JP2024045139A - 抗kras-g12d t細胞受容体 - Google Patents
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Abstract
Description
本特許出願は、2016年8月2日に出願された米国仮特許出願番号第62/369,883号(参照によりその全体がそれぞれ本明細書に取り込まれる)についての利益を主張する。
本明細書と同時に提出され、以下の通り識別される、コンピューターで読み取り可能なヌクレオチド/アミノ酸の配列表は、参照により、その全体が本明細書に取り込まれる:2017年7月26日付けの「728242_ST25.txt」という名前の60,828バイトのASCII(テキスト
)ファイル1件。
幾つかのがんは、特にがんが転移性で切除不能となる場合、治療のオプションが極めて限定され得る。例えば、例、手術、化学療法及び放射線治療等の治療における進歩にも関わらず、例えば、例、膵臓、結腸直腸、肺、子宮内膜、卵巣及び前立腺がん等の多くのがんについての予後は悪い場合がある。従って、がんに対する追加的な治療の満たされていないニーズが存在する。
本発明の実施形態によって、以下:(a) 配列番号9~14;(b) 配列番号17~22;(c) 配
列番号25~30;又は(d) 配列番号33~38のアミノ酸配列を含む、単離又は精製されたTCR
が提供される。
配列番号25~30;又は(d) 配列番号33~38のアミノ酸配列を含む、単離又は精製された
ポリペプチドが提供される。
のポリペプチド鎖及び配列番号12~14のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖;(b) 配列番号17~19のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号20~22のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖;(c) 配列番号25~27のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号28~30のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖;又は(d) 配列番号33~35のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号36~38のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖を含む、単離又は精製されたタンパク質が提供される。
(TRAV4/TRBV5-6(B))。D (TRAV4/TRBV5-6 (C))。
GTPアーゼKRas、V-Ki-Ras2キルステンラット肉腫ウィルスがん遺伝子又はKRAS2として
も参照される、キルステンラット肉腫ウィルスがん遺伝子ホモログ (KRAS)は、低分子量
(small)GTPアーゼ・スーパーファミリーのメンバーである。KRASには2つの転写産物変
異体:KRAS変異体A及びKRAS変異体Bがある。以降、他で特定されない限り、「KRAS」(変異又は未変異)への言及は、変異体A及び変異体Bの両方を指す。特定の理論又は機構に拘束されることはないが、変異した場合、KRASは多くのヒトがんの発がんの早期においてシグナル伝達に関与する場合があると考えられる。単一のアミノ酸置換が、タンパク質を活性化し得る。活性化した場合、変異KRASはグアノシン-5'-三リン酸(GTP)に結合し、GTPをグアノシン5'-二リン酸 (GDP)に変換する。変異KRASタンパク質産物は、構成的に活性化
され得る。変異KRASタンパク質は、多様なヒトがん、例えば、例、膵臓 (例、膵臓がん)
、結腸直腸、肺 (例、肺腺がん)、子宮内膜、卵巣(例、上皮卵巣がん)及び前立腺がん等
のいずれかにおいて発現され得る。
有する、単離又は精製されたTCRを提供する。以降、他で特定されない限り、「TCR」への言及は、TCRの機能的部分及び機能的変異体も指す。本発明のTCRは、G12D変異を有する任意のKRAS (タンパク質、ポリペプチド又はペプチド)に対する抗原特異性を有し得る。
それからなるKRASタンパク質である、G12D変異を有するKRASタンパク質に対する抗原特異性を有する。配列番号3の変異KRAS変異体Aタンパク質のアミノ酸配列は、一般的に、配列番号3においては12位のグリシンがアスパラギン酸で置換されていることを除き、変異し
ていない、配列番号1の野生型 (WT)KRASタンパク質変異体Aのアミノ酸配列の1~189位に
対応する。配列番号4の変異KRAS変異体Bタンパク質のアミノ酸配列は、一般的に、配列番号4においては12位のグリシンがアスパラギン酸で置換されていることを除き、変異して
いない、配列番号2のWT KRASタンパク質変異体Bのアミノ酸配列の1~188位に対応する。
抗原特異性を有し、該KRASペプチドは任意の長さを有する。例えば、TCRはG12D変異を有
するKRASペプチドに対する抗原特異性を有し得、該KRASペプチドは、約8~約24アミノ酸
残基、好ましくは約9~約11アミノ酸残基の長さを有する。本発明の一実施形態において
は、TCRはG12D変異を有するKRASペプチドに対する抗原特異性を有し得、該KRASペプチド
は、約8アミノ酸残基、約9アミノ酸残基、約10アミノ酸残基、約11アミノ酸残基、約12アミノ酸残基又は約24アミノ酸残基の長さを有する。例えば、TCRは、GADGVGKSA (配列番号8)のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるペプチドである、G12D変異を有するKRAS10-18ペプチドに対する抗原特異性を有し得る。G12D変異を有する、配列番号8の変異KRASペプチドのアミノ酸配列は、一般的に、配列番号8において、3位のグリシンがアスパラギン酸で置換されていることを除き、変異していない、配列番号7のWT KRAS10-18ペプチドのア
ミノ酸配列の1~9位に対応する。
抗原特異性を有し得、該変異KRASペプチドは、GADGVGKSA (変異KRAS10-18;配列番号8);又はGADGVGKSAL (変異KRAS10-19;配列番号6)のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる
。例示的な実施形態においては、TCRは変異KRASエピトープに対する抗原特異性を有し、
該変異KRASエピトープは、GADGVGKSA (変異KRAS10-18;配列番号8)又はGADGVGKSAL (変異KRAS10-19;配列番号6)のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
することができる。これに関して、TCRが、HLA-Cw8分子との関連で変異KRASに結合する際に、免疫応答を誘発し得ることを意味する。本発明のTCRは、HLA-Cw8分子によって提示される変異KRASを認識することができ、変異KRASに加えてHLA-Cw8分子に結合し得る。関連
して、本発明のTCRが変異KRASを認識する例示的なHLA-Cw8分子としては、HLA-Cw*0801、HLA-Cw*0802、HLA-Cw*0803、HLA-Cw*0804、HLA-Cw*0805、HLA-Cw*0806、HLA-Cw*0807、HLA-Cw*0808及びHLA-Cw*0809アレルによってコードされるものが挙げられる。好ましい実施
形態においては、TCRは、HLA-Cw*0802分子との関連で変異KRASを認識する。
有することに加えて、本発明のTCRの1つ (TRAV12-2/TRBV10-2 (表5))はまた、HLA-Cw5分
子の関連内で変異KRASを認識することができる。これに関して、TCRは、HLA-Cw5分子の関連内で変異KRASに結合する際、免疫応答を誘発し得る。本発明のTCRは、HLA-Cw5分子によって提示されている変異KRASを認識することができ、変異KRASに加えて、HLA-Cw5分子に
結合し得る。本発明のTCRが変異KRASを認識する関連内では、例示的なHLA-Cw5分子としては、HLA-Cw*0501、HLA-Cw*0502、HLA-Cw*0503、HLA-Cw*0504、HLA-Cw*0505、HLA-Cw*0506、HLA- HLA-Cw*0508、HLA-Cw*0509及びHLA-Cw*0510アレルによってコードされる分子が挙げられる。好ましい実施形態においては、TCRは、HLA-Cw*0501分子の関連内で、変異KRASを認識する。HLA-Cw*0802及びHLA-Cw*0501のアミノ酸配列は、2つのアミノ酸残基のみで
互いに異なっている。特定の理論又は機構に拘束されることはないが、TRAV12-2/TRBV10-2 TCRはまた、HLA-Cw*0802及びHLA-Cw*0501の一方又は両方に類似している、他のHLA分子によって提示される変異KRASを認識し得ると考えられる。
、多くの利点を提供する。変異KRASはがん細胞によって発現され、健常な非がん細胞によっては発現されない。特定の理論又は機構に拘束されることはないが、本発明のTCRは、
健常な非がん細胞の破壊を最小化又は排除し、それにより例えば毒性を最小化又は排除することによって毒性を低減する一方、有利にがん細胞の破壊を目的とすると考えられる。更に、本発明のTCRは、例えば、例、化学療法、手術又は放射線療法等の他の型の治療に
応答しない変異KRAS陽性がんを、有利に成功裏に治療又は予防し得る。追加的に、本発明のTCRは、変異KRASの高度に貪欲な認識を提供し、これは、操作されていない腫瘍細胞 (
例、インターフェロン(IFN)γで処理されていない、変異KRAS及びHLA-Cw*0802の一方若しくは両方をコードするベクターでトランスフェクトされていない、G12D変異を有するKRASペプチドでパルスされていない、又はそれらの組み合わせの腫瘍細胞)を認識する能力
を提供し得る。更に、HLA-Cw*0802アレルは、アメリカ系コーカシアンとアフリカ系アメ
リカ人の人種のそれぞれ最大約8%及び最大約11%で発現している。従って、本発明のTCRは、他のMHC分子との関連で抗原を認識するTCRを用いた免疫療法に適していない場合があるHLA-Cw*0802アレルを発現する患者を含む、免疫療法に適格ながん患者数を増加し得る
。
ティーを有する変異KRASに特異的に結合し得、免疫学的に認識し得ることを意味する。例えば、(a)低濃度の変異KRASペプチド (例、約0.05 ng/mL~約10 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、8 ng/mL、10 ng/mL、又は前記値の任意の2つによって定義される範囲)でパ
ルスした抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞、又は(b)標的細胞が変異KRASを発現するよう、
変異KRASをコードするヌクレオチド配列が導入されている抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞、との共培養の際、TCRを発現する約1×104~約1×105のT細胞が、少なくとも約200 pg/mL以上(例、200 pg/mL以上、300 pg/mL以上、400 pg/mL以上、500 pg/mL以上、600 pg/mL
以上、700 pg/mL以上、1000 pg/mL以上、5,000 pg/mL以上、7,000 pg/mL以上、10,000 pg/mL以上、20,000 pg/mL以上、又は前記値の任意の2つによって定義される範囲)のIFN-γ
を分泌する場合、TCRは変異KRASに対して「抗原特異性」を有すると考えられ得る。本発
明のTCRを発現する細胞はまた、より高濃度の変異KRASペプチドでパルスした抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞との共培養の際、IFN-γを分泌し得る。
発現するT細胞が、陰性対照によって発現されるIFN-γの量と比べて少なくとも2倍のIFN-γを分泌する場合、TCRは変異KRASに対して「抗原特異性」を有すると考えられ得る。陰
性対照は、例えば、(i)(a)同じ濃度の無関係のペプチド (例、変異KRASペプチドとは異なる配列を有する幾つかの他のペプチド)でパルスした抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞、若
しくは(b)標的細胞が無関係のペプチドを発現するよう、無関係のペプチドをコードする
ヌクレオチド配列が導入されている抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞、と共培養した、TCR
を発現するT細胞、又は(ii)(a)同じ濃度の変異KRASペプチドでパルスした抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞、若しくは(b)標的細胞が変異KRASを発現するよう、変異KRASをコードす
るヌクレオチド配列が導入されている抗原陰性HLA-Cw*0802+標的細胞、と共培養した、形質導入されていないT細胞 (例、TCRを発現しないPBMC由来)であり得る。IFN-γ分泌は、
例えば、例、酵素結合免疫吸着アッセイ (ELISA)等の当該技術分野において公知の方法によって測定され得る。
