JP2022534962A

JP2022534962A - Ｃｄ３３陽性悪性腫瘍治療用ｃｄ３３標的化キメラ抗原受容体修飾ｔ細胞

Info

Publication number: JP2022534962A
Application number: JP2021570724A
Authority: JP
Inventors: シュエ，トンユアン; エー．ホーン，デヴィッド; エリザベスブッデ，リファ; フォーマン，スティーブ; リアル，マリッサエム．デル
Original assignee: City of Hope
Current assignee: City of Hope
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2020-06-01
Publication date: 2022-08-04
Also published as: EP3976794A2; CA3142159A1; CN114040978A; US20220213489A1; WO2020243713A2; WO2020243713A3

Abstract

ＣＤ３３を標的とするキメラ抗原受容体及び、様々ながんの治療及び患者の骨髄由来サプレッサー細胞を低下させるためのその使用が記載される。

Description

本開示は、白血病関連ＣＤ３３特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）組換えＴ細胞、その処方方法、及びＣＤ３３陽性細胞に対して選択的な抗がん剤としての使用方法に関する。

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は成人の最も一般的な急性白血病であり、死亡率が最も高い（非特許文献１～３）。ＣＤ３３はＡＭＬ症例のうち８７～９８％で骨髄芽球上に発現している（非特許文献４及び５）。ＣＤ３３はまた、骨髄破壊抑制細胞（ＭＤＳＣ）、白血病幹細胞（ＬＳＣ）、及び造血幹細胞（ＨＳＣ）上で発現される（非特許文献６及び７）。原発性ＡＭＬの現在の治癒率は３５％であり、年齢とともに低下するため、ＡＭＬ患者、特に再発性又は難治性（Ｒ／Ｒ）ＡＭＬ患者に対する新たな治療法が喫緊の課題である。

Ｂｕｄｄｅｅｔａｌ．（２０１７）Ｂｌｏｏｄ１３０：８１１Ｄｏｅｈｎｅｒｅｔａｌ．（２０１５）ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３７３：１１３６－５２Ｓｃｈｕｓｔｅｒｅｔａｌ．（２０１７）ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３７７：２５４５－５４Ｅｈｎｉｎｇｅｒｅｔａｌ．（２０１４）ＢｌｏｏｄＣａｎｃｅｒ４：ｅ２１８ＡｎｄｒｅｗｓＲＧｅｔａｌ．（１９８９）ＪＥｘｐＭｅｄ１６９：１７２１－３１ＥｌｌｉｏｔＬＡｅｔａｌ．（２０１７）ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ８：８６ＷａｌｔｅｒＲＢｅｔａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ１１９：６１９８－２０８

本明細書では、ＣＤ３３標的ＣＡＲＴ細胞（本明細書ではＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞ともいう）を用いて、様々ながん、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療する方法が記載される。

本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むポリペプチドをコードする核酸分子であって、前記ＣＡＲは、配列番号３０で表されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％が同一であるか、又は配列番号３１で表されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％が同一である、アミノ酸配列を含む、核酸分子が記載される。また、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むポリペプチドをコードする核酸分子であって、前記ＣＡＲは、単一のアミノ酸の５個（例えば、１、２、３、４又は５個）以下が修飾された、配列番号３０又は配列番号３１のアミノ酸配列を含む、核酸分子が記載される。ある実施形態では、アミノ酸の修飾は、以下の配列：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＳＫＡＴＩＴＡＤＥＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＰＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＱＧＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＫＥＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１）
又は以下の配列：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＳＫＡＴＩＴＡＤＥＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＰＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）
又は以下の配列：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＭＳＣＫＳＳＱＳＩＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＨＱＹＬＳＳＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３３）
内に完全に存在する。

本明細書では、また、核酸分子を含む発現ベクター（例えば、ウイルスベクター又はレンチウイルスベクター）が記載される。前記ベクターにより形質導入された、又は上記核酸分子を含むヒトＴ細胞又はＮＫ細胞の集団もまた記載される。様々な実施形態では、細胞は、セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブメモリーＴ細胞、ｐａｎＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＣＤ２５＋細胞及びＣＤ１４＋細胞が実質的に除かれている末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含むか、又はこれらからなるか、又はこれらから本質的になる。

本明細書ではまた、前記核酸分子を含むベクターにより形質導入された自己若しくは同種異系のヒトＴ細胞又はＮＫ細胞の集団、又は本明細書に記載の核酸分子を含むＴ細胞若しくはＮＫ細胞の投与を含む、患者の白血病を治療する方法であって、前記白血病はＣＤ３３を発現する細胞を含む、方法が記載される。様々な実施形態では、キメラ抗原受容体は、局所又は全身に投与され；ＣＤ３３を発現する細胞は、がん性Ｔ細胞又はＴ調節性細胞であり；キメラ抗原受容体は、単回投与されるか又は反復投与され；患者は、自己又は同種異系のヒトＴ細胞の集団の投与前、又はそれと同時に、メチル化阻害剤が投与され；メチル化阻害剤は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤であり；メチル化阻害剤は、５－アザシチジン及びデシタビンから選択され；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性新生物；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；及び芽球性形質細胞様樹状細胞新生物から選択される血液がんである。

本明細書ではまた、本明細書に記載の核酸分子を含む免疫細胞を患者に投与することを含む、がんに罹患した患者における骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を減少させる方法が記載される。ある場合では、ＭＤＳＣは系統陰性（ＬＩＮ－）、ＨＬＡ－ＤＲ陰性、及びＣＤ３３陽性である。ある場合では、本明細書に記載されるＣＤ３３ＣＡＲ発現細胞は、ＭＤＳ芽球及びＭＤＳＣを標的とする。実施形態では、本明細書に記載されるＣＤ３３ＣＡＲ発現細胞は、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、又は卵巣がん、結腸がん、又は乳がん等の固形悪性腫瘍の治療に用いられる。

