KR20200005655A - 비시스트론성 키메라성 항원 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

비시스트론성 키메라성 항원 수용체 및 이의 용도 Download PDF

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해잉 킨
크리스탈 엘 맥컬
테리 제이 프라이
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더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈
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Abstract

본 발명은 비시스트론성 키메라성 항원 수용체(CAR) 아미노산 구축물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CAR 구축물과 관련된 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단, 및 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유동물에서 암의 존재를 검출하는 방법, 및 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CAR 구축물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

비시스트론성 키메라성 항원 수용체 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호참조
본원은 2017년 5월 15일자 출원된 미국 가출원 제62/506,268호(이의 전문은 본원에 참조로 혼입됨)를 우선권 주장한다.
연방정부 후원된 연구 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 정부가 프로젝트 번호 Z01BCO11565하에 후원하여 미국 국립 보건원(National Institutes of Health), 국립 암 연구소(National Cancer Institute)에 의해 이루어 졌다. 미국 정부는 본 발명에 있어서 특정 권리를 갖는다.
전자 제출 자료의 참조 포함
본원과 동시에 제출되고 다음과 같이 식별된 컴퓨터-판독가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 전체가 본원에 참조로 혼입된다: 2018년 5월 15일자의 "739267_ST25.TXT"란 명칭의 1개의 180,939 바이트 ASCII(텍스트) 파일.
암은 공중 보건학적 관심사이다. 화학요법과 같은 치료에서의 진보에도 불구하고, 혈액학적 악성종양을 비롯한 많은 암에 대한 예후는 좋지 않을 수 있다. 따라서, 암, 특별히 혈액학적 악성종양을 위한 추가적인 치료에 대한 필요성이 충족되지 않고 있다.
본 발명의 하나의 실시태양은 (a) 절단가능한 도메인; (b) 제1 항원 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제1 키메라성 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor); 및 (c) 제2 항원 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 CAR이 절단가능한 도메인을 통해 연결되고, 제1 항원 결합 도메인이 m971 항체의 항원 결합 도메인을 포함하며, 제1 CAR이 CAR 아미노산 구축물로부터 절단될 때, 제1 항원 결합 도메인이 CD22에 대한 항원적 특이성을 갖는, 키메라성 항원 수용체(CAR) 아미노산 구축물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 (a) 절단가능한 도메인; (b) 제1 항원 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR; 및 (c) 제2 항원 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 CAR이 절단가능한 도메인을 통해 연결되고, 제1 항원 결합 도메인이 FMC63 항체의 항원 결합 도메인을 포함하며, 제1 CAR이 CAR 아미노산 구축물로부터 절단될 때, 제1 항원 결합 도메인이 CD19에 대한 항원적 특이성을 갖는, 키메라성 항원 수용체(CAR) 아미노산 구축물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 (a) 2개 이상의 절단가능한 도메인; (b) 제1 항원 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR; 및 (c) 제2 항원 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 CAR이 2개 이상의 절단가능한 도메인을 통해 연결되는, 키메라성 항원 수용체(CAR) 아미노산 구축물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 (a) 제1 항원 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR; 및 (b) 제2 항원 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR 사이에 2개 이상의 절단가능한 도메인을 고안하는 단계(여기서 제1 및 제2 CAR은 2개 이상의 절단가능한 도메인을 통해 연결됨); 및 N-말단에서 C-말단으로 제1 CAR, 2개 이상의 절단가능한 도메인, 및 제2 CAR을 포함하는 서열을 플라스미드내로 클로닝하는 단계를 포함하는, 키메라성 항원 수용체(CAR) 아미노산 구축물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 CAR 아미노산 구축물을 제공한다.
본 발명의 추가의 실시태양은 본 발명의 CAR 아미노산 구축물에 관한 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단, 및 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가적인 실시태양은 포유동물에서 암의 존재를 검출하는 방법 및 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
도 1은, 본 발명의 실시태양에 따라서, 예시적 CAR 구축물의 개략도를 제시한다.
도 2a 내지 2c는, 본 발명의 실시태양에 따라서, (2a) T 세포가 단일 항-CD19 CAR 또는 V1 CAR 구축물[또한 비시스트론성-V1 또는 비시스(bicis)-V1로서 표시됨]을 인코딩하는 벡터에 의해 형질도입될 때, 항-CD19 CAR("CD19 CAR"로서 표시되는 항-CD19 CAR) 및 CD3, (2b) T 세포가 단일 항-CD22 CAR 또는 V1 CAR 구축물을 인코딩하는 벡터에 의해 형질도입될 때, 항-CD22 CAR("CD22 CAR"로서 표시되는 항-CD22 CAR) 및 CD3, 및 (2c) 세포가 V1 CAR 구축물을 인코딩하는 벡터에 의해 형질도입될 때, 항-CD19 CAR 및 항-CD22 CAR의 인간 T 세포 상에서의 표면 발현을 비교하는, 형광-활성화된 세포 분류 점 도표를 제시한다.
도 3은 단일 항-CD19 CAR, 단일 항-CD22 CAR, LoopCAR6을 인코딩하는 벡터에 의해 형질도입되거나, 단일 항-CD19 CAR 및 단일 항-CD22 CAR을 인코딩하는 별도의 벡터에 의해 공-형질도입될 때, 인간 T 세포 상에서 항-CD19 CAR 및 항-CD22 CAR의 표면 발현을 비교하는 형광-활성화된 세포 분류 점 도표를 제시한다.
도 4는, 본 발명의 실시태양에 따라서, V1 CAR 구축물, V5 CAR 구축물(또한 비시스트론성-V5 또는 비시스-V5로서 표시됨), 또는 LoopCAR6을 인코딩하는 벡터에 의해 형질도입될 때, 인간 T 세포 상에서 항-CD19 CAR 및 항-CD22 CAR의 표면 발현을 비교하는 형광-활성화된 세포 분류 점 도표를 제시한다.
도 5a, 5b, 6a, 6b, 7a, 7b 및 8은, 본 발명의 실시태양에 따라서, 사이토킨 생산에 근거한 시험관내 활성을 보여주는 막대 그래프이다. 도 5a는, 본 발명의 실시태양에 따라서, CD19, CD22 또는 이들 둘 다를 발현하거나 어느 것도 발현하지 않는 K562 세포가, V1 CAR 구축물, 단일 항-CD19 CAR(CAR19), 또는 단일 항-CD22 CAR(CAR22)을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 T 세포와 접촉되었을 때 측정된 IL2 수준을 보여주고, 도 5b는 IFNγ 수준을 보여준다. 도 6a는, 본 발명의 실시태양에 따라서, CD19, CD22 또는 이들 둘 다를 발현하거나 어느 것도 발현하지 않는 K562 세포가, V1 CAR 구축물, V5 CAR 구축물, LoopCAR6, 단일 항-CD19 CAR, 또는 단일 항-CD22 CAR을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 T 세포와 접촉되었을 때 측정된 IL2 수준을 보여주고, 도 6b는 IFNγ 수준을 보여준다. 도 7a는, 본 발명의 실시태양에 따라서, CD19 KO 및/또는 CD22 KO NALM6 세포가, V1 CAR 구축물, V5 CAR 구축물, LoopCAR6, 단일 항-CD19 CAR, 또는 단일 항-CD22 CAR을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 T 세포와 접촉되었을 때 측정된 IL2 수준을 보여주고, 도 7b는 IFNγ 수준을 보여준다. 도 8은 CAR T 세포가 NALM6 종양 세포와 함께 18 시간 동안 공-항온처리된 후, ELISA에 의해 측정된 배양 상청액에서의 IL2 생산의 수준을 보여준다("-N": NALM6; "-N-19": NALM6-CD19neg; "-N-19-22": NALM6-CD19neg-CD22neg).
도9 내지 14는, 본 발명의 실시태양에 따라서, 단일 항-CD19 CAR, 단일 항-CD22 CAR, LoopCAR6, V1 CAR 구축물 또는 V5 CAR 구축물을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 T 세포를 사용하여 치료한 후의 생체내 백혈병 진행에 대한 생물발광 영상을 모의 T 세포(형질도입되지 않은 T 세포)와 비교하여 제시한다. 생물발광 강도는, 음영의 증가된 수준에 의해 보여지는 바와 같이, 종양 크기를 나타낸다. "렌티(Lenti)"는 CAR이 렌티바이러스 주쇄내에서 고안되고 제작됨을 지시한다.
도 15는 CD19의 손실 이전 및 이후에 환자에서의 CD22 발현을 보여주는 선 그래프이다.
도 16은 CRISPR CD19neg 및 CD22neg 백혈병 세포주 대 모 NALM6 세포주의 CD19 및 CD22 발현을 보여주는 점 도표이다.
도 17은 CRISPR CD19neg 및 CD22neg 백혈병 세포 대 모 NALM6 세포의 생체내 진행의 비교를 보여주는 영상을 제시한다. 생물발광 강도는, 음영의 증가된 수준에 의해 보여지는 바와 같이, 종양 크기를 나타낸다.
도 18은 본원에 기재된 바와 같은 CAR을 사용하는 치료 방법들에 대한 비교를 보여주는 영상을 제시한다. NSG 마우스를 2.5E5의 NALM6 및 NALM6-CD19neg 및 NALM6-CD22neg 백혈병 세포주의 혼합물에 의해 0 일째 시험감염(challenge)시켰다. 순차적 치료 군에서 마우스는 3일째 3E6의 CAR+ 및 9일째 3E6의 CAR+ T 세포를 공급받았다. 공-주사 군에서 마우스는 3일째 3E6의 항-CD19 CAR+ 및 3E6의 항-CD22 CAR+ T 세포에 의해 총 6E6의 CAR+ T 세포를 공급받았다. 공-형질도입된 군에서 마우스는 3E6의 항-CD19+ 및 3E6의 항-CD22+ CAR T 세포를 함유하는 총 8E6의 T 세포를 공급받았다. CD19 또는 CD22 군에서 마우스는 3E6의 CAR+ T 세포를 공급받았다. 생물발광 강도는, 음영의 증가된 수준에 의해 보여지는 바와 같이, 종양 크기를 나타낸다. 항-CD19 및 항-CD22 CAR의 공-주사 또는 공-형질도입은 CD19 및 CD22 둘 다에 대한 동시적인 표적화가 백혈병의 재발을 감소시킬 수 있음을 시사한다.
도 19는 항-CD19 및 항-CD22 CAR 구축물에 의한 단일 벡터 형질도입 대 공-형질도입의 비교를 보여주는 점 도표이다.
도 20은 실시예 7에 기재된 바와 같이 CAR 치료 이후의 백혈병 표현형에 대한 그래픽 도표를 제시한다.
도 21은 본 발명의 실시태양에 따라서, 실시예 7의 TanCAR을 도해적으로 제시한다.
도 22a 및 22b는 본 발명의 실시태양에 따라서, K562, K562-CD19, K562-CD22, 및 K562-CD19CD22 표적 세포주에 의한 본원에 기재된 다양한 CAR의 사이토킨 생산을 보여주는 막대 그래프이다.
도 23a는 생체내 백혈병의 치료에 대한 TanCAR1 및 TanCAR4의 비교를 보여주는 영상을 제시한다. NSG 마우스를 0일째 1E6의 루시페라아제(luciferase)-발현 NALM6 백혈병 세포주에 의해 시험감염시켰다. 3일째, 마우스에 3E6의 CAR 발현 T 세포를 정맥내 주사하였다. 생물발광 강도는, 음영의 증가된 수준에 의해 보여지는 바와 같이, 종양 크기를 나타낸다.
도 23b 내지 23d는, 본 발명의 실시태양에 따라서, 각각의 CAR 또는 모의 T 세포 생성물의 공-항온처리에 의한 인큐사이트(Incucyte) 살해능 검사를 보여주는 점 도표를 제시한다.
도 24는, 본 발명의 실시태양에 따라서, 실시예 7의 LoopCAR을 도해적으로 제시한다.
도 25a 내지 25c는, 본 발명의 실시태양에 따라서, K562, K562-CD19, 562-CD22, 및 K562-CD19CD22 표적 세포주에 의한 다양한 CAR의 사이토킨 생산을 보여주는 막대 그래프를 제시한다.
도 26은, 본 발명의 실시태양에 따라서, K562, K562-CD19, K562-CD22, 및 K562-CD19CD22 표적 세포주에 의한 다양한 CAR의 사이토킨 생산을 보여주는 막대 그래프이다.
도 27은, 본 발명의 실시태양에 따라서, 각각의 CAR 또는 모의 T 세포 생성물을 10 : 1의 NALM6 : NALM6-CD19neg 세포와 함께 공-항온처리함에 의한 인큐사이트 살해능 검사를 보여주는 점 도표이다.
도 28은, 본 발명의 실시태양에 따라서, 각각의 CAR 또는 모의 T 세포 생성물을 10 : 1의 NALM6 : NALM6-CD22neg 세포와 함께 공-항온처리함에 의한 인큐사이트 살해능 검사를 보여주는 점 도표이다.
도 29a 내지 29f는 LoopCAR6이 표적 항원과 함께 공-항온처리되는 경우 다양한 사이토킨을 생산함을 보여주는 막대 그래프이다. 도 29a: 인터페론 감마; 도 29b: IL6; 도 29c: TNF 알파; 도 29d: IL8; 도 29e: IL13; 도 29f: IL2.
도 30은 영상을 제시한다. NSG 마우스를 0일째 1E6의 루시페라아제-발현 NALM6 백혈병 세포주에 의해 시험감염시켰다. 3일째, 마우스에게 3E6의 CAR 발현 T 세포를 정맥내 주사하였다. 생물발광 강도는, 음영의 증가된 수준에 의해 보여지는 바와 같이, 종양 크기를 나타낸다.
도 31은 영상을 제시한다. NSG 마우스를 0일째 1E6의 루시페라아제-발현 NALM6 백혈병 세포주에 의해 시험감염시켰다. 3일째, 마우스에게 9E6, 3E6의 및 1E6의 루우프 F CAR(이는 또한 본원에 LoopCAR6으로서 열거됨) 발현 T 세포를 정맥내 주사하였다. 생물발광 강도는, 음영의 증가된 수준에 의해 보여지는 바와 같이, 종양 크기를 나타낸다.
도 32는 영상을 제시한다. NSG 마우스를 0일째 1E6의 NALM6에 의해 시험감염시켰다. 순차적 치료 군에서 마우스는 3일째 3E6의 CAR+를 공급받았고, 7일째 3E6의 CAR+ T 세포를 공급받았다. 공-주사 군에서 마우스는 3일째 3E6의 항-CD19 CAR+ 및 3E6의 항-CD22 CAR+ T 세포에 의해 총 6E6의 CAR+ T 세포를 공급받았다. 공-형질도입된 군에서 마우스는 3E6의 항-CD19+ 및 3E6의 항-CD22+ CAR T 세포를 함유하는 총 10E6의 T 세포를 공급받았다. 항-CD19 또는 항-CD22 군에서 마우스는 3E6의 CAR+ T 세포를 공급받았다. 항-CD19 및 항-CD22 CAR의 공-주사 또는 공-형질도입은, CD19 및 CD22 둘 다에 대한 동시적인 표적화가 백혈병의 재발을 감소시킬 수 있음을 제안한다. 생물발광 강도는, 음영의 증가된 수준에 의해 보여지는 바와 같이, 종양 크기를 나타낸다.
도 33a는 영상을 제시한다. NSG 마우스를 0일째 5E5의 NALM6-CD19neg 및 5E5의 NALM6-CD22neg 루시페라아제-발현 백혈병 세포주의 혼합물에 의해 시험감염시켰다. 3일째, 마우스를 3E6의 CAR 발현 T 세포에 의해 치료하였다. 생물발광 강도는, 음영의 증가된 수준에 의해 보여지는 바와 같이, 종양 크기를 나타낸다.
도 33b는 영상을 제시한다. NSG 마우스를 0일째 도면에 지시된 바와 같이 1E6의 루시페라아제-발현 백혈병 세포에 의해 시험감염시켰다. 이들의 군중 몇몇에서 백혈병은 1%의 NALM6-CD19neg 또는 NALM6-CD22neg 세포에 의해 스파이크(spike) 처리되었다. 3일째, 마우스를 6E6의 CAR 발현 T 세포에 의해 치료하였다. 생물발광 강도는, 음영의 증가된 수준에 의해 보여지는 바와 같이, 종양 크기를 나타낸다.
도 34a는 영상을 제시한다. NSG 마우스를 0일째 1E6의 NALM6 백혈병 세포주에 의해 시험감염시켰다. 7일째 마우스는 8E6의 모의 T, CD19, CD22 또는 루우프 F CAR+ T 세포에 의한 치료를 공급받았다. 생물발광 강도는, 음영의 증가된 수준에 의해 보여지는 바와 같이, 종양 크기를 나타낸다.
도 34b는 영상을 제시한다. NSG 마우스를 0일째 1E6의 NALM6 백혈병 세포주에 의해 시험감염시켰다. 7일째 마우스는 8E6의 모의 T, CD19, CD22 또는 루우프 F CAR+ T 세포에 의한 치료를 공급받았다. 생물발광 강도는, 음영의 증가된 수준에 의해 보여지는 바와 같이, 종양 크기를 나타낸다.
도 35a 및 35b는, 본 발명의 실시태양에 따라서, 정상 조직을 나타내는 다양한 세포주와 함께 공-항온처리된 이후의 LoopCAR6의 IFNγ 생산을 보여주는 막대 그래프이다.
도 36은 8일째 분석된 CD19 CAR 및 CD22 CAR의 인간 PBMC 표면 발현을 보여주는 점 도표이다.
도 37a 내지 37g: 사이토킨 생산을 위해, CAR T 세포(1E5)를 1 x PBS에 의해 3회 세척하고, 96-웰 플레이트에서 200 ㎖의 RPMI 배지중에서 동수의 표적 세포와 함께 37℃ 항온처리기에서 15 내지 20 시간 동안 공-항온처리하였다. 높은 항원 표적 세포를 위해, K562 발현 CD19 또는 CD22 또는 CD19 및 CD22 둘 다를 사용하였고, K562 세포는 음성 대조군으로서 작용하였다. 낮은 표적 항원 세포주를 위해, NALM6 및 NALM6-CD19neg 및 NALM6-CD22neg를 사용하였고, NALM6-CD19negCD22neg를 음성 대조군으로서 사용하였다. 모든 시험은 3중으로 수행하였다. 배양 상청액중 IL2의 사이토킨 수준은 알앤디(R&D)의 ELISA 키트에 의해 검출하였다. 도 37a: 상이한 항원 밀도 수준에서 상이한 공-자극 도메인을 갖는 CD19 및 CD22 CAR의 사이토킨 생산. 도 37b: 상이한 항원 밀도 수준에서 상이한 공-자극 도메인을 갖는 비시스트론성 CAR의 사이토킨 생산. 도 37c: 비시스트론성 CAR의 사이토킨 생산과 2가 CAR의 사이토킨 생산의 비교. 도 37d 내지 37f: 인큐사이트 살해능 검사를 위해, 동량의 CAR T 세포를 5E4의 표적 종양 세포와 공-항온처리하였다. GFP 형광 발현을 위해 플레이트를 스캐닝하여 40 시간 동안 30 분마다 세포를 모니터링하였다. 각각의 시점에서 세포 살해 백분율을 기선-보정하였다. 도 37g: NAL 6CD19negCD22neg 세포에 의한 인큐사이트 살해능 검사.
도 38: RNAseq 분석은 공자극성 도메인의 상이한 짝형성과 연관된 특유의 유전자 발현을 보여준다. 비시스트론성 CAR T 세포를 동수의 NALM6과 함께 24 시간 동안 AMV 배지에서 공-항온처리하였다. 자기 비이드에 의해 NALM6 세포를 제거하고, TRNA를 즉시 추출하여 RNAseq 분석에 사용하였다. PCA 도표는 공자극 도메인의 상이한 짝형성과 연관된 별개의 유전자 발현 프로파일(profile)을 지시한다.
도 39a 및 39b는 영상을 제시한다. 생물발광 강도는, 음영의 증가된 수준에 의해 보여지는 바와 같이, 종양 크기를 나타낸다. 도 39a: NSG 마우스를 0일째 1E6의 루시페라아제-발현 NALM6 백혈병 세포주에 의해 시험감염시켰다. 3일째, 마우스에게 5E6의 CAR 발현 T 세포를 정맥내 주사하였다. 생물발광 강도는 종양 크기를 나타낸다. 도 39b: NSG 마우스를 0일째 1E5의 루시페라아제-발현 NALM6, NALM6-CD19neg, 및 NALM6- CD22neg 백혈병 세포에 의해 시험감염시켰다. 3일째, 마우스에게 3E6의 CAR 발현 T 세포를 정맥내 주사하였다.
도 40: NSG 마우스를 0일째 2.5E5의 루시페라아제-발현 NALM6-CD19neg, 및 NALM6-CD22neg 백혈병 세포에 의해 시험감염시켰다. 3일째, 마우스에게 3E6의 CAR 발현 T 세포를 정맥내 주사하였다. 생물발광 강도는, 음영의 증가된 수준에 의해 보여지는 바와 같이, 종양 크기를 나타낸다.
도 41: NSG 마우스에게 루시페라아제-발현 HMB28 환자 유래된 ALL 이종이식편(CD19negCD22+, 1 x 1O6)을 정맥내 주사하였다. 8일째, 도면에 지시된 바와 같이, 마우스에게 3E6의 CAR 발현 T 세포를 주사하였다. 생물발광 강도는, 음영의 증가된 수준에 의해 보여지는 바와 같이, 종양 크기를 나타낸다.
도 42는, 실시예 7에 기재된 바와 같이, 자리 밀도를 보여주는 그래프이다.
본 발명의 하나의 실시태양은 (a) 절단가능한 도메인; (b) 제1 항원 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR; 및 (c) 제2 항원 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 CAR이 절단가능한 도메인을 통해 연결되고, 제1 항원 결합 도메인이 m971 항체의 항원 결합 도메인을 포함하며, 제1 CAR이 CAR 아미노산 구축물로부터 절단될 때, 제1 항원 결합 도메인이 CD22에 대한 항원 특이성을 갖는, 키메라성 항원 수용체(CAR) 아미노산 구축물을 제공한다.
CAR은 T-세포 신호전달 도메인에 연결된 하나 이상의 항체(예를 들어, 단일 쇄 가변성 단편(scFv))의 항원 결합 도메인을 함유하는, 인공적으로 구축된 혼성 단백질 또는 폴리펩티드이다. CAR의 특징은 비-MHC-제한된 방식으로 단일클론성 항체의 항원-결합 특성을 활용하여 선택된 표적에 대해 T-세포 특이성 및 반응성을 재인도하는 능력을 포함한다. 비-MHC-제한된 항원 인식은 CAR을 발현하는 T 세포에게 항원 처리와 무관한 항원을 인식함으로써 종양 탈출의 주요 기작을 우회하는 능력을 제공한다. 게다가, T-세포에서 발현될 경우, CAR은 유리하게는 내생성 T 세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 쇄와 이량체화하지 않는다. "항원(적) 특이성" 및 "항원-특이적 반응을 유도하는"이라는 구절은, 본원에 사용될 경우, CAR의 항원으로의 반응이 면역 반응을 유도하도록, CAR이 항원에 특이적으로 결합하고 이를 면역학적으로 인식함을 의미한다.
CD22는 면역글로불린(Ig) 상과에 속하는 계통-제한된 B 세포 항원이다. CD22는 60 내지 70%의 B 세포 림프종 및 백혈병[예를 들어, B-만성 림프구성 백혈병, 모양(hairy) 세포 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 및 버킷(Burkitt)의 림프종]에서 발현되고, B 세포 발달의 초기 단계에서 세포 표면 상에 또는 줄기 세포 상에 제시되지 않는다[바이쿠스(Vaickus) 등의 문헌 "Crit. Rev. Oncol. /Hematol., 11: 267-297(1991)"; 방(Bang) 등의 문헌 "Clin. Cancer Res., 11: 1545-50 (2005)"]. CD19(또한 B-림프구 항원 CD19, B4, 및 CVID3으로서 공지됨)는 단지 조혈계의 B 림프구 및 소포성 수지상 세포에 의해서만 발현되는 세포 표면 분자이다. 이는 발현되는 가장 초기의 B-계통-제한된 항원이고, 대부분의 예비-B-세포 및 대부분의 비-T-세포 급성 림프구성 백혈병 세포 및 B-세포 유형의 만성 림프구성 백혈병 세포 상에 제시된다[테더(Tedder) 및 이삭스(Isaacs)의 문헌 "J. Immun., 143: 712-717(1989)"].