くとも2倍である場合、TCRは変異KRASに対して「抗原特異性」を有すると考えられ得る。ペプチドの濃度及び陰性対照は、本発明の他の態様に関して明細書に記載されたものであり得る。IFN-γを分泌する細胞数は、例えば、例、ELISPOT等の当該技術分野において公
知の方法によって測定され得る。
。T細胞活性化マーカーの例としては、4-1BB、OX40、CD107a、CD69、及び抗原刺激によって上方制御されるサイトカイン(例、腫瘍壊死因子 (TNF)、インターロイキン (IL)-2等
)が挙げられる。
を有するという条件で、任意のアミノ酸配列を含み得る。
、TCRは、配列番号9のアミノ酸配列を含むCDR1 (α鎖のCDR1)、配列番号10のアミノ酸配
列を含むCDR2 (α鎖のCDR2)、及び配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR3 (α鎖のCDR3)を含む第一のポリペプチド鎖、並びに配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR1 (β鎖のCDR1)
、配列番号13のアミノ酸配列を含むCDR2 (β鎖のCDR2)、及び配列番号14のアミノ酸配列
を含むCDR3 (β鎖のCDR3)を含む第二のポリペプチド鎖を含む。
鎖のCDR1)、配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR2 (α鎖のCDR2)、及び配列番号19のアミ
ノ酸配列を含むCDR3 (α鎖のCDR3)を含む第一のポリペプチド鎖、並びに配列番号20のア
ミノ酸配列を含むCDR1 (β鎖のCDR1)、配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR2 (β鎖のCDR2)、及び配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR3 (β鎖のCDR3)を含む第二のポリペプチド
鎖、を含む。
鎖のCDR1)、配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR2 (α鎖のCDR2)、及び配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR3 (α鎖のCDR3)を含む第一のポリペプチド鎖、並びに配列番号28のア
ミノ酸配列を含むCDR1 (β鎖のCDR1)、配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR2 (β鎖のCDR2)、及び配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR3 (β鎖のCDR3)を含む第二のポリペプチド
鎖、を含む。
鎖のCDR1)、配列番号34のアミノ酸配列を含むCDR2 (α鎖のCDR2)、及び配列番号35のアミノ酸配列を含むCDR3 (α鎖のCDR3)を含む第一のポリペプチド鎖、並びに配列番号36のア
ミノ酸配列を含むCDR1 (β鎖のCDR1)、配列番号37のアミノ酸配列を含むCDR2 (β鎖のCDR2)、及び配列番号38のアミノ酸配列を含むCDR3 (β鎖のCDR3)を含む第二のポリペプチド
鎖、を含む。
は、TCRは、以下:(i) 配列番号9~11;(ii);配列番号12~14;(iii) 配列番号17~19;(iv) 配列番号20~22;(v) 配列番号25~27;(vi) 配列番号28~30;(vii) 配列番号33~35;又は(viii) 配列番号36~38のアミノ酸配列を含む。特に好ましい実施形態において
は、TCRは、以下:(a) 配列番号9~14の全て;(b) 配列番号17~22の全て;(c) 配列番号25~30の全て;又は(d) 配列番号33~38の全てのアミノ酸配列を含む。
列を含む。これに関して、TCRは、以下:配列番号15 (α鎖の可変領域);配列番号23 (α鎖の可変領域);配列番号31 (α鎖の可変領域);配列番号39 (α鎖の可変領域);配列番
号16 (β鎖の可変領域);配列番号24 (β鎖の可変領域);配列番号32 (β鎖の可変領域)
;配列番号40 (β鎖の可変領域);配列番号15及び16の両方;配列番号23及び24の両方;
配列番号31及び32の両方;又は配列番号39及び40の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、本発明のTCRは、(i) 配列番号15~16の両方;(ii) 配列番号23~24の両方;(iii) 配列番号31~32の両方;又は(iv) 配列番号39~40の両方のアミノ酸配列を含む。
、例、ヒト又はマウス等の任意の好適な種に由来し得る。本発明の一実施形態においては、TCRは、マウスのα鎖及びβ鎖定常領域、又はヒトのα鎖及びβ鎖定常領域を更に含む
。本明細書において用いられる場合、用語「マウスの」又は「ヒトの」は、本明細書に記載されたTCR又はTCRの任意の構成要素(例、相補性決定領域 (CDR)、可変領域、定常領域
、α鎖及び/又はβ鎖)を参照する場合、マウス又はヒトのそれぞれに由来するTCR (又はその構成要素)、即ち、マウスT細胞又はヒトT細胞のそれぞれに起源するか又はかつて発
現したTCR (又はその構成要素)を意味する。
に関して、TCRは、1位のXが天然で生じた任意のアミノ酸残基である、配列番号41 (ヒト
α鎖の定常領域)、配列番号42 (ヒトβ鎖の定常領域)、配列番号43 (ヒトβ鎖の定常領域)、配列番号41及び42の両方、又は配列番号41及び43の両方のアミノ酸配列を含み得る。
本発明の一実施形態においては、TCRは、本明細書に記載されたCDR領域のいずれかとの組
合せで、本明細書に記載されたヒト定常領域のいずれかを含む。これに関して、TCRは、
以下:(a) 配列番号9~14、41及び42の全て;(b) 配列番号17~22、41及び42の全て;(c)
配列番号25~30、41及び42の全て;(d) 配列番号33~38、41及び42の全て;(e) 配列番
号9~14、41及び43の全て;(f) 配列番号17~22、41及び43の全て;(g) 配列番号25~30
、41及び43の全て;又は(h) 配列番号33~38、41及び43の全てのアミノ酸配列を含み得る。本発明の一実施形態においては、TCRは、本明細書に記載された可変領域のいずれかと
の組合せで、本明細書に記載されたヒト定常領域のいずれかを含む。これに関して、TCR
は、以下:(i) 配列番号15~16、41及び42の全て;(ii) 配列番号23~24、41及び42の全
て;(iii) 配列番号31~32、41及び42の全て;(iv) 配列番号39~42の全て;(v) 配列番
号15~16、41及び43の全て;(vi) 配列番号23~24、41及び43の全て;(vii) 配列番号31
~32、41及び43の全て;又は(viii) 配列番号39~40、41及び43の全てのアミノ酸配列を
含み得る。
該TCRがHLA-Cw8分子との関連で提示された変異KRASに対する抗原特異性を有する、キメラTCRを提供する。マウス定常領域は、1以上の任意の利益を提供し得る。例えば、マウス定常領域は、本発明のTCRが導入される宿主細胞の内在的なTCRと、本発明のTCRとのミスペ
アリングを減殺し得る。代替的に又は追加的に、マウス定常領域は、本発明のTCRの発現
を、ヒト定常領域を伴う同じTCRと比較して増大させ得る。キメラTCRは、配列番号44 (野生型(WT)マウスα鎖定常領域)、配列番号45 (WTマウスβ鎖定常領域)、又は配列番号44及び45の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、本発明のTCRは、配列番号44及び45
の両方のアミノ酸配列を含む。キメラTCRは、本発明の他の態様に関して、本明細書に記
載されたCDR領域のいずれかとの組合せで、本明細書に記載されたマウス定常領域のいず
れかを含み得る。これに関して、TCRは、以下:(a) 配列番号9~14、44及び45の全て;(b) 配列番号17~22、44及び45の全て;(c) 配列番号25~30、44及び45の全て;又は(d) 配列番号33~38、44及び45の全てのアミノ酸配列を含み得る。本発明の別の実施形態においては、キメラTCRは、本発明の他の態様に関して、本明細書に記載された可変領域のいず
れかとの組合せで、本明細書に記載されたマウス定常領域のいずれかを含み得る。これに関して、TCRは、以下:(i) 配列番号15~16、44及び45;(ii) 配列番号23~24、44及び45;(iii) 配列番号31~32、44及び45;又は(iv) 配列番号39~40、44及び45;のアミノ酸
配列を含み得る。
、TCRは、α及びβ鎖の一方又は両方の定常領域において、1、2、3又は4のアミノ酸置換
(複数可)を有する本明細書に記載されたTCRのいずれかのアミノ酸配列を含み得る。好
ましくは、TCRは、α鎖及びβ鎖の一方又は両方のマウス定常領域において、1、2、3又は4のアミノ酸置換(複数可)を有するマウス定常領域を含む。特に好ましい実施形態にお
いては、TCRは、α鎖のマウス定常領域における1、2、3又は4のアミノ酸置換(複数可)
、及びβ鎖のマウス定常領域における1つのアミノ酸置換を有するマウス定常領域を含む
。幾つかの実施形態においては、置換されている定常領域を含むTCRは、置換されていな
い(野生型)定常領域を含む親TCRと比べて、変異KRAS+標的の増加した認識、宿主細胞による増加した発現、内在的なTCRとのミスペアリングの減殺、及び増加した抗腫瘍活性の1以上を有利に提供する。一般的に、TCRα鎖及びβ鎖のマウス定常領域の置換されているア
ミノ酸配列(それぞれ配列番号46及び47)は、置換されていないマウス定常領域のアミノ酸配列(それぞれ配列番号44及び45)の全部または一部に対応し、配列番号46は、配列番号44と比べた場合に1つ、2つ、3つ又は4つのアミノ酸置換(複数可)を有し、及び配列番号47は、配列番号45と比べた場合に1つのアミノ酸置換を有する。これに関して、本発明
の一実施形態は、(a) 配列番号46 (α鎖の定常領域)であって、(i)48位のXがThr又はCys
であり;(ii)112位のXがSer、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpであり;(iii)114位のXがMet、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe又はTrpであり;及び(iv)115位のXがGly
、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpである配列番号46;並びに(b) 配列番号47
(β鎖の定常領域)であって、57位のXがSer又はCysである配列番号47、のアミノ酸配列を含むTCRを提供する。本発明の一実施形態においては、配列番号46を含むTCRは、配列番号44 (α鎖の置換されていないマウス定常領域)を含まない。本発明の一実施形態において
は、配列番号47を含むTCRは配列番号45 (β鎖の置換されていないマウス定常領域)を含まない。
る。α及びβ鎖中の対向するシステインは、置換されているTCRのα及びβ鎖の定常領域
を互いに連結するジスルフィド結合を提供し、それは置換されていないマウス定常領域を含むTCR中には存在しない。これに関して、TCRは、配列番号44のネイティブの48位のThr
(Thr48)及び配列番号45のネイティブの57位のSer(Ser57)の一方又は両方がCysで置換され得る、システイン置換TCRであり得る。好ましくは、配列番号44のネイティブThr48及び配列番号45のネイティブのSer57の両方がCysで置換されている。一実施形態においては、システイン置換TCRは、配列番号46のアミノ酸配列を含むα鎖定常領域であって、48位のXがCysであり、112位のXがネイティブのSerであり、114位のXがネイティブのMetであり、
及び115位のXがネイティブのGlyである領域、並びに配列番号47のアミノ酸配列を含むβ
鎖定常領域であって、57位のXがCysである領域、を含む。本発明のシステイン置換TCRは
、本明細書に記載されたCDR又は可変領域のいずれかに加え、置換されている定常領域を
含み得る。
貫通 (TM)ドメインにおける、1つ、2つ又は3つアミノ酸の、疎水性アミノ酸との置換が挙げられる。TCRのTMドメインにおける疎水性アミノ酸置換(複数可)は、TMドメイン中に
疎水性アミノ酸置換(複数可)を欠くTCRと比べて、TCRのTMドメインの疎水性を上昇させ得る。これに関して、TCRは、配列番号44のネイティブのSer112、Met114及びGly115のう
ちの1つ、2つ又は3つが独立してAla、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrp;好ましく
はLeu、Ile又はValで置換され得る、疎水性アミノ酸置換TCRである。好ましくは、配列番号44のネイティブのSer112、Met114及びGly115の3つ全てが独立してAla、Val、Leu、Ile
、Pro、Phe、Met又はTrp;好ましくはLeu、Ile又はValで置換され得る。一実施形態にお
いては、疎水性アミノ酸置換TCRは、配列番号46のアミノ酸配列を含むα鎖定常領域であ
って、48位のXがネイティブのThrであり、112位のXがSer、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpであり、114位のXがMet、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe又はTrpであり、
