ES2765710T3

ES2765710T3 - Receptores de antígeno quimérico específicos de CD33 para la inmunoterapia del cáncer

Info

Publication number: ES2765710T3
Application number: ES15713513T
Authority: ES
Inventors: Roman Galetto
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2014-04-03
Filing date: 2015-04-02
Publication date: 2020-06-10
Anticipated expiration: 2035-04-02
Also published as: IL247917B; RU2016143155A3; MX2016012855A; EP3126390B1; DK3126390T3; MX370788B; JP6673848B2; AU2015239069B2; KR102170533B1; WO2015150526A3; WO2015150526A2; RU2701341C2; CA2944528C; JP2017515460A; US20190002561A1; RU2016143155A; KR20170002412A; CA2944528A1; US20170145094A1; US9944702B2

Abstract

Receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de CD33 que tiene una estructura polipeptídica seleccionada de V1 y V3 tal como se ilustra en la figura 2, en el que dicha estructura V1 comprende (a) un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti-CD33 monoclonal, (b) una bisagra FcγRIIIα, (c) un dominio transmembrana CD8α y (d) un dominio citoplásmico que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB; y en el que dicha estructura V3 comprende (a) un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti- CD33 monoclonal, (b) una bisagra CD8α, (c) un dominio transmembrana CD8α y (d) un dominio citoplásmico que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de antígeno quimérico específicos de CD33 para la inmunoterapia del cáncer

Campo de la invención

La presente invención se refiere a receptores de antígeno quimérico (CAR) que son proteínas quiméricas recombinantes que pueden redirigir la especificidad de células inmunitarias y la reactividad hacia CD33, una glicoproteína de la superficie celular encontrada en la mayoría de células mieloides y usada para diagnosticar leucemia mielógena aguda (LMA) en pacientes. Los CAR según la invención son particularmente útiles para tratar células malignas que portan CD33, cuando se expresan en células T o células NK. Las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética resultantes presentan un alto nivel de especificidad hacia células malignas, lo que confiere seguridad y eficacia para la inmunoterapia.

Antecedentes de la invención

La inmunoterapia adoptiva, que implica la transferencia de células T específicas de antígeno autólogo generadas ex vivo, es una estrategia prometedora para tratar infecciones virales y cáncer. Las células T usadas para la inmunoterapia adoptiva pueden generarse o bien mediante expansión de células T específicas de antígeno o bien redirección de células T a través de modificación por ingeniería genética (Park, Rosenberg et al. 2011). La transferencia de células T específicas de antígeno viral es un procedimiento bien establecido usado para el tratamiento de infecciones virales asociadas con trasplante y tumores malignos raros relacionados con virus. De manera similar, el aislamiento y la transferencia de células T específicas de tumor ha demostrado ser exitoso en el tratamiento de melanoma.

Se han generado con éxito especificidades novedosas en células T a través de la transferencia genética de receptores de células T transgénicas o receptores de antígeno quimérico (CAR) (Jena, Dotti et al. 2010). Los CAR son receptores sintéticos que consisten en un resto de direccionamiento que está asociado con uno o más dominios de señalización en una sola molécula de fusión. En general, el resto de unión de un CAR consiste en un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), que comprende los fragmentos ligeros y variables de un anticuerpo monoclonal unidos por un ligador flexible. Los restos de unión basados en dominios de receptor o ligando también se han usado con éxito. Los dominios de señalización para los CAR de primera generación se derivan de la región citoplásmica de las cadenas gamma del receptor CD3zeta o Fc. Se ha demostrado que los CAR de primera generación redirigen con éxito la citotoxicidad de células T. Sin embargo, no pudieron proporcionar una expansión prolongada y actividad antitumoral in vivo. Los dominios de señalización de las moléculas coestimuladoras, así como los dominios transmembrana y bisagra, se han añadido para formar CAR de segunda y tercera generación, lo que conduce a algunos ensayos terapéuticos exitosos en seres humanos, donde las células T podían redirigirse contra células malignas que expresan CD19 (June et al., 2011). Sin embargo, la combinación particular de dominios de señalización, dominios transmembrana y coestimuladores usados con respecto a CD19 ScFv era más bien específica de antígeno y no puede expandirse a ningún marcador de antígeno.

La leucemia mielógena aguda (LMA) es la segunda leucemia aguda más común con aproximadamente 13.300 casos nuevos por año en los Estados Unidos y 8.800 muertes anuales. La terapia comúnmente aplicada de las enfermedades leucémicas incluye irradiación y/o quimioterapia. Además, en determinadas circunstancias, se considera adecuada la posibilidad adicional de trasplante de médula ósea. Sin embargo, estas terapias son relativamente tóxicas para el paciente y muy a menudo no conducen a una cura completa de la enfermedad. Por tanto, aunque puede lograrse una remisión completa para el 65-80% de los pacientes que reciben quimioterapia, la mayoría de estos pacientes recaen (Cros et al., 2004) porque las células que sobrevivieron a la quimioterapia están enriquecidas en células madre de leucemia LMA (LMA-CML), y constituyen un reservorio de células particularmente peligroso que puede volver a expandirse y provocar una recaída. Las células madre de leucemia se han caracterizado particularmente bien para la leucemia mielógena aguda. Las LMA-CML expresan un conjunto característico de antígenos de la superficie celular que incluyen, entre otros, CD33. Los pacientes mayores de 60 años tienen un pronóstico desfavorable con sólo del 10% al 15% de supervivencia libre de enfermedad a los 4 años (Gardin et al., 2007). Esta alta tasa de recaída para los pacientes con LMA y el mal pronóstico para pacientes mayores destacan la urgente necesidad de opciones terapéuticas novedosas que preferiblemente seleccionen como diana células CD33+.

La CD33 (lectina 3 similar a Ig que se une a ácido siálico) o SIGLEC3, denominada P20138 en la base de datos de proteínas UniProtKB/wiss-Prot, es un receptor transmembrana expresado en células de linaje mieloide. Se considera habitualmente específico de mieloides, pero también puede encontrarse en algunas células linfoides. Se une a los ácidos siálicos, por tanto, es miembro de la familia de lectinas SIGLEC.

En el pasado, se han usado diferentes enfoques para desarrollar anticuerpos monoclonales no conjugados con actividad antitumoral contra CD33. Sin embargo, estos intentos no lograron abordar las células malignas específicamente.

En el 2000, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) aprobó la Gemtuzumabozogamicina (Milotarg™, GO), un anticuerpo monoclonal anti-CD33 humanizado conjugado con calicheamicina, para el tratamiento de pacientes mayores de 60 años con LMA resistente o recidivante. Sin embargo, se retiró del mercado el 21 de junio de 2010; la GO consistía en un anticuerpo de IgG anti-CD33 humanizado, acoplado químicamente al agente citotóxico calicheamicina. Un estudio tras la aprobación (SWOG S0106) planteó preocupaciones sobre la seguridad del producto, mientras que otros ensayos clínicos (ensayos del MRC (Medical Research Council) británico de LMA-15 y HOVON-43) no pudieron demostrar ningún beneficio clínico (Maniecki et al., 2011). Se encontró que los efectos secundarios incluían enfermedad venooclusiva hepática, toxicidad pulmonar y reacciones de hipersensibilidad graves, mientras que estudios in vitro revelaron citotoxicidades independientes de antígeno hacia líneas celulares negativas para CD33 (Schwemmlein ef al, 2006).

Más recientemente, se propusieron moléculas de polipéptido triespecíficas que combinan dominios de inmunoglobulina de anticuerpos CD123, CD16 y CD33 (documento WO2011/070109) para obviar los problemas de especificidad encontrados previamente con opciones terapéuticas que seleccionan como diana CD33.

Como alternativa a las estrategias previas, la presente invención proporciona CAR específicos de CD33, que pueden expresarse en células inmunitarias para seleccionar como diana células malignas CD33+ con ventaja clínica significativa.

Sumario de la invención

Los inventores han generado CAR específico de CD33 que tiene una estructura diferente y que comprende scFV diferente derivado de anticuerpos específicos de CD33 diferentes. Los polipéptidos de CAR, tal como se describen, comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO.19 a 42. Los polipéptidos de CAR más preferidos de la invención comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 68, o con una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO. 68. Tras la activación no específica in vitro (por ejemplo, con perlas recubiertas con anti CD3/CD28 e IL2 recombinante), las células T de donantes se han transformado con polinucleótidos que expresan estos CAR usando transducción viral. En determinados casos, las células T se modificaron por ingeniería genética adicionalmente para crear células T no alorreactivas, más especialmente por interrupción de un componente de TCR (ap-receptores de células T) para evitar la reacción de injerto contra huésped.

Las células T modificadas por ingeniería genética resultantes presentaron reactividad in vitro contra células positivas para CD33 en diversos grados, lo que muestra que los CAR de la presente invención contribuyen a la activación dependiente de antígeno, y también a la proliferación, de las células T, haciéndolos útiles para la inmunoterapia. Los polipéptidos y las secuencias de polinucleótido que codifican para los CAR de la presente invención se detallan en la presente memoria descriptiva.

Las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética de la presente invención son particularmente útiles para aplicaciones terapéuticas tales como linfoma de células B o tratamientos de leucemia.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Representación esquemática de una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética tal como se describe. La célula inmunitaria modificada por ingeniería genética presentada en esta figura es una célula T transducida con un polipéptido retroviral que codifica para CAR. Esta célula T se modifica por ingeniería genética adicionalmente para permitir una incorporación del injerto mejor y más segura en el paciente, que es opcional dentro del marco de la presente descripción. El gen X puede ser, por ejemplo, un gen que expresa un componente de TCR (TCRalfa o TCRbeta), Y puede ser un gen implicado en la sensibilidad de células T a fármacos inmunodepresores como CD52 (con respecto a Campath) o HPRT (con respecto a 6-Tioguanina).

Figura 2: Representación esquemática de la diferente arquitectura de CAR (V1 a V6).

Figura 3: Representación esquemática de CAR diferente con una estructura V1, V3 o V5.

Figura 4: Actividad de desgranulación (% de células CD8/CD107a+ e intensidad de fluorescencia media (IFM) de CD107a en células CD8+) del scFv de M195 con las tres arquitecturas (v1: FcgRIII-bisagra/CD8-transmembrana, v3: CD8-bisagra/CD8-transmembrana, v5: IgG1-bisagra/CD8-transmembrana), cuando se cultivaron conjuntamente células T CAR+ durante 6 horas con células que expresan CD33 (U937), o con células que no expresan CD33 (Jeko). Los datos se presentan como porcentaje (%) de desgranulación e intensidad de fluorescencia media (IFM). Figura 5: Actividad de desgranulación (% de células CD8/CD107a+ e IFM de CD107a en células CD8+) de los scFV de m2H12 y My9.6 con las tres arquitecturas (v1: FcgRIII-bisagra/CD8-transmembrana, v3: CD8-bisagra/CD8-transmembrana, v5: IgG1-bisagra/CD8-transmembrana), cuando se cultivaron conjuntamente células T CAR+ durante 6 horas con células que expresan CD33 (U937), o con células que no expresan CD33 (Jeko). Los datos se presentan como porcentaje (%) de desgranulación e intensidad de fluorescencia media (IFM).

Figura 6: Actividad de desgranulación (% de células CD8/CD107a+) de 7 construcciones: M195-V1, M195-V3, M195-V5, m2H12-V1, m2H12-V3 y My9.6-V1 y My9.6-V3 (v1: FcgRIII-bisagra/CD8-transmembrana, v3: CD8-bisagra/CD8-transmembrana, v5: IgG1-bisagra/CD8-transmembrana), cuando se cultivaron conjuntamente células T CAR+ durante 6 horas con células que expresan niveles altos o intermedios de CD33 (U937 y K562, respectivamente), o con células que no expresan CD33 (Jeko-1). Los datos se presentan como porcentaje (%) de desgranulación. Figura 7: Cantidad de IFN gamma liberado por células T que expresan CAR anti-CD33 cuando se cultivan conjuntamente durante 24 h con células que expresan diferentes niveles de CD33 (U937 y K562), o con células que no expresan CD33 (Jeko-1). También se muestra la liberación de IFN gamma de células T cultivadas solas, en las mismas condiciones que los cultivos conjuntos. Los experimentos se realizaron usando tres donantes independientes, y se muestran los resultados de un donante representativo en este caso.

Figura 8: Actividad citolítica específica de células T que expresan CAR anti-CD33. Se realizaron los ensayos 48 h después de la transfección de ARNm de CAR. Las células T se cultivaron conjuntamente con células U937+Jeko o K562+Jeko durante 4 horas. Se determinó la viabilidad celular para cada una de las líneas celulares al final de las cultivadas conjuntamente y se calculó un porcentaje de lisis celular específica.

Tabla 1: Secuencia de los diferentes componentes de CAR

Tabla 2: Secuencia de los diferentes componentes de CAR

Tabla 3: CAR de estructura V-1

Tabla 4: CAR de estructura V-2

Tabla 5: CAR de estructura V-3

Tabla 6: CAR de estructura V-4

Tabla 7: CAR de estructura V-5

Tabla 8: CAR de estructura V-6

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina específicamente en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos usados tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica en los campos de terapia génica, bioquímica, genética y biología molecular.

Los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende que sean limitativos, a menos que se especifique lo contrario.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican totalmente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, EE.UU.); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. patente estadounidense n.° 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds.

1984); Transcription and Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); la serie, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson y M. Simon, editores jefe, Academic Press, Inc., Nueva York), específicamente, vol.154 y 155 (Wu et al. eds.) y vol. 185, “Gene Expression Technology” (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectores For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walquer, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); y Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). La presente invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) de CD33 que tiene una estructura polipeptídica seleccionada de V1 y V3 tal como se ilustra en la figura 2, en el que dicha estructura V1 comprende: (a) un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti-CD33 monoclonal, (b) una bisagra FcRIIIa,

(c) un dominio transmembrana CD8a y

(d) un dominio citoplásmico que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB; y

en el que dicha estructura V3 comprende:

(a) un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti-CD33 monoclonal, (b) una bisagra CD8a,

(c) un dominio transmembrana CD8a y

(d) un dominio citoplásmico que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB. En una realización preferida, la presente invención proporciona un CAR específico de CD33 tal como anteriormente, en el que dicha estructura V3 comprende una bisagra CD8a y un dominio transmembrana CD8a.

La presente invención proporciona un CAR específico de CD33 tal como anteriormente, en el que dicha bisagra CD8a tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO.4.

La presente invención proporciona un CAR específico de CD33 tal como anteriormente, que comprende una secuencia polipeptídica que tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO. 27.

En una realización, la presente invención proporciona un CAR específico de CD33 tal como anteriormente, en el que dicha estructura V1 comprende una bisagra FcyRIIIa y un dominio transmembrana CD8a.

La presente invención proporciona un CAR específico de CD33 tal como anteriormente, en el que dicha bisagra FcyRIIIa tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO.3.

La presente invención proporciona un CAR específico de CD33 tal como anteriormente, que comprende una secuencia polipeptídica que tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO. 19 o SEQ ID NO.21.

La presente invención proporciona un CAR específico de CD33 tal como anteriormente, en el que dicho VH tiene una identidad de al menos el 80% con una secuencia polipeptídica seleccionada de SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 15 y SEQ ID NO. 17 y dicho VL tiene una identidad de al menos el 80% con una secuencia polipeptídica seleccionada de SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 16 y SEQ ID NO. 18.

La presente invención proporciona un CAR específico de CD33 tal como anteriormente, en el que el dominio coestimulador de 4-1BB tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO.8.

La presente invención proporciona un CAR específico de CD33 tal como anteriormente, en el que dicho dominio de señalización CD3 zeta tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO.9.

La presente invención proporciona un CAR específico de CD33 tal como anteriormente, en el que dicho dominio transmembrana CD8a tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO.6.

La presente invención proporciona un CAR específico de CD33 tal como anteriormente, que comprende además un péptido señal.