本明細書ではまた、ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞を調製する方法であって、以下の：自己又は同種異系のヒトＴ細胞の集団を提供する工程；かつＴ細胞を請求項１に記載の核酸分子を含むベクターにより形質導入する工程；を含む、方法が記載される。

本明細書では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、キメラ抗原受容体が、ＣＤ３３を標的とするｓｃＦｖ、スペーサー、膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、核酸分子が記載される。

様々な実施形態では、膜貫通ドメインは、１～５個のアミノ酸が修飾されたＣＤ４膜貫通ドメイン又はその変異体、１～５個のアミノ酸が修飾されたＣＤ８膜貫通ドメイン又はその変異体、１～５個のアミノ酸が修飾されたＣＤ２８膜貫通ドメイン又はその変異体から選択され；前記スペーサーは２０～１５０個のアミノ酸を含み、かつ、ｓｃＦｖと膜貫通ドメインとの間に位置し；膜貫通ドメインは、１～５個のアミノ酸が修飾されたＣＤ４膜貫通ドメイン又はその変異体；前記膜貫通ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメインであり；前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ４膜貫通ドメイン又は１～２個のアミノ酸が修飾されたその変異体、ＣＤ８膜貫通ドメイン又は１～２個のアミノ酸が修飾された変異体、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又は１～２個のアミノ酸が修飾されたその変異体、から選択される膜貫通ドメインを含み；前記スペーサー領域は、配列番号２～１２からなる群から選択されるアミノ酸配列又は１～５個のアミノ酸が修飾されたその変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；前記スペーサーは、ＩｇＧヒンジ領域を含み；前記スペーサーは、１０～５０個のアミノ酸を含み；前記４－１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号２４又は１～５個のアミノ酸が修飾されたその変異体のアミノ酸配列を含み；前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み；３～１５個のアミノ酸のリンカーが４－１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又はその変異体の間に位置し；前記ＣＡＲは、配列番号３０又は３１のアミノ酸配列、又は１～５個のアミノ酸が修飾された、例えば１～５個の単一アミノ酸が置換された、その変異体を含み；前記ｓｃＦｖは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の核酸分子に関する。

本明細書ではまた、本明細書に記載される核酸分子を含むウイルスベクター；本明細書に記載される核酸分子を含むベクターによって形質導入されたヒトＴ細胞の集団（例えば、セントラルメモリーＴ細胞を含む集団）が記載される。

本明細書ではまた、本明細書に記載されている核酸分子を含むベクターによって形質導入された自己又は同種異系のヒトＴ細胞の集団の投与を含む、患者のＣＤ３３陽性がん（例えば、ＡＭＬ、Ｒ／ＲＡＭＬ、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄腫、骨髄増殖性新生物、他のＣＤ３３＋血液悪性腫瘍などを含む）の治療方法が記載され、がん（又は疾患又は症状）は、ＣＤ３３を発現する細胞を含む。様々な実施形態では、キメラ抗原受容体は局所又は全身に投与され；ＣＤ３３を発現する細胞はがん性Ｔ細胞であり；キメラ抗原受容体は、単回投与されるか又は反復投与される。

様々な実施形態では、キメラ抗原受容体は、以下のアミノ酸配列：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＳＫＡＴＩＴＡＤＥＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＰＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＱＧＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＫＥＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１）
で表されるアミノ酸配列を含む、ＣＤ３３ｓｃＦｖを含むが、ここで、配列番号１のうち単一のアミノ酸が１０個まで置換される。

本明細書ではまた、ＣＤ３３ＣＡＲを発現するベクターを含むＴ細胞が記載される。様々な実施形態では、形質導入されたヒトＴ細胞の少なくとも２０％、３０％、又は４０％は、セントラルメモリーＴ細胞であり；形質導入されたヒトＴ細胞の少なくとも３０％は、ＣＤ４＋及びＣＤ６２Ｌ＋又はＣＤ８＋及びＣＤ６２Ｌ＋である。様々な実施形態では、ヒトＴ細胞の集団は、配列番号３０若しくは３１から選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を発現するベクター、又は１～５個のアミノ酸が修飾された（例えば、１若しくは２個）その変異体（例えば、置換）を含むベクターを含み；ヒトＴ細胞の集団はセントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ細胞）を含むが、例えば、当該細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％はＴ_ＣＭ細胞であり；又は、Ｔ細胞の集団は、セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞及び幹記憶細胞の組み合わせ（Ｔ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞）を含むが、例えば、当該細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％はＴ_{ＣＭ／ＳＣＭ／Ｎ}細胞である。ある実施形態では、Ｔ細胞の集団は、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞をともに含む（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも２０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋Ｔ細胞の少なくとも３％がＣＤ８＋であり、少なくとも７０、８０、又は９０％がＣＤ４＋又はＣＤ８＋のいずれかである；細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％がＣＤ４＋であり、ＣＤ３＋細胞の少なくとも４％、５％、８％、１０％、２０％がＣＤ８＋細胞である）。ある実施形態では、ヒトＴ細胞の集団は、患者に対して自己である。ある実施形態では、ヒトＴ細胞の集団は、患者に対して同種異系である。

ＣＤ３３標的化ＣＡＲ
本明細書に記載されるＣＤ３３標的化ＣＡＲは、ＣＤ３３を標的化するｓｃＦｖを含む。ある実施形態では、以下のアミノ酸配列：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＳＫＡＴＩＴＡＤＥＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＰＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＱＧＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＫＥＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１）を含む、又は以下のアミノ酸配列：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＮＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＰＹＮＧＧＴＧＹＮＱＫＦＫＳＫＡＴＩＴＡＤＥＳＴＮＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＰＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３２）
及び可撓性リンカーによって結合された、以下のアミノ酸配列：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＭＳＣＫＳＳＱＳＩＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＨＱＹＬＳＳＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３３）
を、含むｓｃＦｖである。