及び115位のXがGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpである領域、並びに配
列番号47のアミノ酸配列を含むβ鎖定常領域であって、57位のXがネイティブのSerである領域を含む(配列番号46を含む疎水性アミノ酸置換TCRは配列番号44 (α鎖の置換されて
いないマウス定常領域)を含まない)。好ましい実施形態においては、疎水性アミノ酸置
換TCRは、配列番号46のアミノ酸配列を含むα鎖定常領域であって、48位のXがネイティブのThrであり、112位のXがLeuであり、114位のXがIleであり、及び115位のXがValである領域、並びに配列番号47のアミノ酸配列を含むβ鎖定常領域であって、並びに57位のXがネ
イティブのSerである領域を含む。本発明の疎水性アミノ酸置換TCRは、本明細書に記載されたCDR又は可変領域のいずれかに加えて、置換されている定常領域を含み得る。
配列番号46のネイティブのSer112、Met114及びGly115のうちの1つ、2つ又は3つが独立し
てAla、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrp;好ましくはLeu、Ile又はValで置換され
;及び配列番号47のネイティブのSer57がCysで置換されている、システイン置換・疎水性アミノ酸置換TCRである。好ましくは、配列番号46のネイティブのSer112、Met114及びGly115の3つ全てが独立してAla、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrp;好ましくはLeu、Ile又はValで置換され得る。一実施形態においては、システイン置換・疎水性アミノ酸置
換TCRは、配列番号46のアミノ酸配列を含むα鎖であって、48位のXがCysであり、112位のXがSer、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpであり、114位のXがMet、Ala、Val
、Leu、Ile、Pro、Phe又はTrpであり、115位のXがGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpであるα鎖、並びに配列番号47のアミノ酸配列を含むβ鎖であって、57位のX
がCysであるβ鎖を含む(配列番号46は配列番号44 (置換されていないα鎖)を含まず、配列番号47は配列番号45 (置換されていないβ鎖)を含まない)。好ましくは、システイン
置換・疎水性アミノ酸置換TCRは、配列番号46のアミノ酸配列を含むα鎖であって、48位
のXがCysであり、112位のXがLeuであり、114位のXがIleであり、115位のXがValであるα
鎖、並びに配列番号47のアミノ酸配列を含むβ鎖であって、57位のXがCysであるβ鎖を含む。これに関して、システイン置換・疎水性アミノ酸置換TCRは、配列番号48のアミノ酸
配列を含むα鎖定常領域、及び配列番号49のアミノ酸配列を含むβ鎖定常領域を含む。本発明のシステイン置換・疎水性アミノ酸置換TCRは、本明細書に記載されたCDR又は可変領域のいずれかに加えて、置換されている定常領域を含み得る。
、TCRのα鎖及びTCRのβ鎖を含み得る。本発明のTCRのα鎖及びβ鎖の各々は、任意のア
ミノ酸配列を独立して含み得る。これに関して、本発明のTCRのα鎖は、配列番号50、52
、54又は56のアミノ酸配列を含み得る。この型のα鎖は、TCRの任意のβ鎖と対になり得
る。これに関して、本発明のTCRのβ鎖は、配列番号51、53、55又は57のアミノ酸配列を
含み得る。それゆえ、本発明のTCRは、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号50及び51の両方、配列
番号52及び53の両方、配列番号54及び55の両方、又は配列番号56及び57の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、本発明のTCRは、(1) 配列番号50~51の両方;(2) 配列番
号52~53の両方;(3) 配列番号54~55の両方;又は(4) 配列番号56~57の両方のアミノ酸配列を含む。
チドが提供される。本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、オリゴペプチドを含み、1以上のペプチド結合によって連結した一本鎖のアミノ酸を指す。
メントを指し、そしてその部分又はフラグメントは、一部であるTCR(親TCR)の生物学的活性を保持する。機能的部分は、例えば、変異KRASに特異的に結合する能力(例、HLA-Cw*0802分子の関連内で)、又は親TCRと類似する程度、同じ程度、又はより高い程度にがんを検出、治療若しくは予防する能力、を保持するTCRの部分を含有する。親TCRに準拠して、機能的部分は、例えば、親TCRの約10%、25%、30%、50%、68%、80%、90%、95%
以上を含み得る。
末端若しくはカルボキシ末端、又はその両方の末端に、追加的なアミノ酸を含み得る。望ましくは、追加のアミノ酸は、機能的部分の生物学的機能、例、変異KRASに特異的に結合すること;及び/又はがんを検出し、がんを治療し若しくは予防する能力を有することと
干渉しない。より望ましくは、追加のアミノ酸は、親TCRの生物学的活性と比較して、そ
の生物学的活性を増強する。
、本発明のTCRのα鎖及び/又はβ鎖の可変領域(複数可)のCDR1、CDR2及びCDR3の1以上を含む機能的部分等、を含み得る。本発明の一実施形態においては、ポリペプチドは配列番号9 (α鎖のCDR1)、配列番号10 (α鎖のCDR2)、配列番号11 (α鎖のCDR3)、配列番号12
(β鎖のCDR1)、配列番号13 (β鎖のCDR2)、配列番号14 (β鎖のCDR3)又はそれらの組合
せのアミノ酸配列を含み得る。本発明の別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号17 (α鎖のCDR1)、配列番号18 (α鎖のCDR2)、配列番号19 (α鎖のCDR3)、配列番号20 (β鎖のCDR1)、配列番号21 (β鎖のCDR2)、配列番号22 (β鎖のCDR3)、又はそれらの組合せのアミノ酸配列を含み得る。本発明の別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号25 (α鎖のCDR1)、配列番号26 (α鎖のCDR2)、配列番号27 (α鎖のCDR3)、配列番
号28 (β鎖のCDR1)、配列番号29 (β鎖のCDR2)、配列番号30 (β鎖のCDR3)、又はそれら
の組合せのアミノ酸配列を含み得る。本発明の別の実施形態においては、ポリペプチドは、配列番号33 (α鎖のCDR1)、配列番号34 (α鎖のCDR2)、配列番号35 (α鎖のCDR3)、配
列番号36 (β鎖のCDR1)、配列番号37 (β鎖のCDR2)、配列番号38 (β鎖のCDR3)、又はそ
れらの組合せのアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、(a) 配列番号9
~14の両方;(b) 配列番号17~22の両方;(c) 配列番号25~30の両方;又は(d) 配列番号33~38の両方のアミノ酸配列を含む。
組合せを含む本発明のTCRの可変領域を含み得る。これに関して、ポリペプチドは、配列
番号15 (α鎖の可変領域)、配列番号16 (β鎖の可変領域)、配列番号15及び16の両方、配列番号23 (α鎖の可変領域)、配列番号24 (β鎖の可変領域)、配列番号23及び24の両方、配列番号31 (α鎖の可変領域)、配列番号32 (β鎖の可変領域)、配列番号31及び32の両方、配列番号39 (α鎖の可変領域)、配列番号40 (β鎖の可変領域)、又は配列番号39及び40の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、(i) 配列番号15及び16の両方、(ii) 配列番号23及び24の両方、(iii) 配列番号31及び32の両方、又は(iv) 配列番号39及び40の両方のアミノ酸配列を含む。
領域を更に含み得る。これに関して、ポリペプチドは、配列番号41 (α鎖のヒト定常領域)、配列番号42 (β鎖のヒト定常領域)、配列番号43 (β鎖のヒト定常領域)、配列番号44 (α鎖のWTマウス定常領域)、配列番号45 (β鎖のWTマウス定常領域)、配列番号46 (α鎖
の置換されたマウス定常領域)、配列番号47 (β鎖の置換されたマウス定常領域)、配列番号48 (α鎖のシステイン置換され、疎水性アミノ酸置換されたマウス定常領域)、配列番
号49 (α鎖のシステイン置換され、疎水性アミノ酸置換されたマウス定常領域)、配列番
号44及び45の両方、配列番号46及び47の両方、又は配列番号48及び49の両方、配列番号41及び42の両方、又は配列番号41及び43の両方のアミノ酸配列を更に含み得る。好ましくは、本発明の他の態様に関して、ポリペプチドは、本明細書に記載されたCDR領域又は可変
領域のいずれかとの組合せで、(i) 配列番号44及び45の両方、(ii) 配列番号46及び47の
両方、(iii) 配列番号48及び49の両方、(iv) 配列番号41及び42の両方、又は(v) 配列番
号41及び43の両方のアミノ酸配列を更に含む。
のα又はβ鎖の全長を含み得る。これに関して、本発明のポリペプチドは、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56又は配列番号57のアミノ酸配列を含み得る。代替的には、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載されたTCRの両方の鎖を含み得る。例えば、本発明のポリペプチドは、配列番号50及び51
のアミノ酸配列の両方、配列番号52及び53の両方、配列番号54及び55の両方、又は配列番号56及び57の両方を含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、(1) 配列番号50~51の両方;(2) 配列番号52~53の両方;(3) 配列番号54~55の両方;又は(4) 配列番号56~57の両方のアミノ酸配列を含む。
提供する。「タンパク質」は、1以上のポリペプチド鎖を含む分子を意味する。
含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号12~14のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖;(b) 配列番号17~19のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号20~22のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖;(c) 配列番号25~27のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号28~30のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖;又は(d) 配列番号33~35のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号36~38のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖を含み得る。
列を含む第二のポリペプチド鎖;(iii) 配列番号31のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号32のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖;又は(iv) 配列番号39のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号40のアミノ酸配列を含む第二
のポリペプチド鎖を含み得る。
のXがSer、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpであり;(iii) 配列番号46の114
位のXがMet、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe又はTrpであり;及び(iv) 配列番号46の115
位のXがGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpである、配列番号46のアミノ酸配列を更に含み得;並びに(B) 第二のポリペプチド鎖は、配列番号47の57位のXがSer又はCysである、配列番号47のアミノ酸配列を更に含み得る。本発明の別の実施形態において
は、第一のポリペプチド鎖は、配列番号41 (ヒトα鎖の定常領域)、配列番号44 (α鎖の
マウスWT定常領域)又は配列番号48 (α鎖のシステイン置換され、疎水性アミノ酸置換さ
れたマウス定常領域)のアミノ酸配列を更に含み得、第二のポリペプチド鎖は、配列番号42 (β鎖のヒト定常領域)、配列番号43 (β鎖のヒト定常領域)、配列番号45 (β鎖のマウ
スWT定常領域)又は配列番号49 (β鎖のシステイン置換され、疎水性アミノ酸置換された
マウス定常領域)のアミノ酸配列を更に含み得る。