La presente invención proporciona un CAR específico de CD33 tal como anteriormente, en el que dicho péptido señal tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con SEQ ID NO.1 o SEQ ID NO.2.

En una realización, la presente invención proporciona un CAR específico de CD33 tal como anteriormente, que comprende una secuencia polipeptídica que tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 66 o SEQ ID NO. 68, preferiblemente una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO. 66 o SEQ ID NO. 68.

La presente invención proporciona un CAR específico de CD33 tal como anteriormente, que comprende además otro dominio de unión a ligando extracelular que no es específico para CD33.

En un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica para un CAR según una cualquiera de las realizaciones anteriores.

En un aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido tal como anteriormente.

En un aspecto, la presente invención proporciona una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética que expresa en la membrana de la superficie celular un CAR específico de CD33 según cualquiera de lo anterior.

La presente invención proporciona una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética tal como anteriormente, derivada de linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T cooperadores. La presente invención proporciona una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética tal como anteriormente, en la que expresión de TCR se suprime.

La presente invención proporciona una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética tal como anteriormente, en la que dicha célula inmunitaria modificada por ingeniería genética se modifica para ser resistente a al menos un fármaco inmunodepresor o quimioterápico.

La presente invención proporciona una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética tal como anteriormente, para su uso en terapia.

La presente invención proporciona una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia tal como anteriormente, en la que el paciente es un ser humano.

La presente invención proporciona una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia tal como anteriormente, en la que el estado es un estado de cáncer premaligno o maligno caracterizado por células que expresan CD33.

La presente invención proporciona una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia tal como anteriormente, en la que el estado es un estado que se caracteriza por una sobreabundancia de células que expresan CD33.

La presente invención proporciona una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia tal como anteriormente, en la que el estado es un estado de cáncer hemático.

La presente invención proporciona una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia tal como anteriormente, en la que el estado de cáncer hemático es leucemia.

La presente invención proporciona una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia tal como anteriormente, en la que dicha leucemia se selecciona del grupo que consiste en leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica, síndrome melodisplásico, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica y síndrome mielodisplásico.

La presente invención proporciona una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia tal como anteriormente, en la que dicha leucemia es leucemia mielógena aguda (LMA).

La presente invención proporciona una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia tal como anteriormente, en la que dicho cáncer hemático es un trastorno linfoproliferativo maligno.

La presente invención proporciona una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia tal como anteriormente, en la que dicho trastorno linfoproliferativo maligno es un linfoma.

La presente invención proporciona una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia tal como anteriormente, en la que dicho linfoma se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, linfoma no hodgkiniano, linfoma de Burkitt y linfoma folicular (célula pequeña y célula grande).

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para dañar una célula de cáncer hemático que comprende poner en contacto dicha célula de cáncer hemático con una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética tal como anteriormente, en una cantidad eficaz para provocar el daño de dicha célula cancerosa.

La presente divulgación proporciona un método para modificar por ingeniería genética una célula inmunitaria, que comprende:

(a) Proporcionar una célula inmunitaria,

(b) Expresar en la superficie de dicha célula al menos un receptor de antígeno quimérico de CD33 tal como se describió anteriormente.

La presente divulgación proporciona un método para modificar por ingeniería genética una célula inmunitaria tal como anteriormente, que comprende:

(a) Proporcionar una célula inmunitaria,

(b) Introducir en dicha célula al menos un polinucleótido que codifica para dicho receptor de antígeno quimérico específico de CD33, tal como anteriormente

(c) Expresar dicho polinucleótido en dicha célula, expresando opcionalmente dicho receptor de antígeno quimérico específico de CD33.

La presente invención proporciona un método para modificar por ingeniería genética una célula inmunitaria tal como anteriormente, que comprende además:

(d) Inhibir la expresión de TRC y/o la expresión de CD33.

En una realización, la célula inmunitaria proporcionada para la etapa (a) del método descrito anteriormente es una célula inmunitaria en la que la expresión de TRC y/o CD33 en la superficie celular se inhibe, y opcionalmente resistente a al menos un fármaco usado para tratar un cáncer, en particular LMA.

La presente divulgación proporciona un método para modificar por ingeniería genética una célula inmunitaria tal como anteriormente, que comprende además:

(a) Introducir al menos otro receptor de antígeno quimérico que no es específico para CD33.

La presente invención también proporciona un método para tratar un sujeto que lo necesita, que comprende:

(a) Proporcionar una célula inmunitaria que expresa en la superficie un receptor de antígeno quimérico de CD33 según cualquiera de lo anterior;

(b) Administrar dichas células inmunitarias a dicho paciente.

La presente divulgación proporciona un método tal como anteriormente, en el que dicha célula inmunitaria se proporciona de un donante.

La presente invención proporciona un método para tratar un sujeto que lo necesita tal como anteriormente, en el que dicha célula inmunitaria (que va a modificarse según la invención) se proporciona del propio paciente.

Receptores de antígeno quimérico específicos de CD33

La presente invención se refiere a nuevos diseños de receptor de antígeno quimérico anti-CD33 (CAR o CAR de CD33 o CAR específico de CD33 o CAR anti-CD33) que comprenden un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de transducción de señalización.

Más precisamente, la presente invención se refiere a un nuevo CAR específico de CD33 que comprende un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un VH y un VL de un anticuerpo anti-CD33 monoclonal, una bisagra seleccionada de bisagra FcRIIIa y bisagra CD8alfa, un dominio transmembrana CD8a y un dominio citoplásmico que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

El término “dominio de unión a ligando extracelular” tal como se usa en el presente documento se define como un oligo o polipéptido que puede unirse al ligando. Preferiblemente, el dominio podrá interactuar con una molécula de la superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión a ligando extracelular puede elegirse para reconocer un ligando que actúa como marcador de la superficie celular en células diana asociadas con un estado patológico particular. En una realización preferida, dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) que comprende el fragmento variable ligero (V^l) y pesado (V^h) de un anticuerpo anti-CD33 monoclonal específico de antígeno diana unido por un ligador flexible. Dichos Vl y Vh se seleccionan preferiblemente de los anticuerpos denominados M195, m2H12, DRB2 y My9-6 tal como se indica en la tabla 2.

En una realización incluso más preferida, dichos Vl y Vh comprenden SEQ ID NO 17 y 18, opcionalmente humanizadas.

Se ligan preferiblemente mediante un ligador flexible que comprende, por ejemplo, la secuencia SEQ ID NO.10. En otras palabras, dichos CAR comprenden preferentemente un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una secuencia polipeptídica que presenta una identidad de al menos el 90%, el 95%, el 97% o el 99% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 18.

En una realización, dicho CAR de la invención comprende preferentemente un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un polipéptido de SEQ ID n O: 11 y SEQ ID NO: 12.

En una realización, dicho CAR de la invención comprende preferentemente un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un polipéptido de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14.

En una realización, dicho CAR de la invención comprende preferentemente un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un polipéptido de SEQ ID n O: 15 y SEQ ID NO: 16.

En una realización, dicho CAR de la invención comprende preferentemente un dominio de unión a ligando extracelular que comprende un polipéptido de SEQ ID ⁿO: 17 y SEQ ID NO: 18.

Por el término “anticuerpo recombinante” tal como se usa en el presente documento, quiere decirse un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se genera usando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo expresado por un bacteriófago, un sistema de expresión en levaduras o un sistema de expresión en células de mamífero. El término también debe interpretarse como que significa un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se ha generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica para el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y cuya molécula de ADN expresa un anticuerpo o una proteína de fragmento de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en el que el ADN o la secuencia de aminoácidos se ha obtenido usando tecnología de secuencia de aminoácidos o ADN sintético o recombinante que está disponible y se conoce bien en la técnica.

Tal como se usa en el presente documento, el término “modificaciones de secuencia conservadoras” o “humanización” pretende referirse a modificaciones de aminoácido que no afectan o alteran significativamente las características del CAR (en comparación con las de un CAR construido usando el anti-CD33 original) y/o que no afectan significativamente a la actividad del CAR que contiene la secuencia de aminoácidos modificada y reducen o suprimen una respuesta de anticuerpo anti-ratón humano (HAMA). Tales modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácido en dicho fragmento de anticuerpo en dicho CAR y/o cualquier otra parte de dicha molécula de CAR. Pueden introducirse modificaciones en un anticuerpo, en un fragmento de anticuerpo o en cualquier otra parte de la molécula de CAR de la invención mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis mediada por PCR o empleando secuencias de línea germinal optimizadas. Por consiguiente, la presente invención proporciona un CAR de CD33 (humanizado), en el que el VH tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID No 11, SEQ ID NO13, SEQ ID NO15 o SEQ ID NO17 y el VL tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO 12, SEQ ID NO14, SEQ ID NO16, o SEQ ID NO18.

En una realización, dicho CAR de la invención comprende preferentemente un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una secuencia polipeptídica que tiene una identidad de al menos el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO 12.

En una realización, dicho CAR de la invención comprende preferentemente un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una secuencia polipeptídica que tiene una identidad de al menos el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 13 y SEQ ID NO 14.

En una realización, dicho CAR de la invención comprende preferentemente un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una secuencia polipeptídica que tiene una identidad de al menos el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 15 y SEQ ID NO 16.

En una realización, dicho CAR de la invención comprende preferentemente un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una secuencia polipeptídica que tiene una identidad de al menos el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 17 y SEQ ID NO 18.

Las sustituciones de aminoácido conservadoras son aquellas en las que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, uno o más residuos de aminoácido dentro de un CAR de la invención pueden reemplazarse con otros residuos de aminoácido de la misma familia de cadena lateral y el CAR alterado puede someterse a prueba para determinar la capacidad de unión a CD 33 usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

El dominio de transducción de señales o dominio de señalización intracelular de un CAR según la presente invención es responsable de la señalización intracelular tras la unión del dominio de unión a ligando extracelular a la diana que da como resultado la activación de la célula inmunitaria y la respuesta inmunitaria. En otras palabras, el dominio de transducción de señales es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se expresa el CAR. Por ejemplo, la función efectora de una célula T puede ser una actividad citolítica o actividad cooperadora que incluye la secreción de citocinas. Por tanto, el término “dominio de transducción de señales” se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de función de señal efectora y dirige la célula para realizar una función especializada.

Los ejemplos preferidos de dominio de transducción de señales para su uso en un CAR pueden ser las secuencias citoplásmicas del receptor y correceptores de células T que actúan en conjunto para iniciar la transducción de señales tras la interacción del receptor con el antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tiene la misma capacidad funcional. El dominio de transducción de señales comprende dos clases distintas de secuencia de señalización citoplásmica, aquellas que inician la activación primaria dependiente de antígeno, y aquellas que actúan de manera independiente al antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora. La secuencia de señalización citoplásmica primaria puede comprender motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptor de ITAM. Los ITAM son motivos de señalización bien definidos encontrados en la cola intracitoplásmica de una variedad de receptores que sirven como sitios de unión para tirosina cinasas de clase sky/zap70. Los ejemplos de ITAM usados en la descripción pueden incluir como ejemplos no limitativos aquellos derivados de TCRzeta, FcRgamma, FcRbeta, FcRépsilon, CD3gamma, CD3delta, CD3épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. Según la invención, el dominio de transducción de señalización del CAR puede comprender el dominio de señalización CD3zeta que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, el 95% el 97% - 99% o el 100% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (SEQ ID NO: 9).

El dominio de transducción de señales del CAR de la presente invención comprende una molécula señal coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de la superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta inmunitaria eficaz. “Ligando coestimulador” se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígeno que se une específicamente a una molécula coestimuladora relacionada en una célula T, proporcionando de ese modo una señal que, además de la señal primaria proporcionada por, por ejemplo, la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula de CMH cargada con péptido, media una respuesta de células T, incluyendo, pero sin limitarse a, activación de la proliferación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, pero no se limita a, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ⁱC^aM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une al receptor de ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en una célula T, tal como, pero sin limitarse a, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado con la función de linfocito (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83.

Una “molécula coestimuladora” se refiere a la pareja de unión relacionada en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando de ese modo una respuesta coestimuladora por la célula, tal como, pero sin limitarse a, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a, una molécula de CMH de clase I, BTLA y receptor de ligando Toll. Los ejemplos de moléculas coestimuladoras incluyen CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado con la función de linfocito (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83 y similares.

El dominio de transducción de señales del CAR tal como se describe comprende una parte de molécula señal coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en fragmento de 4-1BB (GenBank: AAA53133.) y CD28 (NP_006130.1). En particular, el dominio de transducción de señales del CAR de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una identidad de secuencia de al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, el 95% el 97% el 699% o el 100% con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8.

Un CAR según la presente invención se expresa en la membrana de la superficie de la célula. Por tanto, tal CAR comprende además un dominio transmembrana CDa. En una realización preferida, dicho dominio transmembrana se deriva de la cadena humana CD8 alfa (por ejemplo, NP_001139345.1) El dominio transmembrana comprende además una región bisagra entre dicho dominio de unión a ligando extracelular y dicho dominio transmembrana. El término “región bisagra” usado en el presente documento significa generalmente cualquier oligo o polipéptido que funciona para ligar el dominio transmembrana al dominio de unión a ligando extracelular. En particular, se usan región bisagra para proporcionar más flexibilidad y accesibilidad para el dominio de unión a ligando extracelular. En una realización preferida, dicho dominio bisagra comprende una parte de receptor de FcyRIIIa humano o cadena CD8 alfa denominados en esta memoria descriptiva, respectivamente, SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 4, o polipéptidos bisagra que presentan preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, el 95% el 97% el 99% o el 100% con estos polipéptidos.

Un CAR según la invención comprende generalmente un dominio transmembrana (TM) de CD8a que muestra una identidad del 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% con el polipéptido de SEQ ID NO. 6. En una realización preferida, un CAR según la invención generalmente comprende además un dominio transmembrana (TM) de CD8a que muestra una identidad del 100% con el polipéptido de SEQ ID NO. 6.

La regulación por disminución o mutación de antígenos diana se observa comúnmente en células cancerosas, creando variantes de escape de pérdida de antígeno. Por tanto, para compensar el escape de tumor y hacer que la célula inmunitaria sea más específica a la diana, el CAR específico de CD33 según la invención puede comprender otros dominios de unión a ligando extracelulares, para unir simultáneamente diferentes elementos en la diana aumentando de ese modo la activación y función de la célula inmunitaria. En una realización, los dominios de unión a ligando extracelulares pueden colocarse en tándem en el mismo polipéptido transmembrana, y pueden separarse opcionalmente por un ligador. En otra realización, dichos diferentes dominios de unión a ligando extracelulares pueden colocarse en diferentes polipéptidos transmembranas que componen el CAR. En otra realización, la presente invención se refiere a una población de CAR comprendiendo cada una dominios de unión a ligando extracelulares diferentes. En un particular, la presente invención se refiere a un método para modificar por ingeniería genética células inmunitarias que comprende proporcionar una célula inmunitaria y expresar en la superficie de dicha célula una población de CAR comprendiendo cada una diferentes dominios de unión a ligando extracelulares. En otra realización particular, la presente invención se refiere a un método para modificar por ingeniería genética una célula inmunitaria que comprende proporcionar una célula inmunitaria e introducir en dicha célula polinucleótidos que codifican para polipéptidos que componen una población de CAR comprendiendo cada una diferentes dominios de unión a ligando extracelulares. Por población de CAR, quiere decirse al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o más CAR comprendiendo cada uno diferentes dominios de unión a ligando extracelulares. Los diferentes dominios de unión a ligando extracelulares según la presente invención pueden unirse preferiblemente de manera simultánea a diferentes elementos en la diana aumentando de ese modo la activación y función de la célula inmunitaria. La presente invención también se refiere a una célula inmunitaria aislada que comprende una población de CAR comprendiendo cada una diferentes dominios de unión a ligando extracelulares.

