorigénicas continuas.
Como ejemplos no limitativos pueden seleccionarse líneas celulares del grupo que consiste en células CHO-K1; células HEK293; células Caco2; células U2-OS; células NIH 3T3; células NSO; células SP2; células CHO-S; células DG44; células K-562, células U-937; células MRC5; células IMR90; células Jurkat; células HepG2; células HeLa; células HT-1080; células HCT-116; células Hu-h7; células Huvec; células Molt 4.
Todas estas líneas celulares pueden modificarse mediante el método de la presente divulgación para proporcionar modelos de líneas celulares para producir, expresar, cuantificar, detectar, estudiar un gen o una proteína de interés; estos modelos pueden usarse también para examinar moléculas de interés biológicamente activas en investigación y producción y diversos campos tales como química, biocombustibles, productos terapéuticos y agronomía como ejemplos no limitativos.
- Por “mutación” está previsto la sustitución, deleción, inserción de hasta uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta, o más nucleótidos/aminoácidos en una secuencia de polinucleótido (ADNc, gen) o polipéptido. La mutación puede afectar a la secuencia codificante de un gen o a su secuencia reguladora. También puede afectar a la estructura de la secuencia genómica o a la estructura/estabilidad del ARNm codificado.
- Por “variante(s)”, está previsto una variante de repetición, una variante, una variante de unión a ADN, una variante de TALE-nucleasa, una variante de polipéptido obtenida mediante mutación o reemplazo de al menos un residuo en la secuencia de aminoácidos de la molécula original.
- Por “variante funcional” está previsto un mutante catalíticamente activo de una proteína o un dominio proteico; tal mutante puede tener la misma actividad en comparación con su proteína o dominio proteico original o propiedades adicionales, o actividad superior o inferior.
- Por “gen” quiere decirse la unidad básica de la herencia, que consiste en un segmento de ADN dispuesto de una manera lineal a lo largo de un cromosoma, que codifica para una proteína o segmento de proteína específico. Un gen incluye normalmente un promotor, una región no traducida en 5', una o más secuencias codificantes (exones), opcionalmente intrones, una región no traducida en 3'. El gen puede comprender además un terminador, potenciadores y/o silenciadores.
- Por “proteína de fusión” está previsto el resultado de un proceso bien conocido en la técnica que consiste en la unión de dos o más genes que codifican originalmente para proteínas diferenciadas o parte de las mismas, dando como resultado la traducción de dicho “gen de fusión” un único polipéptido con propiedades funcionales derivadas de cada una de las proteínas originales.
- “Identidad” se refiere a identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico o polipéptidos. La identidad puede determinarse comparando una posición en cada secuencia que puede alinearse para fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El grado de similitud o identidad entre secuencias de ácido nucleico o aminoácidos es una función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes en posiciones compartidas por las secuencias de ácido nucleico. Pueden usarse diversos algoritmos y/o programas de alineación para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), y pueden usarse con, por ejemplo, parámetros por defecto. Por ejemplo, se contemplan polipéptidos que tienen al menos el 70%, el 85%, el 90%, el 95%, el 98% o el 99% de identidad con polipéptidos específicos descritos en el presente documento y que presentan preferiblemente las mismas funciones sustancialmente, así como un polinucleótido que codifica para tales polipéptidos.
- “Similitud” describe la relación entre las secuencias de aminoácidos de dos o más polipéptidos. También puede usarse BLASTP para identificar una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 87,5%, el 90%, el 92,5%, el 95%, el 97,5%, el 98%, el 99% de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia usando una matriz de similitud tal como BLOSUM45, BLOSUM62 o BLOSUM80. A menos que se indique lo contrario la puntuación se basará en el uso de BLOSUM62. Cuando se usa BLASTP, el porcentaje de similitud se basa en la puntuación de positivos de BLASTP y el porcentaje de identidad de secuencia se basa en la puntuación de identidades de BLASTP. Las “identidades” de BLASTP muestran el número y la fracción de residuos totales en los pares de secuencia de puntuación alta que son idénticos; y los “positivos” de BLASTP muestran el número y la fracción de residuos para los que las puntuaciones de alineación tienen valores positivos y que son similares entre sí. Se contemplan y se abarcan en esta divulgación secuencias de aminoácidos que tienen estos grados de identidad o similitud o cualquier grado intermedio de identidad o similitud con las secuencias de aminoácidos dadas a conocer en el presente documento.