には、例えば、タンパク質が、配列番号50及び51の両方、配列番号52及び53の両方、配列番号54及び55の両方、若しくは配列番号55及び56の両方のアミノ酸配列を含む単一のポリペプチド鎖を含む場合、又はタンパク質の第一及び/若しくは第二のポリペプチド鎖(複数可)が他のアミノ酸配列、例、免疫グロブリン又はその部分をコードするアミノ酸配列
を更に含む場合、本発明のタンパク質は融合タンパク質であり得る。これに関して、本発明はまた、少なくとも1の他のポリペプチドと共に、本明細書に記載された本発明のポリ
ペプチドの少なくとも1を含む融合タンパク質を提供する。他のポリペプチドは、融合タ
ンパク質の別のポリペプチドとして存在し得、又は本明細書に記載された本発明のポリペプチドの1つとインフレームで(in frame)(タンデムで)発現されるポリペプチドとし
て存在し得る。他のポリペプチドは、免疫グロブリン、CD3、CD4、CD8、MHC分子、CD1分
子、例、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d等を含むがそれらに限定されない、任意のペプチド性若しくはタンパク質性の分子、又はそれらの部分をコードし得る。
ドの1以上のコピーを含み得る。例えば、融合タンパク質は、本発明のポリペプチド及び
/又は他のポリペプチドの1、2、3、4、5以上のコピーを含み得る。融合タンパク質を作
製する好適な方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、組換え法が挙げられる。
、α鎖及びβ鎖を連結するリンカーペプチドを含む単一のタンパク質として発現され得る。これに関して、本発明のTCR、ポリペプチド及びタンパク質はリンカーペプチドを更に
含み得る。リンカーペプチドは、宿主細胞内で、組換えTCR、ポリペプチド及び/又はタ
ンパク質の発現を有利に促進し得る。リンカーペプチドは、任意の好適なアミノ酸配列を含み得る。例えば、リンカーペプチドは、配列番号58を含み得る。宿主細胞によるリンカーペプチドを含むコンストラクトの発現の際、リンカーペプチドは切断され得、結果として別のα及びβ鎖となる。本発明の一実施形態においては、TCR、ポリペプチド又はタン
パク質は、完全長α鎖、完全長β鎖、並びにα鎖とβ鎖との間に位置するリンカーペプチドを含むアミノ酸配列を含み得る。
含む組換え抗体又はその抗原結合部分であり得る。本明細書において用いられる場合、「組換え抗体」は、本発明のポリペプチド、抗体のポリペプチド鎖又はその抗原結合部分の少なくとも1を含む組換え(例、遺伝学的に操作された)タンパク質を指す。抗体のポリペ
プチド又はその抗原結合部分は、抗体の重鎖、軽鎖、重鎖若しくは軽鎖の可変領域若しくは定常領域、一本鎖可変フラグメント(scFv)、又はFc、Fab若しくはF(ab)2'フラグメント等であり得る。抗体のポリペプチド鎖又はその抗原結合部分は、組換え抗体の別のポリペプチドとして存在し得る。代替的には、抗体のポリペプチド鎖又はその抗原結合部分は、本発明のポリペプチドとインフレームで(タンデムで)で発現されるポリペプチドとして存在し得る。抗体のポリペプチド又はその抗原結合部分は、本明細書に記載された抗体及び抗体フラグメントのいずれかを含む、任意の抗体又は任意の抗体フラグメントのポリペプチドであり得る。
質の機能的変異体が含まれる。本明細書において用いられる場合、用語「機能的変異体」は、機能的変異体が、変異体であるTCR、ポリペプチド又はタンパク質の生物学的活性を
保持している、親TCR、ポリペプチド又はタンパク質に対する実質的又は有意な配列同一
性又は類似性を有するTCR、ポリペプチド又はタンパク質を指す。機能的変異体は、例え
ば、親TCRが抗原特異性を有するか、又は親ポリペプチド若しくはタンパク質が、特異的
に結合する変異KRASに、親TCR、ポリペプチド又はタンパク質と類似する程度、同じ程度
若しくはより高い程度に特異的に結合する能力を保持する、本明細書に記載されたTCR、
ポリペプチド又はタンパク質(親TCR、ポリペプチド又はタンパク質)の変異体を包含す
る。親TCR、ポリペプチド又はタンパク質に準拠して、例えば、機能的変異体は、親TCR、ポリペプチド又はタンパク質のそれぞれに対して、アミノ酸配列で、少なくとも、約30%
、50%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%以上同一であり得る。
学的又は物理的特性を有する別のアミノ酸に置き換えられるアミノ酸置換が挙げられる。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸 (例、Asp又はGlu)に
置換、非極性側鎖を有するアミノ酸を非極性側鎖を有する別のアミノ酸 (例、Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)に置換、塩基性アミノ酸を別の塩基性アミ
ノ酸 (Lys、Arg等)に置換、極性側鎖を有するアミノ酸を極性側鎖を有する別のアミノ酸 (Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)に置換等であり得る。
する親TCR、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。この場合において
は、非保存的アミノ酸置換が、機能的変異体の生物学的活性と干渉しないか又は阻害しないことが好ましい。好ましくは、機能的変異体の生物学的活性が、親TCR、ポリペプチド
又はタンパク質と比較して増加するよう、非保存的アミノ酸置換は機能的変異体の生物学的活性を増大させる。
又はタンパク質は、本明細書に記載された特定のアミノ酸配列又は配列から本質的になり得る。これに関して、例えば、本発明のTCR、ポリペプチド又はタンパク質は、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列
番号57、(1) 配列番号50~51の両方;(2) 配列番号52~53の両方;(3) 配列番号54~55の両方;又は(4) 配列番号56~57の両方のアミノ酸配列から本質的になり得る。また、例えば、本発明のTCR、ポリペプチド又はタンパク質は、配列番号15、配列番号16、配列番号23、配列番号24、配列番号31、配列番号32、配列番号39、配列番号40、(i) 配列番号15~16の両方;(ii) 配列番号23~24の両方;(iii) 配列番号31~32の両方;又は(iv) 配列番
号39~40の両方のアミノ酸配列(複数可)から本質的になり得る。更に、本発明のTCR、
ポリペプチド又はタンパク質は、(a) 配列番号9~14の全て;(b) 配列番号17~22の全て
;(c) 配列番号25~30の全て;又は(d) 配列番号33~38の全てのアミノ酸配列から本質的になり得る。
りに合成アミノ酸を含み得る。そのような合成アミノ酸は、当該技術分野において公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α-アミノ-n-デカン酸、ホモセリン、S-アセチルアミノメチル-システイン、トランス-3-及びトランス-4-ヒドロキシプロリン、4-アミノフェニルアラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-クロロフェニルアラニン、4-カルボキシフェニルアラニン、β-フェニルセリン、β-ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α-ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シ
クロヘキシルグリシン、インドリン-2-カルボン酸、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-
3-カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、N'-ベンジル-N'-メチル-リジン、N',N'-ジベンジルリジン、6-ヒドロキシリシン、オルニチン、α-アミノシクロペ
ンタンカルボン酸、α-アミノシクロヘキサンカルボン酸、α-アミノシクロヘプタンカルボン酸、α-(2-アミノ-2-ノルボルナン)-カルボン酸、α,γ-ジアミノ酪酸、α,β-ジア
ミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン及びα-tert-ブチルグリシンが挙げられる。
ル化、リン酸化、エステル化、N-アシル化、環化、例えばジスルフィド架橋を介したもの、又は酸付加塩への変換、及び/又は任意選択で二量体化若しくは重合化、又はコンジュゲート化し得る。
該技術分野で公知の方法によって得ることができる。また、ポリペプチド及びタンパク質は、標準的な組換え法により本明細書に記載の核酸を用いて、組換えにより作製することができる。例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版)Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(2012)を参照。代替的には、
本明細書に記載のTCR、ポリペプチド及び/又はタンパク質は、例えばSynpep (Dublin, CA)、Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD)及びMultiple Peptide Systems (Sandiego, CA)等の企業によって商業的に合成され得る。これに関して、本発明のTCR、ポ
リペプチド及びタンパク質は、合成、組換え、単離及び/又は精製され得る。
又は変異体のいずれかを含む)、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、宿主細胞集団、又は抗体若しくはその抗原結合部分のいずれかを含む、コンジュゲート、例、バイオコンジュゲートが含まれる。コンジュゲート及びコンジュゲートを合成する方法は、一般的に、当該技術分野において公知である。
ずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本明細書において用いられる場合、「核酸」は「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」を含み、一般にDNA又はRNAのポリマーを意味し、一本鎖又は二本鎖であり得、天然、非天然又は改変されたヌクレオチドを含み得、天然、非天然又は改変されたヌクレオチド間結合、例えば、未修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間にみられるホスホジエステルの代わりに、ホスホロアミデート結合又はホスホロチオエート結合等を含み得る。一実施形態においては、核酸は相補的DNA(cDNA)を含む。核酸が、挿入、欠失、逆位及び/又は置
換も何ら含まないことが一般には好ましい。しかし、本明細書で考察される通り、幾つかの例においては核酸が1以上の挿入、欠失、逆位、及び/又は置換を含むことが、好適であり得る。
る核酸分子に加えることによって、生細胞外で構築される分子、又は(ii)上記(i)に記載
されたものの複製で得られる分子を指す。本明細書の目的のためには、複製はin vitro複製、又はin vivo複製であり得る。
オチド)、を用いて化学的に合成され得る。核酸を生成するために使用し得る修飾ヌクレオチドの例としては、5-フルオロウラシル(fluorouracil)、5-ブロモウラシル(5-bromouracil)、5-クロロウラシル(5-chlorouracil)、5-ヨードウラシウル(5-iodouracil
)、ヒポキサンチン(hypoxanthine)、キサンチン(xanthine)、4-アセチルシトシン(4-acetylcytosine)、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル(5-(carboxyhydroxymethyl)uracil)、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン(5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine)、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル(5-carboxymethylaminomethyluracil)、ジヒドロウラシル(dihydrouracil)、β-D-ガラクトシルキュ
ーオシン(β-D-galactosylqueosine)、イノシン(inosine)、N6-イソペンテニルアデ
ニン(N6-isopentenyladenine)、1-メチルグアニン(1-methylguanine)、1-メチルイノシン(1-methylinosine)、2,2-ジメチルグアニン(2,2-dimethylguanine)、2-メチルアデニン(2-methyladenine)、2-メチルグアニン(2-methylguanine)、3-メチルシトシン(3-methylcytosine)、5-メチルシトシン(5-methylcytosine)、N6-置換アデニン(N6-substituted adenine)、7-メチルグアニン(7-methylguanine)、5-メチルアミノメチルウラシル(5-methylaminomethyluracil)、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル(5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil)、β-D-マンノシルキューオシン(β-D-mannosylqueosine)、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル(5'-methoxycarboxymethyluracil)、5-メトキシウラシル(5-methoxyuracil)、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン(2-methylthio-N6-isopentenyladenine)、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)(uracil-5-oxyacetic
