JP2023540222A - 二特異性抗体ｃａｒ細胞免疫療法 - Google Patents

二特異性抗体ｃａｒ細胞免疫療法 Download PDF

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Abstract

腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識かつ結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（抗ＴＡＡ抗原結合性配列）、ＮＫＧ２ＤおよびＧタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識し、これらに結合する二特異性抗体、必要に応じたサイトカインおよび必要に応じた自殺遺伝子産物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるポリペプチドが提供される。関連する組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、および方法も提供される。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年８月２５日出願の米国仮出願第６３／０７０，２１９号；２０２０年９月８日出願の第６３／０７５，７５０号；２０２１年１月２７日出願の第６３／１４２，４２６号；および２０２１年５月２５日出願の第６３／１９３，０２４号に基づく米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での優先権を主張する。これらのそれぞれの内容は、これにより参照により全体が本出願に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、これにより参照により全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０２１年８月２３日に作成され、１１３０８６－９２６０＿ＳＬ．ｔｘｔと命名されており、サイズは５６１，７４１バイトである。
技術分野
本開示は一般に、ヒト免疫学の分野、具体的にはがん免疫療法に関する。
背景
本発明の背景に関する以下の考察は、単に本発明の技術を支援するために提供される。
現在のがん処置レジメンには、化学療法、免疫調節薬物、モノクローナル抗体、および自家移植または同種異系移植が含まれる。これらの療法は寛解をもたらすことが多いが、ほぼ全ての患者は最終的には疾患の再来のために再発して死に至る。したがって、再発したおよび／または難治性の疾患のための新たな組合せ免疫療法を含む新しい療法への満たされていないニーズがある。本開示はこれらの限界に対処し、関連する利点も提供する。
本開示の要旨
上記の一般的な記述および以下の詳細な説明は例示的かつ説明的であり、特許を請求する本開示のさらなる説明を提供することを意図している。その他の目的物、利点、および新規な特徴は、以下の図面の簡単な説明および本開示の詳細な説明から当業者には容易に明らかになる。
一態様では、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列（本明細書でペプチドとも称する）および（ｉｉ）二特異性抗体のアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるポリペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。さらに、ＣＡＲペプチドは、（１）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識かつ結合する抗原結合性アミノ酸配列（例えば一本鎖可変断片、すなわちｓｃＦｖ）（抗ＴＡＡ抗原結合性配列）、（２）ヒンジドメイン、（３）膜貫通ドメイン、および（４）細胞内ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらに、二特異性抗体は、（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（例えばｓｃＦｖ）（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）および（２）Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識かつ結合する抗原結合性配列（例えばｓｃＦｖ）（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ＴＡＡはＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）である。
一部の実施形態では、二特異性抗体は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列および抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、二特異性抗体は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列および抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＡＲアミノ酸配列と二特異性抗体のアミノ酸配列との間に位置する切断可能なペプチド（例えば自己切断性ペプチド）をさらに含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、それ自体または酵素によって２つまたはそれより多いペプチド、例えばＣＡＲペプチドおよび二特異性抗体に切断することができる。したがって、ポリペプチドから切断されたＣＡＲペプチドおよび二特異性抗体を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる組成物も提供される。ポリペプチドは、ＣＡＲペプチドのアミノ酸配列、二特異性抗体のアミノ酸配列、およびＣＡＲ配列と抗体配列との間に位置する切断可能なペプチドを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、組成物は、切断されていないポリペプチドをさらに含む。
別の態様では、本明細書で開示するＣＡＲペプチドをコードするヌクレオチド配列、本明細書で開示する二特異性抗体をコードするヌクレオチド配列、およびＣＡＲコード配列と二特異性抗体コード配列との間に位置する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるポリヌクレオチドが提供される。さらに別の態様では、ＣＡＲペプチドをコードするヌクレオチド配列、その発現を方向付ける第１の制御配列、二特異性抗体をコードするヌクレオチド配列、およびその発現を方向付ける第２の制御配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるポリヌクレオチドが提供される。一部の実施形態では、２つの制御配列は、ポリヌクレオチド中のこれらの配列もしくは位置またはその両方において異なる。一部の実施形態では、第１の制御配列と第２の制御配列は、二方向性の制御配列を構成するか、これらを含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる。したがって、それらの両方がポリヌクレオチドによってコードされるＣＡＲペプチドおよび二特異性抗体を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる組成物が提供される
さらなる態様では、（ｉ）本明細書で開示するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列および（ｉｉ）本明細書で開示する二特異性抗体のアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるポリペプチド、または本明細書で開示するポリヌクレオチド、またはポリペプチドとポリヌクレオチドの両方を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、ポリペプチドはさらに処理され、例えばそれ自体または細胞によって切断されて、ＣＡＲペプチドおよび二特異性抗体を生じる。一部の実施形態では、細胞はＣＡＲペプチドおよび二特異性抗体をさらに含む。一部の実施形態では、細胞は、本明細書で開示するポリヌクレオチドおよび細胞中でポリヌクレオチドを発現または複製するために好適な制御配列を含むかさらに含む。
さらなる態様では、本明細書で開示するＣＡＲペプチドおよび本明細書で開示する二特異性抗体を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、細胞は細胞膜上にＣＡＲを含み、細胞外に二特異性抗体を分泌する。さらにまたはその代わりに、ＣＡＲペプチドおよび二特異性抗体は、（ｉ）ＣＡＲのアミノ酸配列、（ｉｉ）二特異性抗体のアミノ酸配列、および（ｉ）と（ｉｉ）との間に位置する切断可能なペプチドを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるポリペプチドを切断することによって、例えば細胞中で産生される。
一部の実施形態では、本明細書で開示するポリペプチドは、（ｉｉｉ）サイトカインのアミノ酸配列、または（ｉｖ）自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方のアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）と（ｉｖ）の両方をさらに含む。一部の実施形態では、提供するポリペプチドは、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列、（ｉｉ）二特異性抗体のアミノ酸配列、および（ｉｉｉ）サイトカインのアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、提供するポリペプチドは、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列、（ｉｉ）二特異性抗体のアミノ酸配列、および（ｉｖ）自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方のアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、提供するポリペプチドは、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列、（ｉｉ）二特異性抗体のアミノ酸配列、（ｉｉｉ）サイトカインのアミノ酸配列、および（ｉｖ）自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方のアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
一部の実施形態では、自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方は、切断型上皮細胞増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）である。一部の実施形態では、自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方は、ＲＱＲ８である。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１５またはＩＬ－２１から選択される。さらなる実施形態では、ＣＡＲのアミノ酸配列は、（１）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を認識かつ結合する抗原結合性アミノ酸配列（抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列）、（２）ヒンジドメイン、（３）膜貫通ドメイン、および（４）細胞内ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、二特異性抗体のアミノ酸配列は、（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）および（２）Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で開示するアミノ酸配列の１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、本明細書で開示するポリペプチド中のいずれか２つのアミノ酸配列、例えば（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）から選択されるアミノ酸配列は切断可能なペプチドによって分離されていてよく、それにより、ポリペプチドのアミノ酸配列が２つまたはそれより多いペプチド断片に切断されることが可能になる。
したがって、本明細書に記載したポリペプチドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその両方を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、ポリペプチドはさらに処理され、例えばそれ自体または細胞によって切断されて、以下：ＣＡＲペプチド、二特異性抗体、サイトカイン、および自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方のいずれか１つまたは２つまたは３つまたは４つ全てが生じる。一部の実施形態では、細胞は、以下：ＣＡＲペプチド、二特異性抗体、サイトカイン、および自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方のいずれか１つまたは２つまたは３つまたは４つ全てをさらに含む。一部の実施形態では、細胞は細胞膜上にＣＡＲを発現し、細胞外に二特異性抗体を分泌する。さらなる実施形態では、細胞は細胞外にサイトカインを分泌する。さらにまたはその代わりに、細胞は自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方を、例えば細胞膜上に発現する。一部の実施形態では、細胞は本明細書で開示するポリヌクレオチドおよび細胞中でポリヌクレオチドを発現または複製するために好適な制御配列を含む。
本明細書で開示するＣＡＲペプチドをコードするヌクレオチド配列および本明細書で開示する二特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるポリヌクレオチドも提供される。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書で開示するサイトカインをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。さらにまたはその代わりに、ポリヌクレオチドは、本明細書で開示する自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、コード配列のいずれかの発現を方向付ける制御配列をさらに含む。さらにまたはその代わりに、ポリヌクレオチドは、コード配列のいずれか２つの間に位置する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは２つ以上の制御配列を含む。さらなる実施形態では、制御配列のそれぞれは、ポリヌクレオチド中のこれらの配列もしくは位置またはその両方について異なっている。一部の実施形態では、制御配列は二方向制御配列を構成している。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは２つ以上のＩＲＥＳを含む。したがって、これらのそれぞれがポリヌクレオチドによってコードされる、以下：ＣＡＲペプチド、二特異性抗体、サイトカイン、検出可能マーカー、または自殺遺伝子産物の少なくとも２つを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる組成物が提供される。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、二特異性抗体は、本明細書で開示する抗ＧＰＲＣ５Ｄである抗ＴＡＡ抗原結合性配列、またはその代わりに抗ＧＰＲＣ５Ｄ以外の抗ＴＡＡ抗原結合性配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲの抗ＴＡＡ抗原結合性配列は抗ＧＰＲＣ５Ｄであり、二特異性抗体の抗ＴＡＡ抗原結合性配列は抗ＢＣＭＡである。他の実施形態では、ＣＡＲの抗ＴＡＡ抗原結合性配列は抗ＢＣＭＡであり、二特異性抗体の抗ＴＡＡ抗原結合性配列は抗ＧＰＲＣ５Ｄである。したがって、二特異性抗体のエレメント、例えば抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列は、抗ＴＡＡ抗原結合性配列のＮ末端側に位置してよく、または抗ＴＡＡ抗原結合性配列のＣ末端側に位置してもよい。さらなる実施形態では、二特異性抗体において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列は、ＨＭＡリンカー等のペプチドリンカー、または免疫グロブリンの断片結晶性（Ｆｃ）領域、その変異体もしくはその等価物、またはペプチドリンカーと免疫グロブリンのＦｃ領域、その変異体もしくはその等価物の両方を介して、抗ＴＡＡ抗原結合性配列に連結されている。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、二特異性抗体の抗原結合性配列の一方または両方は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。一部の実施形態では、抗二特異性抗体は、抗ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖおよび抗ＧＰＲＣ５Ｄ ｓｃＦｖ（または別のＴＡＡを認識かつ結合するｓｃＦｖ）を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖは抗ＴＡＡ ｓｃＦｖのＮ末端側に位置している。一部の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖは抗ＴＡＡ ｓｃＦｖのＣ末端側に位置している。さらなる実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖは、ＨＭＡリンカー等のペプチドリンカー、または免疫グロブリンの断片結晶性（Ｆｃ）領域、その変異体もしくはその等価物、またはペプチドリンカーと免疫グロブリンのＦｃ領域、その変異体、もしくはその等価物の両方を介して、抗ＴＡＡ ｓｃＦｖに連結されている。一部の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖは、ＮＫＧ２Ｄではないが本明細書で開示する免疫細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞の細胞表面上に存在する抗原を認識かつ結合するｓｃＦｖで置き換えられる。好適な抗原を、本明細書中の後のパラグラフで例示する。
さらにまたはその代わりに、二特異性抗体は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列の代わりにまたはそれに加えて、ＮＫＧ２Ｄリガンド、例えばＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＢ）、ＵＬ１６結合タンパク質１（ＵＬＢＰ１）、ＵＬ１６結合タンパク質２（ＵＬＢＰ２）、ＵＬ１６結合タンパク質３（ＵＬＢＰ３）、ＵＬ１６結合タンパク質４（ＵＬＢＰ４）、ＵＬ１６結合タンパク質５（ＵＬＢＰ５）、ＵＬ１６結合タンパク質６（ＵＬＢＰ６）、または他の任意の好適なＮＫＧ２Ｄリガンドを含む。本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、二特異性抗体中の抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列は、ＮＫＧ２Ｄではないが本明細書で開示する免疫細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞の細胞表面上に存在する抗原を認識かつ結合する抗原結合性配列またはリガンドによって置き換えられてもよい。そのような抗原の非限定的な例には、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＣＤ１６、インテグリンアルファ－Ｌ（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２７、ＣＤ５６、または細胞傷害性および制御性Ｔ細胞分子（ＣＲＴＡＭ）が含まれる。したがって、二特異性抗体は、がん細胞上に存在するＴＡＡ（例えばＧＰＲＣ５Ｄ）への結合および免疫細胞上の抗原（例えばＮＫＧ２Ｄまたは本明細書で開示する別の抗原）への結合を介して、がん細胞を免疫細胞の近傍に移動させる。さらなる実施形態では、抗原結合性配列またはリガンドの、ＮＫＧ２Ｄではないが免疫細胞の細胞表面上で発現される抗原との結合は、免疫細胞を活性化する。
理論に縛られることは望まないが、本出願人は、免疫細胞（例えばＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＴ細胞）に関与するＣＡＲまたは二特異性抗体のいずれかまたは両方を介して、必要に応じて免疫細胞上に発現されるＮＫＧ２Ｄを標的とすることを介して、ＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄを標的とすることによって、がん／腫瘍細胞の殺滅において相加的効果に留まらない驚くべき効果（例えば相乗的効果）が得られることを発見した。一部の実施形態では、効果はｉｎ ｖｉｖｏであるかｉｎ ｖｉｖｏで観察される。さらにまたはその代わりに、効果はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでも観察することができ、したがって多発性骨髄腫（ＭＭ）等のがんの処置における効果的な治療レジメンがもたらされる。したがって、本明細書で開示するように、（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列、および（ｉｉ）抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列を含む二特異性抗体のアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるポリペプチドが提供される。本明細書の開示が、両方が存在する場合には抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列と入れ替えられる実施形態および態様も含むことは、当業者には理解されよう。
別の態様では、（１）Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識かつ結合する抗原結合性アミノ酸配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）、（２）ヒンジドメイン、（３）膜貫通ドメイン、および（４）細胞内ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。一部の実施形態では、ＣＡＲはＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を認識かつ結合する抗原結合性配列をさらに含む。
さらに別の態様では、ＮＫＧ２ＤとＧタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）の両方を認識し、これらに結合する抗体（例えば二特異性抗体）またはその断片が提供される。二特異性抗体またはその断片は、（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）および（２）ＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書の開示のいずれかの態様に関する一部の実施形態では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列は、以下のＣＤＲ：ＫＡＳＱＮＶＡＴＨＶＧ（配列番号１０）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるＣＤＲＬ１；ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号１１）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるＣＤＲＬ２；ＱＱＹＮＲＹＰＹＴ（配列番号１２）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるＣＤＲＬ３；ＧＹＳＦＴＧＹ（配列番号１３）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるＣＤＲＨ１；ＮＰＹＮＳＤ（配列番号１４）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるＣＤＲＨ２；およびＶＡＬＲＶＡＬＤＹ（配列番号１５）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるＣＤＲＨ３の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは５つまたは６つ全部を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなり、ただしその等価物はＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する。一部の実施形態では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列は、配列番号１６またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる軽鎖可変領域；または配列番号１７またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる重鎖可変領域；または軽鎖可変領域もしくはその等価物および重鎖可変領域もしくはその等価物の両方を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなり、ただしその等価物はＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する。一部の実施形態では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列は、ＨＣとＬＣの両方、またはその一方もしくは両方の等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなり、その等価物はＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する。
本明細書の開示のいずれかの態様に関する一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメインもしくはＩｇＧ１ヒンジドメインまたはその両方を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。本明細書の開示のいずれかの態様に関する一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインもしくはＣＤ２８膜貫通ドメインまたはその両方を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。本明細書の開示のいずれかの態様に関する一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域、４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域、ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域、ＯＸ４０共刺激領域、ＤＡＰ１０共刺激領域、またはＤＡＰ１２共刺激領域から選択される１つまたは複数（例えば２つまたはそれを超える）共刺激領域を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。本明細書の開示のいずれかの態様に関する一部の実施形態では、細胞内ドメインは１つの共刺激領域を含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。さらなる実施形態では、細胞内ドメインはＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域を含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。さらにまたはその代わりに、細胞内ドメインはＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。本明細書の開示のいずれかの態様に関する一部の実施形態では、本明細書で開示するＣＡＲ、二特異性抗体、サイトカイン、自殺遺伝子産物、検出可能マーカー、またはポリペプチドのいずれか１つまたは複数は、それぞれのＮ末端にシグナルペプチドをさらに含む。
さらなる態様では、以下の：本明細書で開示するポリペプチド、本明細書で開示する二特異性抗体もしくはその断片、または本明細書で開示するＣＡＲペプチドの１つまたは複数をコードするポリヌクレオチド；またはこれに対して相補的もしくはリバースである、または相補的でリバースのポリヌクレオチドが提供される。本明細書で開示するポリヌクレオチドを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなるベクターも提供される。以下の：本明細書で開示するポリペプチド、本明細書で開示する二特異性抗体もしくはその断片、本明細書で開示するＣＡＲ、本明細書で開示するポリヌクレオチド、または本明細書で開示するベクターの１つまたは複数を含む単離されたまたは操作された細胞がさらに提供される。一部の実施形態では、細胞は免疫細胞、必要に応じてＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、骨髄性細胞、単球、またはマクロファージである。さらなる実施形態では、免疫細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導される。一部の実施形態では、細胞は幹細胞、例えばＨＳＣまたはｉＰＳＣである。一部の実施形態では、細胞は細胞膜中にＣＡＲを含み、細胞外に二特異性抗体を分泌する。さらなる実施形態では、細胞は本明細書で開示するサイトカインを分泌する。さらにまたはその代わりに、細胞は、例えば細胞表面上に、本明細書で開示する自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方を発現する。
さらなる態様では、２つ以上のベクターを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるベクター系が提供される。ベクターは、（ｉ）（１）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を認識かつ結合する抗原結合性アミノ酸配列（抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列）、（２）ヒンジドメイン、（３）膜貫通ドメイン、および（４）細胞内ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列；（ｉｉ）（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）、および（２）Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる二特異性抗体のアミノ酸配列；（ｉｉｉ）必要に応じたＩＬ１５またはＩＬ－２１から選択されるサイトカインのアミノ酸配列；および（ｉｖ）必要に応じた自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方、必要に応じて切断型上皮細胞増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）またはＲＱＲ８のアミノ酸配列をコードする。
さらなる態様では、担体、必要に応じて薬学的に許容される担体、ならびに以下：本明細書で開示するポリペプチド、本明細書で開示する二特異性抗体もしくはその断片、本明細書で開示するＣＡＲ、本明細書で開示するポリヌクレオチド、本明細書で開示するベクター、本明細書で開示するベクター系、本明細書で開示する単離された細胞、または本明細書で開示する細胞もしくは細胞集団の１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる組成物が提供される。
以下：がん細胞に結合した本明細書で開示するポリペプチド、がん細胞に結合した本明細書で開示する二特異性抗体もしくはその断片、がん細胞に結合した本明細書で開示するＣＡＲ、がん細胞に結合した単離されたもしくは操作された細胞、または単離されたもしくは操作された細胞および二特異性抗体に結合したがん細胞の１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる単離された複合体も提供される。
一態様では、ＣＡＲを発現するか、二特異性抗体を分泌するか、またはＣＡＲを発現し、二特異性抗体を分泌する細胞を産生する方法が提供される。一部の実施形態では、細胞はサイトカインをさらに分泌するか、自殺遺伝子産物（もしくは検出可能マーカー、またはその両方）を発現するか、またはサイトカインを分泌し、自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方を発現する。本方法は、細胞またはその集団に本明細書で開示するポリヌクレオチド、本明細書で開示するベクター、または本明細書で開示するベクター系を形質導入することを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらにまたはその代わりに、本方法は、本明細書で開示する細胞または細胞集団を培養することを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
別の態様では、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ、例えばＧＰＲＣ５ＤもしくはＢＣＭＡまたはその両方）を発現するがん細胞またはがん細胞を含む組織の増殖を阻害する方法が提供される。本方法は、がん細胞または組織を、本明細書で開示する単離されたまたは操作された細胞と接触させることを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、細胞は免疫細胞、必要に応じてＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、骨髄性細胞、単球、またはマクロファージである。さらなる実施形態では、免疫細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導される。接触はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われてよい。
さらに別の態様では、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法が提供される。本方法は、例えば有効量の本明細書で開示する単離されたまたは操作された細胞を対象に投与することを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、対象は、対象のがん細胞が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ、例えばＧＰＲＣ５ＤもしくはＢＣＭＡまたはその両方）の１つまたは複数を発現している場合には処置のために選択される。一部の実施形態では、がんは多発性骨髄腫（ＭＭ）である。
一態様では、対象におけるＧＰＲＣ５Ｄ発現がんを処置する方法が提供される。本方法は、本明細書で開示する二特異性抗体もしくはその断片の一方もしくは両方、または本明細書で開示する単離されたもしくは操作された細胞を対象に投与することを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
別の抗がん療法もしくは腫瘍関連抗原の発現を上方制御する療法、またはその両方の療法を、本明細書で開示する方法と組み合わせてもよい。
さらに、必要に応じた使用説明書、および以下：本明細書で開示するポリペプチド、本明細書で開示する二特異性抗体もしくはその断片、本明細書で開示するＣＡＲ、本明細書で開示するポリヌクレオチド、本明細書で開示するベクター、本明細書で開示するベクター系、本明細書で開示する単離されたもしくは操作された細胞、本明細書で開示する組成物、または本明細書で開示する単離された複合体の１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるキットが提供される。
上記の一般的な記述および以下の詳細な説明は例示的かつ説明的であり、特許を請求する本開示のさらなる説明を提供することを意図している。その他の目的物、利点、および新規な特徴は、以下の図面の簡単な説明および本開示の詳細な説明から当業者には容易に明らかになる。
図１Ａ～１Ｅは、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系（図１Ａ）、初代Ｂ細胞（図１Ｂ）、ＮＫ細胞（図１Ｃ）およびＴ細胞（図１Ｄ）上のＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ表面発現のフロー分析を、それを要約する棒グラフ（図１Ｅ）と共に提供する。ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２、Ｈ９２９、およびＲＰＭＩ８２２６は多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系であり、完全ＲＰＭＩ １６４０培地中で培養された。新たに単離されたＢ細胞、ならびに活性化ＮＫ細胞およびＴ細胞をこの研究において使用した。全部で２×１０５個の細胞を、ｈｕｍａｎ ＴＲＵＳＴＡＩＮ ＦＣＸ（商標）（Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を１：５０の希釈で使用してブロッキングし、次にＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄをそれらのアイソタイプ対照で染色した。図１Ｅにおいて、各群（ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤまたはＮＫＧ２Ｄ）のバーは、左から右に、ＭＭ細胞系、初代Ｂ細胞、活性化ＮＫ細胞および活性化Ｔ細胞からの結果を表す。本明細書に開示されるデータは、ＢＣＭＡは４つ全てのＭＭ細胞系の表面上に高発現されるが、初代Ｂ細胞ならびに活性化ＮＫおよびＴ細胞の表面上には高発現されないことを実証した。Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）は、３つのＭＭ細胞系ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２およびＨ９２９の表面上にのみ検出され、全ての初代Ｂ細胞、ＮＫおよびＴ細胞についてはそうでなかった。 図１Ａ～１Ｅは、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系（図１Ａ）、初代Ｂ細胞（図１Ｂ）、ＮＫ細胞（図１Ｃ）およびＴ細胞（図１Ｄ）上のＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ表面発現のフロー分析を、それを要約する棒グラフ（図１Ｅ）と共に提供する。ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２、Ｈ９２９、およびＲＰＭＩ８２２６は多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系であり、完全ＲＰＭＩ １６４０培地中で培養された。新たに単離されたＢ細胞、ならびに活性化ＮＫ細胞およびＴ細胞をこの研究において使用した。全部で２×１０５個の細胞を、ｈｕｍａｎ ＴＲＵＳＴＡＩＮ ＦＣＸ（商標）（Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を１：５０の希釈で使用してブロッキングし、次にＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄをそれらのアイソタイプ対照で染色した。図１Ｅにおいて、各群（ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤまたはＮＫＧ２Ｄ）のバーは、左から右に、ＭＭ細胞系、初代Ｂ細胞、活性化ＮＫ細胞および活性化Ｔ細胞からの結果を表す。本明細書に開示されるデータは、ＢＣＭＡは４つ全てのＭＭ細胞系の表面上に高発現されるが、初代Ｂ細胞ならびに活性化ＮＫおよびＴ細胞の表面上には高発現されないことを実証した。Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）は、３つのＭＭ細胞系ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２およびＨ９２９の表面上にのみ検出され、全ての初代Ｂ細胞、ＮＫおよびＴ細胞についてはそうでなかった。 図１Ａ～１Ｅは、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系（図１Ａ）、初代Ｂ細胞（図１Ｂ）、ＮＫ細胞（図１Ｃ）およびＴ細胞（図１Ｄ）上のＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ表面発現のフロー分析を、それを要約する棒グラフ（図１Ｅ）と共に提供する。ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２、Ｈ９２９、およびＲＰＭＩ８２２６は多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系であり、完全ＲＰＭＩ １６４０培地中で培養された。新たに単離されたＢ細胞、ならびに活性化ＮＫ細胞およびＴ細胞をこの研究において使用した。全部で２×１０５個の細胞を、ｈｕｍａｎ ＴＲＵＳＴＡＩＮ ＦＣＸ（商標）（Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を１：５０の希釈で使用してブロッキングし、次にＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄをそれらのアイソタイプ対照で染色した。図１Ｅにおいて、各群（ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤまたはＮＫＧ２Ｄ）のバーは、左から右に、ＭＭ細胞系、初代Ｂ細胞、活性化ＮＫ細胞および活性化Ｔ細胞からの結果を表す。本明細書に開示されるデータは、ＢＣＭＡは４つ全てのＭＭ細胞系の表面上に高発現されるが、初代Ｂ細胞ならびに活性化ＮＫおよびＴ細胞の表面上には高発現されないことを実証した。Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）は、３つのＭＭ細胞系ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２およびＨ９２９の表面上にのみ検出され、全ての初代Ｂ細胞、ＮＫおよびＴ細胞についてはそうでなかった。 図１Ａ～１Ｅは、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系（図１Ａ）、初代Ｂ細胞（図１Ｂ）、ＮＫ細胞（図１Ｃ）およびＴ細胞（図１Ｄ）上のＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ表面発現のフロー分析を、それを要約する棒グラフ（図１Ｅ）と共に提供する。ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２、Ｈ９２９、およびＲＰＭＩ８２２６は多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系であり、完全ＲＰＭＩ １６４０培地中で培養された。新たに単離されたＢ細胞、ならびに活性化ＮＫ細胞およびＴ細胞をこの研究において使用した。全部で２×１０５個の細胞を、ｈｕｍａｎ ＴＲＵＳＴＡＩＮ ＦＣＸ（商標）（Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を１：５０の希釈で使用してブロッキングし、次にＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄをそれらのアイソタイプ対照で染色した。図１Ｅにおいて、各群（ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤまたはＮＫＧ２Ｄ）のバーは、左から右に、ＭＭ細胞系、初代Ｂ細胞、活性化ＮＫ細胞および活性化Ｔ細胞からの結果を表す。本明細書に開示されるデータは、ＢＣＭＡは４つ全てのＭＭ細胞系の表面上に高発現されるが、初代Ｂ細胞ならびに活性化ＮＫおよびＴ細胞の表面上には高発現されないことを実証した。Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）は、３つのＭＭ細胞系ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２およびＨ９２９の表面上にのみ検出され、全ての初代Ｂ細胞、ＮＫおよびＴ細胞についてはそうでなかった。 図１Ａ～１Ｅは、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系（図１Ａ）、初代Ｂ細胞（図１Ｂ）、ＮＫ細胞（図１Ｃ）およびＴ細胞（図１Ｄ）上のＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ表面発現のフロー分析を、それを要約する棒グラフ（図１Ｅ）と共に提供する。ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２、Ｈ９２９、およびＲＰＭＩ８２２６は多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系であり、完全ＲＰＭＩ １６４０培地中で培養された。新たに単離されたＢ細胞、ならびに活性化ＮＫ細胞およびＴ細胞をこの研究において使用した。全部で２×１０５個の細胞を、ｈｕｍａｎ ＴＲＵＳＴＡＩＮ ＦＣＸ（商標）（Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を１：５０の希釈で使用してブロッキングし、次にＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄをそれらのアイソタイプ対照で染色した。図１Ｅにおいて、各群（ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤまたはＮＫＧ２Ｄ）のバーは、左から右に、ＭＭ細胞系、初代Ｂ細胞、活性化ＮＫ細胞および活性化Ｔ細胞からの結果を表す。本明細書に開示されるデータは、ＢＣＭＡは４つ全てのＭＭ細胞系の表面上に高発現されるが、初代Ｂ細胞ならびに活性化ＮＫおよびＴ細胞の表面上には高発現されないことを実証した。Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）は、３つのＭＭ細胞系ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２およびＨ９２９の表面上にのみ検出され、全ての初代Ｂ細胞、ＮＫおよびＴ細胞についてはそうでなかった。
図２Ａ～２Ｃは、エンプティ対照（図２Ａ）、抗ＢＣＭＡ従来型ＣＡＲ（図２Ｂ）ならびに２つの抗ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＣＡＲレトロウイルスベクター（図２Ｃ）の概略図表現を提供する。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した。４つ全ての構築物を使用して、免疫細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞における使用のためのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＣＡＲを生成した。ＢＣＭＡ：Ｂ細胞成熟抗原；ＢｉＴＥ：二特異性Ｔ細胞エンゲージャー；ＢｉＫＥ：二特異性ＮＫ細胞エンゲージャー。ＧＮ１：抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列のＮ末端側に抗ＧＰＣＲ５Ｄ抗原結合性配列を含む二特異性抗体。ＮＧ２：抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列のＣ末端側に抗ＧＰＣＲ５Ｄ抗原結合性配列を含む二特異性抗体。
図３Ａ～３Ｃは、この研究において使用されたＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲおよび対照（配列番号９として開示される「（Ｇ４Ｓ）３」）のダイアグラフ（図３Ａ～３Ｂ）を、この研究において使用されたマウス抗ヒトＢＣＭＡおよびヒト化抗ＢＣＭＡ（登場の順に、それぞれ、配列番号４１、２５２、および４４～４５）のアライメント（図３Ｃ）と共に提供する。図３Ａは、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖはマウス抗ヒトＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ ５．３（ＷＯ ２０１５／１５８６７１ Ａｌ）から抽出され、二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）または二特異性ＮＫ細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）は全長ヒトソース：ヒト抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ－２．０（ＵＳ２０１１０１５０８７０Ａ１）、およびヒト抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体ＧＣ５Ｂ５９６（米国特許出願第２０１８００３７６５１号）であったことを示す。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した。３部位突然変異型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを使用して、分泌されるＢｉＴＥ／ＢｉＫＥを安定化させた。ＩｇＧ４－Ｆｃは、３つの部位、ヒンジ領域内のＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＣＨ２領域内のＮ２９７Ｑにおいて突然変異されており、そのＦｃ領域中の置換は、Ｆｃ受容体結合を回避することを目的とした。上記４つ全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。文字「ｍ」はマウスソースを意味する。上記の構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄおよび１ｅにおいて提供されている。図３Ｂは、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖはヒト化抗ヒトＢＣＭＡ抗体（ＵＳ １０１７４０９５ Ｂ２）から抽出され、ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥは全長ヒトソース：ヒト抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ－２．０（ＵＳ２０１１０１５０８７０Ａ１）、およびヒト抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体ＧＣ５Ｂ５９６（米国特許出願第２０１８００３７６５１号）であったことを示す。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した。３部位突然変異型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを使用して、分泌されるＢｉＴＥ／ＢｉＫＥを安定化させた。ＩｇＧ４－Ｆｃは、３つの部位、ヒンジ領域内のＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＣＨ２領域内のＮ２９７Ｑにおいて突然変異されており、そのＦｃ領域中の置換は、Ｆｃ受容体結合を回避することを目的とした。上記４つ全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。文字「ｈｕ」はヒト化されていることを意味する。上記の構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表１ｆ、１ｇ、１ｈおよび１ｅにおいて提供されている。図３Ｃに示されるように、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム（Al-Lazikani et al.,(1997), JMB 273:214-218）と共にＡｂＲＳＡ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ａｎｄ ＣＤＲｓ Ｄｅｌｉｍｉｔｉｎｇ）を介して指定された。Ｃ１１Ｄ５．３およびヒト化抗ＢＣＭＡのアミノ酸座標はＵＳ １０１７４０９５ Ｂ２からのものであった。 図３Ａ～３Ｃは、この研究において使用されたＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲおよび対照（配列番号９として開示される「（Ｇ４Ｓ）３」）のダイアグラフ（図３Ａ～３Ｂ）を、この研究において使用されたマウス抗ヒトＢＣＭＡおよびヒト化抗ＢＣＭＡ（登場の順に、それぞれ、配列番号４１、２５２、および４４～４５）のアライメント（図３Ｃ）と共に提供する。図３Ａは、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖはマウス抗ヒトＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ ５．３（ＷＯ ２０１５／１５８６７１ Ａｌ）から抽出され、二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）または二特異性ＮＫ細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）は全長ヒトソース：ヒト抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ－２．０（ＵＳ２０１１０１５０８７０Ａ１）、およびヒト抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体ＧＣ５Ｂ５９６（米国特許出願第２０１８００３７６５１号）であったことを示す。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した。３部位突然変異型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを使用して、分泌されるＢｉＴＥ／ＢｉＫＥを安定化させた。ＩｇＧ４－Ｆｃは、３つの部位、ヒンジ領域内のＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＣＨ２領域内のＮ２９７Ｑにおいて突然変異されており、そのＦｃ領域中の置換は、Ｆｃ受容体結合を回避することを目的とした。上記４つ全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。文字「ｍ」はマウスソースを意味する。上記の構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄおよび１ｅにおいて提供されている。図３Ｂは、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖはヒト化抗ヒトＢＣＭＡ抗体（ＵＳ １０１７４０９５ Ｂ２）から抽出され、ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥは全長ヒトソース：ヒト抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ－２．０（ＵＳ２０１１０１５０８７０Ａ１）、およびヒト抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体ＧＣ５Ｂ５９６（米国特許出願第２０１８００３７６５１号）であったことを示す。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した。３部位突然変異型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを使用して、分泌されるＢｉＴＥ／ＢｉＫＥを安定化させた。ＩｇＧ４－Ｆｃは、３つの部位、ヒンジ領域内のＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＣＨ２領域内のＮ２９７Ｑにおいて突然変異されており、そのＦｃ領域中の置換は、Ｆｃ受容体結合を回避することを目的とした。上記４つ全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。文字「ｈｕ」はヒト化されていることを意味する。上記の構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表１ｆ、１ｇ、１ｈおよび１ｅにおいて提供されている。図３Ｃに示されるように、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム（Al-Lazikani et al.,(1997), JMB 273:214-218）と共にＡｂＲＳＡ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ａｎｄ ＣＤＲｓ Ｄｅｌｉｍｉｔｉｎｇ）を介して指定された。Ｃ１１Ｄ５．３およびヒト化抗ＢＣＭＡのアミノ酸座標はＵＳ １０１７４０９５ Ｂ２からのものであった。 図３Ａ～３Ｃは、この研究において使用されたＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲおよび対照（配列番号９として開示される「（Ｇ４Ｓ）３」）のダイアグラフ（図３Ａ～３Ｂ）を、この研究において使用されたマウス抗ヒトＢＣＭＡおよびヒト化抗ＢＣＭＡ（登場の順に、それぞれ、配列番号４１、２５２、および４４～４５）のアライメント（図３Ｃ）と共に提供する。図３Ａは、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖはマウス抗ヒトＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ ５．３（ＷＯ ２０１５／１５８６７１ Ａｌ）から抽出され、二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）または二特異性ＮＫ細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）は全長ヒトソース：ヒト抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ－２．０（ＵＳ２０１１０１５０８７０Ａ１）、およびヒト抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体ＧＣ５Ｂ５９６（米国特許出願第２０１８００３７６５１号）であったことを示す。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した。３部位突然変異型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを使用して、分泌されるＢｉＴＥ／ＢｉＫＥを安定化させた。ＩｇＧ４－Ｆｃは、３つの部位、ヒンジ領域内のＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＣＨ２領域内のＮ２９７Ｑにおいて突然変異されており、そのＦｃ領域中の置換は、Ｆｃ受容体結合を回避することを目的とした。上記４つ全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。文字「ｍ」はマウスソースを意味する。上記の構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄおよび１ｅにおいて提供されている。図３Ｂは、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖはヒト化抗ヒトＢＣＭＡ抗体（ＵＳ １０１７４０９５ Ｂ２）から抽出され、ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥは全長ヒトソース：ヒト抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ－２．０（ＵＳ２０１１０１５０８７０Ａ１）、およびヒト抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体ＧＣ５Ｂ５９６（米国特許出願第２０１８００３７６５１号）であったことを示す。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した。３部位突然変異型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを使用して、分泌されるＢｉＴＥ／ＢｉＫＥを安定化させた。ＩｇＧ４－Ｆｃは、３つの部位、ヒンジ領域内のＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＣＨ２領域内のＮ２９７Ｑにおいて突然変異されており、そのＦｃ領域中の置換は、Ｆｃ受容体結合を回避することを目的とした。上記４つ全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。文字「ｈｕ」はヒト化されていることを意味する。上記の構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表１ｆ、１ｇ、１ｈおよび１ｅにおいて提供されている。図３Ｃに示されるように、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム（Al-Lazikani et al.,(1997), JMB 273:214-218）と共にＡｂＲＳＡ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ａｎｄ ＣＤＲｓ Ｄｅｌｉｍｉｔｉｎｇ）を介して指定された。Ｃ１１Ｄ５．３およびヒト化抗ＢＣＭＡのアミノ酸座標はＵＳ １０１７４０９５ Ｂ２からのものであった。
図４Ａ～４Ｂは、富化の前および後のフローアッセイによる形質導入評価および純度検出を提供する。１．５：１．５：１の比で全てのＰＣＩＲプラスミドをＰＥＱ－ＰＥＭ ３（ｅ）でパッケージングし、ＢａＥＶＴＲでエンベロープ被覆し、ＰＥＩ ＭＡＸ ４０Ｋ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ、Ｃａｔ ＃２４７６５）を介して２９３ Ｔ細胞にトランスフェクトした。４８時間および７２時間でウイルス上清を収集し、ＨＴ１０８０細胞系を使用して滴定を試験した。４人のドナーのＴ細胞を、ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ヒト、１３０－０９８－１９３）を使用して単離し、Ｔ Ｃｅｌｌ ＴＲＡＮＳＡＣＴ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ヒト、１３０－１１１－１６０）、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ヒト、ＣＴＰ００２３）、０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ヒト、１３０－０９５－７６５）、および５％のＡＢヒト血清（Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、ＢＰ２５２５１００）と共に培養した。レトロネクチン試薬（ＴａｋａＲａ、Ｔ１００Ａ／Ｂ）を被覆した非組織培養プレートを使用して、出願人は上記の構築物（図３Ａ）を活性化Ｔ細胞（２～５日）にＭＯＩ３で形質導入した。ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧを使用してフロー分析により形質導入後６日目における形質導入率を決定し、Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＿１１５－６０５－００６）およびＰＥ抗ヒトＣＤ１９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３０２２０８）を使用してＢＣＭＡ－ＣＡＲおよび切断型ＣＤ１９発現を検出した（図４Ａ）。２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔおよび１つの従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔを含む３つ全てのＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔの富化のために、細胞を一次抗体Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（長いスペーサー）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（１１５－０６５－０７２ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で染色し、続いてＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｍ－２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１１２０５Ｄ）で二次染色した。さらに、陽性選択をＤＹＮＡＭＡＧ（商標）－１５ Ｍａｇｎｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１２３０１Ｄ）上で行った。切断型ＣＤ１９エンプティ対照を含む形質導入されたＴ細胞の富化のために、ＲＥＡｌｅａｓｅ ＣＤ１９ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ヒト、１３０－１１７－０３４）を使用した。さらに、陽性選択をＬＳカラムで行い、細胞を次に磁気的分離に進めた。フロー分析は、高度に富化されたＣＡＲ－Ｔおよびエンプティベクター対照があったことを実証した（図４Ｂ）。