有用なＣＤ３３ＣＡＲは、配列番号３０又は３１（シグナル配列欠損成熟ＣＡＲ）のアミノ酸配列からなるか若しくはそれを含むことができるか、又は、当該ＣＤ３３ＣＡＲは、ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列（配列番号３４）（ＧＭＣＳＦＲシグナル配列含有未成熟ＣＡＲ；（ＭＬＬＶＴＳＬＬＣＨＨＰＡＦＬＬＩＰ；配列番号３４））に先行する配列番号３０又は配列番号３１のアミノ酸配列からなるか又はそれを含むことができる。つまり、ＣＡＲは、発現をモニターするのに有用なさらなる配列、例えば、Ｔ２Ａスキップ配列及び切断型ＥＧＦＲｔで発現させることができる。ＣＡＲは、発現をモニターするのに有用なさらなる配列、例えば、Ｔ２Ａスキップ配列及び切断型ＣＤ１９ｔを用いて発現させることができる。したがって、ＣＡＲは、配列番号３０又は３１のアミノ酸配列を含むことができるか、又はそれからなることができ、又は配列番号３０又は３１で表されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％が同一であるアミノ酸配列を含むことができるか、又はそれからなることができる。ＣＡＲは、１、２、３、４又は５個までのアミノ酸が修飾（好ましくは保存的アミノの修飾）された配列番号３０又は３１のいずれかのアミノ酸配列を含むことができるか、又はそのアミノ酸配列からなることができる。ＣＡＲは、ＣＤ３３を標的とするｓｃＦｖ、例えば、１、２、３、４又は５個までのアミノ酸が修飾（好ましくは保存的アミノの修飾）された配列番号３２を含むｓｃＦｖ、及び１、２、３、４又は５個までのアミノ酸が修飾（好ましくは保存的アミノの修飾）された可撓性リンカーによって連結された配列番号３３を含むｓｃＦｖを含むことができる。

ある実施形態では、配列番号１～３４のアミノ酸配列をコードする核酸は、コドンが最適化されている。ある実施形態では、配列番号１～３４のアミノ酸配列をコードする核酸は、コドンが最適化されていない。

スペーサー領域
本明細書に記載されるＣＡＲは、ＣＤ３３標的化ドメイン（すなわち、ＣＤ３３標的化ＳｃＦｖ又はその変異体）と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサーを含むことができる。様々な異なるスペーサーを用いることができる。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも部分、例えば、ヒトＦｃ領域のヒンジ部分、又はＣＨ３ドメイン若しくはその変異体を含む。以下の表１は、本明細書に記載されるＣＡＲにおいて用いることができる様々なスペーサーを提供する。
表１：スペーサーの例

いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域、すなわち、免疫グロブリンのＣＨ１及びＣＨ２ドメインの間にある配列、例えば、ＩｇＧ４Ｆｃヒンジ又はＣＤ８ヒンジの全部又は部分を含む。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含むか又はＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインをともに含む。当該免疫グロブリン由来の配列は、１個又はそれ以上のアミノ酸修飾、例えば、１、２、３、４又は５個の置換、例えば、オフターゲット結合を減少させる置換を含むことができる。

ヒンジ／リンカー領域はまた、配列がＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４）又はＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３）であるＩｇＧ４ヒンジ領域を含むことができる。当該ヒンジ／リンガー領域はまた、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３）、続いてリンカー配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号２）、続いてＩｇＧ４ＣＨ３配列ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１２）を含むことができる。従って、当該リンカー／スペーサー領域全体は、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１１）という配列を含むことができる。
ある場合では、当該スペーサーには、配列番号１１と比較して、１、２、３、４又は５個の単一のアミノ酸が変化（例えば、保存的変化）している。ある場合では、ＩｇＧ４Ｆｃヒンジ／リンカー領域は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）による結合が低下するように、２つの位置（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）で変異する。

膜貫通ドメイン
様々な膜貫通ドメインを用いることができる。表２には、適当な膜貫通ドメインが例示されている。スペーサー領域が存在する場合、膜貫通ドメイン（ＴＭ）は、スペーサー領域のカルボキシ末端に位置する。
表２：膜貫通ドメインの例示

共刺激ドメイン
共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと共に用いるのに適したいかなるドメインでありうる。ある場合、共シグナル伝達ドメインは、ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号２４）と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はと同一である配列があげられる４－１ＢＢ共シグナル伝達ドメインである。ある場合、当該４－１ＢＢ共シグナル伝達ドメインは、配列番号２４と比較して、１、２、３、４又は５個のアミノ酸が変化（好ましくは、保存的に）している。
共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの間に位置する。表３は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの配列と適当な共刺激ドメインを例示する。
表３：ＣＤ３ζドメインと共刺激ドメインの例

様々な実施形態では、共刺激ドメインは、表３に示される共刺激ドメイン又は１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸が修飾されたその変異体、１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸が修飾されたＣＤ２８共刺激ドメイン又はその変異体、１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸が修飾された４－１ＢＢ共刺激ドメイン又はその変異体、及び１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸が修飾されたＯＸ４０共刺激ドメイン又はその変異体からなる群から選択される。特定の実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又はその変異体は、１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸が修飾されている。ある実施形態では、２つの共刺激ドメイン、例えば、１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されているＣＤ２８共刺激ドメイン又はその変異体、及び１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸が修飾（例えば、置換）されている４－１ＢＢ共刺激ドメイン又はその変異体がある。様々な実施形態では、１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸の修飾は置換である。共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのアミノ末端であり、２～１０個からなる短いリンカー、例えば、３つのアミノ酸（例えば、ＧＧＧ）が、共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの間に位置してよい。

ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと共に用いるのに適したいかなるドメインであってよい。ある場合では、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、以下の配列：
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２１）
と少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一又は同一である配列を含む。
ある場合、ＣＤ３ζシグナル伝達は、配列番号２１と比較して、１、２、３、４又は５個のアミノ酸が変化（好ましくは、保存的な）している。

切断型ＥＧＦＲ及び切断型ＣＤ１９
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの後方には、リボソームスキップ配列（例えば、ＬＥＧＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲ；配列番号２７）及び、以下の配列：
ＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＲＫＶＣＮＧＩＧＩＧＥＦＫＤＳＬＳＩＮＡＴＮＩＫＨＦＫＮＣＴＳＩＳＧＤＬＨＩＬＰＶＡＦＲＧＤＳＦＴＨＴＰＰＬＤＰＱＥＬＤＩＬＫＴＶＫＥＩＴＧＦＬＬＩＱＡＷＰＥＮＲＴＤＬＨＡＦＥＮＬＥＩＩＲＧＲＴＫＱＨＧＱＦＳＬＡＶＶＳＬＮＩＴＳＬＧＬＲＳＬＫＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫＮＬＣＹＡＮＴＩＮＷＫＫＬＦＧＴＳＧＱＫＴＫＩＩＳＮＲＧＥＮＳＣＫＡＴＧＱＶＣＨＡＬＣＳＰＥＧＣＷＧＰＥＰＲＤＣＶＳＣＲＮＶＳＲＧＲＥＣＶＤＫＣＮＬＬＥＧＥＰＲＥＦＶＥＮＳＥＣＩＱＣＨＰＥＣＬＰＱＡＭＮＩＴＣＴＧＲＧＰＤＮＣＩＱＣＡＨＹＩＤＧＰＨＣＶＫＴＣＰＡＧＶＭＧＥＮＮＴＬＶＷＫＹＡＤＡＧＨＶＣＨＬＣＨＰＮＣＴＹＧＣＴＧＰＧＬＥＧＣＰＴＮＧＰＫＩＰＳＩＡＴＧＭＶＧＡＬＬＬＬＬＶＶＡＬＧＩＧＬＦＭ（配列番号２８）
と同一又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％が同一である配列である、切断型ＥＧＦＲが位置してよい。ある場合、当該切断型ＥＧＦＲは、配列番号２８と比較して、１、２、３、４又は５個のアミノ酸が変化（好ましくは、保存的な）している。

あるいは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの後方には、リボソームスキップ配列（例えば、ＬＥＧＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲ；配列番号２７）及び、以下の配列：
ＭＰＰＰＲＬＬＦＦＬＬＦＬＴＰＭＥＶＲＰＥＥＰＬＶＶＫＶＥＥＧＤＮＡＶＬＱＣＬＫＧＴＳＤＧＰＴＱＱＬＴＷＳＲＥＳＰＬＫＰＦＬＫＬＳＬＧＬＰＧＬＧＩＨＭＲＰＬＡＩＷＬＦＩＦＮＶＳＱＱＭＧＧＦＹＬＣＱＰＧＰＰＳＥＫＡＷＱＰＧＷＴＶＮＶＥＧＳＧＥＬＦＲＷＮＶＳＤＬＧＧＬＧＣＧＬＫＮＲＳＳＥＧＰＳＳＰＳＧＫＬＭＳＰＫＬＹＶＷＡＫＤＲＰＥＩＷＥＧＥＰＰＣＶＰＰＲＤＳＬＮＱＳＬＳＱＤＬＴＭＡＰＧＳＴＬＷＬＳＣＧＶＰＰＤＳＶＳＲＧＰＬＳＷＴＨＶＨＰＫＧＰＫＳＬＬＳＬＥＬＫＤＤＲＰＡＲＤＭＷＶＭＥＴＧＬＬＬＰＲＡＴＡＱＤＡＧＫＹＹＣＨＲＧＮＬＴＭＳＦＨＬＥＩＴＡＲＰＶＬＷＨＷＬＬＲＴＧＧＷＫＶＳＡＶＴＬＡＹＬＩＦＣＬＣＳＬＶＧＩＬＨＬＱＲＡＬＶＬＲＲＫＲ（配列番号２６）
と同一又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％が同一である配列である、切断型ＣＤ１９Ｒ（ＣＤ１９ｔという）が位置してよい。

「アミノ酸修飾」とは、タンパク質又はペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を意味する。
「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ペプチド又はタンパク質配列中の特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することをいう。当該置換は、非保存的様式（すなわち、コドンを、ある特定の大きさ又は特性があるアミノ酸群に属するアミノ酸から他の群に属するアミノ酸に変化させる）又は保存的様式（すなわち、コドンを、ある特定の大きさ又は特性があるアミノ酸の群に属するアミノ酸から同じ群に属するアミノ酸に変化させる）で、得られたタンパク質中のアミノ酸を変化させることができる。当該保存的変化では、一般に、結果として生じるタンパク質の構造及び機能の変化がより少なくなる。以下に、アミノ酸の様々な群分けを例示する：
１）非極性Ｒ基を有するアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；
２）非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；
３）荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に荷電）：アスパラギン酸、グルタミン酸；
４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に荷電）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０で正に荷電）。
他の群はフェニル基をもつアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンである。