La presente invención proporciona un CAR específico de CD33 que tiene una de la estructura polipeptídica seleccionada de V1 y ^v3 tal como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti-CD33 monoclonal, una bisagra seleccionada de bisagra FcRIIIa y bisagra CD8a, un dominio transmembrana CD8a y un dominio citoplásmico que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

La presente invención proporciona un CAR de CD33 que comprende una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68, preferiblemente dicho CAR comprende una secuencia polipeptídica seleccionada de SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68 y más preferiblemente, dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica seleccionada de SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68, e incluso más preferiblemente, dicho CAR comprende preferentemente un polipéptido de SEQ ID NO: 68.

La presente invención también proporciona :

- un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de CD33 que comprende una secuencia polipeptídica que tiene una identidad de al menos el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68,

más preferiblemente, un CAR que comprende una secuencia polipeptídica que presenta una identidad de al menos el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68,

incluso más preferiblemente, un CAR que comprenden una secuencia polipeptídica que presenta una identidad de al menos el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68.

Preferiblemente, la presente invención proporciona un CAR específico de CD33 que tiene una estructura V1 tal como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti-CD33 monoclonal, una bisagra FcRIIIa, un dominio transmembrana CD8a y un dominio citoplásmico que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

Preferiblemente, la presente invención proporciona un CAR específico de CD33 que tiene la estructura polipeptídica V1 tal como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti-CD33 monoclonal seleccionado de M195, m2h12 y My9.6, opcionalmente humanizado, una bisagra FcRIIIa, un dominio transmembrana CD8a y un dominio citoplásmico que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

Más preferiblemente, la presente invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) de CD33 que tiene la estructura polipeptídica V1 tal como se ilustra en la figura 2, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 54, Se Q ID NO: 60, y SEQ ID NO: 66, más preferiblemente dicho cAr comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que comprende y secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ iD NO: 48, SEQ ID NO: 54, y SEQ ID nO: 66.

Preferiblemente, la presente invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) de CD33 que tiene una estructura V3 tal como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti-CD33 monoclonal, bisagra CD8a, un dominio transmembrana CD8a y un dominio citoplásmico que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

Preferiblemente, la presente invención proporciona un CAR específico de CD33 que tiene una estructura V3 tal como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti-CD33 monoclonal seleccionado de M195, m2h12, DRB2 y My9.6, opcionalmente humanizado, una bisagra FcRIIIa, un dominio transmembrana CD8a y un dominio citoplásmico que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

Más preferiblemente, la presente invención proporciona un CAR específico de CD33 que tiene una estructura V3 tal como se ilustra en la figura 2, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 62, y SEQ ID NO: 68, más preferiblemente dicho C^{a r}comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que comprende y secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 56, y SEQ ID NO: 68.

En una realización, la presente invención proporciona un receptor de antígeno quimérico de CD33 que comprende: - un péptido señal opcional que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, el 95% el 97% o el 99% con el polipéptido de SEQ ID NO. 1 ó 2; Preferiblemente, el péptido señal opcional tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, el 95% el 97% o el 99% con el polipéptido de SEQ ID NO 1. Preferiblemente, el péptido señal está presente.

- un dominio VH separado de un dominio VL por un ligador, contribuyendo dichos VH y VL a la unión a CD33;

- una bisagra derivada de Fcgamma (y) RlIIalfa (a) que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, el 95% el 97% o el 99% con el polipéptido de SEQ ID NO. 3;

- un dominio transmembrana derivado de CD8alfa(a) que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% con el polipéptido de SEQ ID NO. 6;

- una molécula señal coestimuladora derivada de 4-1BB que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, el 95% el 97%, el 99% o el 100% con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8;

- un dominio de señalización intracelular que comprende el dominio de señalización CD3zeta que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, el 95% el 97%, el 99% o el 100% con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9;

- un dominio VH separado de un dominio VL por un ligador, contribuyendo dicho VH y VL a la unión a CD33;

- una bisagra derivada de cadena CD8 alfa humana que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, el 95% el 97% o el 99% con el polipéptido de SEQ ID NO. 4;

- una molécula señal coestimuladora derivada de 4-1BB que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, el 95% el 97%, el 99% o el 100% con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8; - un dominio de señalización intracelular que comprende el dominio de señalización CD3zeta que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, el 95% el 97%, el 99% o el 100% con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9;

En una realización, la presente invención proporciona al menos uno del siguiente CAR específico de CD33 que tiene las siguientes secuencias, o el 80% de las siguientes secuencias:

M195-1

SEQ ID NO 48:

MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGY IYPYNGGTGYNQKFKSKATLTVDNSSSTAYMDVRSLTSEDSAVYYCARGRPAMDYWGQGTSVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAA SNOGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCOOSKEVPWTFGGGTKLEIKGLAVSTISSFFPPGY QIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPA YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKG HDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

M195-3

SEQ ID NO 50:

MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGY IYPYNGGTGYNQKFKSKATLTVDNSSSTAYMDVRSLTSEDSAVYYCARGRPAMDYWGQGTSVTVSSGG GGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAA SNOGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCOOSKEVPWTFGGGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTI ASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQE EDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQE GLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

m2H12-1

SEQ ID NO 54:

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPELVRPGTFVKISCKASGYTFTNYDINWVNQRPGQGLEWIGW IYPGDGSTKYNEKFKAKATLTADKSSSTAYLQLNNLTSENSAVYFCASGYEDAMDYWGQGTSVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVIINCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRL VDGVPSRFSGSGSGODYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELKRGLAVSTISSFFPPGYQIY IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQ QGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHD GLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

m2H12-3

SEQ ID NO 56:

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPELVRPGTFVKISCKASGYTFTNYDINWVNQRPGQGLEWIGW IYPGDGSTKYNEKFKAKATLTADKSSSTAYLQLNNLTSENSAVYFCASGYEDAMDYWGQGTSVTVSSG GGGSGGGGSGGGGSDIKMTQSPSSMYASLGERVIINCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRL VDGVPSRFSGSGSGODYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELKRTTTPAPRPPTPAPTIAS QPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEED GCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLY NELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR DRB2-1

SEQ ID NO 60:

MALPVTALLLPLALLLHAARPEVKLQESGPELVKPGASVKMSCKASGYKFTDYVVHWLKQKPGQGLEWIGY INPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMEVSSLTSEDSAVYYCARDYRYEVYGMDYWGQGTSVTV SSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPTIMSASPGERVTMTCTASSSVNYIHWYQQKSGDSPLRWIFDTS KVASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCOQWRSYPLTFGDGTRLELKRADAAPTVSGLAVS TISSFFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVK FSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM KGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR DRB2-3

SEQ ID NO 62:

MALPVTALLLPLALLLFIAARPEVKLQESGPELVKPGASVKMSCKASGYKFTDYVVHWLKQKPGQGLEWIGY INPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMEVSSLTSEDSAVYYCARDYRYEVYGMDYWGQGTSVTV SSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPTIMSASPGERVTMTCTASSSVNYIHWYQQKSGDSPLRWIFDTS KVASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWRSYPLTFGDGTRLELKRADAAPTVSTTTPA PRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPF MRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGG KPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

My9.6-1

SEQ ID NO 66:

MALPVTALLLPLALLLFIAARPQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGV IYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSNIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLL IYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKRGLAVSTISSF FPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRS ADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGER RRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

My9.6-3

SEQ ID NO 68:

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQPGAEWKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPGQGLEWVGV IYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLRYFDVWGAGTTVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSNIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLL IYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLAIYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKRTTTPAPRPPT PAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQ TTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKN PQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

En una realización, la presente invención proporciona células T primarias dotadas con al menos uno de estos CAR específico de CD33.

En una realización preferida, la presente invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) de CD33 que comprende una secuencia polipeptídica que presenta una identidad de al menos el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68.

En esta realización, dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 81% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 82% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 83% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 84% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 85% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 86% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 87% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dichos CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 88% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 89% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 91% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 92% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 93% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 94% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 95% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 96% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 97% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 98% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

dicho CAR comprende preferentemente una secuencia polipeptídica que presenta una identidad del 99% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:68,

En una realización, dicho CAR consiste en SEQ ID NO:68.

La presente invención proporciona un CAR específico de CD33 que comprende

(a) un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti-CD33 monoclonal, opcionalmente humanizado

(b) una bisagra CD8a,

(c) un dominio transmembrana CD8a y

(d) un dominio citoplásmico que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB. La presente invención proporciona un CAR específico de CD33 que comprende

(b) una bisagra FcyRNIa,

(c) un dominio transmembrana CD8a y

(d) un dominio citoplásmico que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB Polinucleótidos, vectores:

Se describen polinucleótidos, vectores que codifican para uno cualquiera de los CAR descritos anteriormente según la invención.

La presente invención también se refiere a un polinucleótido que codifica para un CAR anti-CD33 según la invención. También se describe un vector, preferiblemente a un vector lentiviral, que comprende al menos uno de dicho polinucleótido que codifica para un CAR anti-CD33 según la invención.

El polinucleótido puede consistir en un casete de expresión o vector de expresión (por ejemplo, un plásmido para introducción en una célula huésped bacteriana, o un vector viral tal como un vector de baculovirus para transfección de una célula huésped de insecto, o un plásmido o vector viral tal como un lentivirus para transfección de una célula huésped de mamífero).

En una realización particular, las diferentes secuencias de ácido nucleico pueden incluirse en un polinucleótido o vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de salto ribosómico tal como una secuencia que codifica para un péptido 2A. Los péptidos 2A, que se identificaron en el subgrupo Aphthovirus de los picornavirus, provoca un “salto” ribosómico desde un codón hasta el siguiente sin la formación de un enlace peptídico entre los dos aminoácidos codificados por los codones (véase (Donnelly y Elliott 2001; Atkins, Wills et al. 2007; Doronina, Wu et al. 2008)). Por “codón” quiere decirse tres nucleótidos en un ARNm (o en la cadena de sentido de una molécula de ADN) que un ribosoma traduce en un residuo de aminoácido. Por tanto, pueden sintetizarse dos polipéptidos a partir de un marco de lectura abierto individual, contiguo dentro de un ARNm cuando los polipéptidos se separan por una secuencia oligopeptídica 2A que está en marco. Tales mecanismos de salto ribosómico se conocen bien en la técnica y se conoce que los usan varios vectores para la expresión de varias proteínas codificadas por un ARN mensajero individual.

Para dirigir el polipéptido transmembrana a la ruta secretora de una célula huésped, se proporciona una secuencia señal secretora (también conocida como secuencia líder, secuencia prepro o secuencia previa) en una secuencia de polinucleótido o secuencia de vector. La secuencia señal secretora se liga operativamente a la secuencia de ácido nucleico transmembrana, es decir, las dos secuencias se unen en el marco de lectura correcto y se sitúan para dirigir el polipéptido recién sintetizado a la ruta secretora de la célula huésped. Las secuencias señal secretoras se sitúan comúnmente en 5' con respecto a la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de interés, aunque determinadas secuencias señal secretoras pueden situarse en cualquier sitio en la secuencia de ácido nucleico de interés (véase, por ejemplo, Welch et al., patente estadounidense n.° 5.037.743; Holland et al., patente estadounidense n.° 5.143.830). En una realización preferida, el péptido señal comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y 2.

Los expertos en la técnica reconocerán que, en vista de la degeneración del código genético, es posible una variación de secuencia considerable entre estas moléculas de polinucleótido. Preferiblemente, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención tienen codones optimizados para la expresión en células de mamífero, preferiblemente para la expresión en células humanas. La optimización de codones se refiere al intercambio en una secuencia de interés de codones que son generalmente raros en genes altamente expresados de una especie dada por codones que son generalmente frecuentes en genes altamente expresados de tales especies, codificando tales codones para los aminoácidos como los codones que están intercambiándose.

Métodos de modificación por ingeniería genética de células inmunitarias dotadas con CAR:

La presente divulgación abarca el método de preparación de células inmunitarias para la inmunoterapia que comprende introducir ex vivo en dichas células inmunitarias los polinucleótidos o vectores que codifican para uno del CAR de CD33 tal como se describió previamente.

En una realización preferida, dichos polinucleótidos se incluyen en vectores lentivirales en vista de expresarse de manera estable en las células inmunitarias.

Según realizaciones adicionales, dicho método comprende además la etapa de modificar por ingeniería genética dicha célula para hacerlas más adecuadas para alotrasplante.

Según un primer aspecto, la célula inmunitaria puede hacerse menos alogénica, por ejemplo, inactivando al menos un gen que expresa uno o más componente de receptor de células T (TCR) tal como se describe en el documento WO 2013/176915, que puede combinarse con la inactivación de un gen que codifica para o que regula la proteína de expresión p2m o HLA. Por consiguiente, el riesgo de síndrome de injerto contra huésped y rechazo del injerto se reduce significativamente.

Según otro aspecto de la descripción, al menos un gen que permite la expresión de uno o más componente de CD33 se inactiva en las células inmunitarias de CAR específico de CD33. Inhibir la expresión en la superficie de CD33 en células que expresan un CAR anti-CD33 forma parte de un método para preparar las células inmunitarias que expresan ^cA^ranti-CD33 tal como se describió. Se describe un método general en el documento W^o2013/176915. La inactivación del gen CD33 puede combinarse con la activación/o inactivación de un gen que codifica para o que regula la expresión de CD33 tal como lectinas similares a Ig que se unen a ácido siálico (Cao H, Crocker PR. Evolution of CD33-related siglecs: regulating host immune functions and escaping pathogen exploitation? Immunology. Enero de 2011;132(1):18-26) de modo que se inhibe la expresión en la superficie celular de CD33 las células inmunitarias que expresan CAR anti-CD33 y, por consiguiente, no alteran la supervivencia o inhiben la actividad las células vecinas que expresan CAR anti-CD33.

Según otro aspecto, las células inmunitarias pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para mejorar su resistencia a fármacos inmunodepresores o tratamientos de quimioterapia, que se usan como tratamiento convencional para tratar células malignas positivas para CD33. Por ejemplo, CD52 y receptores de glucocorticoides (GR), que son dianas farmacológicas de Campath (alemtuzumab) y tratamientos con glucocorticoides, pueden inactivarse para hacer a las células resistentes a estos tratamientos y proporcionarles una ventaja competitiva con respecto a las propias células T del paciente dotadas con CAR de CD33 específicos. La expresión del gen CD3 también puede suprimirse o reducirse para conferir resistencia a Teplizumab, que es otro fármaco inmunodepresor. La expresión de HPRT también puede suprimirse o reducirse según la invención para conferir resistencia a 6-tioguanina, un agente citostático comúnmente usado en quimioterapia especialmente para el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda. La expresión del gen “GLI1” puede reducirse.

Según un aspecto adicional de la invención, las células inmunitarias pueden manipularse adicionalmente para hacerlas más activas o limitar el agotamiento, inactivando genes que codifican para proteínas que actúan como “puntos de control inmunitarios” que actúan como reguladores de la activación de células T, tales como PDCD1 o CTLA-4. Los ejemplos de genes cuya expresión podía reducirse o suprimirse se indican en la tabla 9.

Tabla 9: Lista de genes que codifican para proteínas de punto de control inmunitario.

En una realización preferida, dicho método para modificar por ingeniería genética adicionalmente las células inmunitarias implica introducir en dichas células T polinucleótidos, en particular ARNm, que codifican para una endonucleasa específica de corte raro para inactivar selectivamente los genes, tales como aquellos mencionados anteriormente, mediante escisión de ADN. En una realización más preferida, dichas endonucleasas de corte raro son nucleasas TALE o endonucleasa Cas9. Las nucleasas TAL han demostrado hasta ahora una mayor especificidad y eficacia de escisión con respecto a los demás tipos de endonucleasas de corte raro, haciéndolas las endonucleasas de elección para la producción de las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética a gran escala con una renovación constante.

Métodos de administración

Los diferentes métodos descritos anteriormente implican introducir CAR en una célula. Como ejemplo no limitativo, dicho CAR puede introducirse como transgenes codificados por un vector plasmídico. Dicho vector plasmídico puede contener además un marcador de selección que contempla la identificación y/o selección de células que recibieron dicho vector.