본 발명의 실시태양에서, 본 발명은 각각 단일 항원에 결합하는 다중의 CAR(예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상)을 제공하고, 여기서 각각의 CAR은 절단가능한 도메인에 의해 분리된다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 절단가능한 도메인의 절단은 각각의 CAR, 예를 들어, 제1 및 제2 CAR을 CAR 구축물로부터 방출시켜, 각각의 절단된 CAR이 T 세포 표면 상에 별도로 제시되도록 하고, 각각은 그의 개별 표적에 대한 항원 특이성을 갖고, 각각은 항원-특이적 반응을 유도할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 이러한 CAR 구축물은 절단되거나/방출된 2개의 CAR, 예를 들어, 비시스트론성 CAR을 가질 수 있다. 이론이나 기작에 얽어매려는 것은 아니지만, 이들 CAR의 절단가능한 도메인은 전체 서열의 전체 번역 이후에 절단되거나, 각각의 CAR 및 절단가능한 도메인의 번역 이후에 절단되어, CAR이 서열에서 그 다음 CAR의 번역 이전에 절단/방출된다. 본원에서 이러한 CAR의 예로는 V1, V5, V6, V7, 및 V8이 포함된다.
본 발명의 실시태양에서, 본 발명은 CAR을 제공하고, 여기서 각각의 CAR은 2개의 항원(예를 들어, CD19 및 CD22)에 동시에 결합할 수 있다. 이들 CAR은 CD22 및 CD19에 대하여 이중 특이성을 갖는다. "이중 특이성", "이중 특이적", "이특이적" 및 "2가"는, CAR과 관련하여 본원에 사용될 경우, 2개의 항원중 적어도 하나에 대한 CAR의 결합이 면역 반응을 유도하도록, 동일한 CAR이 2개의 상이한 항원에 특이적으로 결합하고 이를 면역학적으로 인식할 수 있음을 의미한다. 본원에서 이러한 CAR의 예로는 TanCAR 2-4 및 LoopCAR 1-5가 포함된다. 또 다른 실시태양에서, 이중 특이적 CAR은 절단가능한 도메인에 의해 연결될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양은 m971 항체("m971")의 항-CD22 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다. m971의 항원 결합 도메인은 CD22에 특이적으로 결합한다. 이와 관련하여, 본 발명의 하나의 바람직한 실시태양은 m971의 항원 결합 도메인의 단일 쇄 가변성 단편(scFv)을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된 항-CD22 항원-결합 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다. HA22 면역독소 및 m971 항체는 상이한 CD22 에피토프에 결합한다.
항-CD22 항원 결합 도메인은 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 중쇄 가변 영역은 CDR1 영역, CDR2 영역 및 CDR3 영역을 포함한다. 이와 관련하여, 항-CD22 항원 결합 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 영역; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 영역; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 영역중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항-CD22 항원 결합 도메인의 중쇄는 서열번호 4, 6 및 8 모두의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 항-CD22 항원 결합 도메인의 경쇄 가변 영역은 경쇄 CDR1 영역, 경쇄 CDR2 영역 및 경쇄 CDR3 영역을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 항-CD22 항원 결합 도메인은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 영역; 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 영역; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 영역중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항-CD22 항원 결합 도메인의 경쇄는 서열번호 12, 14 및 16 모두의 아미노산 서열을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 항-CD22 항원 결합 도메인은 서열번호 4, 6, 8, 12, 14 및 16 모두의 아미노산 서열을 포함한다.
항-CD22 항원 결합 도메인의 중쇄 가변 영역은 서열번호 3 내지 9의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다. 항-CD22 항원 결합 도메인의 경쇄 가변 영역은 서열번호 11 내지 17의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시태양에서, 항-CD22 항원 결합 도메인은 서열번호 3 내지 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 11 내지 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 항-CD22 항원 결합 도메인은 서열번호 3 내지 9 및 11 내지 17의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 실시태양에서, 제2 CAR이 구축물로부터 절단될 때, 제2 항원 결합 도메인은 CD19에 대한 항원 특이성을 갖는다.
본 발명의 실시태양에서, 제2 항원 결합 도메인은 FMC63 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 실시태양에서, 제2 항원 결합 도메인은 아래에 기재된 바와 같은 FMC63의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 아래에 기재된 바와 같은 FMC63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명의 실시태양에서, 제2 항원 결합 도메인은 아래에 기재된 바와 같은 FMC63의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 (a) 절단가능한 도메인; (b) 제1 항원 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR; 및 (c) 제2 항원 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 CAR이 절단가능한 도메인을 통해 연결되고, 제1 항원 결합 도메인이 FMC63 항체의 항원 결합 도메인을 포함하며, 제1 CAR이 CAR 아미노산 구축물로부터 절단될 때, 제1 항원 결합 도메인이 CD19에 대한 항원 특이성을 갖는, 키메라성 항원 수용체(CAR) 아미노산 구축물을 제공한다. 실시태양에서, 제2 CAR이 구축물로부터 절단될 때, 제2 항원 결합 도메인은 CD22에 대한 항원 특이성을 갖는다.
본 발명의 하나의 실시태양은 FMC63 항체("FMC63")의 항-CD19 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다. FMC63의 항원 결합 도메인은 특이적으로 CD19에 결합한다. 이와 관련하여, 본 발명의 하나의 바람직한 실시태양은 FMC63의 항원 결합 도메인의 단일 쇄 가변성 단편(scFv)을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된 항-CD19 항원-결합 도메인을 포함하는 CAR을 제공한다.
항-CD19 항원 결합 도메인은 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 항-CD19 항원 결합 도메인의 경쇄 가변 영역은 경쇄 CDR1 영역, 경쇄 CDR2 영역, 및 경쇄 CDR3 영역을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 항-CD19 항원 결합 도메인은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 영역; 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 영역; 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 영역중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항-CD19 항원 결합 도메인의 경쇄는 서열번호 24, 26 및 28 모두의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 항-CD19 항원 결합 도메인의 중쇄 가변 영역은 CDR1 영역, CDR2 영역, 및 CDR3 영역을 포함한다. 이와 관련하여, 항-CD19 항원 결합 도메인은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 영역; 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 영역; 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 영역중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항-CD19 항원 결합 도메인의 중쇄는 서열번호 32, 34 및 36 모두의 아미노산 서열을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 항-CD19 항원 결합 도메인은 서열번호 24, 26, 28, 32, 34 및 36 모두의 아미노산 서열을 포함한다.
항-CD19 항원 결합 도메인의 중쇄 가변 영역은 서열번호 31 내지 37의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다. 항-CD19 항원 결합 도메인의 경쇄 가변 영역은 서열번호 23 내지 29의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시태양에서, 항-CD19 항원 결합 도메인은 서열번호 31 내지 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 23 내지 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 항-CD19 항원 결합 도메인은 서열번호 23 내지 29 및 31 내지 37 둘 다의 아미노산 서열을 포함한다.
항-CD22 항원 결합 도메인 및 항-CD19 항원 결합 도메인은 개별적으로 항-CD22 또는 항-CD19 항체의 임의의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 항원 결합 부분은 적어도 1개의 항원 결합 자리, 예컨대 Fab, F(ab')2, dsFv, scFv, 디아바디(diabody) 및 트리아바디(triabody)를 갖는 임의의 부분일 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 부분은 단일-쇄 가변 영역 단편(scFv) 항체 단편이다. scFv는 합성 펩티드 연결기를 경유하여 항체 경쇄의 가변성(V) 도메인에 연결되는 항체 중쇄의 V 도메인을 포함하는 절삭된(truncated) Fab 단편이고, 이는 일상적 재조합 DNA 기술 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 유사하게, 디설파이드-안정화된 가변 영역 단편(dsFv)은 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 항-CD22 항원 결합 도메인의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 연결기에 의해 서로 이어질 수 있다. 연결기는 임의의 적합한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 연결기는 약 1 내지 약 100, 약 3 내지 약 20, 약 5 내지 약 30, 약 5 내지 약 18, 또는 약 3 내지 약 8개 아미노산 길이의 Gly/Ser 연결기이고, 글리신 및/또는 세린 잔기로 차례로 구성된다. 따라서, Gly/Ser 연결기는 글리신 및/또는 세린 잔기로 구성될 수 있다. 바람직하게는, Gly/Ser 연결기는 GGGGS(서열번호 10)의 아미노산 서열을 포함하고, 다수의 서열번호 10이 연결기내에 존재할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 연결기는 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 연결기 서열은 항원 결합 도메인 및 막관통 도메인 사이의 이격기(spacer)로서 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 항-CD19 항원 결합 도메인의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 연결기에 의해 서로 이어질 수 있다. 연결기는 본 발명의 다른 양태와 관련하여 본원에 기재된 임의의 연결기일 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 항-CD19 항원 결합 도메인의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 서열번호 10 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 연결기에 의해 서로 이어진다.
하나의 실시태양에서, 항-CD22 항원 결합 도메인은 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 및 연결기를 포함한다. 이와 관련하여, 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 및 연결기를 포함하는 항-CD22 항원 결합 도메인의 실시태양은 서열번호 3 내지 17 모두를 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된다.
하나의 실시태양에서, 항-CD19 항원 결합 도메인은 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 및 연결기를 포함한다. 이와 관련하여, 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 및 연결기를 포함하는 항-CD19 항원 결합 도메인의 실시태양은 서열번호 23 내지 37 모두를 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된다.
본 발명의 CAR 구축물의 제1 CAR 및 제2 CAR은 1, 2, 3, 4개 또는 그 이상의 절단가능한 도메인을 통해 서로 이어진다. 절단가능한 도메인(들)은, 절단 효소에 의해 인식되는 도메인 또는 자가-절단하는 도메인을 비롯하여, 하나 이상의 임의의 적합한 절단가능한 도메인을 포함할 수 있다. 적합한 도메인으로는, 예를 들어, 2A 도메인, 예컨대 T2A 및/또는 P2A, 및 퓨린(furin) 절단 서열이 포함된다. 표 1은 예시적인 적합한 절단가능한 도메인을 제시한다.
[표 1]
Figure pct00001
본 발명의 하나의 실시태양에서, CAR 구축물은 1개 보다 많은 절단가능한 도메인을 함유하고, 여기서 절단가능한 도메인은 모두 동일하다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, CAR 구축물은 CAR 구축물내에 인접한 1개 보다 많은 절단가능한 도메인을 함유하고, 여기서 적어도 1개의 절단가능한 도메인은 상이하다.
하나의 실시태양에서, 항원 결합 도메인은 리더 서열을 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 리더 서열은 CAR 구축물내에서 항-CD19 CAR의 아미노 말단에 위치할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 리더 서열은 CAR 구축물내에서 항-CD22 CAR의 아미노 말단에 위치할 수 있다. 리더 서열은 임의의 적합한 리더 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 리더 서열은 서열번호 2 또는 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 리더 서열이 세포의 표면 상에서 방출/절단된 CAR의 발현을 촉진시킬 수 있는 반면, 발현된 CAR에서의 리더 서열의 존재는 CAR이 작용하기 위해 필수적인 것은 아니다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 세포 표면 상에서 CAR이 발현될 경우, 리더 서열은 방출된 CAR로부터 절단될 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시태양에서, 방출된 CAR은 리더 서열을 갖지 않는다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, CAR 구축물내의 CAR은 리더 서열을 갖지 않는다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, CAR 구축물은 힌지(hinge) 도메인을 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인이다. 하나의 바람직한 실시태양에서, CD8 힌지 도메인은 인간이다. 바람직하게는, CD8 힌지 도메인은 서열번호 18을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 힌지 도메인 CD28 힌지 도메인이다. 하나의 바람직한 실시태양에서, CD28 힌지 도메인은 인간이다. 바람직하게는, CD28 힌지 도메인은 서열번호 40을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, CAR 구축물은 막관통(TM) 도메인을 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, TM 도메인은 CD8 TM 도메인이다. 하나의 바람직한 실시태양에서, CD8 TM 도메인은 인간이다. 바람직하게는, CD8 TM 도메인은 서열번호 19를 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, TM 도메인은 CD28 TM 도메인이다. 하나의 바람직한 실시태양에서, CD28 TM 도메인은 인간이다. 바람직하게는, CD28 TM 도메인은 서열번호 41을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, CAR 구축물은 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 4-1BB 세포내 T 세포 신호전달 서열을 포함한다. 또한 CD137로서 공지된 4-1BB는, 강력한 공자극성 신호를 T 세포에 전송하여, 분화를 촉진시키고 T 림프구의 장기간의 생존을 증진시킨다. 바람직하게는, 4-1BB 세포내 T 세포 신호전달 서열은 인간이다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 4-1BB 세포내 T 세포 신호전달 서열은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 CD3 제타(ζ) 세포내 T 세포 신호전달 서열을 포함한다. CD3ζ는 TCR과 회합하여 신호를 생산하고 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프(ITAM: immunoreceptor tyrosine-based activation motif)를 함유한다. 바람직하게는, CD3ζ 세포내 T 세포 신호전달 서열은 인간이다. 하나의 바람직한 실시태양에서, CO3ζ 세포내 T 세포 신호전달 서열은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 세포내 T 세포 신호전달 도메인은 CD28 세포내 T 세포 신호전달 서열을 포함한다. 바람직하게는, CD28 세포내 T 세포 신호전달 서열은 인간이다. 하나의 바람직한 실시태양에서, CD28 세포내 T 세포 신호전달 서열은 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다.
제1 및 제2 CAR은 임의의 적합한 배향으로 CAR 구축물에 위치될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, CAR 구축물은 다음을 N-말단에서 C-말단으로 포함한다: 항-CD19 CAR, 1개 이상의 절단가능한 도메인, 및 이어서 항-CD22 CAR. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, CAR 구축물은 다음을 N-말단에서 C-말단으로 포함한다: 항-CD22 CAR, 1개 이상의 절단가능한 도메인, 및 이어서 항-CD19 CAR.
도 1은, 본 발명의 실시태양에 따라서, 예시적인 CAR 구축물의 개략도를 제시한다,
본 발명의 추가적인 실시태양은 하기 표 2 내지 6에 제시된 임의의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된 전장 CAR 구축물을 제공한다.
[표 2]
V1 CAR 구축물
Figure pct00002
Figure pct00003
[표 3]
V5 CAR 구축물
Figure pct00004
Figure pct00005
[표 4]
V6 CAR 구축물
Figure pct00006
Figure pct00007
[표 5]
V7 CAR 구축물
Figure pct00008
Figure pct00009
[표 6]
V8 CAR 구축물
Figure pct00010
Figure pct00011
[표 7]
TanCAR1 구축물
Figure pct00012
Figure pct00013
[표 8]
TanCAR2 구축물
Figure pct00014
Figure pct00015
[표 9]
TanCAR3 구축물
Figure pct00016
Figure pct00017
[표 10]
TanCAR4 구축물
Figure pct00018
Figure pct00019
[표 11]
LoopCAR1 구축물
Figure pct00020
Figure pct00021
[표 12]
LoopCAR2 구축물
Figure pct00022
Figure pct00023
[표 13]
LoopCAR3 구축물
Figure pct00024
Figure pct00025
[표 14]
LoopCAR4 구축물
Figure pct00026
Figure pct00027
[표 15]
LoopCAR5 구축물
Figure pct00028
Figure pct00029
[표 16]
LoopCAR6 구축물
Figure pct00030
Figure pct00031
하나의 실시태양에서, CAR 구축물(본원에서 V1로서 표시됨)은 다음의 서열을 갖는다:
Figure pct00032
.
하나의 실시태양에서, CAR 구축물(본원에서 V5로서 표시됨)은 다음의 서열을 갖는다:
Figure pct00033
.
하나의 실시태양에서, CAR 구축물(본원에서 V6으로서 표시됨)은 다음의 서열을 갖는다:
Figure pct00034
.
하나의 실시태양에서, CAR 구축물(본원에서 V7로서 표시됨)은 다음의 서열을 갖는다:
Figure pct00035
.
하나의 실시태양에서, CAR 구축물(본원에서 V8로서 표시됨)은 다음의 서열을 갖는다:
Figure pct00036
.
하나의 실시태양에서, CAR 구축물(본원에서 TanCAR2로서 표시됨)은 다음의 서열을 갖는다:
Figure pct00037
.
하나의 실시태양에서, CAR 구축물(본원에서 TanCAR3으로서 표시됨)은 다음의 서열을 갖는다:
Figure pct00038
.
하나의 실시태양에서, CAR 구축물(본원에서 TanCAR4로서 표시됨)은 다음의 서열을 갖는다:
Figure pct00039
.
하나의 실시태양에서, CAR 구축물(본원에서 LoopCAR1로서 표시됨)은 다음의 서열을 갖는다:
Figure pct00040
.
하나의 실시태양에서, CAR 구축물(본원에서 LoopCAR2로서 표시됨)은 다음의 서열을 갖는다:
Figure pct00041
.
하나의 실시태양에서, CAR 구축물(본원에서 LoopCAR3으로서 표시됨)은 다음의 서열을 갖는다:
Figure pct00042
.
하나의 실시태양에서, CAR 구축물(본원에서 LoopCAR4로서 표시됨)은 다음의 서열을 갖는다:
Figure pct00043
.
하나의 실시태양에서, CAR 구축물(본원에서 LoopCAR5로서 표시됨)은 다음의 서열을 갖는다:
Figure pct00044
.
본 발명의 CAR 구축물은 많은 이점을 제공할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 예를 들어, 본 발명의 CAR 구축물은, 유리하게는, 암 세포에 의한 하나의 항원, 예를 들어, CD19 또는 CD22의 발현의 손실에 기인한 암 세포 탈출을 감소시키거나 예방한다. 예를 들어, 본 발명의 CAR 구축물은, CD19 또는 CD22에 대해서만 항원 특이성을 갖는 CAR에 의해 치료한 후 암 환자(이의 암은 그 항원의 발현을 손실시킴)에서 관찰되는 재발을 감소시키거나 예방할 수 있는 것으로 여겨진다. 또한, 본 발명의 CAR 구축물은 CD19 또는 CD22의 발현의 불균일한 수준을 갖는 환자를 치료하기 위해 또한 유리할 수 있다. 본 발명의 CAR 구축물은 또한 성공적으로 치료될 수 있는 환자 모집단을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 단지 CD19만을 표적화하는 CAR 치료법에 반응하지 못한 환자는 CD22를 표적화하는 CAR 치료법에 반응할 수 있고, 단지 CD22만을 표적화하는 CAR 치료법에 반응하지 못한 환자는 CD19를 표적화하는 CAR 치료법에 반응할 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 절단가능한 CAR과 관련하여, 각각 단일 CAR을 갖는 2개의 벡터를 사용하는 T 세포의 공-형질도입은, CAR 둘 다를 발현하는 세포의 단지 낮은 백분율 및 하나의 CAR 또는 나머지 하나의 CAR만을 발현하는 T 세포의 상당한 수를 제공하고; 본 발명의 절단가능한 CAR 구축물을 사용하는 이점은 성공적으로 구축물을 완성하는 각각의 T 세포에서의 각각의 CAR이 동일하거나 실질적으로 동일하게 발현할 수 있다는 것이다. 게다가, CD19 및 CD22 둘 다를 표적화함으로써, 본 발명의 절단가능한 CAR 및 절단불가능한 CAR 구축물은, 유리하게는, 단지 단일 항원을 표적화하는 치료법과 비교하여 상승적 반응을 제공할 수 있고, 또한 암 세포 상에서 CD19 및 CD22중 하나 또는 둘 다의 불균일한 발현을 갖는 환자에게 더 광범위한 활성 치료법을 제공할 수 있다.
이와 같이, 특별한 이론 또는 기작에 얽매이지 않고, 2개의 항원, 예를 들어, CD22 및 CD19에 대한 항원-특이적 반응을 유도함으로써, 본 발명의 CAR 구축물은 다음중 어느 하나 이상의 이점을 제공하는 것으로 여겨진다: CD22-발현 암 세포를 표적화하여 파괴함, CD19-발현 암 세포를 표적화하여 파괴함, 암 세포를 감소시키거나 제거함, 면역 세포의 종양 자리(들)로의 침윤을 용이하게 함, 및 항암 반응을 향상/연장시킴.
본원에 기재된 본 발명의 CAR 구축물의 작용성 부분은 본 발명의 범주에 포함된다. 용어 "작용성 부분"은, CAR과 관련하여 사용될 경우, 본 발명의 CAR 구축물의 임의의 일부분 또는 단편을 지칭하고, 이러한 일부분 또는 단편은 CAR 구축물(이의 일부분은 모 CAR 구축물임)의 생물 활성을 보유한다. 작용성 부분은, 예를 들어, 모 CAR 구축물과 유사한 정도로, 동일한 정도로, 또는 더 높은 정도로, 표적 세포를 인식하거나, 암을 검출, 치료 또는 예방하는 능력을 보유하는 CAR 구축물의 이러한 일부분을 포괄한다. 모 CAR 구축물과 관련하여, 작용성 부분은, 예를 들어, 모 CAR의 약 10%, 약 25%, 약 30%, 약 50%, 약 68%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
작용성 부분은 추가적인 아미노산을 작용성 부분의 아미노 또는 카복시 말단에, 또는 말단 둘 다에 포함할 수 있고, 이러한 추가적인 아미노산은 모 CAR 구축물의 아미노산 서열에서 발견되지 않는다. 바람직하게는, 추가적인 아미노산은 작용성 부분의 생물학적 기능에 간섭하지 않고, 이는 예를 들어, 표적 세포를 인식하고, 암을 검출하고, 암을 치료하거나 예방하는 등이다. 더욱 바람직하게는, 추가적인 아미노산은 모 CAR 구축물의 생물 활성과 비교하여 생물 활성을 향상시킨다.
본원에 기재된 본 발명의 CAR 구축물의 작용성 변형체는 본 발명의 범주에 포함된다. 용어 "작용성 변형체"는, 본원에 사용될 경우, 모 CAR 구축물과 실질적인 또는 유의적인 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 CAR 구축물, 폴리펩티드, 또는 단백질을 지칭하고, 이러한 작용성 변형체는 변형체인 CAR의 생물 활성을 보유한다. 작용성 변형체는, 예를 들어, 모 CAR 구축물과 유사한 정도로, 동일한 정도로, 또는 더 높은 정도로, 표적 세포를 인식하는 능력을 보유하는 본원에 기재된 CAR 구축물(모 CAR 구축물)의 변형체를 포괄한다. 모 CAR 구축물과 관련하여, 작용성 변형체는, 모 CAR 구축물에 대하여 아미노산 서열에 있어서, 예를 들어, 적어도 약 30%, 약 50%, 약 75%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상 동일할 수 있다.
작용성 변형체는, 예를 들어, 적어도 1개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 모 CAR의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다르게는 또는 추가적으로, 작용성 변형체는 적어도 1개의 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 모 CAR 구축물의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 비-보존적 아미노산 치환은 작용성 변형체의 생물 활성을 간섭하거나 저해하지 않는 것이 더욱 선호된다. 비-보존적 아미노산 치환은, 작용성 변형체의 생물 활성이 모 CAR 구축물과 비교하여 증가되도록, 작용성 변형체의 생물 활성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 CAR 구축물의 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다. 보존적 아미노산 치환은 당분야에 공지되어 있고, 이는 특정한 물리적 및/또는 화학적 특성을 갖는 하나의 아미노산이 동일하거나 유사한 화학적 또는 물리적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 교체되는 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 또 다른 산성/음성으로 하전된 극성 아미노산에 대해 치환되는 산성/음성으로 하전된 극성 아미노산(예를 들어, Asp 또는 Glu), 비극성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산에 대해 치환되는 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val 등), 또 다른 염기성/양성으로 하전된 극성 아미노산에 대해 치환되는 염기성/양성으로 하전된 극성 아미노산(예를 들어 Lys, His, Arg 등), 극성 측쇄를 갖는 또 다른 하전되지 않은 아미노산에 대해 치환된 극성 측쇄를 갖는 하전되지 않은 아미노산(예를 들어, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr 등), 베타-분지쇄를 갖는 또 다른 아미노산에 대해 치환되는 베타-분지쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, Ile, Thr, 및 Val), 방향족 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산에 대해 치환되는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, His, Phe, Trp, 및 Tyr) 등일 수 있다.
