JP2022521240A - Ｂａｆｆ－ｒ／ｃｄ１９を標的としたキメラ抗原受容体修飾ｔ細胞とその使用 - Google Patents
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Abstract
ＢＡＦＦ－Ｒ及びＣＤ１９をともに標的とするキメラ抗原受容体及びそれを用いる方法が記載される。
Description
腫瘍特異的Ｔ細胞を用いた免疫療法は、遺伝子操作されたＴ細胞を用いた療法も含めて、抗腫瘍治療について研究されている。
ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、多くのＢ－ＡＬＬ及びリンパ腫患者に有効である。しかしながら、ＣＤ１９を標的としたＣＡＲ－Ｔ療法を逃れた抗原欠損変異体による再発が、患者の最大２０～３０％に起こりうる。ＣＤ１９陰性Ｂ－ＡＬＬ患者では臨床反応が達成されたことから明らかなように、ＣＤ２２ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、ＣＤ１９抗原喪失からの再発の克服のための代替戦略の１つとして提案されている。しかし、ＣＤ２２の発現密度は、特に混合型白血病（ＭＬＬ）では変化し、その発現はＣＤ２２標的療法後に減少することが報告された。
本明細書には、Ｂ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）及びＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞を用いて、Ｂ－ＡＬＬ及びリンパ腫を含むＢ細胞悪性腫瘍を治療する方法が記載される。ある場合、単一のＣＡＲはＢＡＦＦ－ＲとＣＤ１９をともに標的とする。ＢＡＦＦ－Ｒ及びＣＤ１９を共に標的とする単一のＣＡＲの場合、細胞外標的化部分には、一方の標的に対するｓｃＦｖが他方のｓｃＦｖに先行するタンデムフォーマットか、又は２つの標的の一方に対するｓｃＦｖが他方の標的に対するｓｃＦｖのＶＬ及びＶＨドメインの間に配置されるループフォーマットがあってよい。これらのフォーマットのいずれにおいても、当該ＣＡＲは、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８膜貫通ドメイン）、共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ共刺激ドメイン）及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。当該ＣＡＲはまた、例えば、ｓｃＦｖドメインと膜貫通ドメインとの間、膜貫通ドメインと補助刺激ドメインとの間、及び／又は補助刺激ドメインとＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインとの間に、スペーサー配列を含んでよい。
本明細書には、ＢＡＦＦ－Ｒ及びＣＤ１９をともに標的化されるキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が記載され、当該キメラ抗原受容体は、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＢＡＦＦ－Ｒ及びＣＤ１９を標的とする標的化ドメイン；スペーサードメイン；膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
様々な実施形態では、（１）当該標的化ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端まで：ａ）ＢＡＦＦ－Ｒを標的化したｓｃＦｖ及びＣＤ１９を標的化したｓｃＦｖ；又は、ｂ）ＣＤ１９を標的化したｓｃＦｖ及びＢＡＦＦ－Ｒを標的化したｓｃＦｖを含み；（２）当該標的化ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端まで：ａ）ＣＤ１９ ｓｃＦｖのＶＬドメイン；ＢＡＦＦ－Ｒを標的化したｓｃＦｖ；及び、ＣＤ１９ ｓｃＦｖのＶＨ；又は、（ｂ）ＣＤ１９ ｓｃＦｖのＶＨドメイン；ＢＡＦＦ－Ｒを標的化したｓｃＦｖ；及び、ＣＤ１９ ｓｃＦｖのＶＬを含み、かつ、（３）当該標的化ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端まで：ａ）ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖのＶＬドメイン；ＣＤ１９を標的化したｓｃＦｖ；及び、ＢＡＦＦＦのＶＨ；又は、（ｂ）ＢＡＦＦのＶＨドメインを含む。－Ｒ ｓｃＦｖ；ＣＤ１９を標的とするｓｃＦｖ；及びＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖのＶＬを含む。
本明細書にはまた、ＢＡＦＦ－Ｒを標的とするキメラ抗原受容体とＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体をともにコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が記載され、ここで、ＢＡＦＦ－Ｒを標的とするキメラ抗原受容体は、アミノ末端からカルボキシ末端まで：ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ；スペーサードメイン；膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体は、アミノ末端からカルボキシ末端まで：ＣＤ１９ ｓｃＦｖ；スペーサードメイン；膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
様々な実施形態では、共刺激ドメインは、アミノ酸の１～５個が修飾されたＣＤ２８共刺激ドメイン又はその変異体、アミノ酸の１～５個が修飾された４－１ＢＢ同時刺激ドメイン又はその変異体、及びアミノ酸の１～５個が修飾されたＯＸ４０共刺激ドメイン又はその変異体からなる群から選択され、膜貫通ドメインは、アミノ酸の１～５個が修飾されたＣＤ４膜貫通ドメイン又はその変異体、アミノ酸の１～５個が修飾されたＣＤ８膜貫通ドメイン又はその変異体、アミノ酸の１～５個が修飾されたＣＤ２８膜貫通ドメイン又はその変異体、及びアミノ酸の１～５個が修飾されたＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又はその変異体から選択され、並びにスペーサードメインは、ＩｇＧ４ヒンジ（Ｓ→Ｐ）、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）＋リンカー、ＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ８ヒンジ－４８ａａ、ＣＤ８ヒンジ－４５ａａ、ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）、ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）、ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）、ＩｇＧ４（ＣＨ３）、及びアミノ酸の１～５個が修飾されたＩｇＧ４ヒンジ（Ｓ→Ｐ）、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ（Ｓ２２８Ｐ）＋リンカー、ＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ８ヒンジ－４８ａａ、ＣＤ８ヒンジ－４５ａａ、ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）、ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）、ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）、及びＩｇＧ４（ＣＨ３）の各変異体からなる群から選択される。
様々な実施形態では、（１）ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、当該軽鎖可変領域は、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号１）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号２）及びＣＤＲ Ｌ３（配列番号３）を含み、当該重鎖可変領域は、ＣＤＲ Ｈ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｈ２（配列番号５）及びＣＤＲ Ｈ３（配列番号６）を含み（２）ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、当該軽鎖可変領域は、ＣＤＲ Ｌ１（配列番号７）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号８）及びＣＤＲ Ｌ３（配列番号９）を含み、当該重鎖可変領域は、ＣＤＲ Ｈ１（配列番号１０）、ＣＤＲ Ｈ２（配列番号１１）及びＣＤＲ Ｈ３（配列番号１１）を含む。（３）の ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖは： Ｃｈｉ９０ ＨＣ、Ｈｕ９０ ＨＣ－１、Ｈｕ９０ ＨＣ－２、Ｈｕ９０ ＨＣ－３、Ｃｈｉ５５ ＨＣ、Ｈｕ５５ ＨＣ－１、Ｈｕ５５ ＨＣ－２、及びＨｕ５５ ＨＣ－３から選択される重鎖可変ドメイン、及びＣｈｉ９０ ＬＣ、Ｈｕ９０ ＬＣ－１、Ｈｕ９０ ＬＣ－２、Ｈｕ９０ ＬＣ－３、Ｃｈｉ５５ ＬＣ、Ｈｕ５５ ＬＣ－１、Ｈｕ５５ ＬＣ－２、及びＨｕ５５ ＬＣ－３から選択される軽鎖可変ドメインを含み；（４）ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖは、配列番号１７～２０及び２５～２８から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含み；（５）ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖは、配列番号１３－１６及び２１－２４から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含み；（６）ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、以下のアミノ酸配列：ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＱＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣ ＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴ（配列番号３０）を含むＶＬ及びＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧ ＳＹＡＭＤＹＷＧＱＱＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号３１）を含むＶＨを含む。