Los polipéptidos pueden sintetizarse in situ en la célula como resultado de la introducción de polinucleótidos que codifican para dichos polipéptidos en la célula. Alternativamente, dichos polipéptidos podrían producirse fuera de la célula y luego introducirse a la misma. Se conocen en la técnica métodos para introducir un constructo de polinucleótido en células e incluyen, como ejemplos no limitativos, métodos de transformación estable en los que el constructo de polinucleótido se integra en el genoma de la célula, métodos de transformación transitoria en los que el constructo de polinucleótido no se integra en el genoma de la célula y métodos mediados por virus. Dichos polinucleótidos pueden introducirse en una célula mediante, por ejemplo, vectores virales recombinantes (por ejemplo, retrovirus, adenovirus), liposoma y similares. Por ejemplo, los métodos de transformación transitoria incluyen, por ejemplo, microinyección, electroporación o bombardeo de partículas. Dichos polinucleótidos pueden incluirse en vectores, más particularmente plásmidos o virus, en vista de expresarse en células.

Células inmunitarias modificadas por ingeniería genética

La presente invención también se refiere a células aisladas o líneas celulares susceptibles a obtenerse mediante dicho método para modificar por ingeniería genética las células. En particular, dicha célula aislada comprende al menos un CAR tal como se describió anteriormente. En otra realización, dicha célula aislada comprende una población de CAR comprendiendo cada una diferentes dominios de unión a ligando extracelulares. En particular, dicha célula aislada comprende una secuencia de polinucleótido exógena que codifica para CAR. Las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética de la presente invención se activan y proliferan independientemente de mecanismos de unión a antígeno.

En el alcance de la presente invención también se abarca una célula inmunitaria aislada, preferiblemente una célula T obtenida según uno cualquiera de los métodos descritos previamente. Dicha célula inmunitaria se refiere a una célula de origen hematopoyético implicada funcionalmente en la iniciación y/o ejecución de respuesta inmunitaria innata y/o adaptativa. Dicha célula inmunitaria según la presente invención puede derivarse de una célula madre. Las células madre pueden ser células madre adultas, células madre embrionarias no humanas, más particularmente células madre no humanas, células madre de sangre del cordón umbilical, células progenitoras, células madre de médula ósea, células madre pluripotentes inducidas, células madre totipotentes o células madre hematopoyéticas. Las células humanas representativas son células CD34+. Dicha célula aislada también puede ser una célula dendrítica, célula dendrítica citolítica, un mastocito, una célula NK, una célula B o una célula T seleccionada del grupo que consiste en linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T cooperadores. En otra realización, dicha célula puede derivarse del grupo que consiste en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Antes de la expansión y modificación genética de las células de la invención, puede obtenerse una fuente de células de un sujeto a través de una variedad de métodos no limitativos. Las células pueden obtenerse a partir de varias fuentes no limitativas, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglio linfático, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitos, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En determinadas realizaciones de la presente invención, puede usarse cualquier número de líneas de células T disponibles y conocidas por los expertos en la técnica. En otra realización, dicha célula puede derivarse de un donante sano, de un paciente diagnosticado con cáncer o de un paciente diagnosticado con una infección. En otra realización, dicha célula forma parte de una población mixta de células que presentan diferentes características fenotípicas. En el alcance de la presente invención también se abarca una línea celular obtenida de una célula T transformada según el método descrito previamente. Las células modificadas resistentes a un tratamiento inmunodepresor y susceptibles a obtenerse mediante el método previo se abarcan en el alcance de la presente invención.

Como una realización preferida, la presente invención proporciona células T o una población de células T dotadas con un CAR de CD33 tal como se describió anteriormente, que no expresan TCR funcional y que son reactivas hacia células positivas para CD33, para su alotrasplante en pacientes.

Como una realización incluso más preferida, la presente invención proporciona las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética según la invención que comprenden células T o una población de células T dotadas con un CAR de CD33, comprendiendo dicho CAR de CD33 una estructura polipeptídica seleccionada de V1 y V3, comprendiendo dicha estructura polipeptídica un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti-CD33 monoclonal, una bisagra seleccionada de una bisagra FcRIIIa y una bisagra CD8a, un dominio transmembrana CD8a y un dominio citoplásmico que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

En una realización, las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética según la invención comprenden un CAR de CD33 específico que comprende un anticuerpo anti-CD33 monoclonal seleccionado de M195, m2h12, DRB2 y My9.6, o de M195, m2h12, y My9.6, y opcionalmente humanizado.

En una realización más preferida, dicho CAR de CD33 comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68, o comprenden un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68.

Activación y expansión de células T

Ya sea antes o después de la modificación genética de las células T, incluso si las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética de la presente invención se activan y proliferan independientemente de mecanismos de unión a antígeno, las células inmunitarias, particularmente células T de la presente invención, en general pueden activarse y expandirse adicionalmente usando métodos tal como se describió, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; y publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 20060121005. Las células T pueden expandirse in vitro.

Generalmente, las células T de la invención se expanden por contacto con un agente que estimula un complejo de CD3 TCR y una molécula coestimuladora en la superficie de las células T para crear una señal de activación para la célula T. Por ejemplo, pueden usarse sustancias químicas tales como ionóforo de calcio A23187, forbol-12-miristato-13-acetato (^pM^a), o lectinas mitógenas como fitohemaglutinina (PHA) para crear una señal de activación para la célula T.

Como ejemplos no limitativos, las poblaciones de células T pueden estimularse in vitro tal como por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado sobre una superficie, o por contacto con un activador de proteína cinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesorio en la superficie de las células T, se usa un ligando que se une a la molécula accesorio. Por ejemplo, una población de células T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Las condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen unos medios apropiados (por ejemplo, medios esenciales mínimos o medios RPMI 1640 o X-vivo 5, (Lonza)) que pueden contener factores necesarios para proliferación y viabilidad, incluyendo suero (por ejemplo, suero fetal bovino o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-g , 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, -2, 1L-15, TGFp y TNF- o cualquier otro aditivo para el crecimiento de células conocido por el experto en la técnica. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, pero no se limitan a, tensioactivo, plasmanate y agentes reductores tales como N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanoi. Los medios pueden incluir RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, o bien libres de suero o bien complementados con una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocina(s) suficiente para el crecimiento y la expansión de células T. Los antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen sólo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que van a infundirse a un sujeto. Las células diana se mantienen en condiciones necesarias para soportar el crecimiento, por ejemplo, un temperatura (por ejemplo, 37°C) y atmósfera (por ejemplo, aire más el 5% de C02) apropiadas. Las células T que se han expuesto a tiempos de estimulación variados pueden presentar diferentes características

En otra realización particular, dichas células pueden expandirse mediante cocultivo con tejido o células. Dichas células también pueden expandirse in vivo, por ejemplo, en la sangre del sujeto después de administrar dicha célula al sujeto.

Aplicaciones terapéuticas

En otra realización, puede usarse una célula aislada obtenida mediante los diferentes métodos o una línea celular derivada de dicha célula aislada tal como se describió previamente como medicamento. En otra realización, dicho medicamento puede usarse para tratar cáncer, particularmente para el tratamiento de linfomas de células B y leucemia en un paciente que lo necesita. En otra realización, dicha célula aislada según la invención o línea celular derivada de dicha célula aislada puede usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en un paciente que lo necesita.

Dicho tratamiento puede ser de mejora, curativo o profiláctico. Puede ser o bien parte de una inmunoterapia autóloga o parte de un tratamiento de inmunoterapia alogénica. Por autóloga quiere decirse que las células, la línea celular o la población de células usadas para tratar pacientes se originan de dicho paciente o de un donante compatible de antígeno leucocitario humano (HLA). Por alogénica quiere decirse que las células o la población de células usadas para tratar pacientes no se originan de dicho paciente sino de un donante.

En una realización, una célula T que expresa CAR anti-CD33 según la invención se proporciona para su uso como medicamento.

En una realización particular, dicha célula T que expresa CAR anti-CD33 según la invención proporcionada para su uso como medicamento, comprende un polipéptido seleccionado de SEQ ID NO 19, SEQ ID N^o21, SEQ ID NO 27, y SEQ ID NO 37.

Incluso más preferiblemente, dicha célula T que expresa CAR anti-CD33 según la invención proporcionada para su uso como medicamento, comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68, o comprenden un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, Se Q ID NO: 56, s Eq ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68; cualquiera de estos CAR puede ser humanizado.

En una realización, una célula T que expresa CAR anti-CD33 según la invención proporcionada para su uso como medicamento, comprende un polipéptido de SEQ ID NO: 68 o un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 80% con un polipéptido de SEQ ID NO: 68, opcionalmente humanizado.

En otras palabras, la invención se refiere a una célula T que expresa CAR anti-CD33 según la invención, que comprende un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 80% con uno cualquiera del polipéptido seleccionado de SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68, opcionalmente humanizado para su uso como medicamento.

Las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética que pueden ser para su uso como medicamento. Preferiblemente, las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética pueden comprender células T primarias, en las que una expresión de CD33 en alterado, se altera una expresión de TCR, opcionalmente resistente a al menos un fármaco usado para tratar un cáncer hemático.

En general, dicho medicamento puede ser para su uso en el tratamiento de un estado patológico mediado por células que expresan CD33 o un estado caracterizado por la actividad directa o indirecta de una célula que expresa CD33, es decir, un estado ligado a la actividad perjudicial de células que expresan CD33.

Dicho medicamento puede ser para su uso en el tratamiento de pacientes diagnosticados en los que un estado de cáncer premaligno o maligno caracterizado por células T que expresan CD33, especialmente por una sobreabundancia de células T que expresan CD33. Tales estados se encuentran en cánceres hemáticos, tales como leucemia o trastornos linfoproliferativos malignos tales como trastornos linfoproliferativos de células B.

Otro ejemplo de estado patológico mediado por células que expresan CD33 o un estado caracterizado por la actividad directa o indirecta de una célula que expresa CD33 que puede tratarse con una célula T que expresa CAR anti-CD33 tal como se describió es la enfermedad de Alzheimer.

Un trastorno linfoproliferativo puede ser linfoma, en particular mieloma múltiple, linfoma no hodgkiniano, linfoma de Burkitt y linfoma folicular (célula pequeña y célula grande).

Puede tratarse una cualquiera de la enfermedad mediada por CD33 o que implica a CD33, en particular trastorno linfoproliferativo maligno o leucemia, y puede mejorarse el estado de salud del paciente que padece dicho estado patológico, con las células T que expresan CAR anti-CD33 de la presente invención.

En una realización preferida, el cáncer que puede tratarse usando las células T que expresan CAR anti-CD33 de la presente invención es leucemia, una enfermedad asociada con leucemia o una complicación de la misma, en particular LMA, un subtipo de LMA, complicación relacionada con LMA y estados relacionados con LMA.

Una leucemia que también puede prevenirse o tratarse usando las células T que expresan CAR anti-CD33 de la presente invención puede ser leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica, síndrome melodisplásico, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica y síndrome mielodisplásico.

La LMA o los subtipos LMA que pueden tratarse usando las células T que expresan CAR anti-CD33 de la presente invención pueden ser, en particular, leucemia mieloblástica aguda, leucemia mieloblástica aguda mínimamente diferenciada, leucemia mieloblástica aguda sin maduración, leucemia mieloblástica aguda con maduración granulocítica, leucemia promielocítica o promielocítica aguda (LPA), leucemia mielomonocítica aguda, mielomonocítica junto con eosinofilia de la médula ósea, leucemia monoblástica aguda (M5a) o leucemia monocítica aguda (M5b), leucemia eritroide aguda, incluyendo eritroleucemia (M6a) y leucemia eritroide pura muy rara (M6b), leucemia megacarioblástica aguda (M7), leucemia basofílica aguda, panmielosis aguda con mielofibrosis, si implican células positivas para CD33.

Los subtipos de LMA que pueden tratarse usando las células T que expresan CAR anti-CD33 de la presente invención también incluyen, LMA con t (8;21) (q22;q22), (LMA1/ETO), LMA con inv (16) (p13;q22) o t (16;16) (p13;q22), (CBFp/MYH11), LMA con t (15;17) (q22;q12), (PML/PARa) y variantes, LMA con t(9;11)(p22;q23), (MLLT3/MLL), LMA con t(6;9)(p23;q34) (DEK/NUP214), LMA con inv(3)(q21q26) o t(3;3)(q21;q26), (RPN1/EVI1), LMA con t(1;22)(p13;q13) (RBM15/MKL1) (megacariocítica), LMA con cambios relacionados con mielodisplasia incluyendo LMA que surge antes de MDS o MDS/MPN, LMA con una anomalía citogenética relacionada con MDS, y LMA con displasia de linaje múltiple, LMA relacionada con agente alquilante/radiación, LMA, mínimamente diferenciada (también conocida como LMA-M0), LMA sin maduración (también conocida como LMA-M1), LMA con maduración (también conocida como LMA-M2), leucemia mielomonocítica aguda (también conocida como LMA-M4), leucemia monocítica/monoblástica aguda (también conocida como LMA-M5), leucemia eritroide aguda (también conocida como LMA-M6) y leucemia eritroide pura.

Por consiguiente, la LMA clasificada como LMA con anomalías genéticas específicas son estados que pueden tratarse usando las células T que expresan CAR anti-CD33 de la presente invención. La clasificación se basa en la capacidad de los cariotipos de predecir una respuesta a terapia de inducción, riesgo de recaída, supervivencia. Por consiguiente, la LMA que puede tratarse usando las células T que expresan CAR anti-CD33 de la presente invención puede ser LMA con una translocación entre los cromosomas 8 y 21, LMA con una translocación o inversión en el cromosoma 16, LMA con una translocación entre los cromosomas 9 y 11, APL (M3) con una translocación entre los cromosomas 15 y 17, LMA con una translocación entre los cromosomas 6 y 9, LMA con una translocación o inversión en el cromosoma 3, LMA (megacarioblástica) con una translocación entre los cromosomas 1 y 22.

La presente invención es particularmente útil para el tratamiento de LMA asociada con estos marcadores citogenéticos particulares.

La presente invención también proporciona una célula T que expresa CAR anti-CD33 para su uso en el tratamiento de pacientes con subconjuntos citogenéticos específicos de LMA, tales como pacientes con t(15;17)(q22;q21) identificados usando ácido all-trans retinoico (ATRA) y para el tratamiento de pacientes con t(8;21)(q22;q22) o inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22) identificados usando dosis repetitivas de citarabina a altas dosis.

Preferiblemente, la presente invención proporciona una célula T que expresa CAR anti-CD33 para su uso en el tratamiento de pacientes con aberraciones, tales como -5/del(5q), -7, anomalías de 3q, o un cariotipo complejo, que han mostrado tener tasas de remisión completas y supervivencia inferiores.

Grupo de pacientes

En una realización preferida, la invención proporciona un medicamento para la leucemia, en particular para LMA, en pacientes mayores de 60 años, en pacientes menores de 20 años, en particular en niños.

En una realización más preferida, la presente invención proporciona un tratamiento pediátrico, en particular un tratamiento pediátrico contra LMA, o enfermedades o complicaciones relacionadas con LMA.

En todavía otra realización preferida, la presente invención se usa como tratamiento en pacientes con LMA con estado bajo, escaso o desfavorable, es decir, con una supervivencia predicha de menos de 5 años de tasa de supervivencia. En este grupo, los pacientes que padecen LMA con las siguientes características citogenéticas: -5; 5q; -7; 7q-;11q23; non t(9;11); inv(3); t(3;3); t(6;9); t(9;22) se asocia con estado de riesgo escaso (Byrd J.C. et al., 15 de diciembre de 2002; Blood: 100 (13) y se contempla especialmente que se trate según la presente invención o con un objeto de la presente invención.