- “Dominio de transducción de señales” o “ligando coestimulador” se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígenos que se une específicamente a una molécula coestimuladora relacionada en una célula T, proporcionando de ese modo una señal que, además de la señal primaria proporcionada por, por ejemplo, la unión de un complejo de TCR/CD3 con una molécula del CMH cargada con péptido, media en una respuesta de células T, incluyendo, pero sin limitarse a, activación de la proliferación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir pero no se limita a CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une a receptor de ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en una célula T, tal como pero sin limitarse a, CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno asociado a función de linfocitos-1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83.
- “Anticuerpo biespecífico” se refiere a un anticuerpo que tiene sitios de unión para dos antígenos diferentes dentro de una molécula de anticuerpo individual. Los expertos en la técnica apreciarán que pueden construirse otras moléculas con dos especificidades de unión además de la estructura de anticuerpo canónica. Se apreciará además que la unión al antígeno por anticuerpos biespecíficos puede ser simultánea o secuencial. Pueden producirse anticuerpos biespecíficos mediante técnicas químicas (véase por ejemplo, Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5807), mediante técnicas de “polidoma” (véase la patente estadounidense n.° 4.474.893) o mediante técnicas de ADN recombinante, que se conocen todas per se. Como ejemplo no limitativo, cada dominio de unión comprende al menos una región variable de una cadena pesada de anticuerpo (“región VH o H”), en el que la región VH del primer dominio de unión se une específicamente al marcador de linfocitos tal como CD3, y la región VH del segundo dominio de unión se une específicamente a antígeno tumoral.
- El término “dominio de unión a ligando extracelular” tal como se usa en el presente documento se define como un oligo- o polipéptido que puede unirse a un ligando. Preferiblemente, el dominio podrá interaccionar con una molécula de superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión a ligando extracelular puede elegirse para reconocer un ligando que actúa como marcador de superficie celular en células diana asociadas con un estado patológico particular. Por tanto, los ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos incluyen los asociados con infecciones virales, bacterianas y parasitarias, enfermedad autoinmunitaria y células cancerosas. El término “sujeto” o “paciente” tal como se usa en el presente documento incluye todos los miembros del reino animal incluyendo seres humanos y primates no humanos.
Cuando se establece un intervalo o límite numérico en el presente documento, están incluidos los puntos finales. Además, todos los valores y subintervalos dentro de un intervalo o límite numérico están incluidos específicamente como si se escribieran explícitamente.
Los siguientes ejemplos se proporcionan en el presente documento para fines de ilustración sólo, y no pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplos
Electroporación de células T con ARNm que codifica respectivamente para un receptor de antígeno quimérico (CAR) de una única cadena y de múltiples cadenas anti-CD19:
Se siguió el mismo protocolo con los siguientes transcritos ilustrados respectivamente en las figuras 6 y 7:
- Transcrito monocistrónico de SEQ ID NO. 110 que codifica para un polipéptido de una única cadena de VNAR-CAR dirigido contra el antígeno CD19. Este transcrito codifica para un polipéptido de una única cadena que comprende un polipéptido de VNAR anti-CD19 derivado del armazón SEQ iD No . 1 fusionado con un dominio transmembrana de CD8 alfa, fusionado por sí mismo con el dominio coestimulador 4-1BB y el dominio de señalización CD3zeta que comprende un ITAM.
- Transcrito policistrónico de SEQ ID NO. 105 que codifica para un CAR de múltiples subunidades dirigido contra el antígeno CD19. Se introducen secuencias de T2A y F2A para dividir las secuencias traducidas en las diferentes cadenas. La primera cadena codifica para el polipéptido de VNAR externo anti-CD19 (el mismo que para el CAR de una única cadena) unido al dominio transmembrana de la cadena alfa de FceRI.
En ambas arquitecturas, se usó la región de bisagra de la cadena alfa de CD8 porque puede detectarse a través de tinción con anticuerpo de cabra conjugado con PE en la superficie de las células T transformadas.
Los transcritos también contenían una secuencia de péptido señal alfa específica de células T para permitir un direccionamiento eficaz a la membrana plasmática.
La humanización del polipéptido de VNAR usado para seleccionar como diana CD19 podría realizarse reemplazando un elemento estructural diferente de la estructura primaria de VNAR (es decir, ubicado principalmente fuera de las regiones CDR3 y CDR1) por una secuencia de aminoácidos que se encuentre en anticuerpos humanos estructuralmente similares. Como ejemplo, tal enfoque se ha usado satisfactoriamente para humanizar VNAR 5A7 usando el anticuerpo humano DPK9, un miembro del subgrupo 1 kappa variable (Vk1) como región de marco.