CAR 구축물은 특정화된 아미노산 서열 또는 본원에 기재된 서열로 본질적으로 구성되어, 다른 성분들, 예를 들어, 다른 아미노산이 작용성 변형체의 생물 활성을 실질적으로 바꾸지 않도록 할 수 있다.
본 발명의 실시태양의 CAR 구축물(작용성 부분 및 작용성 변형체 포함)은 임의의 길이일 수 있고, 즉 임의의 수의 아미노산을 포함할 수 있지만, CAR 구축물(또는 이의 작용성 부분 또는 작용성 변형체)은 이들의 생물 활성, 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하거나, 포유동물에서 병에 걸린 세포를 검출하거나, 포유동물에서 질환을 치료 또는 예방하는 능력 등을 보유해야 한다. 예를 들어, CAR은 약 50 내지 약 5000개의 아미노산 길이, 예컨대 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 이상의 아미노산 길이일 수 있다.
본 발명의 실시태양의 CAR 구축물(본 발명의 작용성 부분 및 작용성 변형체 포함)은 1개 이상의 자연-발생 아미노산 대신 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 합성 아미노산은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 아미노사이클로헥산 카복실산, 노르로이신, α-아미노 n-데칸산, 호모세린, S-아세틸아미노메틸-시스테인, 트랜스-3- 및 트랜스-4-하이드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-카복시페닐알라닌, β-페닐세린 β-하이드록시페닐알라닌, 페닐글리신, α-나프틸알라닌, 사이클로헥실알라닌, 사이클로헥실글리신, 인돌린-2-카복실산, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아미드, N'-벤질-N'-메틸-라이신, N',N'-디벤질-라이신, 6-하이드록시라이신, 오르니틴, α-아미노사이클로펜탄 카복실산, α-아미노사이클로헥산 카복실산, α-아미노사이클로헵탄 카복실산, α-(2-아미노-2-노르보난)-카복실산, α,γ-디아미노부티르산, α,β-디아미노프로피온산, 호모페닐알라닌, 및 α-3급-부틸글리신이 포함된다.
본 발명의 실시태양의 CAR 구축물(본 발명의 작용성 부분 및 작용성 변형체 포함)은 글리코실화, 아미드화, 카복실화, 인산화, 에스테르화, N-아실화되거나, 예를 들어, 디설파이드 가교를 경유하여 환형화되거나, 산 부가 염으로 전환되고/되거나, 임의적으로 이량체화 또는 중합화되거나, 공액될 수 있다.
본 발명의 실시태양의 CAR 구축물(이의 작용성 부분 및 작용성 변형체 포함)은 당분야에 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. CAR 구축물은 드 노보(de novo) 합성을 비롯하여, 폴리펩티드 또는 단백질을 제조하는 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, CAR 구축물은 표준 재조합 방법을 사용하여 본원에 기재된 핵산에 의해 재조합적으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 그린(Green) 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2012]을 참조한다. 추가로, 본 발명의 몇몇 CAR 구축물(이의 작용성 부분 및 작용성 변형체 포함)의 부분은 식물, 세균, 곤충, 포유동물, 예를 들어, 래트, 인간 등과 같은 공급원으로부터 단리되고/되거나 정제될 수 있다. 단리 및 정제 방법은 당분야에 잘 공지되어 있다. 다르게는, 본원에 기재된 CAR 구축물(이의 작용성 부분 및 작용성 변형체 포함)은 신펩(Synpep)(미국 캘리포니아주 두블린), 펩티드 테크놀로지스 코포레이션(Peptide Technologies Corp.)(미국 메릴랜드주 게이터스버그), 및 멀티플 펩티드 시스템스(Multiple Peptide Systems)(미국 캘리포니아주 샌 디에고)와 같은 회사에 의해 상업적으로 합성될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 CAR 구축물은 합성적이거나, 재조합적이거나, 단리되고/되거나, 정제될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 (a) 2개 이상의 절단가능한 도메인; (b) 제1 항원 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR; 및 (c) 제2 항원 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함하고; 여기서 제1 및 제2 CAR이 2개 이상의 절단가능한 도메인을 통해 연결되는, 키메라성 항원 수용체 (CAR) 아미노산 구축물을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 2개 이상의 절단가능한 도메인은 바로 인접해 있거나, 적어도 2개의 절단가능한 도메인 사이에 적어도 1개의 연결기를 갖는다. 하나의 실시태양에서, 정확히 2개의 절단가능한 도메인이 존재한다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 (a) 제1 항원 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR; 및 (b) 제2 항원 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR 사이에 2개 이상의 절단가능한 도메인을 고안하는 단계(여기서 제1 및 제2 CAR은 2개 이상의 절단가능한 도메인을 통해 연결됨), 및 N-말단에서 C-말단으로 제1 CAR, 2개 이상의 절단가능한 도메인, 및 제2 CAR을 포함하는 서열을 플라스미드내로 클로닝하는 단계를 포함하는, 키메라성 항원 수용체(CAR) 아미노산 구축물을 제조하는 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 2개 이상의 절단가능한 도메인은 바로 인접해 있거나, 적어도 2개의 절단가능한 도메인 사이에 적어도 1개의 연결기를 갖는다. 하나의 실시태양에서, 정확히 2개의 절단가능한 도메인이 존재한다.
본원에 기재된 임의의 CAR 구축물(이의 작용성 부분 및 작용성 변형체 포함)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 본 발명의 하나의 실시태양에 의해 추가로 제공된다. 본 발명의 핵산은 본원에 기재된 임의의 리더 서열, 항원 결합 도메인, 막관통 도메인, 연결기, 및/또는 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 핵산은 본원에 기재된 임의의 CAR 구축물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 핵산은 서열번호 53(항-CD19/항-CD22 V1 CAR), 서열번호 54(항-CD19/항-CD22 V5 CAR), 서열번호 55(항-CD19/항-CD22 V6 CAR), 서열번호 56(항-CD19/항-CD22 V7 CAR), 서열번호 57(항-CD19/항-CD22 V8 CAR), 서열번호 71(TanCAR2), 서열번호 72(TanCAR3), 서열번호 73(TanCAR4), 서열번호 74(LoopCAR1), 서열번호 75(LoopCAR2), 서열번호 76(LoopCAR3), 서열번호 77(LoopCAR4), 또는 서열번호 78(LoopCAR5)의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있다.
"핵산"은, 본원에 사용될 경우, "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", 및 "핵산 분자"를 포함하고, 일반적으로 DNA 또는 RNA의 중합체를 의미하는데, 이는 단일-가닥 또는 이중-가닥이고, 합성되거나 천연 공급원으로부터 수득(예를 들어, 단리되고/되거나 정제)될 수 있으며, 이는 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드를 함유할 수 있고, 이는, 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 사이에서 발견되는 포스포디에스테르 대신에, 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드간 연결기, 예컨대 포스포로아미데이트 연결기 또는 포스포로티오에이트 연결기를 함유할 수 있고, 몇몇 실시태양에서, 핵산은 삽입, 결실, 역위, 및/또는 치환을 포함하지 않는다. 그러나, 몇몇 경우에, 본원에 논의된 바와 같이, 핵산은 하나 이상의 삽입, 결실, 역위, 및/또는 치환을 포함하는 것이 적합할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 핵산은 CAR 구축물의 작용에 영향을 주지 않고 숙주 세포에 의한 핵산의 발현시 번역되거나 번역되지 않는 추가적인 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양의 핵산은 재조합적일 수 있다. 본원에 사용될 경우, 용어 "재조합"은 (i) 살아있는 세포에서 복제할 수 있는 핵산 분자에 천연 또는 합성 핵산 분절을 접합시킴으로써 살아있는 세포 밖에서 구축되는 분자, 또는 (ii) 상기 (i)에 기재된 분자의 복제로부터 야기되는 분자를 지칭한다. 본원의 목적을 위해, 복제는 시험관내 복제 또는 생체내 복제일 수 있다.
재조합 핵산은 자연 발생되지 않는 서열을 갖거나, 서열의 2개의 달리 분리된 분절의 인공적 조합에 의해 제조된 서열을 갖는 핵산일 수 있다. 이러한 인공적 조합은 종종 화학적 합성에 의해, 또는 더욱 흔히는 핵산의 단리된 분절의 인공적 조작, 예를 들어, 유전자 조작 기법, 예컨대 그린(Green) 등의 상기 문헌에 기재된 기법에 의해 달성된다. 핵산은 당분야에 공지된 절차를 사용하여 화학적 합성 및/또는 효소적 결찰 반응에 기반하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 그린(Green) 등의 상기 문헌을 참조한다. 예를 들어, 핵산은 자연 발생 뉴클레오티드, 또는 분자의 생물 안정성을 증가시키거나 혼성화시 형성되는 이중물의 물리적 안정성을 증가시키기 위해 고안된 다양하게 변형된 뉴클레오티드[예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘(acridine) 치환된 뉴클레오티드]를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 핵산을 생성하기 위해 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예로는, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시하이드록시메틸) 우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락소실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-치환된 아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 위부톡소신(wybutoxosine), 슈도(pseudo)우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필) 우라실, 및 2,6-디아미노퓨린이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 다르게는, 본 발명의 하나 이상의 핵산은 매크로몰레큘라 리소시즈(Macromolecular Resources)(미국 콜로라도주 포트 콜린스) 및 신테겐(Synthegen)(미국 텍사스주 휴스턴)과 같은 회사로부터 구입될 수 있다.
핵산은 임의의 CAR 구축물, 또는 이의 작용성 부분 또는 작용성 변형체를 인코딩하는 임의의 단리되거나 정제된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다르게는, 뉴클레오티드 서열은 임의의 서열로 퇴화(degenerate)되거나 퇴화 서열의 조합물인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양은 본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보성인 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격한 조건하에 본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리되거나 정제된 핵산을 제공한다.
엄격한 조건하에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열은 고도로 엄격한 조건하에 혼성화될 수 있다. "고도로 엄격한 조건"은, 뉴클레오티드 서열이 비-특이적 혼성화에 비해 강하게 검출될 수 있는 양으로 표적 서열(본원에 기재된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열)에 특이적으로 혼성화됨을 의미한다. 고도로 엄격한 조건은 정확한 상보성 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 서열에 정합하는 소수의 작은 영역(예를 들어, 3 내지 10개 염기)을 갖게된 무작위 서열로부터 단지 소수의 산발적 부정합만을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 구별하는 조건을 포함한다. 상보성의 이러한 작은 영역은 14 내지 17개 또는 그 이상의 염기의 전장 보체에 비해 더욱 쉽게 용융되고, 고도로 엄격한 혼성화는 이들이 쉽게 구별될 수 있도록 만든다. 비교적 고도의 엄격한 조건은, 예를 들어, 약 50 내지 70℃의 온도에서 약 0.02 내지 0.1M NaCl 또는 등가물에 의해 제공되는 바와 같은, 낮은 염 농도 및/또는 높은 온도 조건을 포함할 것이다. 이러한 고도의 엄격한 조건은, 존재하더라도, 뉴클레오티드 서열 및 주형 또는 표적 가닥 사이의 부정합을 거의 용인하지 않고, 본 발명의 임의의 CAR 구축물의 발현을 검출하기 위해 특별히 적합하다. 일반적으로 조건은 증가하는 양의 포름아미드의 첨가에 의해 더욱 엄격해질 수 있는 것으로 인식된다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 핵산에 적어도 약 70% 이상, 예를 들어, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 핵산은 재조합 발현 벡터내로 혼입될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 하나의 실시태양은 본 발명의 임의의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본원의 목적을 위해, 용어 "재조합 발현 벡터"는, 구축물이 mRNA, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, mRNA, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드가 세포내에서 발현되기에 충분한 조건하에 벡터가 숙주 세포와 접촉되는 경우, 숙주 세포에 의한 mRNA, 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드의 발현을 허용하는, 유전자-변형된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 구축물을 의미한다. 본 발명의 벡터는 전체로서 자연-발생되지 않는다. 그러나, 벡터의 일부분은 자연-발생될 수 있다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 임의의 유형의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 이는 단일-가닥 또는 이중-가닥이고, 합성되거나 천연 공급원으로부터 부분적으로 수득될 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하나, 이에 제한되지 않고, 이는 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 자연-발생 또는 비-자연-발생 뉴클레오티드간 연결기, 또는 이러한 유형의 연결기 둘 다를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 비-자연 발생 또는 변경된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드간 연결기는 벡터의 전사 또는 복제를 방해하지 않는다. 예시적 벡터 주쇄는 서열번호 58의 렌티-벡터 주쇄이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있고, 임의의 적합한 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 번식 및 팽창을 위해, 또는 발현을 위해 또는 이들 둘 다를 위해 고안되는 벡터, 예컨대 플라스미드 및 바이러스를 포함한다. 벡터는 pUC 시리즈[페르멘타스 라이프 사이언시스(Fermentas Life Sciences), 미국 메릴랜드주 글렌 부르니에], 피블루스크립트(pBluescript) 시리즈[스트라타겐(Stratagene), 미국 캘리포니아주 라호야], pET 시리즈[노바겐(Novagen), 미국 위스콘신주 매디슨], pGEX 시리즈[파마시아 바이오텍(Pharmacia Biotech), 스웨덴 웁살라], 및 pEX 시리즈[클론텍(Clontech), 미국 캘리포니아주 팔로 알토]로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 박테리오파아지 벡터, 예컨대 λGT10, λGT11, λZapII(스트라타겐), λEMBL4, 및 λNM1149가 또한 사용될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예로는 pBIOl, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(클론텍)가 포함된다. 동물 발현 벡터의 예로는 pEUK-Cl, pMAM, 및 pMAMneo(클론텍)가 포함된다. 재조합 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 재조합 발현 벡터는, 예를 들어, 그린(Green) 등의 상기 문헌에 기재된 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 환형 또는 선형인 발현 벡터의 구축물은 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 작용성인 복제 시스템을 갖도록 제조될 수 있다. 복제 시스템은, 예를 들어, ColE1, 2 μ 플라스미드, λ, SV40, 소 유두종 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다.
재조합 발현 벡터는 조절 서열, 예컨대 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 포함할 수 있고, 이는 적절할 경우 벡터가 도입되는 숙주 세포의 유형(예를 들어, 세균, 곰팡이, 식물, 또는 동물)에 특이적이며 벡터가 DNA-기반인지 RNA-기반인지를 고려한다. 재조합 발현 벡터는 또한 클로닝을 용이하게 하기 위해 제한 자리를 포함할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 하나 이상의 표지 유전자를 포함할 수 있고, 이는 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포의 선택을 허용한다. 표지 유전자는 살생물제 내성, 예를 들어, 항생제, 중금속 등에 대한 내성, 자가영양성(prototrophy)을 제공하기 위한 영양요구성 숙주에서의 상보성 등을 포함한다. 본 발명의 발현 벡터를 위해 적합한 표지 유전자로는, 예를 들어, 네오마이신(neomycin)/G418 내성 유전자, 하이그로마이신(hygromycin) 내성 유전자, 히스티디놀(histidinol) 내성 유전자, 테트라사이클린(tetracycline) 내성 유전자, 및 앰피실린(ampicillin) 내성 유전자가 포함된다.
재조합 발현 벡터는 CAR 구축물(이의 작용성 부분 및 작용성 변형체 포함)을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 CAR 구축물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보성이거나 이에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결되는 고유적 또는 비-고유적 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 강한, 약한, 유도성, 조직-특이적 및 발달 단계-특이적 프로모터의 선택은 당분야의 통상적인 기술에 속한다. 유사하게, 뉴클레오티드 서열과 프로모터의 조합 또한 당분야의 통상적인 기술에 속한다. 프로모터는 비-바이러스성 프로모터 또는 바이러스성 프로모터, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 또는 뮤린 줄기 세포 바이러스의 긴-말단 반복부에서 발견되는 프로모터일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 일시적 발현, 안정한 발현, 또는 이들 둘 다를 위해 고안될 수 있다. 또한, 재조합 발현 벡터는 구성적 발현 또는 유도성 발현을 위해 제조될 수 있다.
추가로, 재조합 발현 벡터는 자살 유전자를 포함하도록 제조될 수 있다. 본원에 사용될 경우, 용어 "자살 유전자"는 자살 유전자를 발현하는 세포가 사멸되도록 만드는 유전자를 지칭한다. 자살 유전자는, 이 유전자가 발현되는 세포 상의 제제, 예를 들어, 약물에 민감성을 부여하여, 세포가 그러한 제제와 접촉되거나 이에 노출될 경우 세포가 사멸하도록 만드는 유전자이다. 자살 유전자는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 단순 포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나아제(TK) 유전자, 시토신 다미나아제(daminase), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제, 및 니트로리덕타아제(nitroreductase)가 포함된다.
본 발명의 임의의 CAR 구축물(이의 임의의 작용성 부분 또는 변형체 포함), 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 또는 숙주 세포 집단을 포함하는 컨주게이트, 예를 들어 바이오컨주게이트는 본 발명의 범주내에 포함된다. 컨주게이트, 뿐만 아니라 컨주게이트를 합성하는 방법은 일반적으로 당분야에 공지되어 있다.
본 발명의 하나의 실시태양은 본원에 기재된 임의의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본원에 사용될 경우, 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 재조합 발현 벡터를 함유할 수 있는 임의의 유형의 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어, 식물, 동물, 곰팡이, 또는 조류일 수 있거나, 원핵 세포, 예를 들어, 세균 또는 원생동물일 수 있다. 숙주 세포는 배양된 세포 또는 1차 세포, 즉 유기체, 예를 들어, 인간으로부터 직접 단리된 세포일 수 있다. 숙주 세포는 접착성 세포 또는 부유성 세포, 즉 현탁액에서 성장하는 세포일 수 있다. 적합한 숙주 세포는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, DH5α 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포, 중국 햄스터 난소 세포, 원숭이 VERO 세포, COS 세포, HEK293 세포 등이 포함된다. 재조합 발현 벡터를 증폭 또는 복제하기 위해서, 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들어, DH5α 세포일 수 있다. 재조합 CAR 구축물을 생산하기 위해서, 숙주 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 숙주 세포는 인간 세포일 수 있다. 숙주 세포는 임의의 세포 유형일 수 있고, 임의의 유형의 조직으로부터 기원할 수 있으며, 임의의 발달 단계일 수 있는 한편, 숙주 세포는 말초 혈액 림프구(PBL) 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)일 수 있다. 숙주 세포는 T 세포 또는 천연 킬러 세포(NK 세포)일 수 있다.
본원의 목적을 위해, T 세포는 임의의 T 세포, 예컨대 배양된 T 세포, 예를 들어, 원발성 T 세포, 또는 배양된 T 세포주, 예를 들어, 주르캣(Jurkat), SupT1 등으로부터의 T 세포, 또는 포유동물로부터 수득된 T 세포일 수 있다. 포유동물로부터 수득된다면, T 세포는 제한되지 않지만 혈액, 골수, 림프절, 흉선, 또는 기타 조직 또는 체액을 비롯한 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. T 세포는 또한 강화되거나 정제될 수 있다. T 세포는 인간 T 세포일 수 있다. T 세포는 인간으로부터 단리된 T 세포일 수 있다. T 세포는 임의의 유형의 T 세포일 수 있고, 임의의 발달 단계일 수 있으며, 제한되지 않지만, CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, 예를 들어, Th1 및 Th2 세포, CD8+ T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포), 종양 침윤 세포, 기억 T 세포, 나이브(naive) T 세포 등이 포함된다. T 세포는 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포일 수 있다.
또한, 본원에 기재된 적어도 1종의 숙주 세포를 포함하는 세포 집단이 본 발명의 하나의 실시태양에 의해 제공된다. 세포 집단은 기재된 임의의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를, 임의의 재조합 발현 벡터를 포함하지 않는 적어도 1종의 다른 세포, 예를 들어 숙주 세포(예를 들어, T 세포), 또는 T 세포 이외의 세포, 예를 들어 B 세포, 대식세포, 호중구, 적혈구, 간세포, 내피 세포, 상피 세포, 근육 세포, 뇌 세포 등에 더하여 포함하는 이종성 집단일 수 있다. 다르게는, 세포 집단은 실질적으로 동종성 집단일 수 있고, 여기서 집단은 재조합 발현 벡터를 포함하는(예를 들어, 이로 본질적으로 구성되는) 숙주 세포를 주로 포함한다. 또한 집단은 세포의 클론성 집단일 수 있고, 여기서 집단의 모든 세포는, 집단의 모든 세포가 재조합 발현 벡터를 포함하도록, 재조합 발현 벡터를 포함하는 단일 숙주 세포의 클론이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 세포 집단은 본원에 기재된 바와 같은 재조합 발현을 포함하는 숙주 세포를 포함하는 클론성 집단이다.
본 발명의 CAR 구축물(이의 작용성 부분 및 변형체 포함), 핵산, 재조합 발현 벡터, 및 숙주 세포(이의 집단 포함)[이들 모두는 이후 "본 발명의 CAR 구축물 물질"로서 집합적으로 지칭됨]는 단리되고/되거나 정제될 수 있다. 용어 "단리된"은, 본원에 사용될 경우, 그의 자연 환경으로부터 제거되어짐을 의미한다. 용어 "정제된" 또는 "단리된"은 절대적인 순도 또는 단리를 요구하는 것이 아니고; 오히려 이는 상대적인 용어로서 의도된다. 이와 같이, 예를 들어, 정제된(또는 단리된) 숙주 세포 제조물은, 숙주 세포가 신체내에서 그의 자연 환경에 있는 세포에 비해 더욱 순수한 제조물이다. 이러한 숙주 세포는, 예를 들어, 표준 정제 기법에 의해 생산될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 숙주 세포의 제조물은 제조물의 전체 세포 함량의 적어도 약 50%, 예를 들어 적어도 약 70%를 나타내도록 정제된다. 예를 들어, 순도는 적어도 약 50%일 수 있거나, 약 60%, 약 70% 또는 약 80%를 초과할 수 있거나, 약 100%일 수 있다.
본 발명의 CAR 구축물 물질은 조성물, 예컨대 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 하나의 실시태양은 본원에 기재된 본 발명의 임의의 CAR 구축물 물질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 임의의 CAR 구축물 물질을 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 1개 보다 많은 본 발명의 CAR 구축물 물질, 예를 들어, CAR 구축물 및 핵산, 또는 2개 이상의 상이한 CAR 구축물을 포함할 수 있다. 다르게는, 약학 조성물은 본 발명의 CAR 구축물 물질을 다른 약학적 활성 제제 또는 약물, 예컨대 화학치료제, 예를 들어, 아스파라기나아제(asparaginase), 부설판(busulfan), 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 플루오로우라실, 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아, 메토트렉세이트(methotrexate), 파클리탁셀(paclitaxel), 리툭시맙(rituximab), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 등과 함께 포함할 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 약학 조성물은 본 발명의 숙주 세포 또는 이의 집단을 포함한다.
약학 조성물에 관하여, 약학적으로 허용가능한 담체는 통상적으로 사용되는 임의의 담체이고 화학-물리적 고려사항, 예컨대 가용성 및 활성 제제(들)와의 반응성 결핍, 및 투여 경로에 의해서만 제한된다. 본원에 기재된 약학적으로 허용가능한 담체, 예를 들어, 비히클, 보조제, 부형제 및 희석제는 당분야의 숙련가에게 잘 알려져 있고, 일반인이 쉽게 입수할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 사용 조건하에 해로운 부작용이나 독성이 없는 담체인 것이 바람직하다.