acid (v))、ワイブトキソシン(wybutoxosine)、シュードウラシル(pseudouracil)
、キューオシン(queosine)、2-チオシトシン(2-thiocytosine)、5-メチル-2-チオウラシル(5-methyl-2-thiouracil)、2-チオウラシル(2-thiouracil)、4-チオウラシル
(4-thiouracil)、5-メチルウラシル(5-methyluracil)、ウラシル-5-オキシ酢酸メチ
ルエステル(uracil-5-oxyacetic acid methylester)、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシ
プロピル)ウラシル(3-(3-amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil)及び2,6-ジアミノプリン(2,6-diaminopurine)が挙げられるが、これらに限定されない。代替的には、本発明の
核酸の1以上は、例えばMacromolecular Resources (Fort Collins, CO)及びSynthegen (Houston, TX)等の企業から購入することができる。
する、任意のヌクレオチド配列を含み得る。本発明の一実施形態においては、核酸は、配列番号63~70のいずれか1つのヌクレオチド配列を含み得る(表1)。本発明の一実施形
態においては、核酸は配列番号63~64の両方、配列番号65~66の両方、配列番号67~68の両方又は配列番号69~70の両方のヌクレオチド配列を含む。
はタンパク質のいずれかをコードする、コドンを最適化したヌクレオチド配列を含む。如何なる特定の理論又は機構にも拘束されることはないが、ヌクレオチド配列のコドンの最適化は、mRNA転写産物の翻訳効率を上昇させると考えられる。ヌクレオチド配列のコドンの最適化は、ネイティブのコドンを、同じアミノ酸をコードするが、細胞内でより容易に利用できるtRNAによって翻訳され得る、別のコドンに置換することを含み得、従って、翻訳効率が上昇する。ヌクレオチド配列の最適化はまた、翻訳に干渉するmRNAの二次構造を減少させ得、従って、翻訳効率が上昇する。
補的な配列を有するポリヌクレオチド又は散在する僅かなミスマッチを含有するに過ぎないポリヌクレオチドを区別する条件が含まれる。そのような相補性の小領域は、14~17塩基又はそれ超の完全長の相補体よりも容易に融解し、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションによりそれらが容易に区別され得る。比較的高ストリンジェンシーの条件には、例えば約50~70℃の温度で、約0.02~0.1MのNaCl又はそれと同等なものによって提供される等の、低塩条件及び/又は高温条件が含まれる。そのような高ストリンジェンシー条
件は、ヌクレオチド配列と鋳型又は標的鎖との間のミスマッチがあれば、ほとんど許容せず、本発明のいずれかのTCRの発現を検出するのに特に好適である。ホルムアミド添加量
を増加することによって、条件をよりストリンジェントにし得ることは一般的に理解されている。
くは発現、又はその両方のために設計されたものが挙げられる。ベクターは、pUCシリー
ズ(Fermentas Life Sciences)、pBluescriptシリーズ(Stratagene, LaJolla, CA)、pETシリーズ(Novagen, Madison, WI)、pGEXシリーズ(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)及びpEXシリーズ(Clontech, Palo Alto, CA)からなる群から選択され得る。バクテリオファージベクター、例えばλGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4及びλNM1149等もまた使用され得る。植物発現ベクターの例としては、pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121及びpBIN19(Clontech)が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、pEUK-C1、pMAM及びpMAMneo(Clontech)が挙げられる。好ましくは、組換え発現ベクター
はウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターである。特に好ましい実施形態においては、組換え発現ベクターはMSGV1ベクターである。
ストラクトは、原核又は真核宿主細胞内で機能的である複製システムを含有するよう調製され得る。複製システムは、例、ColE1、2μプラスミド、λ、SV40、ウシパピローマウイルス等に由来し得る。
スであるかを考慮して、ベクターが導入される宿主細胞の型(例、細菌、真菌、植物又は動物)に特異的な、例えば転写の、並びに翻訳の開始及び終止コドン等の、制御配列を含む。
チド配列、又はTCR、ポリペプチド若しくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列に
相補的であるか若しくはハイブリダイズするヌクレオチド配列、に作動可能に連結した、ネイティブ又は非ネイティブのプロモーターを含み得る。プロモーターの選択、例、強、弱、誘導性、組織特異性及び発生段階特異性は、当業者の通常の技術の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターとを組み合わせることも当業者の技術の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーター又はウイルスプロモーター、例、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター、及びマウス幹細胞ウイルスの長い末端反復に見出されるプロモーターであり得る。
シドホスホリラーゼ、ニトロレダクターゼ及び誘導性カスパーゼ9遺伝子系が挙げられる
。
卵巣細胞、サルVERO細胞、COS細胞、HEK293細胞等が挙げられる。組換え発現ベクターを
増幅又は複製する目的のために、宿主細胞は好ましくは原核細胞、例、DH5α細胞である
。組換えTCR、ポリペプチド又はタンパク質を産生する目的のために、宿主細胞は好まし
くは哺乳動物細胞である。最も好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。宿主細胞は任意の細胞型であり得、任意の型の組織に由来し得、任意の発生段階であり得る一方、宿主細胞は好ましくは末梢血リンパ球(PBL)又は末梢血単核細胞(PBMC)である。より好まし
くは、宿主細胞はT細胞である。
株由来のT細胞、例、Jurkat, SupT1等、又は哺乳動物から得られたT細胞等の任意のT細胞であり得る。哺乳動物から得られた場合、T細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺又は他
の組織若しくは体液を含むが、これらに限定されない多数の供給源から得ることができる。T細胞はまた濃縮又は精製し得る。好ましくは、T細胞はヒトT細胞である。T細胞は、CD4+/CD8+二重陽性T細胞、CD4+ヘルパーT細胞、例、Th1及びTh2細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞(例、細胞傷害性T細胞)、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、記憶T細胞(例、中央記憶T細胞及びエフェクター記憶T細胞)、ナイーブT細胞等を含むが、これらに限定されない
、任意の型のT細胞であり得、任意の発生段階のT細胞であり得る。
る。細胞集団は、少なくとも1の他の細胞、例、組換え発現ベクターのいずれも含まない
宿主細胞(例えば、T細胞)、又はT細胞以外の細胞、例、B細胞、マクロファージ、好中
球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等に加え、記載された組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む、不均一な集団であり得る。代替的には、細胞集団は、集団が組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む(例、本質的にそれからなる)、実質的に均質な集団であり得る。集団はまた、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含むような、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンである、細胞のクローン集団であり得る。本発明の一実施形態においては、細胞集団は、本明細書に記載された組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
幅は、例えば米国特許第8,034,334号;米国特許第8,383,099号;米国特許出願公開番号第2012/0244133号;Dudleyら、J. Immunother., 26:332-42 (2003);及びRiddellら、J. Immunol. Methods, 128:189-201 (1990)に記載のように、当該技術分野において公知である多くの方法のいずれかによって達成され得る。一実施形態においては、T細胞数の増幅は
、T細胞をOKT3抗体、IL-2及びフィーダーPBMC(例、放射線照射した同種異系PBMC)と共
に培養することによって実施される。
その集団を含む)は、単離及び/又は精製し得る。本明細書において用いられる場合、用語「単離した」は天然環境から取り出されていることを意味する。本明細書において用いられる場合、用語「精製した」は純度において上昇していることを意味し、「純度」は相対的な用語であり、絶対の純度として解釈される必要がない。例えば、純度は少なくとも約50%以上であり得、60%、70%、80%、90%、95%超であり得、又は約100%であり得
る。
その集団を含む)(以降、これらは全て「本発明のTCR材料」として総称的に言及される
)は、例えば医薬組成物等の組成物に製剤化し得る。これに関して、本発明は、本明細書に記載されたTCR、ポリペプチド、タンパク質、核酸、発現ベクター及び宿主細胞(その
集団を含む)のいずれか、並びに医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明のTCR材料のいずれかを含有する本発明の医薬組成物は、1超の本発明のTCR材料、
例、ポリペプチド及び核酸、又は2以上の異なるTCRを含み得る。代替的には、医薬組成物は、例えば、化学療法剤、例、アスパラギナーゼ(asparaginase)、ブスルファン(busulfan)、カルボプラチン(carboplatin)、シスプラチン(cisplatin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、ドキソルビシン(doxorubicin)、フルオロウラシル(fluorouracil
)、ゲムシタビン(gemcitabine)、ヒドロキシウレア(hydroxyurea)、メトトレキセート(methotrexate)、パクリタキセル(paclitaxel)、リツキシマブ(rituximab)、ビ
ンブラスチン(vinblastine)、ビンクリスチン(vincristine)等の、別の医薬的な活性
剤(複数可)又は薬剤(複数可)と組み合わせた本発明のTCR材料を含み得る。
与できる組成物を調製する方法は、当業者に公知又は明らかであり、例えば、Remington
:The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed., Pharmaceutical Press (2012)に
おいてより詳細に記載されている。医薬的に許容される担体は、使用条件下で有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。
される担体は、例えば、例、通常の生理食塩水(水に溶解中、約0.90%w/vのNaCl、水中
約300 mOsm/LのNaCl、又は水1L当たり約9.0gのNaCl)、NORMOSOL R電解質溶液(Abbott, Chicago, IL)、PLASMA-LYTE A(Baxter, Deerfield, IL)、水中約5%のデキストロース又はリンゲル乳酸塩等の任意の等張な担体を含んでもよい。一実施形態においては、医薬的に許容される担体に、ヒト血清アルブミンが補充される。