本明細書にはまた、上記の核酸分子の１つ以上を含むベクターも記載される。様々な実施形態では、当該ベクターはレンチウイルスベクターである。本明細書にはまた、記載のベクターによって形質導入されたヒトＴ細胞の集団も記載される。
本明細書にはまた、ヒトＴ細胞の集団を含む組成物の治療有効量を被験体に投与することを含む、それが必要な被験体のがんの治療方法も記載される。本方法の様々な実施形態では、がんは、リンパ腫、白血病又は骨髄腫であり；リンパ腫は、マントル細胞リンパ腫、濾胞性大B細胞型リンパ腫、辺縁帯リンパ腫又はバーキットリンパ腫であり；白血病は、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病又は有毛細胞白血病であり；骨髄腫は、多発性骨髄腫であり；Ｔ細胞の集団は、患者について自家性又は同種異系性であり；かつヒトＴ細胞の集団は、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞を含む。
ある実施形態では、ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖとしては、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域があげられ、軽鎖可変領域としては、配列番号７で表されるＣＤＲ Ｌ１、配列番号８で表されるＣＤＲ Ｌ２、及び配列番号９で表されるＣＤＲ Ｌ３があげられ、重鎖可変領域としては、配列番号１０に示すＣＤＲ Ｈ１、配列番号１１に示すＣＤＲ Ｈ２、及び配列番号１２に示すＣＤＲ Ｈ３があげられる。実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
ある実施形態では、ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖとしては、配列番号１又は７のＣＤＲ Ｌ１、配列番号２又は８のＣＤＲ Ｌ２、配列番号３又は９のＣＤＲ Ｌ３、配列番号４又は１０のＣＤＲ Ｈ１、配列番号５又は１１のＣＤＲ Ｈ２、及び配列番号７又は１３のＣＤＲ Ｈ３があげられる。
ある実施形態では、ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖの部分としては、以下の：モノクローナル抗体Ｈ９０の軽鎖可変ドメイン、モノクローナル抗体Ｈ９０の重鎖可変ドメイン、又はモノクローナル抗体Ｈ５５の軽鎖可変ドメイン、及びモノクローナル抗体Ｈ５５の重鎖可変ドメインがあげられる。重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、５～１００個、１０～５０個、又は１０～２０個のアミノ酸（例えば、ＧＧＧＧSＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のリンカーで連結することができる。
ある実施形態では、ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖは、以下の：ａ）モノクローナル抗体Ｈ９０の軽鎖可変ドメインのヒト化改変体、及びモノクローナル抗体Ｈ９０の重鎖可変ドメインのヒト化改変体；又はｂ）モノクローナル抗体Ｈ５５の軽鎖可変ドメインのヒト化改変体、及びモノクローナル抗体Ｈ５５の重鎖可変ドメインのヒト化改変体を含む。重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインは、１０～２０個のアミノ酸（例えば、ＧＧＧＧSＧＧＧＧSＧＧＧＧＳ）のリンカーで連結することができる。ある場合では、Ｈ９０軽鎖可変ドメインのヒト化改変体は、Ｈｕ９０ ＬＣ－１、Ｈｕ９０ ＬＣ－２及びＨｕ９０ ＬＣ－３から選択され、Ｈ９０重鎖可変ドメインのヒト化改変体は、Ｈｕ９０ ＨＣ－１、Ｈｕ９０ ＨＣ－２及びＨｕ９０ ＨＣ－３から選択される。ある場合では、Ｈ５５軽鎖可変ドメインのヒト化改変体は、Ｈｕ５５ ＬＣ－１、Ｈｕ５５ ＬＣ－２及びＨｕ５５ ＬＣ－３から選択され、Ｈ５５重鎖可変ドメインのヒト化改変体は、Ｈｕ５５ ＨＣ－１、Ｈｕ５５ ＨＣ－２及びＨｕ９０ ＨＣ－３から選択される。
実施形態では、ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ軽鎖可変領域としては、カバット位置７に対応する位置にセリンを含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、カバット位置８に対応する位置にプロリンを含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、カバット位置１５に対応する位置にバリンを含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、カバット位置２２に対応する位置にスレオニンを含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、カバット位置２４に対応する位置にグルタミンを含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、カバット位置４１に対応する位置にグリシンを含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、カバット位置４２に対応する位置にリシンを含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、カバット位置４３に対応する位置にアラニンを含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、カバット位置４４に対応する位置にプロリンを含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、カバット位置５６に対応する位置にスレオニンを含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、カバット位置７２に対応する位置にスレオニンを含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、カバット位置７３に対応する位置にフェニルアラニンを含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、カバット位置７９に対応する位置にグルタミンを含む。実施形態では、軽鎖可変領域は、カバット位置１０４に対応する位置にバリンを含む。
実施形態では、ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ軽鎖可変領域は、カバット位置７に対応する位置にセリン、カバット位置８に対応する位置にプロリン、カバット位置１５に対応する位置にバリン、カバット位置２２に対応する位置にスレオニン、カバット位置２４に対応する位置にグルタミン若しくはセリン、カバット位置４１に対応する位置にグリシン、カバット位置４２に対応する位置にリシン、カバット位置４３に対応する位置にアラニン若しくはスレオニン、カバット位置４４に対応する位置にプロリン、カバット位置５６に対応する位置にスレオニン、カバット位置７２に対応する位置にスレオニン、フェニルアラニン若しくはリシン、カバット位置７３に対応する位置にグルタミン、カバット位置７９に対応する位置にグルタミン、又はカバット位置１０４に対応する位置にバリンを含む。
実施形態では、ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ軽鎖可変領域は、カバット位置７に対応する位置にセリン、カバット位置８に対応する位置にプロリン、カバット位置１５に対応する位置にバリン、カバット位置２２に対応する位置にスレオニン、カバット位置２４に対応する位置にグルタミン若しくはセリン、カバット位置４１に対応する位置にグリシン、カバット位置４２に対応する位置にリシン、カバット位置４３に対応する位置にアラニン若しくはスレオニン、カバット位置４４に対応する位置にプロリン、カバット位置５６に対応する位置にスレオニン、カバット位置７２に対応する位置にスレオニン、フェニルアラニン若しくはリシン、カバット位置７３に対応する位置にグルタミン、カバット位置７９に対応する位置にグルタミン、又はカバット位置１０４に対応する位置にバリンを含む結合フレームワーク領域残基を含む。
実施形態では、ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ重鎖可変領域は、カバット位置１０に対応する位置にスレオニン又はアラニンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置１１に対応する位置にリシンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置１２に対応する位置にバリンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置１５に対応する位置にスレオニンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置１９に対応する位置にスレオニンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置２３に対応する位置にスレオニンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置４１に対応する位置にプロリンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置４４に対応する位置にアラニンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置６１に対応する位置にプロリン又はスレオニンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置６６に対応する位置にアルギニンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置７０に対応する位置にスレオニンを含む。実施形態では、重鎖可変領域はカバット位置７５に対応する位置にリシンを含む。実施形態では、重鎖可変領域はカバット位７９に対応する位置にバリンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置８１に対応する位置にスレオニンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置８２に対応する位置にメチオニンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置８２Ｂに対応する位置にアスパラギンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置８２Ｃに対応する位置にメチオニンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置８４に対応する位置にプロリンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置８５に対応する位置にバリンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置１０８に対応する位置にリシンを含む。実施形態では、重鎖可変領域は、カバット位置１０９に対応する位置にバリンを含む。