ある場合、ＣＤ３３ＣＡＲは、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後にＴ２Ａリボソームスキップ配列と、細胞質シグナル伝達尾部が欠失した切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）が続くベクターを用いて産生されうる。この配列では、ＥＧＦＲｔの共発現により、遺伝子修飾細胞が正確に測定されえ、遺伝子修飾細胞の正の選択、並びに養子移入後の治療用Ｔ細胞の生体内で効率的に細胞追跡しうる不活性な非免疫原性表面マーカーが提供される。サイトカインストーム及び標的外毒性を回避するための増殖の効率的な制御は、Ｔ細胞免疫療法の成功にとって重要なハードルである。ＣＤ３３ＣＡＲレンチウイルスベクターに組み込まれたＥＧＦＲｔは、自殺遺伝子として作用し、治療関連毒性の場合にＣＡＲ＋Ｔ細胞を除去しうる。

本明細書中に記載されるＣＡＲは、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて製造されるが、当技術分野で公知のいかなる手段により製造されうる。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、当技術分野で公知の分子クローニングの標準的な技術（ゲノムライブラリースクリーニング、オーバーラップＰＣＲ、プライマー支援ライゲーション、部位特異的突然変異誘発等）により、簡便に調製し、完全なコード配列を構築することができる。得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、好適な発現宿主細胞系、好ましくはＴリンパ球、最も好ましくは自己Ｔリンパ球の形質転換に用いられる。

患者から単離された様々なＴ細胞サブセットを、ＣＡＲ発現用ベクターで形質導入しうる。セントラルメモリーＴ細胞は、有用なＴ細胞サブセットの１つである。セントラルメモリーＴ細胞は、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を用いて、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を選択することにより、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離して、所望の受容体を発現する細胞を免疫磁気的に選択することができる。セントラルメモリーＴ細胞用に濃縮された細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化することができ、例えば、ＣＤ３３ＣＡＲの発現を指向するレンチウイルスベクター、並びに生体内検出、アブレーション、及び潜在的ｅｘｖｉｖｏ選択用の非免疫原性表面マーカーで形質導入することができる。活性化された／遺伝子修飾されたＣＤ３３セントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５を用いてインビトロで増殖させ、その後凍結保存することができる。ＣＡＲＴ細胞を調製するさらなる方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４３３９２に記載されている。

他の実施形態では、ＣＤ３３ＣＡＲ発現細胞は、外因性ＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載のＣＡＲ分子をコードする核酸を含む生体外転写ＲＮＡ又は合成ＲＮＡがある免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。
特段の限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同義である。
本発明で用いる方法及び材料は本明細書に記載されるが、当該技術分野で公知の他の適当な方法及び材料も用いてよい。
材料、方法、及び実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図しない。
本明細書に記載されている全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース表示、及び他の参考文献は、全ての目的のため、その全体が参照され援用される。
矛盾がある場合、定義がある場合は本明細書の記載が優先される。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の記載及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかであろう。

代表的なＣＤ３３ＣＡＲ構築物を示す概略図である。ＥＧＦＲｔをトラッキングマーカーとして用いた、１３日間の培養期間中発現が安定であったＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲＴ細胞を用いた実験の結果を示すグラフである。Ｍｏｃｋ（非形質導入：２Ａ）及びＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞（２Ｂ）をＥＧＦＲ発現についてフローサイトメトリーにより評価し、ＣＡＲの発現を検出した。ＭｏｃｋＣＡＲＴ細胞及びＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞はいずれも、ｅｘｖｉｖｏ培養中で安定して増殖した（２Ｃ）。ヒトＡＭＬ細胞株におけるＣＤ３３の発現を示す。ヒトバーキットリンパ腫細胞株ＲＡＪＩを陰性対照として用いた実験の結果を示すグラフである。ＣＤ３３を発現するＡＭＬ細胞株に対するＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲＴ細胞のエフェクター機能及び殺傷活性を示すグラフである。ＡＭＬ細胞に対するＭｏｃｋ又はＣＤ３３のＣＡＲＴ細胞のＥ：Ｔ比が２：１である脱顆粒アッセイの結果を示す。ＣＤ３３を発現するＡＭＬ細胞株に対するＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲＴ細胞のエフェクター機能及び殺傷活性を示すグラフである。ＡＭＬ細胞に対するＭｏｃｋ又はＣＤ３３のＣＡＲＴ細胞のＥ：Ｔ比が１：１である細胞内ＩＦＮ－γ染色アッセイの結果を示す。ＣＤ３３を発現するＡＭＬ細胞株に対するＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲＴ細胞のエフェクター機能及び殺傷活性を示すグラフである。ＡＭＬ細胞に対するＭｏｃｋ又はＣＤ３３のＣＡＲＴ細胞のＥ：Ｔ比が１：５、１：１０、及び１：２０である再投与アッセイの結果を示す。ＲＡＪＩ細胞株を陰性対照として用いた。ＣＤ３３発現レベルが高いＡＭＬ細胞株であるＭＯＬＭ－１４－ｆｆｌｕｃ細胞株を用いた、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ＩＬ２Ｒｇｎｕｌｌ（ＮＳＧ）異種移植モデルを用いた代表的な生体内試験を示す図である。図６Ａ～６Ｂは、ＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲＴ細胞の生体内でＣＤ３３発現腫瘍株の殺傷能を示す。図６Ａは、３×１０^６個のＭｏｃｋＴ細胞又は未処理群と比較して、３×１０^６個のＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞により、生体内の白血病負荷が有意に減少したことを示す写真である。図６Ｂは、３×１０^６個のＭｏｃｋＴ細胞又は未処理群と比較して、３×１０^６個のＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞により、生体内の全生存が有意に延びたことを示すグラフである。１００ｎＭのデシタビン又はＤＭＳＯの存在下で、連続した２日間のＡＭＬ細胞株におけるＣＤ３３の発現を示す。ＲＡＪＩ細胞株を陰性対照として用いた。、生体外でのＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲＴ細胞と併用したデシタビンの殺傷活性を示す概略図である。ＡＭＬ細胞株を１０ｎＭデシタビン又はＤＭＳＯで２日間連続処理した後、ＣＤ３３ＣＡＲ又はＭｏｃｋＴ細胞をＥ：Ｔ比１：５０で処理した。さらに４８時間後、各群の殺傷活性をフローサイトメトリーにより測定した。ＲＡＪＩ細胞株を陰性対照として用いた。図９Ａ～９Ｂは、プログラムされた細胞死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）及びｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）の、デシタビン又はＤＭＳＯとＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲ又はＭｏｃｋＴ細胞との併用後の、残留しているＡＭＬ細胞上の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。ＲＡＪＩ細胞株を陰性対照として用いた。ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞治療と併用してデシタビンを投与されたＭＯＬＭ－１４－ｆｆｌｕｃを備えるＮＳＧ異種移植モデルを用いた代表的な生体内試験を示す。図１１Ａ～１１Ｂは、デシタビン及びＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲＴ細胞の生体内での併用効能の結果を示す。Ａは、０．５ｍｇ／ｋｇ／日×５日間のデシタビン投与後、１×１０^６個のＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞の投与により、生体内での白血病負荷が有意に減少したことを示すグラフである。Ｂは、０．５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×５日間のデシタビン及び１×１０^６個のＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞の併用療法により、生体内での全生存を有意に延びたことを示すグラフである。１０ｎＭデシタビン及びＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲＴ細胞を１：５０Ｅ：Ｔ比で処理すると、生存した残存ＡＭＬ細胞により、ＰＤ－Ｌ１発現レベルが有意に増加したことを示すグラフである。抗ＰＤ－１抗体（１０μｇ／ｍＬ）により、Ｅ：Ｔ比１：７５での、ＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲＴ細胞の抗ＡＭＬ効果が有意に高まったことを示すグラフである。ＣＤ３３ＣＤ８ＣＡＲ（Ａ；配列番号３０）及びＣＤ３３ＥＱＣＡＲ（Ｂ；配列番号３１）の注釈付きアミノ酸配列を示す。下線は、様々な構成要素を示す。（Ａ）ＧＭＣＳＲシグナル配列が先行し、Ｔ２Ａスキップ配列およびＥＧＦＲｔ（配列番号３５（核酸）及び配列番号３６（アミノ酸））が後続する、ＣＤ３３ＣＤ８ＣＡＲ；かつ、（Ｂ）ＧＭＣＳＲシグナル配列が先行し、Ｔ２Ａスキップ配列およびＥＧＦＲｔ（配列番号３５（核酸）及び配列番号３６（アミノ酸））が後続する、ＣＤ３３ＥＱＣＡＲ；の注釈付き核酸及び対応するアミノ酸配列を示す。各核酸配列のコドンが最適化された部分は太字で示す。