En una realización, la célula T que expresa CAR anti-CD33 de la presente invención puede usarse como tratamiento en caso de recaída de LMA, o en caso de LMA resistente o que no responde al tratamiento. Preferiblemente, las células T que comprenden al menos un CAR anti-CD33 humanizado de la invención que comprende o consiste en SEQ ID NO. 1 y en un polipéptido seleccionado de un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 80% al 100% con SEQ ID NO 19, S^eQ ID NO 21, SEQ ID NO 27 y SEQ ID NO 37, o una combinación de las mismas, se usan en pacientes con recaída de LMA, o con LMA resistente o que no responde al tratamiento, más preferiblemente, en combinación con al menos otro antineoplásico.

En otra realización preferida, dicha al menos una célula T de CAR anti-CD33 de la invención, se usa para prevenir que se produzca el desarrollo de células cancerosas, en particular después de un tratamiento contra el cáncer, durante el agotamiento de la médula ósea o antes del trasplante de la médula ósea, después de la destrucción de la médula ósea.

Complicaciones de LMA

En una realización particular, la invención proporciona un medicamento que mejora el estado de salud de un paciente, en particular un paciente que experimenta una complicación relacionada con LMA. Más preferiblemente, dicha célula T que expresa CAR anti-CD33 modificada por ingeniería genética de la invención expresa al menos un CAR anti-CD33 que comprende una SEQ ID NO 1 y un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO 19, SEQ ID No 21, SEQ ID NO 27 y SEQ ID nO 37, o una combinación de las mismas, y es para su uso como medicamento para el tratamiento de una complicación relacionada con LMA.

En una realización particular, la invención proporciona un medicamento que mejora el estado de salud de un paciente que padece LMA, en particular un paciente que experimenta una complicación relacionada con LMA, comprendiendo dicho medicamento una célula T que expresa CAR anti-CD33 de la invención que comprende un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 80% con un polipéptido seleccionado de SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68.

Una complicación o enfermedad relacionada con LMA puede incluir una fase de mielodisplasia precedente, leucemia secundaria, en particular LMA secundaria, recuento elevado de glóbulos blancos y ausencia de bastones de Auer.

Entre otras, la leucostasis y la implicación del sistema nervioso central (SNC), la hiperleucocitosis, la enfermedad residual, también se consideran una complicación o enfermedad relacionada con LMA.

Enfermedades asociadas con LMA

En una realización, la presente invención también proporciona una célula T que expresa CAR anti-CD33 para su uso en el tratamiento de un estado patológico relacionado con LMA. Preferiblemente, la presente invención proporciona una célula que expresa al menos un CAR anti-CD33 que comprende un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 80% con un polipéptido seleccionado de SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, Se Q ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68 para su uso en el tratamiento de un estado patológico relacionado con LMA.

La presente invención proporciona un medicamento para neoplasias mielógenas relacionadas con LMA, para leucemia mielógena aguda y síndrome mielodisplásico, un tratamiento de leucemia mielógena aguda recidivante o resistente al tratamiento, un tratamiento de leucemia promielocítica aguda recidivante o resistente al tratamiento en adultos, un tratamiento para leucemia promielógena aguda, un tratamiento de leucemia mielógena aguda en adultos mayores de 60 años.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con LMA, en particular tumores malignos hemáticos relacionados con LMA.

Los estados de tumores malignos hemáticos relacionados con LMA incluyen síndromes de mielodisplasia (MDS, anteriormente conocido como “preleucemia”) que son una colección diversa de estados hemáticos unidos por producción ineficaz (o displasia) de células sanguíneas mieloides y riesgo de transformación en LMA.

En otra realización, la invención proporciona un medicamento según la invención que mejora el estado de salud de un paciente que padece mieloma múltiple.

Otros estados patológicos o síndromes genéticos asociados con el riesgo de LMA pueden mejorarse con el uso adecuado de la presente invención, dichos síndromes genéticos incluyen síndrome de Down, trisomía, anemia de Fanconi, síndrome de Bloom, ataxia-telangiectasia, anemia de Diamond-Blackfan, síndrome de Schwachman-Diamond, síndrome de Li-Fraumeni, Neurofibromatosis tipo 1, neutropenia congénita Grave (también denominada síndrome de Kostmann).

También se describe una célula T que expresa CAR anti-CD33 para su uso en el tratamiento de enfermedad de Alzheimer.

La presente invención proporciona células T que expresan CAR anti-CD33 para su uso en el tratamiento de pacientes diagnosticados con un estado de cáncer premaligno o maligno caracterizado por células que expresan CD33, especialmente por una sobreabundancia de células que expresan CD33. Tales estados se encuentran en cánceres hemáticos, tales como leucemia o trastornos linfoproliferativos malignos.

La leucemia puede ser leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, síndrome melodisplásico, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica y síndrome mielodisplásico.

El trastorno linfoproliferativo puede ser linfoma, en particular mieloma múltiple, linfoma no hodgkiniano, linfoma de Burkitt y linfoma folicular (célula pequeña y célula grande).

Los cánceres que pueden tratarse pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hemáticos, incluyendo, pero sin limitarse a, LLA pre-B (indicación pediátrica), LLA adulta, linfoma de células del manto, linfoma difuso de células B grandes y similares. Los tipos de cánceres que van a tratarse con los CAR de la invención incluyen, pero no se limitan, leucemia o tumores malignos linfocíticos. También se incluyen tumores/cánceres adultos y tumores/cánceres pediátricos.

El tratamiento con las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética según la invención puede ser en combinación con una o más terapias contra el cáncer seleccionada de terapia con anticuerpos, quimioterapia, terapia con citocinas, terapia con células dendríticas, terapia génica, terapia hormonal, terapia con luz láser y radioterapia.

Según una realización preferida de la invención, dicho tratamiento puede administrarse en pacientes que experimentan un tratamiento inmunodepresor. De hecho, la presente invención se basa preferiblemente en células o población de células, que se han hecho resistentes a al menos un agente inmunodepresor debido a la inactivación de un gen que codifica para un receptor para tal agente inmunodepresor. En este aspecto, el tratamiento inmunodepresor debería ayudar en la selección y expansión de las células T según la invención dentro del paciente. La administración de las células o la población de células según la presente invención puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, incluyendo mediante inhalación por aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un paciente por vía subcutánea, por vía intradérmica, por vía intratumoral, por vía intranodal, por vía intramedular, por vía intramuscular, mediante inyección intravenosa o intralinfática, o por vía intraperitoneal. En una realización, las composiciones celulares de la presente invención se administran preferiblemente mediante inyección intravenosa. La administración de las células o la población de células puede consistir en la administración de 104-109 células por kg de peso corporal, preferiblemente de 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores de números enteros de números celulares dentro de esos intervalos. Las células o la población de células pueden administrarse en una o más dosis. En otra realización, dicha cantidad eficaz de células se administra como dosis individual. En otra realización, dicha cantidad eficaz de células se administra como más de una dosis a lo largo de un periodo de tiempo. El momento de la administración está dentro del juicio del médico responsable y depende del estado clínico del paciente. Las células o la población de células pueden obtenerse de cualquier fuente, tal como un banco de sangre o un donante. Mientras que las necesidades individuales varían, la determinación de intervalos óptimos de cantidades eficaces de un tipo celular dado para una enfermedad o condiciones particulares dentro de la habilidad de la técnica. Una cantidad eficaz significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico. La dosificación administrada dependerá de la edad, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.

En otra realización, dicha cantidad eficaz de células o composición que comprende esas células se administra por vía parenteral. Dicha administración puede ser una administración intravenosa. Dicha administración puede realizarse directamente mediante inyección dentro de un tumor.

En determinadas realizaciones de la presente invención, se administran células a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, que incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con agentes tales como terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, citarabina (también conocida como ARA-C) o tratamiento con natalizimab para pacientes con EM o tratamiento con efaliztimab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con LMP. En realizaciones adicionales, las células T de la invención pueden usarse en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunodepresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micoplienólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Estos fármacos inhiben o bien la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o bien inhiben la cinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina) (Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993). En una realización adicional, las composiciones celulares de la presente invención se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) trasplante de médula ósea, terapia ablativa de células T usando o bien agentes quimioterápicos tales como fludarabina, radioterapia de haces externos (XRT), ciclofosfamida o bien anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En otra realización, las composiciones celulares de la presente invención se administran tras una terapia ablativa de células B tal como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, en una realización, los sujetos pueden someterse a un tratamiento convencional con dosis altas de quimioterapia seguida de trasplante de células madre de sangre periférica. En determinadas realizaciones, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas de la presente invención. En una realización adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

Otras definiciones

- A menos que se especifique lo contrario, “un”, “una”, “el/la” y “al menos uno” se usan de manera intercambiable y significan uno o más de uno. - Los residuos de aminoácido en una secuencia polipeptídica se designan en el presente documento según el código de una letra, en el que, por ejemplo, Q significa Gln o residuo Glutamina, R significa Arg o residuo Arginina y D significa Asp o residuo Ácido aspártico.

- Sustitución de aminoácido significa el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro, por ejemplo, el reemplazo de un residuo de Arginina por un residuo de Glutamina en una secuencia peptídica es una sustitución de aminoácido.

- Los nucleótidos se designan de la siguiente manera: se usa el código de una letra para designar la base de un nucleósido: a es adenina, t es timina, c es citosina y g es guanina. Para los nucleótidos degenerados, r representa g o a (nucleótidos de purina), k representa g o t, s representa g o c, w representa a o t, m representa a o c, y representa t o c (nucleótidos de pirimidina), d representa g, a o t, v representa g, a o c, b representa g, t o c, h representa a, t o c, y n representa g, a, t o c.

- “Tal como se usa en el presente documento, “ácido nucleico” o “polinucleótidos” se refiere a nucleótidos y/o polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquiera de ligación, escisión, acción de endonucleasa y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas de monómeros que son nucleótidos que se producen de manera natural (tales como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos que se producen de manera natural (por ejemplo, formas enantioméricas de nucleótidos que se producen de manera natural), o una combinación de ambas. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en restos de azúcar y/o en restos de base de pirimidina o purina. Las modificaciones de azúcar incluyen, por ejemplo, el reemplazo de uno o más grupos hidroxilo por halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o pueden funcionalizarse azúcares como éteres o ésteres. Además, todo el resto de azúcar puede reemplazarse por estructuras estérica y electrónicamente similares, tales como aza-azúcares y análogos de azúcar carbocíclicos. Los ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purines o pirimidinas aciladas, u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden ligarse mediante enlaces fosfodiéster o análogos de tales ligaciones. Los ácidos nucleicos pueden ser o bien monocatenarios o bien bicatenarios.

- Por receptor de antígeno quimérico (CAR) quiere decirse moléculas que combinan un dominio de unión contra un componente presente en la célula diana, por ejemplo una especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (por ejemplo, antígeno tumoral) con un dominio intracelular de activación del receptor de células T para generar una proteína quimérica que presenta una actividad inmunitaria celular anti-diana específica. Generalmente, el CAR consiste en un anticuerpo de cadena sencilla extracelular (scFvFc) fusionado al dominio de señalización intracelular de la cadena zeta del complejo de receptor de antígeno de células T (scFvFc:Q y tiene la capacidad, cuando se expresa en células T, de redirigir el reconocimiento de antígeno basándose en la especificidad del anticuerpo monoclonal.

- Por estructura V1 quiere decirse moléculas que combinan

- un péptido señal CD8alfa,

- un dominio VH separado de un dominio VL por un ligador, contribuyendo dicho VH y VL a la unión a CD33, - una Bisagra de Fcgamma (y) RIIIalfa (a)

- un dominio transmembrana derivado de CD8alfa(a)

- un dominio citoplásmico derivado de 41BB y CD3 zeta (Q

- Por estructura V2 quiere decirse moléculas con una estructura V1 y en la que el dominio transmembrana derivado de 41BB

Por estructura V3 quiere decirse moléculas que combinan

- un péptido señal CD8alfa,

- un dominio VH separado de un dominio VL por un ligador, contribuyendo dicho VH y VL a la unión a CD33, - una Bisagra de CD8alfa ( a)

- un dominio transmembrana derivado de CD8alfa(a)

- un dominio citoplásmico derivado de 41BB y CD3 zeta (Q

- Por estructura V4 quiere decirse moléculas con una estructura V3 y en las que el dominio transmembrana derivado de 41BB.

- Por V5 estructura quiere decirse moléculas que combinan

- un péptido señal CD8alfa,

- un dominio VH separado de un dominio VL por un ligador, contribuyendo dicho VH y VL a la unión a CD33, - una Bisagra de IgG1 (a)

- un dominio transmembrana derivado de CD8alfa(a)

- un dominio citoplásmico derivado de 41BB y CD3 zeta (Q.

- Por estructura V6 quiere decirse moléculas con una estructura V5 y en las que el dominio transmembrana derivado de 41BB.

Las estructuras de CAR tal como se describen se ilustran en la figura 2, preferiblemente en la figura 3.

El término “quimioterapia” se refiere a cualquier terapia que usa un producto químico, en particular los usados contra el cáncer. - El término “endonucleasa” se refiere a cualquier enzima de tipo natural o variante que puede catalizar la hidrólisis (escisión) de enlaces entre ácidos nucleicos dentro de una molécula de ADN o ARN, preferiblemente una molécula de ADN. Las endonucleasas no escinden la molécula de ADN o ARN aparte de su secuencia, pero reconocen y escinden la molécula de ADN o ARN en secuencias de polinucleótido específicas, denominadas además “secuencias diana” o “sitios diana”. Las endonucleasas pueden clasificarse como endonucleasas de corte raro cuando tienen normalmente un sitio de reconocimiento de polinucleótidos mayor de 12 pares de bases (pb) de longitud, más preferiblemente de 14-55 pb. Las endonucleasas de corte raro aumentan significativamente HR induciendo roturas de la doble cadena de ADN (DSB) en un locus definido (Perrin, Buckle et al. 1993; Rouet, Smih et al. 1994; Choulika, Perrin et al. 1995; Pingoud y Silva 2007). Las endonucleasas de corte raro pueden ser, por ejemplo, una endonucleasa de asentamiento (Paques y Duchateau 2007), una nucleasa quimérica de dedos de zinc (ZFN) que resulta de la fusión de dominios de dedos de zinc modificados por ingeniería genética con el dominio catalítico de una enzima de restricción tal como Fokl (Porteus y Carroll 2005), una endonucleasa Cas9 de sistema CRISPR (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chilinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013) o una endonucleasa química (Eisenschmidt, Lanio et al. 2005; Arimondo, Thomas et al. 2006). En las endonucleasas químicas, un agente de escisión químico o peptídico se conjuga o bien con un polímero de ácidos nucleicos o bien con otro ADN que reconoce una secuencia diana específica, dirigiendo de ese modo la actividad de escisión a una secuencia específica. Las endonucleasas químicas también abarcan nucleasas sintéticas como conjugados de ortofenantrolina, una molécula de escisión de ADN y oligonucleótidos formadores de tríplex (TFO), conocidos por unirse a secuencias de ADN específicas (Kalish y Glazer 2005). Tales endonucleasas químicas están comprendidas en el término “endonucleasa”.