物内で治療又は予防応答するために十分でなければならない。例えば、本発明のTCR材料
の用量は、がん抗原(例、変異KRAS)に結合するのに十分でなければならず、又は投与時から約2時間以上、例、12~24時間若しくはそれ超の期間内にがんを検出、治療若しくは予防するのに十分でなければならない。ある実施形態においては、期間はさらに長くなる可能性がある。用量は、特定の本発明のTCR材料の有効性及び動物(例、ヒト)の状態、
並びに治療される動物(例、ヒト)の体重によって決定される。
る哺乳動物の1セットのうち、一匹の哺乳動物にそのようなT細胞を所与の用量で投与し
た際に、本発明のTCR、ポリペプチド又はタンパク質を発現するT細胞によって分泌されるIFN-γの程度を比較することを含むアッセイ法を、哺乳動物に投与する初期用量を決定するために使用し得る。ある用量の投与の際に標的細胞が溶解される又はIFN-γが分泌される程度は、当該技術分野で公知の方法によってアッセイされ得る。
れているがんの重篤度等の様々な要因を考慮に入れて、個々の患者を治療する本発明のTCR材料の投薬量を決定する。本発明のTCR材料が細胞集団である実施形態においては、1回の注入当たりに投与される細胞数は、例、約1×106~約1×1012細胞、又はそれ超で変化
し得る。ある実施形態においては、1×106未満の細胞が投与され得る。
う、本発明のTCR材料(inventive TCR materials of the invention)を任意の数の方法
で改変し得ることを容易に理解する。例えば、本発明のTCR材料は、化学療法剤に対する
架橋によって直接的又は間接的のいずれかで結合され得る。化合物を化学療法剤に結合させる実務は当該技術分野において公知である。当業者であれば、本発明のTCR材料へ結合
時に、架橋及び/又は化学療法剤が、本発明のTCR材料の機能、即ち、変異KRASに結合す
る、又はがんを検出、治療若しくは予防する能力と干渉しないという条件で、本発明のTCR材料の機能のために必要でない本発明のTCR材料の部位が、架橋及び/又は化学療法剤を結合させるための理想的な部位であることを認識する。
宿主細胞及び細胞集団は、がんを治療又は予防する方法において使用され得ると期待される。特定の理論に拘束されることはないが、本発明のTCRは、TCR(又は関連する本発明のポリペプチド若しくはタンパク質)が、細胞によって発現される場合、変異KRASを発現する標的細胞に対する免疫応答を媒介することができるよう、変異KRASに対して特異的に結合すると考えられる。これに関して、本発明は、哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法を提供するものであって、哺乳動物のがんを治療又は予防するための有効量で、本明細書に記載された医薬組成物、TCR、ポリペプチド若しくはタンパク質のいずれか、本
明細書に記載されたTCR、ポリペプチド、タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチ
ド配列を含む任意の核酸若しくは組換え発現ベクター、又は本明細書に記載されたTCR、
ポリペプチド若しくはタンパク質のいずれかをコードする組換えベクターを含む任意の宿主細胞若しくは細胞集団を哺乳動物に投与すること含む。
本明細書に記載されたTCR、ポリペプチド、タンパク質のいずれかをコードするヌクレオ
チド配列を含む任意の核酸若しくは組換え発現ベクター、又は本明細書に記載されたTCR
、ポリペプチド若しくはタンパク質のいずれかをコードする組換えベクターを含む任意の宿主細胞若しくは細胞集団を提供する。
在的な利益又は治療効果を有すると認識する、治療又は予防の様々な程度がある。これに関して、本発明の方法は、哺乳動物における、任意の量又は任意のレベル(any amount of any level)のがんの治療又は予防を提供し得る。更には、本発明の方法によって提供
される治療又は予防は、治療又は予防されている、がんの1以上の状態又は症状の治療又は予防を含み得る。例えば、治療又は予防は、腫瘍の退縮を促進することを含み得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、がん、又はその症状若しくは状態の発症を遅延させることを含み得る。代替的に又は追加的に、「予防」は、がん、又はその症状若しくは状態の再発を予防又は遅延させることを包含し得る。
細書に記載された本発明のTCR、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター
、宿主細胞、細胞集団又は医薬組成物のいずれかと、哺乳動物由来の1以上の細胞を含む試料とを接触させること、それにより複合体を形成し、該複合体を検出することを含み、該複合体の検出が哺乳動物におけるがんの存在を示す。
現ベクター、宿主細胞又は細胞集団は、検出可能な標識、例えば、例、放射性同位体、フルオロフォア(例、フルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)、フィコエリトリン(PE))、酵素(例、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ)及び元素粒子(例、金粒子)等で標識され得る。
、肺がんは肺腺がんであり、卵巣がんは上皮卵巣がんであり、膵臓がんは膵臓腺がんである。別の好ましい実施形態においては、がんは、G12D変異を有する変異KRASアミノ酸配列を発現するがんである。
QIAGEN AllPrep DNA/RNAキット (Qiagen, Venlo, Netherlands)を使用して、製造業者
の提案に従って、ゲノムDNA (gDNA)及び全RNAを様々な腫瘍及びマッチした通常のアフェ
レーシス試料から精製した。1個の試料(Tu-Pri)をホルマリン固定し、パラフィン包埋
し(FFPE)、Covaris truXTRACTMFFPE DNAキットを使用して、製造業者(Covaris, Woburn, MA)の指示通りにgDNAを抽出した。ペアエンドライブラリー用のAgilent Technologies SureSelectXTターゲットエンリッチメントシステムを、Human All Exon V6 RNAベイト (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)と組合せて使用し、全エクソームライブラ
リー構築物及び約20,000個のコード遺伝子のエキソンキャプチャを調製した。その後、NEXTSEQ 500卓上シーケンサー(Illumina, San Diego, CA, USA)で、全エクソームシーケ
ンシング(WES)ライブラリーをシーケンスした。製造業者のプロトコールに従って、新鮮な腫瘍組織試料由来の3 μgのgDNA及びFFPE腫瘍試料由来の200 ngのgDNAを使用して
、ライブラリーを調製した。Illumina高出力フローセルキット (300サイクル)により、最初は試薬/フローセルキットのv1を使用して、ペアエンドシーケンシングを行い、試薬/フローセルキットのv2において、同じライブラリー調製物のその後の実行を続けた。Illumina TruSeq RNA鎖ライブラリー調製キットを使用して、製造業者のプロトコールに従って
、2 μgの全RNAを用いてRNA-seqライブラリーを調製した。NextSeq 500卓上シーケンサー(Illumina, San Diego, CA, USA)において、RNA-seqライブラリーをペアエンドシーケン
シングした。
WESについては、Novocraft (Selangor, Malaysia) (novocraft.com/)のnovoalignMPIプログラムを使用して、ヒトゲノムビルドhg19に対するアラインメントを行った。ピカードMARKDUPLICATESツールを使用して重複をマークした。GATKベストプラクティス・ワークフロー(broadinstitute.org/gatk/)に従って、挿入/欠失リアラインメント及びベースリキャリブレーションを行った。データのクリーンアップ後、samtoolsユーティリティ(samtools.sourceforge.net)を使用して、パイルアップファイルを生成し、以下の基準:10以上の腫瘍及び正常のリード数、10%以上のバリアントアレル頻度及び4以上の腫瘍バリアントリードを使用して、体細胞のバリアントをコールするために、Varscan2プラットフォーム独立変異コーラー (varscan.sourceforge.net)を使用した。次いで、Annovarソフトウェ
アツール (annovar.openbioinformatics.org)を使用して、これらのバリアントについて
アノテーションした。
グした。その後、GATKツールボックスを使用して、挿入/欠失リアラインメント及びベースリキャリブレーションを行った。最終的に再調整したbamファイル及びsamtools mpileupツールを使用して、パイルアップファイルを作成した。最後に、VARSCAN2プラットフォ
ーム独立変異コーラーを使用して、バリアントをコールした。
なクローン集団に代表される可能性がある変異に焦点を当てるために、2つ以上の腫瘍試
料中での検出に基づいて、61変異を更なる分析のために選択した。これらの61変異のうちの1つがKRASである (表2)。これらには、最小の1つのWES及び1つのRNA-seqライブラリー
で特定された29変異、並びに2つ以上の転移性病変に由来するWESライブラリーにおいて特定された32変異が含まれていた。
Tranら、Science, 350:1387-90 (2015)に記載の通り、TIL、注入TIL及び樹状細胞を生成した。簡易には、TILを生成するために、手術で切除した腫瘍を、約1~2 mmのサイズの24個の断片にカットし、各断片を、高用量のIL-2 (6000 IU/ml、Chiron, Emeryville, CA)を含む、2mlの完全培地(CM)を含む、24ウェルプレートのウェルに別々に置いた。CMは、10%ヒト血清(内製)、2 mM L-グルタミン、25 mM HEPES及び10 μg/ml ゲンタマイシ
ンを補充した、RPMI培地を含んでいた。TILの断片培養物6番を治療のために選択し、5%ヒトAB血清、3000 IU/mlのIL-2及び30 ng/mlのOKT3抗体 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)を補充した、400mlの50/50培地中において、放射線照射したPBMCを1:100の比で使用して、ガス透過性G-REX100フラスコ中で、急速増幅過程を行った。50/50培地
は、CMとAIM-V培地の1:1の混合液を含んでいた。全細胞を、5% CO2、37℃で培養した。
用いて7.5-10e6細胞/mlに設定し、次いで組織培養フラスコ (162 cm2の表面積)中におい
て約1e6細胞/cm2でインキュベートし、5% CO2、37℃でインキュベートした。90分 (min)
後、非接着細胞を回収し、フラスコ中でAIM-V培地を用いて非接着細胞を激しく洗浄し、
次いで60分間、AIM-V培地を用いて更にインキュベートした。培地及び非接着細胞を除去
し、次いでフラスコ中でAIM-V培地を用いて接着細胞を再度、激しく洗浄し、次いでDC培
地を用いてインキュベートした。DC培地は、5%ヒト血清、100 U/mlペニシリン及び100 μg/mlストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、800 IU/ml GM-CSF(Leukine (サルグラモスティム(sargramostim)))及び200 U/ml IL-4 (Peprotech, Rocky Hill, NJ)を含むRPMIを含んでいた。2~3日目に、新鮮なDC培地を培養液に添加した。培養開始後、4又は5日目に、DCを凍結保存した。培養開始後、4日目と6日目の間に、実験においてDCを使用した。
詳細な方法は、Tranら、Science, 350:1387-90 (2015)に記載されている。簡易には、全エクソーム及びトランスクリプトームシーケンシングによって、61変異を特定した。これらの61変異のうちの1つがKRASであった (表2)。各変異について、親タンパク質のいず
れの側においても12アミノ酸が隣接する、変異をコードするミニ遺伝子を生成し、タンデムに合成し、タンデムミニ遺伝子 (TMG)コンストラクトを作製した。61変異をコードする5つのTMG (TMG1~5)を作製し、in vitroにおいてRNAに転写し、患者自身のHLA-I及びHLA-II分子との関連で(表4)、全ての変異をプロセッシングし、提示することを可能にした
、自己抗原提示DC中にエレクトロポレーションした。野生型及び変異KRASについてのTMG
を表3に示す。表4に示したHLAデータは、Baiら、BMC Genomics, 15:325 (2014)に記載の
通り、アルゴリズムPHLATを使用して、次世代シーケンシングデータから決定した。次い
で、患者由来の24個の個別のTIL培養物を、これらのTMG発現DCと共に共培養し、IFN-γ酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイ (図1A)、並びにT細胞活性化マーカーの4-1BB及びOX40のフローサイトメトリー分析によって、T細胞反応性を決定した。TMG-1に対して反応性であった複数のTIL培養物を特定した。TMG-1中のどの変異抗原がTIL培養物6番によって認識されているかを特定するために、TMG-1中にコードされたペプチドを合成し (ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)及びGenScript Inc. (Piscataway Township, NJ))、次