図５Ａ～５Ｃは、ウエスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡによりＴ細胞から分泌された二特異性抗体の発現および濃度を決定した結果を提供する。図５Ａに示されるように、ＥＬＩＳＡ分析は、６つの異なる商用のＴ細胞拡大増殖培地、ＡＩＭ Ｖ（商標）（ＧＩＢＣＯ（商標）、１２０５５０８３）、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ Ｔ Ｃｅｌｌ ＣＤＭ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ、９１１５４）、Ｘ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ、ＢＥ０２－０５４Ｑ）、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（Ｔａｋａｒａ、ＷＫ５５２Ｓ）、ＴＥＸＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｉｎｅｎｙｉ、１３０－０９７－１９６）、およびＣＴＳ（商標）ＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ（商標）Ａ１０４８５０１）において培養された形質導入されたＢＩＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の濃縮されていない上清からの検出可能なＢｉＴＥ／ＢｉＫＥがあったことを示した。各群について、左から右のバーは、ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ、ＰＣＩＲ－ＢＣＮＧ２ ＩｇＧ４－Ｆｃ、ＰＣＩＲ－ｔＣＤ１９、ＰＣＩＲ－ＢＣＭＡのみおよびＮＴについて得られたデータを表す。データは、変化倍率としての４人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。図５Ｂに示されるように、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）６２０－ＨＳＦ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｅｌｌｓ（Ｓｉｇｍａ：１４６２１Ｃ）中で培養された４人のドナーからのＴ細胞上清のプールを、ＰＩＥＲＣＥ（商標）Ａｎｔｉ－ＨＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ２６１８２）を使用して精製し、５回の溶出をＥＬＩＳＡアッセイで行った。図５Ｃに示されるように、「ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ」、「ＰＣＩＲ－ＢＣＮＧ２ ＩｇＧ４－Ｆｃ」、「ＰＣＩＲ－Ｔｃｄ１９－ＥＶ」、および「ＰＣＩＲ－ＢＣＭＡ ＣＡＲのみ」で形質導入されたＴ細胞からの全部で１０μｌの未精製上清（Ｕ）、フロースルー（Ｆ）、および溶出（Ｅ）を４～２０％のＭＩＮＩ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）Ｐｒｅｃａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃４５６１０９６）にロードした。使用された一次抗体はウサギ抗ＨＡ（ＣＳＴ、＃３７２４）であり、二次抗体はＬＩ－ＣＯＲ ＩＲＤＹＥ（登録商標）８００ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉ－ＣＯＲ、＃９２６－３２２１１）であった。「ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ」および「ＰＣＩＲ－ＢＣＮＧ２ ＩｇＧ４－Ｆｃ」群からの溶出においてのみ約７５ＫＤのＨＡタグ付加されたＢｉＴＥ／ＢｉＫＥタンパク質バンドが予想されたが、「ＰＣＩＲ－ｔＣＤ１９－ＥＶ」および「ＰＣＩＲ－ＢＣＭＡ ＣＡＲのみ」の試料の上清からはされなかった。 図５Ａ～５Ｃは、ウエスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡによりＴ細胞から分泌された二特異性抗体の発現および濃度を決定した結果を提供する。図５Ａに示されるように、ＥＬＩＳＡ分析は、６つの異なる商用のＴ細胞拡大増殖培地、ＡＩＭ Ｖ（商標）（ＧＩＢＣＯ（商標）、１２０５５０８３）、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ Ｔ Ｃｅｌｌ ＣＤＭ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ、９１１５４）、Ｘ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ、ＢＥ０２－０５４Ｑ）、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（Ｔａｋａｒａ、ＷＫ５５２Ｓ）、ＴＥＸＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｉｎｅｎｙｉ、１３０－０９７－１９６）、およびＣＴＳ（商標）ＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ（商標）Ａ１０４８５０１）において培養された形質導入されたＢＩＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の濃縮されていない上清からの検出可能なＢｉＴＥ／ＢｉＫＥがあったことを示した。各群について、左から右のバーは、ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ、ＰＣＩＲ－ＢＣＮＧ２ ＩｇＧ４－Ｆｃ、ＰＣＩＲ－ｔＣＤ１９、ＰＣＩＲ－ＢＣＭＡのみおよびＮＴについて得られたデータを表す。データは、変化倍率としての４人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。図５Ｂに示されるように、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）６２０－ＨＳＦ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｅｌｌｓ（Ｓｉｇｍａ：１４６２１Ｃ）中で培養された４人のドナーからのＴ細胞上清のプールを、ＰＩＥＲＣＥ（商標）Ａｎｔｉ－ＨＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ２６１８２）を使用して精製し、５回の溶出をＥＬＩＳＡアッセイで行った。図５Ｃに示されるように、「ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ」、「ＰＣＩＲ－ＢＣＮＧ２ ＩｇＧ４－Ｆｃ」、「ＰＣＩＲ－Ｔｃｄ１９－ＥＶ」、および「ＰＣＩＲ－ＢＣＭＡ ＣＡＲのみ」で形質導入されたＴ細胞からの全部で１０μｌの未精製上清（Ｕ）、フロースルー（Ｆ）、および溶出（Ｅ）を４～２０％のＭＩＮＩ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）Ｐｒｅｃａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃４５６１０９６）にロードした。使用された一次抗体はウサギ抗ＨＡ（ＣＳＴ、＃３７２４）であり、二次抗体はＬＩ－ＣＯＲ ＩＲＤＹＥ（登録商標）８００ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉ－ＣＯＲ、＃９２６－３２２１１）であった。「ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ」および「ＰＣＩＲ－ＢＣＮＧ２ ＩｇＧ４－Ｆｃ」群からの溶出においてのみ約７５ＫＤのＨＡタグ付加されたＢｉＴＥ／ＢｉＫＥタンパク質バンドが予想されたが、「ＰＣＩＲ－ｔＣＤ１９－ＥＶ」および「ＰＣＩＲ－ＢＣＭＡ ＣＡＲのみ」の試料の上清からはされなかった。 図５Ａ～５Ｃは、ウエスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡによりＴ細胞から分泌された二特異性抗体の発現および濃度を決定した結果を提供する。図５Ａに示されるように、ＥＬＩＳＡ分析は、６つの異なる商用のＴ細胞拡大増殖培地、ＡＩＭ Ｖ（商標）（ＧＩＢＣＯ（商標）、１２０５５０８３）、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ Ｔ Ｃｅｌｌ ＣＤＭ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ、９１１５４）、Ｘ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ、ＢＥ０２－０５４Ｑ）、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（Ｔａｋａｒａ、ＷＫ５５２Ｓ）、ＴＥＸＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｉｎｅｎｙｉ、１３０－０９７－１９６）、およびＣＴＳ（商標）ＯＰＴＭＩＺＥＲ（商標）Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ（商標）Ａ１０４８５０１）において培養された形質導入されたＢＩＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の濃縮されていない上清からの検出可能なＢｉＴＥ／ＢｉＫＥがあったことを示した。各群について、左から右のバーは、ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ、ＰＣＩＲ－ＢＣＮＧ２ ＩｇＧ４－Ｆｃ、ＰＣＩＲ－ｔＣＤ１９、ＰＣＩＲ－ＢＣＭＡのみおよびＮＴについて得られたデータを表す。データは、変化倍率としての４人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。図５Ｂに示されるように、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）６２０－ＨＳＦ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｅｌｌｓ（Ｓｉｇｍａ：１４６２１Ｃ）中で培養された４人のドナーからのＴ細胞上清のプールを、ＰＩＥＲＣＥ（商標）Ａｎｔｉ－ＨＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ２６１８２）を使用して精製し、５回の溶出をＥＬＩＳＡアッセイで行った。図５Ｃに示されるように、「ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ」、「ＰＣＩＲ－ＢＣＮＧ２ ＩｇＧ４－Ｆｃ」、「ＰＣＩＲ－Ｔｃｄ１９－ＥＶ」、および「ＰＣＩＲ－ＢＣＭＡ ＣＡＲのみ」で形質導入されたＴ細胞からの全部で１０μｌの未精製上清（Ｕ）、フロースルー（Ｆ）、および溶出（Ｅ）を４～２０％のＭＩＮＩ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）Ｐｒｅｃａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃４５６１０９６）にロードした。使用された一次抗体はウサギ抗ＨＡ（ＣＳＴ、＃３７２４）であり、二次抗体はＬＩ－ＣＯＲ ＩＲＤＹＥ（登録商標）８００ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉ－ＣＯＲ、＃９２６－３２２１１）であった。「ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ」および「ＰＣＩＲ－ＢＣＮＧ２ ＩｇＧ４－Ｆｃ」群からの溶出においてのみ約７５ＫＤのＨＡタグ付加されたＢｉＴＥ／ＢｉＫＥタンパク質バンドが予想されたが、「ＰＣＩＲ－ｔＣＤ１９－ＥＶ」および「ＰＣＩＲ－ＢＣＭＡ ＣＡＲのみ」の試料の上清からはされなかった。
図６Ａ～６Ｂは、安全性、増殖、および生存研究の結果を提供する。サイトカイン非依存性増殖実験を行って、ＣＡＲ Ｔ細胞は形質転換されていないことを確実にした。等しい数の細胞（１．５×１０４個の細胞）を、条件「サイトカインなし」（図６Ａ）および「サイトカインあり」（ＩＬ－２ ５０ＩＵ／ｍｌ；ＩＬ－１５ ０．５ｎｇ／ｍｌ）（図６Ｂ）において５％のヒトＡＢ型血清を含有する培地Ｘ－ＶＩＶＯ １５を含む９６ウェルプレート中に播種した。ＮｏｖｏＣｙｔｅ ３００５ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを使用して細胞数をカウントした。１５０００個の出発細胞数に対する全ＤＡＰＩ陰性生細胞の変化倍率を使用して細胞生存および増殖を評価した。データは、変化倍率としての４人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。サイトカインなしで、全ての群は１０日目に死滅し、増殖の範囲は、サイトカインが存在する場合１０日目に１００～２５０倍であり、全てのこれらの形質導入されたＴ細胞の増殖はサイトカインに依存しており、形質転換されていないことを示唆した。重要なことに、サイトカインが存在しないおよび存在するの両方の条件において「従来型ＰＣＩＲ－ＢＣＭＡ ＣＡＲのみ」と比較してＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ、特に「ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ」の生存および増殖に対して顕著に有益な効果があった。ここでＰ値は、従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔと比較したＧＮ１－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔのみを実証した。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１ 図６Ａ～６Ｂは、安全性、増殖、および生存研究の結果を提供する。サイトカイン非依存性増殖実験を行って、ＣＡＲ Ｔ細胞は形質転換されていないことを確実にした。等しい数の細胞（１．５×１０４個の細胞）を、条件「サイトカインなし」（図６Ａ）および「サイトカインあり」（ＩＬ－２ ５０ＩＵ／ｍｌ；ＩＬ－１５ ０．５ｎｇ／ｍｌ）（図６Ｂ）において５％のヒトＡＢ型血清を含有する培地Ｘ－ＶＩＶＯ １５を含む９６ウェルプレート中に播種した。ＮｏｖｏＣｙｔｅ ３００５ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを使用して細胞数をカウントした。１５０００個の出発細胞数に対する全ＤＡＰＩ陰性生細胞の変化倍率を使用して細胞生存および増殖を評価した。データは、変化倍率としての４人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。サイトカインなしで、全ての群は１０日目に死滅し、増殖の範囲は、サイトカインが存在する場合１０日目に１００～２５０倍であり、全てのこれらの形質導入されたＴ細胞の増殖はサイトカインに依存しており、形質転換されていないことを示唆した。重要なことに、サイトカインが存在しないおよび存在するの両方の条件において「従来型ＰＣＩＲ－ＢＣＭＡ ＣＡＲのみ」と比較してＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ、特に「ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ」の生存および増殖に対して顕著に有益な効果があった。ここでＰ値は、従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔと比較したＧＮ１－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔのみを実証した。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１
図７Ａ～７Ｃは、ＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞系ＭＭ１．ＳまたはＯＰＭ２、およびＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ－ ＲＰＭＩ８２２６、ならびにＢＣＭＡ－／ＧＰＲＣ５Ｄ－ ＭＶ４１１を含有する混合物を用いた均一および不均一の両方の腫瘍標的環境中のＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ特異的殺滅モデルの生成を示す。図７Ａに示されるように、フロー分析は、ＭＭ１．ＳおよびＯＰＭ２はＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄ陽性ＭＭ細胞系である一方、ＲＰＭＩ８２２６はＢＣＭＡ陽性であるがＧＰＲＣ５Ｄ陰性のＭＭ細胞系であることを決定した。この研究において使用されたＭＶ４１１はＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄ二重陰性ＡＭＬ細胞系である。ＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄ標的均一および不均一ＭＭ腫瘍環境の生成のために、出願人は、７５％のＭＭ１．ＳまたはＯＰＭ２を２５％のＭＶ４１１と、および４０％のＭＭ１．ＳまたはＯＰＭ２を６０％のＭＶ４１１と混合し（図７Ｂ）、長期１２０時間の殺滅アッセイの結果を図８Ａ～９Ｄに示している。ＧＰＲＣ５Ｄ標的均一および不均一ＭＭ腫瘍環境の生成のために、出願人は、７５％のＭＭ１．ＳまたはＯＰＭ２を２５％のＲＰＭＩ８２２６と、および４０％のＭＭ１．ＳまたはＯＰＭ２を６０％のＲＰＭＩ８２２６と混合し（図７Ｃ）、長期１２０時間の殺滅アッセイの結果を図１０Ａ～１１Ｄに示している。ＢＣＭＡ陰性、ＧＰＲＣ５Ｄ陽性ＭＭ細胞系を作製して、ＢＣＭＡ標的均一および不均一ＭＭ腫瘍環境を生成した。 図７Ａ～７Ｃは、ＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞系ＭＭ１．ＳまたはＯＰＭ２、およびＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ－ ＲＰＭＩ８２２６、ならびにＢＣＭＡ－／ＧＰＲＣ５Ｄ－ ＭＶ４１１を含有する混合物を用いた均一および不均一の両方の腫瘍標的環境中のＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ特異的殺滅モデルの生成を示す。図７Ａに示されるように、フロー分析は、ＭＭ１．ＳおよびＯＰＭ２はＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄ陽性ＭＭ細胞系である一方、ＲＰＭＩ８２２６はＢＣＭＡ陽性であるがＧＰＲＣ５Ｄ陰性のＭＭ細胞系であることを決定した。この研究において使用されたＭＶ４１１はＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄ二重陰性ＡＭＬ細胞系である。ＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄ標的均一および不均一ＭＭ腫瘍環境の生成のために、出願人は、７５％のＭＭ１．ＳまたはＯＰＭ２を２５％のＭＶ４１１と、および４０％のＭＭ１．ＳまたはＯＰＭ２を６０％のＭＶ４１１と混合し（図７Ｂ）、長期１２０時間の殺滅アッセイの結果を図８Ａ～９Ｄに示している。ＧＰＲＣ５Ｄ標的均一および不均一ＭＭ腫瘍環境の生成のために、出願人は、７５％のＭＭ１．ＳまたはＯＰＭ２を２５％のＲＰＭＩ８２２６と、および４０％のＭＭ１．ＳまたはＯＰＭ２を６０％のＲＰＭＩ８２２６と混合し（図７Ｃ）、長期１２０時間の殺滅アッセイの結果を図１０Ａ～１１Ｄに示している。ＢＣＭＡ陰性、ＧＰＲＣ５Ｄ陽性ＭＭ細胞系を作製して、ＢＣＭＡ標的均一および不均一ＭＭ腫瘍環境を生成した。
図８Ａ～８Ｄは、ＧＮ１－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ＋ ＭＭ１．ＳおよびＢＣＭＡ－／ＧＰＲＣ５Ｄ－ ＭＶ４１１の両方の均一および不均一腫瘍標的環境において従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも性能が優れている（例えば、標的細胞の殺滅において顕著により良好な有効性を実証する）ことを示す。長期殺滅アッセイを行った。ＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ＋ ＭＭ１．ＳおよびＢＣＭＡ－／ＧＰＲＣ５Ｄ－ ＭＶ４１１細胞を可変のパーセンテージ、例えば１００％のＭＭ１．Ｓ（図８Ａ）、１００％のＭＶ４１１（図８Ｂ）、７５％のＭＭ１．Ｓと２５％のＭＶ４１１（図８Ｃ）、および４０％のＭＭ１．Ｓと６０％のＭＶ４１１（図８Ｄ）で混合した。均一および不均一モデルにおいてエンプティ対照非形質導入Ｔ細胞と比較してＧＮ１－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲ（ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ）および従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔの両方について顕著に腫瘍殺滅効果があった（図７Ｂ）。しかしながら、ＧＮ１－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲは、従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲと比較して劇的に腫瘍殺滅効果を実証した（統計的有意性Ｐ＜０．０００１）。データは、腫瘍溶解としての４人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。両側スチューデントＴ検定を使用して２つの群の間の有意性を評価し、Ｐ値についてのインデックスは、＊ ｐ＜０．０５；＊＊ ｐ＜０．０１；＊＊＊ ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１であった。
図９Ａ～９Ｄは、ＧＮ１－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔは、ＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ＋ ＯＰＭ２およびＢＣＭＡ－／ＧＰＲＣ５Ｄ－ ＭＶ４１１の両方の均一および不均一腫瘍標的環境において従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔよりも性能が優れている（例えば、標的細胞の殺滅において顕著により良好な有効性を実証する）ことを示す。長期殺滅アッセイを行った。ＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ＋ ＯＰＭ２およびＢＣＭＡ－／ＧＰＲＣ５Ｄ－ ＭＶ４１１細胞を可変のパーセンテージ、例えば１００％のＯＰＭ２（図９Ａ）、１００％のＭＶ４１１（図９Ｂ）、７５％のＯＰＭ２と２５％のＭＶ４１１（図９Ｃ）、および４０％のＯＰＭ２と６０％のＭＶ４１１（図９Ｄ）で混合した。均一および不均一モデルにおいてエンプティ対照非形質導入Ｔ細胞と比較してＧＮ１－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲ（ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ）、ＮＧ２－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲ（ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ）、および従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔについて顕著に腫瘍殺滅効果があった（図７Ｂ）。しかしながら、ＧＮ１－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲは、従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲと比較して劇的に腫瘍殺滅効果を実証した（統計的有意性Ｐ＜０．０００１）。データは、腫瘍溶解としての４人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。両側スチューデントＴ検定を使用して２つの群の間の有意性を評価し、Ｐ値についてのインデックスは、＊ ｐ＜０．０５；＊＊ ｐ＜０．０１；＊＊＊ ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１であった。
図１０Ａ～１０Ｄは、ＧＮ１－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔは、ＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ＋ ＭＭ１．ＳおよびＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ－ ＲＰＭＩ８２２６の両方の均一および不均一腫瘍標的環境において従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔよりも性能が優れている（例えば、標的細胞の殺滅において顕著により良好な有効性を実証する）ことを示す。長期殺滅アッセイを行った。ＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ＋ ＭＭ１．ＳおよびＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ－ ＲＰＭＩ８２２６細胞を可変のパーセンテージ、例えば１００％のＭＭ１．Ｓ（図１０Ａ）、１００％のＲＰＭＩ８２２６（図１０Ｂ）、７５％のＭＭ１．Ｓと２５％のＲＰＭＩ８２２６（図１０Ｃ）、および４０％のＭＭ１．Ｓと６０％のＲＰＭＩ８２２６（図１０Ｄ）で混合した。均一および不均一モデルにおいてエンプティ対照非形質導入Ｔ細胞と比較してＧＮ１－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲ（ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ）および従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔの両方について顕著に腫瘍殺滅効果があった（図７Ｃ）。しかしながら、ＧＮ１－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲは、従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲと比較して劇的に腫瘍殺滅効果を実証した（統計的有意性Ｐ＜０．０００１）。データは、腫瘍溶解としての４人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。両側スチューデントＴ検定を使用して２つの群の間の有意性を評価し、Ｐ値についてのインデックスは、＊ ｐ＜０．０５；＊＊ ｐ＜０．０１；＊＊＊ ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１であった。
図１１Ａ～１１Ｄは、ＧＮ１－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔは、ＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ＋ ＯＰＭ２およびＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ－ ＲＰＭＩ８２２６の両方の均一および不均一腫瘍標的環境において従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔよりも性能が優れている（例えば、標的細胞の殺滅において顕著により良好な有効性を実証する）ことを示す。長期殺滅アッセイを行った。ＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ＋ ＯＰＭ２およびＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ－ ＲＰＭＩ８２２６を可変のパーセンテージ、例えば１００％のＯＰＭ２（図１１Ａ）、１００％のＲＰＭＩ８２２６（図１１Ｂ）、７５％のＯＰＭ２と２５％のＲＰＭＩ８２２６（図１１Ｃ）、および４０％のＯＰＭ２と６０％のＲＰＭＩ８２２６（図１１Ｄ）で混合した。均一および不均一モデルにおいてエンプティ対照非形質導入Ｔ細胞と比較してＧＮ１－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲ（ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ）、ＮＧ２－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲ（ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ）、および免疫細胞、例えばＴ細胞における使用のための従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲについて顕著に腫瘍殺滅効果があった（図７Ｃ）。しかしながら、ＧＮ１－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲは、従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲと比較して劇的に腫瘍殺滅効果を実証した（統計的有意性Ｐ＜０．０００１）。データは、腫瘍溶解としての４人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。両側スチューデントＴ検定を使用して２つの群の間の有意性を評価し、Ｐ値についてのインデックスは、＊ ｐ＜０．０５；＊＊ ｐ＜０．０１；＊＊＊ ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１であった。
図１２Ａ～１２Ｃは、可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変レトロウイルスベクターを有するエンプティ対照（図１２Ａ）、免疫細胞、例えばＮＫ細胞における使用のための抗ＢＣＭＡ従来型ＣＡＲ（図１２Ｂ）ならびに２つの抗ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＣＡＲ（図１２Ｃ）の概略図表現を提供する。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した（図１２Ｃ）。可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を、免疫細胞、例えばＮＫ細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。
図１３Ａ～１３Ｃは、可溶性ＩＬ－１５および受容体複合体（ＳＩＬ１５Ｃ）ならびに自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を有するエンプティ対照（図１３Ａ）、免疫細胞、例えばＮＫ細胞における使用のための抗ＢＣＭＡ従来型ＣＡＲ（図１３Ｂ）ならびに２つの抗ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＣＡＲ（図１３Ｃ）レトロウイルスベクターの概略図表現を提供する。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した（図１３Ｃ）。受容体複合体を有する可溶性ＩＬ－１５（ＳＩＬ１５Ｃ）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を、免疫細胞、例えばＮＫ細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。
図１４Ａ～１４Ｃは、膜結合ＩＬ－１５（ｍｂＩＬ－１５）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を有するエンプティ対照（図１４Ａ）、免疫細胞、例えばＮＫ細胞における使用のための抗ＢＣＭＡ従来型ＣＡＲ（図１４Ｂ）ならびに２つの抗ＧＰＲＣ５Ｄおよび抗ＮＫＧ２Ｄ ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＣＡＲ（図１４Ｃ）レトロウイルスベクターの概略図表現を提供する。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した（図１４Ｃ）。細胞膜上に結合したオンボードサイトカイン（ＩＬ－１５）（ｍｂＩＬ－１５）をＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインおよび自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変と共に免疫細胞、例えばＮＫ細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。
図１５Ａ～１５Ｃは、膜結合ＩＬ－２１（ｍｂＩＬ－２１）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を有するエンプティ対照（図１５Ａ）、免疫細胞、例えばＮＫ細胞における使用のための抗ＢＣＭＡ従来型ＣＡＲ（図１５Ｂ）ならびに２つの抗ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ＣＡＲ（図１５Ｃ）レトロウイルスベクターの概略図表現を提供する。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した（図１５Ｃ）。細胞膜上に結合したオンボードサイトカイン（ＩＬ－２１）（ｍｂＩＬ－２１）をＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインおよび自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変と共に免疫細胞、例えばＮＫ細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。
図１６Ａ～１６Ｃは、人工細胞系の生成のために使用された腫瘍抗原ＢＣＭＡ（図１６Ａ）、ＧＰＲＣ５Ｄ（図１６Ｂ）、ならびに二重ＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡ（図１６Ｃ）レトロウイルスベクターの概略図表現を提供する。この研究において使用されたＢＣＭＡタンパク質配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０２２２３（ＴＮＲ１７＿ＨＵＭＡＮ）であり、ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＮＺＤ１（ＧＰＣ５Ｄ＿ＨＵＭＡＮ）であった。全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。
図１７Ａ～１７Ｆは、この研究において使用されたＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲおよび対照（配列番号９として開示される「（Ｇ４Ｓ）３」）のダイアグラフ（図１７Ａ～１７Ｅ）を、人工細胞系の生成のために使用された腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ならびに二重ＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡレトロウイルスベクターのダイアグラフ（図１７Ｆ）と共に提供する。抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖはマウス抗ヒトＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ ５．３（ＷＯ ２０１５／１５８６７１ Ａ１）から抽出され、ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥは全長ヒトソース：ヒト抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ－２．０（ＵＳ２０１１０１５０８７０Ａ１）、およびヒト抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体ＧＣ５Ｂ５９６（米国特許出願第２０１８００３７６５１号）であった。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した。３部位突然変異型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを使用して、分泌されるＢｉＴＥ／ＢｉＫＥを安定化させた。ＩｇＧ４－Ｆｃは、３つの部位、ヒンジ領域内のＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＣＨ２領域内のＮ２９７Ｑにおいて突然変異されており、そのＦｃ領域中の置換は、Ｆｃ受容体結合を回避することを目的とした。全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。図１７Ａに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅにおいて提供されている。図１７Ｂに示されるように、可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を、免疫細胞、例えばＮＫ細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｂに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｆ、ｇ、ｈおよびｉにおいて提供されている。図１７Ｃに示されるように、受容体複合体を有する可溶性ＩＬ－１５（ＳＩＬ１５Ｃ）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変をＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｃに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｊ、ｋ、ｌおよびｍにおいて提供されている。図１７Ｄに示されるように、細胞膜上に結合したオンボードサイトカイン（ＩＬ－１５）（ｍｂＩＬ－１５）をＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインおよび自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変と共にＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｄに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｎ、ｏ、ｐおよびｑにおいて提供されている。図１７Ｅに示されるように、細胞膜上に結合したオンボードサイトカイン（ＩＬ－２１）（ｍｂＩＬ－２１）をＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインおよび自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変と共にＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｅに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕにおいて提供されている。図１７Ｆは、人工細胞系の生成のために使用された腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ならびに二重ＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡレトロウイルスベクターのダイアグラフを提供する。この研究において使用されたＢＣＭＡタンパク質配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０２２２３（ＴＮＲ１７＿ＨＵＭＡＮ）であり、ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＮＺＤ１（ＧＰＣ５Ｄ＿ＨＵＭＡＮ）であった。全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。図１７Ｆに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｖ、ｗ、およびｘにおいて提供されている。 図１７Ａ～１７Ｆは、この研究において使用されたＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲおよび対照（配列番号９として開示される「（Ｇ４Ｓ）３」）のダイアグラフ（図１７Ａ～１７Ｅ）を、人工細胞系の生成のために使用された腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ならびに二重ＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡレトロウイルスベクターのダイアグラフ（図１７Ｆ）と共に提供する。抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖはマウス抗ヒトＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ ５．３（ＷＯ ２０１５／１５８６７１ Ａ１）から抽出され、ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥは全長ヒトソース：ヒト抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ－２．０（ＵＳ２０１１０１５０８７０Ａ１）、およびヒト抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体ＧＣ５Ｂ５９６（米国特許出願第２０１８００３７６５１号）であった。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した。３部位突然変異型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを使用して、分泌されるＢｉＴＥ／ＢｉＫＥを安定化させた。ＩｇＧ４－Ｆｃは、３つの部位、ヒンジ領域内のＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＣＨ２領域内のＮ２９７Ｑにおいて突然変異されており、そのＦｃ領域中の置換は、Ｆｃ受容体結合を回避することを目的とした。全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。図１７Ａに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅにおいて提供されている。図１７Ｂに示されるように、可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を、免疫細胞、例えばＮＫ細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｂに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｆ、ｇ、ｈおよびｉにおいて提供されている。図１７Ｃに示されるように、受容体複合体を有する可溶性ＩＬ－１５（ＳＩＬ１５Ｃ）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変をＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｃに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｊ、ｋ、ｌおよびｍにおいて提供されている。図１７Ｄに示されるように、細胞膜上に結合したオンボードサイトカイン（ＩＬ－１５）（ｍｂＩＬ－１５）をＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインおよび自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変と共にＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｄに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｎ、ｏ、ｐおよびｑにおいて提供されている。図１７Ｅに示されるように、細胞膜上に結合したオンボードサイトカイン（ＩＬ－２１）（ｍｂＩＬ－２１）をＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインおよび自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変と共にＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｅに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕにおいて提供されている。図１７Ｆは、人工細胞系の生成のために使用された腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ならびに二重ＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡレトロウイルスベクターのダイアグラフを提供する。この研究において使用されたＢＣＭＡタンパク質配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０２２２３（ＴＮＲ１７＿ＨＵＭＡＮ）であり、ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＮＺＤ１（ＧＰＣ５Ｄ＿ＨＵＭＡＮ）であった。全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。図１７Ｆに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｖ、ｗ、およびｘにおいて提供されている。 図１７Ａ～１７Ｆは、この研究において使用されたＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲおよび対照（配列番号９として開示される「（Ｇ４Ｓ）３」）のダイアグラフ（図１７Ａ～１７Ｅ）を、人工細胞系の生成のために使用された腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ならびに二重ＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡレトロウイルスベクターのダイアグラフ（図１７Ｆ）と共に提供する。抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖはマウス抗ヒトＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ ５．３（ＷＯ ２０１５／１５８６７１ Ａ１）から抽出され、ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥは全長ヒトソース：ヒト抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ－２．０（ＵＳ２０１１０１５０８７０Ａ１）、およびヒト抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体ＧＣ５Ｂ５９６（米国特許出願第２０１８００３７６５１号）であった。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した。３部位突然変異型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを使用して、分泌されるＢｉＴＥ／ＢｉＫＥを安定化させた。ＩｇＧ４－Ｆｃは、３つの部位、ヒンジ領域内のＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＣＨ２領域内のＮ２９７Ｑにおいて突然変異されており、そのＦｃ領域中の置換は、Ｆｃ受容体結合を回避することを目的とした。全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。図１７Ａに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅにおいて提供されている。図１７Ｂに示されるように、可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を、免疫細胞、例えばＮＫ細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｂに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｆ、ｇ、ｈおよびｉにおいて提供されている。図１７Ｃに示されるように、受容体複合体を有する可溶性ＩＬ－１５（ＳＩＬ１５Ｃ）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変をＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｃに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｊ、ｋ、ｌおよびｍにおいて提供されている。図１７Ｄに示されるように、細胞膜上に結合したオンボードサイトカイン（ＩＬ－１５）（ｍｂＩＬ－１５）をＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインおよび自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変と共にＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｄに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｎ、ｏ、ｐおよびｑにおいて提供されている。図１７Ｅに示されるように、細胞膜上に結合したオンボードサイトカイン（ＩＬ－２１）（ｍｂＩＬ－２１）をＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインおよび自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変と共にＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｅに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕにおいて提供されている。図１７Ｆは、人工細胞系の生成のために使用された腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ならびに二重ＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡレトロウイルスベクターのダイアグラフを提供する。この研究において使用されたＢＣＭＡタンパク質配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０２２２３（ＴＮＲ１７＿ＨＵＭＡＮ）であり、ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＮＺＤ１（ＧＰＣ５Ｄ＿ＨＵＭＡＮ）であった。全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。図１７Ｆに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｖ、ｗ、およびｘにおいて提供されている。 図１７Ａ～１７Ｆは、この研究において使用されたＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲおよび対照（配列番号９として開示される「（Ｇ４Ｓ）３」）のダイアグラフ（図１７Ａ～１７Ｅ）を、人工細胞系の生成のために使用された腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ならびに二重ＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡレトロウイルスベクターのダイアグラフ（図１７Ｆ）と共に提供する。抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖはマウス抗ヒトＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ ５．３（ＷＯ ２０１５／１５８６７１ Ａ１）から抽出され、ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥは全長ヒトソース：ヒト抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ－２．０（ＵＳ２０１１０１５０８７０Ａ１）、およびヒト抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体ＧＣ５Ｂ５９６（米国特許出願第２０１８００３７６５１号）であった。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した。３部位突然変異型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを使用して、分泌されるＢｉＴＥ／ＢｉＫＥを安定化させた。ＩｇＧ４－Ｆｃは、３つの部位、ヒンジ領域内のＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＣＨ２領域内のＮ２９７Ｑにおいて突然変異されており、そのＦｃ領域中の置換は、Ｆｃ受容体結合を回避することを目的とした。全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。図１７Ａに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅにおいて提供されている。図１７Ｂに示されるように、可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を、免疫細胞、例えばＮＫ細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｂに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｆ、ｇ、ｈおよびｉにおいて提供されている。図１７Ｃに示されるように、受容体複合体を有する可溶性ＩＬ－１５（ＳＩＬ１５Ｃ）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変をＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｃに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｊ、ｋ、ｌおよびｍにおいて提供されている。図１７Ｄに示されるように、細胞膜上に結合したオンボードサイトカイン（ＩＬ－１５）（ｍｂＩＬ－１５）をＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインおよび自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変と共にＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｄに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｎ、ｏ、ｐおよびｑにおいて提供されている。図１７Ｅに示されるように、細胞膜上に結合したオンボードサイトカイン（ＩＬ－２１）（ｍｂＩＬ－２１）をＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインおよび自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変と共にＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｅに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕにおいて提供されている。図１７Ｆは、人工細胞系の生成のために使用された腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ならびに二重ＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡレトロウイルスベクターのダイアグラフを提供する。この研究において使用されたＢＣＭＡタンパク質配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０２２２３（ＴＮＲ１７＿ＨＵＭＡＮ）であり、ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＮＺＤ１（ＧＰＣ５Ｄ＿ＨＵＭＡＮ）であった。全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。図１７Ｆに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｖ、ｗ、およびｘにおいて提供されている。 図１７Ａ～１７Ｆは、この研究において使用されたＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲおよび対照（配列番号９として開示される「（Ｇ４Ｓ）３」）のダイアグラフ（図１７Ａ～１７Ｅ）を、人工細胞系の生成のために使用された腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ならびに二重ＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡレトロウイルスベクターのダイアグラフ（図１７Ｆ）と共に提供する。抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖはマウス抗ヒトＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ ５．３（ＷＯ ２０１５／１５８６７１ Ａ１）から抽出され、ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥは全長ヒトソース：ヒト抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ－２．０（ＵＳ２０１１０１５０８７０Ａ１）、およびヒト抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体ＧＣ５Ｂ５９６（米国特許出願第２０１８００３７６５１号）であった。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した。３部位突然変異型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを使用して、分泌されるＢｉＴＥ／ＢｉＫＥを安定化させた。ＩｇＧ４－Ｆｃは、３つの部位、ヒンジ領域内のＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＣＨ２領域内のＮ２９７Ｑにおいて突然変異されており、そのＦｃ領域中の置換は、Ｆｃ受容体結合を回避することを目的とした。全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。図１７Ａに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅにおいて提供されている。図１７Ｂに示されるように、可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を、免疫細胞、例えばＮＫ細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｂに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｆ、ｇ、ｈおよびｉにおいて提供されている。図１７Ｃに示されるように、受容体複合体を有する可溶性ＩＬ－１５（ＳＩＬ１５Ｃ）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変をＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｃに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｊ、ｋ、ｌおよびｍにおいて提供されている。図１７Ｄに示されるように、細胞膜上に結合したオンボードサイトカイン（ＩＬ－１５）（ｍｂＩＬ－１５）をＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインおよび自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変と共にＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｄに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｎ、ｏ、ｐおよびｑにおいて提供されている。図１７Ｅに示されるように、細胞膜上に結合したオンボードサイトカイン（ＩＬ－２１）（ｍｂＩＬ－２１）をＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインおよび自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変と共にＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｅに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕにおいて提供されている。図１７Ｆは、人工細胞系の生成のために使用された腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ならびに二重ＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡレトロウイルスベクターのダイアグラフを提供する。この研究において使用されたＢＣＭＡタンパク質配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０２２２３（ＴＮＲ１７＿ＨＵＭＡＮ）であり、ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＮＺＤ１（ＧＰＣ５Ｄ＿ＨＵＭＡＮ）であった。全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。図１７Ｆに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｖ、ｗ、およびｘにおいて提供されている。 図１７Ａ～１７Ｆは、この研究において使用されたＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲおよび対照（配列番号９として開示される「（Ｇ４Ｓ）３」）のダイアグラフ（図１７Ａ～１７Ｅ）を、人工細胞系の生成のために使用された腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ならびに二重ＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡレトロウイルスベクターのダイアグラフ（図１７Ｆ）と共に提供する。抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖはマウス抗ヒトＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ ５．３（ＷＯ ２０１５／１５８６７１ Ａ１）から抽出され、ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥは全長ヒトソース：ヒト抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ－２．０（ＵＳ２０１１０１５０８７０Ａ１）、およびヒト抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体ＧＣ５Ｂ５９６（米国特許出願第２０１８００３７６５１号）であった。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した。３部位突然変異型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを使用して、分泌されるＢｉＴＥ／ＢｉＫＥを安定化させた。ＩｇＧ４－Ｆｃは、３つの部位、ヒンジ領域内のＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＣＨ２領域内のＮ２９７Ｑにおいて突然変異されており、そのＦｃ領域中の置換は、Ｆｃ受容体結合を回避することを目的とした。全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。図１７Ａに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅにおいて提供されている。図１７Ｂに示されるように、可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を、免疫細胞、例えばＮＫ細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｂに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｆ、ｇ、ｈおよびｉにおいて提供されている。図１７Ｃに示されるように、受容体複合体を有する可溶性ＩＬ－１５（ＳＩＬ１５Ｃ）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変をＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｃに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｊ、ｋ、ｌおよびｍにおいて提供されている。図１７Ｄに示されるように、細胞膜上に結合したオンボードサイトカイン（ＩＬ－１５）（ｍｂＩＬ－１５）をＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインおよび自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変と共にＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｄに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｎ、ｏ、ｐおよびｑにおいて提供されている。図１７Ｅに示されるように、細胞膜上に結合したオンボードサイトカイン（ＩＬ－２１）（ｍｂＩＬ－２１）をＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインおよび自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変と共にＣＡＲ、例えばＮＫ細胞または他の免疫細胞における使用のためのＣＡＲについて導入した。図１７Ｅに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｒ、ｓ、ｔおよびｕにおいて提供されている。図１７Ｆは、人工細胞系の生成のために使用された腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ならびに二重ＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡレトロウイルスベクターのダイアグラフを提供する。この研究において使用されたＢＣＭＡタンパク質配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０２２２３（ＴＮＲ１７＿ＨＵＭＡＮ）であり、ＧＰＲＣ５Ｄタンパク質はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＮＺＤ１（ＧＰＣ５Ｄ＿ＨＵＭＡＮ）であった。全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。図１７Ｆに示されている構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表２ａ、ｖ、ｗ、およびｘにおいて提供されている。