- Por una “nucleasa TALE” (TALEN) quiere decirse una proteína de fusión que consiste en un dominio de unión a ácido nucleico derivado normalmente de un efector de tipo activador de la transcripción (TALE) y un dominio catalítico de nucleasa para escindir una secuencia diana de ácido nucleico. El dominio catalítico es preferiblemente un dominio de nucleasa y más preferiblemente un dominio que tiene actividad endonucleasa, como por ejemplo I-Tevl, ColE7, NucA y Fok-I. En una realización particular, el dominio TALE puede fusionarse con una meganucleasa como, por ejemplo, I-Crel y I-Onul o variante funcional de la misma. En una realización más preferida, dicha nucleasa es una nucleasa TALE monomérica. Una nucleasa TALE monomérica es una nucleasa TALE que no requiere dimerización para reconocimiento y escisión específicos, tal como las fusiones de repeticiones TAL modificadas por ingeniería genética con el dominio catalítico de I-Tevl descrito en el documento WO2012138927. El efector de tipo activador de la transcripción (TALE) son proteínas de la especie bacteriana Xanthomonas que comprenden una pluralidad de secuencias repetidas, comprendiendo cada repetición di-residuos en la posición 12 y 13 (RVD) que son específicos para cada base de nucleótido de la secuencia dirigida a ácido nucleico. También pueden derivarse dominios de unión con propiedades similares de unión a ácido nucleico base por base modulares (MBBBD) de nuevas proteínas modulares descubiertas recientemente por el solicitante en una especie bacteriana diferente. Las nuevas proteínas modulares tienen la ventaja de presentar más variabilidad de secuencia que las repeticiones de TAL. Preferiblemente, los RVD asociados con el reconocimiento de los diferentes nucleótidos son h D para reconocer C, NG para reconocer T, NI para reconocer A, NN para reconocer G o A, NS para reconocer A, C, G o T, HG para reconocer T, IG para reconocer T, NK para reconocer G, HA para reconocer C, ND para reconocer C, HI para reconocer C, HN para reconocer G, NA para reconocer G, SN para reconocer G o A y YG para reconocer T, TL para reconocer A, VT para reconocer A o G y SW para reconocer A. En otra realización, los aminoácidos críticos 12 y 13 pueden mutarse hacia otros residuos de aminoácido con el fin de modular su especificidad hacia los nucleótidos A, T, C y G y, en particular, para potenciar su especificidad. La nucleasa TALE ya se han descrito y usado para estimular el direccionamiento génico y las modificaciones génicas (Boch, Scholze et al.

2009; Moscou y Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al. 2011). Las nucleasas TAL modificadas por ingeniería genética están disponibles comercialmente con el nombre comercial TALEN™ (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 París, Francia).

La endonucleasa de corte raro también puede ser una endonucleasa Cas9. Recientemente, se ha desarrollado una nueva herramienta de modificación por ingeniería genética del genoma basándose en la nucleasa Cas9 guiada por ARN (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chilinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013) del sistema inmunitario adaptativo procariota CRISPR de tipo II (repeticiones palindrómicas agrupadas cortas y regularmente interespaciadas (véase para revisión (Sorek, Lawrence et al. 2013)). El sistema asociado a CRISPR (Cas) se descubrió en primer lugar en bacterias y actúa como defensa frente a ADN foráneo, o bien viral o bien plásmido. La modificación por ingeniería genética del genoma mediada por CRISPR procede en primer lugar mediante la selección de una secuencia diana a menudo flanqueada por un motivo de secuencia corto, denominado motivo adyacente al protoespaciador (PAM). Tras la selección de la secuencia diana, se crea por ingeniería genética un ARNcr específico, complementario a esta secuencia diana. El ARNcr transactivador (ARNtracr) requerido en los sistemas CRISPR de tipo II se aparea al ARNcr y se une a la proteína Cas9 proporcionada. Cas9 actúa como anclaje molecular facilitando el apareamiento de bases de ARNtracr con ARNc (Deltcheva, Chilinski et al. 2011). En este complejo ternario, la estructura dual ARNtracr:ARNcr actúa como ARN guía que dirige la endonucleasa Cas9 a la secuencia diana relacionada. El reconocimiento de la diana mediante el complejo Cas9-ARNtracr:ARNcr se inicia examinando la secuencia diana para determinar la homología entre la secuencia diana y el ARNcr. Además de la complementariedad de la secuencia diana-ARNcr, el direccionamiento de ADN requiere la presencia de un motivo corto adyacente al protoespaciador (motivo adyacente al protoespaciador - PAM). Tras el apareamiento entre el ARN dual y la secuencia diana, Cas9 introduce posteriormente una rotura de doble cadena roma de 3 bases en el sentido de 5' del motivo PAM (Garneau, Dupuis et al. 2010).

La endonucleasa de corte raro puede ser una endonucleasa de asentamiento, también conocida con el nombre de meganucleasa. Tales endonucleasas de asentamiento se conocen bien en la técnica (Stoddard 2005). Las endonucleasas de asentamiento reconocen una secuencia diana de ADN y generan una rotura de una sola o doble hebra. Las endonucleasas de asentamiento son altamente específicas, reconociendo sitios diana de ADN que oscilan entre 12 y 45 pares de bases (pb) de longitud, que oscilan habitualmente entre 14 y 40 pb de longitud. La endonucleasa de asentamiento puede, por ejemplo, corresponderse a una endonucleasa LAGLIDADG, a una endonucleasa HNH o a una endonucleasa GIY-YIG. La endonucleasa de asentamiento preferida puede ser una variante I-Crel.

- Por “ vector de administración” o “vectores de administración” quiere decirse cualquier vector de administración que puede usarse en la presente invención para poner en contacto con células (es decir, “contactar”) o administrar dentro de las células o compartimentos subcelulares (es decir, “introducir”) agentes/sustancias químicas y moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) necesarios en la presente invención. Incluye, pero no se limita a vectores de administración liposómica, vectores de administración viral, vectores de administración de fármacos, portadores químicos, portadores poliméricos, lipoplejos, poliplejos, dendrímeros, microburbujas (agentes de contraste de ultrasonido), nanopartículas, emulsiones u otros vectores de transferencia apropiados. Estos vectores de administración permiten la administración de moléculas, sustancias químicas, macromoléculas (genes, proteínas), u otros vectores tales como plásmidos, péptidos desarrollados por Diatos. En estos casos, los vectores de administración son portadores de moléculas. Por “vector de administración” o “vectores de administración” también se entiende métodos de administración para realizar la transfección.

- Los términos “vector” o “vectores” se refieren a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado. Un “vector” en la presente descripción incluye, pero no se limita a, un vector viral, un plásmido, un vector de ARN o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede consiste en un ácidos nucleicos cromosómicos, no cromosómicos, semisintéticos o sintéticos. Los vectores preferidos son aquellos que pueden realizar replicación autónoma (vector episómico) y/o expresión de los ácidos nucleicos a los que se ligan (vectores de expresión). Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores adecuados y están disponibles comercialmente.

Los vectores virales incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo, virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa tales como ortomixovirus (por ejemplo, virus de la gripe), rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia y de la estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo, sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN bicatenario incluyendo adenovirus, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar y viruela del canario). Otros virus incluyen virus de Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Los ejemplos de retrovirus incluyen: leucosis-sarcoma aviar, virus de tipo B, de tipo C de mamífero, , virus de tipo D, grupo HTLV-BLV, lentivirus, spumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, en Fundamental Virology, tercera edición, B. N. Campos, et al., eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).

- Por “vector lentiviral” quiere decirse vectores lentivirales basados en VIH que son muy prometedores para la administración génica debido a su capacidad de empaquetamiento relativamente grande, inmunogenicidad reducida y su capacidad para transducir de manera estable con elevada eficacia una gran variedad de diferentes tipos celulares. Los vectores lentivirales se generan habitualmente tras transfección transitoria de tres (empaquetamiento, envuelta y transferencia) o más plásmidos en células productoras. Como el VIH, los vectores lentivirales entran en la célula diana a través de la interacción de glicoproteínas de la superficie viral con receptores en la superficie celular. Al entrar, el ARN viral experimenta transcripción inversa, que está mediada por el complejo de transcriptasa inversa viral. El producto de la transcripción inversa es un ADN viral lineal bicatenario, que es el sustrato para la integración viral en el ADN de células infectadas. Por “vectores lentivirales integradores (o LV)” quiere decirse tales vectores como ejemplo no limitativo, que pueden integrar el genoma de una célula diana. Por el contrario, por “vectores lentivirales no integradores (o NILV)” quiere decirse vectores de inserción de genes eficaces que no integran el genoma de una célula diana a través de la acción de la integrasa del virus.

- Los vectores de administración y los vectores pueden asociarse o combinarse con cualquier técnica de permeabilización celular tal como sonoporación o electroporación o derivados de estas técnicas.

- Por célula o células se entiende cualquier célula viva eucariota, célula primaria y línea celular derivada de estos organismos para cultivos in vitro.

- Por “célula primaria” o “células primarias” se entienden células tomadas directamente de tejido vivo (es decir, material de biopsia) y establecidas para crecimiento in vitro, que han experimentado muy pocas duplicaciones de población y son, por tanto, más representativas de los principales componentes funcionales y características de tejidos de los que se derivan, en comparación con líneas celulares oncógenas continuas, o inmortalizadas artificialmente.

Como ejemplos no limitativos, pueden seleccionarse líneas celulares del grupo que consiste en células CHO-K1; células HEK293; células Caco2; células U2-OS; células NIH 3T3; células NSO; células SP2; células CHO-S; células DG44; células K-562, células U-937; células MRC5; células IMR90; células Jurkat; células HepG2; células HeLa; células HT-1080; células HCT-116; células Hu-h7; células Huvec; células Molt 4.

Todas estas líneas celulares pueden modificarse mediante el método de la presente invención para proporcionar modelos de líneas celulares para producir, expresar, cuantificar, detectar, estudiar un gen o una proteína de interés; estos modelos también pueden usarse para examinar moléculas de interés biológicamente activas en investigación y producción y diversos campos tales como productos químicos, biocombustibles, productos terapéuticos y agronomía como ejemplos no limitativos.

- por “mutación” se entiende la sustitución, deleción, inserción de hasta uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta, o más nucleótidos/aminoácidos en un polinucleótido (ADNc, gen) o una secuencia polipeptídica. La mutación puede afectar a la secuencia de codificación de un gen o su secuencia reguladora. También puede afectar a la estructura de la secuencia genómica o la estructura/estabilidad del ARNm codificado.

- por “variante(s)”, se entiende una variante de repetición, una variante, una variante de unión a ADN, una variante de nucleasa TALE, una variante de polipéptido obtenida mediante mutación o reemplazo de al menos un residuo en la secuencia de aminoácidos de la molécula original.

- por “variante funcional” se entiende un mutante catalíticamente activo de una proteína o un dominio de proteína; dicho mutante puede tener la misma actividad en comparación con su proteína o dominio de proteína o propiedades adicionales originales, o actividad más alta o más baja.

- “identidad” se refiere a la identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico o polipéptidos. La identidad puede determinarse comparando una posición en cada secuencia que puede alinearse para fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similitud o identidad entre las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos es una función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes en las posiciones compartidas por las secuencias de ácido nucleico. Pueden usarse diversos algoritmos y/o programas de alineación para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST, que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencia GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wisconsin), y pueden usarse con, por ejemplo, la configuración predeterminada. Por ejemplo, se contemplan polipéptidos que tienen una identidad de al menos el 70%, el 85%, el 90%, el 95%, el 98% o el 99% con polipéptidos específicos descritos en el presente documento y que presentan sustancialmente las mismas funciones, así como polinucleótido que codifica para dichos polipéptidos. A menos que se indique lo contrario, una puntuación de similitud se basará en el uso de BLOSUM62. Cuando se usa BLASTP, el porcentaje de similitud se basa en la puntuación positiva de BLASTP y el porcentaje de identidad de secuencia se basa en la puntuación de identidad de BLASTP. Las “identidades” de BLASTP muestra el número y la fracción de residuos totales en los pares de secuencia de alta puntuación que son idénticos; y los “positivos” de BLASTP muestra el número y la fracción de residuos para los que las puntuaciones de alineación tienen valores positivos y que son similares entre sí. Las secuencias de aminoácidos que tienen estos grados de identidad o similitud o cualquier grado intermedio de identidad de similitud con las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento se contemplan y abarcan en esta descripción. Las secuencias de polinucleótido de polipéptidos similares se deducen usando el código genético y pueden obtenerse por medios convencionales, en particular mediante traducción inversa de su secuencia de aminoácidos usando el código genético.

- “dominio de transducción de señales” o “ligando coestimulador” se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígeno que se une específicamente a una molécula coestimuladora relacionada en una célula T, proporcionando de ese modo una señal que, además de la señal primaria proporcionada por, por ejemplo, la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula de CMH cargada con péptido, media una respuesta de células T, incluyendo, pero sin limitarse a, activación de la proliferación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, pero no se limita a, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une al receptor de ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en una célula T, tal como, pero sin limitarse a, CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado con la función de linfocito (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83.

Una “molécula coestimuladora” se refiere a la pareja de unión relacionada en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando de ese modo una respuesta coestimuladora por la célula, tal como, pero sin limitarse a, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a, una molécula de CMH de clase I, BTL^ay receptor de ligando Toll.

Una “señal coestimuladora” tal como se usa en el presente documento se refiere a una señal, que en combinación con la señal primaria, tal como ligación de TCR/CD3, conduce a proliferación de células T y/o regulación por incremento o regulación por disminución de moléculas clave.

El término “dominio de unión a ligando extracelular” tal como se usa en el presente documento se define como un oligo o polipéptido que puede unirse al ligando. Preferiblemente, el dominio podrá interactuar con una molécula de la superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión a ligando extracelular puede elegirse para reconocer un ligando que actúa como marcador de la superficie celular en células diana asociadas con un estado patológico particular. Por tanto, los ejemplos de marcadores de la superficie celular que pueden actuar como ligandos incluyen aquellos asociados con infecciones virales, bacterianas y parasitarias, enfermedad autoinmunitaria y células cancerosas. El término “sujeto” o “paciente” tal como se usa en el presente documento incluye todos los miembros del reino animal incluyendo primates no humanos y seres humanos.

Los términos “fármaco usado para tratar un cáncer, en particular LMA” se refiere a un medicamento usado para el tratamiento de cáncer, en particular LMA, y se describen, por ejemplo, en el documento WO2015/140268.

La descripción escrita anterior de la invención proporciona una manera y un procedimiento de elaborarla y usarla de modo que cualquier experto en esta técnica sea capaz de elaborar y usar la misma, proporcionándose esta habilitación en particular para el objeto de las reivindicaciones adjuntas, que constituyen una parte de la descripción original.

Cuando se establece en el presente documento un intervalo o límite numérico, se incluyen los extremos. Además, todos los valores y subintervalos dentro de un intervalo o límite numérico están incluidos específicamente como si estuvieran explícitamente escritos.

Métodos generales:

Inactivación de gen(es) específico(s) en células T primarias

La inactivación de gen(es) específico(s) en células T primarias puede realizarse antes o después de la introducción de CAR en células T.

Al menos un gen, un gen o dos genes pueden inactivarse en una etapa o en etapas sucesivas. En una realización preferida, dos genes pueden inactivarse de una vez, preferiblemente el gen TCRalfa y el gen CD33.

En general, se diseña y produce nucleasa heterodimérica, en particular nucleasa TALE que selecciona como diana dos secuencias largas (denominadas semidianas) separadas por un espaciador dentro de un gen diana.

Cada constructo de nucleasa TALE puede clonarse en un vector de expresión de mamífero apropiado. Puede sintetizarse ARNm que codifica para nucleasa TALE escindiendo una secuencia genómica seleccionada como diana a partir de un plásmido que porta la secuencia de codificación en el sentido de 3' de un promotor.

Las células son células T purificadas preactivadas con perlas recubiertas con anti-CD3/CD28. Las células se transfectan con cada uno de los 2 ARNm que codifican para ambas seminucleasas TALE, en particular tanto las seminucleasas TALE como el espaciador.

Las células pueden reactivarse con anti-CD28 soluble para medir la proliferación celular y el marcador de activación CD25 detectado para evaluar el estado de activación de las células.

Receptores de antígeno quimérico

Ácidos nucleicos- vectores

Un nucleico ácido (ARNm o vector lentiviral) que codifica para un CAR anti-CD33 tal como se describe, se construye según la arquitectura diseñada en la figura 2 o la figura 3.

Pueden prepararse vectores lentivirales de CAR anti-CD33, por ejemplo, tal como se describió previamente en los documentos WO2013176915, WO2013176916, o en el documentoWO2014130635. Los vectores lentivirales son producidos por Vectalys SA (Toulouse, Francia).

Los ARNm de CAR pueden producirse usando ARNm polimerasa de T7 y realizarse transfecciones usando tecnología Cytopulse.