いで、DCに対して、終夜個別にパルスし、TIL培養物6番と共に共培養を続けた (図1B)。
号7);変異した (G12D)-9-mer:GADGVGKSA (配列番号8);WT-10-mer:GAGGVGKSAL (配列
番号5);G12D-10-mer:GADGVGKSAL (配列番号6)を、ペプチド力価実験において使用した
。
て、製造業者の指示に従って、細胞を処理した。FACSCantoIIフローサイトメーター上で
細胞を取得し、FlowJoソフトウェア (TreeStar Inc., Ashland, OR)を使用してデータを
分析した。Booleanゲート分析を使用して、表示された数のエフェクター機能 (サイトカ
イン及び脱顆粒マーカー)を発現している細胞のパーセンテージを決定した。
様々な方法を使用して、4個のKRASG12D反応性TCRを特定した。急速増幅に先立って、注入バッグ中のドミナントなTRBV5-6 (Vβ5.2)クローンを、TILの断片培養物6番から単離した。簡易には、抗Vβ5.2-PE (フィコエリトリン)抗体 (Beckman Coulter, Schaumburg, IL)を用いて、TIL培養物6番を染色し、磁性マイクロビーズにコンジュゲートした抗PE特異的抗体を使用して、製造業者 (Miltenyi Biotec)の指示通りに、Vβ5.2+細胞を濃縮した
。Vβ5.2+ T細胞から全RNAを単離し (RNeasy Miniキット、Qiagen)、製造業者の指示通
りに、TCR-アルファ鎖及びベータ鎖の定常プライマーを使用して、5’RACEを行った (SMARTER RACE cDNA amplificationキット、Clontech)。アルファ鎖及びベータ鎖の定常プラ
イマーの配列は、以下:TCR-アルファ、5’ -GCC ACA GCA CTG TTG CTC TTG AAG TCC-3’
(配列番号59);TCR-ベータ、5’ -CAG GCA GTA TCT GGA GTC ATT GAG-3 (配列番号60)であった。PCRのために、伸長時間に変更を加えて(3分の代わりに2分)、キットのプログ
ラム1を使用した。次いで、TCRのPCR産物は、標準的なアガロースゲル電気泳動及びゲル
抽出(zymogen)によって単離し、次いで産物をシーケンシングした (Macrogen, Seoul, Korea)。
長いKRASG12Dペプチドで終夜、パルスしたDCを用いて、細胞移入後40日のアフェレーシス試料を最初に刺激することによって単離した。次いで、終夜の刺激後、T細胞活性化マー
カーの4-1BBが上方制御されたVβ5.2陽性及び陰性のCD8+ T細胞を、FACSにより別々に選
別した。上記の通り、5’RACEを行うのに先立って、Vβ5.2+細胞を更に増幅させ、その後にTCRのPCR産物のTOPO-TAクローニング、及び個々のコロニーのシーケンシングを続け、TCR-アルファ鎖及びベータ鎖を特定した。Pasettoら、Cancer Immunol. Res., (2016)に記載の通り、Vβ5.2陰性細胞で単一細胞のTCRのマルチプレックスPCRを行い、TCR-アルファ鎖及びベータ鎖を特定した。
単一細胞技術アプローチを使用して、異なるTIL断片 (TIL断片5番)から特定した。簡易には、TIL培養物5番を、TMG-1 (KRASG12Dをコードする)を用いてトランスフェクトしたDCと共に共培養し、4時間(h)後、TILを回収し、Fluidigm C1システム (Fluidigm, San Francisco, CA)に供し、製造業者のプロトコールに従って、単一細胞のRNA-seq試料を調製し
た。次いで、Illumina MiSeqシステムにより、単一細胞のRNA-seq試料をシーケンシング
し、社内のバイオインフォマティクスプログラムによりデータを分析した。刺激によってIFN-γ転写産物の上方制御を示した試料から、TCR-アルファ及びベータ配列を抽出した。
試料中におけるKRASG12D反応性T細胞の頻度を決定するために、KRASG12D反応性T細胞クローンのTCR配列を最初に特定し、これらの配列を、表示された試料由来のTCR-Vβディープシーケンシングデータに対してインターロゲートした(interrogated)。試料中のインフレームの実益性のある (productive)TCRのリード数は、522,499~1,990,345の範囲であった。
以下の抗ヒトフローサイトメトリー抗体:CD3-AF700 (クローン:UCHT1, BioLegend)、CD8-PE-Cy7 (クローン:SK1, BD Biosciences)、CD4-APC-Cy7 (クローン:SK3, BioLegend)、OX40-FITC (クローン:Ber-ACT35, BD Biosciences)、4-1BB-APC (クローン:4B4-1,
BioLegend)及びVβ5.2-PE (Beckman Coulter)を本報告において使用した。蛍光色素をコンジュゲートした抗マウスTCR-ベータの定常領域抗体 (H57-597, eBioscience)を使用し
、TCRの形質導入効率を評価した。IO Test beta Mark TCR Vキットを使用し、TCR-Vβの
レパートリーを評価した(Beckman Coulter)。
既に記載された方法(Luら、Clin. Cancer Res., 20:3401-10 (2014);Tranら、Science, 344:641-5 (2014);Tranら、Science, 350:1387-90 (2015))を使用して、患者4095に由来するTILが、彼女の転移性肺腫瘍が発現していた体細胞変異を認識できるかどうかをテストした。TIL培養物6番は、最も高い頻度でKRASG12D反応性CD8+ T細胞を含んでおり
、従って、Tranら、Science, 344:641-5 (2014)に記載の通り、細胞注入に先立って、2
週間の急速増幅過程を行った。
患者の注入産物、処置前の3つの別々の肺結節、進行性病変 (病変3)、並びに細胞注入
前及び後の様々な時点の末梢血から単離したgDNAにおいてT細胞レセプター (TCR)ディー
プシーケンシングを行い (Adaptive Biotechnologies, Seattle WA)、KRASG12D反応性TCR配列の頻度をインターロゲートした。
4つのKRASG12D反応性TCRを特定し、TCR-アルファ鎖及びベータ鎖配列を合成し、次いでMSGV1 レトロウイルスベクター (GenScript Inc.)にクローニングした。Tranら、Science, 344:641-5 (2014)に記載の通り、TCRをコードするレトロウイルス上清を生成し、自己末梢血T細胞を形質導入するために使用した。次いで、TCRを形質導入したT細胞を、様々
なKRASペプチドの段階希釈した用量をロードした自己末梢血単核細胞 (PBMC)、又は拘束
性のHLA-C*08:02アレルを安定して発現しているか若しくは発現していないKRASG12D陽性
膵臓がん細胞株と共に共培養した(Tranら、Science, 350:1387-90 (2015))。IFN-γELISPOTアッセイ、並びにT細胞活性化マーカーの4-1BB及びOX40のフローサイトメトリー分
析 (Tranら、Science, 350:1387-90 (2015))により、T細胞の反応性を翌日に決定した。
本実施例は、KRASG12D変異反応性 CD8+ T細胞のin vivoでの頻度を実証する。
患者は、49歳の女性であり、結腸直腸腺がん及び多発両側肺転移を有していた。既に彼女は、S状結腸切除術及び部分膀胱摘出後に、12サイクルのFOLFOX化学療法を受けており
、それに続き膀胱の縫合ラインに対する4182 cGyの放射線照射が行われた。この直後に、彼女にFDGが集中した両側肺結節の数及びサイズの増大が起きた。右下葉結節の生検は転
移性の結腸直腸腺がんと一致していた。
て切除し、複数の腫瘍断片から24個の個別のTIL培養物を生成した。腫瘍が発現している
変異を特定するために、3病変では、また、全エクソーム及びトランスクリプトームシー
ケンシングを行った(表2)。各TIL培養物を、これらの変異に対する反応性について評価した。患者のTILは、KRASG12D変異を特異的に認識するCD8+ T細胞を含むことが見い出され
た(図1A及びB)。KRASG12D反応性CD8+ T細胞の頻度が最も高かったTIL培養物を選択した。選択した細胞の数を治療のために増幅した (図1B及びC)。細胞注入に先立って、患者には、2日間の60 mg/kgのシクロフォスファミド、続けて、5日間の25 mg/m2のフルダラビンを含む、骨髄非破壊的なリンパ枯渇化学療法レジメン (Dudleyら、J. Clin. Oncol., 23
:2346-57 (2005))を行った。患者に、1.48×1011 TILの単回注入を行い、続けて、720,000 IU/kgのインターロイキン2(IL-2)の5回投与を行い、疲労のために中止していた。該治療に良く耐え、患者は、細胞注入の2週間後に帰宅した。注入産物の約75%は、KRASG12D変異を特異的に認識するCD8+ T細胞を含み、これらのT細胞の大部分は、複数のエフェク
ターサイトカイン (IFN-γ、TNF及びIL-2)を産生し、細胞溶解の潜在性を示した。7つの
転移性肺病変の全てが、細胞移入後の最初の40日の追跡調査において退縮し、1つの病変
(病変3)が治療の約9カ月後に進行するまで、6/7の病変は退縮を続けたか又は完全な反
応を続けた。細胞移入の約9カ月後、唯一の進行性病変 (病変3)、並びにPET陰性で、病理学分析において生きている腫瘍細胞がなく完全に壊死していた反応性の病変(病変2)を
切除するために、左下肺のVATS切除を行った。患者は、肺の切除後3カ月、臨床的な疾患
がないままである。
でいた。注入バッグの49.5%、19.1%及び6.9%を構成する、注入産物中の最も高い頻度の3
つのTCRは、KRASG12Dに対して反応性である一方で、4番目のKRASG12D反応性TCRは、45番
目の頻度であり、注入バッグの0.04%しか存在しなかった(図2A~2D及び表5)。これらのKRASG12D反応性TCRは、注入の1週間前の患者の末梢血においては、検出されなかった(頻度<0.0002%、図2A~2D)。細胞移入後、KRASG12D反応性TCRの生着において劇的な相違が観察された。注入されたT細胞の最もドミナントなクローン型 (~7.3×1010細胞)は、細
胞移入の40日後の血中において検出されなかった一方で、残りのKRASG12D反応性T細胞ク
ローンはこの時点で検出された (図2A~2D)。末梢血中に残っていたKRASG12D反応性T細胞クローンは、細胞移入の後約9カ月で、末梢血T細胞全体の10.4%、4.5%及び0.005%であり
、その時に末梢血中で最もドミナントであったT細胞クローンはTRBV10-02変異KRASG12D反応性TCRであった (図2A~2D及び表5)。末梢血と比べて進行している腫瘍中では、KRASG12D反応性T細胞クローンの濃縮は起こらないようであった (図2A~2D)。
本実施例は、KRASG12D反応性TCRの特異性及び感受性を実証する。
TCRをコードするヌクレオチド配列を、実施例1のKRASG12D反応性T細胞の4つのクローン型の各々からクローニングした。各TCRを、MSGV1-レトロウイルスベクターにクローニン
グした。4つの各々のTCRのアルファ鎖及びベータ鎖のアミノ酸配列を表6に示す。
リンカー配列 (配列番号58)、並びにTCR ベータ鎖の可変領域(表6に示す)及びマウスTCRベータ鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列が続いていた。TCRは、アルファ鎖のマウス定常領域のTM領域において、3アミノ酸の、疎水性アミノ酸との置換(複数可)と
組合わせて、α鎖及びβ鎖の両方のマウス定常領域におけるシステイン置換を含むよう更に改変した。4つのTCRの各々の完全長アミノ酸配列を表7に示す。特定の理論又は機構に
拘束されることはないが、TCRアルファ及びベータのマウス定常鎖は、内在的なTCRとのミスペアリングが減殺され得、導入されたTCRの宿主細胞による発現を促進し得ると考えら
れる。また、導入されたTCRアルファ鎖及びベータ鎖の促進された発現及びペアリングは
、TCRアルファの定常鎖に疎水性アミノ酸を組み込むこと、並びにアルファ鎖及びベータ
鎖の定常領域の間に二番目のジスルフィド結合を導入することにより達成し得ると考えられる。
たTCRの細胞表面での発現を、マウスTCR-βの定常領域 (mTCR-β)についてのフローサイ
トメトリー分析により、TCR遺伝子を改変した10日後に評価した。ベクター導入細胞を陰
性対照とした。データは、CD8+ T細胞上でゲートした(are gated were gated)。マウスTCR-β定常領域を発現している細胞のパーセンテージを表8に示す。
マーカーの4-1BBを発現している細胞のパーセンテージを測定した。結果を図3A~3Dに示
す。4つのTCRのうちの3つは、9アミノ酸長のKRASG12Dペプチド
してパルスした場合、TCRは1~10 nMの間の濃度でペプチドを認識することができること
が実証された (図3A~3D)。
レルの両方を発現していた場合にのみ、TCRは膵臓がん細胞株を特異的に認識した (図4A