本開示では、ヒト化抗ヒトＣＤ３３ｓｃＦｖ抗原結合ドメイン、及びある実施形態では、４－１ＢＢ細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含有するＣＡＲの生成及び抗腫瘍効果が記載される。ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ３３発現ヒトがん株に対して強力な抗原依存性細胞毒性を呈示した。ヒト白血病／リンパ腫マウス腫瘍モデルにおけるＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞の腹腔内又は静脈内生体内投与により、抗原陽性疾患が除去され、かつ、全生存期間が延びた。

本発明は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに説明される。例
〔実施例１〕異なるリンカーを含むＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞の構築
以下に記載する試験は、ＣＤ３３ＣＡＲが初代Ｔ細胞上で安定に発現できることを示す。
複数のＣＤ３３－標的ＣＡＲ構築物を設計した。すべての構築物は、同一のコドンを最適化したヒト化ＣＤ３３単鎖可変断片を発現した。ある実施形態では、ＣＡＲ構築物はまた、ＣＤ４膜貫通ドメイン（ＴＭ）、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ３ゼータドメインを含んでいた。ある実施形態では、ＣＡＲ構築物はまた、ＣＤ８膜貫通ドメイン（ＴＭ）、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ３ゼータドメインを含んでいた。ＣＤ３３ＣＡＲの代表的な模式図を図１に示す。ＣＡＲは、ＣＡＲ構築物と共に細胞の形質導入の成功についてのマーカーとして機能する切断型ＥＧＦＲと、共発現された。ある実施形態では、ＣＤ３３ＣＡＲ構築物は、それらのリンカードメイン及び膜貫通ドメインが異なる。理論に拘束されることなく、構築物の細胞外部分の長さが異なることで、抗原結合後に抗原に結合し、活性化シグナルを伝達するＣＡＲの機能が相違する可能性がある。これらの相違によりまた、ＣＤ３３発現腫瘍細胞の殺傷は異なるかもしれない。

図１４Ａは、ＣＤ３３標的化ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ（スペーサー）、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＧＧＧリンカーによってＣＤ３ゼータ刺激ドメイン（配列番号３０）に連結された４－１ＢＢ共刺激ドメインを含むＣＤ３３ＣＡＲのアミノ酸配列を示す。図１４Ｂは、ＣＤ３３標的化ｓｃＦｖ、ＩｇＧ４スペーサー（ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ））、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＧＧＧリンカーによってＣＤ３ゼータ刺激ドメイン（配列番号３１）に連結された４－１ＢＢ共刺激ドメインを含むＣＤ３３ＣＡＲのアミノ酸配列を示す。