実施形態では、ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ重鎖可変領域は、カバット位置１０に対応する位置にスレオニン又はアラニン、カバット位置１１に対応する位置にリジン、カバット位置１２に対応する位置にバリン、カバット位置１５に対応する位置にスレオニン、カバット位置１９に対応する位置にスレオニン、カバット位置２３に対応する位置にスレオニン、カバット位置４１に対応する位置にプロリン、カバット位置４４に対応する位置にアラニン、カバット位置６１に対応する位置にプロリン、セリン又はスレオニン、カバット位置６６に対応する位置にアルギニン、カバット位置７０に対応する位置にスレオニン、カバット位置７５に対応する位置にリシン、カバット位置７９に対応する位置にバリン、位置８１に対応する位置にスレオニン又はリシン、カバット位置８２に対応する位置にメチオニン、カバット位置８２Ｂに対応する位置にアスパラギン、カバット位置８２Ｃに対応する位置にメチオニン、カバット位置８４に対応する位置にプロリン、カバット位置８５に対応する位置にバリン、カバット位置１０８に対応する位置にリシン、又はカバット位置１０９に対応する位置にバリンを含む。
実施形態では、ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ重鎖可変領域は、カバット位置１０に対応する位置にスレオニン又はアラニン、カバット位置１１に対応する位置にリジン、カバット位置１２に対応する位置にバリン、カバット位置１５に対応する位置にスレオニン、カバット位置１９に対応する位置にスレオニン、カバット位置２３に対応する位置にスレオニン、カバット位置４１に対応する位置にプロリン、カバット位置４４に対応する位置にアラニン、カバット位置６１に対応する位置にプロリン、セリン又はスレオニン、カバット位置６６に対応する位置にアルギニン、カバット位置７０に対応する位置にスレオニン、カバット位置７５に対応する位置にリシン、カバット位置７９に対応する位置にバリン、位置８１に対応する位置にスレオニン又はリシン、カバット位置８２に対応する位置にメチオニン、カバット位置８２Ｂに対応する位置にアスパラギン、カバット位置８２Ｃに対応する位置にメチオニン、カバット位置８４に対応する位置にプロリン、カバット位置８５に対応する位置にバリン、カバット位置１０８に対応する位置にリシン、又はカバット位置１０９に対応する位置にバリンを含む結合フレームワーク領域残基を含む。
ＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９二重ＣＡＲ及びＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９二シストロン性ＣＡＲは、様々なＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ及びＣＤ１９ ｓｃＦｖのいずれかを用いることができ、第一のｓｃＦｖが第二のｓｃＦｖの可変ドメインの間に位置するＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９二重ＣＡＲの場合、様々なＶＬ及びＶＨのいずれかを用いることができる。
図１は、ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖがＣＤ１９ ｓｃＦｖのアミノ末端であり、ＣＤ１９ ｓｃＦｖがＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖのアミノ末端であるタンデム構築物の２つの例の概略図である。また、ＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ２９二重ＣＡＲ用のループ構築体の一例を示す。この実施例では、ＢＡＦＦ－Ｒは、ＣＤ１９ ＶＬ（ｓｃＦｖのアミノ末端）とＣＤ１９ ＶＨドメイン（ｓｃＦｖのカルボキシ末端）の間に位置する。１つの細胞が２つのＣＡＲを発現し、１つはＢＡＦＦ－Ｒを標的とし、もう１つがＣＤ１９を標的とする、二シストロン性構築物の例もまた、示される。
ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ配列
ＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９二重ＣＡＲで用いられるＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ配列は、２つのモノクローナル抗体、クローン９０及びクローン５５から誘導することができる。これらは、米国ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３６１８１に詳細に記載されている。例えば、ＶＬは、以下に記載されるＣ９０ ＣＤＲ配列又はＣ５５ ＣＤＲ配列を含んでよい。
ＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９二重ＣＡＲで用いられるＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ配列は、２つのモノクローナル抗体、クローン９０及びクローン５５から誘導することができる。これらは、米国ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３６１８１に詳細に記載されている。例えば、ＶＬは、以下に記載されるＣ９０ ＣＤＲ配列又はＣ５５ ＣＤＲ配列を含んでよい。
Ｃ９０ ＣＤＲ Ｌ１： ＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦ （配列番号１）
Ｃ９０ ＣＤＲ Ｌ２： ＡＡＳ （配列番号２）
Ｃ９０ ＣＤＲ Ｌ３： ＱＱＳＫＥＶＰＷＴ （配列番号３）
Ｃ９０ ＣＤＲ Ｈ１： ＧＤＳＩＴＳＧＹ （配列番号４）
Ｃ９０ ＣＤＲ Ｈ２： ＩＳＹＳＧＳＴ （配列番号５）
Ｃ９０ ＣＤＲ Ｈ３： ＡＳＰＮＹＰＦＹＡＭＤＹ （配列番号６）
Ｃ５５ ＣＤＲ Ｌ１： ＱＤＩＳＮＹ （配列番号７）
Ｃ５５ ＣＤＲ Ｌ２： ＹＴＳ （配列番号８）
Ｃ５５ ＣＤＲ Ｌ３： ＦＳＥＬＰＷＴ （配列番号９）
Ｃ５５ ＣＤＲ Ｈ１： ＧＦＳＬＳＴＳＧＭＧ （配列番号１０）
Ｃ５５ ＣＤＲ Ｈ２： ＩＷＷＤＤＤＫ （配列番号１１）
Ｃ５５ ＣＤＲ Ｈ３： ＡＲＳＦＧＹＧＬＤＹ （配列番号１２）
二重ＣＡＲのＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖで用いるのに適する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）には、モノクローナル抗体クローン９０（ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３６１８１により詳細に記載されている）に由来する以下の重鎖可変ドメインがある。これらのうち、Ｈｕ９０ ＨＣ－１、ＨＣ－２及びＨＣ－３はヒト化されている。
Ｃｈｉ９０ ＨＣ：
（配列番号１３）
Ｈｕ９０ ＨＣ－１：
（配列番号１４）
Ｈｕ９０ ＨＣ－２：
（配列番号１５）
Ｈｕ９０ ＨＣ－３：
（配列番号１６）
二重ＣＡＲのＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖで用いるのに適する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）には、モノクローナル抗体クローン９０（ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３６１８１により詳細に記載されている）に由来する以下の重鎖可変ドメインがある。これらのうち、Ｈｕ９０ ＬＣ－１、ＬＣ－２及びＬＣ－３はヒト化されている。
Ｃｈｉ９０ ＬＣ：
（配列番号１７）
ＨｕＣ９０ ＬＣ－１：
（配列番号１８）
Ｈｕ９０ ＬＣ－２：
（配列番号１９）
ＨｕＣ９０ ＬＣ－３：
（配列番号２０）
二重ＣＡＲのＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖで用いるのに適する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の中には、モノクローナル抗体クローン５５（ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３６１８１により詳細に記載されている）に由来する以下の重鎖可変ドメインもある。これらのうち、Ｈｕ５５ ＨＣ－１、ＨＣ－２及びＨＣ－３はヒト化されている。
Ｃｈｉ５５ ＨＣ：
（配列番号２１）
Ｈｕ５５ ＨＣ－１：
（配列番号２２）
Ｈｕ５５ ＨＣ－２：
（配列番号２３）
Ｈｕ５５ ＨＣ－３：
（配列番号２４）
また、二重ＣＡＲのＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖで用いるのに適する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の中には、モノクローナル抗体クローン９０（ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３６１８１により詳細に記載されている）に由来する以下の重鎖可変ドメインがある。これらのうち、Ｈｕ５５ ＬＣ－１、ＬＣ－２及びＨＣ－３はヒト化されている。
Ｃｈｉ５５ ＬＣ：
（配列番号２５）
Ｈｕ５５ ＬＣ－１：
（配列番号２６）
Ｈｕ５５ ＬＣ－２：
（配列番号２７）
Ｈｕ５５ ＬＣ－３：
（配列番号２８）
ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬドメインを修飾することができる。従って、ｓｃＦｖ中のＨｕ９０ ＬＣ－１、Ｈｕ９０ ＬＣ－２、Ｈｕ９０ ＬＣ－３、Ｈｕ９０ ＨＣ－１、Ｈｕ９０ ＨＣ－２及びＨｕ９０ ＨＣ－３、Ｈｕ５５ ＬＣ－１、Ｈｕ５５ ＬＣ－２、Ｈｕ５５ ＬＣ－３、Ｈｕ５５ ＨＣ－１、Ｈｕ５５ ＨＣ－２及びＨｕ９０ ＨＣ－３の各々は、１、２、３、４又は５個の単一アミノ酸置換を含むことができる。ある場合、置換はＣＤＲではなくフレームワーク領域（ＦＲ）に限定される。ある場合の置換は、保存的置換である。