~4B)。
本実施例は、TRAV12-2/TRBV10-2 TCR (配列番号56及び57)を発現するよう形質導入した細胞は、HLAアレル C*08:02又はC*05:01の関連で、変異KRASを認識することを実証する。
実施例2に記載の通り、4つのTCRのうちの1つを発現させるために、自己末梢血T細胞を
遺伝的に改変した。COS7細胞は、完全長の野生型 (wt)KRAS又はKRAS-G12D遺伝子、及びHLAアレルC*07:01、C*08:02又はC*05:01を用いて共トランスフェクションし、その後、表示されたKRASG12D反応性TCR導入細胞と共に共培養を続けた。その次の日、フローサイトメ
トリーにより、4-1BBの発現について細胞を分析した。結果は、図5A~5Dに示されている
。データは、TCRを形質導入した (マウスTCRβ+) CD8+ T細胞でゲートした。HLA-C*07:01を陰性対照のHLAアレルとした。
「an」及び「the」及び「少なくとも1つ」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、単数及び複数形の両方を含むものとして解釈されるべきである。1以上の項目の列記が続く、用語「少なくとも
1つ」の使用(例えば、「A及びBの少なくとも1つ」)は、本明細書に別段の記載がない
限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、列記された項目から選択された1つの項目(A又はB)、又は列記された項目の2以上の任意の組合せ(A及びB)を意味するものと
して解釈されるべきである。「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」及び「含有する(containing)」という用語は、別段の記載がない限り、
制限のない用語(open-ended terms)(即ち、「含むが、これに限定されない(including, but not limited to)」を意味する)として解釈されるべきである。本明細書中の値
の範囲の列挙は、本明細書中に別段の指示がない限り、単に範囲内の各別個の値を個別に指す簡略方法として役立つことを意図しており、本明細書において個々の値はそれぞれ個別に列挙されているかのように、個々の値は明細書に取り込まれる。本明細書中に記載された全ての方法は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は特に文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施し得る。本明細書で提供される任意の及び全ての例、又は例示的な言語(例えば「など(such as)」)の使用は、単に本発明をよりよ
く説明することを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠であるとして、特許請求されていない任意の要素を示すものと解釈されるべきではない。
Claims (21)
- 単離又は精製されたTCRであって、以下:
(a) 配列番号9~14;
(b) 配列番号17~22;
(c) 配列番号25~30;又は
(d) 配列番号33~38
のアミノ酸配列を含む、TCR。 - 以下:
(i) 配列番号15~16;
(ii) 配列番号23~24;
(iii) 配列番号31~32;又は
(iv) 配列番号39~40
のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離又は精製されたTCR。 - 以下:
(A)配列番号46のアミノ酸配列であって:
(i)配列番号46の48位のXがThr又はCysであり;
(ii)配列番号46の112位のXがSer、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpであり;
(iii)配列番号46の114位のXがMet、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe又はTrpであり;及び
(iv)配列番号46の115位のXがGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpである配列;
並びに
(B)配列番号47のアミノ酸配列であって、配列番号47の57位のXがSer又はCysである配列
を更に含む、請求項1又は2に記載の単離又は精製されたTCR。 - 以下:
(1) 配列番号50~51;
(2) 配列番号52~53;
(3) 配列番号54~55;又は
(4) 配列番号56~57
のアミノ酸配列を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の単離又は精製されたTCR。 - 単離又は精製されたポリペプチドであって、以下:
(a)配列番号9~14;
(b)配列番号17~22;
(c)配列番号25~30;又は
(d)配列番号33~38
のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。 - 以下:
(i)配列番号15~16;
(ii)配列番号23~24;
(iii)配列番号31~32;又は
(iv)配列番号39~40
のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の単離又は精製されたポリペプチド。 - 以下:
(A)配列番号46のアミノ酸配列であって:
(i)配列番号46の48位のXがThr又はCysであり;
(ii)配列番号46の112位のXがSer、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpであり;
(iii)配列番号46の114位のXがMet、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe又はTrpであり;及び
(iv)配列番号46の115位のXがGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpである配列;
並びに
(B)配列番号47のアミノ酸配列であって、配列番号47の57位のXがSer又はCysである配列
を更に含む、請求項5又は6に記載の単離又は精製されたポリペプチド。 - 以下:
(1)配列番号50~51;
(2)配列番号52~53;
(3)配列番号54~55;又は
(4)配列番号56~57
のアミノ酸配列を含む、請求項5~7のいずれか一項に記載の単離又は精製されたポリペプチド。 - 単離又は精製されたタンパク質であって、以下:
(a)配列番号9~11のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号12~14のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖;
(b)配列番号17~19のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号20~22のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖;
(c)配列番号25~27のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号28~30のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖;又は
(d)配列番号33~35のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号36~38のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖
を含む、タンパク質。 - 以下:
(i)配列番号15のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号16のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖;
(ii)配列番号23のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号24のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖;
(iii)配列番号31のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号32のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖;又は
(iv)配列番号39のアミノ酸配列を含む第一のポリペプチド鎖及び配列番号40のアミノ酸配列を含む第二のポリペプチド鎖
を含む、請求項9に記載の単離又は精製されたタンパク質。 - 以下:
(A)第一のポリペプチド鎖が配列番号46のアミノ酸配列を更に含み:
(i)配列番号46の48位のXがThr又はCysであり;
(ii)配列番号46の112位のXがSer、Ala、Val、Leu、
Ile、Pro、Phe、Met又はTrpであり;
(iii)配列番号46の114位のXがMet、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe又はTrpであり;及び
(iv)配列番号46の115位のXがGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met又はTrpであり;
並びに
(B)第二のポリペプチド鎖が、配列番号47のアミノ酸配列を更に含み、配列番号47の57位のXがSer又はCysである、
請求項9又は10に記載の単離又は精製されたタンパク質。 - 以下:
(1)第一のポリペプチド鎖が配列番号50のアミノ酸配列を含み、第二のポリペプチド鎖が配列番号51のアミノ酸配列を含む;
(2)第一のポリペプチド鎖が配列番号52のアミノ酸配列を含み、第二のポリペプチド鎖が配列番号53のアミノ酸配列を含む;
(3)第一のポリペプチド鎖が配列番号54のアミノ酸配列を含み、第二のポリペプチド鎖が配列番号55のアミノ酸配列を含む;又は
(4)第一のポリペプチド鎖が配列番号56のアミノ酸配列を含み、第二のポリペプチド鎖が配列番号57のアミノ酸配列を含む、
請求項9~11のいずれか一項に記載の単離又は精製されたタンパク質。 - 請求項1~4のいずれか一項に記載のTCR、請求項5~8のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項9~12のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離又は精製された核酸。
- 請求項13に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
- 請求項14に記載の組換え発現ベクターを含む、単離又は精製された宿主細胞。
- 少なくとも1つの請求項15に記載の単離又は精製された宿主細胞を含む、細胞集団。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載のTCR、請求項5~8のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項9~12のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項13に記載の核酸、請求項14に記載の組換え発現ベクター、請求項15に記載の宿主細胞、又は請求項16に記載の宿主細胞集団、及び医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法であって、前記方法が以下:
(a)がんの細胞を含む試料と、請求項1~4のいずれか一項に記載のTCR、請求項5~8のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項9~12のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項13に記載の核酸、請求項14に記載の組換え発現ベクター、請求項15に記載の宿主細胞、請求項16に記載の宿主細胞集団又は請求項17に記載の医薬組成物とを接触させ、それにより複合体を形成すること;及び
(b)前記複合体を検出すること
を含み、前記複合体の検出が哺乳動物におけるがんの存在を示す、方法。 - 前記がんが、膵臓、結腸直腸、肺、子宮内膜、卵巣又は前立腺のがんである、請求項18に記載の方法。
- 哺乳動物におけるがんの治療又は予防において使用するための、請求項1~4のいずれか一項に記載のTCR、請求項5~8のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項9~
12のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項13に記載の核酸、請求項14に記載の組換え発現ベクター、請求項15に記載の宿主細胞、請求項16に記載の宿主細胞集団、又は請求項17に記載の医薬組成物。 - 前記がんが、膵臓、結腸直腸、肺、子宮内膜、卵巣又は前立腺のがんである、請求項20に記載の使用のための、TCR、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、宿主細胞集団、又は医薬組成物。
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