Se resuspendieron 5X106 células T preactivadas varios días (3-5) con perlas recubiertas con anticuerpo anti-CD3/CD28 e IL2 en tampón de citoporación T, y se sometieron a electroporación en cubetas de 0,4 cm sin ARNm o con 10 |ig de ARNm que codifica respectivamente para el VNAR-CAR de una única cadena (SEQ ID NO: 110) y el VNAR-CAR de múltiples cadenas (SEQ ID NO. 105).
24 horas tras la electroporación, se tiñeron las células con un colorante de viabilidad que puede fijarse eFluor-780 y un anticuerpo de cabra anti-CD8 conjugado con PE para evaluar la expresión en la superficie celular del CAR en las células vivas.
24 horas tras la electroporación, se cocultivaron células T con células Daudi (CD19+) durante 6 horas y se analizaron mediante citometría de flujo para detectar la expresión del marcador de desgranulación CD107a en su superficie (Betts, Brenchley et al. 2003).
Los resultados mostraron que la mayoría de las células sometidas a electroporación, o bien con el ARNm monocistrónico o bien con el ARNm policistrónico tal como se describió anteriormente, se desgranularon en presencia de células diana que expresan CD19. Estos resultados demuestran claramente que el VNAR-CAR expresado en la superficie de células T sometidas a electroporación era activo con las arquitecturas de tanto una única cadena como de múltiples cadenas.
Tabla 2 - Secuencias enumeradas en la presente memoria descriptiva
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Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Receptor de antígeno quimérico (CAR) caracterizado porque comprende:
    i) un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular que comprende un polipéptido de VNAR; y ii) un polipéptido transmembrana que comprende al menos un dominio de transducción de señales;
  2. 2. Receptor de antígeno quimérico según la reivindicación 1, en el que dicho dominio de reconocimiento de antígeno comprende sólo dos regiones determinantes de complementariedad (CDR) denominadas CDR1 y CDR3; o en el que dicho dominio de reconocimiento de antígeno tiene sólo una región determinante de complementariedad (CDR3).
  3. 3. Receptor de antígeno quimérico según la reivindicación 1 ó 2, en el que la especificidad de reconocimiento del CAR por un antígeno viene determinada por dicha CDR3.
  4. 4. Receptor de antígeno quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho CDR3 comprende al menos dos residuos de cisteína que crean enlaces disulfuro con residuos del polipéptido de VNAR.
  5. 5. Receptor de antígeno quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho CAR comprende además una región de bisagra entre su región transmembrana y su dominio de reconocimiento de antígeno extracelular.
  6. 6. Receptor de antígeno quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que todo su dominio extracelular es más corto de 150 aminoácidos.
  7. 7. Receptor de antígeno quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho polipéptido de VNAR tiene al menos el 50% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO. 1 a 100.
  8. 8. Receptor de antígeno quimérico según la reivindicación 7, en el que dicha secuencia de polipéptido de VNAR está humanizada.
  9. 9. Receptor de antígeno quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la región transmembrana de dicho CAR comprende un dominio de transducción de señales seleccionado del grupo que consiste en: cadena zeta de TCR, cadena de receptor de Fc, motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM).
  10. 10. Receptor de antígeno quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que está bajo la forma de un CAR de una única cadena.
  11. 11. Receptor de antígeno quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que está bajo la forma de un CAR de múltiples cadenas.
  12. 12. Célula inmunitaria aislada que comprende al menos un receptor de antígeno quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
  13. 13. Célula inmunitaria aislada según la reivindicación 12, para su uso como medicamento.
  14. 14. Célula inmunitaria aislada según la reivindicación 12 ó 13, para su uso como medicamento para tratar cáncer o una enfermedad autoinmunitaria.
  15. 15. Célula inmunitaria aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, para su uso como medicamento para tratar tumores líquidos.
  16. 16. Célula inmunitaria aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, para su uso como medicamento para tratar tumores malignos de células B.
  17. 17. Célula inmunitaria aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, para su uso como medicamento para seleccionar como diana células resistentes a fármacos que expresan canales iónicos de bombas de flujo de salida sobre su superficie, solo o en combinación con quimioterapia.
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