ＣＤＲ及びＦＲの位置は、カバット番号付けシステム（Ｋａｂａｔら、免疫学的に注目されるタンパク質の塩基配列第５版米国保健社会福祉省、米国印刷局（１９９１）））で特定される。同様に、抗体の軽鎖又は重鎖内の個々の残基によって占有される位置は、カバット番号付けシステムによって特定されうる。従って、ヒト化抗体のヒト化軽鎖及びヒト化重鎖内での結合に必要な残基の位置は、当技術分野で周知のように、カバット番号付けシステムによる残基の位置で特定することができる。上記のように、ヒト化抗体は、ドナー抗体（例えば、マウス）由来のＣＤＲ及びヒト抗体由来の可変領域フレームワーク（ＦＲ）がある抗体でありうる。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ヒト化抗体中のＣＤＲを所定の位置に保持するといわれる。これらの領域は、アミノ末端から順に、軽鎖についてはＦＲ Ｌ１、ＦＲ Ｌ２、ＦＲ Ｌ３及びＦＲ Ｌ４と、重鎖についてはＦＲ Ｈ１、ＦＲ Ｈ２、ＦＲ Ｈ３及びＦＲ Ｈ４と、命名される。
ＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列
ＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９二重ＣＡＲでは、ＣＤ１９を標的とする様々なｓｃＦｖを用いることができる。
ＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９二重ＣＡＲでは、ＣＤ１９を標的とする様々なｓｃＦｖを用いることができる。
ＦＭＣ６３ ｓｃＦｖ：
（配列番号２９）
ＦＭＣ６３ ＶＬ
（配列番号３０）
ＦＭＣ６３ ＶＨ：
（配列番号３１）
ＣＤ１９と結合するさらなるｓｃＦｖは、米国特許出願公開第２０１６／０１５２７２３号及び国際公開第２０１６／０３３５７０号に記載されている。
スペーサー領域
本明細書に記載される二重ＣＡＲ及び二シストロン性ＣＡＲは、標的化ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサーを含むことができる。様々な異なるスペーサーを用いることができる。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも一部、例えば、ヒトＦｃ領域のヒンジ部分、又はＣＨ３ドメイン若しくはその変異体を含む。以下の表１は、本明細書に記載されるＣＡＲで用いられうる様々なスペーサーを提供する。
表１：スペーサーの例
本明細書に記載される二重ＣＡＲ及び二シストロン性ＣＡＲは、標的化ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサーを含むことができる。様々な異なるスペーサーを用いることができる。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも一部、例えば、ヒトＦｃ領域のヒンジ部分、又はＣＨ３ドメイン若しくはその変異体を含む。以下の表１は、本明細書に記載されるＣＡＲで用いられうる様々なスペーサーを提供する。
表１：スペーサーの例
いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域、すなわち、免疫グロブリンのＣＨ１及びＣＨ２ドメインの間にある配列、例えば、ＩｇＧ４ Ｆｃヒンジ又はＣＤ８ヒンジの全部又は一部を含む。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメイン又はＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインをともに含む。免疫グロブリン由来の配列は、１個以上のアミノ酸修飾、例えば、１、２、３、４又は５個の置換、例えば、オフターゲット結合を低下させる置換を含むことができる。
ヒンジ／リンカー領域はまた、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号３４）又はＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３３）を有するＩｇＧ４ヒンジ領域を含むことができる。
ヒンジ／リンカーはまた、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号３３）、続いてリンカー配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号３２）、続いて以下のＩｇＧ４ ＣＨ３配列
（配列番号４１）を含むことができる。従って、リンカー／スペーサー領域全体は、以下の配列：
（配列番号＿）という配列を含むことができる。ある場合、当該スペーサーには、配列番号＿＿と比較して、１、２、３、４、又は５個の単一アミノ酸変化（例えば、保存的変化）がある。ある場合、ＩｇＧ４ Ｆｃヒンジ／リンカー領域は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）による結合を低下させるように、２つの位置（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）で変異される。
膜貫通ドメイン
本明細書中に記載される二重ＣＡＲ及び二シストロン性ＣＡＲには、様々な膜貫通ドメインが用いられうる。表２は、適当な膜貫通ドメインの例を含む。スペーサー領域が存在する場合、膜貫通ドメインは、スペーサー領域のカルボキシ末端に位置する。
表２：膜貫通ドメインの例
本明細書中に記載される二重ＣＡＲ及び二シストロン性ＣＡＲには、様々な膜貫通ドメインが用いられうる。表２は、適当な膜貫通ドメインの例を含む。スペーサー領域が存在する場合、膜貫通ドメインは、スペーサー領域のカルボキシ末端に位置する。
表２：膜貫通ドメインの例
共刺激ドメインとＣＤ３ゼータドメイン
共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと共に用いるのに適したいかなるドメインでありうる。ある場合、共刺激ドメインは、以下の配列：
（配列番号５２：ＬＬからＧＧへのアミノ酸変化に二重下線を付した）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一である配列を含むＣＤ２８共刺激ドメインである。ある場合、ＣＤ２８共シグナル伝達ドメインには、配列番号２３と比較して、５個のアミノ酸変化（好ましくは、保存的であり、好ましくは、下線を付したＧＧ配列中に存在しない）のうち、１、２、３、４個がある。ある場合、共シグナル伝達ドメインは、以下の配列：
（配列番号５４）と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％と同一又は同一である配列を含む４－１ＢＢの共シグナル伝達ドメインである。ある場合、当該４－１ＢＢ共シグナル伝達ドメインには、配列番号２４と比較して１、２、３、４又は５個のアミノ酸変化（好ましくは保存的）がある。
共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと共に用いるのに適したいかなるドメインでありうる。ある場合、共刺激ドメインは、以下の配列：
当該共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの間に位置する。表３は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの配列と共に、適当な共刺激ドメインの例を含む。
表３： ＣＤ３ζドメインと共刺激ドメインの例
表３： ＣＤ３ζドメインと共刺激ドメインの例
様々な実施形態では、共刺激ドメインは、表３に示される共刺激ドメイン又は１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸修飾があるその変異体、１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸修飾があるＣＤ２８共刺激ドメイン又はその変異体、１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸修飾がある４－１ＢＢ共刺激ドメイン又はその変異体、及び１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸修飾があるＯＸ４０共刺激ドメイン又はその変異体からなる群から選択される。特定の実施形態では、４－１ＢＢ共刺激ドメイン又はその変異体には、１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸修飾がある。ある実施形態では、２つの共刺激ドメイン、例えば、１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸修飾（例えば、置換）があるＣＤ２８共刺激ドメイン又はその変異体、及び１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸修飾（例えば、置換）がある４－１ＢＢ共刺激ドメイン又はその変異体が存在する。様々な実施形態では１～５個（例えば、１又は２個）のアミノ酸修飾は置換である。当該共刺激ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのアミノ末端であり、ある場合、２～１０からなる短いリンカー、例えば、３つのアミノ酸（例えば、ＧＧＧ）が、共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの間に位置している。
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと共に用いるのに適したいかなるドメインでありうる。ある場合、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、以下の配列：
（配列番号５１）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、同一又は同一である配列を含む。ある場合、ＣＤ３ζシグナル伝達には、配列番号５１と比較して、５個のアミノ酸変化のうち１、２、３、４個（好ましくは保存的）がある。
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと共に用いるのに適したいかなるドメインでありうる。ある場合、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、以下の配列：
切断型上皮成長因子受容体
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの後には、リボソームスキップ配列（例えば、ＬＥＧＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲ；配列番号５６）及び、以下の配列：
（配列番号５７と）少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％と同一又は同一である配列を有する切断型ＥＧＦＲが続くことができる。ある場合、切断型ＥＧＦＲには、配列番号５７と比較して、５個のアミノ酸変化のうち１、２、３、４個（好ましくは保存的）がある。
ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの後には、リボソームスキップ配列（例えば、ＬＥＧＧＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰＲ；配列番号５６）及び、以下の配列：
（配列番号５７と）少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％と同一又は同一である配列を有する切断型ＥＧＦＲが続くことができる。ある場合、切断型ＥＧＦＲには、配列番号５７と比較して、５個のアミノ酸変化のうち１、２、３、４個（好ましくは保存的）がある。
「アミノ酸修飾」とは、タンパク質又はペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を意味する。「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ペプチド又はタンパク質配列中の特定の位置のアミノ酸を別のアミノ酸で置換することをいう。当該置換により、非保存的様式（すなわち、コドンを、特定の大きさや特徴を持つアミノ酸のグループに属するアミノ酸から、他のグループに属するアミノ酸へと変化させることにより）で、又は保存的様式（すなわち、コドンを、特定の大きさや特徴を持つアミノ酸のグループに属するアミノ酸と同じグループに属するアミノ酸に変化させることにより）で、得られたタンパク質中のアミノ酸を変化させることができる。そのような保守的な変化は、一般に、結果として生じるタンパク質の構造及び機能の変化がより小さい。以下は、アミノ酸の様々な群：１）非極性Ｒ基があるアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；２）非荷電極性Ｒ基があるアミノ酸：グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；３）荷電極性Ｒ基があるアミノ酸（ｐＨ ６．０で負に荷電）：アスパラギン酸、グルタミン酸；４）塩基性アミノ酸（ｐＨ ６．０で正に荷電）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ ６．０で正に荷電）；の例示である。他の群はフェニル基があるアミノ酸、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンである。
ＣＡＲは、図９（配列番号２９～４０）に示された成熟アミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一であるか、又は同一である配列を含むことができ、ＧＭＣＳＦＲａシグナル配列を含むか、又は含まないか、並びにＴ２Ａリボソームスキップ配列及び切断型ＥＧＦＲｔを含むか、又は含まないかのいずれかである。
ある場合、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後にＴ２Ａリボソームスキップ配列と、細胞質シグナル伝達尾部欠損切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）が続くベクターを用いてＣＡＲを産生することができる。この配列では、ＥＧＦＲｔの共発現により、遺伝子改変細胞が正確に測定できる、遺伝子改変細胞の正の選択、並びに養子移入後の治療用Ｔ細胞の生体内での効率的な細胞追跡ができる不活性な非免疫原性表面マーカーを提供する。サイトカインストーム及び標的外毒性を回避するための増殖の効率的な制御は、Ｔ細胞免疫療法の成功の重要なハードルである。ＣＡＲレンチウイルスベクターに取り込まれたＥＧＦＲｔは、治療関連毒性の場合にＣＡＲ＋ Ｔ細胞を除去する自殺遺伝子として作用することができる。
本明細書中に記載されるＣＡＲは、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて製造されるが、当技術分野で公知のいかなる手段によって製造されうる。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸は、当技術分野で公知の分子クローニングの標準的な技術（ゲノムライブラリースクリーニング、オーバーラップＰＣＲ、プライマー支援ライゲーション、部位特異的突然変異誘発など）により、簡便に調製し、完全なコード配列に組み立てることができる。得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、好適な発現宿主細胞系、好ましくはＴリンパ球細胞系、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞系を形質転換するために用いられる。
患者から単離された様々なＴ細胞サブセットを、ＣＡＲ発現用ベクターで形質導入することができる。セントラルメモリーＴ細胞は、有用なＴ細胞サブセットの１つである。セントラルメモリーＴ細胞は、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を用いて、所望の受容体を発現する細胞を免疫磁気的に選択して、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を選択することにより、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離することができる。セントラルメモリーＴ細胞用に濃縮された細胞は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化され得、例えば、ＣＡＲの発現を指示するレンチウイルスベクター、並びにインビボ検出、アブレーション、及び潜在的ｅｘ ｖｉｖｏ選択用の非免疫原性表面マーカーで形質導入されうる。活性化／遺伝子修飾されたセントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５を用いてインビトロで増殖させた後、凍結保存することができる。
二重ＣＡＲ発現用Ｔ細胞集団の調製
ＢＡＦＦ－ＣＤ１９二重ＣＡＲの発現用に以下のＴ細胞集団：ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＴＮ）、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞（ＣＤ８＋ＴＮ）、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ８＋ＴＣＭ）、ＣＤ８＋メモリー幹細胞（ＣＤ８＋ＭＳＣ）及びＰａｎ Ｔ細胞（Ｐａｎ Ｔ）を調製することができる。簡潔には、５ｍＬの血液試料を５ｍＬのヒストパーク－１０７７（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に加える。混合物を２５００ ＲＰＭ（室温、ブレーキなし）で２０分間遠心分離する。中期末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）層を収集し、５０ｍＬのＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で洗浄し、１５００ ＲＰＭ（ＲＴ）で５分間遠心分離する。採取した細胞を１０ｍＬの赤血球溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）と混合し、７分間インキュベートする。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、５分間遠心分離する（１５００ ＲＰＭ、ＲＴ）。
ＢＡＦＦ－ＣＤ１９二重ＣＡＲの発現用に以下のＴ細胞集団：ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＴＮ）、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞（ＣＤ８＋ＴＮ）、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ８＋ＴＣＭ）、ＣＤ８＋メモリー幹細胞（ＣＤ８＋ＭＳＣ）及びＰａｎ Ｔ細胞（Ｐａｎ Ｔ）を調製することができる。簡潔には、５ｍＬの血液試料を５ｍＬのヒストパーク－１０７７（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に加える。混合物を２５００ ＲＰＭ（室温、ブレーキなし）で２０分間遠心分離する。中期末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）層を収集し、５０ｍＬのＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で洗浄し、１５００ ＲＰＭ（ＲＴ）で５分間遠心分離する。採取した細胞を１０ｍＬの赤血球溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）と混合し、７分間インキュベートする。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、５分間遠心分離する（１５００ ＲＰＭ、ＲＴ）。
様々なＴ細胞集団は、製造業者の指示書を用いてＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．から入手可能な以下のキット： ＥａｓｙＳｅｐＴＭ Ｈｕｍａｎ Ｎａｉｖｅ ＣＤ４＋ Ｔ細胞増菌キット（ＣＤ４＋ ＴＮ）、ＥａｓｙＳｅｐＴＭ Ｈｕｍａｎ Ｎａｉｖｅ ＣＤ８＋ Ｔ細胞増菌キット（ＣＤ８＋ ＴＮ）、及びＥａｓｙＳｅｐＴＭ Ｈｕｍａｎ Ｔ細胞増菌キット（Ｐａｎ Ｔ）；を用いて調製することができる。ＣＤ８＋ ＴＣＭは、製造業者の指示書を用いてＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．からＥａｓｙＳｅｐＴＭ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋ Ｔ細胞増菌キットを用いてＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離し、次いで、ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ４５ ＲＯ－ＡＰＣ、及びＣＤ６２Ｌ－ＰＥで染色することによって調製することができる。次いで、染色された細胞を選別して、ＣＤ８＋／ＣＤ４５＋／ＣＤ６２Ｌ＋トリプル陽性細胞を単離する。ＣＤ８＋メモリー幹細胞（ＣＤ８＋ ＭＳＣ）は、表４に示す培養条件を用いてＣＤ８＋ ＴＮから作製することができる。他のＴ細胞集団は、表４に示すように培養することができる。
ＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９二重ＣＡＲの配列決定