Examen y selección de CAR anti-CD33

- Cultivos de células T primarias

Las células T se purifican a partir de muestras con capas leucocitarias proporcionadas por EFS (Etablissement Frangais du Sang, París, Francia) usando medio de densidad en gradiente Ficoll. La fase de PBMC se recupera y se purifican células T usando un kit de enriquecimiento de células T disponible comercialmente. Se activan células T purificadas en medio X-Vivo™-15 (Lonza) usando IL-2 humana y activador T humano de CD3/CD28 Dynabeads. Transfección de ARNm de CAR

Se realizan transfecciones de ARNm de CAR que codifican para los diferentes constructos de CAR en el día 4 o el día 11 después de la purificación y activación de células T.

La transducción de células T con vectores lentivirales recombinantes que permiten la expresión de la transducción de CAR de células T con vectores lentivirales recombinantes se lleva a cabo tres días después de la purificación/activación de células T. Los vectores lentivirales son producidos por Vectalys SA (Toulouse, Francia), mediante la transfección de plásmidos genómicos y cooperadores en células HEK-293. Las transducciones pueden llevarse a cabo en diversas multiplicidades de infección (MOI), en particular a una MOI de 5. La detección de CAR en la superficie de las células T se realiza usando una proteína recombinante que consiste en el dominio extracelular de la proteína CD33 humana fusionada con un fragmento Fc de IgG1 murina (producido por LakePharma).

La unión de esta proteína a la molécula de CAR se detecta con un anticuerpo secundario conjugado con PE (Jackson Immunoresearch) que selecciona como diana la porción Fc de ratón de la proteína, y

- Ensayo de desgranulación (movilización de CD107a)

Las células T se incuban junto con una cantidad igual de células que expresan diversos niveles de la proteína CD33. Se mantienen los cocultivos durante al menos 6 horas. Se realiza tinción de CD107a durante la estimulación celular, mediante la adición de un anticuerpo anti-CD107a fluorescente al comienzo del cocultivo. Después del periodo de incubación de 6 h, se tiñen las células con un tinte de viabilidad fijable y anti-CD8 conjugado con fluorocromo y se analizan mediante citometría de flujo. La actividad de desgranulación se determina como el % de células CD8+/CD107a+, y determinando la señal de intensidad de fluorescencia media (IFM) para la tinción de CD107a entre células CD8+.

Los ensayos de desgranulación se llevan a cabo 24 h después de la transfección de ARNm.

- Ensayo de liberación de IFN gamma

24 h después de la transfección de ARNm, se incuban células T que expresan CAR anti-CD33 junto con líneas celulares que expresan diversos niveles de la proteína CD33 durante 24 horas a 37°C. Los sobrenadantes se recuperan y la detección de IFN gamma en los sobrenadantes de cultivo celular se realiza mediante ensayo ELISA. - Ensayo de citotoxicidad

Se incuba CAR de CD33 que expresa células T junto con células diana (que expresan diversos niveles de CD33) o células (CD33neg) en el mismo pocillo. Las células diana CD33+ diana y CD33 de control se marcan con tintes intracelulares fluorescentes (por ejemplo, CFSE o Cell Trace Violet), antes del cocultivo con durante 4 horas a 37°C. Después de este periodo de incubación, las células se marcan con un tinte de viabilidad fijable y se analizan mediante citometría de flujo. Se determina la viabilidad de cada población celular (células diana o células de control CD33neg) y se calcula el % de lisis de células específicas. Se llevan a cabo ensayos de citotoxicidad 48 h después de la transfección de ARNm.

- Modelo de ratón antitumoral

A ratones NOG inmunodeficientes se les inyecta por vía intravenosa (i.v.) células de luciferasa que expresan CD33. Opcionalmente, los ratones reciben un tratamiento contra el cáncer antes de la inyección con células T CAR+ anti-CD33. A continuación, a los ratones se les inyecta por vía i.v. (por ejemplo, o bien 2 o bien 7 días después de la inyección de la línea de células tumorales) con diferentes dosis de células T CAR+ anti-CD33 que van a someterse a prueba, o con células T que no se transdujeron con el vector lentiviral de CAR. Las señales bioluminiscentes se determinan en el día de inyección de células T (D0), en el D7, 14, 21, 28 y 40 después de la inyección de células T con el fin de seguir la evolución tumoral en los diferentes animales.

Habiendo descrito en general esta invención, puede obtenerse una comprensión adicional mediante referencia a determinados ejemplos específicos, que se proporcionan en el presente documento con fines de ilustración únicamente, y no se pretende que sean limitativos a menos que se especifique lo contrario.

Ejemplos

Construcción de CAR de CD33 usando diversos fragmentos de anticuerpo anti-CD33

Se diseñaron diferentes arquitecturas de CAR (figura 3), concretamente de V1 a V6. Como primera etapa, se construyeron 4 scFv diferentes a partir de anticuerpo M195, DRB2, m2H12 y My9.6 para generar receptores de antígeno quimérico (CAR) (SEQ ID NO 48 a SEQ ID NO 71) en células T.

Ejemplo 1: Proliferación de células inactivadas con TCRalfa que expresan un CAR de CD33.

- Cultivos de células T primarias

Se purificaron células T de diversas muestras con capas leucocitarias proporcionadas por EFS (Etablissement Frangais du Sang, París, Francia) usando medio de densidad en gradiente Ficoll. Se recuperó la fase de PBMC y se purificaron células T usando un kit de enriquecimiento de células T disponible comercialmente (Stem Cell Technologies). Se inactivaron las células T purificadas en medio X-Vivo™-15 (Lonza) complementado con IL-2 humana 20 ng/ml, suero humano al 5% y activador T humano de CD3/CD28 Dynabeads a una razón perla:célula 1:1 (Life Technologies). Después de la activación, las células se hicieron crecer y se mantuvieron en Medio X-Vivo™-15 (Lonza) complementado con IL-2 humana 20 ng/ml y suero humano al 5%.

- Transfección de ARNm de CAR

Se realizaron transfecciones de cada CAR de CD33 generado usando diversos fragmentos de anticuerpo anti-CD33 en el día 4 o día 11 después de la purificación y activación de células T. Se transfectaron 5 millones de células con 15 ig de ARNm que codifica para los diferentes constructos de CAR. Se produjeron ARNm de CAR usando el kit mMESSAGE mMACHINE T7 (Life Technologies) y se purificaron usando columnas RNeasy Mini Spin (Qiagen). Se realizaron transfecciones usando tecnología Cytopulse, aplicando dos pulsos de 0,1 mS a 3000V/cm seguidos por cuatro pulsos de 0,2 mS a 325V/cm en cubetas de espacio de 0,4 cm en un volumen final de 200 | l de “tampón Cytoporation T” (aparato BTX Harvard). Se diluyeron las células inmediatamente en medios X-Vivo™-15 (Lonza) y se incubaron a 37°C con el 5% de CO2. Se añadió IL-22 h después de la electroporación a 20 ng/ml.

Transducción de células T primarias

- Transducción de células T

Se llevó a cabo transducción de células T con expresión de vectores lentivirales recombinantes el CAR antiCD33 tres días después de la purificación/activación de células T. Se utilizaron vectores lentivirales producidos por Vectalys SA (Toulouse, Francia). La detección de CAR anti-CD33 en la superficie de las células T se realiza usando una proteína recombinante que consiste en el dominio extracelular de la proteína CD33 humana fusionada junto con un fragmento Fc de IgG1 murina (producido por LakePharma). La unión de esta proteína a la molécula CAR anti-CD33 se detecta con un anticuerpo secundario conjugado con PE (Jackson Immunoresearch) dirigido a la porción Fc de ratón de la proteína, y se analiza por citometría de flujo.

Se diseñó y produjo la nucleasa TALE heterodimérica que selecciona como diana dos secuencias de 17 pb de longitud (denominadas semidianas) separadas por un espaciador de 15 pb dentro del gen de la región de cadena constante del receptor alfa de células T (TRAC). Cada semidiana se reconoce por las repeticiones de las seminucleasas TALE enumeradas en la tabla 10.

Tabla 10: Nucleasas TAL que seleccionan como diana el gen TCRalpha

Se subclonó cada constructo de nucleasa TALE usando digestión con enzimas de restricción en un vector de expresión de mamífero bajo el control del promotor T7. El ARNm que codifica para la secuencia genómica TRAC de escisión de nucleasa TALE se sintetizó a partir del plásmido que portaba la secuencia codificante en el sentido de 3’ del promotor T7.

Las células T purificadas preactivadas durante 72 horas con microesferas recubiertas con anti-CD3/CD28 se transfectaron con cada uno de los 2 ARNm que codifican para las dos seminucleasas TAC TRAC_T01. 48 horas después de la transfección, diferentes grupos de células T del mismo donante se transdujeron respectivamente con un vector lentiviral que codifica para uno del CAR de CD33 descrito anteriormente (SeQ ID NO: 19 a 42). 2 días después de la transducción, se purificaron las células CD3^negusando perlas magnéticas anti-CD3 y 5 días después de la transducción, las células se reactivaron con anti-CD28 soluble (5 ig/ml).

Se siguió la proliferación celular hasta 30 días después de la reactivación contando las células 2 veces por semana. Se observó una proliferación aumentada en células inactivadas con TCR alfa que expresan los CAR de CD33, especialmente cuando se reactivan con anti-CD28, en comparación con las células no transducidas.

Para investigar si las células T humanas que expresan el CAR de CD33 presentan estado activado, la expresión del marcador de activación CD25 se analizan mediante FACS 7 días después de la transducción. Las células purificadas transducidas con el vector lentiviral que codifica para el CAR de CD33 evaluadas para la expresión de CD25 en su superficie con el fin de evaluar su activación en comparación con las células no transducidas. Se espera una expresión de CD25 aumentada tanto en la reactivación de CD28 como en condiciones de no reactivación.

La presente invención proporcionó una célula T de CAR específica de CD33 en la que el nivel de TCR en la superficie celular estaba por debajo de lo detectado.

Ejemplo 2:

Inactivación del gen CD33

Para inactivar el gen CD33, se diseñaron y produjeron nucleasa TALE heterodimérica que selecciona como diana dos secuencias (denominada secuencia unida por TALEN izquierda y secuencia unida por TALEN derecha, véase la tabla 11) separada por un espaciador de 10 ó 15 pb dentro del gen CD33 tal como se describe a continuación. Cada semidiana se reconoce mediante repeticiones de las seminucleasas TALE enumeradas en la tabla 11. A continuación, se introdujeron los constructos en células T junto con y al mismo tiempo que aquellas diseñadas para inactivar el gen TCR alfa.

Tabla 11: Nucleasas TAL que seleccionan como diana el gen TCRalfa

En las células resultantes, el dominio extracelular de CD33 está truncado. La doble tinción de las células resultantes y el análisis por citometría de flujo indicaron una caída en la expresión de la superficie celular de CD33 y de TCR en comparación con las células de control (transfectadas de forma simulada).

Alternativamente, pueden usarse células T de TCR KO purificadas preactivadas durante 72 horas con perlas recubiertas con anti-CD3/CD28 para la inactivación de CD33.

Para investigar el estado activado de las células T de TCR KO y de CD33 KO humanas que expresan el CAR de CD33, la expresión del marcador de activación CD25 se analiza mediante FACS 7 días después de la transducción. Pueden producirse células T de CAR anti-CD33 y células T de CAR anti-CD33 en las que el gen TCR alfa y/o el gen CD33 están inactivos y en el que el CAR corresponde a las arquitecturas V1, V3 y V5.

Las células se designan “células T” o “CAR de CD33”, por conveniencia.

Ejemplo 3

Actividad de desgranulación de CAR de CD33 generado usando diversos fragmentos de anticuerpo anti-CD33 La actividad de los constructos V1, V3 y V5 de M195, m2H12 y My9.6 tal como se describió anteriormente se determinó en primer lugar tras expresión transitoria en células T primarias humanas.

- Ensayo de desgranulación (movilización de CD107a)

A continuación, se incubaron células T en placas de 96 pocillos (40.000 células/pocillo), junto con una cantidad igual de células que expresan diversos niveles de la proteína CD33. Los cocultivos se mantuvieron en un volumen final de 100 |il de medio X-Vivo™-15 (Lonza) durante 6 horas a 37°C con el 5% de CO2. La tinción de CD107a se realizó durante la estimulación celular, mediante la adición de un anticuerpo fluorescente anti-CD107a al comienzo del cocultivo, junto con 1 |ig/ml de anti-CD49d, 1 |ig/ml de anti-CD28 y 1x disolución de Monensina. Después del periodo de incubación de 6 h, las células se tiñeron con un tinte de viabilidad fijable y anti-CD8 conjugado con fluorocromo y se analizaron por citometría de flujo. La actividad de desgranulación se determinó como el % de células CD8+/CD107a+, y determinando la señal de intensidad de fluorescencia media (IFM) para la tinción de CD107a entre las células CD8+. Los ensayos de desgranulación se llevaron a cabo 24 h después de la transfección de ARNm.

Entre las moléculas de CAR generadas tal como se ilustra en la figura 3, se sometieron a prueba 9 para determinar su actividad de desgranulación (figura 4 a figura 6) y 7 de ellas se seleccionaron para pruebas de actividad adicionales: liberación de interferón gamma y lisis celular (figura 7 y figura 8).

Se midió la actividad de desgranulación de cada uno del CAR que comprende un scFv de M195, m2H12 o My9.6 dentro de una de las tres arquitecturas (v1: FcgRIII-bisagra/CD8-transmembrana, v3: CD8-bisagra/CD8-transmembrana, o v5: IgG1-bisagra/CD8- transmembrana), cuando se cultivaron conjuntamente células T CAR+ durante 6 horas con células que expresan CD33 (U937), o con células que expresan nivel indetectable CD33 (Jeko o Jeko-1). Los resultados se ilustran en la figura 4 a la figura 6.

La figura 4 muestra la actividad de desgranulación (% de células CD8/CD107a+ e IFM de CD107a en células CD8+) del scFv M195 con las tres arquitecturas (v1: FcgRIII-bisagra/CD8-transmembrana, v3: CD8-bisagra/CD8-transmembrana, v5: IgG1-bisagra/CD8-transmembrana), cuando se cultivaron conjuntamente células T CAR+ durante 6 horas con células que expresan CD33 (U937), o con células que no expresan CD33 (Jeko). Los datos se presentan como porcentaje (%) de desgranulación y actividad de fluorescencia media (IFM).

La figura 5 muestra la actividad de desgranulación (% de células CD8/CD107a+ e IFM de CD107a en células CD8+) de los scFV m2H12 y My9.6 con las tres arquitecturas (v1: FcgRIII-bisagra/CD8-transmembrana, v3: CD8-bisagra/CD8-transmembrana, v5: IgG1-bisagra/CD8-transmembrana), cuando se cultivaron conjuntamente células T CAR+ durante 6 horas con células que expresan CD33 (U937), o con células que no expresan CD33 (Jeko). Los datos se presentan como porcentaje (%) de desgranulación y actividad de fluorescencia media (IFM).

La figura 6 muestra la actividad de desgranulación (% de células CD8/CD107a+) de 7 construcciones : M195-V1, M195-V3, M195- V5, m2H12-V1, m2H12-V3 y My9.6-V1 y My9.6-V3 (v1: FcgRIII-bisagra/CD8-transmembrana, v3: CD8-bisagra/CD8-transmembrana, v5: IgG1-bisagra/CD8-transmembrana), cuando se cultivaron conjuntamente células T CAR+ durante 6 horas con células que expresan niveles altos o intermedios de CD33 (U937 y K562, respectivamente), o con células que no expresan CD33 (Jeko-1). Los datos se presentan como porcentaje (%) de desgranulación y actividad de fluorescencia media (IFM).

Liberación de interferón gamma y lisis celular inducida por células T que expresan CAR de CD33 generado usando fragmentos de anticuerpo scFV anti-CD33 derivados de M195, M2H12 y My9.6

Para esto, se aislaron células T de diversos donantes de muestras con capa leucocitaria y activadas usando perlas de CD3/CD28. Las células se transfectaron de manera transitoria con ARNm que codifican para los diferentes candidatos en el D11 después de la activación.