図１８は、ＥＬＩＳＡにより形質導入されたＮＫ細胞から分泌された二特異性抗体の分泌を決定するデータを示す。データは、４人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。示されているＥＬＩＳＡ分析は、オンボードサイトカイン改変ありまたはなしの５つ全ての群のＣＡＲ－ＮＫにおける形質導入されたＢｉＴＥ／ＢＩＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＮＫ細胞培養物の濃縮されていない上清からのＢｉＴＥ／ＢｉＫＥを検出した。各群内のバーは、左から右に、従来型ｍＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＧＮ１－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ｍＢＣＭＡ－ＣＡＲ、ＮＧ２－ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ ｍＢＣＭＡ－ＣＡＲ、エンプティ対照－ｔＣＤ１９および非形質導入細胞を使用することを介して得られたデータを表す。
図１９Ａ～１９Ｃは、この研究においてＲＴＣＡ（リアルタイム細胞傷害性アッセイ）のために使用されたエフェクター細胞（例えばＣＡＲ発現免疫細胞）および不均一腫瘍モデルを示す。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＭＰ ｓｙｓｔｅｍの機器およびＲＴＣＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐｒｏ ２．３（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してＲＴＣＡを行い、分析した。ＲＴＣＡにおいて使用されたエフェクター細胞群および形質導入評価は図１９Ａ～１９Ｂに図示されている。人工的な過剰発現ＧＰＲＣ５Ｄおよび二重ＢＣＭＡ／ＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子を、改変されたレトロウイルス遺伝子送達システムを使用して２９３Ｔに形質導入してこれを標的細胞とし、これは本明細書において標的とも称される。２９３Ｔ－ＧＰＲＣ５Ｄの２つの部分（７６．７４％）および２９３Ｔ－ＧＰＲＣ５Ｄ／ＢＣＭＡの３つの部分（７０．６２％の二重陽性、および２１．９７％のＢＣＭＡ＋）の混合物と共に、出願人は、多発性骨髄腫の腫瘍環境を模倣するための不均一腫瘍モデルを生成した（図１９Ｃ）。全部で５０００個の標的をＥ－Ｐｌａｔｅ ９６ ＰＥＴ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＥＦ ３００６００９１０）上に播種し、３７度で５％のＣＯ２と共に約２０時間インキュベートし、次に全部で５００個のエフェクターをウェルに標的と共に加えた。この研究において使用されたエフェクター（本明細書に開示されているベクターを用いて形質導入された免疫細胞、例えばＮＫ細胞）と標的（ＧＰＲＣ５ＤまたはＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄの両方で感染させた２９３ Ｔ細胞）の比は１：１０であった。 図１９Ａ～１９Ｃは、この研究においてＲＴＣＡ（リアルタイム細胞傷害性アッセイ）のために使用されたエフェクター細胞（例えばＣＡＲ発現免疫細胞）および不均一腫瘍モデルを示す。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＭＰ ｓｙｓｔｅｍの機器およびＲＴＣＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐｒｏ ２．３（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してＲＴＣＡを行い、分析した。ＲＴＣＡにおいて使用されたエフェクター細胞群および形質導入評価は図１９Ａ～１９Ｂに図示されている。人工的な過剰発現ＧＰＲＣ５Ｄおよび二重ＢＣＭＡ／ＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子を、改変されたレトロウイルス遺伝子送達システムを使用して２９３Ｔに形質導入してこれを標的細胞とし、これは本明細書において標的とも称される。２９３Ｔ－ＧＰＲＣ５Ｄの２つの部分（７６．７４％）および２９３Ｔ－ＧＰＲＣ５Ｄ／ＢＣＭＡの３つの部分（７０．６２％の二重陽性、および２１．９７％のＢＣＭＡ＋）の混合物と共に、出願人は、多発性骨髄腫の腫瘍環境を模倣するための不均一腫瘍モデルを生成した（図１９Ｃ）。全部で５０００個の標的をＥ－Ｐｌａｔｅ ９６ ＰＥＴ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＥＦ ３００６００９１０）上に播種し、３７度で５％のＣＯ２と共に約２０時間インキュベートし、次に全部で５００個のエフェクターをウェルに標的と共に加えた。この研究において使用されたエフェクター（本明細書に開示されているベクターを用いて形質導入された免疫細胞、例えばＮＫ細胞）と標的（ＧＰＲＣ５ＤまたはＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄの両方で感染させた２９３ Ｔ細胞）の比は１：１０であった。 図１９Ａ～１９Ｃは、この研究においてＲＴＣＡ（リアルタイム細胞傷害性アッセイ）のために使用されたエフェクター細胞（例えばＣＡＲ発現免疫細胞）および不均一腫瘍モデルを示す。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＭＰ ｓｙｓｔｅｍの機器およびＲＴＣＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐｒｏ ２．３（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してＲＴＣＡを行い、分析した。ＲＴＣＡにおいて使用されたエフェクター細胞群および形質導入評価は図１９Ａ～１９Ｂに図示されている。人工的な過剰発現ＧＰＲＣ５Ｄおよび二重ＢＣＭＡ／ＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子を、改変されたレトロウイルス遺伝子送達システムを使用して２９３Ｔに形質導入してこれを標的細胞とし、これは本明細書において標的とも称される。２９３Ｔ－ＧＰＲＣ５Ｄの２つの部分（７６．７４％）および２９３Ｔ－ＧＰＲＣ５Ｄ／ＢＣＭＡの３つの部分（７０．６２％の二重陽性、および２１．９７％のＢＣＭＡ＋）の混合物と共に、出願人は、多発性骨髄腫の腫瘍環境を模倣するための不均一腫瘍モデルを生成した（図１９Ｃ）。全部で５０００個の標的をＥ－Ｐｌａｔｅ ９６ ＰＥＴ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＥＦ ３００６００９１０）上に播種し、３７度で５％のＣＯ２と共に約２０時間インキュベートし、次に全部で５００個のエフェクターをウェルに標的と共に加えた。この研究において使用されたエフェクター（本明細書に開示されているベクターを用いて形質導入された免疫細胞、例えばＮＫ細胞）と標的（ＧＰＲＣ５ＤまたはＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄの両方で感染させた２９３ Ｔ細胞）の比は１：１０であった。
図２０は、免疫細胞、例えばＮＫ細胞中で発現された可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を有するＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＣＡＲについてのＲＴＣＡアッセイを提供する。データは、２人の独立したドナーからの細胞溶解％として示されている。細胞を３７℃の加湿された５％のＣＯ２雰囲気中でリアルタイムでモニターした。細胞インデックス（ＣＩ）データを１５分毎に１２０時間記録した。選択された正規化時点は播種後２０時間であった。標的単独群ｇｅｔについて最大細胞インデックスに達するまでの時間は約８０時間であったため、細胞溶解％をエフェクターの追加と共に約６０時間において算出し、比較した。
図２１は、免疫細胞、例えばＮＫ細胞中で発現された可溶性ＩＬ－１５およびＩＬ－１５受容体複合体（ＳＩＬ１５Ｃ）ならびに自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を有するＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＣＡＲについてのＲＴＣＡアッセイを提供する。データは、２人の独立したドナーからの細胞溶解％として示されている。細胞を３７℃の加湿された５％のＣＯ２雰囲気中でリアルタイムでモニターした。細胞インデックス（ＣＩ）データを１５分毎に１２０時間記録した。選択された正規化時点は播種後２０時間であった。標的単独群ｇｅｔについて最大細胞インデックスに達するまでの時間は約８０時間であったため、細胞溶解％をエフェクターの追加と共に約６０時間において算出し、比較した。
図２２は、免疫細胞、例えばＮＫ細胞中で発現された膜結合ＩＬ－１５および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を有するＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＣＡＲについてのＲＴＣＡアッセイを提供する。データは、２人の独立したドナーからの細胞溶解％として示されている。細胞を３７℃の加湿された５％のＣＯ２雰囲気中でリアルタイムでモニターした。細胞インデックス（ＣＩ）データを１５分毎に１２０時間記録した。選択された正規化時点は播種後２０時間であった。標的単独群ｇｅｔについて最大細胞インデックスに達するまでの時間は約８０時間であったため、細胞溶解％をエフェクターの追加と共に約６０時間において算出し、比較した。
図２３は、免疫細胞、例えばＮＫ細胞中で発現された膜結合ＩＬ－２１および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を有するＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＣＡＲについてのＲＴＣＡアッセイを提供する。データは、２人の独立したドナーからの細胞溶解％として示されている。細胞を３７℃の加湿された５％のＣＯ２雰囲気中でリアルタイムでモニターした。細胞インデックス（ＣＩ）データを１５分毎に１２０時間記録した。選択された正規化時点は播種後２０時間であった。標的単独群ｇｅｔについて最大細胞インデックスに達するまでの時間は約８０時間であったため、細胞溶解％をエフェクターの追加と共に約６０時間において算出し、比較した。
図２４は、免疫細胞、例えばＮＫ細胞中で発現された改変を有しないＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＣＡＲについてのＲＴＣＡアッセイを提供する。データは、２人の独立したドナーからの細胞溶解％として示されている。細胞を３７℃の加湿された５％のＣＯ２雰囲気中でリアルタイムでモニターした。細胞インデックス（ＣＩ）データを１５分毎に１２０時間記録した。選択された正規化時点は播種後２０時間であった。標的単独群ｇｅｔについて最大細胞インデックスに達するまでの時間は約８０時間であったため、細胞溶解％をエフェクターの追加と共に約６０時間において算出し、比較した。
図２５は、ＲＴＣＡにより決定された従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲと比較した免疫細胞、例えばＮＫ細胞中で発現されたＮＫＧ２ＤおよびＧＰＲＣ５Ｄ ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲの増加した細胞溶解を示す。データは、６０時間の反応における腫瘍溶解としての２人の独立したドナーからの平均±ＳＤとして示されている。
図２６Ａ～２６Ｃは、可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ＲＱＲ８改変レトロウイルスベクターを有するエンプティ対照（図２６Ａ）、抗ＢＣＭＡ従来型ＣＡＲ－ＮＫ（図２６Ｂ）ならびに２つの抗ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ ＢｉＫＥ ＣＡＲ（図２６Ｃ）の概略図表現を提供する。図２６Ｃに示されるように、ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物がこの研究において使用された。可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ＲＱＲ８改変をＣＡＲ－ＮＫに導入した。＊：ＩＬ－２シグナルペプチドまたはアズロシジンシグナルペプチドを有する２種類のＢｉＫＥの有効性を、ウイルス産生の実現可能性、冷却血液由来ＮＫ細胞の形質導入、ＢｉＫＥの分泌、および特異的な腫瘍殺滅能力に基づいて調べた。
図２７は、高度に小型の選別－自殺レポーターＲＱＲ８およびＢｉＫＥ分泌のための強いアズロシジンシグナルペプチドを有する構築物「Ｔｗｏ ｉｎ Ｏｎｅ」の最適化を示す。ＲＱＲ８は、選択／追跡および自殺遺伝子の両方のための二重の役割のレポーターであり、３３６ａａのｔＥＧＦＲと比較して高度に小型のサイズ１３６ａａを有する。アズロシジンシグナルペプチドは、可溶性ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ分泌のための強いシグナルペプチドとして他の構築物において証拠が証明されており、ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥのための以前のＩＬ ２シグナルペプチドを置き換えるために使用される。これらの改変の目標は、導入遺伝子発現および抗腫瘍の有効性を改善することである。
図２８は、ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲならびに対照、例えばＰ６７（ＰＣＩＲ－ｍＢＣＭＡ－Ａｚ－ＳＩＬ－１５－ＲＱＲ８）、Ｐ６１（ＰＣＩＲ－ＧＮ１－ ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－Ａｚ－ＳＩＬ－１５－ＲＱＲ８）、Ｐ６２（ＰＣＩＲ－ＮＧ２－ ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－Ａｚ－ＳＩＬ－１５－ＲＱＲ８）、Ｐ７２（ＰＣＩＲ－ＮＧ２－ ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ－Ａｚ－ＳＩＬ－１５－ＲＱＲ８）、およびＰ６８（ＰＣＩＲ－ｔＤＣ１９－Ａｚ－ＳＩＬ－１５－ＲＱＲ８）のダイアグラフを提供する。構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、表３において提供されている。配列番号９として開示される「（Ｇ４Ｓ）３」。
図２９Ａ～２９Ｂは、「Ｔｗｏ ｉｎ Ｏｎｅ」ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＮＫ分泌ＢｉＫＥの導入遺伝子発現の評価を提供する。それは、冷却血液由来ＮＫ細胞の「Ｔｗｏ ｉｎ Ｏｎｅ」ウイルス産生および形質導入の実現可能性を提供する。４人のドナーからのＮＫ細胞（ＵＣＢＶ－０３３、ＵＣＢＶ－０３４、ＵＣＯＳＵ－０１８およびＵＣＳＣ－７１１）を、改変されたＩＲＲ Ｋ５６２フィーダー細胞と１：２の比で、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含むＳＣＧＭ培地を使用して共培養した。ＮＫ細胞に、可溶性ＩＬ－１５および選別／自殺マーカーＲＱＲ８を発現するレトロウイルスを用いて６日目に３のＭＯＩで形質導入した。図２９Ａは、フロー抗体ＱＢＥＮＤ／１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．ＦＡＢ７２２７Ａ）と共に抗ヒトＣＤ３４を使用することにより評価された６日目におけるＮＫ細胞の形質導入効率の代表的なフローダイアグラムを提供する。図２９Ｂは、平均±ＳＥＭと共に陽性ＲＱＲ８集団％として示されるデータを示す。
図３０Ａ～３０Ｃは、ＩＬ２ ＳＰ ＧＰＲＣ５Ｄ－ＮＫＧ２Ｄ ＢｉＫＥの分泌を伴う「Ｔｗｏ ｉｎ Ｏｎｅ」ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＮＫのフローサイトメトリーを用いた腫瘍殺滅の有効性を提供する。それは、ＭＭ細胞系ＭＭ１．Ｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ長期殺滅のための二特異性抗体ＮＫＧ２Ｄ－ＣＳ１またはＮＫＧ２Ｄ－ＧＰＲＣ５Ｄの分泌でＢＣＭＡを標的とすることの有効性を提供する。図３０Ａは、ＣＡＲ－ＮＫ研究において使用されたＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙの試料統計を提供する。フローサイトメーターＮｏｖｏＣｙｔｅ ４５１１８１２３１０２８およびソフトウェアＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓ １．５．１（Ａｃｅａ）をデータ収集および分析のために使用した。等しいアップデート体積１００μｌの試料を収集した。多発性骨髄腫細胞系、ＭＭ１．ＳにＬｕｃ－ＺｓＧｒｅｅｎプラスミドを前もって感染させ、パラメーターを使用して標的細胞からエフェクターを識別した。ＤＡＰＩ陰性生シングレットからのゲートＱ４－４（ＺｓＧｒｅｅｎ陽性、赤色で標識している）の細胞計数を使用して生ＭＭ細胞を評価した。特異的溶解のパーセンテージ（％）は、式：特異的溶解％＝１００×（標的のみ－混合物中の標的）／標的のみを使用して算出される。図３０Ｂは、ＭＭ細胞系、ＭＭ１．Ｓ上に発現された腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄを示す。図３０Ｃは、エフェクターＣＡＲ－ＮＫ細胞およびそれらのモックエンプティベクター対照（図２７）を多発性骨髄腫細胞系、ＭＭ１．Ｓと、形質導入されたＣＡＲ－ＮＫ：腫瘍の比１：１０で９６時間共培養したことを示す。データは、腫瘍溶解としての４人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。
図３１は、ＩＬ２ ＳＰ ＧＰＲＣ５Ｄ－ＮＫＧ２Ｄ ＢｉＫＥの分泌を伴う「Ｔｗｏ ｉｎ Ｏｎｅ」ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＮＫのリアルタイム細胞傷害性アッセイ（ＲＴＣＡ）を用いた腫瘍殺滅の有効性を示す。ＲＴＣＡアッセイを、可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ＲＱＲ８改変を有するＢｉＫＥ－ＣＡＲ－ＮＫについて行った。形質導入されたＣＡＲ－ＮＫ：腫瘍の比は１：５であり、細胞を３７℃の加湿された５％のＣＯ２雰囲気中でリアルタイムでモニターした。細胞インデックス（ＣＩ）データを１５分毎に１２０時間記録した。選択された正規化時点は播種後３０時間であった。標的単独群ｇｅｔについて最大細胞インデックスに達するまでの時間は約８０時間であったため、細胞溶解％をエフェクターの追加と共に約６０時間において算出し、比較した。
図３２は、「二特異性抗体」との「ＣＡＲ－ＮＫ」の組合せは、殺滅アッセイにおいて「ＣＡＲ－ＮＫ」ベースの生成物よりも性能が優れていることを示す。ＲＴＣＡ（リアルタイム細胞溶解アッセイ）は、「ＣＡＲ－ＮＫ」ベースの生成物（従来型の単一のＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＮＫ、ＧＰＲＣ５Ｄ－ＣＡＲ－ＮＫ、ならびにタンデムＢＣＭＡ－ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－ＮＫ）と比較して、ＢｉＫＥ－ＧＰＲＣ５Ｄ－ＮＫＧ２Ｄ（ＧＮ１）またはＢｉＫＥ－ＮＫＧ２Ｄ－ＧＰＲＣ５Ｄ（ＮＧ２）と組み合わせた生成物「ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＮＫ」の増強された殺滅有効性があることを実証した。形質導入されていないＮＫ細胞およびエンプティベクターモック感染は、両方の生成物のための陰性対照として役立った。強制的なＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡ抗原発現を伴うＨＴ１０８０細胞系を標的として使用し、形質導入されたＮＫ対腫瘍標的の比は各群において１：１０であった（全ＮＫ対腫瘍は１：２であった）。データは、エフェクターの追加と共に反応４４時間における腫瘍溶解としての２人の独立したドナーからの平均±ＳＤとして示されている。
図３３Ａ～３３Ｂは、「二特異性抗体」との「ＣＡＲ－ＮＫ」の組合せのｉｎ ｖｉｔｒｏ殺滅活性の有効性を示す。ＲＴＣＡ（リアルタイム細胞溶解アッセイ）は、「ＣＡＲ－ＮＫ」単独生成物と比較して、戦略１および２の両方の生成物「ＢｉＫＥ－ＧＰＲＣ５Ｄ－ＮＫＧ２Ｄ（ＧＮ１）またはＢｉＫＥ－ＮＫＧ２Ｄ－ＧＰＲＣ５Ｄ（ＮＧ２）と組み合わせたＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＮＫ」について増強された殺滅有効性があることを実証した。形質導入されていないＮＫ細胞およびエンプティベクターモック感染は両方の生成物のための陰性対照として役立った。強制的なＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡ抗原発現を伴うＨＴ１０８０細胞系を標的として使用し、形質導入されたＮＫ対腫瘍標的の比は各群において１：１０であった（全ＮＫ対腫瘍は１：２であった）。データは、エフェクターの追加と共に反応４４時間における腫瘍溶解としての３人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。対応のあるＴ検定を使用して他の群との従来型ＢＣＭＡ群の差異を評価している。図３３Ａは戦略１「Ｔｗｏ ｉｎ Ｏｎｅ」を示し、図３３Ｂは戦略２「ウイルスミックス」を示す。
図３４Ａ～３４Ｂは、「二特異性抗体」との「ＣＡＲ－ＮＫ」の組合せの２つの戦略を示す。元々の戦略１「可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変レトロウイルスベクターを有する抗ＢＣＭＡ従来型ＣＡＲ－ＮＫならびに２つの抗ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ ＢｉＫＥ ＣＡＲ」ならびに戦略２「ウイルス混合物」の概略図表現が提供された。ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物がこの研究において使用された。可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変をＣＡＲ－ＮＫについて導入した。図３４Ａは戦略１「Ｔｗｏ ｉｎ Ｏｎｅ」を示し、図３４Ｂはウイルス混合物戦略２「Ｏｎｅ ｐｌｕｓ Ｏｎｅ」を示す。
図３５は、高度に小型の選別－自殺レポーターＲＱＲ８およびＢｉＫＥ分泌のための強いアズロシジンシグナルペプチドを有する構築物「Ｔｗｏ ｉｎ Ｏｎｅ」の最適化を示す。元々の構築物「Ｔｗｏ ｉｎ Ｏｎｅ」は、高度に小型の選別－自殺レポーターＲＱＲ８およびＢｉＫＥのための強いアズロシジンシグナルペプチドを用いて最適化された。ＲＱＲ８は、選択／追跡および自殺遺伝子の両方のための二重の役割のレポーターであり、３３６ａａのｔＥＧＦＲと比較して高度に小型のサイズ１３６ａａを有する。アズロシジンシグナルペプチドは、可溶性ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ分泌のための強いシグナルペプチドとして他の構築物において証拠が証明されており、ＢｉＫＥのための以前のＩＬ ２シグナルペプチドを置き換えるために使用される。これらの改変の目標は、導入遺伝子発現および抗腫瘍の有効性を改善することである。
図３６Ａ～３６Ｄは、ＣＡＲ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を提供する。図３６Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏ実験モデルのスキームならびに標識されている異なる療法で処置されたマウス（対照として役立つ食塩水を注射されたマウス、対照として役立つエンプティ対照をトランスフェクト／形質導入されたＴ細胞を注射されたマウス；二特異性抗体発現Ｔ細胞を注射されたマウス、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を注射されたマウス、逐次的に二特異性抗体発現Ｔ細胞およびＣＡＲ発現Ｔ細胞を注射されたマウス、ならびにＣＡＲおよび二特異性抗体発現Ｔ細胞を注射されたマウスを含む）の、標識されている様々な時点における腫瘍負荷を示す代表的な画像を提供する。各時点は、２つの観点から示されており、より大きい日の数は腫瘍移植後何日目かを示し、より小さい日の数は処置後何日目かを示す。図３６Ｂは、処置されたマウスから単離された試料中の操作されたＴ細胞の例示されるフローサイトメトリープロットを示す。図３６Ｃは、処置されたマウスから単離された試料における全ＰＢＬ細胞数、Ｆａｂ＋パーセンテージおよびＦａｂ＋細胞数をプロットしている。図３６Ｄは、標識されている異なる療法で処置されたマウスの生存曲線を提供する。 図３６Ａ～３６Ｄは、ＣＡＲ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を提供する。図３６Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏ実験モデルのスキームならびに標識されている異なる療法で処置されたマウス（対照として役立つ食塩水を注射されたマウス、対照として役立つエンプティ対照をトランスフェクト／形質導入されたＴ細胞を注射されたマウス；二特異性抗体発現Ｔ細胞を注射されたマウス、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を注射されたマウス、逐次的に二特異性抗体発現Ｔ細胞およびＣＡＲ発現Ｔ細胞を注射されたマウス、ならびにＣＡＲおよび二特異性抗体発現Ｔ細胞を注射されたマウスを含む）の、標識されている様々な時点における腫瘍負荷を示す代表的な画像を提供する。各時点は、２つの観点から示されており、より大きい日の数は腫瘍移植後何日目かを示し、より小さい日の数は処置後何日目かを示す。図３６Ｂは、処置されたマウスから単離された試料中の操作されたＴ細胞の例示されるフローサイトメトリープロットを示す。図３６Ｃは、処置されたマウスから単離された試料における全ＰＢＬ細胞数、Ｆａｂ＋パーセンテージおよびＦａｂ＋細胞数をプロットしている。図３６Ｄは、標識されている異なる療法で処置されたマウスの生存曲線を提供する。 図３６Ａ～３６Ｄは、ＣＡＲ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を提供する。図３６Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏ実験モデルのスキームならびに標識されている異なる療法で処置されたマウス（対照として役立つ食塩水を注射されたマウス、対照として役立つエンプティ対照をトランスフェクト／形質導入されたＴ細胞を注射されたマウス；二特異性抗体発現Ｔ細胞を注射されたマウス、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を注射されたマウス、逐次的に二特異性抗体発現Ｔ細胞およびＣＡＲ発現Ｔ細胞を注射されたマウス、ならびにＣＡＲおよび二特異性抗体発現Ｔ細胞を注射されたマウスを含む）の、標識されている様々な時点における腫瘍負荷を示す代表的な画像を提供する。各時点は、２つの観点から示されており、より大きい日の数は腫瘍移植後何日目かを示し、より小さい日の数は処置後何日目かを示す。図３６Ｂは、処置されたマウスから単離された試料中の操作されたＴ細胞の例示されるフローサイトメトリープロットを示す。図３６Ｃは、処置されたマウスから単離された試料における全ＰＢＬ細胞数、Ｆａｂ＋パーセンテージおよびＦａｂ＋細胞数をプロットしている。図３６Ｄは、標識されている異なる療法で処置されたマウスの生存曲線を提供する。
図３７Ａ～３７Ｃは、可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ＲＱＲ８改変レトロウイルスベクターを有するエンプティ対照（図３７Ａ）、抗ＢＣＭＡ従来型ＣＡＲ（図３７Ｂ）ならびに２つの抗ＮＫＧ２ＤおよびＧＰＲＣ５Ｄ ＢｉＫＥ ＣＡＲ（図３７Ｃ）の概略図表現を提供する。ＢｉＴＥ／ＢｉＫＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖの差異を有する２つのＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した。可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ＲＱＲ８改変をＣＡＲ－ＮＫに導入した。
図３８は、ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲおよび対照（配列番号９として開示される「（Ｇ４Ｓ）３」）のダイアグラフを提供する。４つ全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。上記の構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列を表３に提供した。Ｐ６８：エンプティ対照－切断型ＣＤ１９－ＳＩＬ－１５－ＲＱＲ８；Ｐ６７：従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＳＩＬ－１５－ＲＱＲ８；Ｐ６１：ＧＰＲＣ５Ｄ－ＮＫＧ２Ｄ ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＮＫ；Ｐ６２：ＮＫＧ２Ｄ－ＧＰＲＣ５Ｄ ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＮＫ。
図３９Ａ～３９Ｂは、細胞傷害性の前のフローサイトメトリー分析によるＢＣＭＡ ＣＡＲ ＮＫ、ならびにＮＫＧ２ＤおよびＧＰＲＣ５Ｄ ＢｉＫＥの分泌を伴うＢＣＭＡ ＣＡＲ ＮＫの導入遺伝子発現の決定を示す。ヒトＣＤ３４抗体（ＱＢＥｎｄ／１０）（アロフィコシアニン）（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＬＬＣ、＃ＦＡＢ７２２７Ａ）に対するフロー抗体を使用して、レポートされる遺伝子ＲＱＲ８を検出した。図３９Ａは、ＮｏｖｏＣｙｔｅ ３００５ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ分析が４人のドナーからのガンマレトロウイルスベクターＰＣＩＲ／ＢａＥＶＴＲ操作型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＮＫについての形質導入効率を実証したことを示す。図３９Ｂは、平均±ＳＥＭとしての４人の独立したドナーからのＲＱＲ８陽性集団の平均パーセンテージとしてのデータを示す。 図３９Ａ～３９Ｂは、細胞傷害性の前のフローサイトメトリー分析によるＢＣＭＡ ＣＡＲ ＮＫ、ならびにＮＫＧ２ＤおよびＧＰＲＣ５Ｄ ＢｉＫＥの分泌を伴うＢＣＭＡ ＣＡＲ ＮＫの導入遺伝子発現の決定を示す。ヒトＣＤ３４抗体（ＱＢＥｎｄ／１０）（アロフィコシアニン）（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＬＬＣ、＃ＦＡＢ７２２７Ａ）に対するフロー抗体を使用して、レポートされる遺伝子ＲＱＲ８を検出した。図３９Ａは、ＮｏｖｏＣｙｔｅ ３００５ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ分析が４人のドナーからのガンマレトロウイルスベクターＰＣＩＲ／ＢａＥＶＴＲ操作型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＮＫについての形質導入効率を実証したことを示す。図３９Ｂは、平均±ＳＥＭとしての４人の独立したドナーからのＲＱＲ８陽性集団の平均パーセンテージとしてのデータを示す。
図４０Ａ～４０Ｂは、ＥＬＩＳＡによるＮＫ細胞から分泌された二特異性抗体の発現および濃度の決定を示す。形質導入されたＮＫ細胞から分泌された可溶性ＩＬ－１５およびＢｉＫＥの分泌をＥＬＩＳＡにより決定した。０．５～１×１０６個の形質導入されたＮＫ細胞（図３９）を無血清培地中に播種し、７２時間培養した。上清をその後に収集し、遠心分離し、ＩＬ－１５予備被覆ＥＬＩＳＡプレート（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｓ１５００）およびＮＫＧ２Ｄ融合タンパク質被覆プレートを備える自社開発したＢｉＫＥ検出ＥＬＩＳＡに直ちに加えた。ＥＬＩＳＡ分析は、各群において検出可能な可溶性ＩＬ－１５があること（図４０Ａ）および培養７２時間において５つ全ての群において形質導入されたＢＩＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＮＫ細胞培養物の濃縮されていない上清からのＩＬ２ ＳＰ ＢｉＫＥがあること（図４０Ｂ）を示した。ここに示すデータは、平均±ＳＤとしての４人の独立したドナーからの平均濃度としてのものであった。 図４０Ａ～４０Ｂは、ＥＬＩＳＡによるＮＫ細胞から分泌された二特異性抗体の発現および濃度の決定を示す。形質導入されたＮＫ細胞から分泌された可溶性ＩＬ－１５およびＢｉＫＥの分泌をＥＬＩＳＡにより決定した。０．５～１×１０６個の形質導入されたＮＫ細胞（図３９）を無血清培地中に播種し、７２時間培養した。上清をその後に収集し、遠心分離し、ＩＬ－１５予備被覆ＥＬＩＳＡプレート（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｓ１５００）およびＮＫＧ２Ｄ融合タンパク質被覆プレートを備える自社開発したＢｉＫＥ検出ＥＬＩＳＡに直ちに加えた。ＥＬＩＳＡ分析は、各群において検出可能な可溶性ＩＬ－１５があること（図４０Ａ）および培養７２時間において５つ全ての群において形質導入されたＢＩＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＮＫ細胞培養物の濃縮されていない上清からのＩＬ２ ＳＰ ＢｉＫＥがあること（図４０Ｂ）を示した。ここに示すデータは、平均±ＳＤとしての４人の独立したドナーからの平均濃度としてのものであった。
図４１は、独立したアッセイを用いて示されたＣＡＲ－ＮＫの異なる改変の群の間でモニターされたＲＴＣＡ（リアルタイム細胞傷害性アッセイ）評価および細胞溶解％を示す。ＲＴＣＡアッセイを、可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）およびレポート遺伝子ＲＱＲ８改変を有するＢｉＫＥ－ＣＡＲ－ＮＫについて行った。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＭＰ ｓｙｓｔｅｍの機器およびＲＴＣＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐｒｏ ２．３（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してＲＴＣＡを行い、分析した。ＲＴＣＡにおいて使用されたエフェクター細胞群および形質導入評価を図３９に図示し、臍帯血細胞からの初代ＮＫ細胞をこの研究において使用した。ＨＴ１０８０上のＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡ遺伝子の強制的な発現をＲＴＣＡアッセイにおける腫瘍抗原標的として使用した。全部で５０００個の標的をＥ－Ｐｌａｔｅ ９６ ＰＥＴ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＥＦ ３００６００９１０）上に播種し、３７度で５％のＣＯ２と共に約２３時間インキュベートし、次に全部で５０００個のエフェクターをウェルに標的と共に加えた。等しい１２５０個の形質導入されたＮＫを、導入遺伝子発現にしたがって同じドナーからの形質導入されていないＮＫと調整することにより各群において使用した。この研究において使用された形質導入されたＮＫおよび標的の比は１：４であった。細胞インデックス（ＣＩ）データを１５分毎に１２０時間記録した。標的単独群ｇｅｔについて最大細胞インデックスに達するまでの時間は約５６時間であったため、細胞溶解％をエフェクターの追加と共に約２６時間において算出し、比較した。データは、他の群と比較してＧＮ１ ＢｉＫＥ ＢＣＭＡ ＣＡＲ ＮＫの増強された腫瘍殺滅有効性があることを実証した。
図４２Ａ～４２Ｂは、フローサイトメトリーによる長期ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性にアクセスしたデータを提供する。ＭＭ細胞系ｉｎ ｖｉｔｒｏ長期殺滅についての二特異性抗体ＧＰＲＣ５Ｄ－ＮＫＧ２Ｄの分泌を伴うＢＣＭＡの標的化の有効性を評価した。図４２Ａは、フロー抗体抗ヒトＢＣＭＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ ＃３５７５０６）およびＧＰＲＣ５Ｄ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ６３００Ｐ－１００）をそれらのアイソタイプ対照と共に使用することにより評価された多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系、ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２、Ｈ９２９およびＲＰＭＩ８２２６上のＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄ表面発現のダイアグラムを提供する。データは、ＭＭ細胞の表面上にブロードなＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄがあることを実証した。図４２Ｂは、エフェクターＣＡＲ－ＮＫ細胞およびそれらのモックエンプティベクター（Ｔｃｄ１９）対照、ならびに形質導入されていないＮＫを４つの多発性骨髄腫細胞系、ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２、Ｈ９２９、およびＲＰＭＩ８２２６と、形質導入されたＣＡＲ－ＮＫ：腫瘍の比１：８（全ＮＫ：腫瘍 １：２）で９６時間共培養したことを提供する。データは、腫瘍溶解としての４人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。両側スチューデントＴ検定を使用して２つの群の間の有意性を評価し、Ｐ値についてのインデックスは、＊ ｐ＜０．０５；＊＊ ｐ＜０．０１であった。従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＮＫ、およびその他と比較して分泌二特異性抗体ＧＰＲＣ５Ｄ－ＮＫＧ２Ｄ（ＧＮ１－ＢｉＫＥ）を伴うＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＮＫの劇的な腫瘍殺滅活性がある。 図４２Ａ～４２Ｂは、フローサイトメトリーによる長期ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性にアクセスしたデータを提供する。ＭＭ細胞系ｉｎ ｖｉｔｒｏ長期殺滅についての二特異性抗体ＧＰＲＣ５Ｄ－ＮＫＧ２Ｄの分泌を伴うＢＣＭＡの標的化の有効性を評価した。図４２Ａは、フロー抗体抗ヒトＢＣＭＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ ＃３５７５０６）およびＧＰＲＣ５Ｄ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ６３００Ｐ－１００）をそれらのアイソタイプ対照と共に使用することにより評価された多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系、ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２、Ｈ９２９およびＲＰＭＩ８２２６上のＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄ表面発現のダイアグラムを提供する。データは、ＭＭ細胞の表面上にブロードなＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄがあることを実証した。図４２Ｂは、エフェクターＣＡＲ－ＮＫ細胞およびそれらのモックエンプティベクター（Ｔｃｄ１９）対照、ならびに形質導入されていないＮＫを４つの多発性骨髄腫細胞系、ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２、Ｈ９２９、およびＲＰＭＩ８２２６と、形質導入されたＣＡＲ－ＮＫ：腫瘍の比１：８（全ＮＫ：腫瘍 １：２）で９６時間共培養したことを提供する。データは、腫瘍溶解としての４人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。両側スチューデントＴ検定を使用して２つの群の間の有意性を評価し、Ｐ値についてのインデックスは、＊ ｐ＜０．０５；＊＊ ｐ＜０．０１であった。従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＮＫ、およびその他と比較して分泌二特異性抗体ＧＰＲＣ５Ｄ－ＮＫＧ２Ｄ（ＧＮ１－ＢｉＫＥ）を伴うＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＮＫの劇的な腫瘍殺滅活性がある。
詳細な説明
理解されるように、セクションまたはサブセクションの見出しは、本明細書で使用される場合、文書構成の目的のために過ぎず、記載される主題を限定および／または分けるものとして解釈されるべきではない。
他に定義されなければ、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が本開示の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、デバイス、および材料がこれより記載される。本明細書において引用される全ての技術的および特許刊行物は参照により全体が本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいかなる記載も、本開示は先行開示を理由としてそのような開示に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。
本開示の実施は、他に示されなければ、当技術分野の技術的範囲内にある、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来技術を用いる。例えば、Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Herzenberg et al. eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)); Sohail (ed.) (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press)を参照されたい。
全ての数値的指定、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、範囲を含めて、おおよそのものであり、適切な場合に、０．１または１．０の増分により（＋）または（－）に変動される。常に明示的に述べられるわけではないが、全ての数値的指定は「約」という用語により先行されることが理解されるべきである。常に明示的に述べられるわけではないが、本明細書に記載される試薬は単に例示的なものであり、そのような均等物は当技術分野において公知であることもまた理解されるべきである。
「約」という用語は、測定可能な値、例えば量または濃度などを指す場合に本明細書で使用される場合、指定される量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらには０．１％の変動を包含することが意味される。
本明細書および請求項において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明確に規定しなければ、複数への言及を含む。例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」という用語は、これらの混合物を含む、複数の細胞を含む。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、組成物および方法は列挙される要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することが意図される。「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、記載される目的のために組合せに対して何らかの本質的な意義を持つ他の要素を除外することを意味するものとする。そのため、本明細書において定義されている要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量の夾雑物ならびに薬学的に許容される担体、例えばリン酸緩衝食塩水および保存剤などを除外しない。「からなる」は、他の成分の微量要素を超えるものおよび本開示の組成物を投与するための実質的な方法ステップまたは組成物を生成するかもしくは意図される結果を達成するための実質的なプロセスステップを除外することを意味するものとする。これらの移行句のそれぞれにより定義される実施形態は本開示の範囲内にある。
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載される状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、その結果、記載は、状況が起こる事例およびそれが起こらない事例を含む。
本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連付けられて列挙される項目の１つまたは複数の任意のおよび全ての可能な組合せ、ならびに選択肢（「または」）において解釈される場合の組合せの欠如を指し、かつ包含する。
「実質的に」または「本質的に」は、何らかの所与の量のほぼ全体または完全、例えば、９５％またはそれより高いを意味する。一部の実施形態では、「実質的に」または「本質的に」は、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％を意味する。
一部の実施形態では、成分の名称における「第１」、「第２」、「第３」、「第４」または類似した用語は、それらの名称においてある特定の同一性を共有する１つより多くの成分を区別および同定するために使用される。例えば、「第１のＴＡＡ」および「第２のＴＡＡ」は、２つのＴＡＡを区別するために使用される。
「単離された」という用語は、核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡに関して本明細書で使用される場合、高分子の天然の供給源において存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡからそれぞれ分離された分子を指す。「単離された核酸」という用語は、断片として天然に存在せず、天然の状態において見出されない核酸断片を含むことが意味される。「単離された」という用語はまた、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチド、タンパク質および／または宿主細胞を指すために本明細書で使用され、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することが意味される。他の実施形態では、「単離された」という用語は、構成成分、細胞およびその他、通常は天然において付随する細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片から分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、異なる表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離されている細胞である。当業者に明らかなように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、その天然に存在する対応物からそれを区別するために「単離」を要求しない。
一部の実施形態では、「操作された」または「組換え」という用語は、参照される種の天然に存在するタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、系統、野生型系統または親宿主系統において通常は見出されない少なくとも１つの改変を有することを指す。一部の実施形態では、「操作された」または「組換え」という用語は、ヒトの介入により合成されていることを指す。本明細書で使用される場合、「組換えタンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ技術により産生されたポリペプチドを指し、一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡは好適な発現ベクターに挿入され、発現ベクターは次いで、宿主細胞を形質転換して異種タンパク質を産生するために使用される。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそのアナログのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、既知または未知の、任意の機能を行うことができる。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えばメチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリヌクレオチドのアセンブリーの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって遮られ得る。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより、さらに改変され得る。用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。他に指定または要求されなければ、ポリヌクレオチドである本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態および二本鎖形態を構成することが既知であるかまたは予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれ両方を包含する。
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡである場合にチミンの代わりにウラシル（Ｕ）の特定の配列から構成される。そのため、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表現である。このアルファベット表現は、中央処理装置を有するコンピュータ中のデータベースに入力し、バイオインフォマティクス応用、例えば機能ゲノミクスおよび相同性検索のために使用され得る。
「ポリヌクレオチドの増幅」という表現は、方法、例えばＰＣＲ、ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）および増幅方法を含む。これらの方法は、当技術分野において公知であり、広く実施されている。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号ならびにInnis et al., 1990（ＰＣＲについて）；およびWu et al. (1989) Genomics 4:560-569（ＬＣＲについて）を参照されたい。一般に、ＰＣＲ手順は、（ｉ）ＤＮＡ試料（またはライブラリー）内の特定の遺伝子へのプライマーの配列特異的なハイブリダイゼーション、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼを使用する複数ラウンドのアニーリング、伸長、および変性を伴うその後の増幅、ならびに（ｉｉｉ）正確なサイズのバンドについてのＰＣＲ生成物のスクリーニングから構成される遺伝子増幅の方法を記載する。使用されるプライマーは、重合の開始を提供するための十分な長さおよび適切な配列のオリゴヌクレオチドであり、すなわち各プライマーは、増幅されるべきゲノム座位の各鎖に相補的であるように特異的に設計される。
ＰＣＲを実行するための試薬およびハードウェアは市販されている。特定の遺伝子領域から配列を増幅するために有用なプライマーは、好ましくは、標的領域またはその隣接領域中の配列に相補的であり、その配列に特異的にハイブリダイズする。増幅により生成される核酸配列は、直接的にシークエンシングされてもよい。あるいは、増幅された配列は、配列解析の前にクローニングされてもよい。酵素的に増幅されたゲノムセグメントの直接的なクローニングおよび配列解析の方法は当技術分野において公知である。
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードする能力を有する少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。
「発現する」という用語は、遺伝子産物、例えばｍＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の産生を指す。本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスまたは転写されたｍＲＮＡがその後にペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞中でのｍＲＮＡのスプライシングを含んでもよい。
「遺伝子産物」あるいは「遺伝子発現産物」は、遺伝子が転写および翻訳された場合に生成されるアミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を指す。一部の実施形態では、遺伝子産物は、遺伝子が転写された場合に生成されるｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ、例えば干渉ＲＮＡを指すことができる。
「コードする」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、そのネイティブな状態においてまたは当業者に周知の方法により操作された場合に、転写されてポリペプチドまたはその断片のためのｍＲＮＡを産生し、および必要に応じて翻訳されてポリペプチドまたはその断片を産生することができるポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補体であり、コード配列はそれから導出され得る。さらに、本明細書で使用される場合、アミノ酸配列コード配列は、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。
「～の発現を方向付ける」としても本明細書で使用される、「転写制御下で」は、当技術分野においてよく理解される用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常はＤＮＡ配列の転写が、それが、転写の開始に寄与するか、または転写を促進するエレメントに作動可能に連結されていることに依存することを示す。「作動可能に連結された」は、ポリヌクレオチドが、それらが細胞中で機能することを可能とする方式で配置されていることを意図する。
「制御配列」、「発現制御エレメント」または「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、転写または複製されるべき標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結されており、標的ポリヌクレオチドの発現または複製を促すポリヌクレオチドを意図する。プロモーターは、発現制御エレメントまたは制御配列の例である。プロモーターは、遺伝子または他のポリヌクレオチドの５’または上流に位置することができ、調節された遺伝子転写のための制御点を提供する。ポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩはプロモーターの例である。一部の実施形態では、制御配列は二方向性であり、すなわち、制御配列の両側におけるコード配列のための制御配列として作用する。そのような二方向性制御配列は、二方向性プロモーターを含むか、またはから本質的になるか、またはからなるものであってもよい（例えばTrinklein ND, et al. An abundance of bidirectional promoters in the human genome. Genome Res. 2004 Jan;14(1):62-6を参照されたい）。
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、コード配列、例えば遺伝子の発現を調節する任意の配列を指す。プロモーターは、例えば、構成的、誘導可能、抑制性、または組織特異的であってもよい。「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域であるコントロール配列である。それは、調節タンパク質および分子が、例えばＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子を結合し得る遺伝子エレメントを含有してもよい。プロモーターの非限定的な例はＥＦ１アルファプロモーターおよびＣＭＶプロモーターを含む。ＥＦ１アルファ配列は当技術分野において公知である（例えば、addgene.org/11154/sequences/; ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J04617、それぞれ最終アクセス日2019年3月13日、およびZheng and Baum (2014) Int’l. J. Med. Sci. 11(5):404-408を参照されたい）。ＣＭＶプロモーター配列は当技術分野において公知である（例えば、snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=basic_cloning_vectors&plasmid=CMV_promoter、最終アクセス日2019年3月13日、およびZheng and Baum (2014)、上掲を参照されたい）。
エンハンサーは、標的配列の発現を増加させる調節エレメントである。「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を提供する能力を有する配列を含有するポリヌクレオチドである。例えば、レトロウイルスの長いターミナルリピートは、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を含有する。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」または「外因性」または「異種」であってもよい。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム中の所与の遺伝子と天然に連結されているエンハンサー／プロモーターである。「外因性」または「異種」エンハンサー／プロモーターは、遺伝子マニピュレーション（すなわち、分子生物学技術）により遺伝子に並置れているエンハンサー／プロモーターであって、その結果、その遺伝子の転写が、連結されたエンハンサー／プロモーターにより方向付けられる。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用されている「エンハンサー」という用語は、発現されるべき核酸配列に対するその位置および配向性にかかわらず核酸配列の転写を増大、向上または改善させる配列エレメントを表す。エンハンサーは、単一のプロモーターからまたは同時に１つより多くのプロモーターから転写を増強してもよい。転写を向上させるこの機能性が保持されるかまたは実質的に保持される（例えば、野生型活性、すなわち、全長配列の活性の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％）限り、野生型エンハンサー配列の任意の切断された、突然変異されたまたは他に改変されたバリアントもまた上記の定義内にある。
「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基の間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン－クリック塩基対合、フーグスティーン結合により、または任意の他の配列特異的な方式において起こってもよい。複合体は、デュプレックス構造を形成する２つの鎖、多鎖複合体を形成する３つもしくはより多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組合せを含んでもよい。ハイブリダイゼーション反応は、より大規模なプロセス中のステップ、例えばＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素切断を構成してもよい。
本明細書で使用される場合、「相補的な」配列は、互いに対して逆平行にアライメントされた場合に、互いと対合する複数の個々のヌクレオチド塩基を含有する２つのヌクレオチド配列を指す。ヌクレオチド塩基の対合は水素結合を形成し、そのため相補配列により形成される二本鎖構造を安定化させる。配列が「相補的」であると考えられるために２つの配列中のあらゆるヌクレオチド塩基が互いと対合することは必要でない。配列は、例えば、２つの配列中のヌクレオチド塩基の少なくとも３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が互いと対合する場合に、相補的であると考えられ得る。一部の実施形態では、相補的という用語は、２つの配列中のヌクレオチド塩基の１００％が互いと対合することを指す。追加的に、２つの配列の全長が互いから大幅に異なる場合に、配列は依然として「相補的」であると考えられ得る。例えば、１５ヌクレオチドのプライマーは数百のヌクレオチドを含有するより長いポリヌクレオチドに対して、プライマーがより長いポリヌクレオチドの特定の領域に対して逆平行にアライメントされた場合にプライマーの複数の個々のヌクレオチド塩基がより長いポリヌクレオチド中のヌクレオチド塩基と対合する場合に、「相補的」であると考えられ得る。ヌクレオチド塩基対合は当分野において公知であり、例えばＤＮＡにおいて、プリンアデニン（Ａ）はピリミジンチミン（Ｔ）と対合し、ピリミジンシトシン（Ｃ）は常にプリングアニン（Ｇ）と対合し；一方ＲＮＡにおいて、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）と対合し、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と対合する。さらに、２つの相補配列中で互いに対して逆平行にアライメントされているが、対合しないヌクレオチド塩基は、本明細書においてミスマッチと称される。
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行われ得る。一般に、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、約４０℃で１０×ＳＳＣまたは同等のイオン強度／温度の溶液中で実行される。中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは典型的には約５０℃で６×ＳＳＣ中で行われ、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は一般に約６０℃で１×ＳＳＣ中で行われる。ハイブリダイゼーション反応はまた、当業者に周知の「生理学的条件」下で行われ得る。生理学的条件の非限定的な例は、細胞において通常見出される温度、イオン強度、ｐＨおよびＭｇ２＋の濃度である。