様々なＢＡＦＦ‐Ｒ／ＣＤ１９二重ＣＡＲを調製した。１２５０二重ＣＡＲ（配列番号５９）は、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて：ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ、リンカー、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３由来）、ＩｇＧ４（ＳｍＰ／Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）スペーサードメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４１ＢＢ細胞質ドメイン、ＧＧリンカー、及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む（図２）。１２９６二重ＣＡＲ（配列番号６１）は、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて：ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３由来）、リンカー、ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ、ＩｇＧ４（ＳｍＰ／Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）スペーサードメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４１ＢＢ細胞質ドメイン、ＧＧリンカー、及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む（図３）。１３１６二重ＣＡＲ（配列番号６３）は、アミノ末端からカルボキシ末端にむけて：ＣＤ１９ ＶＬ（ＦＭＣ６３由来）、ＧＧＧＳリンカー、ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ、ＣＤ１９ ＶＨ（ＦＭＣ６３由来）、ＩｇＧ４（ＳｍＰ／Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）スペーサードメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４１ＢＢ細胞質ドメイン、ＧＧリンカー、及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。
様々なＢＡＦＦ‐Ｒ／ＣＤ１９二重ＣＡＲを調製した。１２５０二重ＣＡＲ（配列番号５９）は、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて：ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ、リンカー、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３由来）、ＩｇＧ４（ＳｍＰ／Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）スペーサードメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４１ＢＢ細胞質ドメイン、ＧＧリンカー、及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む（図２）。１２９６二重ＣＡＲ（配列番号６１）は、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて：ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３由来）、リンカー、ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ、ＩｇＧ４（ＳｍＰ／Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）スペーサードメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４１ＢＢ細胞質ドメイン、ＧＧリンカー、及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む（図３）。１３１６二重ＣＡＲ（配列番号６３）は、アミノ末端からカルボキシ末端にむけて：ＣＤ１９ ＶＬ（ＦＭＣ６３由来）、ＧＧＧＳリンカー、ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ、ＣＤ１９ ＶＨ（ＦＭＣ６３由来）、ＩｇＧ４（ＳｍＰ／Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）スペーサードメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４１ＢＢ細胞質ドメイン、ＧＧリンカー、及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。
二シストロン性ＣＡＲは、レンチウイルスベクターを用いてＢＡＦＦ－Ｒ ＣＡＲ及びＣＤ１９ ＣＡＲを発現する。２つのＣＡＲは同じＴ細胞で発現する。成熟ＣＤ１９ ＣＡＲ（配列番号６５）は、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて：ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３由来）、ＩｇＧ４（ＳｍＰ／Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）スペーサードメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８（ＧＧ）細胞質ドメイン、ＧＧＧリンカー、及びＣＤ３シグナル伝達ドメインを含むことができる。成熟ＢＡＦＦ－Ｒ ＣＡＲ （配列番号６７）は、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて：ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ、ＩｇＧ４（ＳｍＰ／Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）スペーサードメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞質ドメイン、ＧＧＧリンカー、及びＣＤ３シグナル伝達ドメインを含むことができる。
〔実施例２〕ＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９二重ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターの調製
〔実施例２〕ＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９二重ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターの調製
図５は、１２５０二重ＣＡＲ発現用レンチウイルスベクターの概略図である。１２９６二重ＣＡＲ及び１３１６二重ＣＡＲは、類似のレンチウイルスベクター（ｓｖＦｖ部分の置換）を用いて作製した。
ＣＡＲ発現細胞の調製
ＣＤ３／ＣＤ２８ヒトＴ細胞活性化ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と細胞に対するビーズ比１：１で細胞を混合し、一晩インキュベート（加湿５％ ＣＯ２、３７℃）することで、二重ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターを用いて形質導入のための調製において細胞を活性化した。インキュベーション後、細胞を計数し、４８穴プレート中に１×１０６細胞／穴を分配した。細胞をＭＯＩ１で感染させた。各々の場合、全培養培地を２５０μＬに補足し、３０分間遠心分離した（８００ｇ、ＲＴ）。細胞を一晩インキュベートし（加湿５％ ＣＯ２、３７℃）、次いで表１に示された培地中で１０日間培養する。ＣＤ４＋ ＴＮ、ＣＤ８＋ ＴＮ、ＣＤ８＋ ＴＣＭ、及びＰａｎ Ｔ細胞の培養物は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを１：１の細胞対ビーズ比で含んでいた。ＣＤ８＋ Ｔ ＭＳＣの培養物は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを含まなかった。ＣＡＲの発現は、フローサイトメトリーを用いてＧＦＰ陽性細胞の比率によって評価した。
ＣＤ３／ＣＤ２８ヒトＴ細胞活性化ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と細胞に対するビーズ比１：１で細胞を混合し、一晩インキュベート（加湿５％ ＣＯ２、３７℃）することで、二重ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターを用いて形質導入のための調製において細胞を活性化した。インキュベーション後、細胞を計数し、４８穴プレート中に１×１０６細胞／穴を分配した。細胞をＭＯＩ１で感染させた。各々の場合、全培養培地を２５０μＬに補足し、３０分間遠心分離した（８００ｇ、ＲＴ）。細胞を一晩インキュベートし（加湿５％ ＣＯ２、３７℃）、次いで表１に示された培地中で１０日間培養する。ＣＤ４＋ ＴＮ、ＣＤ８＋ ＴＮ、ＣＤ８＋ ＴＣＭ、及びＰａｎ Ｔ細胞の培養物は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを１：１の細胞対ビーズ比で含んでいた。ＣＤ８＋ Ｔ ＭＳＣの培養物は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを含まなかった。ＣＡＲの発現は、フローサイトメトリーを用いてＧＦＰ陽性細胞の比率によって評価した。
ＣＡＲの発現
Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を、各ＣＡＲ構築物又は空ベクターで形質導入した。ＣＡＲの発現を評価するため、細胞をプロテインＬ－又はＥＧＦＲ－ＡＰＣ結合抗体で染色した。タンパク質ＬはｓｃＦｖの可変軽鎖を標的とし、切断型ＥＧＦＲはＣＡＲベクターによって共発現される。二重ＣＡＲを適当に発現することができる構築物をさらに検討した。図７に見られるように、二重ＣＡＲ１２９６及び二重ＣＡＲ１３１６は、完全型ＣＡＲ及びＥＧＦＲｔ選択マーカーを発現したが、二重ＣＡＲ１２５０は、完全型ＣＡＲを発現しなかった。
Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を、各ＣＡＲ構築物又は空ベクターで形質導入した。ＣＡＲの発現を評価するため、細胞をプロテインＬ－又はＥＧＦＲ－ＡＰＣ結合抗体で染色した。タンパク質ＬはｓｃＦｖの可変軽鎖を標的とし、切断型ＥＧＦＲはＣＡＲベクターによって共発現される。二重ＣＡＲを適当に発現することができる構築物をさらに検討した。図７に見られるように、二重ＣＡＲ１２９６及び二重ＣＡＲ１３１６は、完全型ＣＡＲ及びＥＧＦＲｔ選択マーカーを発現したが、二重ＣＡＲ１２５０は、完全型ＣＡＲを発現しなかった。