담체의 선택은 특별한 본 발명의 CAR 구축물 물질, 뿐만 아니라 본 발명의 CAR 구축물 물질을 투여하기 위해 사용되는 특별한 방법에 의해 부분적으로 결정될 것이다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물의 다양한 적합한 제형이 존재한다. 투여가능한(예를 들어, 비경구적으로 투여가능한) 조성물을 제조하는 방법은 당분야의 숙련가에게 공지되거나 분명하고, 예를 들어, 레밍턴(Remington)의 문헌[The Science and Practice of Pharmacy, Pharmaceutical Press; 22nd ed. (2012)]에 더욱 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 CAR 구축물 물질은 임의의 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 CAR 구축물 물질은 주사(예를 들어, 피하, 정맥내, 종양내, 동맥내, 근육내, 피부내, 복강내, 또는 척추강내 주사)에 의해 투여된다. 바람직하게는, 본 발명의 CAR 구축물 물질은 정맥내로 투여된다. 본 발명의 CAR 구축물 물질의 주사를 위해 적합한 약학적으로 허용가능한 담체로는, 예를 들어, 정상 식염수(수중 약 0.90(w/v)%의 NaCl, 수중 약 300 mOsm/ℓ의 NaCl, 또는 물 1 ℓ 당 약 9.0 g의 NaCl), 노르모솔(NORMOSOL) R 전해질 용액[애보트(Abbott), 미국 일리노이주 시카고], 플라스마-라이트(PLASMA-LYTE) A[박스터(Baxter), 미국 일리노이주 디어필드], 수중 약 5% 덱스트로스, 또는 링거(Ringer)의 락테이트와 같은 임의의 등장성 담체가 포함될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 인간 혈청 알부민이 보충된다.
"효과량" 또는 "치료에 효과적인 양"은 개별체에서 암을 예방하거나 치료하기에 적절한 용량을 지칭한다. 치료학적 또는 예방학적 사용을 위해 효과적인 양은, 예를 들어, 치료될 질환 또는 질병의 단계 및 위중성, 환자의 연령, 체중, 및 건강의 일반적 상태, 및 담당 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 용량의 크기는 또한 선택되는 활성물질, 투여 방법, 투여의 시기 및 빈도, 특별한 활성물질의 투여와 동반될 지도 모르는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 정도, 및 원하는 생리학적 효과에 의해 결정될 것이다. 당분야의 숙련가라면, 다양한 질환 또는 질병이, 아마도 각각의 또는 다양한 회차의 투여로 본 발명의 CAR 구축물 물질을 사용하는 다중 투여를 비롯하여 장기간의 치료를 필요로 할 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니고 예로서, 본 발명의 CAR 구축물 물질이 숙주 세포인 경우, 숙주 세포의 예시적 용량은 최소한 100만개 세포(1 x 106 세포/용량)일 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 투여되는 본 발명의 CAR 구축물 물질의 양 또는 용량은 합리적인 시간대에 걸쳐 피험자 또는 동물에서 치료학적 또는 예방학적 반응에 영향을 주기에 충분해야 한다. 예를 들어, 본 발명의 CAR 구축물 물질의 용량은, 투여 시점으로부터 약 2 시간 또는 그 이상, 예를 들어, 약 12 내지 약 24 시간 또는 그 이상의 기간에 항원에 결합하거나, 암을 검출하거나 치료하거나 예방하기에 충분해야 한다. 특정 실시태양에서, 시간 기간은 심지어 더 길 수 있다. 용량은 특별한 본 발명의 CAR 구축물 물질 및 동물(예를 들어, 인간)의 증상, 뿐만 아니라 치료되는 동물(예를 들어, 인간)의 체중에 의해 결정될 것이다.
본 발명의 목적을 위해, 예를 들어, 상이한 용량의 T 세포가 각각 제공된 포유동물 세트중에서, 포유동물에 소정의 용량의 T 세포를 투여할 경우, 본 발명의 CAR 구축물중 방출된 CAR을 발현하는 T 세포에 의해 표적 세포가 용해되고/되거나 IFN-γ가 분비되는 정도를 비교함을 포함하는 검정은, 포유동물에게 투여되는 출발 용량을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 특정 용량의 투여시에 표적 세포가 용해되고/되거나 IFN-γ가 분비되는 정도는 당분야에 공지된 방법에 의해 분석될 수 있다.
본 발명의 CAR 구축물 물질이 1종 이상의 추가적인 치료제와 함께 투여되는 경우, 1종 이상의 추가적인 치료제는 포유동물에 공-투여될 수 있다. "공-투여"는, 본 발명의 CAR 구축물 물질이 1종 이상의 추가적인 치료제의 효과를 증진시킬 수 있거나, 이의 반대이도록, 1종 이상의 추가적인 치료제 및 본 발명의 CAR 구축물 물질을 충분히 가까운 시간내에 투여함을 의미한다. 이와 관련하여, 본 발명의 CAR 구축물 물질이 먼저 투여되고 1종 이상의 추가적인 치료제가 두 번째로 투여될 수 있거나, 그 반대일 수 있다. 다르게는, 본 발명의 CAR 구축물 물질 및 1종 이상의 추가적인 치료제는 동시에 투여될 수 있다. CAR 구축물 물질과 공-투여될 수 있는 예시적인 치료제는 IL-2이다. IL-2는 본 발명의 CAR 구축물 물질의 치료학적 효과를 증진시키는 것으로 여겨진다.
본 발명의 CAR 구축물 물질은 포유동물에서 질환을 치료하거나 예방하는 방법에 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 특별한 이론 또는 기작에 얽매이지 않고, 본 발명의 CAR 구축물은, 세포에 의해 발현되는 경우 방출된 CAR이 항원, 예를 들어, CD19 및 CD22중 하나 또는 둘 다를 발현하는 세포에 대하여 면역 반응을 중재할 수 있도록, 생물 활성, 예를 들어, 항원, 예를 들어, CD19 및 CD22중 하나 또는 둘 다를 인식하는 CAR을 방출/절단하는 능력을 갖는다. 이와 관련하여, 본 발명의 하나의 실시태양은 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하기에 효과적인 양으로 본 발명의 임의의 CAR 구축물, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단, 및/또는 약학 조성물을 포유동물에게 투여함을 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 실시태양은 본 발명의 CAR 구축물 물질을 투여하기 이전에 포유 동물로부터 림프구제거(lymphodepletion)를 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 림프구제거의 예로는 비골수파괴성(nonmyeloablative) 림프구제거 화학요법, 골수파괴성(myeloablative) 림프구제거 화학요법, 전신 방사선 조사 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
숙주 세포 또는 세포 집단이 투여되는 본 발명의 방법의 목적을 위해, 세포는 포유동물에 대해 동종이형이거나 자가유래성인 세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 포유동물에 대해 자가유래성이다.
본원에 언급된 포유동물은 임의의 포유동물일 수 있다. 본원에 사용될 경우, 용어 "포유동물"은 임의의 포유동물을 지칭하고, 설치목(Rodentia)의 포유동물, 예컨대 마우스 및 햄스터, 및 중치목(Logomorpha)의 포유동물, 예컨대 토끼를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 포유동물은 식육목(Carnivora), 예컨대 고양이과(Feline)(고양이) 및 개과(Canine)(개)로부터일 수 있다. 포유동물은 우제목(Artiodactyla), 예컨대 소과(소) 및 돼지과(돼지), 또는 기제목( Perissodactyla), 예컨대 말속(말)으로부터일 수 있다. 포유동물은 영장류(Primates), 세보이드(Ceboid), 또는 시모이드(Simoid)(원숭이) 또는 진원류(인간 및 유인원) 목으로부터일 수 있다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
본 발명의 치료 방법에 관하여, 암은 임의의 암일 수 있고, 임의의 급성 림프구성 암, 급성 골수성 백혈병, 포상 횡문근육종, 방광암(예를 들어, 방광 암종), 골암, 뇌암(예를 들어, 수모세포종), 유방암, 항문, 항문관, 또는 항문직장(anorectum)의 암, 안암, 간내담관의 암, 관절의 암, 경부(neck), 담낭, 또는 늑막의 암, 코, 비강, 또는 중이의 암, 구강암, 음문암, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 암, 결장암, 식도암, 자궁경부암, 섬유육종, 위장 유암종, 두경부암(예를 들어, 두부 및 경부의 편평상피 세포 암종), 호지킨(Hodgkin) 림프종, 하인두암, 콩팥암, 후두암, 백혈병, 혈액암(liquid tumor), 간암, 폐암(예를 들어, 비-소 세포 폐 암종), 림프종, 악성 중피종, 비만세포종, 흑색종, 다발성 골수종, 비인두암, 비-호지킨 림프종, B-만성 림프구성 백혈병, B-전구체 급성 림프아구성 백혈병(B-ALL), 전구-B 세포 전구체 급성 림프아구성 백혈병(BCP-ALL), B 세포 림프종, 모양 세포 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 및 버킷의 림프종, 난소암, 췌장암, 복막, 그물막, 및 장간막 암, 인두암, 전립선암, 직장암, 신장암, 피부암, 소장암, 연조직 암, 고형 종양, 위암, 고환암, 갑상선암, 및 신우요관암을 포함한다. 바람직하게는, 암은 혈액학적 악성종양[예를 들어, 백혈병 또는 림프종; 예컨대 제한되지 않지만, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, CLL, 급성 림프구성암, 급성 골수성 백혈병, B-만성 림프구성 백혈병, 모양 세포 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL)(또한 "급성 림프아구성 백혈병"으로서 지칭됨), B-ALL, BCP-ALL, B 세포 림프종, 및 버킷 림프종]이다. 바람직하게는, 암은 CD22 및 CD19중 하나 또는 이들 둘 다를 발현함을 특징으로 하고, 더 바람직하게는 CD19 및 CD22중 하나 또는 이들 둘 다를 발현함을 특징으로 하는 혈액학적 악성종양이다.
용어 "치료하는" 및 "예방하는" 및 이들로부터 유래된 단어들은, 본원에 사용될 경우, 반드시 100% 또는 완전한 치료 또는 예방을 의미할 필요는 없다. 오히려, 당분야의 숙련가가 잠재적 이점 또는 치료학적 효과를 갖는 것으로서 인식하는 다양한 정도의 치료 또는 예방이 존재한다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은 포유동물에서 임의의 수준의 암의 치료 또는 예방의 임의의 양을 제공할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 방법에 의해 제공되는 치료 또는 예방은 치료되거나 예방되는 질환, 예를 들어, 암의 하나 이상의 증상 또는 증후의 치료 또는 예방을 포함할 수 있다. 또한, 본원의 목적을 위해, "예방"은 질환의 개시, 또는 이의 증후 또는 증상을 지연시킴을 포괄할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하는데 있어서의 본 발명의 CAR 구축물, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단, 또는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 포유동물로부터의 하나 이상의 세포를 포함하는 샘플을 본 발명의 CAR 구축물, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단, 또는 약학 조성물과 접촉시킴으로써 복합체를 형성하는 단계, 및 (b) 복합체를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 복합체의 검출이 포유동물에서의 암의 존재를 지시하는, 포유동물에서 암의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
샘플은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 생검 또는 부검에 의해 수득될 수 있다. 생검은 개별체로부터의 조직 및/또는 세포의 제거이다. 이러한 제거는 제거된 조직 및/또는 세포 상에서 실험을 수행하기 위해 개별체로부터 조직 및/또는 세포를 수집하는 것일 수 있다. 이러한 실험은, 개별체가 특정 증상 또는 질환-상태를 갖고/갖거나 이로부터 고통받는지를 결정하기 위한 실험을 포함할 수 있다. 증상 또는 질환은, 예를 들어, 암일 수 있다.
포유동물에서 암의 존재를 검출하는 본 발명의 방법의 실시태양과 관련하여, 포유동물의 세포를 포함하는 샘플은 전체 세포, 이의 용해물, 또는 전체 세포 용해물의 분별물, 예를 들어, 핵 또는 세포질 분별물, 전체 단백질 분별물, 또는 핵산 분별물을 포함하는 샘플일 수 있다. 샘플이 전체 세포를 포함한다면, 세포는 포유동물의 임의의 세포, 예를 들어, 임의의 기관 또는 조직의 세포, 예컨대 혈액 세포 또는 내피 세포일 수 있다.
발명의 검출 방법의 목적을 위해, 접촉은 포유동물과 관련하여 시험관내 또는 생체내에서 일어날 수 있다. 바람직하게는, 접촉은 시험관내에서이다.
또한, 복합체의 검출은 당분야에 공지된 임의의 수의 방식들을 통해 발생할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 본 발명의 CAR 구축물, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 또는 세포 집단은, 검출가능한 라벨, 예컨대, 예를 들어, 방사성동위원소, 형광단[예를 들어, 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC: fluorescein isothiocyanate), 파이코에리트린(PE: phycoerythrin)], 효소[예를 들어, 알칼리성 포스파타아제, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)], 및 원소 입자(예를 들어, 금 입자)에 의해 표지화될 수 있다.
표적 세포를 인식하는 능력 및 항원 특이성에 대하여 CAR을 시험하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 클레이(Clay) 등의 문헌[J. Immunol, 163: 507-513 (1999)]은, 사이토킨[예를 들어, 인터페론-γ, 과립구/단핵구 콜로니 자극 인자(GM-CSF: granulocyte/monocyte colony stimulating factor), 종양 괴사 인자 α(TNF-α: tumor necrosis factor-α) 또는 인터류킨(interleukin) 2(IL-2)]의 방출을 측정하는 방법을 교시한다. 또한, CAR 작용은 자오(Zhao) 등의 문헌[J. Immunol, 174: 4415-4423 (2005)]에 기재된 바와 같은 세포 독성을 측정함으로써 평가될 수 있다.
다음은 본 발명의 특정 양태를 포함한다.
1. (a) 절단가능한 도메인;
(b) 제1 항원 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제1 키메라성 항원 수용체(CAR); 및
(c) 제2 항원 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함하는 CAR 아미노산 구축물로서,
제1 및 제2 CAR이 절단가능한 도메인을 통해 연결되고,
제1 항원 결합 도메인이 m971 항체의 항원 결합 도메인을 포함하고,
제1 CAR이 CAR 아미노산 구축물로부터 절단될 때, 제1 항원 결합 도메인이 CD22에 대한 항원 특이성을 갖는,
키메라성 항원 수용체(CAR) 아미노산 구축물.
2. 절단가능한 도메인의 절단이 제1 및 제2 CAR을 CAR 구축물로부터 방출시키는, 제1 양태에 따른 CAR 구축물.
3. 제1 항원 결합 도메인이 서열번호 3 내지 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 11 내지 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 제1 또는 제2 양태에 따른 CAR 구축물.
4. 제1 항원 결합 도메인이 서열번호 3 내지 9 및 11 내지 17의 아미노산 서열을 포함하는, 제1 양태 내지 제3 양태중 어느 한 양태에 따른 CAR 구축물.
5. 제2 CAR이 구축물로부터 절단될 때, 제2 항원 결합 도메인이 CD19에 대한 항원 특이성을 갖는, 제1 양태 내지 제4 양태중 어느 한 양태에 따른 CAR 구축물.
6. 제2 항원 결합 도메인이 FMC63 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는, 제1 양태 내지 제5 양태중 어느 한 양태에 따른 CAR 구축물.
7. 제2 항원 결합 도메인이 서열번호 31 내지 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23 내지 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 제1 양태 내지 제6 양태중 어느 한 양태에 따른 CAR 구축물.
8. 제2 항원 결합 도메인이 서열번호 23 내지 29 및 31 내지 37의 아미노산 서열을 포함하는, 제1 양태 내지 제7 양태중 어느 한 양태에 따른 CAR 구축물.
9. (a) 절단가능한 도메인;
(b) 제1 항원 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR; 및
(c) 제2 항원 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함하는 CAR 아미노산 구축물로서,
제1 및 제2 CAR이 절단가능한 도메인을 통해 연결되고,
제1 항원 결합 도메인이 FMC63 항체의 항원 결합 도메인을 포함하고,
제1 CAR이 CAR 아미노산 구축물로부터 절단될 때, 제1 항원 결합 도메인이 CD19에 대한 항원 특이성을 갖는,
키메라성 항원 수용체(CAR) 아미노산 구축물.
10. 절단가능한 도메인의 절단이 제1 및 제2 CAR을 CAR 구축물로부터 방출시키는, 제9 양태에 따른 CAR 구축물.
11. 제1 항원 결합 도메인이 서열번호 31 내지 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23 내지 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 제9 양태 또는 제10 양태에 따른 CAR 구축물.
12. 제1 항원 결합 도메인이 서열번호 23 내지 29 및 31 내지 37의 아미노산 서열을 포함하는, 제9 양태 내지 제11 양태중 어느 한 양태에 따른 CAR 구축물.
13. 제2 CAR이 구축물로부터 절단될 때, 제2 항원 결합 도메인이 CD22에 대한 항원 특이성을 갖는, 제9 양태 내지 제12 양태중 어느 한 양태에 따른 CAR 구축물.
14. 제1 또는 제2 막관통 도메인이 CD8 막관통 도메인 및 CD8 힌지 도메인을 포함하는, 제1 양태 내지 제13 양태중 어느 한 양태에 따른 CAR 구축물.
15. CD8 막관통 도메인이 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하고 CD8 힌지 도메인이 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는, 제14 양태에 따른 CAR 구축물.
16. 제1 또는 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인이 4-1BB 세포내 T 세포 신호전달 서열을 포함하는, 제1 양태 내지 제15 양태중 어느 한 양태에 따른 CAR 구축물.
17. 4-1BB 세포내 T 세포 신호전달 서열이 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는, 제16 양태에 따른 CAR 구축물.
18. 제1 또는 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인이 CD3 제타(ζ) 세포내 T 세포 신호전달 서열을 포함하는, 제1 양태 내지 제17 양태중 어느 한 양태에 따른 CAR 구축물.
19. CO3ζ 세포내 T 세포 신호전달 서열이 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는, 제18 양태에 따른 CAR 구축물.
20. 절단가능한 도메인이 2A 또는 퓨린인, 제1 양태 내지 제19 양태중 어느 한 양태에 따른 CAR 구축물.
21. CAR 구축물이 각각 제1 및 제2 CAR인 정확히 2개의 CAR을 포함하는, 제1 양태 내지 제20 양태중 어느 한 양태에 따른 CAR 구축물.
22. 서열번호 48, 49, 50, 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 항원 수용체(CAR) 아미노산 구축물.
23. 서열번호 63 내지 70중 어느 하나와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성(예를 들어, 100%)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 항원 수용체(CAR) 아미노산 구축물.
24. (a) 2개 이상의 절단가능한 도메인;
(b) 제1 항원 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR; 및
(c) 제2 항원 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR을 포함하는 CAR 아미노산 구축물로서,
제1 및 제2 CAR이 2개 이상의 절단가능한 도메인을 통해 연결되는, 키메라성 항원 수용체(CAR) 아미노산 구축물.
25. 2개 이상의 절단가능한 도메인이 바로 인접해 있거나, 적어도 2개의 절단가능한 도메인 사이에 적어도 1개의 연결기를 갖는, 제24 양태의 CAR 구축물.
26. 정확히 2개의 절단가능한 도메인이 존재하는, 제24 양태 또는 제25 양태의 CAR 구축물.
27. 제1 양태 내지 제26 양태중 어느 한 양태의 CAR 아미노산 구축물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
28. 서열번호 53 내지 57 또는 71 내지 78중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 제27 양태에 따른 핵산.
29. 제27 양태 또는 제28 양태의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
30. 제29 양태의 재조합 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
31. 제30 양태의 적어도 1종의 숙주 세포를 포함하는 세포 집단.
32. 제1 양태 내지 제26 양태중 어느 한 양태의 CAR 구축물, 제27 양태 또는 제28 양태의 핵산, 제29 양태의 재조합 발현 벡터, 제30 양태의 숙주 세포, 또는 제31 양태의 세포 집단, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
33. (a) 포유동물로부터의 하나 이상의 세포를 포함하는 샘플을 제1 양태 내지 제26 양태중 어느 한 양태의 CAR 구축물, 제27 양태 또는 제28 양태의 핵산, 제29 양태의 재조합 발현 벡터, 제30 양태의 숙주 세포, 제31 양태의 세포 집단, 또는 제32 양태의 약학 조성물과 접촉시킴으로써 복합체를 형성하는 단계; 및
(b) 복합체를 검출하는 단계(여기서 복합체의 검출은 포유동물에서 암의 존재를 지시함)
를 포함하는, 포유동물에서 암의 존재를 검출하는 방법.
34. 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한, 제1 양태 내지 제26 양태중 어느 한 양태의 CAR 구축물, 제27 양태 또는 제28 양태의 핵산, 제29 양태의 재조합 발현 벡터, 제30 양태의 숙주 세포, 제31 양태의 세포 집단, 또는 제32 양태의 약학 조성물.
35. 암이 혈액학적 악성종양인, 제34 양태의 용도를 위한 CAR 구축물.
36. (a) 제1 항원 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CAR, 및 (b) 제2 항원 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CAR 사이에 2개 이상의 절단가능한 도메인을 고안하는 단계(여기서 제1 및 제2 CAR은 2개 이상의 절단가능한 도메인을 통해 연결됨); 및
N-말단에서 C-말단으로 제1 CAR, 2개 이상의 절단가능한 도메인, 및 제2 CAR을 포함하는 서열을 플라스미드내로 클로닝하는 단계
를 포함하는, 키메라성 항원 수용체(CAR) 아미노산 구축물을 제조하는 방법.
37. 2개 이상의 절단가능한 도메인이 바로 인접해 있거나, 적어도 2개의 절단가능한 도메인 사이에 적어도 1개의 연결기를 갖는 제36 양태의 방법.
38. 정확히 2개의 절단가능한 도메인이 존재하는 제36 양태 또는 제37 양태의 방법.
하기 실시예는 추가로 본 발명을 예시하지만, 물론 그의 범주를 임의의 방식으로 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1
본 실시예는, 본 발명의 실시태양에 따라서, CAR 구축물, CAR 구축물-인코딩 렌티바이러스 벡터, 및 CAR-발현 T 세포의 생성, 뿐만 아니라 비교를 위한 다른 CAR의 생성을 보여준다.
CAR 구축물을 제네위츠(GENEWIZ)(미국 뉴저지주 사우쓰 플레인필드)에 의해 합성한 다음, 렌티-바이러스 플라스미드 주쇄내로 NhE1 및 HincII 자리 사이에 서브클로닝하였다.
CAR 구축물-인코딩 렌티바이러스 벡터를 293T 세포주의 일시적 형질감염에 의해 생산하였다. 간단히, 293T 세포를 폴리-D 라이신 코팅된 15 cm 플레이트[비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 새너웨이]에 플레이팅하였다. 다음날, 리포펙타민 3000[라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 칼스바드]을 사용하여 CAR 구축물을 인코딩하는 플라스미드에 의해 패키징(packaging) 및 엔벨롭(envelope) 벡터(pMDLg/pRRE, pMD-2G, 및 pRSV-Rev)와 함께 293T 세포를 형질감염시켰다. 렌티바이러스 상청액을 형질 감염후 48 내지 72 시간째 수집하고, 3000 RPM에서 10 분 동안 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하고, 이후 -80℃에서 저장하였다. 정상 공여자로부터의 인간 PBMC를 40 IU/㎖의 재조합 IL-2[rhIL-2; 로슈(Roche), 스위스 바셀]가 함유된 AIM-V 배지중에서 24 시간 동안 1 : 1 비의 CD3/CD28 마이크로비이드(microbead)(라이프 테크놀로지스)에 의해 활성화시켰다. 활성화된 T 세포를 3 ㎖의 렌티바이러스 상청액 + 10 ㎍/㎖의 프로타민 황산염 및 100 IU/㎖의 IL-2가 함유된 1 ㎖의 신선한 AIM-V 배지당 2 밀리온 세포로 재현탁시키고, 6-웰 플레이트에서 배양시켰다. 플레이트를 1000 x g에서 2 시간 동안 32℃하에 원심분리한 다음 37℃에서 하룻밤 항온처리하였다. 다음날 제2 형질도입을 수행하였다. 3일째, CD3/CD28 비이드를 제거하고, 세포를 100 IU/㎖의 IL-2가 함유된 AIM-V에서 300,000 세포/㎖로 배양시켰고, 이때 8일 또는 9일째 수거할 때까지 2 내지 3일에 한번씩 신선한 IL2-함유 배지를 첨가하였다.