Se evaluó la actividad de CAR midiendo la liberación de IFN gamma, y la actividad citotóxica cuando se cultiva conjuntamente con células que expresan diversos niveles de CD33 de la siguiente manera.

- Ensayo de liberación de IFN gamma

Se incubaron células T que expresan CAR anti-CD33 en placas de 96 pocillos (40.000 células/pocillo), junto con líneas celulares que expresan diversos niveles de la proteína CD33. Se mantuvieron los cocultivos en un volumen final de 100 |il de medio X-Vivo™-15 (Lonza) durante 24 horas a 37°C con el 5% de CO2. Después de este periodo de incubación, las placas se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos y se recuperaron los sobrenadantes en una nueva placa. La detección de IFN gamma en los sobrenadantes de cultivo celular se realizó mediante ensayo ELISA. Los ensayos de liberación de IFN gamma se llevaron a cabo iniciando los cocultivos celulares 24 h después de la transfección de ARNm.

La figura 7 muestra la cantidad de IFN gamma liberado por células T de CAR de CD33 (células T) cuando se cultivan conjuntamente durante 24 h con células que expresan diferentes niveles de CD33 (U937 y K562), o con células que no expresan CD33 (Jeko-1). También se muestra la liberación de IFN gamma de células T cultivadas solas, en las mismas condiciones que los cocultivos. Los experimentos se realizaron para tres donantes independientes, y se muestran en este caso los resultados de un donante representativo.

Las células T que expresan CAR de CD33 generado usando fragmentos de anticuerpo scFV anti-CD33 derivados de M195, M2H12 y My9.6 se sometieron luego a prueba para determinar su capacidad de lisar células cancerosas diana que expresan CD33+ (U937: célula de linfoma de monocitos leucémicos humanos y célula leucémica humana K562 derivada de un paciente con leucemia mielógena crónica (LMC) de la siguiente manera.

- Ensayo de citotoxicidad

Se incubaron células T que expresan CAR anti-CD33 en placas de 96 pocillos (100.000 células/pocillo), junto con 10.000 células diana (que expresan CD33) y 10.000 células de control (CD33neg) en el mismo pocillo. Se marcaron las células diana y de control con tintes intracelulares fluorescentes (CFSE o Cell Trace Violet) antes de su cocultivo con células T ^cA^r+. Los cocultivos se incubaron durante 4 horas a 37°C con el 5% de CO2. Después de este periodo de incubación, se marcaron las células con un tinte de viabilidad fijable y se analizaron mediante citometría de flujo. Se determinó la viabilidad de cada población celular (células diana o células de control CD33neg) y se calculó el % de lisis de células específicas. Se llevaron a cabo ensayos de citotoxicidad 48 h después de la transfección de ARNm.

La figura 8 muestra la actividad citolítica específica de células T de CAR. Se realizaron los ensayos 48 h después de la transfección de ARNm de CAR. Se cultivaron conjuntamente células T con células U937+Jeko o K562+Jeko durante 4 horas. Se determinó la viabilidad celular para cada una de las líneas celulares al final de las cultivadas conjuntamente y se calculó un porcentaje de lisis celular específica.

Todas las construcciones fueron activas, presentando el CAR de V3 My9.6 (My9.6-3, SEQ ID NO 68) la mayor actividad global en comparación con el control distinto de CAR.

Los ejemplos anteriores demuestran que las estructuras de CAR ejemplificadas (V1, V3 y V5) que comprenden una secuencia de unión VH-Ligador-VL a CD33 son activas en todo el ensayo.

Los CAR que tenían las estructuras V1 y V3 se encontraron particularmente activos en el ensayo de desgranulación, el ensayo de liberación de INFy y el ensayo citotóxico, véanse las figuras 4 a 8.

La presente invención proporciona, por tanto, una célula T que expresa CAR anti-CD33 activa contra células cancerosas.

Ejemplos de secuencias polipeptídicas de CAR

M195-1 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.19)

m a l p v t a l l l p l a l l l h a a r p |e v q l q q s g p e l v k p g a s v k is c k a s g y t f t d y n m h w v k q s |

iHGKSLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATLTVDNSSSTAYMDVRSLTSEDSAVYYCARGRPl

Ia m d y w g q g t s v t v s s Ig g g g s g g g g s g g g g s Id ív l t q s p a s l a v s l g q r a t is c r a s e s v I

|DNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAM|

hi^FCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK|GLAVSTISSFFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCK

RGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQ LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKG ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

M195-2 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.20)

MALPVTALLLPLALLLHAARP|EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVKQS|

iHGKSLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATLTVDNSSSTAYMDVRSLTSEDSAVYYCARGRPl

|DNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAM|

hi^FCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK|GLAVSTISSFFPPGYQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQN QLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK GERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

M195-3 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.21)

m a l p v t a l l l p l a l l l h a a r p |e v q l q q s g p e l v k p g a s v k is c k a s g y t f t d y n m h w v k q s | iHGKSLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATLTVDNSSSTAYMDVRSLTSEDSAVYYCARGRPl ^\m d y w g q g t s v t v s s |g g g g s g g g g s g g g g s [d iv l t q s p a s l a v s l g q r a t is c r a s e s v | |DNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAM| |YFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIKfnTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRG LDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFP EEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPR RKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALP PR

M195-4 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.22)

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M195-5 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.23)

MALPVTALLLPLALLLHAARP|EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVKQS| iHGKSLEWIGYIYPYNGGTGYNQKFKSKATLTVDNSSSTAYMDVRSLTSEDSAVYYCARGRPl ^\MDYWGQGTSVTVSS|GGGGSGGGGSGGGGS[blVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESV| iDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMl hi^FCQQSKEVPWTFGGGTKLEIK|EPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIAR TPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCS CRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMG GKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALH MQALPPR

M195-6 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.24)

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m2H12-1 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.25)

M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P |Q V Q LQ Q S G P E LV R P G T F V K IS C K A S G Y T F T N Y D IN W V N Q R P | iGQGLEWIGWIYPGDGSTKYNEKFKAKATLTADKSSSTAYLQLNNLTSENSAVYFCASGYEDl ^\m d y w g q g t s v t v s s |g g g g s g g g g s g g g g s [d ík m t q s p s s m y a s l g e r v iin c k a s q d i| INSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQI

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m2H12-2 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.26)

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m2H12-3 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.27)

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m2H12-4 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.28)

m a l p v t a l l l p l a l l l h a a r p [q v q l q q s g p e l v r p g t f v k is c k a s g y t f t n y d in w v n q r p | iGQGLEWIGWIYPGDGSTKYNEKFKAKATLTADKSSSTAYLQLNNLTSENSAVYFCASGYEDl ÍAMDYWGQGTSVTVSS|GGGGSGGGGSGGGGS|DIKMTQSPSSMYASLGERVIINCKASQDI| INSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQI

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m2H12-5 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.29)

m a l p v t a l l l p l a l l l h a a r p |q v q l q q s g p e l v r p g t f v k is c k a s g y t f t n y d in w v n q r p | iGQGLEWIGWIYPGDGSTKYNEKFKAKATLTADKSSSTAYLQLNNLTSENSAVYFCASGYEDl ÍAMDYWGQGTSVTVSS|GGGGSGGGGSGGGGS|DIKMTQSPSSMYASLGERVIINCKASQDI| INSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQI

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m2H12-6 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.30)

m a l p v t a l l l p l a l l l h a a r p [q v q l q q s g p e l v r p g t f v k is c k a s g y t f t n y d in w v n q r p | iGQGLEWIGWIYPGDGSTKYNEKFKAKATLTADKSSSTAYLQLNNLTSENSAVYFCASGYEDl ^\m d y w g q g t s v t v s s |g g g g s g g g g s g g g g s |d ik m t q s p s s m y a s l g e r v iin c k a s q d i| INSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQI

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DRB2-1 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.31)

m a l p v t a l l l p l a l l l h a a r p [e v k l q e s g p e l v k p g a s v k m s c k a s g y k f t d y w h w l k q k | iPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMEVSSLTSEDSAVYYCARDYRl ^EVYGMDYWGQGTSVTVSSlGGGGSGGGGSGGGGS^ÍVLTQSPTIMSASPGERVTMTCTl ^\SSSVNYIHWYQQKSGDSPLRWIFDTSKVASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATY| ^CQQWRSYPLTFGDGTRLELKRADAAPTV^GLAVSTISSFFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLL SLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAP AYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAE AYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

DRB2-2 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.32)

m a l p v t a l l l p l a l l l h a a r p [e v k l q e s g p e l v k p g a s v k m s c k a s g y k f t d y w h w l k q k | iPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMEVSSLTSEDSAVYYCARDYRl ^EVYGMDYWGQGTSVTVSS|GGGGSGGGGSGGGGS^ÍVLTQSPTIMSASPGERVTMTCT| ^\SSSVNYIHWYQQKSGDSPLRWIFDTSKVASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATY| ^CQQWRSYPLTFGDGTRLELKRADAAPTV^GLAVSTISSFFPPGYQIISFFLALTSTALLFLLF FLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADA PAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMA EAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

DRB2-3 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.33

m a l p v t a l l l p l a l l l h a a r p [eví<l q e s g p e l v k p g a s v k m s c k a s g y k f t d y w h w l k q k | iPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMEVSSLTSEDSAVYYCARDYRl ^EVYGMDYWGQGTSVTVSSlGGGGSGGGGSGGGGS^ÍVLTQSPTIMSASPGERVTMTCTl ^\SSSVNYIHWYQQKSGDSPLRWIFDTSKVASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATY| híCQQWRSYPLTFGDGTRLELKRADAAPTVSlTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAA GGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEE DGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRD PEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTY DALHMQALPPR

DRB2-4 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.34)

m a l p v t a l l l p l a l l l h a a r p |e v k l q e s g p e l v k p g a s v k m s c k a s g y k f t d y w h w l k q k | |PGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMEVSSLTSEDSAVYYCARDYR| ^EVYGMDYWGQGTSVTVSS|GGGGSGGGGSGGGGS|DIVLTQSPTIMSASPGERVTMTCT| ^\SSSVNYIHWYQQKSGDSPLRWIFDTSKVASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATY| ^CQQWRSYPLTFGDGTRLELKRADAAPTVSlTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAA GGAVHTRGLDFACDIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQ EEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRG RDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKD TYDALHMQALPPR

DRB2-5 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.35)

m a l p v t a l l l p l a l l l h a a r p |e v k l q e s g p e l v k p g a s v k m s c k a s g y k f t d y w h w l k q k | iPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMEVSSLTSEDSAVYYCARDYRl ^EVYGMDYWGQGTSVTVSS|GGGGSGGGGSGGGGS|DIVLTQSPTIMSASPGERVTMTCT| ASSSVNYIHWYQQKSGDSPLRWIFDTSKVASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATY

^CQQWRSYPLTFGDGTRLELKRADAAPTVSlEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPK PKDTLMIARTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTT QEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRR GRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATK DTYDALHMQALPPR

DRB2-6 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.36)

m a l p v t a l l l p l a l l l h a a r p |e v k l q e s g p e l v k p g a s v k m s c k a s g y k f t d y w h w l k q k | iPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMEVSSLTSEDSAVYYCARDYRl ^EVYGMDYWGQGTSVTVSS|GGGGSGGGGSGGGGS|DIVLTQSPTIMSASPGERVTMTCT| ^\SSSVNYIHWYQQKSGDSPLRWIFDTSKVASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATY| ^CQQWRSYPLTFGDGTRLELKRADAAPTVSlEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPK PKDTLMIARTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGKIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQ TTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTA TKDTYDALHMQALPPR

My9.6-1 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.37)

MALPVTALLLPLALLLHAARPIQVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTPI

iGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLl |RYFDVWGAGTTVTVSS|GGGGSGGGGSGGGGS|NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQ| ISVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLlYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLl ^IYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKR|GLAVSTISSFFPPGYQIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQN QLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK GERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

My9.6-2 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.38)

M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P |Q V Q LQ Q P G A E V V K P G A S V K M S C K A S G Y T F T S Y Y 1H W IK Q T P | iGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLl |RYFDVWGAGTTVTVSS|GGGGSGGGGSGGGGS[NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQ| |SVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDL| ^lYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKRlGLAVSTISSFFPPGYQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSV VKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQ NQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM KGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

My9.6-3 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.39)

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My9.6-4 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.40)

MALPVTALLLPLALLLHAARP|QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTP| iGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLl |RYFDVWGAGTTVTVSS|GGGGSGGGGSGGGGS|NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQ| ISVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLlYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDLl ^j y y c h q y l s s r t f g g g t k l e ik r It t t p a p r p p t p a p t ia s q p l s l r p e a c r p a a g g a v h t r GLDFACDIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSWKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSC RFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGG KPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM QALPPR

My9.6-5 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.41)

MALPVTALLLPLALLLHAARP|QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYYIHWIKQTP| iGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLl |RYFDVWGAGTTVTVSS|GGGGSGGGGSGGGGS[NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQ| |SVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDL| ^lYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKRlEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIA RTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGC SCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEM GGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL HMQALPPR

My9.6-6 (SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.42)

M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P |Q V Q LQ Q P G A E V V K P G A S V K M S C K A S G Y T F T S Y Y 1H W IK Q T P | iGQGLEWVGVIYPGNDDISYNQKFKGKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREVRLl |RYFDVWGAGTTVTVSS|GGGGSGGGGSGGGGS[NIMLTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQ| SVFFSSSQKNYLAWYQQIPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQSEDL

^IYYCHQYLSSRTFGGGTKLEIKR|EPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIA RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGKIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSWKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEED GCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDP EMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD ALHMQALPPR

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Claims

REIVINDICACIONES

i . Receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de CD33 que tiene una estructura polipeptídica seleccionada de V1 y V3 tal como se ilustra en la figura 2, en el que dicha estructura V1 comprende (a) un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti-CD33 monoclonal, (b) una bisagra FcyRNIa, (c) un dominio transmembrana CD8a y (d) un dominio citoplásmico que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB; y en el que dicha estructura V3 comprende (a) un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti-CD33 monoclonal, (b) una bisagra CD8a, (c) un dominio transmembrana CD8a y (d) un dominio citoplásmico que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.
2. CAR específico de CD33 según la reivindicación 1, en el que dicho VH tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO. 11 y dicho VL tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO. 12, o dicho VH tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO. 13 y dicho VL tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO. 14, o dicho VH tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO. 15 y dicho VL tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO. 16, o dicho VH tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO. 17 y dicho VL tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO. 18.
3. CAR específico de CD33 según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho CAR tiene la estructura V3 que comprende (a) un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti-CD33 monoclonal, (b) una bisagra CD8a, (c) un dominio transmembrana CD8a y (d) un dominio citoplásmico que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.
4. CAR específico de CD33 de estructura V3 según la reivindicación 3, que comprende una secuencia polipeptídica que tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO. 27.
5. CAR específico de CD33 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además un péptido señal.
6. Polinucleótido que codifica para un CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Célula inmunitaria modificada por ingeniería genética que expresa en la membrana de la superficie celular un CAR específico de CD33 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
8. Célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según la reivindicación 7, derivada de linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T cooperadores.
9. Célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según la reivindicación 8, en la que la expresión de TCR se suprime.
10. Célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que dicha célula inmunitaria modificada por ingeniería genética se modifica para ser resistente a al menos un fármaco inmunodepresor o quimioterápico.
11. Célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, para su uso en terapia.
12. Célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, para su uso en terapia de leucemia, en la que dicha leucemia se selecciona del grupo que consiste en leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica y síndrome mielodisplásico.
13. Célula inmunitaria modificada por ingeniería genética para su uso en terapia según la reivindicación 12, en la que dicha leucemia es leucemia mielógena aguda (LMA).
14. Célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, para su uso en terapia de linfoma, en la que dicho linfoma se selecciona del grupo que consiste en mieloma múltiple, linfoma no hodgkiniano, linfoma de Burkitt y linfoma folicular (célula pequeña y célula grande).