ＢＡＦＦ－Ｒ標的ＣＡＲ Ｔ細胞によるインビトロ細胞殺傷
１２９６二重ＣＡＲ、１３１６二重ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ又はＢＡＦＦ－Ｒ ＣＡＲ細胞を発現する様々なＴ細胞集団を用いるインビトロアッセイである。標的細胞株Ｎａｌｍ－６（ＷＴ、ＣＤ１９ノックアウト、又はＢＡＦＦ－Ｒノックアウト変異体）をクロミウム－３１で標識し、エフェクターＣＡＲ Ｔ細胞とインキュベートした。ＣＡＲには、ＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９二重標的ＣＡＲ：１２９６及び１３１６；単一標的ＣＡＲ：ＢＡＦＦ－Ｒ ＣＡＲ及びＣＤ１９ ＣＡＲが含まれた。非形質導入Ｔ細胞（非ＣＡＲ）を同種対照として用いた。全Ｔ細胞は、単一の健常ドナーに由来した。エフェクターＴ細胞機能による標的細胞から放出されたクロムをガンマカウンターで測定し、可能な最大放出比率として計算した。図８に見られるように、１２５０二重ＣＡＲは、ＢＡＦＦ－Ｒ－標的化ｓｃＦｖが適当に発現されないことを示唆するＢＡＦＦ－Ｒ－陽性Ｌ細胞に対する応答を誘導しなかった。
１２９６二重ＣＡＲ、１３１６二重ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ又はＢＡＦＦ－Ｒ ＣＡＲ細胞を発現する様々なＴ細胞集団を用いるインビトロアッセイである。標的細胞株Ｎａｌｍ－６（ＷＴ、ＣＤ１９ノックアウト、又はＢＡＦＦ－Ｒノックアウト変異体）をクロミウム－３１で標識し、エフェクターＣＡＲ Ｔ細胞とインキュベートした。ＣＡＲには、ＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９二重標的ＣＡＲ：１２９６及び１３１６；単一標的ＣＡＲ：ＢＡＦＦ－Ｒ ＣＡＲ及びＣＤ１９ ＣＡＲが含まれた。非形質導入Ｔ細胞（非ＣＡＲ）を同種対照として用いた。全Ｔ細胞は、単一の健常ドナーに由来した。エフェクターＴ細胞機能による標的細胞から放出されたクロムをガンマカウンターで測定し、可能な最大放出比率として計算した。図８に見られるように、１２５０二重ＣＡＲは、ＢＡＦＦ－Ｒ－標的化ｓｃＦｖが適当に発現されないことを示唆するＢＡＦＦ－Ｒ－陽性Ｌ細胞に対する応答を誘導しなかった。
ＢＡＦＦ－Ｒ及びＣＤ１９欠損マウスモデル
Ｎａｌｍ－６ Ｂ－ＡＬＬ腫瘍株をＣＲＩＳＰＲで遺伝子編集して、ＢＡＦＦ－Ｒ又はＣＤ１９をノックアウトした。市販のＢＡＦＦ－Ｒ及びＣＤ１９抗体を用いたＦＡＣＳ染色により、表面タンパク質の発現を確認した。Ｎａｌｍ‐６野生型（ＷＴ）を対照として用いた。図９に示すように、ＦＡＣＳ分析はノックアウトを確認する。
Ｎａｌｍ－６ Ｂ－ＡＬＬ腫瘍株をＣＲＩＳＰＲで遺伝子編集して、ＢＡＦＦ－Ｒ又はＣＤ１９をノックアウトした。市販のＢＡＦＦ－Ｒ及びＣＤ１９抗体を用いたＦＡＣＳ染色により、表面タンパク質の発現を確認した。Ｎａｌｍ‐６野生型（ＷＴ）を対照として用いた。図９に示すように、ＦＡＣＳ分析はノックアウトを確認する。
二重ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＴＬ機能
本研究では、その結果を図１０に示すが、標的細胞株Ｎａｌｍ－６、ＷＴ、ＣＤ１９ノックアウト、又はＢＡＦＦ－Ｒノックアウト変異体をクロミウム－５１で標識し、エフェクターＣＡＲ Ｔ細胞とインキュベートした。ＣＡＲにはＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９の二重標的ＣＡＲが含まれた。１２５０の二重ＣＡＲ ＣＴＬデータは、ＢＡＦＦ－Ｒ標的欠損の可能性を示唆する。
本研究では、その結果を図１０に示すが、標的細胞株Ｎａｌｍ－６、ＷＴ、ＣＤ１９ノックアウト、又はＢＡＦＦ－Ｒノックアウト変異体をクロミウム－５１で標識し、エフェクターＣＡＲ Ｔ細胞とインキュベートした。ＣＡＲにはＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９の二重標的ＣＡＲが含まれた。１２５０の二重ＣＡＲ ＣＴＬデータは、ＢＡＦＦ－Ｒ標的欠損の可能性を示唆する。
ＢＡＦＦ－Ｒ陽性ＣＤ１９陰性混合型Ｂ－ＡＬＬ腫瘍におけるＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９二重ＣＡＲの活性
図１１Ａ－１１Ｂは、１．５×１０５のＲＦＰ陰性、ルシフェラーゼを発現するＮａｌｍ－６－ＣＤ１９ＫＯ＋２．５×１０５のＲＦＰ陽性、ルシフェラーゼを発現するＮａｌｍ－６－ＢＡＦＦ－ＲＫＯ腫瘍細胞の混合物を用いて、０日目の腫瘍誘発のＩＶ後の１３１６二重ＣＡＲ及び１２９６ＮＳＧマウスの影響を調べる研究の結果を示す。次いで、５匹の腫瘍マウス群を、各々、単回注入として、１０日目に２．５×１０６個のＣＤ４ ＴＮ ＣＡＲ－Ｔ ＋ １０６個のＣＤ８ ＴＮ １２９６又は１３１６個の二重ＣＡＲ Ｔ細胞／マウスＩＶのいずれかによる治療に無作為に割り付けた。同一ドナー由来の非形質導入ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を同種対照（非ＣＡＲ）として用いた。図からわかるように、１３１６の治療による延命効果は、１２９６の治療と比較して有意であった。
図１１Ａ－１１Ｂは、１．５×１０５のＲＦＰ陰性、ルシフェラーゼを発現するＮａｌｍ－６－ＣＤ１９ＫＯ＋２．５×１０５のＲＦＰ陽性、ルシフェラーゼを発現するＮａｌｍ－６－ＢＡＦＦ－ＲＫＯ腫瘍細胞の混合物を用いて、０日目の腫瘍誘発のＩＶ後の１３１６二重ＣＡＲ及び１２９６ＮＳＧマウスの影響を調べる研究の結果を示す。次いで、５匹の腫瘍マウス群を、各々、単回注入として、１０日目に２．５×１０６個のＣＤ４ ＴＮ ＣＡＲ－Ｔ ＋ １０６個のＣＤ８ ＴＮ １２９６又は１３１６個の二重ＣＡＲ Ｔ細胞／マウスＩＶのいずれかによる治療に無作為に割り付けた。同一ドナー由来の非形質導入ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を同種対照（非ＣＡＲ）として用いた。図からわかるように、１３１６の治療による延命効果は、１２９６の治療と比較して有意であった。
ノックアウト腫瘍に対する１３１６ ＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９二重ＣＡＲの脱顆粒
ＣＤ１０７ａ脱顆粒を用いて、ノックアウト腫瘍に対する１３１６二重ＣＡＲの効力を評価した。ＣＤ４又はＣＤ８ ＢＡＦＦ－Ｒ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９ＢＡＦＦ－Ｒ＋ Ｎａｌｍ－６又はＣＤ１９＋ ＢＡＦＦ－ＲＮａｌｍ－６系のいずれかとインキュベートした。単一標的ＣＤ１９又はＢＡＦＦ－Ｒ ＣＡＲ Ｔ細胞を対照として用いた。
ＣＤ１０７ａ脱顆粒を用いて、ノックアウト腫瘍に対する１３１６二重ＣＡＲの効力を評価した。ＣＤ４又はＣＤ８ ＢＡＦＦ－Ｒ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９ＢＡＦＦ－Ｒ＋ Ｎａｌｍ－６又はＣＤ１９＋ ＢＡＦＦ－ＲＮａｌｍ－６系のいずれかとインキュベートした。単一標的ＣＤ１９又はＢＡＦＦ－Ｒ ＣＡＲ Ｔ細胞を対照として用いた。
混合型Ｂ－ＡＬＬ腫瘍におけるＴＮ／ＭＥＭ １３１６ ＢＡＦＦ－Ｒ／ＣＤ１９二重ＣＡＲの活性
０日目に、ＮＳＧマウスに、１×１０５のＲＦＰ陰性、ルシフェラーゼ発現Ｎａｌｍ－６－ＣＤ１９ＫＯ＋１×１０５のＲＦＰ陽性、ルシフェラーゼ発現Ｎａｌｍ－６－ＢＡＦＦ－ＲＫＯ腫瘍細胞の混合物を投与した。次いで、各群５匹の腫瘍マウスを、低用量（２．８×１０６ ＴＮ／ＭＥＭ）、高用量（５．６×１０６ ＴＮ／ＭＥＭ）のいずれかを単回注入し、それぞれ１×１０６及び２×１０６ ＢＡＦＦ－Ｒ ＣＡＲ Ｔ細胞を産生させ、９日目に１３１６二重ＣＡＲ Ｔ細胞／マウス静脈内投与に無作為に割り付けた。又は同一ドナー由来の５×１０６個の非形質導入ＴＮ／ＭＥＭ細胞を同種対照（非ＣＡＲ）として用いた。１３１６二重ＣＡＲの延命効果は有意であった。２回の投与間で生存率に有意差は認められなかった。
０日目に、ＮＳＧマウスに、１×１０５のＲＦＰ陰性、ルシフェラーゼ発現Ｎａｌｍ－６－ＣＤ１９ＫＯ＋１×１０５のＲＦＰ陽性、ルシフェラーゼ発現Ｎａｌｍ－６－ＢＡＦＦ－ＲＫＯ腫瘍細胞の混合物を投与した。次いで、各群５匹の腫瘍マウスを、低用量（２．８×１０６ ＴＮ／ＭＥＭ）、高用量（５．６×１０６ ＴＮ／ＭＥＭ）のいずれかを単回注入し、それぞれ１×１０６及び２×１０６ ＢＡＦＦ－Ｒ ＣＡＲ Ｔ細胞を産生させ、９日目に１３１６二重ＣＡＲ Ｔ細胞／マウス静脈内投与に無作為に割り付けた。又は同一ドナー由来の５×１０６個の非形質導入ＴＮ／ＭＥＭ細胞を同種対照（非ＣＡＲ）として用いた。１３１６二重ＣＡＲの延命効果は有意であった。２回の投与間で生存率に有意差は認められなかった。
Claims (33)
- ＢＡＦＦ－Ｒ及びＣＤ１９をともに標的とするキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９結合ｓｃＦｖのＶＬドメイン、ＣＤ１９結合ｓｃＦｖのＶＨドメイン、ＢＡＦＦ－Ｒ結合ｓｃＦｖのＶＬドメイン、ＢＡＦＦ－Ｒ結合ｓｃＦｖのＶＨドメインをいかなる順序で含み、次いで、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、核酸分子。
- ＢＡＦＦ－Ｒ及びＣＤ１９をともに標的とするキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ここで、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって：ａ）ＢＡＦＦ－Ｒを標的とするｓｃＦｖ及びＣＤ１９を標的とするｓｃＦｖ；又はｂ）ＣＤ１９を標的とするｓｃＦｖ及びＢＡＦＦ－Ｒを標的とするｓｃＦｖ；スペーサードメイン；膜貫通ドメイン；共刺激ドメイン；及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む標的化ドメインを含む核酸分子。
- 前記標的化ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の：ＣＤ１９結合ｓｃＦｖのＶＬドメイン、ＢＡＦＦ－Ｒ結合ｓｃＦｖのＶＨドメイン、ＢＡＦＦ－Ｒ結合ｓｃＦｖのＶＬドメイン、及びＣＤ１９結合ｓｃＦｖのＶＨドメインを含む、請求項１に記載の核酸分子。
- 前記標的化ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の：ＣＤ１９結合ｓｃＦｖのＶＨドメイン、ＢＡＦＦ－Ｒ結合ｓｃＦｖのＶＨドメイン、ＢＡＦＦ－Ｒ結合ｓｃＦｖのＶＬドメイン、及びＣＤ１９結合ｓｃＦｖのＶＬドメインを含む、請求項１に記載の核酸分子。