단일 항-CD19 CAR, 단일 항-CD22 CAR, 및 이중특이적 LoopCAR6을 위한 벡터를 293T 렌티 패키징 세포주의 일시적 형질감염에 의해 생산하였다.
항-CD19 CAR의 서열은 다음과 같다:
Figure pct00045
.
항-CD22 CAR의 서열은 다음과 같다:
Figure pct00046
.
LoopCAR6은 국제 특허출원 공개공보 제WO 2016/149578호에 기재되어 있고, 다음과 같은 서열을 갖는다:
Figure pct00047
.
실시예 2
본 실시예는, 본 발명의 실시태양에 따라서, CAR 구축물로부터 절단된 CAR의 인간 T 세포 상에서의 표면 발현을 다른 CAR과 비교하여 보여준다.
V1 형질도입된 T 세포 상에서의 항-CD19 CAR 및 항-CD22 CAR의 표면 발현은 약 15%인 반면, 단일 항-CD19 CAR만을 인코딩하는 벡터로부터의 항-CD19 CAR의 발현은 61%이고 단일 항-CD22 CAR만을 인코딩하는 벡터로부터의 항-CD22 CAR의 발현은 56%이다(도 2a 내지 2c).
건강한 공여자로부터의 인간 PBMC를 CD3/CD28 마이크로비이드에 의해 24 시간 동안 활성화시켰다. 이어서, 활성화된 T 세포에 벡터를 개별적으로 형질도입하거나, 단일 항-CD19 CAR 및 단일 항-CD22 CAR 벡터 둘 다와 함께 공-형질도입하였다. 항-CD19 CAR 및 항-CD22 CAR의 표면 발현을 8일째 분석하였다. 공형질도입된 T 세포는, 이중특이적 LoopCAR6에 비하여, 항-CD19 및 항-CD22 CAR 둘 다를 훨씬 더 낮게 발현하였다. 공-형질도입된 T 세포상에서의 항-CD19 및 항-CD22 CAR의 발현은 동일한 몰 비로 존재하지 않았다. 대조적으로, LoopCAR6은 항-CD19 및 항-CD22 CAR의 발현에 있어서 거의 1 : 1의 비를 나타내었고, 이는 사선 도표로서 표시된다. 도 3을 참조한다.
이중특이적 LoopCAR6, 및 V1 및 V5 CAR을 위한 벡터를 293T 렌티 패키징 세포주의 일시적 형질감염에 의해 생산하였다. 건강한 공여자로부터의 인간 PBMC를 CD3/CD28 마이크로비이드에 의해 24 시간 동안 활성화시켰다. 이어서, 활성화된 T 세포에 벡터를 형질도입하였다. 항-CD19 CAR 및 항-CD22 CAR의 표면 발현을 유세포분석기에 의해 7일째 분석하였다. V5 CAR을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 T 세포는, V1 CAR을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 T 세포에 비하여, CAR의 절단에 의해 제공된 분리된 항-CD19 CAR 및 분리된 항-CD22 CAR 둘 다의 더 높은 세포 표면 발현을 나타내었다(도 4).
실시예 3
본 실시예는, 본 발명의 실시태양에 따라서, 사이토킨 생산에 근거한 CAR 구축물의 시험관내 활성을 다른 CAR과 비교하여 보여준다.
CAR-형질도입된 T 세포(1E5)를 1 x PBS에 의해 3회 세척한 다음, 96-웰 플레이트에서 200 ㎖의 RPMI 배지중에서 동수의 표적 세포와 함께 37℃의 항온처리기에서 15 내지 20 시간 동안 공-항온처리하였다. 표적 세포는 CD19 또는 CD22, 또는 CD19 및 CD22 둘 다를 발현하는 K562였다. 562 세포는 음성 대조군으로서 작용하였다. 배양 상청액중 IL2 및 IFNγ의 사이토킨 수준을 ELISA 키트[알앤디 시스템스(R&D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스]에 의해 측정하였다. 모든 시험을 3중으로 설정하였다. V1 CAR T 세포는 CD22 발현 표적 세포와 함께 공-배양될 경우 다수의 IL2 및 IFNg를 만들었지만, CD19 발현 표적 세포와 함께 공-배양될 경우 단지 낮은 수준의 IL2 및 IFNg를 만들었다(도 5a 및 5b).
표적 항원을 발현하기 위해 CML 세포주 K562에 CD19 또는 CD22, 또는 둘 다를 인공적으로 형질도입하였다. K562 세포는 음성 대조군으로서 작용하였다. 1E5의 CAR T 세포를 3회 세척한 다음, RPMI 배지에서 37℃하에 1E5의 표적 세포와 함께 공-항온처리하였다. 14 시간 이후, 배양 상청액을 수거하고, 사이토킨의 생산을 ELISA 키트에 의해 측정하였다. 이중특이적 LoopCAR6 및 항-CD19 및 항-CD22 단일 CAR과 비교하여, V5는 K562 상에서 발현된 표적 항원과 공-항온처리될 경우 IL2 및 IFNg 둘 다를 가장 높은 수준으로 만들었다. 이중특이적 LoopCAR6 및 항-CD19 및 항-CD22 단일 CAR과 비교하여, V1은 K562 상에서 발현된 표적 항원과 공-항온처리될 경우 IL2 및 IFNg 둘 다를 다량으로 만들었다. 도 6a 및 6b를 참조한다.
B 세포 백혈병 세포주 NALM6은 CD19 및 CD22 표면 항원 둘 다를 발현한다. CD19 또는 CD22는 CRISPR/Cas9 기술에 의해 넉아웃(knock out)되어 이들 표적 항원의 발현을 제거한다. NALM6 세포는 양성 대조군으로서 작용하였다. 1E5의 CAR T 세포를 3회 세척한 다음, 1E5의 표적 세포와 함께 RPMI 배지에서 37℃하에 공-항온처리하였다. 14 시간 이후, 배양 상청액을 수거하고, 사이토킨의 생산을 ELISA 키트에 의해 측정하였다. V5는, 이중특이적 LoopCAR6 및 항-CD19 및 항-CD22 단일 CAR과 비교하여, NALM6 상에서 발현된 CD19와 함께 공-항온처리될 경우 IL2 및 IFNg 둘 다를 가장 높은 수준으로 만들었다. V5는, 항-CD22 단일 CAR과 비교하여, NALM6 상에서 발현된 CD22와 함께 공-항온처리될 경우 더 낮은 양의 IL2 및 IFNg를 만들었다. V1은, V5 CAR과 비교하여, NALM6 상에서 발현된 표적 항원과 함께 공-항온처리될 경우 소량의 IL2 및 IFNg를 만들었다. V1은 이중특이적 LoopCAR6 및 항-CD19 및 항-CD22 단일 CAR과 필적할만한 양의 IL2 및 IFNg를 만들었다. 도 7a 및 7b를 참조한다.
CAR T 세포를 18 시간 동안 NALM6 종양 세포와 공-항온처리하고, 배양 상청액중 IL2 생산의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 비시스(bicis)-V5 및 비시스-V6은 상승적 효과를 가질 수 있다.
실시예 4
본 실시예는, 본 발명의 실시태양에 따라서, CAR 구축물을 사용하는 재발성 백혈병 모델의 치료를 다른 CAR과 비교하여 보여준다.
생물발광 영상을 사용하여 백혈병 진행을 생체내에서 추적하였다. 0일째, 0.5 밀리온의 CD19KO NALM6 세포를 동수의 CD22KO NALM6 세포와 혼합하고, NSG 마우스에게 주사하였다. 3일 후, 이들 마우스를 3 밀리온의 CAR T 세포 또는 모의 T 세포에 의해 치료하였다.
V1 CAR을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 T 세포의 사용은 백혈병을 완전히 근절한 것으로 보인 반면, 단일 항-CD19 CAR 또는 단일 항-CD22 CAR을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 T 세포의 사용은 이에 실패하였다(도 9).
마우스를 14일째 안락사시켰다. 백혈병의 검출을 위해 골수(BM) 세포를 항-CD19 또는 항-CD22 항체로 염색시키고, 또한 항-CD22 CAR 또는 항-CD19 CAR의 검출을 위해 CD22 Fc 또는 CD19의 항-유전자형으로 염색시켰다.
V1 CAR을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 T 세포에 의해 치료된 마우스에서 백혈병은 검출되지 않은 반면, 단일 항-CD19 CAR 또는 단일 항-CD22 CAR을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 T 세포에 의해 치료된 마우스에서는 종양 크기가 컸다. 모의 T 세포에 의해 치료된 마우스에서는 종양 크기가 컸다. V1 CAR T 세포는 BM 구획에서 14일까지 지속되었다.
0일째, NSG 마우스에게 혼합된 백혈병 세포(0.1E6의 NALM6 및 0.1E6의 NALM6-CD19- 및 0.1E6의 NALM6-CD22-)를 주사하였다. 3일째, 마우스는 6E6의 CAR+ T 세포를 공급받는 그룹 2(G2)를 제외한 모든 그룹에서 3E6의 CAR+ T 세포를 공급받았다. 그룹 5(G5)에서 마우스는 CD19 CAR 및 CD22 CAR 공-형질도입된 T 세포를 공급받았다. 그룹 6(G6)에서 마우스는 3E6의 CD19 CAR 및 3E6의 CD22 CAR을 공-투여받았다. 그룹 9(G9)에서 마우스는 렌티-GFP+ T 세포를 공급받았고, 음성 대조군으로서 작용하였다. 생물발광 강도는 종양 크기를 나타낸다. 데이터는, CAR T 세포(3E6)의 동일한 용량 수준에서 비시스트론성-V1 CAR이 재발성 모델에서 백혈병을 감소시키기 위해 가장 강력할 수 있음을 시사한다(도 10).
실시예 5
본 실시예는, 본 발명의 실시태양에 따라서, CAR 구축물을 사용하는 CD19- 및 CD22- 백혈병의 치료를 다른 CAR과 비교하여 보여준다.
생물발광 영상을 사용하여 백혈병 진행을 생체내에서 추적하였다. 0일째, 0.5 밀리온의 CD19KO NALM6 세포를 동수의 CD22KO NALM6 세포와 혼합하고, NSG 마우스에게 주사하였다. 3일 후, 이들 마우스를 3 밀리온의 CAR T 세포에 의해 치료하였다.
V1 CAR을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 T 세포의 사용은 백혈병을 거의 완전히 소거한 것으로 보인 반면, 단일 항-CD19 CAR 또는 단일 항-CD22 CAR을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 T 세포의 사용은 이에 실패하였다(도 11).
NSG 마우스를 1E5의 NALM6 세포, 1E5의 NALM6-CD19KO 세포 및 1E5의 CD22KO 백혈병 세포에 의해 0일째 시험감염시킨 다음, 3E6의 CAR+ T 세포를 3일째 공급하였다. 생물발광 강도는 종양 크기를 나타낸다. 영상은 V1, V5, V6, 및 V7 CAR이 CD19+CD22+ 백혈병 둘 다를 감소시키는데 효율적이고, 또한 CD19-음성 및 CD22-음성 백혈병 세포, 뿐만 아니라 항-CD19 또는 항-CD22 단일 CAR은 이에 실패하였음을 나타낸다(도 12).
실시예 6
본 실시예는, 본 발명의 실시태양에 따라서, CAR 구축물에 의한 백혈병의 치료를 다른 CAR과 비교하여 보여준다.
NSG 마우스를 0일째 1E6의 NALM6 백혈병 세포에 의해 시험감염시켰다. 그룹 1 및 그룹 2(마우스 그룹을 위해 도 13을 참조함)에서의 마우스는 단일 항-CD19 CAR 또는 단일 항-CD22를 인코딩하는 벡터가 형질도입된 1E6의 T 세포에 의해 3일째 및 다른 단일 CAR을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 3E6의 T 세포에 의해 7일째 순차적으로 치료를 받았다. 그룹 3에서의 마우스는 단일 항-CD19 CAR을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 3E6의 T 세포 및 단일 항-CD22 CAR을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 3E6의 T 세포에 의해 3일째 총 6E6의 CAR+ T 세포의 공-투여를 공급받았다. 그룹 4 내지 7에서의 마우스는 도 13에 지시된 CAR을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 3E6의 T 세포를 3일째 공급받았다. 그룹 4에서의 마우스는 공-형질도입된 T 세포 상에서의 낮은 발현에 기인하여 거의 10E6의 총 CAR+ T 세포를 공급받았다. 도 13은 CD19 및 CD22 둘 다의 동시적 표적화가 단일 표적화 CAR에 의한 순차적 치료에 비해 더 우수함을 보여준다.
NSG 마우스를 0.25E6의 NALM6-CD19KO 및 0.25E6의 CD22KO 백혈병 세포에 의해 0일째 시험감염시켰다. 3일째, NSG 마우스에게 3E6의 CAR+ T 세포를 주사하였다. V1 CAR을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 T 세포의 사용 및 V5 CAR을 인코딩하는 벡터가 형질도입된 T 세포의 사용은 CD19- 및 CD22- 백혈병 세포 둘 다를 완전히 근절시킨것으로 보인다(도 14).
실시예 7
본 실시예는, 본 발명의 실시태양에 따라서, 이중특이적 CAR을 보여준다.
인간 백혈병 샘플
NCI IRB 승인된 선별 프로토콜(protocol)을 통해 환자 샘플을 항원 발현에 대해 선별하였다. 국립 암 연구소(NCI: National Cancer Institute)-IRB 승인된 조직 획득 프로토콜에 대해 사전 동의 후, 이종이식편 생성을 위한 인간 ALL 샘플을 수집하고, 저장하였다. 인간 피험체로부터의 모든 연구 견본을 헬싱키 조약(Declaration of Helsinki)에 따라서 사전 동의하에 수득하였다.
세포주 및 배양 조건
다음과 같은 백혈병 세포주를 사용하였다: 적백혈병 K562-CD22[인간 CD22에 의해 형질도입됨, 제네코포에이아(GeneCopoeia), 카탈로그 번호: EX-Z9364-Lv151], K562-CD19(인간 CD19에 의해 형질도입됨), K562-CD19CD22(인간 CD19 및 CD22 둘 다에 의해 형질도입됨), 음성 대조군으로서의 형질도입되지 않은 K562; B 세포 급성 림프아구성 백혈병 세포주 NALM6, NALM6-GL(GFP 및 루시페라아제에 의해 형질도입됨) 및 REH-TSLPR-GL[킨(Qin) 등의 문헌 "Blood, 126: 629-39 (2015)", 참고로 혼입됨]. 세포주를 10% 열-불활성화된 FBS, 1OmM HEPES, 100 U/㎖의 페니실린(penicillin), 100 μg/㎖의 스트렙토마이신, 및 2 mM L-글루타민[인비트로겐(Invitrogen)]이 보충된 배지에서 배양시켰다. 렌티-X 293T 렌티 패키징 세포주(클론텍. 카탈로그 번호 632180)를 DMEM(인비트로겐) 배지에서 배양시켰다.
CD19 neg 및 CD22 neg 백혈병 재발성 모델의 생성
CR1SPR Cas9 기술을 사용하여 Nalm6을 편집함으로써 NALM6-CD19neg-GL(엑손 3 상의 CRISPR CD19), NALM6-CD22neg-GL(엑손 6 상의 CRISPR CD22)을 생성하였다. NALM6 상에 CD19 또는 CD22를 편집하는 CRISPR/Cas9 유전자를 위한 렌티바이러스 벡터는 이전에 기재되어 있다[프라이(Fry) 등의 문헌 "Nat. Med., 24: 20-28 (2018)", 참고로 혼입됨]. 간단히, 안내-RNA를 http://crispr.mit.edu/에 의해 최적화하고, 렌티CRISPR v2 플라스미드[애드진(Addgene) 플라스미드 52,961]내로 클로닝하였다. 이어서 플라스미드를 패키징 플라스미드와 함께 공-형질감염시키고, HEK293T 세포내로 형질전환시켰다. 2일 이후, 상청액을 수거하고, 여과하고, 농축시켰다. 바이러스 형질도입을 위해, 105의 NALM6 세포를 10 ㎖의 농축된 바이러스 상청액과 함께 2일 동안 항온처리한 후, RPMI 배지에서 팽창시켰다. 세포 표현형을 유세포분석에 의해 평가한 후, 표현형 변경 및 단일-세포 클로닝에 의해 세포를 분류하였다. 단일-세포 클론 상에서 서열분석을 수행하여 유전자형 변경을 확인하였다.
CAR 렌티바이러스 벡터 생산 및 T 세포 형질도입
2가 CAR 구축물을 고안하고 합성한 후, 렌티바이러스 전달 플라스미드내로 클로닝하였다. 2가 CAR-인코딩 렌티바이러스 벡터를 렌티-X 293T 렌티 패키징 세포주의 일시적 형질감염에 의해 생산하였다. 간단히, 렌티-X 293T 세포를 폴리-D 라이신 코팅된 15-cm 플레이트에 플레이팅하였다(비디 바이오사이언시즈). 다음날, 렌티-X 293T 세포를, 리포펙타민 3000[써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)]을 사용하여 CAR 구축물을 인코딩하는 플라스미드에 의해 패키징 및 엔벨롭 벡터(pMDLg/pRRE, pMD-2G, 및 pRSV-Rev)와 함께 형질감염시켰다. 렌티바이러스 상청액을 형질감염 후 24 및 48 시간째 수거하고, 3000 RPM에서 10 분 동안 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하고, 드라이 아이스 상에서 동결시키고, -80℃에서 저장하였다. 정상 공여자로부터의 인간 PBMC를 NIH-승인된 프로토콜에 의해 수득하고, 1 : 3 비의 CD3/CD28 마이크로비이드[다이나비즈(Dynabeads) 인간 T-익스팬더(Expander) CD3/CD28, 써모 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 11141D]에 의해 40 IU/㎖의 재조합 IL-2 및 5% FBS가 함유된 AIM-V 배지에서 24 시간 동안 활성화시켰다. 활성화된 T 세포를 6-웰 플레이트에서 10 μg/㎖ 및 100 IU/㎖의 IL-2의 최종 농도에서 2 ㎖의 렌티바이러스 상청액 + 프로타민 황산염이 함유된 1 ㎖의 신선한 AIM-V 배지당 2 밀리온 세포로 재현탁시켰다. 플레이트를 1000 x g에서 2 시간 동안 32℃하에 원심분리하고, 하룻밤 37℃에서 항온처리하였다. 다음날 상기 기재된 동일한 형질도입 절차를 반복함으로써 제2 형질도입을 수행하였다. CD3/CD28 비이드를 형질도입 후 3일째 제거하고, 세포를 100 IU/㎖의 IL2이 함유된 AIM-V에서 300,000 세포/㎖로 배양시켰고, 8 또는 9일째 수거할 때까지 신선한 IL2-함유 배지를 2 내지 3일 마다 첨가하였다.
유세포분석
CD22-Fc(알앤디 시스템스)를 사용하여 CD22 CAR-형질도입된 T 세포의 표면 발현을 유세포분석에 의해 결정한 후, 인간 IgG-Fc에 특이적인 PE-F(ab)2 또는 APC-F(ab)2(잭슨 이뮤노리서치 래보레이토리즈)와 함께 항온처리하였다. 라이트닝-링크(Lightning-Link) APC 항체 라벨링 키트[노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals)]를 사용하여 APC와 컨주게이션된 항-CD19 유전자형 또는 재조합 인간 CD19 Fc 키메라 단백질(알앤디 시스템스)에 의해 CD19 CAR-형질도입된 T 세포의 표면 발현을 검출하였다. 개별 도면에 대해 지시된 바와 같은 검출 시약 둘 다의 조합물을 사용하여 2가 CAR의 발현을 평가하였다. B-ALL 세포주 상에서의 CD19 및 CD22의 발현을 다음의 항-인간 항체에 의해 검출하였다: CD45-PerCP-Cy5.5[이바이오사이언스(eBioscience)], CD19-퍼시픽 블루(Pacific Blue), CD19-APC-Cy7, CD10-PE-Cy7, 및 CD22-PE[바이오레전드(Biolegend)]. T 세포는 다음의 항체에 의해 특징지워 졌다: CD3-APC-Cy7, CD4-퍼시픽 블루, 및 CD8a-PE-Cy7(바이오레전드).
인큐사이트 세포독성 검정
100 ㎕의 RPMI 배지중 5E4의 표적 종양 세포를 96-웰 플레이트[코닝(Corning: 등록상표) 바이오코트(BioCoat: 상표명) 폴리-L-라이신 96-웰 클리어(Well Clear) TC-처리된 환저 검정 플레이트]에 적재하였다. 다음날 동량의 CAR T 세포를 지정된 웰에 첨가하였다. 아포토시스(apoptosis) 표지[에센 바이오사이언스(Essen Bioscience)]를 1OO ㎕의 PBS에서 희석시키고, 1 ㎕의 희석제를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 GFP 형광 발현에 대해 스캐닝하여 아포토시스 GFP-양성 세포 소멸을 인큐사이트 ZOOM(등록상표) 시스템에 의해 30 분 마다 40 시간의 기간 동안 모니터링하였다. 세포 살해의 백분율은 각 시점에서 기선에 대해 결정되었다.
사이토킨 생산의 분석
표적 종양 세포 및 형질도입된 CAR 양성 T 세포를 PBS에 의해 3회 세척하고 RPMI에 1E6/㎖로 재현탁시켰다. lOO ㎕의 종양 세포 현탁액 및 1OO ㎕의 CAR T 세포 현탁액을 대조군으로서 단지 T 세포만 및 단지 종양 세포만을 갖는 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 이중으로 또는 삼중으로 적재하였다. 37℃의 항온처리기에서 18 시간 이후, 배양 상청액을 수거하여 ELISA[알앤디 바이오사이언시즈(R&D Biosciences)] 또는 멀티플렉스(multiplex) 검정[메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)]에 의해 사이토킨을 검출하였다.
생체내 연구
동물 실험을 NCI 베테스다 동물실험 윤리 위원회(Bethesda Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜하에 실행하였다. B-ALL 세포주 및 이종이식된 인간 B-ALL 견본을 NSG 마우스[NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ, 잭슨 래보레이토리즈(Jakcson Laboratories)]에게 정맥내로 주사하였다. 루시페라아제-발현 세포주의 경우, 제노겐(Xenogen) IVIS 루미나(Lumina)[캘리퍼 라이프 사이언시즈(Caliper Life Sciences)]를 사용하여 백혈병을 검출하였다. 마우스에게 복강내로 3 mg의 D-루시페린(luciferin)(캘리퍼 라이프 사이언시즈)을 주사하고, NALM6 에 대해 30 초 및 PDX에 대해 2 분간 노출시킨지 4 분 후에 영상촬영하였다. 리빙 이미지(Living Image) 버전 4.1 소프트웨어(캘리퍼 라이프 사이언시즈)를 사용하여 각 마우스에 대해 생물발광 신호 흐름을 광자/s/㎠/sr로서 분석하였다. 비-루시페라아제 발현 이종이식편에서 백혈병 크기는 말초 혈액, 골수 및 비장의 유세포분석에 의해 측정하였다.
환자-유래된 이종이식편
PDX 모델의 생성을 위해 다음의 1차 샘플을 사용하였다: CD19- ALL 및 CD19+CD22dim[드 노보 재발성 견본 ALL_H0113_post22_r(CAR3), ALL_H0090_post19_pd(HMB15). 1E6 내지 10E6의 환자 ALL 세포를 NSG 마우스(NOD scid 감마, NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ; 잭슨 이뮤노리서치 래보레이토리즈)에게 정맥내로 주사함으로써 PDX를 생성하였다. 2회의 성공적인 계대배양 이후, PDX 세포주에 렌티-GFP-Luc 바이러스를 형질도입하고, 제1 및 제2 계대배양 이후 GFP 및 루시페라아제의 높은 발현에 대해 분류하였다. 생체내 GFP-형질도입된 PDX 백혈병 크기를 매주 형광 영상에 의해 평가하였고, 인간 ALL이 형광 영상에 의해 검출가능한 경우, 동물을 CAR T 세포에 의해 꼬리 정맥 주사를 통해 치료하였다. 건강한 공여자로부터의 현탁분리된(elutriated) 인간 림프구를 미국 국립 보건원(NIH) 임상 센터의 수혈 의학과(Department of Transfusion Medicine)로부터 IRB-승인된 프로토콜하에 수득하였다. 인간 림프구를 AIM-V 배지에서 배양시켰다.