既報（ＰｒｉｃｅｍａｎＳＪ，ＧｅｒｄｔｓＥＡ，ＴｉｌａｋａｗａｒｄａｎｅＤ，ＫｅｎｎｅｗｉｃｋＫＴ，ＭｕｒａｄＪＰ，ＰａｒｋＡＫ，ＪｅａｎｇＢ，ＹａｍａｇｕｃｈｉＹ，ＹａｎｇＸ，ＵｒａｋＲ，ＷｅｎｇＬ，ＣｈａｎｇＷＣ，ＷｒｉｇｈｔＳ，ＰａｌＳ，ＲｅｉｔｅｒＲＥ，ＷｕＡＭ，ＢｒｏｗｎＣＥ，ＦｏｒｍａｎＳＪ．Ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｓｉｇｎａｌｉｎｇｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓｔｕｍｏｒａｎｔｉｇｅｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅｏｆＣＡＲＴｃｅｌｌｓｔａｒｇｅｔｉｎｇＰＳＣＡ＋ｍｅｔａｓｔａｔｉｃｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１８；７（２）：ｅ１３８０７６４）のように、ＣＤ３３ＣＡＲレンチウイルスを用いて、ＣＤ１４＋及びＣＤ２５＋細胞（ｄＰＢＭＣ）を枯渇させたヒト健康ドナー由来の末梢血単核細胞、Ｔ（ｎ／ｍｅｍ）細胞、ＰａｎＴ細胞及び濃縮Ｔ細胞等の他の細胞種を形質導入した（ＥａｓｙＳｅｐＨｕｍａｎＴｃｅｌｌｉｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
トラッキングマーカーとしてＥＧＦＲｔを用いて、フローサイトメトリーにより、上記のようにＣＡＲ発現を示した。代表的なＣＤ３３ＣＡＲ構築物は、Ｔ細胞中で安定的に発現した（図２Ａ～２Ｃ）。細胞を形質導入してから７日後、ＣＤ３３ＣＡＲ構築物の取り込みの成功を標示するように細胞を抗ＥＧＦＲで染色した。ＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲは、形質導入後１５日で安定に発現された（図２Ｃ）。

〔実施例２〕ＡＭＬ細胞株におけるＣＤ３３の発現
以下に記載する試験では、様々なＡＭＬ細胞株におけるＣＤ３３の発現を検討した。
図３に示すように、ＣＤ３３の発現は、ＭＯＬＭ－１４及びＴＨＰ－１細胞株において最も高かった。
ＣＤ３３発現は、ＫＧ－１Ａ細胞株で中程度であった。
ＣＤ３３の発現は、Ｒａｊｉ細胞株で最も低かった。

〔実施例３〕ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞は生体外で強力かつ特異的な細胞殺傷機能とエフェクター機能を呈示する
ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞がＣＤ３３陽性がん細胞に対して選択的エフェクター機能及び殺傷活性を示すかどうかを判定するために、ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞をＣＤ３３陽性がん細胞又はＣＤ３３陰性がん細胞のいずれかの存在下で増殖させた。その後、ＣＤ１０７ａ脱顆粒レベル、細胞内ＩＦＮ－γ染色、及び死滅したがん細胞の比率を定量した。用いたアッセイの概略図を図４に示す。
ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイ用に、Ｍｏｃｋ又はＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞を、ゴルジストップ及びＣＤ１０７ａ抗体が補足された完全Ｘ－ＶＩＶＯ培地中で６時間、Ｅ：Ｔ比２：１で標的細胞と共培養した後、フローサイトメトリーを行った。ＣＤ３３陽性ＡＭＬ細胞株は、ＭＯＬＭ－１４、ＴＨＰ－１及びＫＧ－１Ａであった。用いたＣＤ３３－陰性細胞系はＲＡＪＩであった（図４Ａ）。細胞内ＩＦＮ－γ染色アッセイ用に、Ｍｏｃｋ又はＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞を、完全Ｘ－ＶＩＶＯ培地中、１：１のＥ：Ｔ比で４～６時間、標的細胞と共培養した。その後、ゴルジプラグを添加して、培養物を一晩インキュベーションした。次に、細胞を固定し、透過化し、ＩＦＮ－γ抗体で染色し、フローサイトメトリーにかけた（図４Ｂ）。再投与アッセイ用に、ＭｏｃｋＣＡＲＴ細胞又はＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞を、Ｅ：Ｔ比１：５、１：１０、及び１：２０で、標的細胞と共培養した。４８時間後、追加の腫瘍細胞を、１：５、１：１０、又は１：２０のＥ：Ｔに共培養ウェルに加え、４８時間のインキュベーションを繰り返し、追加の腫瘍細胞を、１：５、１：１０、又は１：２０のＥ：Ｔに共培養ウェルに加えた。さらに４８時間後、フローサイトメトリーを用いて、腫瘍細胞の％特異的溶解を測定した（図４Ｃ）。
ＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ３３－陰性ＲＡＪＩ細胞株と比較して、強力かつ特異的な、ＣＤ１０７ａ脱顆粒レベル、細胞内ＩＦＮ－γ染色、及びＣＤ３３－陽性ＡＭＬ細胞株に対する殺傷活性を提示した（図４Ａ－４Ｃ）。

〔実施例５〕マウスモデルの生体内で送達されたＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞が強力な抗腫瘍活性を示し、マウスに延命効果をもたらすことの検証
ＭＯＬＭ－１４モデルにおいて、ＣＤ３３陽性細胞を選択的に標的とするＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞の生体内での効能を評価するため、ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞を送達し、腫瘍の大きさ及び生存を経時的に評価した。
ＭＯＬＭ－１４細胞をレンチウイルスで形質導入してホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）を発現させることで、非侵襲的光学イメージングによる腫瘍増殖を追跡した。腫瘍静脈内注射の６日後に、マウスを、全身静脈内（ｉ．ｖ．）送達により、Ｍｏｃｋ又はＣＤ３３のＣＡＲＴ細胞（３×１０^６）で処理した（図５）。ＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲＴ細胞で静脈内送達により処理したマウスでは、迅速な抗腫瘍効果が観察され、処理後１～２週間で抗腫瘍反応が最高となった（図６Ａ）。マウスの抗腫瘍反応は３～４週間持続した。ＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲＴ細胞の送達は、マウスの生存を有意に延長した（図６Ｂ）。