ハイブリダイゼーションが２つの一本鎖ポリヌクレオチドの間の逆平行の構成において起こる場合、反応は「アニーリング」と呼ばれ、それらのポリヌクレオチドは「相補的」として記載される。二本鎖ポリヌクレオチドは別のポリヌクレオチドに対して、ハイブリダイゼーションが第１のポリヌクレオチドの鎖のうちの１つと第２のポリヌクレオチドの間で起こり得る場合に、「相補的」または「相同的」であり得る。「相補性」または「相同性」（１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般に許容される塩基対合規則にしたがって、互いと水素結合を形成することが予想される対向する鎖中の塩基の割合の観点で定量化可能である。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチドの間または２つの核酸分子の間の配列類似性を指す。相同性は、比較の目的のためにアライメントされ得る各配列中の位置を比較することにより決定され得る。比較される配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸により占有される場合には、分子はその位置において相同的である。配列の間の相同性の程度は、配列により共有されるマッチするまたは相同的な位置の数の関数である。「無関連の」または「非相同的な」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、あるいは２５％未満の同一性を共有する。
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有し、すなわち、アライメントされた場合に、そのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が、２つの配列の比較において同じである。このアライメントおよび相同性または配列同一性パーセントは、当技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biologyに記載されているものを使用して決定され得る。好ましくは、デフォルトのパラメーターがアライメントのために使用される。１つのアライメントプログラムは、デフォルトのパラメーターを使用するＢＬＡＳＴである。特に、プログラムは、以下のデフォルトのパラメーター：遺伝コード＝標準的；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソーティング方法＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを使用するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLASTにおいて見出され得る。別の実施形態では、プログラムは、www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/においてアクセス可能なＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/においてアクセス可能なＮｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳＳ）、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_stretcher/においてアクセス可能なＳｔｒｅｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/においてアクセス可能なＷａｔｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_matcher/においてアクセス可能なＭａｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/においてアクセス可能なＬＡＬＩＧＮのいずれか１つである。さらなる実施形態では、デフォルトの設定が使用される。
一部の実施形態では、本明細書に開示されているポリヌクレオチドはＲＮＡである。一部の実施形態では、本明細書に開示されているポリヌクレオチドはＤＮＡである。一部の実施形態では、本明細書に開示されているポリヌクレオチドはＤＮＡおよびＲＮＡのハイブリッドである。
一部の実施形態では、参照核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに対する等価物は、参照によりコードされる同じ配列をコードする。一部の実施形態では、参照核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに対する等価物は、必要に応じて高いストリンジェンシーの条件下で、参照、相補体参照、リバース参照、またはリバース相補体参照にハイブリダイズする。
追加的あるいは、等価物核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、参照核酸、ポリヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドに対して少なくとも７０％の配列同一性、もしくは少なくとも７５％の配列同一性、もしくは少なくとも８０％の配列同一性、あるいは少なくとも８５％の配列同一性、あるいは少なくとも９０％の配列同一性、あるいは少なくとも９２％の配列同一性、あるいは少なくとも９５％の配列同一性、あるいは少なくとも９７％の配列同一性、あるいは少なくとも９８％の配列同一性、あるいは少なくとも９９％の配列同一性を有するものであるか、あるいは等価物核酸は、参照ポリヌクレオチドもしくはその相補体に高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。一態様では、等価物は、同じタンパク質または必要に応じて本明細書に記載される１つもしくは複数のアッセイを通じて同定され得るタンパク質の機能的な等価物をコードしなければならない。追加的あるいは、ポリヌクレオチドの等価物は、参照または親ポリヌクレオチドと同じまたは類似した機能のタンパク質またはポリペプチドをコードする。
「形質導入する」または「形質導入」という用語は、細胞、例えばキメラ抗原受容体細胞の産生に適用される場合、外来ヌクレオチド配列が細胞に導入されるプロセスを指す。一部の実施形態では、この形質導入は、ウイルス性または非ウイルス性の、ベクターを介して行われる。
本明細書で使用される場合、制限酵素は、制限部位として公知の分子内の特異的な認識部位においてまたはその近くでＤＮＡを断片に切断する酵素である。それらは、遺伝子クローニングおよびタンパク質産生実験の間にポリヌクレオチド、例えば遺伝子の、ベクター（例えば、プラスミドベクター）への挿入を補助するために使用される。最適な使用のために、遺伝子クローニングのために一般的に使用されるプラスミド、例えばウイルスベクターゲノムをコードするプラスミドは、制限酵素認識配列に富んだ短いポリリンカー配列（多重クローニング部位、またはＭＣＳと呼ばれる）を含むように改変される。これは、遺伝子断片をプラスミドベクターに挿入する場合に柔軟性を可能とし；遺伝子内に天然に含有される制限部位は、ＤＮＡを消化するためのエンドヌクレアーゼの選択に影響を及ぼし、その理由は、望まれるＤＮＡの末端を意図的に切断しながら該ＤＮＡの制限を回避することが必要であるからである。遺伝子断片をベクターにクローニングするために、プラスミドＤＮＡおよび遺伝子挿入物の両方は、典型的には同じ制限酵素で切断され、次にＤＮＡリガーゼとして公知の酵素の補助により一緒に接着される。
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、交換可能におよびそれらの最も広い意味において使用されて、２つまたはより多くのサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチド模倣物の化合物を指す。サブユニット（残基とも称される）はペプチド結合により連結されてもよい。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどにより連結されてもよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤとＬの両方の光学異性体、アミノ酸アナログならびにペプチド模倣物を含む、天然のおよび／もしくは非天然のまたは合成のアミノ酸を指す。
一部の実施形態では、抗原結合アミノ酸配列は、本明細書で使用される場合、抗体またはその断片を指す。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子を総称的に指し、これは、例としておよび限定なく、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、これらの組合せ、ならびに任意の脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えばヒト、ヤギ、ウサギおよびマウス、ならびに非哺乳動物種において免疫応答の間に産生される類似した分子、例えばサメ免疫グロブリンを含む。特に他に記載されなければ、「抗体」という用語は、他の分子への結合が実質的に除外されるもど、目的の分子（または高度に類似した目的の分子の群）に特異的に結合するインタクトな免疫グロブリンおよび「抗体断片」または「抗原結合性断片」（例えば、生体試料中の他の分子に対する結合定数よりも少なくとも１０３Ｍ－１高い、少なくとも１０４Ｍ－１高いまたは少なくとも１０５Ｍ－１高い目的の分子に対する結合定数を有する抗体および抗体断片）を含む。「抗体」という用語はまた、遺伝子操作された形態、例えばキメラ抗体（例えば、マウスまたはヒト化非霊長類抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば二特異性抗体）を含む。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Owen et al., Kuby Immunology, 7th Ed., W.H. Freeman & Co., 2013; Murphy, Janeway’s Immunobiology, 8th Ed., Garland Science, 2014; Male et al., Immunology (Roitt), 8th Ed., Saunders, 2012; Parham, The Immune System, 4th Ed., Garland Science, 2014もまた参照。一部の実施形態では、「抗体」という用語は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ、またはＳｃＦＶ）を指す。一部の実施形態では、「抗体」という用語は、必要に応じてペプチドリンカーまたは本明細書に開示されている別の好適な成分を介して、互いと連結された１つより多くの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ、またはＳｃＦＶ）を指す。一部の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、単一特異性抗体または多特異性抗体、例えば二特異性抗体もしくは三特異性抗体である。抗体の種は、ヒトまたは非ヒト、例えば、哺乳動物であり得る。
本明細書で使用される場合、エピトープは、抗原中の連続するまたは連続しないアミノ酸残基、例えば抗原の３次元構造において互いに隣接するアミノ酸残基であって、それらの残基は抗体または免疫系の別の成分が認識および結合する。
本明細書で使用される場合、「多特異性」という用語は、互いから異なる１つより多くのエピトープまたは抗原に結合する能力を指す。一部の実施形態では、「多特異性」という用語は、必要に応じてペプチドリンカーまたは本明細書に開示されている別の成分により連結された、１つより多くの抗原結合性配列または抗原リガンドを含むか、またはから本質的になるか、またはからなることを指す。さらなる実施形態では、「多特異性」という用語は、必要に応じてペプチドリンカーまたは本明細書に開示されている別の成分により連結された、１つより多くの抗原結合性配列（例えばｓｃＦｖ）を含むか、またはから本質的になるか、またはからなることを指す。一部の実施形態では、１つより多くの（例えば２つの）エピトープは同じ抗原中に位置する。あるいは、１つより多くの（例えば２つの）エピトープは少なくとも２つの抗原からのものである。一部の実施形態では、リガンドは抗原のリガンドを指す。一部の実施形態では、多特異性抗体は、少なくとも２つの抗原結合性配列を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態では、多特異性抗体は、少なくとも１つの抗原結合性配列および少なくとも１つのリガンドを含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。
よって、二特異性抗体（ＢｓＡｂと略記される）は、互いから異なる２つのエピトープまたは抗原に結合する能力を有する抗体を指す。一部の実施形態では、二特異性抗体は、必要に応じてペプチドリンカーまたは本明細書に開示されている別の成分により連結された、２つの抗原結合性配列または抗原リガンドを含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。さらなる実施形態では、二特異性抗体は、必要に応じてペプチドリンカーまたは本明細書に開示されている別の成分により連結された、２つの抗原結合性配列（例えばｓｃＦｖ）を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態では、二特異性抗体は、第１のエピトープを認識かつ結合する１つの抗原結合性配列および第２のエピトープを含む抗原を認識かつ結合する１つのリガンドを含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態では、２つのエピトープは同じ抗原中に位置する。あるいは、２つのエピトープは、互いから異なる２つの抗原からのものである。一部の実施形態では、リガンドは、抗原のリガンドを指す。一部の実施形態では、二特異性抗体は、少なくとも２つの抗原結合性配列を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態では、二特異性抗体は、少なくとも１つの抗原結合性配列および少なくとも１つのリガンドを含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。
本明細書で使用される場合、ＢｉＫＥという用語は、二特異性ＮＫ細胞エンゲージャーの略語であり、ＮＫ細胞の第１のエピトープまたは抗原および非ＮＫ標的（例えばがん細胞）の第２のエピトープまたは抗原を認識し、これらに結合する二特異性抗体、その抗原結合性断片、またはそのそれぞれの等価物を指す。よって、ＢｉＫＥは、非ＮＫ標的（例えばがん細胞）をＮＫ細胞に、標的上のエピトープまたは抗原への結合およびＮＫ細胞上のエピトープまたは抗原への結合を介して近接させる。一部の実施形態では、第２のエピトープまたは抗原はがん細胞のものである。一部の実施形態では、第２のエピトープまたは抗原はＴＡＡのものである。追加的あるいは、第２のエピトープまたは抗原は、ＮＫ細胞上に存在しないか、またはＮＫ細胞上に存在するが、例えば、望ましい標的（例えばがん細胞）上と比較して、より低いレベル（例えば１０％もしくはより低い、または１％もしくはより低い）であり、それにより、ＢｉＫＥは、依然としてＮＫ細胞および望ましい標的を同時に認識し、これらに結合し、望ましい標的をＮＫ細胞に近接させ得る。
本明細書で使用される場合、ＢｉＴＥという用語は、二特異性Ｔ細胞エンゲージャーの略語であり、Ｔ細胞の第１のエピトープまたは抗原および非Ｔ標的（例えばがん細胞）の第２のエピトープまたは抗原を認識し、これらに結合する二特異性抗体、その抗原結合性断片、またはそのそれぞれの等価物を指す。よって、ＢｉＴＥは、非Ｔ標的（例えばがん細胞）をＴ細胞に、標的上のエピトープまたは抗原への結合およびＴ細胞上のエピトープまたは抗原への結合を介して近接させる。一部の実施形態では、第２のエピトープまたは抗原はがん細胞のものである。一部の実施形態では、第２のエピトープまたは抗原はＴＡＡのものである。追加的あるいは、第２のエピトープまたは抗原は、Ｔ細胞上に存在しないか、またはＴ細胞上に存在するが、例えば、望ましい標的（例えばがん細胞）上と比較して、より低いレベル（例えば１０％もしくはより低い、または１％もしくはより低い）であり、それにより、ＢｉＴＥは、依然としてＴ細胞および望ましい標的を同時に認識し、これらに結合し、望ましい標的をＴ細胞に近接させ得る。
一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫ細胞上およびＴ細胞上の両方で発現し、よって抗ＮＫＧ２Ｄ ＢｉＴＥおよび抗ＮＫＧ２Ｄ ＢｉＫＥは交換可能に使用され得る。
本明細書で使用される場合、免疫細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞の「近接」という言い回しは、免疫細胞の辺りの任意の位置を指し、該位置に存在する免疫細胞の標的（例えばがん細胞）は、例えば免疫細胞上に存在する分子の標的上に存在する別の分子への結合を介して、免疫細胞により認識され得、必要に応じて免疫細胞により損傷または殺滅され得る。したがって、免疫細胞に近接させる行為は、本明細書において免疫細胞に関与するとも称される。
細胞傷害性試験に関して本明細書で使用される場合、エフェクターは、細胞傷害性試験において標的細胞、例えばがん細胞を損傷または殺滅する免疫細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞を指し、標的は、細胞傷害性試験においてエフェクターにより認識、損傷または殺滅される標的細胞、例えばがん細胞を指す。一部の実施形態では、エフェクターは、本明細書に開示されている単離または操作された細胞である。追加的あるいは、標的は、本明細書に開示されている１つまたは複数のＴＡＡを発現するがん細胞である。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、Ｂリンパ球の単一のクローンによりまたは単一の抗体の軽鎖および重鎖遺伝子がトランスフェクトされている細胞により産生される抗体を指す。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により、例えば免疫脾臓細胞との骨髄腫細胞の融合からハイブリッド抗体形成細胞を作製することにより産生される。モノクローナル抗体はヒト化モノクローナル抗体を含む。
抗体構造の観点において、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合により相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。２種類の軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）がある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥがある。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する（領域は「ドメイン」としても公知である）。組合せにおいて、重鎖および軽鎖可変領域は抗原に特異的に結合する。軽鎖および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域により遮られた「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は定義されている（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照されたい；該文献はこれにより参照により本明細書に組み込まれる）。Ｋａｂａｔデータベースは現在ではオンラインで維持されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は種内で相対的に保存されている。構成成分の軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である、抗体のフレームワーク領域は、概してはβ－シートコンホメーションをとり、ＣＤＲは、β－シート構造を接続する、および一部の場合においてその部分を形成する、ループを形成する。そのため、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用により正確な配向性でのＣＤＲの配置を提供するスカフォールドを形成するように作用する。
ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合の主な原因となる。各鎖のＣＤＲは、典型的には、Ｎ末端から開始して逐次的に番号付けされるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称され、そしてまた、典型的には、特定のＣＤＲが位置する鎖により同定される（重鎖領域はＣＤＲＨと標識され、軽鎖領域はＣＤＲＬと標識される）。そのため、ＣＤＲＨ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインからのＣＤＲ３である一方、ＣＤＲＬ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインからのＣＤＲ１である。例えば、抗ＢＣＭＡ抗体は、ＢＣＭＡ関連抗原にとって特有の特定のＶＨ領域およびＶＬ領域配列、ならびにそのため特定のＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原のための異なる結合部位）を有する抗体は異なるＣＤＲを有する。抗体毎に異なるのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接的に関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置は特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖまたはＳｃＦＶ）は、本明細書において抗体の断片とも称され、必要に応じて約１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで接続された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常は、柔軟性のためにグリシンに富んでいる他に、溶解性のためにセリンまたはスレオニンに富んでおり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続するか、またはその逆であり得る。このタンパク質は、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、元々の免疫グロブリンの特異性を保持する。
本明細書で使用される場合、断片結晶性（Ｆｃ）領域は、抗体、例えば二特異性抗体を安定化させ、および必要に応じて免疫細胞上もしくは血小板上のＦｃ受容体と相互作用する（例えば結合する）か、または補体タンパク質に結合する、抗体のテイル領域を指す。一部の実施形態では、Ｆｃ突然変異体が使用されてもよく、これは例えば、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域の位置に相当する位置においてＦｃまたはその等価物中のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＮ２９７Ｑの１つまたは２つまたは３つ全ての突然変異を含み、例えば配列番号１８または１９について、相当する位置は、配列番号１８または１９のアミノ酸（ａａ）１６、ａａ１７およびａａ７９である。Wang et al. Protein Cell. 2018 Jan;9(1):63-73. Epub 2017 Oct 6および他の刊行物に示されるように、当業者は、使用、例えば炎症性サイトカイン放出の低減などにしたがってＦｃ領域を操作する。
ポリペプチドまたはその等価物は、カルボキシ末端（Ｃ末端）において追加の５０個のアミノ酸、あるいは約４０個のアミノ酸、あるいは約３０個のアミノ酸、あるいは約２０個のアミノ酸、あるいは約１０個のアミノ酸、あるいは約５個のアミノ酸、あるいは約４、もしくは３、もしくは２もしくは１個のアミノ酸により後続され得る。追加的あるいは、ポリペプチドまたはその等価物は、アミノ末端（amine-terminus）（Ｎ末端）において追加の５０個のアミノ酸、あるいは約４０個のアミノ酸、あるいは約３０個のアミノ酸、あるいは約２０個のアミノ酸、あるいは約１０個のアミノ酸、あるいは約５個のアミノ酸、あるいは約４、もしくは３、もしくは２もしくは１個のアミノ酸をさらに含むことができる。
参照ポリペプチドの等価物は、参照ポリペプチド、例えば本明細書に開示されているＣＡＲに対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、または参照ポリペプチド、例えば本明細書に開示されているＣＡＲをコードするポリヌクレオチドの相補体に高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含むか、から本質的になるか、あるいはからなり、高いストリンジェンシーの条件は、約５５℃～約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣの緩衝剤濃度；約５５％～約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液を含む。
代替的な実施形態は、他の抗体ＣＤＲからの適切なＣＤＲ、またはそのそれぞれの等価物で置換されたＬＣ可変領域からのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）の１つまたは複数を含む。よって、例として、ＬＣ可変領域からのＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、別の抗体のＬＣ可変領域のＣＤＲ３と組み合わせることができ、一部の態様では、カルボキシ末端において追加の５０個のアミノ酸、あるいは約４０個のアミノ酸、あるいは約３０個のアミノ酸、あるいは約２０個のアミノ酸、あるいは約１０個のアミノ酸、あるいは約５個のアミノ酸、あるいは約４、もしくは３、もしくは２もしくは１個のアミノ酸を含むことができる。
一部の実施形態では、抗体の「等価物」または「生物学的等価物」という用語は、ＥＬＩＳＡまたは他の好適な方法により測定される場合にそのエピトープタンパク質またはその断片に選択的に結合する抗体の能力が、例えば、少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、またはより高いレベルで実質的に維持されることを意味する。生物学的に同等の抗体は、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、ペプチド、抗体断片、抗体バリアント、抗体誘導体および抗体模倣物を含むが、これらに限定されない。追加的あるいは、等価物および参照抗体は、同じＣＤＲのセットを共有するが他のアミノ酸は改変されている。
本開示が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関する場合、その等価物または生物学的等価物は本開示の範囲内であることが意図されると、明示的な記載なしでおよび他に意図されなければ推測されるべきである。本明細書で使用される場合、「その生物学的等価物」という用語は、参照タンパク質、抗体、ポリペプチドまたは核酸に言及する場合に「その等価物」と同義であることが意図され、所望される構造または機能性を依然として維持しながら最小の相同性を有するものを意図する。特に本明細書に記載されなければ、本明細書において言及される任意のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質はまた、その等価物を含むことが企図される。例えば、等価物は、参照タンパク質、ポリペプチドまたは核酸に対して少なくとも約７０％の相同性もしくは同一性、または少なくとも８０％の相同性もしくは同一性、または少なくとも約８５％の相同性もしくは同一性、あるいは少なくとも約９０％の相同性もしくは同一性、あるいは少なくとも約９５％の相同性もしくは同一性、あるいは９８％の相同性もしくは同一性を意図し、実質的に同等の生物活性を示す。あるいは、ポリヌクレオチドに言及する場合、その等価物は、ストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
「抗体バリアント」という用語は、マウス以外の種において産生される抗体を含むことを意図する。それはまた、抗体またはその断片の直鎖状ポリペプチド配列に対する翻訳後修飾を含有する抗体を含む。それは、完全ヒト抗体をさらに包含する。
「抗体誘導体」という用語は、上記に定義されているエピトープに結合し、本開示のネイティブなモノクローナル抗体の改変または誘導体である分子を包含することが意図される。誘導体は、例えば、二特異性、多特異性、ヘテロ特異性、三特異性、四特異性、多特異性抗体、ダイアボディ、キメラ、組換えおよびヒト化されたものを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「特異的結合」または「結合」という用語は、少なくとも１０－６Ｍの結合親和性を有する抗体と抗原との間の接触を意味する。ある特定の実施形態では、抗体は、少なくとも約１０－７Ｍ、および好ましくは少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、少なくとも約１０－１０Ｍ、少なくとも約１０－１１Ｍ、または少なくとも約１０－１２Ｍの親和性で結合する。
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、特定の液性または細胞性免疫の生成物、例えば抗体分子またはＴ細胞受容体が特異的に結合し得る化合物、組成物、または物質を指す。抗原は、任意の種類の分子であり得、これは、例えば、ハプテン、単純な中間代謝物、糖（例えば、オリゴ糖）、脂質、およびホルモン、ならびに高分子、例えば複合炭水化物（例えば、多糖）、リン脂質、およびタンパク質を含む。抗原の一般的なカテゴリーは、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物および他の寄生生物抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギーおよびグラフト拒絶に関与する抗原、毒素、ならびに他の種々雑多な抗原を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、結合部分、例えば抗体、その抗原結合性断片、またはＣＡＲの抗原は、「抗原」に続いて結合部分（例えばＢＣＭＡ ＣＡＲ）のフォーマット、または抗原の前の「抗（ａｎｔｉもしくはａｎｔｉ－）」および抗原の後の結合部分（例えば抗ＢＣＭＡ抗体）を有するフォーマット、または結合部分に続いて「～に対する」もしくは「～に方向付けられた」および次に抗原（例えばＢＣＭＡに対する抗体）のフォーマットにおいて本明細書において提供され得る。
本明細書で使用される場合、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、がん抗原、腫瘍抗原、がん関連抗原、および腫瘍関連抗原という用語は、本明細書において交換可能に使用され、がんまたは腫瘍細胞の抗原物質を指す。一部の実施形態では、ＴＡＡは、一部の腫瘍またはがん細胞上に存在し、そしてまた、必要に応じてより低いレベルで、一部の正常細胞上に存在する。一部の実施形態では、ＴＡＡは、腫瘍またはがん細胞上にのみ存在し、正常細胞上に存在しない。一部の実施形態では、ＴＡＡは、本明細書に開示されているＣＡＲが認識および結合するＴＡＡを指す。一部の実施形態では、ＴＡＡは、本明細書に開示されている抗体が認識および結合するＴＡＡを指す。一部の実施形態では、ＴＡＡは、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＦＬＴ３、ＣＤ１９、メソテリン、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３３、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ＣＤ５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ムチン１、（Ｍｕｃ１）、エフリンＡ型受容体２前駆体（ＥｐｈＡ２）、上皮細胞増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、インターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ１３Ｒａ２）、ＣＤ１３３、グリピカン３（ＧＰＣ３）、上皮細胞接着分子前駆体（ＥｐＣａｍ）、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、がん／精巣（ＣＴ）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、腫瘍関連糖タンパク質－７２（ＴＡＧ－７２）、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）、またはヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１）から選択される。
本明細書で使用される場合、「ＮＫＧ２Ｄ」という用語は、Ｃ型レクチン様受容体のＣＤ９４／ＮＫＧ２ファミリーに属し、ＮＫ遺伝子複合体またはその生物学的等価物中に位置する遺伝子ＫＬＲＫ１遺伝子によりコードされる膜貫通タンパク質を指す。このタンパク質または基礎となる遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ１２Ｍ０１１７２８、ＨＧＮＣ：１８７８８、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２２９１４、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２１３８０９、ＯＭＩＭ：６１１８１７、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２６７１８の下で見出すことができ、これらのそれぞれは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ＢＣＭＡ」および「Ｂ細胞成熟抗原」という用語は、交換可能に使用され、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）を認識し、ＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子によりコードされるＴＮＦスーパーファミリーに属するタンパク質を指す。このタンパク質または基礎となる遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ１６Ｐ０１２０５８、ＨＧＮＣ：１１９１３、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：６０８、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００４８４６２、ＯＭＩＭ：１０９５４５、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ０２２２３の下で見出すことができ、これらのそれぞれは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「抗原結合性ドメイン」という用語は、抗原標的に特異的に結合することができる任意のタンパク質またはポリペプチドドメインを指す。
本明細書で使用される場合、細胞に関する「自家」という用語は、単離され、同じ対象（レシピエントまたは宿主）に再び注入される細胞を指す。「同種異系」は非自家細胞を指す。
「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に結合する能力を有する細胞外ドメイン、細胞外ドメインが由来するポリペプチドとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合したタンパク質を指す。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、「キメラ受容体」、「Ｔボディ」、または「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれることがある。「抗原に結合する能力を有する細胞外ドメイン」は、ある特定の抗原に結合することができる任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。「細胞内ドメイン」または「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、シグナルを伝達して細胞、例えば免疫細胞において生物学的プロセスの活性化または阻害を引き起こすドメインとして機能することが公知の任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。ある特定の実施形態では、細胞内ドメインは、一次シグナル伝達ドメインに加えて１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含むか、あるいはから本質的になるか、またはさらにはからなるものであってもよい。「膜貫通ドメイン」は、細胞膜を貫通することが公知であり、細胞外およびシグナル伝達ドメインを連結するように機能することができる任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。
キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のリンカーとして役立つ「ヒンジドメイン」を必要に応じて含んでもよい。そのようなドメインの非限定的な例は本明細書において提供されている、例えば：ヒンジドメイン：ＩｇＧ１重鎖ヒンジコード配列：配列番号８２またはＬＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号８３）、もしくはＬＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＤＰＫＧＴ（配列番号４７）を含むか、もしくはから本質的になるか、もしくはさらにはからなるＩｇＧ１ヒンジアミノ酸配列またはそのそれぞれの等価物。本明細書で使用される場合、ＩｇＧ１ヒンジドメインという用語はまた、この名称と関連付けられる特定のタンパク質断片または本明細書に示されているＩｇＧ１ヒンジドメイン配列と少なくとも約７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＩｇＧ１ヒンジドメインの追加の例である配列は、例えば、ＵＳ２０１８０２７３６４２Ａ１およびDall'Acqua WF, Cook KE, Damschroder MM, Woods RM, Wu H. Modulation of the effector functions of a human IgG1 through engineering of its hinge region. J Immunol. 2006 Jul 15;177(2):1129-38において提供されている。ヒンジドメインの追加の非限定的な例は、別の免疫グロブリンのヒンジドメイン、例えばＩｇＧ４ヒンジ領域、およびＩｇＤヒンジドメインを含む。例えば、ＵＳ２０１８０２７３６４２Ａ１を参照されたい。別の例は、当技術分野において公知のように、ＣＤ８ヒンジドメイン、例えばＣＤ８αヒンジドメインである。
各例示的なドメイン成分のさらなる実施形態は、本明細書に開示されているドメイン、例えば本明細書に開示されている核酸配列によりコードされるタンパク質のドメインと少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他のタンパク質、またはその断片を含む。さらに、そのようなドメインの非限定的な例は本明細書において提供されている。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ８αヒンジドメイン」という用語はまた、この名称と関連付けられる特定のタンパク質断片または本明細書に示されているＣＤ８αヒンジドメイン配列と少なくとも約７０％、あるいは少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ヒト、マウス、および他の種のＣＤ８αヒンジドメインの例である配列は、Pinto, R.D. et al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177において提供されている。ＣＤ８αヒンジドメインと関連付けられる配列はまた、Pinto, R.D. et al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177において提供されている。その非限定的な例は、ヒトＣＤ８アルファヒンジドメイン：配列番号８４、マウスＣＤ８アルファヒンジドメイン：配列番号８５、ネコＣＤ８アルファヒンジドメイン：配列番号８６を含む。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ８α膜貫通ドメイン」という用語は、この名称と関連付けられる特定のタンパク質断片または本明細書に示されているＣＤ８α膜貫通ドメイン配列と少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ヒトＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００１７５９．３）のアミノ酸位置１８３～２０３、またはマウスＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００１０７４５７９．１）のアミノ酸位置１９７～２１７、またはラットＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ８アルファ鎖（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿１１３７２６．１）のアミノ酸位置１９０～２１０と関連付けられる断片配列は、ＣＤ８α膜貫通ドメインの追加の例である配列を提供する。列挙される受託番号のそれぞれと関連付けられる配列は以下のように提供される：ヒトＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴ（配列番号８７）；マウスＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：ＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡＬＬＬＳＬＩＩＴＬＩ（配列番号８８）；およびラットＣＤ８アルファ膜貫通ドメイン：ＩＷＡＰＬＡＧＩＣＡＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＩ（配列番号８９）。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８膜貫通ドメイン」という用語は、この名称と関連付けられる特定のタンパク質断片または本明細書に示されているＣＤ２８膜貫通ドメイン配列と少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＭ＿００６７１２８６２．２またはＸＭ＿００９４４４０５６．１と関連付けられる断片配列は、ＣＤ２８膜貫通ドメインの追加の、非限定的な、例示される配列を提供する。列挙される受託番号のそれぞれと関連付けられる配列が本明細書において提供され、例えば、膜貫通ドメイン：ＣＤ２８膜貫通領域コード配列：配列番号９０または配列番号９１を含むか、から本質的になるか、もしくはからなるＣＤ２８膜貫通領域アミノ酸配列またはその等価物である。
本明細書で使用される場合、「４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域」または「４－１ＢＢ共刺激領域」という用語は、この名称と関連付けられる特定のタンパク質断片または本明細書に示されている４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域の非限定的な例である配列は、米国特許出願公開第２０１３０２６６５５１Ａ１号において提供されており、例えば例示的な配列が以下において提供される：４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域：配列番号９２；および細胞内ドメイン：４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域コード配列：配列番号９３。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域」または「ＣＤ２８共刺激領域」という用語は、この名称と関連付けられる特定のタンパク質断片または本明細書に示されるＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインの例である配列は、米国特許第５，６８６，２８１号；Geiger, T.L. et al., Blood 98: 2364-2371 (2001); Hombach, A. et al., J Immunol 167: 6123-6131 (2001); Maher, J. et al. Nat Biotechnol 20: 70-75 (2002); Haynes, N.M. et al., J Immunol 169: 5780-5786 (2002);またはHaynes, N.M. et al., Blood 100: 3155-3163 (2002)において提供されている。非限定的な例は、ＣＤ２８配列：配列番号９４の残基１１４～２２０、およびその等価物を含む。一部の実施形態では、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域は、配列番号９５またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。さらなる実施形態では、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域コード配列は、配列番号９６を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。
本明細書で使用される場合、「ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域」または「ＩＣＯＳ共刺激領域」という用語は、この名称と関連付けられる特定のタンパク質断片または本明細書に示されているＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域の非限定的な例である配列は、米国特許出願公開第２０１５／００１７１４１Ａ１号、およびＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域コード配列：配列番号９７またはその等価物において提供されている。
本明細書で使用される場合、「ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域」または「ＯＸ４０共刺激領域」という用語は、この名称と関連付けられる特定のタンパク質断片または本明細書に示されているＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域の非限定的な例である配列は、米国特許出願公開第２０１２／２０１４８５５２Ａ１号に開示されており、以下において提供される例示的な配列を含む：ＯＸ４０共刺激シグナル伝達領域コード配列：配列番号９８、およびその等価物。
本明細書で使用される場合、「ＤＡＰ１０共刺激シグナル伝達領域」または「ＤＡＰ１０共刺激領域」という用語は、この名称と関連付けられる特定のタンパク質断片または本明細書に示されているＤＡＰ１０共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＤＡＰ１０共刺激シグナル伝達領域の非限定的な例である配列は、ＵＳ９５８７０２０Ｂ２において開示されており、以下において提供される例示的な配列を含む：ＲＰＲＲＳＰＡＱＤＧＫＶＹＩＮＭＰＧＲＧ（配列番号９９）、またはその等価物。
本明細書で使用される場合、「ＤＡＰ１２共刺激シグナル伝達領域」または「ＤＡＰ１２共刺激領域」という用語は、この名称と関連付けられる特定のタンパク質断片または本明細書に示されているＤＡＰ１２共刺激シグナル伝達領域配列と少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す（ＵＳ９５８７０２０Ｂ２）。ＤＡＰ１２共刺激シグナル伝達領域の非限定的な例である配列は、Ｕにおいて開示されており、以下において提供される例示的な配列を含む：ＥＳＰＹＱＥＬＱＧＱＲＳＤＶＹＳＤＬＮＴＱ（配列番号１００）、またはその等価物。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン」という用語は、この名称と関連付けられる特定のタンパク質断片または本明細書に示されているＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン配列と少なくとも約７０％、あるいは少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する任意の他の分子を指す。ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの非限定的な例である配列は、米国特許出願公開第２０１３０２６６５５１Ａ１号において提供されており、例えば：配列番号１０１；および細胞内ドメイン：ＣＤ３ゼータシグナル伝達領域コード配列：配列番号１０２。
本明細書で使用される場合、サイトカインは、免疫系の特定の細胞により分泌されるタンパク質、ペプチドまたは糖タンパク質ならびに免疫、炎症および造血を媒介および調節するシグナル伝達分子の大きい群である。一部の実施形態では、それらは約５ｋＤａ～約２０ｋＤａである。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子を含むが、一般にホルモンも増殖因子も含まない。一部の実施形態では、サイトカインは、本明細書で使用される場合、免疫細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、またはこれらの任意の組合せの発生、分化、活性化、または拡大増殖の１つまたは複数を促進する。
本明細書で使用される場合、インターロイキン（ＩＬ）は、白血球細胞（白血球）により発現されることが最初に見られたサイトカインを指す。免疫系の機能は、インターロイキンに大部分で依存する。インターロイキンの大部分は、ヘルパーＣＤ４ Ｔリンパ球により、ならびに単球、マクロファージ、および内皮細胞を通じて合成される。それらは、ＴおよびＢリンパ球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ならびに造血細胞の発生および分化を促進する。本明細書で使用される場合、インターロイキンは、細胞から分泌される可溶性サイトカイン、または細胞表面上に発現される膜結合（ｍｂ）サイトカインであり得る。サイトカインの可溶性形態および膜結合形態は、当業者により、例えば膜貫通ドメイン（例えば血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲβ）膜貫通ドメイン）またはシグナルペプチドまたは膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドの両方をサイトカインに対して操作することを含むか、から本質的になるか、またはからなる方法により、変換され得る。
一部の実施形態では、サイトカインは、本明細書で使用される場合、ＩＬ－１５を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。本明細書で使用される場合、「ＩＬ１５」、「ＩＬ １５」、「ＩＬ－１５」および「インターロイキン－１５」という用語は、交換可能に使用され、Ｔおよびナチュラルキラー細胞の活性化および増殖を調節し、ＩＬ１５遺伝子によりコードされるサイトカインを指す。このタンパク質または基礎となる遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ０４Ｐ１４１６３６、ＨＧＮＣ：５９７７、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：３６００、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６４１３６、ＯＭＩＭ：６００５５４、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４０９３３の下で見出すことができ、これらのそれぞれはこれにより参照により本明細書に全体が組み込まれる。
一部の実施形態では、ＩＬ－１５は可溶性ＩＬ－１５である。さらなる実施形態では、可溶性ＩＬ－１５は、配列番号１０３、配列番号１０６、もしくは配列番号１０４のアミノ酸配列（これらのそれぞれは本明細書において野生型ＩＬ１５と称され得る）またはその等価物から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一部の実施形態では、ＩＬ１５等価物は、野生型ＩＬ１５と比較してＩＬ１５ＲＡに対する少なくとも約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約１００％、または約１．５倍、または約２倍、または約３倍、または約５倍、または約１０倍、またはより高い結合親和性を有する。一部の実施形態では、ＩＬ－１５等価物は、Ｌ４５Ｄ、Ｌ４５Ｅ、Ｓ５１Ｄ、Ｌ５２Ｄ、Ｎ７２Ｄ、Ｎ７２Ｅ、Ｎ７２Ａ、Ｎ７２Ｓ、Ｎ７２ＹおよびＮ７２Ｐから選択される１つまたは複数の突然変異を含むＩＬ－１５であり、最初の文字は元々のアミノ酸残基を示し、最後の文字は突然変異したアミノ酸残基を示し、中央の数は、配列番号１０５の配列中のまたは該配列に対してアライメントされたアミノ酸残基番号を示す。
一部の実施形態では、サイトカインとして本明細書で使用されるのは、ＩＬ－１５およびＩＬ１５受容体を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる可溶性複合体（ＳＩＬ１５Ｃ）である。さらなる実施形態では、ＩＬ－１５は、配列番号１０６のアミノ酸配列、または配列番号１０４のアミノ酸配列またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。
さらなる実施形態では、ＩＬ１５受容体は、ＩＬ１５受容体サブユニットアルファ（ＩＬ１５ＲＡ）またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。追加的あるいは、ＩＬ１５受容体は、ＩＬ１５受容体サブユニットベータ（ＩＬ１５ＲＢ、すなわち、ＩＬ２受容体サブユニットベータ）を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一部の実施形態では、ＩＬ１５ＲＡ等価物は、野生型ＩＬ１５ＲＡと比較してＩＬ１５に対する少なくとも約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約１００％、または約１．５倍、または約２倍、または約３倍、または約５倍、または約１０倍、またはより高い結合親和性を有する。結合親和性は、実施例、および当技術分野、例えばWei et al, J. Immunol, vol.167(1), p:277-282, 2001において提供されている方法により決定され得る。一部の実施形態では、ＩＬ１５ＲＡ等価物は、ＩＬ１５ＲＡのスシドメインを含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。さらなる実施形態では、ＩＬ１５ＲＡ等価物は、ＩＬ１５ＲＡのスシドメインを含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる野生型ＩＬ１５ＲＡの断片である。一部の実施形態では、ＩＬ１５受容体は、配列番号１０７またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。
さらなる実施形態では、ＳＩＬ１５Ｃは、配列番号１０６のアミノ酸配列またはその等価物および配列番号１０７のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一部の実施形態では、ＩＬ１５およびＩＬ１５受容体はペプチドリンカーにより連結されている。一部の実施形態では、リンカーは、ＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱ（配列番号１０８）または配列番号９、またはそのそれぞれの等価物を含む。一部の実施形態では、ＳＩＬ１５Ｃは、ＡＬＴ－８０３（ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ１５ＲαＳｕ／ＩｇＧ１ Ｆｃ複合体）を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。ＡＬＴ－８０３は、ＩＬ－１５突然変異体（ＩＬ－１５Ｎ７２Ｄ）および二量体ＩＬ－１５受容体αスシドメイン－ＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなるＩＬ－１５スーパーアゴニスト複合体ＩＬ－１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ－１５ＲαＳｕ／Ｆｃである。
本明細書で使用される場合、ＩＬ１５ＲＡスシドメインは、ＣＰＸ１ＰＸ２ＳＶＥＨＡＤＩＸ３ＶＫＳＹＳＬＸ４ＳＲＥＲＹＸ５ＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＸ６ＡＸ７ＷＴＴＰＳＬＫＣ（ここで、Ｘ１はＰまたはＡであり、Ｘ２はＭまたはＶであり、Ｘ３はＷ、ＲまたはＱであり、Ｘ４はＹまたはＨであり、Ｘ５はＩまたはＶであり、Ｘ６はＶまたはＡであり、Ｘ７はＶまたはＡである）（配列番号１０９）のコンセンサス配列を指す。
本明細書で使用される場合、「ＩＬ１５ＲＡ」、「ＩＬ １５ ＲＡ」、「ＩＬ－１５ ＲＡ」および「ＩＬ １５受容体サブユニットアルファ」という用語は、交換可能に使用され、高い親和性でインターロイキン１５（ＩＬ１５）に特異的に結合し、ＩＬ１５ＲＡ遺伝子によりコードされるサイトカイン受容体またはその断片を指す。ＩＬ１５ＲＡは、シスおよびトランスの両方でシグナル伝達が可能であり、細胞の１つのサブセットからのＩＬ１５受容体（ＩＬ１５Ｒ）は、隣接するＩＬ２ＲＧ発現細胞にＩＬ１５を提示する。このタンパク質または基礎となる遺伝子の非限定的な例示的な配列またはその機能は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ１０Ｍ００５９４３、ＨＧＮＣ：５９７８、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：３６０１、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１３４４７０、ＯＭＩＭ：６０１０７０、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１３２６１の下で見出すことができ、これらのそれぞれは参照により全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＩＬ１５ＲＡは、配列番号１０７のアミノ酸配列を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。
本明細書で使用される場合、ＩＬ２ＲＢおよびＩＬ１５ＲＢは、交換可能に使用され、ＩＬ１５による好中球ファゴサイトーシスの刺激に関与する、ＩＬ１５ＲＡと会合状態のＩＬ２の受容体を指す。例えば、Ratthe et al. J. Leukoc. Biol. 76:162-168(2004)を参照されたい。このタンパク質または基礎となる遺伝子の非限定的な例示的な配列またはその機能は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ２２Ｍ０３７１２５、ＨＧＮＣ：６００９、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：３５６０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１００３８５、ＯＭＩＭ：１４６７１０、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１４７８４の下で見出すことができ、これらのそれぞれは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
他の実施形態では、ＩＬ－１５は、膜結合ＩＬ－１５（ｍｂＩＬ－１５）、例えば膜貫通ドメインとコンジュゲートしており、必要に応じてペプチドリンカーまたは１つもしくは複数のランダムなアミノ酸残基をさらに含み、そのため細胞膜上に結合している可溶性ＩＬ－１５である。さらなる実施形態では、ｍｂＩＬ－１５は、ＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインまたはその等価物とコンジュゲートしているＩＬ１５である。
一部の実施形態では、サイトカインは、本明細書で使用される場合、ＩＬ－２１を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。本明細書で使用される場合、「ＩＬ２１」、「ＩＬ ２１」、「ＩＬ－２１」および「インターロイキン－２１」という用語は、交換可能に使用され、免疫調節活性を有し、ＩＬ２１遺伝子によりコードされるサイトカインを指す。このタンパク質または基礎となる遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：Ｃ０４Ｍ１２２６１２、ＨＧＮＣ：６００５、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：５９０６７、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１３８６８４、ＯＭＩＭ：６０５３８４、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＨＢＥ４の下で見出すことができ、これらのそれぞれは参照により全体が本明細書に組み込まれる。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－ＰｒｏｔエントリーＱ９ＨＢＥ４（ＩＬ２１＿ＨＵＭＡＮ）は、選択的スプライシングにより生成される２つのアイソフォームを記載し、アイソフォーム１は１８ｋＤａ、アイソフォーム２は１７ｋＤａであり、アライメントにより２つのアイソフォームの間に１４６ａａの共通配列がある。理論により縛られることを望まないが、ＩＬ－２１の構造解析によれば、ＩＬ－２１の最小配列は１４６ａａの長さ、例えばアイソフォーム１またはアイソフォーム２の最初の１４６ａａである。よって、一部の実施形態では、ＩＬ－２１は、ＩＬ－２１シグナルペプチドありまたはなしで、ＩＬ－２１アイソフォーム１およびアイソフォーム２により共有される共通配列を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。共通配列の非限定的な例は、配列番号１１０、または配列番号１１１、または配列番号１１２を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態では、ＩＬ－２１は、ＩＬ－２１シグナルペプチドありまたはなしで、ＩＬ－２１アイソフォーム１を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。ＩＬ－２１アイソフォーム１配列の非限定的な例は、配列番号１１３、または配列番号１１４、または配列番号１１５を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態では、ＩＬ－２１は、ＩＬ－２１シグナルペプチドありまたはなしで、ＩＬ－２１アイソフォーム２を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。ＩＬ－２１アイソフォーム２配列の非限定的な例は、配列番号１１６、または配列番号１１７、または配列番号１１８を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態では、ＩＬ２１は可溶性ＩＬ２１である。さらなる実施形態では、ＩＬ２１は、配列番号１１６、もしくは配列番号１１７、もしくは配列番号１１８のアミノ酸配列またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。他の実施形態では、ＩＬ２１は、膜結合ＩＬ－２１（ｍｂＩＬ－２１）、例えば膜貫通ドメインとコンジュゲートしており、必要に応じてペプチドリンカーまたは１つもしくは複数のランダムなアミノ酸残基をさらに含み、そのため細胞膜上に結合している可溶性ＩＬ－２１である。さらなる実施形態では、ｍｂＩＬ－２１は、ＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインまたはその等価物とコンジュゲートしているＩＬ２１である。
本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」という用語は、疎水性のタンパク質領域であって、その結果、細胞膜に挿入されることを選好し、それにより、ドメインの両方の側のタンパク質の部分が膜の反対側にあるようなものを指す。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、膜貫通タンパク質の単一のアルファヘリックスの膜貫通セグメントを含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。追加的あるいは、膜貫通ドメインは、主に非極性アミノ酸残基を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなり、膜二重層を１回または数回貫通してもよい。さらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、ＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインを含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。いっそうさらなる実施形態では、ＰＤＧＦＲβ膜貫通ドメインは、ＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ（配列番号１１９）のアミノ酸配列を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。