PDX 모델의 게놈 분석
핵산 추출을 생존가능한 동결보존된 샘플 상에서 키아겐(Qiagen) 알프렙 마이크로 키트(AllPrep micro kit)에 의해 제조업체 프로토콜(키아겐)에 따라 수행하였다. 아길런트(Agilent) 2100 생물분석기를 사용하여 DNA 및 RNA를 정량화하고, 품질을 평가하였다. 폴리-아데닐화 RNA 라이브러리를 생성하고, 트루세크(TruSeq) 4.0 케미스트리(chemistry)를 사용하여 Hiseq2500[일루미나(Illumina)] 플랫폼 상에서 서열분석하였다. 전체 진유전체 데이터를 아길런트 슈어셀렉트(SureSelect) XT 휴먼 올 엑손(Human All Exon) V5 및 트루세크 V4 케미스트리에 의해 생성하고, HiSeq 2500(일루미나)에 의해 1OOx 커버리지(coverage)의 중심값으로 서열분석하였다.
전체-진유전체 및 RNA-서열분석 데이터를 매핑(mapping)하고, CCR 공동 생물정보학(CCBR: Collaborative Bioinformatics) 파이프라인을 사용하여 분석하였다(https://bioinformatics.cancer.gov). 판독값을 기준 게놈 Hg19에 대해 정렬하였다. 체세포 변이체 콜링(calling)을 뮤텍트(MuTect)20에 의해 수행하고, 복사 수 변화를 넥서스 카피 넘버 디스커버리 에디션(Nexus Copy Number Discovery Edition) #9[바이오디스커버리(BioDiscovery)]에 의해 분석하였다. 통합적 게놈 뷰어(IGV: Integrative Genome Viewer)를 사용하여 수동 검사에 의해 CD19 및 CD22 유전자의 완전성에 대한 정보를 추가로 얻었다. 트리모매틱(Trimmomatic) 소프트웨어에 의해 각각의 샘플에 대한 RNA 서열분석 판독값으로부터 이들의 어댑터(adapter) 및 낮은 품질의 기본값을 정리하고, STAR 소프트웨어에 의해 기준 인간 Hg 38 및 유전자코드 V24 전사물과 정렬시켰다.
통계 분석
통계 분석을 프리즘(Prism) 7.0 소프트웨어에 의해 수행하였다. 만 휘트니(Mann Whitney) 시험을 사용하여 환자 CD19 및 CD22 분석에 대해 통계학적 유의성을 계산하였다.
전구-B ALL 상에서 CD19 및 CD22의 이종성 및 동적 발현
다발성의 재발성 질환을 앓는 환자로부터 주로 유래된 환자 샘플을 CD19 및 CD22 발현에 대해 평가하였다. 면역요법의 투여 이전에 CD19 및 CD22의 발현에서 넓은 범위가 존재하였다(도 42). CD19 에피토프 손실은 CD19-표적화된 면역요법 이후 잘 설명되어 있다. 정합된 짝형성 분석(matched paired analysis)에서, CD22 발현을 CD19의 손실 이전 및 이후에 환자에서 평가한 결과 CD19 손실과 연관된 CD22 발현에서 일정한 감소를 나타내었고, 이는 단일 항원 손실이 또한 항원 발현을 광범위하게 조절할 수 있음을 시사한다(도 15). 이들 결과는 단일-항원 표적화된 면역요법과 연관된 어려움을 예시한다.
CD19 및 CD22 둘 다의 동시적 표적화는 항원 손실-재발 모델의 재발 또는 질환 진행을 방지하는데 있어서 순차적 치료에 비해 더 우수하다.
임상 실험에서 보여지는 CD19 및 CD22 재발 현상을 모델링하기 위해, CRISPR/Cas9 유전자 편집을 사용하여 CD19 및/또는 CD22를 전구-B ALL 세포주 NALM6 세포로부터 결실시켰고(도 16), 데이터는 표 17에 제공된다.
[표 17]
Figure pct00048
안정화를 확보하기 위한 단일 세포 클로닝 이후, CRISPR-편집된 NALM6 세포주 및 모 NALM6 모두는, B 세포 수용체-연관된 유전자의 결실 및 상응하는 표면 단백질 발현의 손실에도 불구하고, NSG 마우스에 이식되는 경우 질환 진행을 나타내었다(도 17).
면역치료학적 압력을 2개의 항원에 가하는 한가지 접근법은 항-CD19-CAR T 세포, 이후 항-CD22 CAR T-세포 또는 그 반대인 순차적 주입을 통해서이다. 이러한 전략을 시험하기 위해, 마우스에게 CD19neg, CD22neg 및 모 NALM6(CD19pos/CD22pos) ALL의 혼합물을 주사하여 항원-음성적 재발을 자극하였다. 단일 항원-특이적 CAR T 세포의 투여는 백혈병의 재발을 초래하였지만, 표적화된 항원의 발현을 일으키지 않았고, 재발 모델을 타당화하였다(도 18). 놀랍게도, 6일에 의해 분리된 치유량의 항-CD19 및 항-CD22 CAR T의 순차적 주입은 ALL 진행을 예방하지 않았다. 중요하게는, 재발 표현형은 제2 CAR 주입의 감소된 효능을 나타내었다. 항-CD19 및 항-CD22 둘 다를 표적화하는 CAR T 둘 다의 동시적인 투여(공-주입)는 순차적 주입에 비해 우수하였지만 CD22를 발현할 때까지 CD19neg ALL을 진행시켰고, 이는 항-CD19 CAR이 우세할 수 있음을 시사한다.
CD22 CAR과 함께 공-주입될 경우 항-CD19 CAR의 명백한 우세성에 기초하여, 다음 단계는 항-CD19 및 항-CD22 CAR 둘 다를 동일한 T 세포내로 공-형질도입을 통해 도입하여, 이중으로 특이적인 CAR T 세포가 함유된 T 세포의 푸울(pool)을 생성하는 것이다. 그러나, 공-형질도입 효율은 일관되게 낮아서, 항-CD19 및 항-CD22 CAR 둘 다를 발현하는 T 세포 생성물은 전체의 1/4이었다(도 19). 더욱이, 재발성 표현형(CD22+CD19neg 및 CD22negCD19neg, 도 20)은, 다시, 항-CAR 또는 항-CD22 CAR을 단독으로 발현하는 T 세포를 투여하는 경우 항-CD19 CAR T 세포가 우세할 수 있음을 시사한다. 이와 같이, 2개의 벡터에 의한 유전자 전달의 비효율성, 2개의 벡터를 다루는 것과 연관되는 기술적 어려움 및 비용 뿐만 아니라, 2개의 단일 CAR 발현 T 세포의 포함이 이중으로 특이적인 T 세포 모집단의 팽창을 손상시킬 수 있다는 가능성에 기초하여, 동일한 벡터로부터의 이중-특이성을 도입하는 접근법이 추구되었다.
scFv의 탠덤(Tandem) 서열분석에 의한 2가 CAR의 개발
2개의 상이한 scFv 도메인을 단일 CAR 구축물내로 커플링시킴으로써 2가 CAR을 생성하였다. 항-CD19 x 항-CD22 CAR을 구축하는데 착수되는 접근법은, 도 21에 도시된 바와 같이 탠덤 CAR(TanCAR)을 제조하기 위해 각각의 scFv(CD19의 경우 FMC63 및 CD22의 경우 m971)를 위한 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)를 순차적으로 위치시키는 것이다. TanCAR1을 위해, 각각의 단일 CAR로부터 VH와 VL 사이의 고유의 연결기를 유지시키고 2개의 scFv를 G(S)4 x 5 연결기에 의해 연결시키는 것이고, 이는 형질도입 후 단일 항원 표적화된 CAR에 필적할만한 수준으로 세포 표면 상에서 검출될 수 있는 형식이다. TanCAR1은 국제 특허출원 공개공보 제WO 2016/149578호에 기재되어 있다. 중요하게는, 항-CD22 Fc 융합물 및 항-FMC63 유전자형을 사용하여 모든 CAR-발현 T 세포를 검출할 수 있었다. TanCAR2(서열번호 63)의 경우, 항-CD19 및 항-CD22 scFv의 순서는 바뀌어서, 표면 상에 훨씬 낮게 검출되었다. CD19pos/CD22neg ALL에 대하여 1가 CD19 CAR T에 비교되는 IL2 생산의 필적할만한 수준 및 TanCAR1의 양호한 표면 검출에도 불구하고, IL-2 생산은 CD9neg/CD22pos ALL과 함께 공-항온처리될 경우 특히 낮았다(도 22a 및 22b). 항-CD22 VH와 VL 사이에 극히 짧은 연결기(G4S)가 제공되므로, TanCAR3(서열번호 64)을 CD22 scFv 내에서 증가된 연결기 길이에 의해 구축하였고, 이는 CD22 Fc 및 항-유전자형 결합을 없애는 형식이다(도 21). TanCAR4의 경우(서열번호 65), 항-CD22 scFv를 위한 짧은 모 연결기가 유지되었지만, 연결기의 길이는 항-CD19와 항-CD22 scFv 사이에서 감소하였다. 이는 CAR 표면 발현(항-CD22 Fc 및 항-FMC63 유전자형 결합)을 초래하였고, CD19-/CD22+ ALL에 대한 IL2 생산에 의해 측정될 경우 TanCAR1에 비하여 CD22-인도된 작용성을 증진시켰다(도 22a 및 22b).
TanCAR1 및 TanCAR4의 세포독성을 추가로 평가한 결과 CD19 및 CD22 1가 CAR에 대해 필적할만한 활성을 나타내었다. 시험관내 활성에도 불구하고, TanCAR1 또는 TanCAR4는 CD19posCD22pos ALL을 생체내에서 완전히 근절하지 못했다(도 23a 내지 23d).
루우프 구조를 생성하는 scFv의 교대 서열을 갖는 2가 CAR의 개발
일련의 2가 CAR 구축물을 구축하였다(도 24). LoopCAR1(서열번호 66)을 항-CD22 scFv(짧은 연결기 유지)에 의해 항-CD19 scFv의 VH와 VL 사이에서 구축하였고, 이는 세포 표면 상에서 단지 낮은 백분율로 검출될 수 있는 형식이다. LoopCAR2(서열번호 67)의 경우, 루우프 구조의 접힘을 용이하게 하기 위해 연결기의 길이를 항-CD22 scFv 사이에서 증가시켰고, 연결기의 아미노산 구조를 항-CD19 가변성 쇄와 항-CD22 scFv 사이에서 약간 변형시켜 디설파이드 결합 형성을 용이하게 하였다. 이는 CAR 표면 검출을 증진시켰다. LoopCAR1은 CD19 또는 CD22에 대하여 IL-2를 생성하지 못하였다. 증진된 표면 검출 및 CD19에 대한 일부 IL-2 생성에도 불구하고, LoopCAR2는 CD22 항원에 대하여 검출가능한 IL-2를 생성하지 않았다. 도 25a 및 25b를 참조한다.
LoopCAR3(서열번호 68)을 추가로 변형시켜 항-CD19 중쇄와 항-CD22 scFv 사이의 연결기의 길이를 감소시켰고, 약간 더 긴 연결기를 Loop2에 도입된 VH와 VL 사이에 유지시킴으로써, CD19neg/CD22pos ALL에 대하여 IL-2 생산을 증진시켰다. 다음의 일련의 구축물의 경우, 항-CD19 scFv를 막 원위 위치와 항-CD22 scFv의 가변성 쇄 사이에 위치시켰다. LoopCAR4(서열번호 69)에서는, LoopCAR3에 도입된 항-CD19 scFv와 항-CD22 scFv 가변성 쇄 사이의 연결기를 유지시켜서, 임의의 이전 형식과 비교하여 높은 수준의 CAR 검출 및 우수한 IL2 생산을 초래하였고, 이는 항-CD22 scFv 막 근위 위치가 최적일 수 있음을 시사한다. CD19neg/CD22pos ALL에 대한 IL-2 생산이 여전히 항-CD22 1가 CAR에 비해 불량하므로, LoopCAR5(서열번호 70)를 디설파이드 결합 형성에 유리하도록 변형시켰고, 이러한 구조는 사이토킨 생산을 증진시키지 않았다. 도 25c를 참조한다.
최종적으로, LoopCAR6(서열번호 61)에서, 더 짧은 연결기를 항-CD19 scFv와 항-CD22 가변성 쇄 사이에 혼입하였고, 이는 CD19pos/CD22neg 및 CD19neg/CD22pos ALL 둘 다에 대해 CAR 검출 및 IL-2 생산 둘 다(도 26), 뿐만 아니라 단일-항원 발현 ALL의 시험관내 살해를 극적으로 증진시켰다(도 27 및 28). 주지할만하게, 항-CD22 CAR 발현 T 세포와 비교된 LoopCAR6 발현 T 세포에 의한 CD19neg ALL의 살해 동력학은 CD22에 대한 약간 더 작은 효능을 시사하였다. LoopCAR6은 CD19 및 CD22 둘 다에 대한 반응에서 다중의 사이토킨을 생산하여(도 29a 내지 29f), LoopCAR6 발현 T 세포의 효능 및 다작용성을 추가로 확인하였다. 이와 같이, 루우프 고안은, 아마도 CD22 결합을 유지시키는 어려움으로 인해, CD19xCD22 특이성을 혼입한 2가 CAR을 위해 최적일 수 있다. 고안되고 시험된 다수의 구축물중에서, Loop6이 가장 강력한 형식으로서 확인되었고, 이를 추가로 생체내 모델에서 시험하였다.
LoopCAR6은 CD19posCD22neg 및 CD19neg PDX를 효율적으로 근절시킨다.
다음으로, LoopCAR6을 Nalm6 이종이식편 상에서 시험하였다. LoopCAR6은 8 x 106의 용량에서 CD19pos/CD22pos Nalm6을 근절시키는 것으로 보이고(도 30), 활성 저하를 3 x 106의 용량까지 유지하였다(도 31). LoopCAR6은 또한 CD19pos/CD22pos ALL에 대한 순차적 주입에 비해 우수하였다(도 32). 그러나, 낮은 용량에서, LoopCAR6은 모 NALM6에 비교하여 CD22의 발현이 더 낮은 세포주인 CD19neg/CD22pos 백혈병에 대해서도 작용하지 않았다(도 33a).
LoopCAR6을 추가로 "스파이크 인(spike in)" 재발성 모델에서 시험하였고, 여기서 이식된 ALL 접종물은 1% CD19neg 또는 CD22neg ALL을 99% CD19pos/CD22pos ALL과 함께 함유하였고, 검정은 이전에 존재하는 작은 클론으로부터의 재발을 모방한다. 이러한 모델에서, LoopCAR6은 CD22neg ALL의 소거에 있어서 항-CD19 CAR과 필적할만하였고, 이는 LoopCAR6이 CD19에 대하여 항-CD19 1가 CAR에 필적할만한 효능을 가짐을 확인시킨다. 그러나, 항-CD22 1가 CAR과 대조적으로, LoopCAR6은 낮은 CD22 자리 밀도에 의해 CD19neg/CD22pos ALL을 완전히 소거시킬 수 없었다(도 33b). 총체적으로, CD22-단일 발현 ALL의 시험관내 살해에 대한 동력학에 의해 시사되는 바와 같이(도 27), 생체내 실험은 LoopCAR6이 CD19에 대하여 항-CD19 1가 CAR에 필적할만한 효능을 갖지만 CD22에 대하여 항-CD22 1가 CAR에 비해 약간 더 낮은 효능을 가짐을 보여준다.
항-CD19 CAR 내성의 임상적 관련 모델에서 LoopCAR6의 생체내 활성을 추가로 탐색하기 위해, 드 노보 재발성 견본으로부터 생성된 2가지 상이한 환자-유래된 이종이식편(HMB15; CD19pos/CD22pos 및 HMB28; CD19neg/CD22pos)을 이용하였다. 전체-진유전체 및 전사체 서열분석을 수행하여 2개의 PDX 모델 시스템을 특징지웠다. HMB15는 MLL(엑손 1-6)의 N-말단과 MLLT10의 C 말단 사이에 프레임내 융합 종양유전자를 생성하는 전좌를 갖는다. CD19 및 CD22 게놈 유전자자리는 이러한 모델에서 온전하다. HMB28 PDX 1차 종양발생 구동자는 KRAS G12D의 점 돌연변이이다. 또한, 이러한 모델은 미성숙 종결 코돈을 CD19에 갖는다(표 18).
[표 18]
Figure pct00049
HMB15는 1가 CAR 둘 다 뿐만 아니라 LoopCAR6에 의해 소거된 것으로 보였다(도 34a 및 34b). HMB 28은 항-CD19 1가 CAR에 대해 내성이었고, 따라서, 항-CD19 CAR 내성의 양호한 모델이다. 고무적으로, LoopCAR6은 HMB28의 진행을 예방하였는데, 이는 LoopCAR6이 항-CD19 CAR 내성을 예방하는데 있어서 효과적일 수 있음을 지시한다.
LoopCAR6의 표적 이외의 활성에 대한 증거 없음
2가지 상이한 VH 및 VL의 염기쌍오류가 종양 이외에 강력한 독성을 초래하는 가능성이 제시되므로, LoopCAR6을 발현하는 T 세포의 기능적 선별을 수행하였다. LoopCAR6 T 세포를 다수의 정상 조직을 나타내는 인간 iPSC 세포주와 공-항온처리하고, IFNγ 생산을 배양 상청액에서 측정하였다. 개발된 모든 활성 CAR 구축물이 IFNγ를 유도하므로, IFNγ 생산을 사용하여 반응성을 측정하였다. CD19 및 CD22 둘 다를 발현하는 2개의 별도의 ALL 세포주인 NALM6 및 REH-TSLPR을 양성 대조군으로서 사용하였다.
이러한 검정에서, LoopCAR6은 NALM6 및 REH-TSLPR 둘 다에 대하여 T 세포에서 IFNγ를 유도하였다. IFNγ 생산은 임의의 iPS 세포주의 존재하에 LoopCAR6-발현 T 세포에 의해 상청액에서 검출되지 않았다(도 35a 및 35b).
표 19는 결과의 요약을 제시한다.
[표 19]
Figure pct00050
실시예 8
본 실시예는, 본 발명의 실시태양에 따라서, 절단가능한 CAR을 보여준다.
세포주 및 배양 조건
다음과 같은 백혈병 세포주를 사용하였다: 적백혈병 K562-CD22(인간 CD22에 의해 형질도입됨, 제네코포에이아, 카탈로그 번호: EX-Z9364-Lv151), K562-CD19(인간 CD19에 의해 형질도입됨), K562-CD19CD22(인간 CD19 및 CD22 둘 다에 의해 형질도입됨), 음성 대조군으로서의 형질도입되지 않은 K562; B 세포 급성 림프아구성 백혈병 세포주 NALM6, NALM6-GL(GFP 및 루시페라아제에 의해 형질도입됨), NALM6-CD19--GL[엑손 3 상에서의 크리스퍼(Crisper) KO CD19], NALM6-CD22--GL(엑손 6 상에서의 크리스퍼 KO CD22). 세포주를 10% 열-불활성화된 FBS, lOmM HEPES, 100 U/㎖의 페니실린, 100 μg/㎖의 스트렙토마이신, 및 2 mM L-글루타민(인비트로겐)이 보충된 배지에서 배양시켰다. 렌티-X 293T 렌티 패키징 세포주(클론텍, 카탈로그 번호 632180)를 DMEM(인비트로겐) 배지에서 배양시켰다.
원발성 인간 백혈병 샘플 및 환자-유래된 이종이식편
IRB-승인된 조직 획득 프로토콜(프로토콜 번호: 15-C-0029)에 대한 사전 동의 후 인간 ALL(급성 림프아구성 백혈병) 샘플을 수집하고 저장하였다. 인간 피험체로부터의 모든 연구 견본을 헬싱키 조약에 따른 사전 동의와 함께 수득하였다. 다음과 같은 1차 샘플을 사용하였고: CD19- ALL 및 CD19+CD22dim(드 노보 재발성 견본 ALL_H0113_post22_r(CAR3), ALL_H0090_post19_pd(HMB15); 이를 이중특이적 CAR 구축물에 대한 생체내 시험을 위해 사용하였다. 1E6 내지 10E6의 환자 ALL 세포를 NSG 마우스(NOD scid 감마, NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ; 잭슨 이뮤노리서치 래보레이토리즈)에게 주사함으로써 PDX 모델을 생성하였다. PDX 세포주에 렌티-GFP-Luc 바이러스를 형질도입하고, 제1 및 제2 계대배양 이후 GFP 및 루시페라아제를 발현하는 백혈병 세포에 대해 분류하였다. 이러한 연구를 위해, PDX의 2차 및 후속 계대배양을 재발성 및 드 노보 ALL 견본에 대해 각각 사용하였다. 생체내 GFP-형질도입된 PDX 백혈병 크기를 매주 형광 영상에 의해 평가하였고, 인간 ALL이 형광 영상에 의해 검출가능한 경우 동물을 CAR T 세포에 의해 꼬리 정맥 주사를 통해 치료하였다. 건강한 공여자로부터의 현탁분리된 인간 림프구를 미국 국립 보건원(NIH) 임상 센터의 수혈 의학과로부터 IRB-승인된 프로토콜하에 수득하였다. 인간 림프구를 AIM-V 배지에서 배양시켰다.
CRISPR에 의한 CD19 음성 또는 CD22 음성 백혈병의 생성
NALM6 상에서의 CD19 또는 CD22의 CRISPR 넉아웃(knockout)을 위한 렌티바이러스 벡터를 제조하였다. 간단히, 안내-RNA를 http://crispr.mit.edu/에 의해 최적화하고, 렌티CRISPR v2 플라스미드(애드진 플라스미드 52,961)내로 클로닝하였다. 이어서 플라스미드를 패키징 플라스미드와 함께 공-형질감염시키고, HEK293T 세포내로 형질전환시켰다. 2일 이후, CRISPR 상청액을 수거하고, 여과하고, 농축시켰다. 바이러스 형질도입을 위해, 105의 NALM6 세포를 10 ㎖의 농축된 바이러스 상청액과 함께 2일 동안 항온처리한 후, RPMI 배지에서 팽창시켰다. 세포 표현형을 유세포분석에 의해 평가한 후, 표현형 변경 및 단일-세포 클로닝에 의해 세포를 분류하였다. 단일-세포 클론 상에서 서열분석을 수행하여 유전자형 변경을 확인하였다.
렌티-바이러스 CAR 구축물의 제조
CD19/CD22 비시스트론성 CAR을 각각의 CD19 및 CD22 CAR에서 CD28 또는 4-1BB 공자극 도메인의 상이한 짝형성에 의해 제조하고 사이를 절단가능한 연결기에 의해 연결시켰다. 각각의 CD19 및 CD22 CAR은 출발점에 리더 서열을 갖고, 이후 CD19 또는 CD22 단일 쇄 가변성 단편이 수반되며, 이어서 4-1BB 및 CD3 제타 도메인과 연결된 CD8 막관통 도메인, 또는 CD28 및 CD3 제타 도메인과 연결된 CD28 막관통 도메인이 수반된다. 이들 CAR을 pELNS 렌티 벡터 주쇄내로 서브클로닝하였다. 모든 제한 효소를 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터 구입하였다. 모든 CAR 구축물의 서열을 마크로겐(Macrogen)에서 서열분석에 의해 확인하였다.
본 실시예에 기재된 CAR은 다음과 같다: 22-BB/19-28(이는 또한 본원에 V5로서 열거됨), 22-28/19-BB(이는 또한 본원에 V6으로서 열거됨), 22-BB/19-BB(이는 또한 본원에 V7로서 열거됨), 및 22-28/19-28(이는 또한 본원에 V8로서 열거됨).