- 前記標的化ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の：ＣＤ１９結合ｓｃＦｖのＶＬドメイン、ＢＡＦＦ－Ｒ結合ｓｃＦｖのＶＬドメイン、ＢＡＦＦ－Ｒ結合ｓｃＦｖのＶＨドメイン、及びＣＤ１９結合ｓｃＦｖのＶＨドメインを含む、請求項１に記載の核酸分子。
- 前記標的化ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の：ＣＤ１９結合ｓｃＦｖのＶＨドメイン、ＢＡＦＦ－Ｒ結合ｓｃＦｖのＶＬドメイン、ＢＡＦＦ－Ｒ結合ｓｃＦｖのＶＨドメイン、及びＣＤ１９結合ｓｃＦｖのＶＬドメインを含む、請求項１に記載の核酸分子。
- ＢＡＦＦ－Ｒ ＶＨは、配列番号１３～１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ＢＡＦＦ－Ｒ ＶＬは、配列番号１７～２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸分子。
- ＢＡＦＦ－Ｒ ＶＨは、配列番号２１～２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ＢＡＦＦ－Ｒ ＶＬは、配列番号２５～２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記キメラ抗原受容体は、配列番号５８～６３から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１記載の核酸分子。
- 前記ＶＬ及び前記ＶＨドメインの各々の間に４～１５個のアミノ酸を含むリンカーを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記リンカーは、Ｇ及びＳのみを含む、請求項９に記載の核酸分子。
- 前記標的化ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の：ａ）ＣＤ１９ ｓｃＦｖのＶＬドメイン；ＢＡＦＦ－Ｒを標的化したｓｃＦｖ；及びＣＤ１９ ｓｃＦｖのＶＨ；又はｂ）ＣＤ１９ ｓｃＦｖのＶＨドメイン；ＢＡＦＦ－Ｒを標的化したｓｃＦｖ；及びＣＤ１９ ｓｃＦｖのＶＬを含む、請求項１記載の核酸分子。
- 前記標的化ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の：ａ）ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖのＶＬドメイン；ＣＤ１９を標的化したｓｃＦｖ；及びＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖのＶＨ；又はｂ）ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖのＶＨドメイン；ＣＤ１９を標的化したｓｃＦｖ；及びＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖのＶＬを含む、請求項１記載の核酸分子。
- ＢＡＦＦ－Ｒを標的とするキメラ抗原受容体とＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体をともにコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ＢＡＦＦ－Ｒを標的とするキメラ抗原受容体は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の：ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖ、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、前記ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の：ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む核酸分子。
- 前記共刺激ドメインは、アミノ酸の１～５個が修飾されたＣＤ２８共刺激ドメイン又はその変異体、アミノ酸の１～５個が修飾された４－１ＢＢ共刺激ドメイン又はその変異体、及びアミノ酸の１～５個が修飾されたＯＸ４０共刺激ドメイン又はその変異体からなる群より選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記膜貫通ドメインは、アミノ酸の１～５個が修飾されたＣＤ４膜貫通ドメイン又はその変異体、アミノ酸の１～５個が修飾されたＣＤ８膜貫通ドメイン又はその変異体、アミノ酸の１～５個が修飾されたＣＤ２８膜貫通ドメイン又はその変異体、及びアミノ酸の１～５個が修飾されたＣＤ３ζ膜貫通ドメイン又はその変異体、共刺激ドメイン、及びアミノ酸の１～５個が修飾されたその変異体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインから選択される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記スペーサードメインは、ＩｇＧ４ヒンジ（Ｓ→Ｐ）、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ（Ｓ２２８Ｐ）＋リンカー、ＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ８ヒンジ－４８ａａ、ＣＤ８ヒンジ－４５ａａ、ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）、ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）、ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）、及びＩｇＧ４（ＣＨ３）、並びに、ＩｇＧ４ヒンジ（Ｓ→Ｐ）、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ（Ｓ２２８Ｐ）＋リンカー、ＣＤ２８ヒンジ、ＣＤ８ヒンジ－４８ａａ、ＣＤ８ヒンジ－４５ａａ、ＩｇＧ４（ＨＬ－ＣＨ３）、ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）、ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ｑ）、及びＩｇＧ４（ＣＨ３）の各変異体、並びに、アミノ酸の１～５個が修飾されたＩｇＧ４（ＣＨ３）からなる群より選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域はＣＤＲ Ｌ１（配列番号１）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号２）及びＣＤＲ Ｌ３（配列番号３）を含み、前記重鎖可変領域がＣＤＲ Ｈ１（配列番号４）、ＣＤＲ Ｈ２（配列番号５）及びＣＤＲ Ｈ３（配列番号６）を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の核酸分子。
- ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖは軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域はＣＤＲ Ｌ１（配列番号７）、ＣＤＲ Ｌ２（配列番号８）及びＣＤＲ Ｌ３（配列番号９）を含み、前記重鎖可変領域はＣＤＲ Ｈ１（配列番号１０）、ＣＤＲ Ｈ２（配列番号１１）及びＣＤＲ Ｈ３（配列番号１２）を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖは、Ｃｈｉ９０ ＨＣ、Ｈｕ９０ ＨＣ－１、Ｈｕ９０ ＨＣ－２、Ｈｕ９０ ＨＣ－３、Ｃｈｉ５５ ＨＣ、Ｈｕ５５ ＨＣ－１、Ｈｕ５５ ＨＣ－２、及びＨｕ５５ ＨＣ－３から選択される重鎖可変ドメイン、及びＣｈｉ９０ ＬＣ、Ｈｕ９０ ＬＣ－１、Ｈｕ９０ ＬＣ－２、Ｈｕ９０ ＬＣ－３、Ｃｈｉ５５ ＬＣ、Ｈｕ５５ ＬＣ－１、Ｈｕ５５ ＬＣ－２、及びＨｕ５５ ＬＣ－３から選択される軽鎖可変ドメインを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の核酸分子。
- ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖは、配列番号１７～２０及び２５～２８から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
- ＢＡＦＦ－Ｒ ｓｃＦｖは、配列番号１３～１６及び２１～２４から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の核酸分子。
- ＣＤ１９ ｓｃＦｖは、配列番号３０で表されるアミノ酸配列ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴを含むＶＬ及び配列番号３１で表されるアミノ酸配列ＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳを含むＶＨを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記請求項１～２３のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
- レンチウイルスベクターである、請求項２４記載のベクター。
- 請求項２５に記載のベクターによって形質導入されたヒトＴ細胞又はＮＫ細胞の集団。
- 請求項１７に記載されたヒトＴ細胞の集団を含む組成物の治療有効量を被験体に投与することを含み、それにより、被験体におけるがんを治療することを含む、それを必要とする被験体のがんを治療する方法。
- がんは、リンパ腫、白血病又は骨髄腫である、請求項２７記載の方法。
- 前記リンパ腫は、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫又はバーキットリンパ腫である、請求項２８に記載の方法。
- 前記白血病が急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病又は有毛細胞白血病である、請求項２８記載の方法。
- 前記骨髄腫は、多発性骨髄腫である、請求項２８に記載の方法。
- 前記Ｔ細胞の集団は、前記患者に対して自己又は同種である、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒトＴ細胞集団は、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞を含む、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の方法。
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