本明細書で使用される場合、「ＰＤＧＦＲβ」および「血小板由来増殖因子受容体ベータ」という用語は、交換可能に使用され、ＰＤＧＦＲＢ遺伝子によりコードされる、血小板由来増殖因子ファミリーのメンバーのための細胞表面チロシンキナーゼ受容体を指す。このタンパク質または基礎となる遺伝子の非限定的な例示的な配列は、Ｇｅｎｅ Ｃａｒｄｓ ＩＤ：ＧＣ０５Ｍ１５０１１３、ＨＧＮＣ：８８０４、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：５１５９、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１１３７２１、ＯＭＩＭ：１７３４１０、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０９６１９の下で見出すことができ、これらのそれぞれはこれにより参照により本明細書に全体が組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞にとって致死性の生成物（必要に応じて別の作用物質、例えば抗体の存在を伴う）を発現する任意の遺伝子を指す。単独でのまたは他の作用物質を伴う細胞中でのそのような遺伝子の転写または発現、すなわち、その遺伝子産物の存在は、例えばアポトーシスを通じて、細胞が自らを殺滅することを引き起こす。それは、細胞、例えば、ＣＡＲまたは二特異性抗体または両方を発現する治療用細胞を、それがその所望される機能、例えばがんの処置を行った後に、排除する可能な戦略を提供する。さらなる実施形態では、自殺遺伝子産物は、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシルエステラーゼ、シトクロムＰ４５０もしくはＰＮＰ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）、切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）、または誘起可能なカスパーゼ（「ｉＣａｓｐ」）の１つまたは複数から選択される。いっそうさらなる実施形態では、例示される自殺戦略は、チミジンキナーゼ／ガンシクロビルシステム、シトシンデアミナーゼ／５－フルオロシトシンシステム、ニトロレダクターゼ／ＣＢ１９５４システム、カルボキシペプチダーゼＧ２／ナイトロジェンマスタードシステム、シトクロムＰ４５０／オキサザホスホリジン（oxazaphosphorine）システム、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ／６－メチルプリンデオキシリボシド（ＰＮＰ／ＭＥＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ／インドール－３－酢酸システム（ＨＲＰ／ＩＡＡ）、およびカルボキシルエステラーゼ／イリノテカン（ＣＥ／イリノテカン）システム、切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）、誘起可能なカスパーゼ（「ｉＣａｓｐ」）、Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｐｔ遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｄｅｏ遺伝子およびニトロレダクターゼを含む。より詳細はKarjoo, Z. et al. 2016. Adv. Drug Deliv. Rev. 99 (Pt. A):123-128を参照されたい。
細胞表面上に発現されるタンパク質は、マーカー（例えば精製または検出または追跡のため）としてまたは本明細書に開示されているＣＡＲ発現細胞の自殺スイッチを提供するために使用されてもよい。そのようなタンパク質は、本明細書において自殺遺伝子産物または検出可能マーカーまたは両方と称される。そのようなタンパク質の細胞質領域の部分または全体は通常は切断され、その結果、タンパク質のネイティブな機能は低減またはさらには消失される。そのため、そのようなタンパク質は本明細書において切断型タンパク質マーカーとも称される。一部の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の自殺スイッチとして使用される場合、切断型タンパク質マーカーは、対象における正常細胞またはＣＡＲ発現細胞に隣接する正常細胞上に発現しないか、または実質的により低いレベルで発現される。よって、ＣＡＲ発現細胞の除去（例えば、切断型タンパク質マーカーを特別に認識し、それに結合する抗体を投与することによるか、または毒素を切断型タンパク質マーカーに方向付ける部分にコンジュゲートされた毒素を投与することによる）で、対象の正常細胞は危険にさらされない。よって、一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、対象においてＣＡＲ発現細胞を低減または消失させる薬剤を対象に投与することをさらに含むことができる。さらなる実施形態では、対象においてＣＡＲ発現細胞を低減または消失させる薬剤は、自殺遺伝子産物、例えばｔＥＧＦＲまたはＲＱＲ８を特異的に認識し、それに結合する抗体またはその断片を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。追加的あるいは、対象においてＣＡＲ発現細胞を低減または消失させる薬剤の投与は、本明細書に開示されている細胞の投与の約１日、約３日、約１週、約２週、約３週、約４週、約５週、約６週、約７週、約８週、約９週、約１０週、約３か月、約４か月、約５か月、約６か月、約１年、約１．５年、約２年、またはより長い時間の後である。
一部の実施形態では、ｔＥＧＦＲは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。細胞上のｔＥＧＦＲの発現は、抗ＥＧＦＲ抗体による細胞の認識を可能にし、そのため細胞を排除する。例えば、Wu, et al., Mol Ther. 2017 Oct 4;25(10):2270-2279. doi: 10.1016/j.ymthe.2017.06.026. Epub 2017 Jul 3を参照されたい。
本明細書で使用される場合、ＣＤ３４およびＣＤ２０の両方の抗原からの標的エピトープは、組み合わせて自殺遺伝子産物または検出可能マーカーまたは両方、例えば、ＲＱＲ８として本明細書で使用され得る。ＲＱＲ８は、臨床的な選択、細胞追跡、および毒性の場合における欠失を可能にするエピトープベースのマーカー／自殺遺伝子である。例えば、Philip et al. Blood. 2014 Aug 21;124(8):1277-87、および米国特許第１０，９２５，９４３号を参照されたい。一部の実施形態では、ＲＱＲ８は、配列番号１２１を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。
シグナルペプチドは、本明細書で使用される場合、（シグナル配列、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、トランジットペプチド、リーダー配列またはリーダーペプチドと称される場合もある）は、分泌経路に向かうことが運命付けられている新たに合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短いペプチド（通常は１６～３０アミノ酸の長さ）である。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、またはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）、またはＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、またはＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）、またはＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）、またはＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、またはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）、またはＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、またはＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）、またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。別の実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）、またはＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一部の実施形態では、シグナルペプチドはアズロシジンシグナルペプチドである。さらなる実施形態では、アズロシジンシグナルペプチドは、ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号１２６）を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一部の実施形態では、アズロシジンシグナルペプチドは、ＡＴＧＡＣＴＡＧＧＴＴＧＡＣＡＧＴＣＣＴＣＧＣＣＴＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＴＴＧＣＴＴＧＣＣＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＣ（配列番号１２７）によりコードされ得る。一実施形態では、シグナルペプチドは分泌シグナルである。
分泌シグナルは、サイトゾルから分泌経路へのタンパク質のエクスポートを可能とする分泌シグナルペプチドを意図する。タンパク質は、差次的なレベルの成功裏の分泌を示すことができ、多くの場合に、ある特定のシグナルペプチドは、特定のタンパク質とパートナーとなった場合により低いまたはより高いレベルを引き起こすことができる。真核生物において、シグナルペプチドは、真核細胞のサイトゾル中のシグナル認識粒子（ＳＲＰ）により認識されるアミノ酸の疎水性ストリングである。シグナルペプチドがｍＲＮＡ－リボソーム複合体から産生された後に、ＳＲＰはペプチドに結合し、タンパク質翻訳を停止させる。ＳＲＰは次に、ｍＲＮＡ／リボソーム複合体を粗面小胞体に輸送し、タンパク質が小胞体の内腔中に翻訳される。シグナルペプチドは次にタンパク質から切断されて、小胞体中で可溶性の、または膜にタグ付加された（膜貫通領域もまた存在する場合）、タンパク質が産生される。これらは当技術分野において公知であり、ベンダー、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓから市販されている。
本明細書で使用される場合、切断可能なリンカーとも称される切断可能なペプチドは、例えば酵素により、切断され得るペプチドを意味する。そのような切断可能なペプチドを含む１つの翻訳されたポリペプチドは、２つの最終生成物を産生することができ、したがって、１つのオープンリーディングフレームから１つより多くのポリペプチドを発現することが可能となる。切断可能なペプチドの１つの例は、自己切断性ペプチド、例えば２Ａ自己切断性ペプチドである。２Ａ自己切断性ペプチドは、１８～２２ａａの長さのペプチドのクラスであり、細胞中で組換えタンパク質の切断を誘導することができる。一部の実施形態では、２Ａ自己切断性ペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２ＡおよびＢｍＣＰＶ２Ａから選択される。例えば、Wang Y, et al. 2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori. Sci Rep. 2015;5:16273. Published 2015 Nov 5を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「Ｔ２Ａ」および「２Ａペプチド」という用語は、交換可能に使用され、任意の２Ａペプチドもしくはその断片、任意の２Ａ様ペプチドもしくはその断片、またはコンセンサスポリペプチドモチーフＤ－Ｖ／Ｉ－Ｅ－Ｘ－Ｎ－Ｐ－Ｇ－Ｐ（Ｘは、自己切断性であると一般に考えられる任意のアミノ酸を指す）（配列番号１２８）を含有する相対的に短いペプチド配列（起源のウイルスに依存して２０アミノ酸ほどの長さ）中に必要なアミノ酸を含む人工ペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、「リンカー配列」、「リンカーペプチド」および「リンカーポリペプチド」という用語は、交換可能に使用され、１～１０回、あるいは約８回まで、あるいは約６回まで、あるいは約５回まで、あるいは、約４回まで、あるいは約３回まで、あるいは約２回まで繰り返されてもよい１～１０個、あるいは８個のアミノ酸、あるいは６個のアミノ酸、あるいは５個のアミノ酸を含む任意のアミノ酸配列に関する。例えば、リンカーは、３回繰り返されたペンタペプチドからなる最大１５個のアミノ酸残基を含んでもよい。一実施形態では、リンカー配列は、３コピーのｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｇｌｙ－ｓｅｒ（配列番号１２９）を含む（グリシン４セリン）３（配列番号９）柔軟性ポリペプチドリンカーである。一部の実施形態では、リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎは、１、または２、または３、または４、または５、または６、または７、または８、または９、または１０、または１１、または１２、または１３、または１４、または１５である）（配列番号１３０）である。一部の実施形態では、リンカーはヒト筋アルドラーゼ（ＨＭＡ）リンカーである。さらなる実施形態では、ＨＭＡリンカーは、ＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ（配列番号８１）を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一部の実施形態では、リンカーは、本明細書に開示されている切断可能なペプチドである。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱ（配列番号１０８）を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。
「内部リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」という用語は、本明細書で使用される場合、リボソーム結合およびｍＲＮＡ翻訳を直接的に促進し、それによりキャップ非依存的な方式で翻訳の開始を可能にするポリヌクレオチドを交換可能に指す。一部の実施形態では、ＩＲＥＳはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）上のＲＮＡ配列を指す。追加的あるいは、ＩＲＥＳはまた、ＩＲＥＳ ＲＮＡ配列に対して相補的な、またはリバースの、または相補的およびリバースの両方のポリヌクレオチド配列（例えばＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはこれらのハイブリッド）を指す。ＩＲＥＳの非限定的な例は、Hellen CU and Sarnow P. Internal ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules. Genes Dev. 2001 Jul 1;15(13):1593-612において見出され得る。
「検出可能な標識」、「標識」、「検出可能マーカー」または「マーカー」は、交換可能に使用され、放射性同位体、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含むタンパク質を含むが、これらに限定されない。検出可能な標識はまた、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体または組成物に取り付けられ得る。
本明細書で使用される場合、「標識」または検出可能な標識という用語は、検出されるべき組成物に直接的または間接的にコンジュゲートされる直接的または間接的に検出可能な化合物または組成物、例えば、Ｎ末端ヒスチジンタグ（Ｎ－Ｈｉｓ）、磁気活性同位体、例えば、１１５Ｓｎ、１１７Ｓｎおよび１１９Ｓｎ、非放射活性同位体、例えば１３Ｃおよび１５Ｎ、ポリヌクレオチドまたはタンパク質、例えば抗体であって、「標識された」組成物を生成するようなものを意図する。用語はまた、挿入された配列の発現でシグナルを提供するポリヌクレオチドにコンジュゲートされる配列、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などを含む。標識は、それ自体が検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識）、または、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学的な変更を触媒してもよい。標識は、小スケール検出のために好適であり得るか、またはハイスループットスクリーニングのためにより好適であり得る。そのため、好適な標識は、磁気活性同位体、非放射活性同位体、放射性同位体、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含むタンパク質を含むが、これらに限定されない。標識は単純に検出されてもよく、または定量化されてもよい。単純に検出される応答は、その存在が単に確認される応答を一般に含む一方、定量化される応答は、定量化可能な（例えば、数値的に報告可能な）値、例えば強度、極性化、または他の特性を有する応答を一般に含む。発光または蛍光アッセイにおいて、検出可能な応答は、結合に実際に関与するアッセイ成分と会合した発光団もしくはフルオロフォアを使用して直接的に、または別の（例えば、レポーターもしくはインジケーター）成分と会合した発光団もしくはフルオロフォアを使用して間接的に生成されてもよい。シグナルを生成する発光標識の例は、生物発光および化学発光を含むが、これらに限定されない。検出可能な発光応答は、発光シグナルにおける変化、またはその発生を一般に含む。アッセイ成分を発光的に標識するための好適な方法および発光団は当技術分野において公知であり、例えばHaugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed)において記載されている。発光プローブの例は、エクオリンおよびルシフェラーゼを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「イムノコンジュゲート」という用語は、第２の薬剤、例えば細胞傷害剤、検出可能な薬剤、放射活性剤、標的化剤、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、半合成抗体、または多特異性抗体と会合または連結された抗体または抗体誘導体を含む。
好適な蛍光標識の例は、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル－クマリン、ピレン、Ｍａｌａｃｉｔｅ ｇｒｅｅｎ、スチルベン、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（商標）、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄを含むが、これらに限定されない。他の好適な光学色素は、Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.)において記載されている。
一部の実施形態では、蛍光標識は、細胞または組織の中またはその表面上に存在する細胞成分、例えば細胞表面マーカーへの共有結合性取付けを促すために官能化される。好適な官能基は、イソチオシアネート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステル、およびハロゲン化スルホニルを含むが、これらに限定されず、これらの全ては、蛍光標識を第２の分子に取り付けるために使用され得る。蛍光標識の官能基の選択は、リンカー、薬剤、マーカー、または第２の標識化剤のいずれかへの取付けの部位に依存する。
本明細書で使用される場合、精製標識またはマーカーは、標識がコンジュゲートされた分子または成分の精製において使用され得る標識を指し、例えばエピトープタグ（Ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグを含むがこれらに限定されない）、親和性タグ（グルタチオン－Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を含むがこれらに限定されない）、または蛍光タグである。
本明細書で使用される場合、参照配列中の同定された位置に「相当する」目的の配列中のアミノ酸（ａａ）またはヌクレオチド（ｎｔ）残基位置は、残基位置が、目的の配列と参照配列との間の配列アライメントにおいて同定された位置にアライメントされることを指す。そのような配列アライメントを行うためのＣｌｕｓｔａｌ ＯｍｅｇａおよびＢＬＡＳＴなどの様々なプログラムが利用可能である。
「コンセンサス配列」という用語は、本明細書で使用される場合、複数の配列のシリーズをアライメントすることにより決定され、複数の配列の各相当する位置におけるアミノ酸または塩基の優勢な選択を表す理想化された配列を定義するアミノ酸または核酸配列を指す。複数の配列のシリーズの配列に依存して、シリーズのためのコンセンサス配列は、０個、１個、数個、またはより多くの置換により配列のそれぞれから異なることができる。また、複数の配列のシリーズの配列に依存して、１つより多くのコンセンサス配列がシリーズのために決定されてもよい。コンセンサス配列の生成は、重点的な数学的解析に供されている。コンセンサス配列を決定するために様々なソフトウェアプログラムが使用され得る。
一部の実施形態では、「ベクター」という用語は、非分裂または分裂細胞、例えばゆっくりと分裂する細胞に感染または形質導入し、必要に応じて標的細胞のゲノムに組み込まれる能力を保持する組換えベクターを意図する。一部の実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクター、例えばプラスミドである。一部の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。
「プラスミド」は、染色体ＤＮＡと分離された染色体外のＤＮＡ分子であり、染色体ＤＮＡとは独立に複製することができる。これは多くの場合に環状で二本鎖である。プラスミドは微生物の集団の中で遺伝子の水平移動の機構を提供し、典型的には所与の環境状況の下で選択的な利点を提供する。プラスミドは、競合的な環境ニッチの中で天然に存在する抗生剤への耐性を提供する遺伝子を運搬するか、あるいは産生するタンパク質が同様の状況の下で毒素として作用することがある。多くのプラスミドがそのような用途のために市販で入手できる。複製すべき遺伝子は、特定の抗生剤に対して細胞を耐性にする遺伝子および多重クローニング部位（ＭＣＳ、またはポリリンカー）を含むプラスミドのコピーに挿入される。ＭＣＳは、一般に使用されるいくつかの制限部位を含む短い領域であり、この位置におけるＤＮＡ断片の挿入を容易にする。一部の実施形態では、ウイルスベクターまたはウイルスゲノムの産生において１つまたは複数のプラスミドが使用される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを複製または増幅するためにプラスミドが使用される。プラスミドの別の主要な使用は、大量のタンパク質の作製である。この場合には、研究者は目的の遺伝子を含むプラスミドを含む細菌を増殖させる。細菌がその抗生剤耐性を付与するタンパク質を産生するのと同時に、挿入された遺伝子から大量のタンパク質を産生するように細菌を誘起することもできる。これは、遺伝子またはこれがコードするタンパク質を大量生産する安価で容易な方法である。
「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏで宿主細胞中に送達すべきポリヌクレオチド（ウイルスゲノム）を含む、組換え産生されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。当業者には知られているように、ウイルスには６つのクラスがある。ＤＮＡウイルスはクラスＩおよびＩＩからなっている。ＲＮＡウイルスおよびレトロウイルスが残りのクラスを構成する。クラスＩＩＩのウイルスは二本鎖ＲＮＡゲノムを有している。クラスＩＶのウイルスはポジティブな一本鎖ＲＮＡゲノムを有し、ゲノムそれ自体はｍＲＮＡとして作用する。クラスＶウイルスはｍＲＮＡ合成の鋳型として使用されるネガティブな一本鎖ＲＮＡゲノムを有している。クラスＶＩウイルスはポジティブな一本鎖ＲＮＡゲノムを有しているが、複製のみでなくｍＲＮＡ合成においてもＤＮＡ中間体を有している。レトロウイルスはその遺伝情報をＲＮＡの形で運搬するが、ウイルスが細胞に感染すれば、ＲＮＡはＤＮＡ形態に逆転写され、ＤＮＡが必要に応じて感染細胞のゲノムＤＮＡの中に一体化される。一体化されたＤＮＡ形態はプロウイルスと称される。
ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター等が含まれる。アルファウイルスベクター、例えばセミリキフォレストウイルス系ベクターおよびシンドビスウイルス系ベクターも、遺伝子療法および免疫療法における使用のために開発されてきた。Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 およびYing, et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827を参照されたい。
いくつかの実施形態では、ベクターは野生型ウイルスから誘導されるか、これに基づいている。さらなる実施形態では、ベクターは野生型のアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレトロウイルス、例えばガンマレトロウイルスもしくはレンチウイルスの１つまたは複数から誘導されるか、これらに基づいている。本明細書で使用される場合、ベクターはガンマレトロウイルスベクター（ＰＣＩＲ）であってよい。レトロウイルスの例には、制限なくモロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ネズミ幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、またはフレンドネズミ胚幹細胞ウイルス（ＦＭＥＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が含まれる。ウイルスベクターは２つまたはそれより多い異なるウイルスから誘導された成分を含んでよく、合成成分を含んでもよい。ベクター成分は、標的細胞特異性等の所望の特性を得るために操作することができる。
本開示の組換えベクターは、霊長類および非霊長類から誘導してよい。霊長類レンチウイルスの例には、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。非霊長類レンチウイルスの群には、プロトタイプ「スローウイルス」ｖｉｓｎａ／ｍａｅｄｉウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連するヤギ関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、最近記載されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。先行技術の組換えレンチウイルスベクターは当技術で公知であり、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９２４，１２３号、第７，０５６，６９９号、第７，４１９，８２９号、および第７，４４２，５５１号を参照されたい。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは自己不活化レンチウイルスベクターである。さらなる実施形態では、レンチウイルスベクターはＴＡＴＡボックスを欠くＵ３領域を有している。さらにまたはその代わりに、レンチウイルスベクターは転写因子結合部位の１つまたは複数を欠くＵ３領域を有している。
ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルス等のレトロウイルスは、（ａ）脂質および糖タンパク質を含むエンベロープ、（ｂ）標的細胞に送達されるＲＮＡ（通常、ＬＴＲに隣接する、５’末端にキャップおよび３’末端にポリＡテイルを含むダイマーＲＮＡ）であるベクターゲノム、（ｃ）カプシド、および（ｄ）プロテアーゼ等のその他のタンパク質を含む。米国特許第６，９２４，１２３号は、ある種のレトロウイルス配列が標的細胞ゲノムへの一体化を容易にしていることを開示している。この特許は、それぞれのレトロウイルスゲノムが、ビリオンタンパク質および酵素をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖと称される遺伝子を含んでいることを教示している。これらの遺伝子は両端において長いターミナルリピート（ＬＴＲ）と称される領域に隣接している。ＬＴＲはプロウイルスの一体化および転写に関与している。これらは、エンハンサー－プロモーター配列としても働く。換言すれば、ＬＴＲはウイルス遺伝子の発現を制御することができる。レトロウイルスＲＮＡのカプシド化は、ウイルスゲノムの５’末端に位置するｐｓｉ配列によって生じる。ＬＴＲそれ自体は、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５と称される３つのエレメントに分割できる同一の配列である。Ｕ３はＲＮＡの３’末端に特有の配列から誘導される。ＲはＲＮＡの両末端において繰り返される配列から誘導され、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に特有の配列から誘導される。３つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルスの間でかなり変動することがある。ウイルスゲノムについては、ポリ（Ａ）付加（終止）の部位は、右手側ＬＴＲのＲとＵ５の境界にある。Ｕ３はプロウイルスの転写制御エレメントの大部分を含み、細胞の、またある場合にはウイルスの、転写アクチベータータンパク質に関与するプロモーターおよび多重エンハンサー配列を含む。
構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖそれ自体に関しては、ｇａｇはウイルスの内部構造タンパク質をコードする。ｇａｇタンパク質はタンパク質分解によって成熟タンパク質ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（カプシド）、およびＮＣ（ヌクレオカプシド）に処理される。ｐｏｌ遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼ、付随するＲＮアーゼＨ、およびインテグラーゼ（ＩＮ）を含む逆転写酵素（ＲＴ）をコードし、これらがゲノムの複製を媒介する。
ウイルスベクター粒子の産生のため、ベクターゲノム（例えばＲＮＡベクターゲノム）が、宿主細胞中で、それをコードするＤＮＡ構築物（例えばプラスミド）から発現される。ベクターゲノムによってコードされない粒子の成分は、宿主細胞中で発現される追加の核酸配列（通常、ｇａｇ／ｐｏｌの一方または両方、およびｅｎｖ遺伝子を含む「パッケージングシステム」）によってトランスで提供される。ウイルスベクター粒子の産生に必要な配列の組は、過渡的なトランスフェクションによって宿主細胞に導入されるか、宿主細胞ゲノムに一体化されるか、または様々な方法の組合せで提供されてよい。関連する手法は、当業者には公知である。
遺伝子導入がレンチウイルスベクターによって媒介される実施形態では、ベクター構築物は、レンチウイルスゲノムまたはその一部および治療用遺伝子を含むポリヌクレオチドを意味する。本明細書で使用される場合、「レンチウイルス媒介遺伝子導入」または「レンチウイルス形質導入」は同じ意味を有し、細胞中に進入し、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに一体化するウイルスによって遺伝子または核酸配列が宿主細胞中に安定的に導入されるプロセスを意味する。ウイルスは、その正常な感染機構を介して宿主細胞中に進入することができ、または細胞に進入するために異なる宿主細胞表面受容体またはリガンドに結合するように改変することもできる。レトロウイルスはその遺伝情報をＲＮＡの形態で有しているが、ウイルスがいったん細胞に感染すれば、ＲＮＡはＤＮＡ形態に逆転写され、これが感染した細胞のゲノムＤＮＡの中に一体化される。一体化されたＤＮＡ形態はプロウイルスと称される。本明細書で使用される場合、レンチウイルスベクターは、ウイルスまたはウイルス様の進入機構によって外因性核酸を細胞内に導入することができるウイルス粒子を意味する。「レンチウイルスベクター」は、非分割細胞の形質導入において他のレトロウイルスベクターと比較してある種の利点を有する、当技術で周知のレトロウイルスベクターの型である。Trono D. (2002) Lentiviral vectors, New York: Spring-Verlag Berlin Heidelbergを参照されたい。
本開示のレンチウイルスベクターは、オンコレトロウイルス（ＭＬＶを含むレトロウイルスのサブグループ）およびレンチウイルス（ＨＩＶを含むレトロウイルスのサブグループ）に基づくか、これらから誘導される。例には、ＡＳＬＶ、ＳＮＶ、およびＲＳＶが含まれ、これらの全てはレンチウイルスベクター粒子産生系のパッケージングおよびベクター成分に分割されている。本開示によるレンチウイルスベクター粒子は、特定のレトロウイルスの遺伝的にまたはその他に（例えばパッケージング細胞系の特定の選択によって）変更されたバージョンに基づいてよい。
本明細書で使用される用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、この名称に随伴し、ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーに属するウイルスのクラスのメンバーを意味する。このウイルスの多数の血清型は遺伝子送達に好適であることが知られており、公知の全ての血清型が種々の組織型由来の細胞に感染することができる。連続的に番号付けされた少なくとも１１種のＡＡＶ血清型が当技術で公知である。本明細書で開示する方法において有用な非限定的で例示的な血清型には、１１種の血清型、例えばＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９のいずれか、またはバリアントもしくは合成の血清型、例えばＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂが含まれる。ＡＡＶ粒子は、３つの主要なウイルス粒子：ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含むか、あるいは本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ、またはＡＡＶ ｒｈ７４を意味する。これらのベクターは市販で入手可能であるか、または特許もしくは技術文献に記載されている。
本開示によるベクター粒子が特定のレトロウイルスに「基づいている」ということは、そのベクターがその特定のレトロウイルスから誘導されることを意味する。ベクター粒子のゲノムは、そのレトロウイルスに由来する成分を骨格として含む。ベクター粒子は、逆転写および一体化の系を含む、ＲＮＡゲノム等のゲノムと適合性のある基本的なベクター成分を含む。通常、これらは、特定のレトロウイルスから誘導されたｇａｇおよびｐｏｌタンパク質を含むことになる。すなわち、ベクター粒子の構造成分の大多数は、通常はそのレトロウイルスに由来することになるが、これらは所望の有用な特性を提供するように遺伝子的にまたはその他に変更されていてよい。しかし、ある種の構造成分および特にｅｎｖタンパク質は、異なるウイルスに起源してもよい。ベクター宿主範囲および感染または形質導入された細胞型を、ベクター粒子産生系における様々なｅｎｖ遺伝子を使用して変更し、ベクター粒子に異なる特異性を付与することができる。
本明細書で使用される場合、細胞は原核生物または真核生物の細胞であってよい。さらなる実施形態では、細胞は免疫細胞である。
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」には、例えば骨髄で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）から誘導されてよい白血球（ロイコサイト、例えば顆粒細胞（好中球、好酸球、および好塩基球）、単球、およびリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＮＫＴ細胞））、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＮＫＴ細胞）、および骨髄から誘導される細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が含まれる。一部の実施形態では、免疫細胞は以下：前駆細胞、胚幹細胞、胚幹細胞から誘導された細胞、胚胎芽細胞、胚胎芽細胞から誘導された細胞、幹細胞、幹細胞から誘導された細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳｃ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または不死化細胞の１つまたは複数から誘導される。一部の実施形態では、ＨＳＣは、対象の臍帯血、対象の末梢血、または対象の骨髄から誘導される。
「宿主細胞」は、特定の対象細胞のみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫を意味する。ある種の改変は突然変異または環境の影響によって継続する世代において起こり得るので、そのような子孫は、事実上、親細胞と同一ではないかもしれないが、それでも本明細書で使用される用語の範囲の中に含まれる。
細胞の「富化された集団」は、ある種の定義された特徴を有する実質的に均一な細胞の集団を意図している。細胞は定義された特徴において７０％を超え、あるいは７５％を超え、あるいは８０％を超え、あるいは８５％を超え、あるいは９０％を超え、あるいは９５％を超え、あるいは９８％を超えて同一である。
用語「増殖させる」は、細胞または細胞の集団を成長させることを意味する。用語「成長させる」も、支持培地、栄養素、増殖因子、支持細胞、または所望の数の細胞もしくは細胞型を得るために必要な任意の化学的または生物学的な化合物の存在下における細胞の増殖を意味する。
用語「培養する」は、様々な種類の培地の上または中における細胞または生命体のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの増殖を意味する。培養で増殖した細胞の子孫は親細胞と完全に同一ではないかもしれない（すなわち形態的、遺伝的、または表現型的に）ことが理解される。
本明細書で使用される場合、用語「ＮＫ細胞」はナチュラルキラー細胞としても知られており、骨髄起源で先天性の免疫系において重要な役割を果たすリンパ球の型を意味する。ＮＫ細胞は、細胞表面上の抗体および主要組織適合性複合体の非存在下であってもウイルス感染細胞、腫瘍細胞、またはその他のストレスを受けた細胞に対する迅速な免疫応答を提供する。ＮＫ細胞は、市販で入手可能な供給源から単離または取得できる。市販のＮＫ細胞系の非限定的な例には、ＮＫ－９２系（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０７（商標））、ＮＫ－９２ＭＩ系（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０８（商標））が含まれる。さらなる例には、それだけに限らないが、ＮＫ系ＨＡＮＫ１、ＫＨＹＧ－１、ＮＫＬ、ＮＫ－ＹＳ、ＮＯＩ－９０、およびＹＴが含まれる。そのような市販で入手可能な細胞系の非限定的で例示的な供給源には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、すなわちＡＴＣＣ（www.atcc.org/）およびＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（www.dsmz.de/）が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞」は、胸腺で成熟するリンパ球の型を意味する。Ｔ細胞は細胞媒介免疫において重要な役割を果たし、細胞表面上のＴ細胞受容体の存在によって他のリンパ球、例えばＢ細胞と区別される。Ｔ細胞は市販で入手可能な供給源から単離または取得できる。「Ｔ細胞」には、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｔ制御細胞（Ｔｒｅｇ）、およびガンマ－デルタＴ細胞を含む、ＣＤ３を発現する全ての型の免疫細胞が含まれる。「細胞傷害性細胞」にはＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および好中球が含まれ、これらの細胞は細胞傷害性応答を媒介することができる。市販で入手可能なＴ細胞系の非限定的な例には、ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ系（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９０２（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ系（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９００（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ系（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９０１（商標））、ＢＣＬ２ Ｊｕｒｋａｔ系（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２８９９（商標））、Ｎｅｏ Ｊｕｒｋａｔ系（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２８９８（商標））、ＴＡＬＬ－１０４細胞傷害性ヒトＴ細胞系（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ－１１３８６）が含まれる。さらなる例には、それだけに限らないが、成熟Ｔ細胞系、例えばＤｅｇｌｉｓ、ＥＢＴ－８、ＨＰＢ－ＭＬｐ－Ｗ、ＨＵＴ ７８、ＨＵＴ １０２、Ｋａｒｐａｓ ３８４、Ｋｉ ２２５、Ｍｙ－Ｌａ、Ｓｅ－Ａｘ、ＳＫＷ－３、ＳＭＺ－１ およびＴ３４；および未成熟Ｔ細胞系、例えばＡＬＬ－ＳＩＬ、Ｂｅ１３、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＣＭＬ－Ｔ１、ＤＮＤ－４１、ＤＵ．５２８、ＥＵ－９、ＨＤ－Ｍａｒ、ＨＰＢ－ＡＬＬ、Ｈ－ＳＢ２、ＨＴ－１、ＪＫ－Ｔ１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋａｒｐａｓ ４５、ＫＥ－３７、ＫＯＰＴ－Ｋ１、Ｋ－Ｔ１、Ｌ－ＫＡＷ、Ｌｏｕｃｙ、ＭＡＴ、ＭＯＬＴ－１、ＭＯＬＴ ３、ＭＯＬＴ－４、ＭＯＬＴ １３、ＭＯＬＴ－１６、ＭＴ－１、ＭＴ－ＡＬＬ、Ｐ１２／Ｉｃｈｉｋａｗａ、Ｐｅｅｒ、ＰＥＲ０１１７、ＰＥＲ－２５５、ＰＦ－３８２、ＰＦＩ－２８５、ＲＰＭＩ－８４０２、ＳＴ－４、ＳＵＰ－Ｔ１～Ｔ１４、ＴＡＬＬ－１、ＴＡＬＬ－１０１、ＴＡＬＬ－１０３／２、ＴＡＬＬ－１０４、ＴＡＬＬ－１０５、ＴＡＬＬ－１０６、ＴＡＬＬ－１０７、ＴＡＬＬ－１９７、ＴＫ－６、ＴＬＢＲ－１、－２、－３、および－４、ＣＣＲＦ－ＨＳＢ－２（ＣＣＬ－１２０．１）、Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５３）、Ｊ４５．０１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９９０）、Ｊ．ＣａＭ１．６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２０６３）、ＲＳ４；１１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１８７３）、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ（ＡＴＣＣ ＣＲＭ－ＣＣＬ－１１９）；ならびに皮膚Ｔ細胞リンパ腫系、例えばＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ ＣＲＭ－ＴＩＢ－１６１）、ＭＪ［Ｇ１１］（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－８２９４）、ＨｕＴ１０２（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１６２）が含まれる。ＲＥＨ、ＮＡＬＬ－１、ＫＭ－３、Ｌ９２－２２１を含むが、これらに限らないヌル白血病細胞系、ならびに他の白血病およびリンパ腫から誘導される細胞系、例えばＫ５６２赤白血病、ＴＨＰ－１単球白血病、Ｕ９３７リンパ腫、ＨＥＬ赤白血病、ＨＬ６０白血病、ＨＭＣ－１白血病、ＫＧ－１白血病、Ｕ２６６骨髄腫は、市販で入手可能な免疫細胞の別の供給源である。そのような市販で入手可能な細胞系の非限定的で例示的な供給源には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、すなわちＡＴＣＣ（www.atcc.org/）およびＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（www.dsmz.de/）が含まれる。
用語「幹細胞」は、非分化または部分的分化の状態にあり、自己更新する能力もしくは分化した子孫を生成する能力またはその両方を有する細胞を意味する。自己更新は、増殖してより多くのそのような幹細胞を生じる一方、その発達可能性（すなわち分化全能性、多能性（pluripotent）、多能性（multipotent）、その他）を維持する幹細胞の能力として定義される。用語「体性幹細胞」は、本明細書で胎児、若年、および成年の組織を含む非胚組織から誘導された任意の幹細胞を意味するために使用される。天然の体性幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵、骨格筋、および心筋を含む広範囲の成年組織から単離されている。天然に存在する例示的な体性幹細胞には、それだけに限らないが、間充織幹細胞（ＭＳＣ）および神経系またはニューロンの幹細胞（ＮＳＣ）が含まれる。一部の実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、胚幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってよい。一部の実施形態では、幹細胞または前駆細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。本明細書で使用される場合、「胚幹細胞」は、前胚組織（例えば胚盤胞）、胚組織、または典型的には妊娠約１０～１２週の前であるが必ずしもそうでなくてもよい妊娠中の任意の時期に採取された胎児組織を含む、受精後で妊娠の終了前に形成された組織から誘導される幹細胞を意味する。最も頻繁には、胚幹細胞は早期の胚または胚盤胞から誘導された多能性細胞である。胚幹細胞は、ヒト組織を含むがそれに限らない好適な組織から、または確立された胚細胞系から直接得ることができる。「胚様幹細胞」は、胚幹細胞の１つまたは複数であるが全てではない特徴を共有する細胞を意味する。
「分化」は、専門化されていない細胞が、心細胞、肝細胞、免疫細胞、または筋肉細胞等の専門化された細胞の特徴を獲得するプロセスを表現している。「方向付けられた分化」は、特定の細胞型への分化を誘起するための幹細胞の培養条件の操作を意味する。「脱分化した」は、細胞のリニエージの中で関わりが少ない立場に逆行する細胞を定義している。本明細書で使用される場合、用語「分化するまたは分化した」は、細胞のリニエージの中で関わりが大きい（「分化した」）立場をとる細胞を定義している。
本明細書で使用される場合、用語「分化するまたは分化した」は、細胞のリニエージの中で関わりが大きい（「分化した」）立場をとる細胞を定義している。「脱分化した」は、細胞のリニエージの中で関わりが少ない立場に逆行する細胞を定義している。誘導多能性幹細胞は、脱分化した細胞の例である。
本明細書で使用される場合、細胞の「リニエージ」は、細胞の遺伝性、すなわちその祖先および子孫を定義している。細胞のリニエージは、細胞を発達および分化の遺伝的スキームの中に置く。
「マルチリニエージ幹細胞」または「多能性幹細胞」は、それ自体および区別できる発達リニエージに由来する少なくとも２つのさらに分化した子孫細胞を再生産する幹細胞を意味する。リニエージは、同じ胚葉（すなわち中胚葉、外胚葉、または内胚葉）由来または異なる胚葉由来であってよい。
「前駆体」または「前駆細胞」は、特定の細胞の型に分化する能力を有する細胞を意味することを意図している。前駆細胞は幹細胞であってよい。前駆細胞は幹細胞より特異的であってよい。前駆細胞は単能性または多能性であってよい。成年幹細胞と比較して、前駆細胞は細胞分化の遅い段階にあってよい。前駆細胞の例には、限定なく前駆神経細胞が含まれる。
本明細書で使用される場合、「多能性細胞」は、少なくとも２つの区別できる（遺伝型もしくは表現型またはその両方として）さらに分化した子孫細胞を生じることができる低分化の細胞を定義している。別の態様では、「多能性細胞」には、歴史的には１つまたは複数の幹細胞特異的遺伝子の発現を誘起することによって産生されてきた、非多能性細胞、典型的には成年体細胞から人工的に誘導された幹細胞である誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が含まれる。そのような幹細胞特異的遺伝子には、それだけに限らないが、オクタマー転写因子のファミリー、すなわちＯｃｔ－３／４；Ｓｏｘ遺伝子のファミリー、すなわちＳｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、およびＳｏｘ１８；Ｋｌｆ遺伝子のファミリー、すなわちＫｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、およびＫｌｆ５；Ｍｙｃ遺伝子のファミリー、すなわちｃ－ｍｙｃおよびＬ－ｍｙｃ；Ｎａｎｏｇ遺伝子のファミリー、すなわちＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびＲＥＸ１；またはＬＩＮ２８が含まれる。ｉＰＳＣの例は、Takahashi et al. (2007) Cell advance online publication 20 November 2007; Takahashi & Yamanaka (2006) Cell 126:663-76; Okita et al. (2007) Nature 448:260-262; Yu et al. (2007) Science advance online publication 20 November 2007; およびNakagawa et al. (2007) Nat. Biotechnol. Advance online publication 30 November 2007に記載されている。
「誘導多能性細胞」は、成年細胞から未成熟表現型に再プログラミングされた胚様細胞を意図している。当技術において種々の方法、例えば"A simple new way to induce pluripotency: Acid." Nature, 29 January 2014 が知られており、sciencedaily.com/releases/2014/01/140129184445（２０１４年２月５日に最後に閲覧）、および米国特許出願公開第２０１０／００４１０５４号で入手可能である。ヒトｉＰＳＣは幹細胞マーカーも発現しており、３つ全ての肺葉に特徴的な細胞を生成することができる。
「単為発生幹細胞」は、卵の単為活性化から生じる幹細胞を意味する。単為発生幹細胞を創成する方法は当技術で公知である。例えばCibelli et al. (2002) Science 295(5556):819 およびVrana et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(Suppl. 1)11911-6を参照されたい。
本明細書で使用される場合、用語「多能性遺伝子またはマーカー」は、未成熟または未分化の表現型、例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｃ－Ｍｙｃ、およびＬＩＮ－２８に相関された、発現した遺伝子またはタンパク質を意図している。これらを同定する方法は当技術で公知であり、これらを同定するシステムは、例えばＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）Ｍａｐ Ｋｉｔ）から市販で入手可能である。
本明細書で使用される場合、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、白血球、赤血球、および血小板を含むがこれらに限らない全ての型の血液細胞を生じる、幹細胞等の細胞である。造血幹細胞は末梢血および骨髄において見出すことができる。一部の実施形態では、本明細書で開示する免疫細胞は、ＨＳＣから誘導される。
用語「表現型」は、集団の中の個体のサブセットにおいてのみ測定可能であり、発現される個体の形質または特徴の表現を意味する。本開示の一態様では、個体の表現型には、単一細胞、細胞の実質的に均一な集団、分化した細胞の集団、または細胞の集団からなる組織の表現型が含まれる。
一部の実施形態では、細胞の集団は、表現型もしくは遺伝型またはその両方において同一の（クローナルな）または非同一の２つ以上の細胞の集合を意図している。集団は、本明細書に記載したように、精製され、高度に精製され、実質的に均一または不均一であり得る。
用語「有効な期間（または時間）」および「有効な条件」は、薬剤または組成物が、その意図した結果、例えば所定の細胞型への細胞の分化または脱分化を達成するために必要なまたは好ましい期間またはその他の制御可能な条件（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法における温度、湿度）を意味する。
「実質的に均一」は、細胞の約５０％超、あるいは約６０％超、あるいは７０％超、あるいは７５％超、あるいは８０％超、あるいは８５％超、あるいは９０％超、あるいは９５％超が同じまたは同様の表現型である細胞の集団を表現している。表現型は、予め選択した細胞表面マーカーまたはその他のマーカーによって決定することができる。
用語「許容できる」、「有効な」、または「十分な」は、本明細書で開示する任意の成分、範囲、用量形態、その他の選択を表現するために使用される場合には、前記成分、範囲、用量形態、その他が開示した目的に適していることを意図している。
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」等は、所望の薬学的または生理学的な効果を得ることを意味するために本明細書で使用される。一部の実施形態では、効果は、障害またはその兆候もしくは症状を完全にまたは部分的に防止するという観点で予防的であってよく、または障害もしくは障害に起因する有害効果の部分的または完全な治癒の観点で治療的であってよい。「処置」の例には、それだけに限らないが、障害に罹患する傾向があるが障害を有するとは診断されていない対象において障害が生じることを防止すること、障害を阻止すること、すなわちその進行を阻むこと、または障害の症状を緩和もしくは改善することが含まれる。一部の実施形態では、処置は、疾患または障害、例えばがんの症状の進行を阻止することである。一部の実施形態では、処置は、（１）罹患する傾向があるか疾患の症状を呈していない対象において症状または疾患が生じることを防止すること；（２）疾患を阻止するかその進行を阻むこと；または（３）疾患または疾患の症状を改善するか寛解を惹起することを意味する。当技術で理解されるように、「処置」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本技術の目的のため、有益なまたは所望の結果には、検出可能であっても検出可能でなくても、１つまたは複数の症状の緩和または改善、状態（疾患を含む）の程度の消失、状態（疾患を含む）の状況の安定化（すなわち悪化しないこと）、状態（疾患を含む）の遅延または遅くすること、状態（疾患を含む）の進行、改善、または軽減、状況および寛解（部分的であっても全体的であっても）の１つまたは複数を含み得るが、これらに限らない。疾患ががんである場合には、以下の臨床的エンドポイントが、処置の非限定的な例である。腫瘍負荷の低減、腫瘍成長の遅延、全生存期間の延長、腫瘍進行の長期化、転移の阻止、または腫瘍の転移の低減。疾患が免疫細胞のがんである一部の実施形態、例えば多発性骨髄腫（ＭＭ）または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の場合には、対象の生物試料、例えば末梢血、血漿、または血清中の免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）レベル、もしくは残存がん細胞（例えばフローサイトメトリー、ＲＴ－ＰＣＲ、またはその他の従来の臨床方法によって測定される）、またはその両方の低減を、臨床的エンドポイントとして使用してよい。疾患ががんまたは腫瘍である一部の実施形態では、対象の末梢血、血漿、または血清等の生体試料中の（例えばＰＣＲまたはその他の好適な臨床方法によって測定される）循環中の腫瘍細胞（ＣＴＣ、血管系またはリンパ系中に流出し、血液循環の中で対象の身体中に運搬される細胞を意味する）の低減を、臨床的エンドポイントとして使用してよい。一部の実施形態では、処置は予防を除外する。一態様では、処置は予防を除外する。
本明細書で使用される場合、用語「試料」および「生体試料」は相互交換可能に使用され、対象から誘導された試料材料を意味する。生体試料には、対象から単離された組織、細胞、細胞のタンパク質または膜抽出物、および生物流体（例えば腹水または脳脊髄液（ＣＳＦ））、ならびに対象の内部に存在する組織、細胞、および流体が含まれ得る。生物試料には、それだけに限らないが、乳腺組織、腎組織、子宮頸部、子宮内膜、頭頸部、胆嚢、耳下腺組織、前立腺、脳、下垂体、腎組織、筋肉、食道、胃、小腸、結腸、肝、脾、膵、甲状腺組織、心組織、肺組織、膀胱、脂肪組織、リンパ節組織、子宮、卵巣組織、副腎組織、精巣組織、扁桃腺、胸腺、血液、毛髪、頬、皮膚、血清、血漿、ＣＳＦ、精液（semen）、前立腺液、精液（seminal fluid）、尿、糞便、汗、唾液、痰、粘液、骨髄、リンパ、および涙液から採取された試料が含まれ得る。一部の実施形態では、生体試料は、末梢血、血漿、または血清から選択される。一部の実施形態では、試料は腫瘍生検である。
本明細書で使用される場合、治療用のタンパク質またはポリペプチドは、抗体もしくはその断片、酵素、リガンド、または受容体を含むがそれらに限らない、処置のために好適なタンパク質またはポリペプチドを意味する。そのような治療用のタンパク質またはポリペプチドは、処置すべき疾患に基づいて医師または当業者によって選択され得る。例えば、がんを処置するためには、免疫チェックポイント受容体またはそのリガンドに対する抗体、例えば抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその両方を使用してよい。
一実施形態では、本明細書で使用される用語「疾患」または「障害」は、がん、がんを有すると診断される状態、がんを有すると疑われる状態、またはがんを有する高いリスクにある状態を意味する。
本明細書で使用される場合、「がん」は、対象における異常な制御できない複製を示す細胞の存在によって特徴付けられる疾患状態であり、一部の態様では、この用語は用語「腫瘍」と相互交換可能に使用してよい。用語「がんまたは腫瘍の抗原」は、がん細胞または腫瘍の細胞もしくは組織に付随し、その表面に発現されることが知られている抗原を意味し、用語「がんまたは腫瘍を標的とする抗体」は、そのような抗原を標的とする抗体を意味する。一部の実施形態では、本明細書で使用される用語「がん」は、多発性骨髄腫（ＭＭ）を意味する。一部の実施形態では、本明細書で使用される用語「がん」は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を意味する。さらにまたはその代わりに、本明細書で使用されるがんは、ＢＣＭＡまたはＧＰＲＣ５Ｄの１つまたは両方を発現する。
「固形腫瘍」は、通常は嚢胞または液体区域を含まない組織の異常な密集体である。固形腫瘍は良性または悪性、転移性または非転移性であることがある。様々な型の固形腫瘍が、これを形成する細胞の型について命名されている。固形腫瘍の例には、肉腫、癌腫、およびリンパ腫が含まれる。
「組成物」は、活性薬剤と不活性（例えば検出可能な薬剤または標識）または活性な別の化合物または組成物、例えばアジュバント、希釈剤、結合剤、安定化剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバント、その他の組合せを意味し、薬学的に許容される担体を含むことを意図している。
担体にも、医薬用の賦形剤および添加剤タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物（例えば単糖、二オリゴ糖、三オリゴ糖、四オリゴ糖、およびオリゴ糖を含む糖類；アルジトール、アルドン酸、エステル化糖類等の誘導糖類；ならびに多糖または糖ポリマー類）が含まれ、これらは、個別にまたは組合せで存在し、単独でまたは組合せで重量もしくは体積の１～９９．９９％を構成してよい。例示的なタンパク質賦形剤には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）等の血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン等が含まれる。緩衝容量においても機能し得る代表的なアミノ酸／抗体成分には、アラニン、アルギニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテーム等が含まれる。炭水化物賦形剤も本技術の範囲内であることを意図しており、その例には、それだけに限らないが、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボース等の単糖；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等の二糖；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖；ならびにマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、およびミオイノシトール等のアルジトールが含まれる。
「医薬組成物」は、活性なポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、または細胞と、組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏにおける診断または治療の用途に好適にする、固体支持体等の不活性または活性の担体との組合せを含むことを意図している。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、標準的な医薬用担体のいずれか、例えばリン酸塩緩衝食塩溶液、水、およびエマルション、例えば油／水もしくは水／油エマルション、および種々の型の湿潤剤を包含する。組成物は、安定剤および保存剤を含んでもよい。担体、安定剤、およびアジュバントの例については、Martin (1975) Remington’s Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton)を参照されたい。用語「薬学的に許容される担体（または媒体）」は、用語「生物学的に適合する担体または媒体」と相互交換可能に使用されてよく、治療用に投与される細胞およびその他の薬剤と適合するのみでなく、妥当な医学的判断の範囲内で過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の合併症がなく、適正な利益対リスク比に相応する、人類および動物の組織と接触する用途に適した、薬剤、細胞、化合物、材料、組成物、もしくは投薬形態、またはこれらの任意の組合せを意味する。本開示における使用のために好適な薬学的に許容される担体には、液体、半固体（例えばゲル）、および固体の材料（例えば細胞のスカフォールドおよびマトリックス、チューブ、シートおよびその他の当技術で公知で本明細書でより詳細に記載した材料）が含まれる。これらの半固体および固体の材料は、体内での分解に抵抗する（非生分解性）ように設計してよく、または体内で分解する（生分解性、生浸食性）ように設計してもよい。生分解性材料はさらに生体再吸収性または生体吸収性であってよく、すなわち体液に溶解され吸収されてもよく（水溶性インプラントが１つの例である）、または他の材料への変換もしくは天然の経路を通る分解および排除によって分解され、最終的には身体から排除されてもよい。
「薬学的に許容される担体」は、本明細書で開示する組成物中で使用され得る任意の希釈剤、賦形剤、または担体を意味する。薬学的に許容される担体には、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、リン酸塩等の緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、プロタミン硫酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩等の塩または電解質、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス類、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が含まれる。好適な医薬用担体は、この分野における標準的な参照教科書であるRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Companyに記載されている。これらは、意図した投与の形態、すなわち経口錠剤、カプセル、エリキシル、シロップ等に関連し、従来の医薬業務と合致するように選択されてよい。