CAR T-세포 생성
비시스트론성 CAR-인코딩 렌티바이러스 벡터를 렌티-X 293T 렌티 패키징 세포주의 일시적 형질감염에 의해 생산하였다. 간단히, 렌티-X 293T 세포를 폴리-D 라이신 코팅된 15-cm 플레이트(비디 바이오사이언시즈)에 플레이팅하였다. 다음날, 리포펙타민 3000(써모 피셔 사이언티픽)을 사용하여 CAR 구축물을 인코딩하는 플라스미드에 의해 패키징 및 엔벨롭 벡터(pMDLg/pRRE, pMD-2G, 및 pRSV-Rev)와 함께 렌티-X 293T 세포를 형질감염시켰다. 렌티바이러스 상청액을 형질감염 후 24 및 48 시간째 수거하고, 3000 RPM에서 10 분 동안 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하고, 드라이 아이스 상에서 동결시키고, -80℃에서 저장하였다. 정상 공여자로부터의 인간 PBMC를 NIH-승인된 프로토콜에 의해 수득하고, 1 : 3 비의 CD3/CD28 마이크로비이드(다이나비즈 인간 T-익스팬더 CD3/CD28, 써모 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 11141D)에 의해 40 IU/㎖의 재조합 IL-2 및 5% FBS가 함유된 AIM-V 배지에서 24 시간 동안 활성화시켰다. 활성화된 T 세포를 6-웰 플레이트에서 2 ㎖의 렌티바이러스 상청액 + 10 ㎎/㎖의 프로타민 황산염 및 100 IU/㎖의 IL-2를 갖는 1 ㎖의 신선한 AIM-V 배지당 2 밀리온 세포로 재현탁시켰다. 플레이트를 1000 x g에서 2 시간 동안 32℃하에 원심분리하고, 하룻밤 37℃에서 항온처리하였다. 다음날 상기 기재된 동일한 형질도입 절차를 반복함으로써 제2 형질도입을 수행하였다. CD3/CD28 비이드를 형질도입 후 3일째 제거하고, 세포를 100 IU/㎖의 IL2이 함유된 AIM-V에서 300,000 세포/㎖로 배양시켰고, 8 또는 9일째 수거할 때까지 신선한 IL2-함유 배지를 2 내지 3일 마다 첨가하였다.
유세포분석
CD22-Fc(알앤디 시스템스)를 사용하여 CD22 CAR-형질도입된 T 세포의 표면 발현을 유세포분석에 의해 결정한 후, 인간 IgG-Fc에 특이적인 PE-F(ab)2 또는 APC-F(ab)2(잭슨 이뮤노리서치 래보레이토리즈)와 함께 항온처리하였다. 라이트닝-링크 APC 항체 라벨링 키트(노부스 바이올로지칼스)를 사용하여 APC와 컨주게이션된 항-CD19 유전자형 또는 재조합 인간 CD19 Fc 키메라 단백질(알앤디 시스템스)에 의해 CD19 CAR-형질도입된 T 세포의 표면 발현을 검출하였다. B-ALL 세포주 상에서의 CD19 및 CD22의 발현을 다음의 항-인간 항체에 의해 검출하였다: CD45-PerCP-Cy5.5(이바이오사이언스), CD19-퍼시픽 블루, CD19-APC-Cy7, CD10-PE-Cy7, 및 CD22-PE(바이오레전드). T 세포는 다음의 항체에 의해 특징지워졌다: CD3-APC-Cy7, CD4-퍼시픽 블루, 및 CD8a-PE-Cy7(바이오레전드).
세포독성 검정
100 ㎕의 RPMI 배지중 5E4의 표적 종양 세포를 96-웰 플레이트[코닝(등록상표) 바이오코트(상표명) 폴리-L-라이신 96-웰 클리어 TC-처리된 환저 검정 플레이트]에 적재하였다. 다음날 동량의 CAR T 세포를 지정된 웰에 첨가하였다. 초기 인큐사이트 아포토시스 표지(에센 바이오사이언스)를 1OO ㎕의 PBS에서 희석시키고, 1 ㎕의 희석제를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 GFP 및/또는 RFP 형광 발현에 대해 스캐닝하여 세포 아포토시스를 인큐사이트 ZOOM(등록상표) 시스템에 의해 30 분 마다 40 시간의 기간 동안 모니터링하였다. 각 시점에서 세포 살해의 백분율을 기선-보정하였다.
사이토킨 생산의 분석
표적 종양 세포 및 형질도입된 CAR 양성 T 세포를 1 x PBS에 의해 3회 세척하고 RPMI에 1E6/㎖로 재현탁시켰다. lOO ㎕의 종양 세포를 1OO ㎕의 CAR 양성 T 세포와 함께 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 적재하였다. T 세포 만의 대조군 및 종양 세포 만의 대조군을 설정하였다. 모든 시험을 이중 또는 삼중으로 수행하였다. 세포를 18 시간 동안 37℃에서 항온처리하고, 120 ㎕의 배양 상청액을 수거하여 사이토킨 생산을 검출하였다. 상청액중 사이토킨 수준을 ELISA 키트(알앤디 시스템스) 또는 멀티플렉스 검정(메조 스케일 디스커버리)에 의해 측정하였다.
RNAseq 분석
NALM6 및 CAR T 세포를 1E6/㎖로 재현탁시켰다. 5E5의 NALM6을 5E5의 CAR+ T 세포와 함께 40U의 IL2 배양 배지를 갖는 10 ㎖의 AIMV중에서 25 ㎖의 배양 플라스크에서 24 시간 동안 이중으로 또는 삼중으로 공-항온처리하였다. CD19 마이크로비이드를 갖는 NALM6을 LD 칼럼에 의해 제거하였다. 전체 용출액을 수집하고, 세포를 1200 rpm에서 6 분 동안 원심분리하여 펠릿화하였다. tRNA를 RNA이지 플러스 미니 키트(RNAeasy Plus Mini Kit)에 의해 즉시 추출하였다. 분석을 위해 RNA 샘플을 NIH 거점 시설로 보내었다. RNA 품질을 테입스테이션(TapeStation) 분석 소프트웨어(아길런트 테크놀로지스)에 의해 평가하였다. 트루세크 LT 검정에 의해 넥스트세크(NextSeq) FASTQ로 RNAseq를 생성하였다.
생물에너지 분석
당분해 스트레스 시험을 위해, CAR T 세포를 L-글루타민(200 mM) 및 NaCl(143 mM)이 보충된 무혈청의 완충되지 않은 DMEM 배지[시그마(Sigma)-알드리치(Aldrich)]에 현탁시켰다. 0.6 ㎖의 0.5% 페놀 레드(Phenol Red) 용액(시그마P0290)을 3 mg/ℓ의 최종 농도를 위해 첨가하고 pH를 7.35+/-0.05로 조정하였다. CAR T 세포를 세파로스 세포 플레이트 상으로 플레이팅하고(웰당 3E5의 세포), 셀-탁(Cell-Tak)(코닝)으로 코팅시켜 T 세포 부착을 용이하게 하였다. 간단히, 카트리지(cartridge)를 검정 전날 수화시켰다. 검정일에, 플레이트를 셀-탁으로 코팅시키고 세포를 셀-탁 코팅된 플레이트에 접종하고, 검정을 위해 XF24 분석기 상에 두었다. 상세한 절차는 다음과 같다. 검정 카트리지를 초기에 XF 칼리브런트(calibrant) 용액에 의해 200 ㎕/웰로 수화시키고, 하이드로 부스터(hydro booster)를 첨가하고, 파라필름(parafilm)으로 래핑하고, 센서 카트리지를 유틸리티(utility) 플레이트의 상부 위에 두고, 37℃에서 하룻밤 CO2 부재하에 항온처리하였다. 이어서 세포 배양 플레이트를 셀-탁으로 다음과 같이 코팅시켰다: 1개의 플레이트에 대하여, 46 ㎕의 셀-탁을 204 ㎕의 TC 워터(water) 및 1 ㎖의 NaHC03에 희석시켰다. 혼합물을 각각의 웰에 50 ㎕씩 분배하고, 플레이트를 실온에서 적어도 20 분 동안 항온처리하였다. 셀-탁 용액을 제거한 후, 250 ㎖의 TC 워터를 사용하여 각각의 웰을 세척하였다. CAR T 세포(3E5/웰)를 158 ㎕의 검정 배지에 플레이팅하였다. 이어서 세포 배양 플레이트를 낮은 가속 및 비-감속하에 1 초 동안 450 rpm에서 회전시킨 다음, 플레이트의 방향을 바꿔서 낮은 가속 및 비-감속하에 1 초 동안 650 rpm에서 회전시켰다. 이어서, 플레이트를 37℃ 및 0% C02에서 25 내지 30 분 동안 항온처리하였다. 25 내지 30 분 항온처리한 후, 158 ㎕의 따뜻한 검정 배지를 각각의 웰의 상부에 벽면을 따라 수동 P200 피펫터(pipettor)에 의해 천천히 온화하게 첨가하였다. 세포 플레이트를 15 내지 25 분 동안 항온처리하였다. 15 내지 25 분 항온처리한 후, 플레이트를 XF24 분석기(보정 마무리 이후) 위에 두었다. XF 검정을 실행하였다. 용액을 3개의 포트를 통해 순차적으로 주입하였다: 포트 A: 글루코스 80 mM(3 ㎖ 검정 배지중 96 ㎕의 스톡 용액). 포트 B: 올리고마이신(oligomycin) 18 μM(3 ㎖ 검정 배지중 10.8 ㎕의 스톡 용액). 포트 C: 2DG 사용 스톡 용액. 카프리지 포트에 75 ㎕의 약물 용액을 적재한 후 ECAR(mpH/분)을 정상 상태(steady state)에서 측정함으로써 당분해 스트레스 시험을 수행하였다. 미토콘드리아 스트레스 시험을 위해, CAR T 세포를 D-글루코스(25 mM) 및 피루브산 나트륨(1 mM)이 보충된 무혈청의 완충되지 않은 DMEM 배지에 현탁시켰다. 올리고마이신(0.5 μM), FCCP(0.5 μM), 로테논(rotenone)(1 μM) 및 안티마이신(antimycin) A(1 μM)(시그마-알드리치)를 순차적으로 주사한 후 OCR(pmol/분)을 정상 상태에서 측정함으로써 미토콘드리아 스트레스 시험을 상기와 유사하게 수행하였다. 세파로스 시스템에 의한 실험은 다음의 검정 조건을 이용하였다: 2 분 혼합; 2 분 대기; 및 3 분 측정.
형광 현미경 영상 및 분석
T 세포를 공-형질도입하여 CAR-세룰린(Cerulean) 또는 CAR-엠체리(mCherry) 융합 단백질을 발현시켰다. CAR 양성 T 세포를 분류하고 친유성 추적자-DiD 멤브레인 염료(Membrane dye)(라이프 테크놀로지스) 및 LIVE/DEAD 픽서블 블루 데드 셀(Fixable Blue Dead Cell)(라이프 테크놀로지스)에 의해 PBS중에서 염색하였다. 이어서 세포를 세척하고 장착시켰다. 악시오캠(AxioCam) MRm 카메라가 구비된 제이스 아포톰(Zeiss Apotome)에 의해 제이스 평면 아포크로마트(apochromat) 20x 대물렌즈를 사용하여 영상을 얻었다. 노출 설정은 전체 실험에 대해 동일하였다. 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어를 데이터 분석에 사용하였다. 사멸 세포를 배제하였다. DiD 멤브레인 염색을 사용하여 각각의 세포를 식별하였다. 세룰린(CFP) 양성 또는 엠체리 양성 영역의 치수 및 최대 강도를 계산하였다. 1 보다 더 큰 최대 강도만을 계산에 포함시켰다. DiD 염색을 위한 역치를 최대 화소 강도의 10%로 설정하였다. 세룰린 채널 및 엠체리 채널에 대한 역치를 최대 화소 강도의 20%로 설정하였다.
생체내 실험
동물 실험을 NCI 베테스다 동물실험 윤리 위원회에 의해 승인된 프로토콜하에 실행하였다. B-ALL 세포주 및 이종이식된 인간 B-ALL 견본을 NSG 마우스에게 정맥내로 주사하였다. 루시페라아제-발현 세포주의 경우, 제노겐 IVIS 루미나(캘리퍼 라이프 사이언시즈)를 사용하여 백혈병을 검출하였다. NSG에게 복강내로 3 mg의 D-루시페린(캘리퍼 라이프 사이언시즈)을 주사하고, NALM6 세포에 대해 30 초 및 PDX에 대해 2 분간 노출시킨지 4 분 후에 영상촬영하였다. 리빙 이미지 버전 4.1 소프트웨어(캘리퍼 라이프 사이언시즈)를 사용하여 각 마우스에 대해 생물발광 신호 흐름을 광자/s/㎠/sr로서 분석하였다. 비-루시페라아제 발현 이종이식편에서 백혈병 크기는 말초 혈액, 골수 및 비장의 유세포분석에 의해 측정하였다.
통계 분석
통계 분석을 프리즘 7.0 소프트웨어에 의해 수행하였다. 도표를 평균+/- SD로서 나타내었다. 만 휘트니 시험을 사용하여 환자 CD19 및 CD22 분석에 대해 모든 데이터의 통계학적 유의성을 계산하였다.
비시스트론성 CAR의 개발
극히 공격적인 재발성 모델에서 낮은 용량의 CAR에 의해 시험할 경우, 2가 LoopCAR6은 CD19neg 및 CD22neg 백혈병을 완전히 근절하지 못한다. 11가지 상이한 형태의 2가 CAR을 시험한 후, CD22 활성을 2가 형태로 보유하는 것이 어려운 것으로 밝혀졌다.
비시스트론성 CAR 발현을 유세포분석에 의해 결정하여 비시스트론성 구축물의 발현을 확인하였다. 도 36에 지시된 바와 같이, 단백질 번역시, 비시스트론성 CD19 CAR 및 CD22 CAR은 2개의 별도의 단편이 되었고, 궁극적으로 2개의 CAR로서 세포 표면 상에서 발현되었다. 제4 분면에서의 세포의 군집화는 세포 표면 상에서의 CD19 및 CD22 CAR의 동몰수의 발현을 지시하였다. 22-BB/19-28 발현 시스템을 갖는 CAR이 70.3%의 양성 세포를 가지면서 이중 양성 세포의 가장 높은 비율을 갖는 것으로 밝혀졌다. 가장 낮은 수준의 이중 발현은 각각 40.8% 및 58.1%를 갖는 이중 BB 또는 이중 28과 연관되었다. 공자극성 도메인이 전환될 경우, 대략 10% 발현이 이중 양성 집단에서 소실되었다.
4-1BB 및 CD28의 조합을 갖는 비시스트론성 CAR은 2가 및 기타 비시스트론성 CAR과 비교하여 시험관내에서 탁월한 작용을 갖는다.
공-자극 엔도 도메인 CD28 및 4-1BB가 CAR 작용의 면역조절에 상이한 효과를 갖는 것으로 이전에 보고되어 있다. 단일 표적화 CAR 구축물의 민감성을 설명하기 위해, 각각의 CAR-T 세포를 동족 항원을 발현하는 백혈병과 다양한 밀도에서 공-배양시키고, IL-2 수준을 18 시간 동안 공-배양 상청액에서 측정하였다. 표적 항원 밀도는 사이토킨 생산에서 10-배 만큼 높은 차이를 만들었고, CD22 CAR은 특히 표적 밀도에 민감하였다(도 37a). 공-자극 도메인은 또한 사이토킨 생산에서의 차이에 기여하지만, 공-자극 도메인에 기인하는 차이는 표적 항원 밀도의 영향에 비해 적다.
다음으로, 공-자극 도메인의 상이한 짝형성을 갖는 비시스트론성 CAR을 K562 및 NALM6 유래된 세포와 항온처리하여 항원 밀도가 사이토킨 생산에 영향을 주는지의 여부를 결정하였다. CD28 및 4-1BB 공-자극 도메인 둘 다의 조합을 갖는 비시스트론성 CAR은 CD28 또는 4-1BB 공-자극 도메인만을 갖는 CAR 또는 단일 표적화 CAR에 비해 더 많은 사이토킨을 생산한다(도 37b). 항원 밀도는 다시 CAR T 세포의 사이토킨 생산에 가장 높은 영향을 가졌다. 22-BB/19-28은 22-28/19-BB CAR에 비해 약간 더 많은 사이토킨을 만들었다. 22-BB/19-28 CAR은 또한 CD19/CD22 2가 CAR에 비해 더 많은 사이토킨을 만들었다(도 37c). 모든 비시스트론성 CAR은 표적 세포주의 효과적인 살해를 나타내었다(도 37d 내지 37f).
RNAseq 분석은 공자극성 도메인의 상이한 짝형성과 연관된 독특한 유전자 발현을 보여준다.
RNAseq 분석을 수행하여 상이한 공-자극 도메인 조합과 연관된 생물 경로에 대한 정보를 수득하였다. 비시스트론성 CAR을 CD19+CD22+ NALM6 세포와 함께 공-항온처리하고, RNAseq 분석을 위해 전체 RNA를 추출하였다. PCA는 상이한 조합이 별개의 유전자 발현 프로파일과 연관됨을 지시한다(도 38).
비시스트론성 CAR은 CD19+CD22+ 백혈병, 및 CD19 neg 또는 CD22 neg 백혈병 아세포 둘 다를 효율적으로 감소시킨다.
CD19+CD22+ NALM6 세포주를 사용하여 비시스트론성 CAR의 생체내 활성을 시험하였다. CD28을 갖는 CD19 및 CD22 CAR, 또는 4-1BB 단일 CAR을 대조군으로서 사용하였다. 도 39에 지시된 바와 같이, 일반적으로, 비시스트론성 CAR은 단일 표적화 CAR에 비해 우수하다. CD28 및 4-1BB 공-자극의 상이한 짝형성은 상이한 속도로 종양 제거를 유도하고; 22-BB/19-28은 백혈병 아세포를 제거하는데 있어서 최고이다.
CD19neg 및 CD22저 아세포를 재발된 환자에서 관찰하였다. 이러한 임상적 상황을 모의하기 위해, CRISPR Cas9 기술을 사용하여 NALM6 세포에 의해 CD19neg 및 CD22neg 백혈병 세포주를 생성하였다. CD19neg, CD22neg, 및 모 NALM6 세포의 혼합물을 면역결핍 NSG에 주사하여 공격적인 이종이식편 모델을 생성함으로써 임상적 재발 상황을 모의하였다. 3가지 비시스트론성 CAR을 CD19 및 CD22 단일 표적화 CAR과 비교하였다(도 39b). 단일 표적화 CAR은 백혈병 진행을 예방할 수 없었다. CD28 및 4-1BB 둘 다를 갖는 비시스트론성 CAR은 백혈병을 소거하는데 있어서 매우 강력한 활성을 가졌다.
혼합된 CD19neg 및 CD22neg 백혈병을 갖는 생체내에서 비시스트론성 CAR 및 2가 CAR을 추가로 비교하였다(도 40). 비시스트론성 CAR은 CD19neg 및 CD22neg 백혈병을 감소시키는데 있어서 2가 CAR에 비해 우수하였다.
비시스트론성 CAR의 강력한 활성
임상적으로 관련된 CD19neg PDX 모델(HMB28)을 사용하여 비시스트론성 CAR을 시험하였다. CD19 CAR에 의해 이전에 치료되었고, CD19 음성 백혈병 재발에 의해 재발되었으며, 후속적으로 항-CD22 CAR-T 세포에 의해 치료되었으나, CD22-저 발현 아세포의 출현에 기인하여 백혈병을 소거하지 못한 환자로부터 PDX 모델을 위한 백혈병을 유도하였다. 비시스트론성 CAR은 CD19 음성 백혈병 아세포를 완전히 근절할 수 있었다(도 41).
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본 발명을 기재함에 있어서(특별히 하기 청구범위와 관련하여) "하나의", "그" 및 "적어도 하나의"라는 용어의 사용 및 유사한 언급은, 달리 본원에 지시되거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 다를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 하나 이상의 항목에 대한 열거가 수반되는 "적어도 하나의"라는 용어의 사용(예를 들어, "A 및 B중 적어도 하나")은, 달리 본원에 지시되거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한, 열거된 항목으로부터 선택된 하나의 항목(A 또는 B) 또는 열거된 항목 중 둘 이상의 임의의 조합(A 및 B)을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "포함하는", "갖는", "포함되는" 및 "함유하는"이라는 용어는, 달리 주지되지 않는 한, 확장가능한 용어(즉, "제한되지 않고 포함함"을 의미함)인 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 값들의 범위에 대한 언급은, 달리 본원에 지시되지 않는 한, 단지 그 범위내에 속하는 각각의 별도의 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서 작용하고자 할 뿐이고, 각각의 별도의 값은 이것이 개별적으로 본원에 언급되는 것과 마찬가지로 본 명세서에 혼입된다. 본원에 언급된 모든 방법은, 달리 본원에 지시되거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 표현(예를 들어, "예컨대")의 사용은, 단지 본 발명을 좀 더 잘 설명하려는 것이고, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범주에 제한을 두는 것이 아니다. 본 명세서에서 어떠한 표현도 임의의 청구되지 않은 요소가 본 발명의 실행에 필수적임을 지시하는 것으로 이해되어서는 안된다.