〔実施例６〕デシタビンは生体外でＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞媒介性ＡＭＬ殺傷を増強する
デシタビンは、ＡＭＬ治療で用いられることが多いメチル化阻害剤（ＨＭＡ）である。まず、ＡＭＬ細胞株を１００ｎＭのデシタビン又はＤＭＳＯで２日間連続処理した。ＲＡＪＩ細胞株を陰性対照として用いた。デシタビン処理により、ＡＭＬ細胞上のＣＤ３３発現を上方制御することが観察された（図７）。
発明者らは、デシタビンがＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞媒介性ＡＭＬ殺傷を増強する可能性があると仮定した。生体外併用試験では、ＡＭＬ細胞株を１０ｎＭデシタビン又はＤＭＳＯで２日間連続処理した後、ＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲ又はＭｏｃｋＴ細胞をＥ：Ｔ比１：５０で処理した。さらに４８時間後、各群の殺傷比率（％）を、フローサイトメトリーを用いて定量した。ＡＭＬ細胞を標的として用いた生体外実験では、デシタビン、その後ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞で処理した群で強力な殺傷が見られた（図８）。
さらに、ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞と併用したデシタビンによる治療後に生存した残存ＡＭＬ細胞において、ＰＤ－Ｌ１及びＣＬＬ－１のＭＦＩ発現を検出した。ＰＤ－Ｌ１（図９Ａ）及びＣＬＬ－１（図９Ｂ）の発現レベルは、生体外併用治療により、有意に高まった。

〔実施例７〕デシタビンは生体内でＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞の抗白血病効果を改善する
ＮＳＧマウスに１×１０^６個のＭＯＬＭ－１４－ｆｆｌｕｃ細胞を０日目に静脈内投与した。１日目～５日目まで、デシタビン０．５ｍｇ／ｋｇ／日又はＰＢＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により連続５日間投与した。６日目に、マウスに、１×１０^６個のＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲ（配列番号３０）又はＭｏｃｋＴ細胞を静注により投与した（図１０）。
生体外で得られた知見と一致して、デシタビンと、ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞との併用により、生体内で白血病負荷（図１１Ａ）が有意に低下し、全生存期間が延びた（図１１Ｂ）。

〔実施例８〕ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断によりＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞の効能が高まる
プログラムされた細胞死－１（ＰＤ－１）／ＰＤ－Ｌ１を標的とするチェックポイント遮断は、免疫系治療に対する耐性機序に関与している。１０ｎＭデシタビン及びＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲ（配列番号３０）Ｔ細胞の１：５０Ｅ：Ｔ比での処理において生存した残留ＡＭＬ細胞では、ＰＤ－Ｌ１発現が優位に高まった（図１２）。抗ＰＤ－１抗体（１０μｇ／ｍＬ）は、Ｅ：Ｔ比１：７５でＣＤ３３（ＣＤ８）ＣＡＲ（配列番号３０）Ｔ細胞の抗ＡＭＬの効能を有意に増強することが見出された（図１３）。

他の実施形態
本発明をその詳細な説明と組み合わせて記載してきたが、上記の説明は例示を意図し、付随する特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を限定することを意図しないことが理解されるであろう。他の態様、利点、及び変更は特許請求の範囲内に内在する。
全ての参考文献は、全ての目的のためにその全体が本明細書に援用される。

Claims

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むポリペプチドをコードする核酸分子であって、前記ＣＡＲは、配列番号３０で表されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％が同一であるか、又は配列番号３１で表されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％が同一である、アミノ酸配列を含む、核酸分子。
請求項１に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
請求項１に記載の核酸分子を含む、ウイルスベクター。
請求項１に記載の核酸分子を含むベクターによって形質導入された、ヒトＴ細胞の集団。
セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブメモリーＴ細胞、ｐａｎＴ細胞、ＮＫ細胞、又はＣＤ２５＋細胞及びＣＤ１４＋細胞が実質的に除かれている末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む、請求項４に記載のヒトＴ細胞集団。
請求項１に記載の核酸分子を含むベクターによって形質導入された自己又は同種異系のヒトＴ細胞の集団の投与を含む、患者の白血病を治療する方法であって、前記白血病はＣＤ３３を発現する細胞を含む、方法。
キメラ抗原受容体は、局所又は全身に投与される、請求項６に記載の方法。
ＣＤ３３を発現する細胞は、がん性Ｔ細胞又はＴ調節性細胞である、請求項６記載の方法。
キメラ抗原受容体は、単回投与されるか又は反復投与される、請求項６に記載の方法。
患者は、自己又は同種異系のヒトＴ細胞の集団の投与前、又はそれと同時に、メチル化阻害剤が投与される、請求項６記載の方法。
メチル化阻害剤は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項１０記載の方法。
メチル化阻害剤は、５－アザシチジン及びデシタビンから選択される、請求項６記載の方法。
請求項１に記載の核酸分子を含む免疫細胞の投与を含む、患者のがんを治療する方法であって、前記がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性新生物；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；及び芽球性形質細胞様樹状細胞新生物から選択される血液がんである、方法。
請求項１に記載の核酸分子を含む免疫細胞を患者に投与することを含む、がんに罹患した患者における骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を減少させる方法。
がんは固形腫瘍である、請求項１４に記載の方法。
ＣＤ３３ＣＡＲＴ細胞を調製する方法であって、以下の：
自己又は同種異系のヒトＴ細胞の集団を提供する工程；かつ
Ｔ細胞を請求項１に記載の核酸分子を含むベクターにより形質導入する工程；
を含む、方法。