本開示に従って使用される組成物は、投与を容易にし、投薬量を均一にするために、投薬単位形態で包装することができる。用語「単位用量」または「投薬量」は、対象における使用のために好適な物理的に離散的な単位を意味し、各単位はその投与、すなわち適切な経路およびレジメンに付随する所望の応答を産生するように計算された所定の量の組成物を含む。投与すべき量は処置の数および単位用量の両方に従い、望ましい結果もしくは保護またはその両方に依存する。組成物の正確な量は臨床医の判断にもより、それぞれの個体に特有である。用量に影響する因子には、対象の身体的および臨床的な状態、投与の経路、意図した処置の目標（症状の緩和と治癒）、ならびに特定の組成物の能力、安定性、および毒性が含まれる。製剤化に際しては、溶液は、投薬製剤と適合する様式で、治療的または予防的に有効な量で、投与される。製剤は、種々の投薬形態、例えば本明細書に記載した注射可能な溶液の型で容易に投与される。
本明細書で使用される場合、用語「接触させる」は、２つまたはそれより多い分子またはその他の実体の間の直接的または間接的な結合または相互作用を意味する。直接的相互作用の特定の例は結合である。間接的な相互作用の特定の例は、１つの実体が中間の分子に作用し、これが次に第２の参照した実体に作用する場合である。本明細書で使用される接触は、溶液中、固相中、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、細胞中、およびｉｎ ｖｉｖｏを含む。ｉｎ ｖｉｖｏにおける接触は、投与すること、または投与と称することができる。
細胞もしくはベクターまたはその他の薬剤およびこれらを含む組成物の「投与」または「送達」は、処置の経過を通して連続的または間欠的に、１つの用量で実施することができる。最も効果的な投与の手段および投薬量を決定する方法は当業者には公知であり、治療に使用される組成物、治療の目的、処置される標的細胞、および処置される対象に応じて変動することになる。単回投与または多回投与は、処置を施す医師または動物の場合には処置を施す獣医によって選択される用量レベルおよびパターンで行うことができる。好適な投薬製剤および薬剤を投与する方法は、当技術で公知である。投与経路を決定することもでき、最も有効な投与経路を決定する方法は当業者には公知であり、処置に使用される組成物、処置の目的、処置される対象の健康状態または疾患のステージ、および標的の細胞または組織によって変動することになる。投与経路の非限定的な例には、経口投与、腹腔内、注入、経鼻投与、吸入、注射、および局所的適用が含まれる。一部の実施形態では、投与は腫瘍内投与もしくは腫瘍微小環境への投与、またはその両方である。一部の実施形態では、投与はある特定の時間、例えば約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約２４時間、またはそれより長くにわたる注入（例えば対象の末梢血への）である。
用語「投与」は、限定なく経口、非経口（例えば筋肉内、腹腔内、静脈内、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内、嚢内の注射または注入、皮下注射、またはインプラント）、吸入スプレイ経鼻、経膣、経直腸、経舌下腺、経尿道（例えば尿道坐剤）による投与または局所投与経路（例えばゲル、軟膏、クリーム、エアロゾル等）を含み、単独で、または従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、および各投与経路に適したビヒクルを含む好適な投薬単位製剤で、製剤化することができる。本開示は、投与経路、製剤、または投薬スケジュールによって限定されない。
「投与」は、処置の経過を通して連続的または間欠的に、１つの用量で実施することができる。最も効果的な投与の手段および投薬量を決定する方法は当業者には公知であり、治療に使用される組成物、治療の目的、処置される標的細胞、および処置される対象に応じて変動することになる。単回投与または多回投与は、処置を施す医師によって選択される用量レベルおよびパターンで行うことができる。好適な投薬製剤および薬剤を投与する方法は、当技術で公知である。投与経路を決定することもでき、最も有効な投与経路を決定する方法は当業者には公知であり、処置に使用される組成物、処置の目的、処置される対象の健康状態または疾患のステージ、および標的の細胞または組織によって変動することになる。一部の実施形態では、１×１０４～１×１０１５、例えば１×１０７～１×１０１０、またはその間の範囲の本明細書で開示する細胞が対象に投与される。一部の実施形態では、投与またはその文法的変形は、一定の間隔での２つ以上の用量も意味する。一部の実施形態では、間隔は１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、１０日、２週、３週、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、１年であるか、それより長い。一部の実施形態では、１つの用量が１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれより多く繰り返される。例えば、本明細書で開示する細胞は毎週、および４週まで、対象に投与してよい。組成物および治療は他の治療、例えば１回のサイクルを定義するリンパ球枯渇化学療法およびそれに続く本療法の注入（例えば４回の毎週注入）、ならびにそれに続く、部分的または完全な奏効が見られるまでの、あるいは別の治療手段、例えば造血幹細胞移植またはＣＡＲ Ｔ細胞療法への「ブリッジング」療法として利用される、さらなるサイクルと組み合わせることができる。
本開示の薬剤は、任意の好適な投与経路による治療のために投与することができる。最適な経路はレシピエントの状態および年齢、ならびに処置される疾患によって変動することも認識されよう。
「対象」、「個体」、または「患者」は本明細書で相互交換可能に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを意味する。哺乳動物には、それだけに限らないが、ネズミ、ラット、ウサギ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、家畜、運動動物、ペット、ウマ、および霊長類、特にヒトが含まれる。ヒトの処置に有用である他に、本開示は哺乳動物、げっ歯類を含むコンパニオン哺乳動物、外来動物、および家畜化された動物の獣医処置にも有用である。一実施形態では、哺乳動物はウマ、イヌ、およびネコを含む。本開示の別の実施形態では、ヒトは胎児、小児、思春期前の対象、青年、小児患者、または成人である。一態様では、対象は発症前の哺乳動物またはヒトである。別の態様では、対象は疾患の最小限の臨床症状を有している。対象は男性または女性、成人、新生児、または小児対象であってよい。さらなる態様では、対象は成人である。一部の例では、成人は成人のヒト、例えば年齢１８歳を超える成人のヒトである。
用語「罹患している」は、これが用語「処置」に関連している場合、本明細書で開示する疾患を有していると診断されたか、または罹患しやすい患者または個体を意味する。この患者は、特徴的な疾患病変をまだ発現していない。
「有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすために十分な量である。有効量は、１回もしくは複数回の投与、適用、または投薬量で投与することができる。そのような送達は、個別の投薬単位が使用される期間、治療剤の生体利用効率、投与経路等を含むいくつかの変数に依存する。しかし、いずれかの特定の対象に対する本開示の治療剤の特定の用量レベルは、採用した特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、一般的健康状態、性別、および食事、投与の時期、排泄速度、薬物の組合せ、および処置される特定の障害の重症度、および投与の形態を含む種々の因子に依存することが理解される。処置投薬量は、一般に安全性および有効性を最適化するために増減してよい。典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ試験（またはこれらの任意の組合せ）からの投薬量－効果相関性が、最初に患者への投与のための適正な用量についての有用なガイダンスを提供できる。一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで有効であることが見出された濃度に相応する血清レベルを達成するために有効な量の本明細書で開示する薬剤（例えば細胞）を投与することが望ましい。これらのパラメーターの決定は十分に本技術のスキルの中にある。これらの考慮、ならびに効果的な処方および投与の手順は当技術で周知であり、標準的な教科書に記載されている。
薬物または薬剤の「治療有効量」は、薬理学的な応答を得るために十分な量である薬物または薬剤（例えば本明細書で開示する細胞）の量を意味するか、あるいは特定した障害または疾患を有する患者に投与した場合に、意図した効果、例えば患者における特定した障害または疾患の１つまたは複数の兆候の処置、軽減、改善、緩和、または除去を有するために十分である薬物または薬剤の量である。治療効果は必ずしも１つの用量の投与によって生じず、部分的なまたは完全な効果を誘起するために必要な一連の用量の投与の後でのみ生じてもよい。すなわち、治療有効量は、１回または複数回の投与で投与してよい。一部の実施形態では、本明細書で開示する細胞の治療有効量は、１×１０４～１×１０１５の範囲、例えば１×１０７～１×１０１０である。
一部の実施形態では、処置、例えば本明細書で開示するポリペプチドを含む免疫細胞は、本明細書で開示する対象に有効量で投与される。さらなる実施形態では、処置、例えば本明細書で開示するポリペプチドを含む免疫細胞は、本明細書で開示する対象に治療有効量で投与される。
「抗がん療法」は、本明細書で使用される場合、それだけに限らないが、外科的切除、化学療法、凍結療法、放射線療法、免疫療法、および標的療法を含む。細胞増殖を低減するように作用する薬剤は当技術で公知であり、広く使用されている。がん細胞が分裂している場合にのみがん細胞を殺滅する化学療法薬物は、細胞サイクル特異的と称される。これらの薬物には、トポイソメラーゼ阻害剤および代謝拮抗剤を含む、Ｓ相で作用する薬剤が含まれる。
トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼ酵素（トポイソメラーゼＩおよびＩＩ）の作用に干渉する薬物である。化学処置のプロセスの間、トポイソメラーゼ酵素は複製のために必要なＤＮＡの構造の操作を制御し、したがって細胞サイクル特異的である。トポイソメラーゼＩ阻害剤の例には、上で列挙したカンプトテカンアナログ、イリノテカン、およびトポテカンが含まれる。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の例には、アムサクリン、エトポシド、エトポシドホスフェート、およびテニポシドが含まれる。
代謝拮抗剤は通常、正常な代謝基質のアナログであり、染色体の複製に関与するプロセスに干渉することが多い。これらは、サイクルの極めて特異的な相で細胞を攻撃する。代謝拮抗剤には、葉酸アンタゴニスト、例えばメトトレキサート；ピリミジンアンタゴニスト、例えば５－フルオロウラシル、フォクスウリジン、シタラビン、カペシタビン、およびゲムシタビン；プリンアンタゴニスト、例えば６－メルカプトプリンおよび６－チオグアニン；アデノシンデアミナーゼ阻害剤、例えばクラドリビン、フルダラビン、ネララビン、およびペントスタチン；その他が含まれる。
植物アルカロイドは、ある種の植物から誘導される。ビンカアルカロイドは、ニチニチソウ（Catharanthus rosea）から作られる。タキサン類はタイヘイヨウイチイ（taxus）の樹皮から作られる。ビンカアルカロイドおよびタキサン類は抗微小管剤としても知られている。ポドフィロトキシンはポドフィルム植物から誘導される。カンプトテカンアナログはアジアの「ハッピーツリー」（Camptotheca acuminata）から誘導される。ポドフィロトキシンおよびカンプトテカンアナログは、トポイソメラーゼ阻害剤としても分類されている。植物アルカロイドは一般に細胞サイクル特異的である。
これらの薬剤の例には、ビンカアルカロイド類、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビノレルビン；タキサン類、例えばパクリタキセルおよびドセタキセル；ポドフィロトキシン類、例えばエトポシドおよびテニソピド；ならびにカンプトテカンアナログ、例えばイリノテカンおよびトポテカンが含まれる。
がんが免疫細胞のがんである一部の実施形態では、抗がん療法は、造血幹細胞の移植を含むか、本質的にこれからなるか、これからなり得る。
一部の実施形態では、治療剤、例えば本明細書で開示する細胞は、がんの処置において、別の抗がん療法または免疫細胞を枯渇させる療法と組み合わせてよい。例えば、リンパ球枯渇化学療法およびこれに続く例えば４回の毎週の注入による本明細書で開示する細胞の投与が実施される。さらなる実施形態では、これらのステップは、部分的または完全な効果が観察されるか、臨床的エンドポイントが達成されるまで、１回、２回、３回、またはそれより多く、繰り返してよい。
凍結療法には、それだけに限らないが、温度の低下が関与する療法、例えば低体温療法が含まれる。
放射線療法には、それだけに限らないが、当技術で知られているように、放射線、例えばイオン化放射線、ＵＶ放射線への曝露が含まれる。例示的な投与量には、それだけに限らないが、少なくとも約２Ｇｙ～約１０Ｇｙを超えない範囲のイオン化放射線の用量、または少なくとも約５Ｊ／ｍ２～約５０Ｊ／ｍ２を超えない範囲、通常約１０Ｊ／ｍ２の紫外放射線の用量が含まれる。
語句「第１線」または「第２線」または「第３線」は、患者が受ける処置の順を意味する。第１線療法レジメンは最初に与えられる処置であり、第２線または第３線の療法は、それぞれ第１線療法の後または第２線療法の後で与えられる。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは、第１線療法を「疾患または状態に対する最初の処置」と定義している。がんを有する患者においては、第１次の処置は手術、化学療法、放射線療法、またはこれらの療法の組合せであってよい。第１線療法は、当業者には「第１次の療法および第１次の処置」とも称される。２００８年５月１日に最後に閲覧したＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトwww.cancer.govを参照されたい。典型的には、患者が第１線療法に対して肯定的な臨床的または準臨床的な応答を示さなかった、または第１線療法が中止されたために、患者には引き続く化学療法レジメンが与えられる。
本開示を実施するための様式
理論に縛られることは望まないが、免疫細胞（例えばＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＴ細胞）に関与するＣＡＲまたは二特異性抗体のいずれかまたは両方を介して、必要に応じて免疫細胞上に発現されるＮＫＧ２Ｄを標的とすることを介して、ＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄを標的とすることによって、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるがん細胞の殺滅において相加的効果に留まらない驚くべき効果（例えば相乗的効果）が得られ、したがって、がん細胞の増殖の阻害または多発性骨髄腫（ＭＭ）等のがんの処置における効果的な治療レジメンがもたらされることが発見された。さらにまたはその代わりに、ＣＡＲ、二特異性抗体、または本明細書で開示する別の成分（例えばサイトカイン）の１つまたは複数のそのような発現は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける免疫細胞の生存または増殖に有益である。
したがって、本明細書で開示するように、（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列、および（ｉｉ）抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列を含む二特異性抗体のアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるポリペプチドが提供される。本明細書の開示が、両方が存在する場合には抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列と入れ替えられる実施形態および態様も含むことは、当業者には理解されよう。
一態様では、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列および（ｉｉ）二特異性抗体のアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるポリペプチドが提供される。
一部の実施形態では、二特異性抗体は、必要に応じて免疫細胞を特異的に認識し、これに結合することによる、免疫細胞エンゲージャーである。さらなる実施形態では、二特異性抗体はさらにＴＡＡを認識かつ結合する。したがって、二特異性抗体は、がん細胞上に存在するＴＡＡ（例えばＧＰＲＣ５Ｄ）への結合および免疫細胞上の抗原（例えばＮＫＧ２Ｄまたは本明細書で開示する別の抗原）への結合を介して、がん細胞を免疫細胞の近傍に移動させる。一部の実施形態では、二特異性抗体は、必要に応じてＣＤ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、インテグリンアルファ－Ｌ（ＬＦＡ－１）、ＣＤ５６、細胞傷害性および制御性Ｔ細胞分子（ＣＲＴＡＭ）またはＣＤ２を特異的に認識し、これらに結合することによって、Ｔ細胞またはＮＫＴ細胞に関与する（すなわち本明細書で二特異性Ｔ細胞エンゲージャー、ＢｉＴＥと称する）。他の実施形態では、二特異性抗体は、必要に応じてＣＤ３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、ＳＬＡＭ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、もしくはＮＫｐ４６、またはＣＤ５６を特異的に認識し、これらに結合することによって、またはそれを介して、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞に関与する（すなわち本明細書で二特異性ＮＫ細胞エンゲージャー、ＢｉＫＥと称する）。一部の実施形態では、二特異性抗体はＢｉＴＥもしくはＢｉＫＥまたはその両方であり、これらはＮＫＧ２Ｄを特異的に認識し、これに結合することによって、またはそれを介して、作用する。さらなる実施形態では、抗原結合性配列またはリガンドの、ＮＫＧ２Ｄではないが免疫細胞の細胞表面上に発現される抗原との結合は、免疫細胞を活性化する。さらなる実施形態では、二特異性抗体は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識かつ結合する抗原結合性アミノ酸配列（抗ＴＡＡ抗原結合性配列）またはＴＡＡを認識かつ結合することを前提としてその等価物をさらに含む。さらにまたはその代わりに、二特異性抗体は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列の代わりにまたはそれに加えて、ＮＫＧ２Ｄリガンド、例えばＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＢ）、ＵＬ１６結合タンパク質１（ＵＬＢＰ１）、ＵＬ１６結合タンパク質２（ＵＬＢＰ２）、ＵＬ１６結合タンパク質３（ＵＬＢＰ３）、ＵＬ１６結合タンパク質４（ＵＬＢＰ４）、ＵＬ１６結合タンパク質５（ＵＬＢＰ５）、ＵＬ１６結合タンパク質６（ＵＬＢＰ６）、または他の任意の好適なＮＫＧ２Ｄリガンドを含んでよい。さらなる実施形態では、二特異性抗体のＴＡＡは、Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）もしくはＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）またはその等価物を認識してこれに結合し、等価物はそれぞれＧＰＲＣ５ＤまたはＢＣＭＡを認識し、これらに結合する。さらなる実施形態では、二特異性抗体において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列は、ＨＭＡリンカー等のペプチドリンカー、または免疫グロブリンの断片結晶性（Ｆｃ）領域、その変異体もしくはその等価物、またはペプチドリンカーと免疫グロブリンのＦｃ領域、その変異体もしくはその等価物の両方を介して、抗ＴＡＡ抗原結合性配列に連結されている。
一部の実施形態では、ポリペプチドのＣＡＲは、（１）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識かつ結合する抗原結合性アミノ酸配列（抗ＴＡＡ抗原結合性配列）またはＴＡＡを認識かつ結合するその等価物、（２）ヒンジドメイン、（３）膜貫通ドメイン、および（４）細胞内ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ＣＡＲのＴＡＡは、二特異性抗体のＴＡＡと異なるか、同じである。さらなる実施形態では、ＣＡＲの抗ＴＡＡ抗原結合性配列は、二特異性抗体の抗ＴＡＡ抗原結合性配列と異なるか、同じである。
さらなる実施形態では、ＣＡＲのＴＡＡは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）である。さらにまたはその代わりに、ポリペプチドの二特異性抗体は、（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）またはＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合することを前提としてその等価物、および（２）Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）またはＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合するその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
一部の実施形態では、ＣＡＲは二特異性抗体のＮ末端側に位置している。他の実施形態では、ＣＡＲは二特異性抗体のＣ末端側に位置している。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＡＲのアミノ酸配列と二特異性抗体のアミノ酸配列との間に位置する切断可能なペプチド（例えば自己切断性ペプチド）をさらに含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、それ自体によって、または酵素によって、２つまたはそれより多いペプチド、例えばＣＡＲ（本明細書でＣＡＲペプチドと称する）および二特異性抗体を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるペプチドに切断され得る。一部の実施形態では、切断可能なペプチドは、ポリペプチドが２つまたはそれより多いペプチド断片に切断されることを可能にする。
一部の実施形態では、ポリペプチドのＣＡＲは、（１）Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識かつ結合する抗原結合性アミノ酸配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）またはＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合するその等価物、（２）ヒンジドメイン、（３）膜貫通ドメイン、および（４）細胞内ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらにまたはその代わりに、二特異性抗体は、（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）またはＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合するその等価物、および（２）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＴＡＡ抗原結合性配列）またはＴＡＡを認識かつ結合するその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、ＴＡＡはＢＣＭＡである。
別の態様では、ＮＫＧ２ＤとＧタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）の両方を認識かつ結合する抗体、例えば二特異性抗体、またはＮＫＧ２ＤとＧＰＲＣ５Ｄの両方を認識し、これらに結合することを前提としてその断片が提供される。一部の実施形態では、二特異性抗体は、（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）またはＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合するその等価物、および（２）ＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）またはＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合するその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
さらに別の態様では、（１）Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）またはＧＰＲＣＤを認識かつ結合することを前提としてその等価物、（２）ヒンジドメイン、（３）膜貫通ドメイン、および（４）細胞内ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を認識かつ結合する抗原結合性配列またはＢＣＭＡを認識かつ結合するその等価物をさらに含む。
さらなる実施形態では、ＣＡＲは、非ＧＰＲＣ５Ｄ ＴＡＡを認識かつ結合する抗原結合性配列、または非ＧＰＲＣ５Ｄ ＴＡＡを認識かつ結合するその等価物をさらに含む。すなわち、ＣＡＲは二特異性ＣＡＲである。
さらなる実施形態では、本明細書で開示するＴＡＡは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９）、ＥＧＦＲ，野生型上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲｗｔ）、上皮細胞増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、ＦＬＴ３、ＣＤ７０、メソテリン、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１３３、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣＬ１）、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、ＣＤ５、インターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ１３Ｒａ２）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１）、がん／精巣（ＣＴ）、ＣＤ３３、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、上皮細胞接着分子前駆体（ＥｐＣａｍまたはＥＰＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－１１Ｒα、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＳＳ２１、血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ムチン１（Ｍｕｃ１）、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ，チロシナーゼ、エフリンＡ型受容体２前駆体（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、タイ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サービビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、腸カルボキシエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ＦＣＲＬ５、またはＩＧＬＬ１から選択されるタンパク質またはポリペプチド由来のエピトープを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、本明細書で開示するＴＡＡは、上で列挙したタンパク質またはポリペプチドに由来するエピトープを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、ＴＡＡは、ＢＣＭＡのエピトープを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。一部の実施形態では、ＴＡＡは、ＢＣＭＡのタンパク質またはポリペプチドを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
一部の実施形態では、ＣＡＲはタンデムＣＡＲであり、すなわち抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列（例えば抗ＧＰＲＣ５Ｄ ｓｃＦｖ）またはその等価物を含み、等価物は抗非ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＡＡ抗原結合性配列（例えば抗非ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＡＡ ｓｃＦｖ）またはその等価物に連結されたＧＰＲＣ５Ｄを認識してこれに結合し、等価物は必要に応じてリンカーを介して非ＧＰＲＣ５Ｄ ＴＡＡを認識してこれに結合する。一実施形態では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列（例えば抗ＧＰＲＣ５Ｄ ｓｃＦｖ）またはその等価物は、抗非ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＡＡ抗原結合性配列（例えば抗非ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＡＡ ｓｃＦｖ）またはその等価物のＮ末端側にある。一実施形態では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列（例えば抗ＧＰＲＣ５Ｄ ｓｃＦｖ）またはその等価物は、抗非ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＡＡ抗原結合性配列（例えば抗非ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＡＡ ｓｃＦｖ）またはその等価物のＣ末端側にある。
一部の実施形態では、ＣＡＲはループ状タンデムＣＡＲである。ループ状タンデムＣＡＲは、抗ＧＰＲＣ５Ｄ重鎖可変領域および抗ＧＰＲＣ５Ｄ軽鎖可変領域を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列（例えば抗ＧＰＲＣ５Ｄ ｓｃＦｖ）、ならびに抗非ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＡＡ重鎖可変領域および抗非ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＡＡ軽鎖可変領域を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる抗非ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＡＡ抗原結合性配列（例えば抗非ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＡＡ ｓｃＦｖ）を含む。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端から出発して、抗非ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＡＡ軽／重鎖可変領域、抗ＧＰＲＣ５Ｄ軽／重鎖可変領域、抗ＧＰＲＣ５Ｄ重／軽鎖可変領域、および抗非ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＡＡ重／軽鎖可変領域を含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端から出発して、抗ＧＰＲＣ５Ｄ軽／重鎖可変領域、抗非ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＡＡ軽／重鎖可変領域、抗非ＧＰＲＣ５Ｄ－ＴＡＡ重／軽鎖可変領域、および抗ＧＰＲＣ５Ｄ重／軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、可変領域のいずれか２つの間にさらにリンカーを含む。
さらにまたはその代わりに、本明細書で開示するポリペプチド、またはＣＡＲ、または二特異性抗体は、（ｉｉｉ）サイトカインのアミノ酸配列または（ｉｖ）自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方のアミノ酸配列の１つまたは両方をさらに含む。一部の実施形態では、サイトカインはＩＬ１５またはＩＬ－２１から選択される。一部の実施形態では、サイトカインは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、本明細書で開示する別の免疫細胞、またはこれらのそれぞれの前駆体細胞の１つまたは複数の成長、分化、活性化、または増殖を促進する。さらなる実施形態では、サイトカインはＩＬ１５、例えば本明細書で開示する可溶性ＩＬ１５、本明細書で開示する膜結合ＩＬ１５、本明細書で開示する可溶性のＩＬ－１５とＩＬ－１５受容体との複合体（ＳＩＬ１５Ｃ）（すなわち、可溶性ＩＬ－１５および可溶性ＩＬ－１５受容体を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる可溶性複合体）、可溶性ＩＬ－１５および膜結合ＩＬ－１５受容体を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる膜結合複合体、膜結合ＩＬ－１５および可溶性ＩＬ－１５受容体を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる膜結合複合体、または膜結合ＩＬ－１５および膜結合ＩＬ－１５受容体を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる膜結合複合体である。一部の実施形態では、サイトカインはＩＬ２１、例えば本明細書で開示する可溶性ＩＬ２１または本明細書で開示する膜結合ＩＬ２１である。一部の実施形態では、自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方は、切断型上皮細胞増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）である。一部の実施形態では、自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方は、ＲＱＲ８を含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
さらに別の態様では、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列、（ｉｉ）二特異性抗体のアミノ酸配列、および（ｉｉｉ）サイトカインのアミノ酸配列もしくは（ｉｖ）自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方のアミノ酸配列の１つまたは両方を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれからなるポリペプチドが提供される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、二特異性抗体のＮ末端側に位置している。他の実施形態では、ＣＡＲは二特異性抗体のＣ末端側に位置している。一部の実施形態では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）の成分は、例えばＮ末端からＣ末端へ、（ｉ）－（ｉｉ）－存在すれば（ｉｉｉ）－存在すれば（ｉｖ）、（ｉ）－（ｉｉ）－存在すれば（ｉｖ）－存在すれば（ｉｉｉ）、（ｉ）－存在すれば（ｉｉｉ）－（ｉｉ）－存在すれば（ｉｖ）、（ｉ）－存在すれば（ｉｉｉ）－存在すれば（ｉｖ）－（ｉｉ）、（ｉ）－存在すれば（ｉｖ）－（ｉｉ）－存在すれば（ｉｉｉ）、（ｉ）－存在すれば（ｉｖ）－存在すれば（ｉｉｉ）－（ｉｉ）、（ｉｉ）－（ｉ）－存在すれば（ｉｉｉ）－存在すれば（ｉｖ）、（ｉｉ）－（ｉ）－存在すれば（ｉｖ）－存在すれば（ｉｉｉ）、（ｉｉ）－存在すれば（ｉｉｉ）－（ｉ）－存在すれば（ｉｖ）、（ｉｉ）－存在すれば（ｉｉｉ）－存在すれば（ｉｖ）－（ｉ）、（ｉｉ）－存在すれば（ｉｖ）－（ｉ）－存在すれば（ｉｉｉ）、（ｉｉ）－存在すれば（ｉｖ）－存在すれば（ｉｉｉ）－（ｉ）、存在すれば（ｉｉｉ）－（ｉ）－（ｉｉ）－存在すれば（ｉｖ）、存在すれば（ｉｉｉ）－（ｉ）－存在すれば（ｉｖ）－（ｉｉ）、存在すれば（ｉｉｉ）－（ｉｉ）－（ｉ）－存在すれば（ｉｖ）、存在すれば（ｉｉｉ）－（ｉｉ）－存在すれば（ｉｖ）－（ｉ）、存在すれば（ｉｉｉ）－存在すれば（ｉｖ）－（ｉ）－（ｉｉ）、存在すれば（ｉｉｉ）－存在すれば（ｉｖ）－（ｉｉ）－（ｉ）、存在すれば（ｉｖ）－（ｉ）－（ｉｉ）－存在すれば（ｉｉｉ）、存在すれば（ｉｖ）－（ｉ）－存在すれば（ｉｉｉ）－（ｉｉ）、存在すれば（ｉｖ）－（ｉｉ）－（ｉ）－存在すれば（ｉｉｉ）、存在すれば（ｉｖ）－（ｉｉ）－存在すれば（ｉｉｉ）－（ｉ）、存在すれば（ｉｖ）－存在すれば（ｉｉｉ）－（ｉ）－（ｉｉ）、または存在すれば（ｉｖ）－存在すれば（ｉｉｉ）－（ｉｉ）－（ｉ）の任意の順で、ポリペプチド中に位置してよい。本明細書中で使用される「－」は、任意の数（例えば０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれより多い）のアミノ酸残基からなってよく、それぞれのアミノ酸残基は任意のアミノ酸（すなわちランダムなアミノ酸）であってよい。一部の実施形態では、本明細書で使用される「－」は、本明細書で開示するペプチドリンカー、本明細書で開示するマーカー、切断可能なペプチド、または本明細書で開示するシグナルペプチドの１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、ポリペプチドはそのＮ末端にシグナルペプチドをさらに含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドのＣＡＲは、（１）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識かつ結合する抗原結合性アミノ酸配列（抗ＴＡＡ抗原結合性配列）またはＴＡＡを認識かつ結合することを前提としてその等価物、（２）ヒンジドメイン、（３）膜貫通ドメイン、および（４）細胞内ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、ＴＡＡはＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）である。さらにまたはその代わりに、二特異性抗体は、（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）またはＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合することを前提としてその等価物、および（２）Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）またはＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合するその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
一部の実施形態では、ＣＡＲは、（１）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識かつ結合する抗原結合性アミノ酸配列（抗ＴＡＡ抗原結合性配列）またはＴＡＡを認識かつ結合するその等価物、（２）ヒンジドメイン、（３）膜貫通ドメイン、および（４）細胞内ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、ＴＡＡはＧタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）である。さらにまたはその代わりに、二特異性抗体は、（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）またはＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合するその等価物、および（２）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列）またはＢＣＭＡを認識かつ結合するその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
一部の実施形態では、サイトカインはＩＬ１５またはＩＬ－２１から選択される。一部の実施形態では、サイトカインは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、本明細書で開示する別の免疫細胞、またはこれらのそれぞれの前駆体細胞の１つまたは複数の成長、分化、活性化、または増殖を促進する。さらなる実施形態では、サイトカインはＩＬ１５、例えば本明細書で開示する可溶性ＩＬ１５、本明細書で開示する膜結合ＩＬ１５、本明細書で開示する可溶性のＩＬ－１５とＩＬ－１５受容体との複合体（ＳＩＬ１５Ｃ）、可溶性ＩＬ－１５および膜結合ＩＬ－１５受容体を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる膜結合複合体、膜結合ＩＬ－１５および可溶性ＩＬ－１５受容体を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる膜結合複合体、または膜結合ＩＬ－１５および膜結合ＩＬ－１５受容体を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる膜結合複合体である。一部の実施形態では、サイトカインはＩＬ２１、例えば本明細書で開示する可溶性ＩＬ２１または本明細書で開示する膜結合ＩＬ２１である。一部の実施形態では、自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方は、切断型上皮細胞増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）である。一部の実施形態では、自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方は、ＲＱＲ８を含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列は、ＣＡＲまたは二特異性抗体の抗ＴＡＡ抗原結合性配列のＮ末端側に位置している。本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列は、ＣＡＲまたは二特異性抗体の抗ＴＡＡ抗原結合性配列のＣ末端側に位置している。さらなる実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列は、１つまたは複数のランダムアミノ酸残基、ＨＭＡリンカー等の本明細書で開示するペプチドリンカー、免疫グロブリンの断片結晶性（Ｆｃ）領域、その変異体もしくはその等価物、またはこれらの任意の組合せを介して、ＣＡＲまたは二特異性抗体の抗ＴＡＡ抗原結合性配列に連結されている。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、二特異性抗体の抗原結合性配列のいずれかまたは両方は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。一部の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖは、抗ＴＡＡ ｓｃＦｖのＮ末端側に位置している。一部の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖは、抗ＴＡＡ ｓｃＦｖのＣ末端側に位置している。さらなる実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖは、１つまたは複数のランダムアミノ酸残基、ＨＭＡリンカー等のペプチドリンカー、または免疫グロブリンの断片結晶性（Ｆｃ）領域、その変異体もしくはその等価物、またはこれらの任意の組合せを介して、抗ＴＡＡ ｓｃＦｖに連結されている。一部の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖは、ＮＫＧ２Ｄではないが本明細書で開示する免疫細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞の細胞表面上に存在する抗原を認識かつ結合するｓｃＦｖで置き換えられる。好適な抗原を本明細書に記載する。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列は、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）： ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ（配列番号１）またはその等価物を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）；ＹＤＤＬＬＰＳ（配列番号２）またはその等価物を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）；ＡＡＷＤＤＳＬＮＧＰＶ（配列番号３）またはその等価物を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）；ＧＦＴＦＳＳＹ（配列番号４）またはその等価物を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）；ＲＹＤＧＳＮ（配列番号５）またはその等価物を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）；およびＤＲＧＬＧＤＧＴＹＦＤＹ（配列番号６）またはその等価物を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは５つまたは６つ全てを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、その等価物はＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列は、配列番号７もしくはその等価物を含む軽鎖可変領域；または配列番号８もしくはその等価物を含む重鎖可変領域；または軽鎖可変領域もしくはその等価物および重鎖可変領域もしくはその等価物の両方を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、その等価物はＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、配列番号７または８の等価物は、それぞれ配列番号７または８と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。一部の実施形態では、配列番号１～８の等価物は、それぞれ配列番号１～８のＣ末端からＮ末端のアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列は、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間に、ペプチドリンカーをさらに含む。さらなる実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列は、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間に、配列番号９またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるペプチドリンカーをさらに含む。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列は、以下のＣＤＲ：ＫＡＳＱＮＶＡＴＨＶＧ（配列番号１０）またはその等価物を含むＣＤＲＬ１；ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号１１）またはその等価物を含むＣＤＲＬ２；ＱＱＹＮＲＹＰＹＴ（配列番号１２）またはその等価物を含むＣＤＲＬ３；ＧＹＳＦＴＧＹ（配列番号１３）またはその等価物を含むＣＤＲＨ１；ＮＰＹＮＳＤ（配列番号１４）またはその等価物を含むＣＤＲＨ２；およびＶＡＬＲＶＡＬＤＹ（配列番号１５）またはその等価物を含むＣＤＲＨ３の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは５つまたは６つ全てを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、その等価物はＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列は、配列番号１６もしくはその等価物を含む軽鎖可変領域；または配列番号１７もしくはその等価物を含む重鎖可変領域；または軽鎖可変領域もしくはその等価物および重鎖可変領域もしくはその一方または両方の等価物の両方を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、その等価物はＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、配列番号１６または１７の等価物は、それぞれ配列番号１６または１７と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、配列番号１０～１７の等価物は、それぞれ配列番号１０～１７のＣ末端からＮ末端へのアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列は、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間に、ペプチドリンカーをさらに含む。さらなる実施形態では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列は、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間に、配列番号９またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるペプチドリンカーをさらに含む。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、二特異性抗体は、免疫グロブリンの断片結晶性（Ｆｃ）領域、その変異体、またはその等価物をさらに含む。一実施形態では、Ｆｃ領域またはその変異体は、ヒトＦｃ領域またはその変異体である。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号１８またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一実施形態では、等価物はまた、例えば分泌のために、配列番号１８として二特異性抗体を実質的に安定化する。さらにまたはその代わりに、等価物は、免疫細胞上もしくは血小板上のまたは補体タンパク質に結合するＦｃ受容体に、必要に応じて配列番号１８のレベルと実質的に同様のレベルで結合する。一部の実施形態では、等価物は、免疫細胞上もしくは血小板上のまたは補体タンパク質に結合するＦｃ受容体に、必要に応じて配列番号１８のレベルと比較して実質的に低いレベルで結合する。一部の実施形態では、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）への強い結合は、炎症促進性サイトカインの誘起（すなわちサイトカインストーム）を含むｉｎ ｖｉｖｏの有害事象の観点から望ましくない。この意図しないエフェクター機能を低減するため、Ｆｃ領域等価物は、炎症性サイトカイン放出を低減させる突然変異の１つまたは複数を含んでよい。Ｆｃ断片を含み、免疫細胞によって発現される抗体に関連する実施形態のような一部の実施形態では、抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を低減または回避するために、突然変異を有するＦｃ断片（例えばＩｇＧ４ Ｆｃ断片）が使用される。さらなる実施形態では、免疫細胞はＮＫ細胞である。理論に縛られることは望まないが、ＡＤＣＣまたはＣＤＣの誘起において抗体またはそのＦｃ断片の能力を保持することは、免疫細胞の相互殺滅、例えばＮＫ自己殺滅またはＮＫ枯渇をもたらすことがある。さらにまたはその代わりに、一部の実施形態では、ＡＤＣＣまたはＣＤＣは、抗体のＦｃ部分における１つまたは複数のアミノ酸残基を突然変異させ、補体またはＦｃ受容体へのその結合を低減させることを含む方法によって低減または回避される。本明細書で使用される１つの例は、３部位突然変異型ヒトＩｇＧ４ Ｆｃである。ＩｇＧ４－Ｆｃは３つの部位、すなわちヒンジ領域内のＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＣＨ２領域内のＮ２９７Ｑで突然変異されており、そのＦｃ領域における置換は、Ｆｃ受容体の結合を避けることを目的としたものであった。例えば、Wang et al. Protein Cell. 2018 Jan;9(1):63-73. Epub 2017 Oct 6を参照されたい。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号１９または配列番号１９のアミノ酸（ａａ）１６、ａａ１７、およびａａ７９に相当する位置に突然変異を有するＦｃ等価物を含む。一実施形態では、等価物はまた、例えば分泌のために、配列番号１９として二特異性抗体を実質的に安定化させる。さらにまたはその代わりに、等価物は、免疫細胞上もしくは血小板上のまたは補体タンパク質に結合するＦｃ受容体に、必要に応じて配列番号１９のレベルと実質的に同様のレベルで結合する。一部の実施形態では、等価物は、免疫細胞上もしくは血小板上のまたは補体タンパク質に結合するＦｃ受容体に、必要に応じて配列番号１９のレベルと比較して実質的に低いレベルで結合する。一部の実施形態では、本明細書で使用されるＦｃまたはその等価物は、抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を低減するか、誘起しない。さらにまたはその代わりに、本明細書で使用されるＦｃまたはその等価物は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を低減するか、誘起しない。一部の実施形態では、等価物は、配列番号１９のレベルと比較して実質的に（例えば約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、またはそれより多く）低いレベル、または配列番号１９のレベルと同様（例えば約９０％～約１１０％、またはその中間の任意の範囲またはパーセンテージ）で、Ｆｃ受容体または補体タンパク質に結合する。そのようなＦｃまたはその等価物の非限定的な例は、本明細書または例えばＷＯ２０１８１０７０５８Ａ１に示すように開示されている。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、本明細書で開示する二特異性抗体は、必要に応じてＮ末端からＣ末端へ、第１の抗体結合性配列、必要に応じた第１のリンカー、必要に応じた第１のＦｃ領域、必要に応じた第２のリンカー、第２の抗体結合性配列、必要に応じた第３のリンカー、および必要に応じた第２のＦｃ領域を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、本明細書で開示する二特異性抗体は、必要に応じてＮ末端からＣ末端へ、第１の抗体結合性配列、必要に応じた第１のリンカー、第２の抗体結合性配列、必要に応じた第２のリンカー、および必要に応じたＦｃ領域を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、本明細書で開示する二特異性抗体は、必要に応じてＮ末端からＣ末端へ、第１の抗体結合性配列、必要に応じた第１のリンカー、必要に応じたＦｃ領域、必要に応じた第２のリンカー、および第２の抗体結合性配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、第２の抗体結合性配列は、本明細書で開示する抗体結合性配列のＣ末端からＮ末端へのアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなってよい。換言すれば、第２の抗体結合性配列は、二特異性抗体を構築または操作している間に、反転してもよい。一部の実施形態では、第１の抗体結合性配列は抗ＧＰＲＣ５Ｄであり、必要に応じて第２の抗体結合性配列は抗ＮＫＧ２Ｄである。一部の実施形態では、第２の抗体結合性配列は抗ＧＰＲＣ５Ｄであり、必要に応じて第１の抗体結合性配列は抗ＮＫＧ２Ｄである。さらにまたはその代わりに、リンカーのいずれかは本明細書で開示するリンカー、例えば（ＧＧＧＧＳ）ｎペプチドリンカー（ここでｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、または１５のいずれか１つ（配列番号１３０））、ＨＭＡペプチドリンカー、切断可能なペプチド、またはこれらの任意の組合せから選択してよい。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、抗原結合性配列は、抗体またはその断片、例えば抗原結合性ドメイン、可変領域、抗原結合性断片（Ｆａｂ）、ｓｃＦｖ、ジｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ＣＨ、またはｓｃＦａｂであってよい。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、二特異性抗体は、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列と抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列との間にペプチドリンカーをさらに含む。さらなる実施形態では、ペプチドリンカーは、ヒト筋肉アロドラーゼ（ＨＭＡ）リンカー、例えばＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ（配列番号８１）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、ＣＡＲは、必要に応じてそのＮ末端に、シグナルペプチドをさらに含む。さらなる実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＡＲを細胞膜に方向付けるために好適である。さらなる実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＡＲを細胞膜に方向付けるＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＡＲを細胞膜に方向付けるＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、またはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）、またはＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、またはＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）、またはそのそれぞれの等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＡＲを細胞膜に方向付けるＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、またはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）、またはＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、またはＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）、またはＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）、またはＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）、またはそのそれぞれの等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、二特異性抗体は、必要に応じてそのＮ末端に、シグナルペプチドをさらに含む。さらなる実施形態では、シグナルペプチドは、抗体の分泌を方向付けるために好適である。さらなる実施形態では、シグナルペプチドは、二特異性抗体、その断片、または等価物の分泌を促進するＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一実施形態では、シグナルペプチドは、二特異性抗体、その断片、または等価物の分泌を促進するＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、またはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）、またはＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、またはＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）、またはそのそれぞれの等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、二特異性抗体、その断片、または等価物の分泌を促進するＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、またはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）、またはＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、またはＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）、またはＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）、またはＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）、またはそのそれぞれの等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
一部の実施形態では、本明細書で開示するシグナルペプチドは、配列番号２０，配列番号２１、ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号１２６）、またはそのそれぞれの等価物のいずれか１つもしくは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、二特異性抗体は、検出可能マーカーまたは精製マーカーをさらに含む。さらなる実施形態では、検出可能マーカーは、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号２２）を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書で開示する一部の実施形態では、ＴＡＡはＧＰＲＣ５Ｄではない。さらなる実施形態では、ＴＡＡは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＳＬＡＭＦ７（ＣＳ１またはＣＤ３１９）、ＥＧＦＲ、野生型上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲｗｔ）、上皮細胞増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、ＦＬＴ３、ＣＤ７０、メソテリン、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１３３、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣＬ１）、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、ＣＤ５、インターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ１３Ｒａ２）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、腫瘍関連糖タンパク質－７２（ＴＡＧ－７２）、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１）、がん／精巣（ＣＴ）、ＣＤ３３、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ＧＤ３、Ｔｎ Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、上皮細胞接着分子前駆体（ＥｐＣａｍまたはＥＰＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＩＬ－１１Ｒα、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＲＳＳ２１、血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ムチン１（Ｍｕｃ１）、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、エフリンタイプＡ受容体２前駆体（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、タイ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サービビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ＦＣＲＬ５、またはＩＧＬＬ１から選択されるタンパク質またはポリペプチドに由来するエピトープを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、ＴＡＡは、ＢＣＭＡのエピトープを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、ＢＣＭＡを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列）は、以下のＣＤＲ：ＲＡＳＥＳＶＴＩＬＧＳＨＬＩＨ（配列番号２３）、ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号２４）、ＲＡＳＥＳＶＴＩＬＧＳＨＬＩＹ（配列番号２５）またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＬ１；ＬＡＳＮＶＱＴ（配列番号２６）、ＹＴＳＮＬＨＳ（配列番号２７）、ＬＡＳＮＶＱＴ（配列番号２８）またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＬ２；ＬＱＳＲＴＩＰＲＴ（配列番号２９）、ＱＱＹＲＫＬＰＷＴ（配列番号３０）、ＬＱＳＲＴＩＰＲＴ（配列番号３１）、そのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＬ３；ＧＹＴＦＴＤＹ（配列番号３２）、ＧＧＴＦＳＮＹ（配列番号３３）、ＧＹＴＦＲＨＹ（配列番号３４）、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＨ１；ＩＮＴＥＴＲＥ（配列番号３５）、ＹＲＧＨＳＤ（配列番号３６）、ＮＴＥＳＧＶ（配列番号３７）、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＨ２；およびＤＹＳＹＡＭＤＹ（配列番号３８）、ＧＡＩＹＮＧＹＤＶＬＤＮ（配列番号３９）、ＤＹＬＹＳＬＤＦ（配列番号４０）、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＨ３の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは５つまたは６つを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