본 발명의 바람직한 실시태양, 예컨대 본 발명을 실행하기 위해 발명자들에게 공지된 최적의 방식이 본원에 기재되어 있다. 이들 바람직한 실시태양의 변경은 선행 기재내용을 살펴볼 경우 당분야의 숙련가에게 분명할 것이다. 본 발명자들은 숙련가라면 이러한 변경을 적절히 이용할 것으로 기대하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실행될 수 있을 것으로 생각한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법률에 의해 허용될 경우 청구범위에 인용된 주제 내용의 모든 변형 및 대등물을 포함한다. 게다가, 이의 모든 가능한 변경에서 상기 기재된 요소의 임의의 조합은, 달리 본원에 지시되거나 문맥상 명확히 모순되지 않는 한, 본 발명에 의해 포괄된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES <120> BICISTRONIC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND THEIR USES <130> 739267 <140> PCT/US2018/032809 <141> 2018-05-15 <150> US 62/506,268 <151> 2017-05-15 <160> 85 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Met 1 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala 1 5 10 15 Phe Leu Leu Ile Pro 20 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser 20 25 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 4 Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 5 Trp Asn 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gggaacctcc gtgaccgtgt cctctactag ttccggaacc 1560 acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 1620 ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 1680 ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 1740 tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa 1800 caaccattta tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt 1860 ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 1920 cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 1980 gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 2040 aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 2100 tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 2160 cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 2220 cctcgcggat cctaatgatc agtcgac 2247 <210> 75 <211> 2274 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 75 atgctgctgc tcgtgacaag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccctgc ctttctgctg 60 atccccgaca tccagatgac ccagaccacc agcagcctga gcgccagcct gggcgataga 120 gtgaccatca gctgcagagc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180 aaacccgacg gcaccgtgaa gctgctgatc taccacacca gcagactgca cagcggcgtg 240 cccagcagat tttctggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300 gaacaggaag atatcgctac ctacttctgt cagcaaggca acaccctgcc ctacaccttc 360 ggcggaggca ccaagctgga aatcacaggc ggctgcggat ccggcggcgg aggatccggc 420 ggcggaggat cccaggtgca gctgcagcag tctggacccg gcctcgtgaa gcctagccag 480 accctgtctc tgacctgcgc catcagcggc gatagcgtgt ccagcaatag cgccgcctgg 540 aactggatcc ggcagagccc ttctagaggc ctggaatggc tgggccggac ctactaccgg 600 tccaagtggt acaacgacta cgccgtgtcc gtgaagtccc ggatcaccat caaccccgac 660 accagcaaga accagttctc cctgcagctg aacagcgtga cccccgagga taccgccgtg 720 tactactgcg ccagagaagt gaccggcgac ctggaagatg ccttcgacat ctggggccag 780 ggcacaatgg tcaccgtgtc tagcggcagc acaagcggct ctggcaagcc tggatctggc 840 gagggctcta ccaagggcga tattcagatg acacagagcc cctccagcct gtccgcctct 900 gtgggagaca gagtgacaat cacctgtcgg gcctcccaga ccatctggtc ctatctgaat 960 tggtatcagc agcggcctgg caaggccccc aacctgctga tctatgccgc cagctctctg 1020 cagtccggcg tgccatctag attcagcggc agaggcagcg gcaccgattt caccctgaca 1080 attagcagtc tgcaggccga ggacttcgcc acctactatt gccagcagag ctacagcatc 1140 ccccagacct tcggccaggg aacaaaactg gaaatcaaag ggggaggcgg cagcggggga 1200 ggcggcagcg ggggatgcgg cagcgaagtg aaactgcagg aatctggccc tggcctggtg 1260 gccccaagcc agtctctgag cgtgacctgt accgtgtctg gcgtgtccct gcccgattac 1320 ggcgtgtcct ggatcagaca gccccccaga aagggactgg aatggctggg agtgatctgg 1380 ggcagcgaga caacctacta caacagcgcc ctgaagtcca ggctgaccat catcaaggac 1440 aactccaaga gccaggtgtt cctgaagatg aattccctgc agaccgacga caccgccatc 1500 tattactgtg ccaagcacta ctactacggc ggcagctacg ccatggacta ctggggacag 1560 ggaacctccg tgaccgtgtc ctctactagt tccggaacca cgacgccagc gccgcgacca 1620 ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 1680 ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc 1740 tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 1800 tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 1860 caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 1920 tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1980 aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 2040 agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 2100 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 2160 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 2220 aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgcggatc ctaa 2274 <210> 76 <211> 2235 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 76 atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctcca tgccgccaga 60 cccgatatcc agatgaccca gaccaccagc agcctgagcg ccagcctggg cgatagagtg 120 accatcagct gccgggccag ccaggacatc agcaagtacc tgaactggta tcagcagaaa 180 cccgacggca ccgtgaagct gctgatctac cacaccagca gactgcacag cggcgtgccc 240 agcagatttt ctggcagcgg ctccggcacc gactacagcc tgaccatctc caacctggaa 300 caggaagata tcgctaccta cttctgtcag caaggcaaca ccctgcccta caccttcggc 360 ggaggcacca agctggaaat cacaggcggc ggaggatctg gcggaggcgg atctcaggtc 420 cagctccagc agtctggacc cggcctggtc aagcctagcc agaccctgag cctgacctgc 480 gccatcagcg gcgacagcgt gtcctctaac agcgccgcct ggaattggat cagacagagc 540 cccagcagag gcctggaatg gctgggccgg acctactacc ggtccaagtg gtacaacgac 600 tacgccgtgt ccgtgaagtc ccggatcacc atcaaccccg acaccagcaa gaaccagttc 660 tccctgcagc tgaacagcgt gacccctgag gacaccgccg tgtactactg cgccagagaa 720 gtgaccggcg acctggaaga tgccttcgac atctggggcc agggcaccat ggtcaccgtg 780 tctagcggca gcacaagcgg ctctggcaag cctggaagcg gcgagggctc taccaagggc 840 gacattcaga tgactcagag cccctccagc ctgtccgcct ctgtgggaga cagagtgaca 900 atcacctgta gagcctccca gaccatctgg tcctatctca attggtacca gcagcggcca 960 ggcaaggccc ctaacctgct catctatgcc gcctctagcc tgcagtccgg cgtgccatct 1020 agattcagcg gcaggggcag cggcaccgat ttcaccctga caatcagttc cctgcaggcc 1080 gaggacttcg ccacctacta ttgccagcag tcctacagca tccctcagac cttcggccag 1140 ggaacaaagc tcgaaatcaa aggtggtggt ggcagtggtg gcggcggaag cgaagtgaaa 1200 ctgcaggaaa gcggccctgg cctggtggcc ccttctcagt ctctgtccgt gacctgtacc 1260 gtgtctggcg tgtccctgcc cgattacggc gtgtcctgga tcaggcagcc accccggaaa 1320 ggactcgaat ggctcggcgt gatctggggc agcgagacaa cctactacaa cagcgccctg 1380 aagtccaggc tgaccatcat caaggacaac tccaagagcc aggtgttcct gaagatgaac 1440 agcctgcaga ccgacgatac cgccatctat tactgtgcca agcactacta ctacggcggc 1500 agctacgcca tggactactg gggacaggga acctccgtga ccgtgtccag tactagttcc 1560 ggaaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 1620 ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 1680 ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 1740 ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 1800 ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 1860 cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgagag tgaagttcag caggagcgca 1920 gacgcccccg cgtacaagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 1980 agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 2040 ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 2100 gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 2160 ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 2220 ctgccccctc gctaa 2235 <210> 77 <211> 2238 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 77 atgctgctgc tggtcacaag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 attcctcagg tccagctgca gcagtctggc cctggcctgg tcaagcctag ccagaccctg 120 agcctgacct gcgccatcag cggcgacagc gtgtcctcta acagcgccgc ctggaactgg 180 atcagacaga gccccagcag aggcctggaa tggctgggcc ggacctacta ccggtccaag 240 tggtacaacg actacgccgt gtccgtgaag tcccggatca ccatcaaccc cgacaccagc 300 aagaaccagt tctccctgca gctgaacagc gtgacccctg aggacaccgc cgtgtactac 360 tgcgccagag aagtgaccgg cgacctggaa gatgccttcg acatctgggg ccagggcacc 420 atggtcaccg tgtctagcgg aggcggagga agtggcggcg gaggcagcga tatccagatg 480 acccagacca ccagcagcct gagcgccagc ctgggcgata gagtgaccat ctcctgccgg 540 gccagccagg acatcagcaa gtacctgaat tggtatcagc agaagcccga cggcaccgtc 600 aagctgctga tctaccacac cagcagactg cacagcggcg tgcccagcag attttctggc 660 agcggctccg gcaccgacta cagcctgacc atcagcaacc tggaacagga agatatcgct 720 acctacttct gtcagcaagg caacaccctg ccctacacct tcggaggcgg caccaagctg 780 gaaatcaccg gcagcacaag cggcagcggc aagcctggat ctggcgaggg ctctaccaag 840 ggcgaagtga agctgcagga aagcggaccc ggactggtgg cccctagcca gtctctgtct 900 gtgacctgta ccgtgtccgg cgtgtccctg cccgattatg gcgtgtcctg gatcaggcag 960 cctccccgga aaggactcga atggctcggc gtgatctggg gcagcgagac aacctactac 1020 aacagcgccc tgaagtccag gctgacaatc atcaaggaca actccaagag ccaggtgttc 1080 ctgaagatga acagcctgca gaccgacgat accgccatct actattgtgc caagcactac 1140 tactacggcg gcagctacgc catggactac tggggacagg gaacctccgt gaccgtcagt 1200 agtggtggtg gcggatctgg tggaggcggc tccgacattc agatgactca gagcccttcc 1260 agcctgtccg cctctgtggg agacagagtg acaatcacct gtagagcctc ccagaccatc 1320 tggtcctatc tcaactggta ccagcagcgg ccaggcaagg cccctaacct gctcatctat 1380 gccgcctcta gcctgcagtc cggggtgccc tctagattca gcggcagagg aagcggcacc 1440 gatttcaccc tgacaattag ctcactgcag gccgaggact tcgccaccta ttactgccag 1500 cagagctaca gcatccctca gaccttcggc cagggaacaa agctcgaaat caagactagt 1560 tccggaacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 1620 cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 1680 gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 1740 cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat 1800 atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1860 tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1920 gcagacgccc ccgcgtacaa gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1980 cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 2040 aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 2100 gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 2160 ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 2220 gccctgcccc ctcgctaa 2238 <210> 78 <211> 2244 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 78 atgctgctgc tggtcacaag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 atccccgaca tccagatgac ccagaccacc agcagcctga gcgccagcct gggcgataga 120 gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180 aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gcagactgca cagcggcgtg 240 cccagcagat tttctggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300 gaacaggaag atatcgctac ctacttctgt cagcaaggca acaccctgcc ctacaccttc 360 ggcggaggca ccaagctgga aatcacaggc ggcggaggat ctggcggagg cggaagttgt 420 ggtggcggat ctcaggtcca gctgcagcag agtggccctg gcctggtcaa gcctagccag 480 accctgagcc tgacctgcgc catcagcggc gacagcgtgt cctctaacag cgccgcctgg 540 aattggatca gacagagccc cagcagaggc ctggaatggc tgggccggac ctactaccgg 600 tccaagtggt acaacgacta cgccgtgtcc gtgaagtccc ggatcaccat caaccccgac 660 accagcaaga accagttctc cctgcagctg aacagcgtga cccctgagga caccgccgtg 720 tactactgcg ccagagaagt gaccggcgac ctggaagatg ccttcgacat ctggggccag 780 ggcaccatgg tcaccgtcag tagtggaggc ggtggcagcg gtggcggcgg aagcgatatt 840 cagatgactc agagcccctc cagcctgtcc gcctctgtgg gagacagagt gacaatcacc 900 tgtagagcct cccagaccat ctggtcctat ctcaattggt accagcagcg gccaggcaag 960 gcccctaacc tgctcatcta tgccgcctct agcctgcagt ccggcgtgcc atctagattc 1020 agcggcagag gcagcggcac cgatttcacc ctgacaatca gttccctgca ggccgaggac 1080 ttcgccacct actattgcca gcagagctac agcatccctc agaccttcgg ccagggaaca 1140 aagctcgaaa tcaaaggtgg aggcggctgc ggaggtggtg gatctggagg cggaggctcc 1200 gaagtgaagc tgcaggaaag cggcccagga ctggtggccc ctagccagtc tctgtccgtg 1260 acctgtaccg tgtctggcgt gtccctgccc gattacggcg tgtcctggat caggcagcca 1320 ccccggaaag gactcgaatg gctcggcgtg atctggggca gcgagacaac ctactacaac 1380 agcgccctga agtccagact gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca ggtgttcctg 1440 aagatgaaca gcctgcagac cgacgatacc gccatctatt actgtgccaa gcactactac 1500 tacggcggca gctacgccat ggactactgg ggacagggaa cctccgtgac cgtgtccagt 1560 actagttccg gaaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 1620 tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 1680 acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 1740 ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 1800 ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1860 tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1920 aggagcgcag acgcccccgc gtacaagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1980 ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 2040 gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 2100 aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 2160 cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 2220 atgcaggccc tgccccctcg ctaa 2244 <210> 79 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 79 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 81 Gly Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 82 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 82 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Cys Gly Ser 1 5 10 15 <210> 83 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 83 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 84 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 84 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 85 Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (38)

  1. (a) 절단가능한 도메인;
    (b) 제1 항원 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제1 키메라성 항원 수용체(chimeric antigen receptor); 및
    (c) 제2 항원 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제2 키메라성 항원 수용체
    를 포함하는 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물로서,
    제1 및 제2 키메라성 항원 수용체가 절단가능한 도메인을 통해 연결되고,
    제1 항원 결합 도메인이 m971 항체의 항원 결합 도메인을 포함하고,
    제1 키메라성 항원 수용체가 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물로부터 절단될 때, 제1 항원 결합 도메인이 CD22에 대한 항원 특이성을 갖는,
    키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  2. 제1항에 있어서,
    절단가능한 도메인의 절단이 제1 및 제2 키메라성 항원 수용체를 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물로부터 방출시키는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 항원 결합 도메인이 서열번호 3 내지 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 11 내지 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원 결합 도메인이 서열번호 3 내지 9 및 11 내지 17의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서,
    제2 키메라성 항원 수용체가 구축물로부터 절단될 때, 제2 항원 결합 도메인이 CD19에 대한 항원 특이성을 갖는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  6. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서,
    제2 항원 결합 도메인이 FMC63 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서,
    제2 항원 결합 도메인이 서열번호 31 내지 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23 내지 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
    제2 항원 결합 도메인이 서열번호 23 내지 29 및 31 내지 37의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  9. (a) 절단가능한 도메인;
    (b) 제1 항원 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제1 키메라성 항원 수용체; 및
    (c) 제2 항원 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제2 키메라성 항원 수용체
    를 포함하는 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물로서,
    제1 및 제2 키메라성 항원 수용체가 절단가능한 도메인을 통해 연결되고,
    제1 항원 결합 도메인이 FMC63 항체의 항원 결합 도메인을 포함하고,
    제1 키메라성 항원 수용체가 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물로부터 절단될 때, 제1 항원 결합 도메인이 CD19에 대한 항원 특이성을 갖는,
    키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  10. 제9항에 있어서,
    절단가능한 도메인의 절단이 제1 및 제2 키메라성 항원 수용체를 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물로부터 방출시키는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    제1 항원 결합 도메인이 서열번호 31 내지 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23 내지 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  12. 제9항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원 결합 도메인이 서열번호 23 내지 29 및 31 내지 37의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  13. 제9항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서,
    제2 키메라성 항원 수용체가 구축물로부터 절단될 때, 제2 항원 결합 도메인이 CD22에 대한 항원 특이성을 갖는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  14. 제1항 내지 제13항중 어느 한 항에 있어서,
    제1 또는 제2 막관통 도메인이 CD8 막관통 도메인 및 CD8 힌지 도메인을 포함하는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  15. 제14항에 있어서,
    CD8 막관통 도메인이 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하고, CD8 힌지 도메인이 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  16. 제1항 내지 제15항중 어느 한 항에 있어서,
    제1 또는 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인이 4-1BB 세포내 T 세포 신호전달 서열을 포함하는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  17. 제16항에 있어서,
    4-1BB 세포내 T 세포 신호전달 서열이 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  18. 제1항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서,
    제1 또는 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인이 CD3 제타(ζ) 세포내 T 세포 신호전달 서열을 포함하는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  19. 제18항에 있어서,
    CO3ζ 세포내 T 세포 신호전달 서열이 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  20. 제1항 내지 제19항중 어느 한 항에 있어서,
    절단가능한 도메인이 2A 또는 퓨린(furin)인, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  21. 제1항 내지 제20항중 어느 한 항에 있어서,
    각각 제1 및 제2 키메라성 항원 수용체인 정확히 2개의 키메라성 항원 수용체를 포함하는 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  22. 서열번호 48, 49, 50, 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  23. 서열번호 63 내지 70중 어느 하나와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  24. (a) 2개 이상의 절단가능한 도메인;
    (b) 제1 항원 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제1 키메라성 항원 수용체; 및
    (c) 제2 항원 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제2 키메라성 항원 수용체
    를 포함하는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물로서,
    제1 및 제2 키메라성 항원 수용체가 2개 이상의 절단가능한 도메인을 통해 연결되는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  25. 제24항에 있어서,
    2개 이상의 절단가능한 도메인이 바로 인접해 있거나, 2개 이상의 절단가능한 도메인 사이에 1개 이상의 연결기를 갖는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서,
    정확히 2개의 절단가능한 도메인이 존재하는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  27. 제1항 내지 제26항중 어느 한 항에 따른 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  28. 제27항에 있어서,
    서열번호 53 내지 57 또는 71 내지 78중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  29. 제27항 또는 제28항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  30. 제29항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  31. 하나 이상의 제30항에 따른 숙주 세포를 포함하는 세포 집단.
  32. 제1항 내지 제26항중 어느 한 항에 따른 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물, 제27항 또는 제28항에 따른 핵산, 제29항에 따른 재조합 발현 벡터, 제30항에 따른 숙주 세포, 또는 제31항에 따른 세포 집단, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  33. (a) 포유동물로부터의 하나 이상의 세포를 포함하는 샘플을 제1항 내지 제26항중 어느 한 항에 따른 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물, 제27항 또는 제28항에 따른 핵산, 제29항에 따른 재조합 발현 벡터, 제30항에 따른 숙주 세포, 제31항에 따른 세포 집단, 또는 제32항에 따른 약학 조성물과 접촉시킴으로써 복합체를 형성하는 단계; 및
    (b) 복합체를 검출하는 단계로서, 복합체의 검출이 포유동물에서 암의 존재를 지시하는, 단계
    를 포함하는, 포유동물에서 암의 존재를 검출하는 방법.
  34. 포유동물에서 암을 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제26항중 어느 한 항에 따른 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물, 제27항 또는 제28항에 따른 핵산, 제29항에 따른 재조합 발현 벡터, 제30항에 따른 숙주 세포, 제31항에 따른 세포 집단, 또는 제32항에 따른 약학 조성물.
  35. 제34항에 있어서,
    암이 혈액학적 악성종양인, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물.
  36. (a) 제1 항원 결합 도메인, 제1 막관통 도메인, 및 제1 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제1 키메라성 항원 수용체; 및 (b) 제2 항원 결합 도메인, 제2 막관통 도메인, 및 제2 세포내 T 세포 신호전달 도메인을 포함하는 제2 키메라성 항원 수용체 사이에 2개 이상의 절단가능한 도메인을 고안하는 단계로서, 제1 및 제2 키메라성 항원 수용체가 2개 이상의 절단가능한 도메인을 통해 연결되는, 단계; 및
    N-말단에서 C-말단으로 제1 키메라성 항원 수용체, 2개 이상의 절단가능한 도메인, 및 제2 키메라성 항원 수용체를 포함하는 서열을 플라스미드내로 클로닝하는 단계
    를 포함하는, 키메라성 항원 수용체 아미노산 구축물을 제조하는 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    2개 이상의 절단가능한 도메인이 바로 인접해 있거나, 2개 이상의 절단가능한 도메인 사이에 1개 이상의 연결기를 갖는, 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서,
    정확히 2개의 절단가능한 도메인이 존재하는, 방법.
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Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10738116B2 (en) 2015-03-19 2020-08-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Dual specific anti-CD22-anti-CD19 chimeric antigen receptors
IT201800003464A1 (it) * 2018-03-13 2019-09-13 Ospedale Pediatrico Bambino Gesu Cellule T CAR-CD30 per il trattamento di tumori CD30+
WO2020123691A2 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Kite Pharma, Inc Chimeric antigen and t cell receptors and methods of use
CA3125484A1 (en) 2019-01-08 2020-07-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cross-species single domain antibodies targeting mesothelin for treating solid tumors
EP3883971A1 (en) 2019-01-22 2021-09-29 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services High affinity monoclonal antibodies targeting glypican-1 and methods of use
KR20210129125A (ko) * 2019-02-20 2021-10-27 시티 오브 호프 Baff-r/cd19 표적화된 키메라 항원 수용체-변형된 t 세포 및 그의 용도
EP3952886A1 (en) * 2019-04-10 2022-02-16 Elevatebio Technologies, Inc Flt3-specific chimeric antigen receptors and methods of using the same
GB201906283D0 (en) * 2019-05-03 2019-06-19 Moredun Res Institute Vector
WO2020227446A1 (en) * 2019-05-07 2020-11-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enhancement of polypeptides and chimeric antigen receptors via hinge domains
WO2020243713A2 (en) * 2019-05-31 2020-12-03 City Of Hope Cd33 targeted chimeric antigen receptor modified t cells for treatment of cd33 positive malignancies
CN112390891B (zh) * 2019-08-14 2022-06-03 苏州方德门达新药开发有限公司 嵌合抗原受体及其构建方法和应用
CN114729041A (zh) 2019-10-22 2022-07-08 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 用于治疗多种实体瘤的靶向b7h3（cd276）的高亲和力纳米抗体
WO2021087245A1 (en) * 2019-10-30 2021-05-06 The Texas A&M University System Protease switch for dual targets chimeric antigen receptor t cell therapy
US11975026B2 (en) * 2019-11-26 2024-05-07 Novartis Ag CD19 and CD22 chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2021168000A1 (en) * 2020-02-17 2021-08-26 University Of Virginia Patent Foundation CAR T CELLS TARGETING THE INTEGRIN ALPHAv BETA3 EXHIBIT ROBUST ANTI-TUMOR RESPONSES AGAINST GLIOMAS AND OTHER SOLID TUMOR MALIGNANCIES
CN113493516A (zh) * 2020-04-02 2021-10-12 重庆精准生物技术有限公司 靶向双特异性位点的嵌合抗原受体及其应用
CN113493517B (zh) * 2020-04-02 2023-05-02 重庆精准生物技术有限公司 双特异性单链抗体及其构建的嵌合抗原受体和应用
CN111632135A (zh) * 2020-05-09 2020-09-08 深圳宾德生物技术有限公司 靶向nkg2d的嵌合抗原受体t细胞在治疗前列腺癌中的应用、治疗前列腺癌的药物
WO2022093745A1 (en) 2020-10-26 2022-05-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting sars coronavirus spike protein and uses thereof
CA3200509A1 (en) 2020-12-31 2022-07-07 Sonja SCHREPFER Methods and compositions for modulating car-t activity
AU2022206324A1 (en) 2021-01-11 2023-07-20 Sana Biotechnology, Inc. Use of cd8-targeted viral vectors
CN112961245B (zh) * 2021-02-24 2023-07-25 重庆精准生物技术有限公司 一种靶向cd96的双特异性抗体及其制备方法和用途
WO2022232612A1 (en) 2021-04-29 2022-11-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Lassa virus-specific nanobodies and methods of their use
CA3219352A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 Sonja SCHREPFER Hypoimmunogenic rhd negative primary t cells
AU2022283291A1 (en) 2021-05-27 2023-11-02 Sana Biotechnology, Inc. Hypoimmunogenic cells comprising engineered hla-e or hla-g
WO2022261017A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cross species single domain antibodies targeting pd-l1 for treating solid tumors
WO2023287827A2 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Sana Biotechnology, Inc. Altered expression of y chromosome-linked antigens in hypoimmunogenic cells
TW202321457A (zh) 2021-08-04 2023-06-01 美商薩那生物科技公司 靶向ｃｄ４之病毒載體之用途
WO2023019229A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified primary cells for allogeneic cell therapy
WO2023019227A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce complement-mediated inflammatory reactions
CA3227613A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 William Dowdle Inducible systems for altering gene expression in hypoimmunogenic cells
AU2022325955A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions
WO2023019226A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy
WO2023069790A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Sana Biotechnology, Inc. Methods of engineering allogeneic t cells with a transgene in a tcr locus and associated compositions and methods
WO2023076881A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein
WO2023086829A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Igg4 hinge-containing chimeric antigen receptors targeting glypican-3 (gpc3) and use thereof
TW202342498A (zh) 2021-12-17 2023-11-01 美商薩那生物科技公司 經修飾副黏液病毒科融合醣蛋白
TW202342757A (zh) 2021-12-17 2023-11-01 美商薩那生物科技公司 經修飾副黏液病毒科附著醣蛋白
WO2023122337A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Sana Biotechnology, Inc. Chimeric antigen receptor (car) t cells for treating autoimmune disease and associated methods
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023150518A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
WO2023150647A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
CN114478803B (zh) * 2022-02-11 2023-09-26 北京大学深圳研究生院 一种新型双特异性嵌合抗原受体的构建及其应用
WO2023154578A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Sana Biotechnology, Inc. Methods of treating patients exhibiting a prior failed therapy with hypoimmunogenic cells
WO2023158986A1 (en) 2022-02-15 2023-08-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cd28 hinge and transmembrane containing chimeric antigen receptors targeting gpc2 and use thereof
WO2023158836A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Sana Biotechnology, Inc. Engineered cd47 proteins and uses thereof
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
WO2024050399A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting hpv e6/e7 oncogenic peptide/mhc complexes
WO2024064838A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof
WO2024081820A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2889055C (en) * 2012-10-24 2024-01-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services M971 chimeric antigen receptors
WO2015090230A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
DK3149031T3 (da) * 2014-05-29 2020-03-16 Us Health Anti-human papillomavirus 16 e7 t-cellereceptorer
CA3224507A1 (en) * 2014-12-24 2016-06-30 Autolus Limited Cell co-expressing chimeric antigen receptors binding cd19 and cd22
US10738116B2 (en) * 2015-03-19 2020-08-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Dual specific anti-CD22-anti-CD19 chimeric antigen receptors
RU2021121771A (ru) * 2015-04-08 2022-01-12 Новартис Аг Cd20 терапия, cd22 терапия и комбинированная терапия клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (car) к cd19
CN115058395A (zh) * 2015-06-25 2022-09-16 美商生物细胞基因治疗有限公司 嵌合抗原受体(car)、组合物及其使用方法
CN105647873A (zh) * 2016-03-14 2016-06-08 紫程瑞生会(北京)生物技术发展有限公司 一种双特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备方法及其试剂盒

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