一部の実施形態では、その等価物はＢＣＭＡを認識かつ結合する。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含む軽鎖可変領域、または配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含む重鎖可変領域、または軽鎖可変領域もしくはその等価物および重鎖可変領域もしくはその等価物の両方または両方の等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、その等価物はＢＣＭＡを認識かつ結合する。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、配列番号４１～４６の等価物は、それぞれ配列番号４１～４６と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。一部の実施形態では、配列番号２３～４６の等価物は、それぞれ配列番号２３～４６のＣ末端からＮ末端へのアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列またはその等価物は、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間に、ペプチドリンカーをさらに含む。さらなる実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列は、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間に、配列番号９またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるペプチドリンカーをさらに含む。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、サイトカインのアミノ酸配列は、配列番号１０６、配列番号１０４、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、またはそのそれぞれの等価物の少なくとも１つを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、サイトカインのアミノ酸配列は、配列番号１０６またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、サイトカインのアミノ酸配列は、配列番号１０６および配列番号１０７、またはそのそれぞれの等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、２つの配列は、本明細書で開示するペプチドリンカー等のリンカーによって連結されている。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱ（配列番号１０８）を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる。
一部の実施形態では、サイトカインはシグナルペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、サイトカインを発現する細胞の外に可溶性サイトカインを分泌するために好適である。他の実施形態では、シグナルペプチドは、膜結合サイトカインが細胞膜等の標的膜に位置するように方向付けるために好適である。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１３１）、ＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、ＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）、またはそのそれぞれの等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）、またはそのそれぞれの等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、またはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）、またはＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、またはＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）、またはＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）、またはＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）、またはそのそれぞれの等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
一部の実施形態では、ｔＥＧＦＲは、配列番号１２０の配列またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ｔＥＧＦＲは、ヒト上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）アイソフォームｉ前駆体のａａ６７～ａａ４０１またはＥＧＦＲアイソフォームＩ前駆体の別の断片を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなり、必要に応じてタンパク質の細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、ＥＧＦＲアイソフォームＩ前駆体の配列は、ＮＰ＿００１３３３８７０．１に開示されている通りである。
一部の実施形態では、ｔＥＧＦＲはシグナルペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ｔＥＧＦＲが細胞膜に位置することを方向付けるために好適である。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、群：ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）、ＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、ＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）のペプチドまたはｔＥＧＦＲが細胞膜に位置することを方向付けるそのそれぞれの等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）もしくはＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）、またはｔＥＧＦＲが細胞膜に位置することを方向付けるそのそれぞれの等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、もしくはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）、もしくはＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、もしくはＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）、もしくはＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）、もしくはＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）、またはｔＥＧＦＲが細胞膜に位置することを方向付けるそのそれぞれの等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
一部の実施形態では、自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方は、ＲＱＲ８を含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
一部の実施形態では、ＲＱＲ８は、配列番号１３２またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
一部の実施形態では、（ｉ）～（ｉｖ）のいずれか１つまたは複数のアミノ酸配列は、検出可能マーカーをさらに含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、存在すれば（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）のいずれか２つの間に位置する切断可能なペプチドをさらに含む。一実施形態では、切断可能なペプチドは自己切断性ペプチドである。さらなる実施形態では、自己切断性ペプチドは、Ｔ２ＡペプチドまたはＰ２Ａから選択される。さらなる実施形態では、切断可能なペプチドまたは自己切断性ペプチドは、ＨＶＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５０）、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５０のａａ３～ａａ２３）、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１３３）、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１３４）、ＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１３５）、またはそのそれぞれの等価物から選択されるペプチドを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
一部の実施形態では、ポリペプチドまたはＣＡＲまたは二特異性抗体は、表１ａ～１ｈ、表２ａ～２ｘ、および表３ａ～３ｄのいずれか１つまたは複数で提供されるアミノ酸配列の１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ポリペプチドまたはＣＡＲまたは二特異性抗体は、表１ａ～１ｈ、表２ａ～２ｘ、および表３ａ～３ｄのいずれか１つまたは複数で提供されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、本明細書で開示されるポリペプチドは、表１ｂ～１ｈ、表２ｂ～２ｘ、および表３ａ～３ｄのいずれか１つで提供されるアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、本明細書で開示されるポリペプチドは、表１ｂ～１ｈ、表２ｂ～２ｘ、および表３ａ～３ｄのいずれか１つで提供されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、本明細書で開示されるポリペプチドは、以下の配列またはその断片：本明細書で開示されるＰ４～Ｐ９、Ｐ１１Ｅ、Ｐ１２Ｅ、Ｐ１９、Ｐ２０、Ｐ６１、Ｐ６２、またはＰ７２のアミノ酸配列の１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、（１）本明細書で開示するシグナルペプチド、例えばＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるシグナルペプチド；（２）本明細書で開示する抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列、例えば（２－ｉ）配列番号４１もしくは配列番号４２またはそのそれぞれの等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる軽鎖可変領域、（２－ｉｉ）例えば配列番号９またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる本明細書で開示する必要に応じたペプチドリンカー、および（２－ｉｉｉ）配列番号４４もしくは配列番号４５またはそのそれぞれの等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる重鎖可変領域を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列（ここで可変領域の等価物はＢＣＭＡを認識かつ結合する）；（３）本明細書で開示するヒンジドメイン、例えばＬＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＤＰＫＧＴ（配列番号４７）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるヒンジドメイン；（４）本明細書で開示する膜貫通ドメイン、例えばＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号９１）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるＣＤ２８膜貫通ドメイン；（５）本明細書で開示する共刺激シグナル伝達領域、例えばＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号９５）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域；（６）本明細書で開示するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、例えばＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号４９）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン；（７）本明細書で開示する切断性ペプチド、例えばＨＶＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５０）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるＴ２Ａ自己切断性ペプチド；（８）本明細書で開示するシグナルペプチド、例えばＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるシグナルペプチド；（９）本明細書で開示する抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列、例えば（９－ｉ）配列番号１６またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる軽鎖可変領域、（９－ｉｉ）例えば配列番号９またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる、本明細書で開示する必要に応じたペプチドリンカー、および（９－ｉｉｉ）配列番号１７またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる重鎖可変領域を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列（ここで可変領域の等価物はＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する）；（１０）本明細書で開示する必要に応じたペプチドリンカー、例えばＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ（配列番号８１）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるヒト筋アルドラーゼ（ＨＭＡ）リンカー；（１１）本明細書で開示する抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列、例えば（１１－ｉ）配列番号７またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる軽鎖可変領域、（１１－ｉｉ）例えば配列番号９またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる本明細書で開示する必要に応じたペプチドリンカー、および（１１－ｉｉｉ）配列番号８またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる重鎖可変領域を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列（ここで可変領域の等価物はＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する）；（１２）本明細書で開示するＦｃ領域、例えば配列番号１９またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるＦｃ領域；（１３）本明細書で開示する切断性ペプチド、例えばＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１３４）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるＴ２Ａ自己切断性ペプチド；（１４）本明細書で開示するシグナルペプチド、例えばＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）もしくはＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）もしくはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）またはそのそれぞれの等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるシグナルペプチド；（１５）本明細書で開示するサイトカインのアミノ酸配列、例えば配列番号１０６、配列番号１０４、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１６、またはそのそれぞれの等価物の少なくとも１つを含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるサイトカインのアミノ酸配列；（１６）本明細書で開示する切断性ペプチド、例えばＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１３３）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるＰ２Ａ自己切断性ペプチド；（１７）本明細書で開示するシグナルペプチド、例えばＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるシグナルペプチド；および（１８）本明細書で開示する自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方、例えば配列番号１２０またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる。さらなる実施形態では、サイトカインのアミノ酸配列は、膜貫通ドメイン、例えばＡＶＧＱＤＴＱＥＶＩＶＶＰＨＳＬＰＦＫＶＶＶＩＳＡＩＬＡＬＶＶＬＴＩＩＳＬＩＩＬＩＭＬＷＱＫＫＰＲ（配列番号１１９）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる膜貫通ドメインをさらに含む。さらなる実施形態では、サイトカインのアミノ酸配列は、サイトカイン受容体、例えばＩＬ１５受容体またはその断片をさらに含む。一部の実施形態では、サイトカインのアミノ酸配列は、配列番号１０６またはその等価物、本明細書で開示する必要に応じたペプチドリンカー、例えばＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱ（配列番号１０８）もしくは配列番号９またはそのそれぞれの等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなるペプチドリンカー、およびＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲ（配列番号１０７）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる。一部の実施形態では、ポリペプチドの部分または成分は、このパラグラフでポリペプチド中の任意の配置または順を示すことなく提供され、または番号付けされている。一部の実施形態では、ポリペプチドの部分または成分は、このパラグラフでポリペプチドのＮ末端からＣ末端への順で提供され、または番号付けされている（すなわち、他の追加の配列ありでまたはなしに、Ｎ末端からＣ末端へポリペプチド中で配置されている）。他の実施形態では、このパラグラフでポリペプチドの部分または成分はポリペプチドのＣ末端からＮ末端への順で提供され、または番号付けされている（すなわち、他の追加の配列ありでまたはなしに、Ｃ末端からＮ末端へポリペプチド中で配置されている）。一部の実施形態では、このパラグラフでポリペプチドの部分または成分は、軽鎖可変領域の１つまたは複数が同じ抗原結合性配列の重鎖可変領域と入れ替えられていることを除いて、ポリペプチドのＮ末端からＣ末端、またはＣ末端からＮ末端の順に提供され、または番号付けされている。一部の実施形態では、ポリペプチドの部分または成分は、抗原結合性配列の少なくとも２つが入れ替えられていることを除いて、このパラグラフでポリペプチドのＮ末端からＣ末端へ、またはＣ末端からＮ末端への順で提供され、または番号付けされている。一部の実施形態では、ポリペプチドの部分または成分は、抗原結合性配列の少なくとも２つが入れ替えられ、軽鎖可変領域の１つまたは複数が同じ抗原結合性配列の重鎖可変領域と入れ替えられていることを除いて、ポリペプチドのＮ末端からＣ末端へ、またはＣ末端からＮ末端への順で提供され、または番号付けされている。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、表１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｆ、１ｇ、２ａ、２ｄ、２ｅ、２ｈ、２ｉ、２ｌ、２ｍ、２ｐ、２ｑ、２ｔ、２ｕ、３ａ、３ｂ、３ｃ、または３ｄのいずれか１つで開示されるアミノ酸配列の１つもしくは複数またはそれらの任意の断片を含むか、本質的にこれらからなるか、これらからなる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で開示する以下の構築物：Ｐ４～Ｐ９、Ｐ１１Ｅ、Ｐ１２Ｅ、Ｐ１９、Ｐ２０、Ｐ６１、Ｐ６２、またはＰ７２のいずれか１つのアミノ酸配列またはその断片を含む。
治療用抗体は、その様々な作用機序および安全性プロファイルを鑑みると、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）における使用が成功することを保証するものではない。これらは、同じ抗原を標的とする場合でも、相互についての予測を与えることはできない。抗体は、抗原結合を利用して、多面の免疫応答を誘起する腫瘍のアポトーシスもしくはマクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および好中球へのＦｃ受容体の結合、またはその両方を誘起する。しかし、ＣＡＲ免疫細胞（例えばＴ細胞およびＮＫ細胞）は、腫瘍抗原への特異的な結合を利用し、人工のキメラ受容体を介して結果的に免疫細胞の活性化を誘起する。ＣＡＲ免疫細胞と抗体の両方がオフターゲット毒性を有し得るが、具体的には抗体がＦｃ受容体媒介毒性（Schlothauer et al. Protein Eng. Des. Sel. 29, 457-466 (2016)）を誘起し得る一方、ＣＡＲ免疫細胞は通常、致死的なサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）および神経毒性をもたらす（Gupta et al. J Emerg Med. 2020 May 27;S0736-4679(20)30352-8）。したがって、当業者は、共通の抗原結合ドメインのみに基づいてＣＡＲの有効性および安全性を予測することはできない。この理由により、開示したＣＡＲ構築物による主要な治療応答は、予期されず驚くべきものであった。一部の実施形態では、および一態様では、Ｆｃ受容体媒介毒性を回避するために、３つの部位突然変異を有するＩｇＧ４ Ｆｃ断片を使用することができる。
一部の態様ではＣＡＲ中のｓｃＦｖは抗体から誘導することができるが、機能性であるためには、両方が腫瘍抗原（ＴＡＡ）に結合する必要がある。しかし、腫瘍抗原への抗体の結合は通常、可溶性の形態における結合である一方、腫瘍抗原へのＣＡＲ上のｓｃＦｖの結合は免疫細胞の表面からの結合である。これらの２つの型の相互作用を決定する少なくとも３つの差異がある。１）タンパク質またはペプチドのコンフォメーションの要求は２つの設定において異なる。２）抗体の設定において、重鎖の２つのＦａｂ領域（それぞれ重鎖および軽鎖の部分からなる）およびＦｃからなる全長抗体が結合親和性を支配し、結合は２つのＦａｂ領域があるため二価である一方、ＣＡＲについては、１つのＦａｂ領域がリンカーによって相互に連結された重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）からなるｓｃＦｖは一価結合である。３）対応する抗体と比較してｓｃＦｖが一価結合でありその長さが短いために、ＣＡＲはより小さな結合親和性を有する一方、ＣＡＲのためにネズミｓｃＦｖを使用した場合に患者における免疫原性が低い。これは市販のＣＡＲの大部分の場合である（Dotti et al. Immunol Rev 257, 107-126 (2014)）。したがって、抗体の機能性からＣＡＲの機能性を予測できない。実際上、Haso et al. (Blood 121, 1165-1174 (2013))は最近、高親和性の抗体誘導ｓｃＦｖを使用してＣＡＲの結合親和性を増大させても、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＣＡＲの活性を増大させることはできなかったことを実証した（Haso et al. Blood 121, 1165-1174 (2013) および Handgretinger et al. Blood 121, 1065-1066 (2013)）。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジドメインまたはＩｇＧ１ヒンジドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、ＩｇＧ１ヒンジドメインは、ＬＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＤＰＫＧＴ（配列番号４７）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域、４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域、ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域、ＯＸ４０共刺激領域、ＤＡＰ１０共刺激領域、ＤＡＰ１２共刺激領域、ＰＤ－１共刺激ドメイン、ＣＴＬＡ－４共刺激ドメイン、ＬＡＧ－３共刺激ドメイン、２Ｂ４共刺激ドメイン、ＢＴＬＡ共刺激ドメイン、またはそれらの任意の組合せから選択される１つもしくは複数または２つもしくはそれより多くの共刺激領域を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ２８膜貫通ドメインである。さらなる実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号９１）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、細胞内ドメインは、本明細書で共刺激シグナル伝達領域とも称される共刺激領域を含む。さらなる実施形態では、共刺激領域はＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域である。さらなる実施形態では、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域は、ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号９５）またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４８またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ２８細胞質ドメイン（例えばＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域）を含む。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、細胞内ドメインはＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。さらなる実施形態では、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号４９またはその等価物を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書に開示されている任意の態様の一部の実施形態では、細胞内ドメインは、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ活性化ドメインを含むＩＬ２Ｒβまたはその断片をさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されているＣＡＲまたはその細胞質／細胞内ドメインはＩＬ２Ｒβまたはその断片をさらに含む。さらなる実施形態では、ＩＬ２Ｒβの断片は、免疫細胞の活性化を促す、ＩＬ２ＲβのＪＡＫ－ＳＴＡＴ活性化ドメインを含むか、あるいはから本質的になるか、またはさらにからなる。一部の実施形態では、ＣＡＲまたはＣＡＲの細胞内ドメインは、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ活性化ドメインを含むＩＬ２Ｒβまたはその断片をさらに含む。一部の実施形態では、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ活性化ドメインは、ＪＡＫ結合性ドメイン（チロシンキナーゼＪＡＫ会合を可能とするｂｏｘ－１モチーフとしても公知、例えばＪＡＫ１）またはシグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子（ＳＴＡＴ、例えばＳＴＡＴ３またはＳＴＡＴ５）関連モチーフまたは両方を含むか、あるいはから本質的になるか、またはさらにからなる。ＪＡＫ結合性ドメインの例は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００８６９．１のアミノ酸番号２７８～２８６に見出され得る。さらなる実施形態では、細胞内ドメインは、内因性もしくは外因性ＪＡＫ結合モチーフ、または内因性もしくは外因性ＳＴＡＴ関連モチーフ、または両方をさらに含む。一部の実施形態では、外因性ＳＴＡＴ３関連モチーフは、ＹＸＸＱ（配列番号１３６）、必要に応じてＹＲＨＱ（配列番号１３７）である。そのようなＣＡＲ細胞を発現する細胞は、抗原依存性ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３／５経路活性化を示し、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでそれらの増殖および終末分化の予防を促進する。あるいは、ＩＬ２Ｒβ以外のタンパク質からのＪＡＫ－ＳＴＡＴ活性化ドメインがここでの代替として使用されてもよい。例示されるそのようなタンパク質は、エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）、トロンボポエチン受容体（ＴｐｏＲ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭ－ＣＳＦＲ）、または成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）を含み得る。例えば、ＵＳ２０１９０３５９６８５Ａ１およびKagoya et al. Nat Med. 2018 Mar;24(3):352-359. doi: 10.1038/nm.4478. Epub 2018 Feb 5を参照されたい。
本明細書に開示されている任意の態様の一部の実施形態では、ポリペプチドまたはＣＡＲは、自殺遺伝子産物または検出可能マーカーまたは両方をさらに含む。さらなる実施形態では、自殺遺伝子産物は、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシルエステラーゼ、シトクロムＰ４５０もしくはＰＮＰ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）、切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）、ＲＱＲ８、または誘起可能なカスパーゼ（「ｉＣａｓｐ」）の１つまたは複数から選択される。
本明細書に開示されている任意の態様の一部の実施形態では、ＣＡＲは、二特異性抗体のＮ末端におけるシグナルペプチドとは必要に応じて異なる、そのＮ末端におけるシグナルペプチドをさらに含む。さらなる実施形態では、シグナルペプチドは、細胞表面上にあるＣＡＲの位置を特定するのを容易にする。いっそうさらなる実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）、またはＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、またはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）、またはＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、またはＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）、またはＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）、またはＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）または細胞表面上にあるＣＡＲの位置を特定するのを容易にするそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。
本明細書に開示されている任意の態様の一部の実施形態では、ＣＡＲまたはポリペプチドは、検出可能マーカーをさらに含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲが認識し、結合するＴＡＡにより検出され得る。さらなる実施形態では、ＴＡＡは、検出可能マーカーにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＣＡＲは、その抗原結合性配列を認識かつ結合する抗体により検出され得る。例えば、ＣＡＲの抗原結合性配列がマウスＦａｂまたはｓｃＦｖである場合、そのようなＣＡＲは、マウスＦａｂまたはｓｃＦｖを認識かつ結合する抗体、例えばヤギ抗マウス抗体により検出され得る。
本明細書に開示されている任意の態様の一部の実施形態では、ポリペプチドは、以下：ＣＡＲ；二特異性抗体（本明細書においてＢｉＴＥ、二特異性Ｔ細胞エンゲージャーまたはＢｉＫＥ、二特異性ＮＫ細胞エンゲージャーとも称される）；必要に応じたサイトカイン；または必要に応じた自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーもしくは両方のいずれか２つの間に位置する切断可能なペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、切断可能なペプチドは自己切断性ペプチドである。さらなる実施形態では、自己切断性ペプチドはＴ２Ａペプチドである。いっそうさらなる実施形態では、切断可能なペプチドまたは自己切断性ペプチドまたはＴ２Ａペプチドは、ＨＶＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５０）またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。
一部の実施形態では、二特異性抗体は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列および抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一部の実施形態では、二特異性抗体は、Ｎ末端からＣ末端へ、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列および抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。結合配列は、本明細書に記載され、かつ本明細書に組み込まれており、例えば、ｓｃＦｖ、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ、ならびに最小のＣＤＲを含む。
一部の実施形態では、可変領域の等価物は可変領域のＣＤＲを保持する。一部の実施形態では、配列番号７の等価物は配列番号７のＣＤＲを保持する。一部の実施形態では、配列番号８の等価物は配列番号８のＣＤＲを保持する。一部の実施形態では、配列番号１６の等価物は配列番号１６のＣＤＲを保持する。一部の実施形態では、配列番号１７の等価物は配列番号１７のＣＤＲを保持する。一部の実施形態では、配列番号４１～４６の等価物はそれぞれ配列番号４１～４６のＣＤＲを保持する。
一部の実施形態では、本明細書に開示されているポリペプチドは、以下またはその断片の１つまたは複数を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる：配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４；表１ｂ～１ｈ、表２ｂ～２ｘ、および表３ａ～３ｄに列挙されるアミノ酸配列；または表１ｂ～１ｈ、表２ｂ～２ｘ、および表３ａ～３ｄに列挙されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列。
一部の実施形態では、本明細書に開示されているポリペプチドは、配列番号１３８または配列番号１３９、またはそのそれぞれの等価物の１つまたは複数を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。
ポリヌクレオチド
追加的に提供されるのは、以下：本明細書に開示されているポリペプチドもしくはその任意の断片、本明細書に開示されている二特異性抗体、または本明細書に開示されているＣＡＲの１つまたは複数をコードするポリヌクレオチドに加えて、それに対するリバースまたは相補体またはリバース相補体ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下：ポリペプチドの発現を方向付ける第１の制御配列；二特異性抗体の発現を方向付ける第２の制御配列；およびＣＡＲの発現を方向付ける第３の制御配列のいずれか１つまたはいずれか２つまたは３つ全てをさらに含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、（１）本明細書に開示されているシグナルペプチドコード配列、例えばＡＴＧＧＧＧＴＧＧＴＣＡＡＧＣＡＴＴＡＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＣＧＣＴＡＣＣＧＣＴＡＣＡＧＧＣＧＴＣＣＡＴ（配列番号５５）またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなるもの；（２）本明細書に開示されている抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列コード配列、例えば（２－ｉ）配列番号５８または配列番号５９またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる軽鎖可変領域コード配列、（２－ｉｉ）例えばＧＧＴＧＧＧＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＴ（配列番号５７）またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる必要に応じたペプチドリンカーコード配列、および（２－ｉｉｉ）配列番号６２または配列番号６３またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる重鎖可変領域コード配列を含むか、またはから本質的になるか、またはからなり、等価物が、ＢＣＭＡを認識かつ結合する可変領域をコードするもの；（３）本明細書に開示されているヒンジドメインコード配列、例えばＣＴＣＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＡＡＧＧＴＡＣＣ（配列番号６６）またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなるもの；（４）本明細書に開示されている膜貫通ドメインコード配列、例えばＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧ（配列番号９０）またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなるＣＤ２８膜貫通ドメインコード配列；（５）本明細書に開示されている共刺激シグナル伝達領域コード配列、例えば配列番号９６またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなるＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域コード配列；（６）ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインコード配列、例えば配列番号６８またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなるもの；（７）本明細書に開示されている切断性ペプチドコード配列、例えば配列番号６９または配列番号１４０またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなるＴ２Ａ自己切断性ペプチドコード配列；（８）本明細書に開示されているシグナルペプチドコード配列、例えば配列番号５６またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなるもの；（９）本明細書に開示されている抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列コード配列、例えば（９－ｉ）配列番号７１または配列番号１４１またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる軽鎖可変領域コード配列、（９－ｉｉ）配列番号５７または配列番号１４２またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなるペプチドリンカーコード配列、および（９－ｉｉｉ）配列番号７２、または配列番号１４３、またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる重鎖可変領域コード配列を含むか、またはから本質的になるか、またはからなり、等価物が、ＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する可変領域をコードするもの；（１０）本明細書に開示されているリンカーコード配列、例えば配列番号７０または配列番号１４４またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなるヒト筋アルドラーゼ（ＨＭＡ）リンカーコード配列；（１１）本明細書に開示されている抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列コード配列、例えば（１１－ｉ）配列番号７３または配列番号１４５またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる軽鎖可変領域コード配列、（１１－ｉｉ）配列番号５７または配列番号１４６またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなるペプチドリンカーコード配列、および（１１－ｉｉｉ）配列番号７４またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる重鎖可変領域コード配列を含むか、またはから本質的になるか、またはからなり、等価物が、ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する可変領域をコードするもの；（１２）本明細書に開示されているＦｃ領域コード配列、例えば配列番号７５または配列番号１４７またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなるもの；（１３）本明細書に開示されている切断性ペプチドコード配列、例えば配列番号１４８または配列番号１４９またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなるＴ２Ａ自己切断性ペプチドコード配列；（１４）本明細書に開示されているシグナルペプチドコード配列、例えば配列番号５６または配列番号１５０または配列番号２００、配列番号１２７、または配列番号１５１またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなるもの；（１５）本明細書に開示されているサイトカインコード配列、例えば配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８またはそのそれぞれの等価物の少なくとも１つを含むか、またはから本質的になるか、またはからなるもの；（１６）本明細書に開示されている切断性ペプチドコード配列、例えば配列番号１５９または配列番号１６０またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなるＰ２Ａ自己切断性ペプチドコード配列；（１７）必要に応じた本明細書に開示されているシグナルペプチドコード配列、例えば配列番号１６１またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなるもの；ならびに（１８）本明細書に開示されている検出可能マーカーおよび／もしくは自殺遺伝子産物コード配列または自殺遺伝子、例えば配列番号１６２または配列番号１６３またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなるものを含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態では、サイトカインコード配列は、配列番号１６４またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる膜貫通ドメインコード配列をさらに含む。一部の実施形態では、サイトカインコード配列は、配列番号１５２、または配列番号１５３またはそのそれぞれの等価物、配列番号１６５または配列番号１６６または配列番号５７またはそのそれぞれの等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる必要に応じたペプチドリンカーコード配列、および配列番号１６７またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの部分または成分は、ポリヌクレオチド中でのそれらの位置または構成のいかなる限定も指示もなしに提供または番号付けされる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの部分または成分は、ポリヌクレオチドの５’から３’の順で提供または番号付けされる（すなわち、他の配列ありまたはなしで５’から３’へとしてポリヌクレオチド中で配置されている）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの部分または成分は、ポリヌクレオチドの３’から５’の順で提供または番号付けされる（すなわち、他の配列ありまたはなしで３’から５’へとしてポリヌクレオチド中で配置されている）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの部分または成分は、軽鎖可変領域コード配列の１つまたは複数が同じ抗原結合性配列の重鎖可変領域コード配列で入れ替えられていることを除いて、ポリヌクレオチド中で５’から３’または３’から５’の順で提供または番号付けされる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの部分または成分は、抗原結合性配列コード配列の少なくとも２つが入れ替えられていることを除いて、ポリヌクレオチド中で５’から３’または３’から５’の順で提供または番号付けされる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの部分または成分は、抗原結合性配列コード配列の少なくとも２つが入れ替えられており、軽鎖可変領域コード配列の１つまたは複数が同じ抗原結合性配列の重鎖可変領域コード配列で入れ替えられていることを除いて、ポリヌクレオチド中で５’から３’または３’から５’の順で列挙される。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、表１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｆ、１ｇ、２ａ、２ｄ、２ｅ、２ｈ、２ｉ、２ｌ、２ｍ、２ｐ、２ｑ、２ｔ、２ｕ、３ａ、３ｂ、３ｃ、もしくは３ｄのいずれか１つに開示されているヌクレオチド配列、またはこれらの任意の断片の１つまたは複数を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている以下の配列またはその断片：Ｐ４～Ｐ９、Ｐ１１Ｅ、Ｐ１２Ｅ、Ｐ１９、Ｐ２０、Ｐ６１、Ｐ６２、またはＰ７２のヌクレオチド配列の１つまたは複数を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下：ＣＡＲの発現を方向付ける第１の制御配列、二特異性抗体の発現を方向付ける第２の制御配列、またはＣＡＲをコードする配列と二特異性抗体をコードする配列との間に位置する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の１つまたは複数をさらに含む。一部の実施形態では、第１の制御配列は、配列またはポリヌクレオチド中の位置または両方において第２の制御配列とは異なる。一部の実施形態では、第１の制御配列および第２の制御配列は二方向性制御配列を構成する。よって、提供されるのは、両方ともポリヌクレオチドによりコードされる、ＣＡＲペプチドおよび二特異性抗体を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる組成物である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下：ＣＡＲの発現を方向付ける第１の制御配列、二特異性抗体の発現を方向付ける第２の制御配列、サイトカインの発現を方向付ける第３の制御配列、自殺遺伝子産物または検出可能マーカーまたは両方の発現を方向付ける第４の制御配列の１つまたは複数をさらに含む。一部の実施形態では、制御配列のいずれか２つは、配列またはポリヌクレオチド中の位置または両方において互いから異なる。一部の実施形態では、制御配列のいずれか２つは二方向性制御配列を構成する。追加的あるいは、ポリヌクレオチドは、以下：ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列、二特異性抗体をコードするヌクレオチド配列、存在する場合にサイトカインをコードするヌクレオチド配列、または存在する場合に自殺遺伝子産物（例えば、自殺遺伝子）もしくは検出可能マーカーもしくは両方をコードするヌクレオチド配列のいずれか２つの間に位置する１つまたは複数の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。よって、提供されるのは、全てがポリヌクレオチドによりコードされる、ＣＡＲ、二特異性抗体、サイトカイン、または自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーもしくは両方の１つまたは複数を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる組成物である。
いっそうさらなる実施形態では、制御配列のそれぞれは、以下：プロモーター、イントロン、エンハンサー、またはポリアデニル化シグナルの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチド、ＣＡＲ、二特異性抗体、サイトカイン、自殺遺伝子産物、検出可能マーカー、またはこれらの任意の組合せの発現を方向付ける。一部の実施形態では、制御配列は、ポリヌクレオチドを複製するために好適である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、検出可能な標識または抗生物質耐性を付与するポリヌクレオチドまたは両方をさらに含む。さらなる実施形態では、標識またはポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを成功裏に形質導入された細胞を選択するために有用である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、単離または操作または単離および操作の両方をされている。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、表１ａ～１ｈ、表２ａ～２ｘ、および表３ａ～３ｄに開示されているヌクレオチド配列または同じアミノ酸配列をコードするそのそれぞれの等価物の１つまたは複数を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、検出可能マーカーをさらに含む。追加的あるいは、ポリヌクレオチドは、自殺遺伝子、例えば誘起可能なカスパーゼ（ｉＣａｓｐ）自殺遺伝子をさらに含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下：（Ｉ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号５５またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなるヌクレオチド配列；（ＩＩ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号５６またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなるヌクレオチド配列；（ＩＩＩ）リンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号５７またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなるヌクレオチド配列；（ＩＶ）抗ＢＣＭＡ軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、または配列番号６１またはその等価物から選択されるヌクレオチド配列；（Ｖ）抗ＢＣＭＡ重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、または配列番号６５またはその等価物から選択されるヌクレオチド配列；（ＶＩ）ヒンジドメインをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号６６またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなるヌクレオチド配列；（ＶＩＩ）膜貫通および細胞質／細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号６７またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなるヌクレオチド配列；（ＶＩＩＩ）シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号６８またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなるヌクレオチド配列；（ＩＸ）自己切断性ペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号６９またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなるヌクレオチド配列；（Ｘ）リンカーをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号７０またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなるヌクレオチド配列；抗ＧＰＲＣ５Ｄ軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号７１またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなるヌクレオチド配列；（ＸＩＩ）抗ＧＰＲＣ５Ｄ重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号７２またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなるヌクレオチド配列；（ＸＩＩＩ）抗ＮＫＧ２Ｄ軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号７３またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなるヌクレオチド配列；（ＸＩＶ）抗ＮＫＧ２Ｄ重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号７４またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなるヌクレオチド配列；（ＸＶ）突然変異体Ｆｃ領域をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号７５またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなるヌクレオチド配列；（ＸＶＩ）タグをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号７６またはその等価物を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなるヌクレオチド配列；（ＸＶＩＩ）配列番号７７またはその等価物のヌクレオチド配列；（ＸＶＩＩＩ）配列番号７８またはその等価物のヌクレオチド配列；（ＸＩＸ）配列番号７９またはその等価物のヌクレオチド配列；ならびに（ＸＸ）配列番号８０またはその等価物のヌクレオチド配列の１つまたは複数を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、表１ａ～１ｈに列挙されるヌクレオチド配列のいずれか１つまたは複数を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。
一部の実施形態では、本明細書に開示されているポリヌクレオチドは、自殺遺伝子産物または検出可能マーカーまたは両方をさらに含む。さらなる実施形態では、自殺遺伝子は、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシルエステラーゼ、シトクロムＰ４５０もしくはＰＮＰ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）、切断型ＥＧＦＲ、または誘起可能なカスパーゼ（「ｉＣａｓｐ」）の１つまたは複数から選択される生成物をコードする。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、検出可能マーカーをさらに含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１６８；または配列番号１６９、またはそのそれぞれの等価物のいずれか１つまたは複数を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。
一部の実施形態では、参照ポリヌクレオチドの等価物は、参照ポリヌクレオチドがコードする同じポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、参照ポリヌクレオチドの等価物は、参照ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの等価物をコードする。
一部の実施形態では、本明細書に開示されているポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの複製を方向付ける１つまたは複数の制御配列をさらに含む。
ベクター
さらに、本明細書で開示するポリヌクレオチド、その相補体、そのリバース配列、またはそのリバース相補体の１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるベクターが提供される。一部の実施形態では、ベクターは非ウイルスベクターまたはウイルスベクターである。一実施形態では、非ウイルスベクターはプラスミドである。一実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターの群から選択される。さらに、ベクターは、ポリヌクレオチドの複製もしくは発現またはその両方を方向付ける制御配列をさらに含んでよい。一部の実施形態では、プラスミドは、例えば実施例１および２に示すように構築および調製され、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを産生する。
一部の実施形態では、ベクターは、本明細書で開示するように、ポリヌクレオチドを複製または増幅するために使用される。さらなる実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチド、その相補体、そのリバース配列、またはそのリバース相補体の１つまたは複数を含む。さらなる実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチドの複製を方向付ける制御配列をさらに含む。
一部の実施形態では、ベクターは、本明細書で開示するポリヌクレオチドを、例えば本明細書で開示するポリペプチドまたはその断片に転写もしくは翻訳するため、または転写と翻訳の両方のために使用される。さらなる実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチド、その相補体、そのリバース配列、またはそのリバース相補体の１つまたは複数を含む。さらなる実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチドの発現を方向付ける制御配列をさらに含む。さらにまたはその代わりに、ベクターは、以下：ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列、二特異性抗体をコードするヌクレオチド配列、存在すればサイトカインをコードするヌクレオチド配列、または存在すれば自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方（例えば自殺遺伝子）をコードするヌクレオチド配列のいずれか２つの間に位置する１つまたは複数の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。
一態様では、２つ以上のベクターを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるベクター系が提供される。一部の実施形態では、ベクターは、（ｉ）（１）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を認識かつ結合する抗原結合性アミノ酸配列（抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列）、（２）ヒンジドメイン、（３）膜貫通ドメイン、および（４）細胞内ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列；（ｉｉ）（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）および（２）Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる二特異性抗体のアミノ酸配列；（ｉｉｉ）ＩＬ１５またはＩＬ－２１から選択されるサイトカインの必要に応じたアミノ酸配列；および（ｉｖ）自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方、必要に応じて切断型上皮細胞増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）またはＲＱＲ８の必要に応じたアミノ酸配列をコードする。
一部の実施形態では、ベクター系は、少なくとも２つのベクターを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、第１のベクターは、（ｉ）（１）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を認識かつ結合する抗原結合性アミノ酸配列（抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列）、（２）ヒンジドメイン、（３）膜貫通ドメイン、および（４）細胞内ドメインを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列；（ｉｉｉ）ＩＬ１５またはＩＬ－２１から選択されるサイトカインの必要に応じたアミノ酸配列；および（ｉｖ）自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方、必要に応じて切断型上皮細胞増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）またはＲＱＲ８の必要に応じたアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、第２のベクターは、（ｉｉ）（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）および（２）Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる二特異性抗体のアミノ酸配列；（ｉｉｉ）ＩＬ１５またはＩＬ－２１から選択されるサイトカインの必要に応じたアミノ酸配列；および（ｉｖ）自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方、必要に応じて切断型上皮細胞増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）またはＲＱＲ８の必要に応じたアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、第１のベクターの自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方は、第２のベクターの自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方とは異なる。一部の実施形態では、第１のベクターの自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方は、第２のベクターの自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方と同じである。
一部の実施形態では、ベクター系の異なるベクターにおける自殺遺伝子産物または検出可能マーカーは異なる。一部の実施形態では、ベクター系の異なるベクターにおける自殺遺伝子産物または検出可能マーカーは同じである。
細胞
以下：本明細書で開示するポリペプチド、本明細書で開示する二特異性抗体またはその断片、本明細書で開示するＣＡＲ、本明細書で開示するサイトカイン、本明細書で開示する自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方、本明細書で開示する自殺遺伝子、本明細書で開示するポリヌクレオチド、本明細書で開示するベクター、または本明細書で開示するベクター系の１つまたは複数を含む、単離もしくは操作された、または単離および操作された細胞がさらに提供される。
一部の実施形態では、細胞は原核生物細胞または真核生物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、必要に応じて動物細胞、哺乳動物細胞、ウシ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ネズミ細胞、ウマ細胞、またはヒト細胞から選択される真核生物細胞である。一部の実施形態では、真核生物細胞は免疫細胞、必要に応じてＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、骨髄性細胞、単球、またはマクロファージであり、必要に応じて造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導される。一部の実施形態では、ＨＳＣおよびｉＰＳＣは本明細書で前駆体細胞と称される。一部の実施形態では、細胞は幹細胞、例えばＨＳＣまたはｉＰＳＣである。一部の実施形態では、単離された細胞は、本明細書で開示するようにＣＡＲを発現するか、本明細書で開示するように二特異性抗体を分泌するか、またはその両方である。さらに、単離された細胞は、本明細書で開示するように、サイトカインをさらに発現するか、発現して分泌する。さらにまたはその代わりに、単離された細胞は、本明細書で開示する自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方をさらに発現する。
一部の実施形態では、細胞はＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、骨髄性細胞、単球、マクロファージ、それらの任意のサブセット、または他の任意の免疫細胞である。一部の実施形態では、細胞は、必要に応じてＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、骨髄性細胞、単球、マクロファージから選択される免疫細胞である。さらなる実施形態では、免疫細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導される。真核生物細胞は、任意の好ましい種、例えば動物細胞、哺乳動物細胞、例えばヒト、ウシ細胞、ネズミ細胞、ウマ細胞、ネコ細胞、またはイヌ細胞に由来してよい。細胞は患者、ドナー、または細胞系、例えば既製で入手可能な細胞から誘導してよい。細胞は処置される対象に対して自家または同種異系であってよい。一部の実施形態では、細胞は、検出可能マーカーまたは精製マーカーをさらに含む。一部の実施形態では、細胞は本明細書で開示するようにＣＡＲを発現する。さらにまたはその代わりに、細胞は本明細書で開示するように二特異性抗体を発現する。さらなる実施形態では、細胞は細胞外に二特異性抗体を分泌する。
本明細書で開示する細胞を含むか、その代わりに本質的にこれからなるか、さらにこれからなる細胞集団も提供される。一部の実施形態では、細胞集団は均一または不均一である。さらなる実施形態では、細胞集団は実質的に均一である。一部の実施形態では、細胞は、遺伝子編集技術、例えばＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを使用してＣＤ５２の発現を除去するように改変されたＴ細胞である。
一態様では、（ｉ）本明細書で開示するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列、（ｉｉ）本明細書で開示する二特異性抗体のアミノ酸配列、（ｉｉｉ）本明細書で開示するサイトカインのアミノ酸配列、または（ｉｖ）本明細書で開示する自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方のアミノ酸配列の１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるポリペプチド；または本明細書で開示するポリヌクレオチド；またはポリペプチドとポリヌクレオチドの両方を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、ポリペプチドはさらに処理され、例えばそれ自体または細胞によって切断されて、ＣＡＲペプチド、二特異性抗体、サイトカイン、または自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方の１つまたは複数を生じる。さらなる実施形態では、細胞は、ＣＡＲペプチド、二特異性抗体、サイトカイン、または自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方の１つまたは複数をさらに含む。さらなる実施形態では、細胞は、細胞膜上にＣＡＲを発現する。さらなる実施形態では、細胞は、細胞外に二特異性抗体を分泌する。一部の実施形態では、細胞はサイトカインを発現する。さらなる実施形態では、細胞はサイトカインを分泌する。一部の実施形態では、細胞は細胞膜上にサイトカインを発現する。一部の実施形態では、細胞は自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方を発現する。さらなる実施形態では、細胞は細胞膜上に自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方を発現する。一部の実施形態では、細胞は、本明細書で開示するポリヌクレオチドおよび細胞中においてポリヌクレオチドを複製または発現するために好適な制御配列を含むか、さらに含む。一部の実施形態では、細胞は単離される。さらにまたはその代わりに、細胞は操作される。
一部の実施形態では、細胞はポリヌクレオチドまたはベクターもしくはベクター系を複製するためのものである。さらなる実施形態では、細胞は細胞系である。一部の実施形態では、細胞は原核生物細胞または真核生物細胞であってよい。さらなる実施形態では、細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。さらなる実施形態では、細胞は、最適化された効率および品質を有する、１０Ｋｂより大きなサイズのポリヌクレオチド（例えばＰ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１１Ｅ、Ｐ１２Ｅ、Ｐ６１、Ｐ６２、またはＰ７２）を増大させるためのＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（商標）Ｓｔｂｌ２（商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１０２６８０１９）である。一部の実施形態では、細胞は、１０Ｋｂに等しいかこれより小さいサイズの他のプラスミド（例えばＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ１０Ｅ、Ｐ３６Ｅ、Ｐ３７Ｅ、Ｐ３８Ｅ、Ｐ３９Ｅ、Ｐ１７、Ｐ１８、Ｐ１９、Ｐ２０）に好適なＮＥＢ（登録商標）Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（ＮＥＢ，Ｃ３０３０Ｈ）である。
さらなる態様では、本明細書で開示するＣＡＲペプチド、本明細書で開示する二特異性抗体、本明細書で開示するサイトカイン、または本明細書で開示する自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方の１つまたは複数（例えば２つまたは３つまたは４つ全て）を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、細胞は、細胞膜上にＣＡＲを含み、細胞外に二特異性抗体を分泌する。一部の実施形態では、細胞はサイトカインを発現する。さらなる実施形態では、細胞はサイトカインを分泌する。一部の実施形態では、細胞は細胞膜上にサイトカインを発現する。一部の実施形態では、細胞は自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方を発現する。さらなる実施形態では、細胞は細胞膜上に自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方を発現する。さらにまたはその代わりに、ＣＡＲペプチド、二特異性抗体、サイトカイン、または自殺遺伝子産物のいずれか１つまたは複数は、例えば細胞中で、（ｉ）ＣＡＲのアミノ酸配列、（ｉｉ）二特異性抗体のアミノ酸配列、（ｉｉｉ）本明細書で開示するサイトカインの必要に応じたアミノ酸配列、（ｉｖ）本明細書で開示する自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方の必要に応じたアミノ酸配列、および（ｉ）～（ｉｖ）のいずれか２つの間に位置する１つまたは複数の切断可能なペプチドを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなるポリペプチドの切断を介して産生される。一部の実施形態では、細胞は単離される。さらにまたはその代わりに、細胞は操作される。
したがって、本明細書で開示するポリペプチドもしくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその両方を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、ポリペプチドはさらに処理され、例えばそれ自体または細胞によって切断されて、以下：ＣＡＲペプチド、二特異性抗体、サイトカイン、および自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方のいずれか１つまたは２つまたは３つまたは４つ全てが生じる。一部の実施形態では、細胞は、以下：ＣＡＲペプチド、二特異性抗体、サイトカイン、および自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方のいずれか１つまたは２つまたは３つまたは４つ全てをさらに含む。一部の実施形態では、細胞は細胞膜上にＣＡＲを発現し、二特異性抗体を細胞外に分泌する。さらなる実施形態では、細胞はサイトカインを細胞外に分泌するか、サイトカインを細胞膜上に発現する。さらにまたはその代わりに、細胞は自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方を、例えば細胞膜上に発現する。一部の実施形態では、細胞は本明細書で開示するポリヌクレオチドおよび細胞中でポリヌクレオチドを複製または発現するために好適な制御配列を含む。一部の実施形態では、細胞は単離される。さらにまたはその代わりに、細胞は操作される。
以下：本明細書で開示するポリペプチド、本明細書で開示する二特異性抗体またはその断片、本明細書で開示するＣＡＲ、本明細書で開示するポリヌクレオチド、または本明細書で開示するベクター、または本明細書で開示するベクター系の１つまたは複数を含む単離または操作された細胞がさらに提供される。一部の実施形態では、細胞は細胞膜にＣＡＲを含み、二特異性抗体を細胞外に分泌する。さらなる実施形態では、細胞は本明細書で開示するサイトカインを分泌する。さらにまたはその代わりに、細胞は、例えば細胞表面上に、本明細書で開示する自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方を発現する。
本明細書で開示する細胞の増殖および遺伝子改変に先立って、細胞は、例えば自家療法を含む実施形態で、対象から、または市販の細胞系もしくは培養、または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）等の幹細胞から得てよい。
細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾組織、および腫瘍を含む対象のいくつかの供給源から得ることができる。
産生法および組成物
一態様では、ＣＡＲを発現するか二特異性抗体を分泌する、またはＣＡＲを発現しかつ二特異性抗体を分泌する細胞を産生する方法が提供される。一部の実施形態では、細胞はさらに、サイトカインを分泌するか自殺遺伝子産物（もしくは検出可能マーカーまたはその両方）を発現するか、またはサイトカインを分泌しかつ自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方を発現する。一部の実施形態では、本方法は、細胞またはその集団に、本明細書で開示するポリヌクレオチドまたは本明細書で開示するベクターまたは本明細書で開示するベクター系を形質導入することを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、本方法は、細胞またはその集団に、ベクター系のベクターを同時にまたは引き続いて形質導入することを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。さらにまたはその代わりに、本方法は、細胞または細胞の集団を、本明細書で開示するように培養することを含むか、本質的にこれからなるか、さらにこれからなる。
関連する細胞を単離する方法は当技術で周知であり、本出願に容易に適合させることができる。例示的な方法を、以下の実施例に記載している。本開示に関連する使用のための単離方法には、それだけに限らないが、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ；ＳＴＥＭｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＥａｓｙＳｅｐ（商標）、ＲｏｂｏＳｅｐ（商標）、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）、ＳｅｐＭａｔｅ（商標）；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＭＡＣＳ（商標）細胞分離キット；およびその他の市販の細胞分離および単離用のキットが含まれる。免疫細胞の特定の部分集団は、特有の細胞表面マーカーに特異的なこれらのキット中で利用可能なビーズまたはその他の結合剤の使用によって単離することができる。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するために、ＭＡＣＳ（商標）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを使用することができる。公知の手法に従って単離され得る細胞の代替の非限定的な例には、バルク化されたＴ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、およびガンマデルタＴ細胞が含まれる。
その代わりに、細胞は、それだけに限らないが、Ｔ細胞についてはＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９０２（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９００（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２９０１（商標））、ＢＣＬ２ Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２８９９（商標））、Ｎｅｏ Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２８９８（商標））系；Ｂ細胞についてはＡＨＨ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－８１４６（商標））、ＢＣ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２２３０（商標））、ＢＣ－２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２２３１（商標））、ＢＣ－３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２２７７（商標））、ＣＡ４６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６４８（商標））、ＤＧ－７５［Ｄ．Ｇ．－７５］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２６２５（商標））、ＤＳ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１１１０２（商標））、ＥＢ－３［ＥＢ３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－８５（商標））、Ｚ－１３８（ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ－３００１）、ＤＢ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２２８９）、Ｔｏｌｅｄｏ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６３１）、Ｐｆｉｆｆｅｒ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６３２）、ＳＲ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２２６２）、ＪＭ－１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１０４２１）、ＮＦＳ－５ Ｃ－１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６９３）系；ＮＦＳ－７０ Ｃ１０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６９４）、ＮＦＳ－２５ Ｃ－３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６９５）、およびＳＵＰ－Ｂ１５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９２９）系；ならびにＮＫ細胞についてはＮＫ－９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０７（商標））、ＮＫ－９２ＭＩ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０８（商標））系を含む市販の細胞培養によって得ることができる。さらなる例には、それだけに限らないが、成熟Ｔ細胞系、例えばＤｅｇｌｉｓ、ＥＢＴ－８、ＨＰＢ－ＭＬｐ－Ｗ、ＨＵＴ ７８、ＨＵＴ １０２、Ｋａｒｐａｓ ３８４、Ｋｉ ２２５、Ｍｙ－Ｌａ、Ｓｅ－Ａｘ、ＳＫＷ－３、ＳＭＺ－１、およびＴ３４；未成熟Ｔ細胞系、例えばＡＬＬ－ＳＩＬ、Ｂｅ１３、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＣＭＬ－Ｔ１、ＤＮＤ－４１、ＤＵ．５２８、ＥＵ－９、ＨＤ－Ｍａｒ、ＨＰＢ－ＡＬＬ、Ｈ－ＳＢ２、ＨＴ－１、ＪＫ－Ｔ１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋａｒｐａｓ ４５、ＫＥ－３７、ＫＯＰＴ－Ｋ１、Ｋ－Ｔ１、Ｌ－ＫＡＷ、Ｌｏｕｃｙ、ＭＡＴ、ＭＯＬＴ－１、ＭＯＬＴ ３、ＭＯＬＴ－４、ＭＯＬＴ １３、ＭＯＬＴ－１６、ＭＴ－１、ＭＴ－ＡＬＬ、Ｐ１２／Ｉｃｈｉｋａｗａ、Ｐｅｅｒ、ＰＥＲ０１１７、ＰＥＲ－２５５、ＰＦ－３８２、ＰＦＩ－２８５、ＲＰＭＩ－８４０２、ＳＴ－４、ＳＵＰ－Ｔ１～Ｔ１４、ＴＡＬＬ－１、ＴＡＬＬ－１０１、ＴＡＬＬ－１０３／２、ＴＡＬＬ－１０４、ＴＡＬＬ－１０５、ＴＡＬＬ－１０６、ＴＡＬＬ－１０７、ＴＡＬＬ－１９７、ＴＫ－６、ＴＬＢＲ－１、－２、－３、および－４、ＣＣＲＦ－ＨＳＢ－２（ＣＣＬ－１２０．１）、Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５３）、Ｊ４５．０１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９９０）、Ｊ．ＣａＭ１．６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２０６３）、ＲＳ４；１１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１８７３）、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ（ＡＴＣＣ ＣＲＭ－ＣＣＬ－１１９）；皮膚Ｔ細胞リンパ腫系、例えばＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ ＣＲＭ－ＴＩＢ－１６１）、ＭＪ［Ｇ１１］（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－８２９４）、ＨｕＴ１０２（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１６２）；未分化および大細胞リンパ腫から誘導されたＢ細胞、例えばＤＥＬ、ＤＬ－４０、ＦＥ－ＰＤ、ＪＢ６、Ｋａｒｐａｓ ２９９、Ｋｉ－ＪＫ、Ｍａｃ－２Ａ Ｐｌｙ１、ＳＲ－７８６、ＳＵ－ＤＨＬ－１、－２、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、および－１６、ＤＯＨＨ－２、ＮＵ－ＤＨＬ－１、Ｕ－９３７、Ｇｒａｎｄａ ５１９、ＵＳＣ－ＤＨＬ－１、ＲＬ；ホジキンリンパ腫、例えばＤＥＶ、ＨＤ－７０、ＨＤＬＭ－２、ＨＤ－ＭｙＺ、ＨＫＢ－１、ＫＭ－Ｈ２、Ｌ ４２８、Ｌ ５４０、Ｌ１２３６、ＳＢＨ－１、ＳＵＰ－ＨＤ１、およびＳＵ／ＲＨ－ＨＤ－ｌ；ならびにＮＫ系、例えばＨＡＮＫ１、ＫＨＹＧ－１、ＮＫＬ、ＮＫ－ＹＳ、ＮＯＩ－９０、およびＹＴが含まれる。ＲＥＨ、ＮＡＬＬ－１、ＫＭ－３、Ｌ９２－２２１を含むがそれだけに限らないヌル白血病細胞系は、他の白血病およびリンパ腫、例えばＫ５６２赤白血病、ＴＨＰ－１単球性白血病、Ｕ９３７リンパ腫、ＨＥＬ赤白血病、ＨＬ６０白血病、ＨＭＣ－１白血病、ＫＧ－１白血病、Ｕ２６６骨髄腫から誘導された細胞系と同じく、免疫細胞の別の市販の供給源である。そのような市販の細胞系の非限定的で例示的な供給源には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、すなわちＡＴＣＣ（ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）およびＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｄｓｍｚ．ｄｅ／）が含まれる。
一部の実施形態では、開示したＣＡＲを発現するＴ細胞は、内因性ＴＣＲの発現を低減または除去するためにさらに改変してよい。内因性ＴＣＲを低減または除去することによって、オフターゲット効果を低減し、Ｔ細胞の有効性を増大させることができる。機能性ＴＣＲの発現を安定的に欠くＴ細胞は、種々のアプローチを使用して産生することができる。Ｔ細胞は、全体のＴ細胞受容体を複合体として内在化、選別、および分解し、半減期を休止Ｔ細胞については約１０時間、刺激されたＴ細胞については３時間にする（von Essen, M. et al. 2004. J. Immunol. 173:384-393）。ＴＣＲ複合体の適正な機能には、ＴＣＲ複合体を構成するタンパク質の適正な化学量論比が必要である。ＴＣＲ機能にはまた、ＩＴＡＭモチーフを含む２つの機能性ＴＣＲゼータタンパク質が必要である。ＴＣＲのＭＨＣ－ペプチドリガンドの関与に際してのＴＣＲの活性化には、全てが適正にシグナル伝達しなければならない同じＴ細胞上のいくつかのＴＣＲの関与が必要である。すなわち、適正に関連しないまたは最適にシグナル伝達できないタンパク質によってＴＣＲ複合体が不安定化されれば、Ｔ細胞は細胞応答を開始するために十分に活性化されないことになる。
したがって、一部の実施形態では、ＴＣＲの発現は、ＲＮＡ干渉（例えばｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、その他）、ＣＲＩＳＰＲ、または特定のＴＣＲ（例えばＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β）および／もしくは初代Ｔ細胞中のＣＤ３鎖をコードする核酸を標的とする他の方法を使用して除外され得る。これらのタンパク質の１つまたは複数の発現をブロックすることによって、Ｔ細胞はもはやＴＣＲ複合体の重要な成分の１つまたは複数を産生することはなく、それにより、ＴＣＲ複合体は不安定化され、機能性ＴＣＲの細胞表面における発現が防止される。ＲＮＡ干渉を使用した場合にはいくらかのＴＣＲ複合体が細胞表面にリサイクルされ得るとしても、ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、その他）はＴＣＲタンパク質の新たな産生を防止し、全体のＴＣＲ複合体の分解および除去をもたらし、その結果、機能性ＴＣＲ発現の安定な欠如を有するＴ細胞が産生される。
初代Ｔ細胞における阻害性ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、その他）の発現は、任意の従来の発現系、例えばレンチウイルス発現系を使用して達成することができる。レンチウイルスは休止初代Ｔ細胞を標的とするためには有用であるが、全てのＴ細胞がｓｈＲＮＡを発現するわけではない。これらのＴ細胞のいくらかは、Ｔ細胞の機能活性を変化させるために十分なＴＣＲ発現の阻害を可能にする十分な量のＲＮＡを発現しない可能性がある。したがって、ウイルスによる形質導入の後で中程度から高いＴＣＲ発現を保持するＴ細胞を、例えば細胞選別または分離手法によって除去し、それにより残存Ｔ細胞を細胞表面ＴＣＲまたはＣＤ３の欠乏状態にし、機能性ＴＣＲまたはＣＤ３の発現が欠如したＴ細胞の単離された集団の増殖を可能にすることができる。
初代Ｔ細胞におけるＣＲＩＳＰＲの発現は、従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系および標的ＴＣＲに特異的なガイドＲＮＡを使用して達成することができる。好適な発現系、例えばレンチウイルスまたはアデノウイルス発現系が当技術で公知である。阻害剤ＲＮＡの送達と同様に、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、休止初代Ｔ細胞またはＣＡＲ細胞療法に好適なその他の免疫細胞を特異的に標的とすることができる。さらに、ＣＲＩＳＰＲ編集が不成功の範囲内で、上で開示した方法に従って成功のために細胞を選択することができる。例えば、上で注記したように、ウイルスによる形質導入の後で中程度から高いＴＣＲ発現を保持するＴ細胞を、例えば細胞選別または分離手法によって除去し、それにより残存Ｔ細胞を細胞表面ＴＣＲまたはＣＤ３の欠乏状態にし、機能性ＴＣＲまたはＣＤ３の発現が欠如したＴ細胞の単離された集団の増殖を可能にすることができる。ＣＲＩＳＰＲ編集構築物は、内因性ＴＣＲをノックアウトする場合にも、本明細書で開示するＣＡＲ構築物をノックインする場合にも有用であることがさらに認識される。したがって、ＣＲＩＳＰＲ系はこれらの目的の一方または両方を達成するために設計できることが認識される。
例示的なベクターの調製および前記ベクターを使用するＣＡＲ発現細胞の生成を本明細書で論じる。まとめると、本明細書で開示するポリペプチド、本明細書で開示するＣＡＲ、本明細書で開示する二特異性抗体、またはそれらの任意の組合せをコードする天然または合成の核酸の発現は、典型的には、ポリペプチド、ＣＡＲ、または二特異性抗体をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、その構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、複製および一体化真核生物に好適であってよい。ベクターまたは外因性核酸を含む細胞を産生する方法は当技術で周知である。例えばSambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)を参照されたい。
ポリヌクレオチドは、パッケージングベクターおよび細胞系を使用することによって、レトロウイルスパッケージング系にパッケージすることができる。パッケージングベクターには、それだけに限らないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれる。パッケージングベクターは、遺伝物質の細胞中への送達を容易にするエレメントおよび配列を含む。例えば、レトロウイルス構築物は、複製能力のあるヘルパーウイルスを産生せずに、複製能力のないレトロウイルスベクターをパッケージングするためおよび複製能力のないレトロウイルスベクターをパッケージングすることができるビリオンタンパク質を高い力価で産生するために必要な全てのビリオンタンパク質をトランスで（in trans）コードする複製能力のないレトロウイルスゲノムから誘導された少なくとも１つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含むパッケージングベクターである。レトロウイルスＤＮＡ配列は、ウイルスのウイルス５’ＬＴＲの天然のエンハンサーまたはプロモーターをコードする領域を欠き、ヘルパーゲノムのパッケージングに関与するｐｓｉ機能配列と３’ＬＴＲの両方を欠いているが、外来のポリアデニル化部位、例えばＳＶ４０ポリアデニル化部位およびウイルスの産生が望ましい細胞型における効率的な転写を方向付ける外来のエンハンサーもしくはプロモーターまたはその両方をコードする。レトロウイルスは白血病ウイルス、例えばモロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）である。外来のエンハンサーおよびプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）即時早期（immediate early（ＩＥ））エンハンサーおよびプロモーター、モロニーネズミ肉腫ウイルス（ＭＭＳＶ）のエンハンサーおよびプロモーター（Ｕ３領域）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＵ３領域、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）のＵ３領域、または天然のモロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターに結合したＨＣＭＶ ＩＥエンハンサーであってよい。レトロウイルスパッケージングベクターは、プラスミド系発現ベクターによってコードされた２つのレトロウイルスヘルパーＤＮＡ配列からなってよく、例えば第１のヘルパー配列は、同種指向性のＭＭＬＶまたはＧＡＬＶのｇａｇおよびｐｏｌタンパク質をコードするｃＤＮＡを含み、第２のヘルパー配列は、ｅｎｖタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。宿主範囲を決定するｅｎｖ遺伝子は、異種指向性、両指向性、同種指向性、多指向性（ミンクフォーカス形成性）、または１０Ａ１ネズミ白血病ウイルスｅｎｖタンパク質、またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ｅｎｖタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスｅｎｖ（ｇｐ１６０）タンパク質、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）Ｇタンパク質、ヒトＴ細胞白血病（ＨＴＬＶ）Ｉ型およびＩＩ型ｅｎｖ遺伝子産物をコードする遺伝子、上記のｅｎｖ遺伝子の１つまたは複数の組合せから誘導されるキメラエンベロープ遺伝子、または上記のｅｎｖ遺伝子産物の細胞質または膜貫通ならびに所望の標的細胞上の特定の表面分子に方向付けられたモノクローナル抗体をコードするキメラエンベロープ遺伝子から誘導され得る。
パッケージングプロセスでは、パッケージングベクターとレトロウイルスベクターが、ウイルスを産生できる哺乳動物細胞、例えばヒト胚腎細胞、例えば２９３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３、ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）の第１の集団に過渡的に共トランスフェクトされ、高力価の組換えレトロウイルス含有上清が産生される。本開示の別の方法では、この過渡的にトランスフェクトされた第１の細胞集団は、次に哺乳動物の標的細胞、例えばヒトリンパ球と共培養されて、外来遺伝子が標的細胞に高効率で形質導入される。本開示のさらに別の方法では、上記の過渡的にトランスフェクトされた第１の細胞集団からの上清が哺乳動物の標的細胞、例えばヒトリンパ球または造血幹細胞と共にインキュベートされ、外来遺伝子が高効率で標的細胞に形質導入される。
別の態様では、パッケージングベクターが、ウイルスを産生できる哺乳動物細胞、例えばヒト胚腎細胞、例えば２９３細胞の第１の集団中で安定に発現される。レトロウイルスまたはレンチウイルスのベクターは、選択可能なマーカーとの共トランスフェクションまたはシュードタイプ化されたウイルスによる感染のいずれかによって、細胞に導入される。両方の場合に、ベクターは一体化する。その代わりに、エピソームに保持されたプラスミドにベクターを導入することができる。高力価の組換えレトロウイルス含有上清が産生する。
一部の実施形態では、ＣＡＲもしくは自殺遺伝子産物（もしくは検出可能マーカーまたはその両方）またはその両方を発現する細胞は、例えばＣＡＲが認識して結合する抗原（例えばＢＣＭＡまたはその断片）への結合、または自殺遺伝子産物のリガンド（例えば抗体）への結合、またはその両方に基づく選択によって、富化される。そのような選択は、抗原もしくはリガンドまたはその両方を、プレート、ビーズ、カラム、膜、マトリックス、または他の任意の好適な固体支持体に固定化し、固定化された抗原もしくはリガンドまたはその両方を認識してこれらに結合する細胞を選択することによって、達成され得る。１つの例示的な方法を実施例２に詳細に示す。
ＣＡＲ細胞の活性化および増殖。所望のＣＡＲを発現する細胞の遺伝子改変の前でも後でも、米国特許第６，３５２，６９４号；第６，５３４，０５５号；第６，９０５，６８０号；第６，６９２，９６４号；第５，８５８，３５８号；第６，８８７，４６６号；第６，９０５，６８１号；第７，１４４，５７５号；第７，０６７，３１８号；第７，１７２，８６９号；第７，２３２，５６６号；第７，１７５，８４３号；第５，８８３，２２３号；第６，９０５，８７４号；第６，７９７，５１４号；第６，８６７，０４１号、およびLapateva et al. (2014) Crit Rev Oncog 19(1-2):121-32; Tam et al. (2003) Cytotherapy 5(3):259-72; Garcia-Marquez et al. (2014) Cytotherapy 16(11):1537-44等の参考文献に記載されたような一般に公知の方法を使用して、細胞を活性化し、増殖させることができる。腫瘍関連抗原によるｅｘ ｖｉｖｏでの刺激によって、選択されたＣＡＲ発現細胞部分集団を活性化し、増殖させることができる。その代わりに、腫瘍関連抗原との相互作用によって細胞をｉｎ ｖｉｖｏで活性化してよい。理論に縛られることは望まないが、細胞によって発現されるＩＬ１５等の本明細書で開示するサイトカインは、細胞の活性化および増殖を改善する。
ある種の免疫細胞の場合には、さらなる細胞集団、可溶性リガンドもしくはサイトカインまたはその両方、またはその他の刺激剤が、細胞を活性化し、増殖させるために必要なことがある。関係する薬剤は当技術で周知であり、公知の免疫学的原理に従って選択される。例えば、可溶性ＣＤ－４０リガンドは、ある種のＢ細胞集団の活性化および増殖の助けになり得る。同様に、照射したフィーダー細胞が、ＮＫ細胞の活性化および増殖の手順で使用できる。
関係する細胞を活性化する方法は当技術で周知であり、本出願に容易に適合できる。例示的な方法を以下の実施例に記載する。本開示に関連する使用のための単離方法には、それだけに限らないが、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍの活性化および増幅のキット；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）活性化キット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＭＡＣＳ（商標）活性化／増殖キット、および関係する細胞の活性化部分に特異的な市販のその他の細胞キットが含まれる。免疫細胞の特定の部分集団は、そのようなキットで入手可能なビーズまたはその他の薬剤の使用によって、活性化または増殖させることができる。例えば、α－ＣＤ３／α－ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）は、単離されたＴ細胞の集団を活性化し増殖させるために使用され得る。
一態様では、担体（必要に応じて薬学的に許容される担体）および以下：本明細書で開示するポリペプチドもしくはその断片、本明細書で開示する二特異性抗体もしくはその断片、本明細書で開示するＣＡＲ、本明細書で開示するポリヌクレオチド、本明細書で開示するベクター、本明細書で開示するベクター系および単離された複合体、本明細書で開示する単離された細胞、または本明細書で開示する細胞集団の１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる組成物が提供される。さらなる実施形態では、担体は薬学的に許容される担体である。
別の態様では、以下：がん細胞に結合した本明細書で開示するポリペプチド、がん細胞に結合した本明細書で開示する二特異性抗体もしくはその断片、がん細胞に結合した本明細書で開示するＣＡＲ、がん細胞に結合した本明細書で開示する単離された細胞、単離されもしくは操作された細胞および二特異性抗体に結合したがん細胞、サイトカインおよびがん細胞に結合した本明細書で開示する単離されもしくは操作された細胞、または二特異性抗体とサイトカインにさらに結合した本明細書で開示する単離されもしくは操作された細胞とに結合したがん細胞の１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる単離された複合体が提供される。
一態様では、ＣＡＲ発現細胞を産生する方法が提供される。本方法は、細胞またはその集団に、本明細書で開示するポリヌクレオチドまたは本明細書で開示するベクターまたは本明細書で開示するベクター系を形質導入することを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターまたはベクター系は、ＣＡＲをコードする。
別の態様では、二特異性抗体を分泌する細胞を産生する方法が提供される。本方法は、細胞またはその集団に、本明細書で開示するポリヌクレオチドまたは本明細書で開示するベクターまたは本明細書で開示するベクター系を形質導入することを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターまたはベクター系は、二特異性抗体をコードする。
さらに別の態様では、二特異性抗体を分泌するＣＡＲ発現細胞を産生する方法が提供される。本方法は、細胞またはその集団に、本明細書で開示するポリヌクレオチドまたは本明細書で開示するベクターまたは本明細書で開示するベクター系を形質導入することを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターまたはベクター系は、ＣＡＲおよび二特異性抗体をコードする。
一態様では、二特異性抗体を分泌し、サイトカインを発現する（例えば細胞膜上にサイトカインを発現するか、サイトカインを分泌する）ＣＡＲ発現細胞を産生する方法が提供される。本方法は、細胞またはその集団に、本明細書で開示するポリヌクレオチドまたは本明細書で開示するベクターまたは本明細書で開示するベクター系を形質導入することを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターまたはベクター系は、ＣＡＲ、二特異性抗体、およびサイトカインをコードする。
別の態様では、二特異性抗体を分泌し、自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方を発現するＣＡＲ発現細胞を産生する方法が提供される。本方法は、細胞またはその集団に、本明細書で開示するポリヌクレオチドまたは本明細書で開示するベクターまたは本明細書で開示するベクター系を形質導入することを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターまたはベクター系は、ＣＡＲ、二特異性抗体、および自殺遺伝子をコードする。
一態様では、二特異性抗体を分泌し、サイトカインを発現し（例えば細胞膜上にサイトカインを発現するか、サイトカインを分泌する）、自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方を発現するＣＡＲ発現細胞を産生する方法が提供される。本方法は、細胞またはその集団に、本明細書で開示するポリヌクレオチドまたは本明細書で開示するベクターまたは本明細書で開示するベクター系を形質導入することを含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターまたはベクター系は、ＣＡＲ、二特異性抗体、サイトカイン、および自殺遺伝子をコードする。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、または免疫細胞から選択される。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、細胞集団は、以下：ＨＳＣ、ｉＰＳＣ、または免疫細胞の１つまたは複数を含むか、本質的にこれらからなるか、さらにこれらからなる。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、骨髄性細胞、単球、またはマクロファージから選択される。本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、免疫細胞はＨＳＣまたはｉＰＳＣから誘導される。
本明細書で開示するいずれかの態様の一部の実施形態では、本方法は、本明細書で開示するポリヌクレオチドまたはベクターまたはベクター系を含む細胞を選択または富化することをさらに含む。さらにまたはその代わりに、本方法は、ＣＡＲを発現する細胞を選択または富化することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は、好適な条件下で、例えば好適な培地中で、好適な培養温度で、好適な酸素供給で、またはそれらの任意の組合せの下に細胞を培養することをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は細胞を保存することをさらに含む。
処置方法
一態様では、提供されるのは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ、例えばＧＰＲＣ５ＤまたはＢＣＭＡまたは両方）を発現するがん細胞またはがん細胞を含む組織の増殖を阻害する方法である。方法は、がん細胞または組織を、一部の実施形態では、ＴＡＡを標的化するように選択された、本明細書に開示されている細胞、例えば本明細書に開示されている操作もしくは単離された細胞、または本明細書に開示されている細胞集団と接触させることを含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。方法の一部の実施形態は、がん細胞または組織を、本明細書に開示されている二特異性抗体またはその断片と接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、接触させることは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われる。一実施形態では、接触させることはｉｎ ｖｉｖｏで行われ、単離された細胞は、処置される対象に対して自家または同種異系である。別の実施形態では、接触させることはｉｎ ｖｉｖｏで行われ、単離された細胞は、処置される対象に対して同種異系である。一部の実施形態では、がん細胞はＢＣＭＡのＴＡＡを発現する。追加的あるいは、がん細胞はＧＰＲＣ５ＤのＴＡＡを発現する。一部の実施形態では、がん細胞はＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄの両方を発現する。一部の実施形態では、有効量の細胞が使用される。
別の態様では、提供されるのは、ＧＰＲＣ５Ｄを発現するがん細胞またはがん細胞を含む組織の増殖を阻害する方法である。方法は、がんまたは組織を、本明細書に開示されている二特異性抗体もしくはその断片、または本明細書に開示されている細胞もしくは細胞集団、または本明細書に開示されている二特異性抗体もしくはその断片および細胞もしくは細胞集団の両方と接触させることを含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一部の実施形態では、接触させることは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われる。一部の実施形態では、有効量の細胞または抗体または両方が使用される。
方法の一部の実施形態は、がん細胞または組織を、有効量の抗がん療法、免疫細胞を枯渇させる療法、腫瘍縮小療法、がん細胞上のＴＡＡの発現を上方調節する療法、またはこれらの任意の組合せと接触させることをさらに含む。一部の実施形態では、接触させることは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われる。
さらに別の態様では、提供されるのは、それを必要とする対象においてがんを処置するための方法である。方法は、本明細書に開示されている細胞または細胞集団、例えば本明細書に開示されている単離または操作された細胞を対象に投与することを含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一部の実施形態では、対象は、対象から単離された試料中の１つまたは複数の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を決定することにより療法のために選択され、１つまたは複数のＴＡＡを認識かつ結合するＣＡＲを発現する細胞を投与される。一部の実施形態では、方法は、対象から単離された試料中の１つまたは複数の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を決定することにより対象を選択することをさらに含む。一部の実施形態では、ＴＡＡ発現は、試料を抗ＴＡＡ抗体またはその抗原結合性断片とｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで接触させることおよび試料と抗ＴＡＡ抗体またはその抗原結合性断片との間の結合を検出することにより決定される。さらなる実施形態では、抗ＴＡＡ抗体は、検出可能マーカーをさらに含む。一実施形態では、ＴＡＡの少なくとも１つは、ＢＣＭＡのエピトープを含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。追加的あるいは、ＴＡＡの少なくとも１つは、ＧＰＲＣ５Ｄのエピトープを含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一部の実施形態では、有効量の細胞が使用される。
本明細書に開示されている方法の一部の実施形態は、本明細書に開示されている二特異性抗体またはその断片を対象に投与することをさらに含む。
一態様では、提供されるのは、処置のために選択された対象においてがんを処置するための方法である。方法は、本明細書に開示されている細胞または細胞集団、例えば本明細書に開示されている単離または操作された細胞を対象に投与することを含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一部の実施形態では、対象は、対象のがん細胞が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の１つまたは複数を発現するかどうかを介して選択される。さらなる実施形態では、ＴＡＡ発現は、対象のがん細胞を抗ＴＡＡ抗体またはその抗原結合性断片とｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで接触させることにより決定される。一部の実施形態では、抗ＴＡＡ抗体は、検出可能マーカーを含む。一部の実施形態では、ＴＡＡはＢＣＭＡである。追加的あるいは、ＴＡＡはＧＰＲＣ５Ｄである。一部の実施形態では、有効量の細胞が使用される。
本明細書に開示されている任意の態様の一部の実施形態では、細胞（例えば単離または操作された細胞）および二特異性抗体またはその断片は一緒に投与される。一部の実施形態では、細胞（例えば単離または操作された細胞）および二特異性抗体またはその断片は別々に投与される。さらなる実施形態では、細胞（例えば単離または操作された細胞）および二特異性抗体またはその断片は同時に投与される。いっそうさらなる実施形態では、細胞（例えば単離または操作された細胞）および二特異性抗体またはその断片は、１時間離して、４時間離して、２４時間離して、２日離して、３日離して、または１週離して投与される。
一部の実施形態では、細胞（例えば単離または操作された細胞）は、それを必要とする対象に対して自家または同種異系である。一部の実施形態では、細胞（例えば単離または操作された細胞）は、それを必要とする対象に対して同種異系である。
一態様では、提供されるのは、対象においてＧＰＲＣ５Ｄ発現がんを処置するための方法である。方法は、本明細書に開示されている二特異性抗体またはその断片を対象に投与することを含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。
本明細書に開示されている方法の一部の実施形態は、対象に別の抗がん療法、例えば腫瘍縮小療法、または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えばＢＣＭＡもしくはＧＰＲＣ５Ｄもしくは両方の発現を上方調節する療法を施すことをさらに含む。さらなる実施形態では、腫瘍縮小療法は、以下：化学療法、凍結療法、温熱療法、標的療法、または放射線療法の１つまたは複数を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる。
本明細書に開示されている方法の一部の実施形態では、投与は、対象に第１線療法、または第２線療法、または第３線療法、または第４線療法として適用される。
本明細書に開示されている任意の態様の一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、イヌ、ネコ、ウマ、マウス、またはヒト患者である。
本明細書に開示されている任意の態様の一部の実施形態では、がんは多発性骨髄腫（ＭＭ）である。本明細書に開示されている任意の態様の一部の実施形態では、がんは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
ｔＥＧＦＲが自殺遺伝子産物または検出可能マーカーまたは両方として使用される一部の実施形態では、方法は、細胞を投与した後に、ｔＥＧＦＲを認識かつ結合する抗体（抗ｔＥＧＦＲ抗体）を投与し、それによりｔＥＧＦＲ発現細胞を排除することをさらに含む。一部の実施形態では、抗ｔＥＧＦＲ抗体の投与は、細胞の投与の約４週、または約１．５か月、または約２か月、または約３か月、または約４か月、または約５か月、または約６か月、または約７か月、または約８か月、または約９か月、または約１０か月、または約１１か月、または約１２か月、または約１．５年後である。好適な抗ｔＥＧＦＲ抗体は、以下：セツキシマブ、ネシツムマブ、またはパニツムマブの１つまたは複数から選択されてもよい。
自殺遺伝子産物または検出可能マーカーまたは両方がＲＱＲ８を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる一部の実施形態では、方法は、細胞を投与した後に、ＲＱＲ８を認識かつ結合する抗体（すなわち、抗ＲＱＲ８抗体）を投与し、それによりＲＱＲ８発現細胞を排除することをさらに含む。一部の実施形態では、抗ＲＱＲ８抗体は、ＲＱＲ８中のＣＤ３４エピトープを認識かつ結合する。追加的あるいは、抗ＲＱＲ８抗体は、ＲＱＲ８中のＣＤ２０エピトープを認識かつ結合する。一部の実施形態では、抗ＲＱＲ８抗体の投与は、細胞の投与の約４週、または約１．５か月、または約２か月、または約３か月、または約４か月、または約５か月、または約６か月、または約７か月、または約８か月、または約９か月、または約１０か月、または約１１か月、または約１２か月、または約１．５年後である。好適な抗ＲＱＲ８抗体は、以下：リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、またはトシツモマブの１つまたは複数から選択されてもよい。
自殺遺伝子産物または検出可能マーカーまたは両方がＲＱＲ８を含むか、またはから本質的になるか、またはさらにはからなる一部の実施形態では、方法は、ＲＱＲ８発現細胞を選択することにより細胞を精製することをさらに含む。一部の実施形態では、抗ＲＱＲ８抗体は、ＲＱＲ８発現細胞を選択するために使用される。さらなる実施形態では、ＲＱＲ発現細胞を選択するために、当業者に利用可能なシステム、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＣＤ３４ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍが使用される。
一部の実施形態では、がん細胞は、循環系、例えば、心臓（肉腫［血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫］、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、および脂肪腫）、縦隔および胸膜、ならびに他の胸腔内臓器、血管腫瘍および腫瘍関連血管組織；気道、例えば、鼻腔および中耳、副鼻腔、喉頭、気管、気管支および肺、例えば小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、気管支原性癌（扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨腫様過誤腫、中皮腫；胃腸系、例えば、食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）、膵臓（腺管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ（Karposi’s）肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；任意の部位において生じる消化管間質腫瘍および神経内分泌腫瘍；泌尿生殖路、例えば、腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱および／または尿道（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（精上皮腫、胚性癌腫、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）；肝臓、例えば、ヘパトーマ（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫、膵臓内分泌腫瘍（例えば褐色細胞腫、インスリノーマ、血管作動性腸管ペプチド腫瘍、膵島細胞腫瘍およびグルカゴノーマ）；骨、例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網細胞肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍、脊索腫、骨軟骨腫（osteochronfroma）（骨軟骨性外骨腫）、良性軟骨腫、軟骨芽腫、軟骨粘液様線維腫（chondromyxofibroma）、類骨腫および巨細胞腫瘍；神経系、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、頭蓋がん（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫（meningiosarcoma）、神経膠腫症）、脳のがん（星細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形神経膠芽腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；生殖系、例えば、婦人科、子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、前腫瘍子宮頸部異形成）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、未分類癌腫］、顆粒膜－髄膜細胞腫瘍、セルトリ－ライディッヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、胎盤、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、卵管（癌腫）および女性生殖器と関連付けられる他の部位；陰茎、前立腺、精巣、および男性生殖器と関連付けられる他の部位；血液系、例えば、血液（骨髄性白血病［急性および慢性］、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；口腔、例えば、唇、舌、歯肉、口腔底、口蓋、および口の他の部分、耳下腺、および唾液腺の他の部分、扁桃腺、中咽頭、鼻咽頭、梨状洞、下咽頭、ならびに唇、口腔および咽頭中の他の部位；皮膚、例えば、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、黒子形成異常母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、およびケロイド；副腎：神経芽腫；ならびに結合組織および軟組織、後腹膜および腹膜、目、眼内黒色腫、および付属器、乳房、頭頸部、肛門領域、甲状腺、副甲状腺、副腎および他の内分泌腺および関連する構造を含む他の組織、リンパ節の二次的なおよび不特定の悪性新生物、呼吸器および消化器系の二次的な悪性新生物ならびに他の部位の二次的な悪性新生物のがん細胞から選択される。
一部の実施形態では、がん細胞は固形腫瘍細胞である。他の実施形態では、がん細胞は固形腫瘍の細胞ではない。さらなる実施形態では、がん細胞は白血病がん細胞である。一部の実施形態では、がん細胞は原発がん細胞または転移性がん細胞である。一部の実施形態では、がん細胞は、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、またはリンパ腫からのものである。
本開示の方法の態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍もしくはがん細胞（例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）もしくは多形神経膠芽腫（ＧＢ）細胞）の増殖を阻害するか；またはそれを必要とするがん患者を処置するか；または両方のための方法に関する。一部の実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。一部の実施形態では、がんは、血液または骨髄または両方に影響するがん、例えば、ＭＭである。一部の実施形態では、がんまたは腫瘍細胞は、がんまたは腫瘍抗原ＢＣＭＡもしくはＧＰＲＣ５Ｄまたは両方を発現または過剰発現する。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施される場合、方法は、精密医療応用のためのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏアッセイならびに新たな組合せおよび療法を試験するための有用なアッセイを提供する。
一部の実施形態では、投与するステップは、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはより多く繰り返されてもよい。さらなる実施形態では、２つの投与は、約１日離して、約２日離して、約３日離して、約４日離して、約５日離して、約６日離して、約１週離して、約１０日離して、約２週離して、約３週離して、約４週離して、約１か月離して、約２か月離して、約３か月離して、約４か月離して、約５か月離して、約６か月離して、約７か月離して、約８か月離して、約９か月離して、約１０か月離して、約１１か月離して、約１年離して、約１．５年離して、約２年離して、約３年離して、約５年離して、約１０年離してまたはより長く離して為される。
本開示の追加の態様は、担体および本明細書に開示される実施形態に記載される生成物、例えば、本明細書に開示されている細胞集団、ＣＡＲ、ＣＡＲを含む単離された細胞、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、単離された核酸、ベクター、ベクター系、細胞、細胞集団、または本明細書に開示されているＣＡＲもしくは二特異性抗体もしくは両方もしくはそれをコードする核酸を含有する単離された細胞の１つまたは複数を含むか、あるいはから本質的になるか、またはさらにはからなる組成物に関する。一部の実施形態では、担体は、薬学的に許容される担体である。さらなる態様では、組成物は免疫調節分子を追加的に含んでもよい。
簡潔に述べれば、本開示の医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載されている特許請求される組成物のいずれか１つを含むがこれらに限定されない。そのような組成物は、緩衝剤、例えば中性緩衝食塩水およびリン酸緩衝食塩水など；炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；ならびに保存剤を含んでもよい。本開示の組成物は、局部または全身投与、例えば、経口、静脈内、頭蓋内、局所、経腸、または非経口投与のために製剤化されていてもよい。ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、静脈内投与のために製剤化されている。
細胞または組成物の投与は、１つの用量で、処置の過程の全体を通じて連続的にまたは間欠的に行うことができ、所望される治療利益を達成するための有効量が提供される。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は当業者に公知であり、療法のために使用される組成物、療法の目的および処置されている対象と共に変動する。単一のまたは複数の投与は、処置を施す医師により選択される用量レベルおよびパターンで実行され得る。好適な投薬製剤および薬剤を投与する方法は当技術分野において公知である。さらなる態様では、本開示の細胞および組成物は、他の処置と組み合わせて投与され得る。
細胞および細胞の集団は、当技術分野において公知のおよび例えばＷＯ２０１２０７９０００Ａ１に記載される方法を使用して宿主または対象に投与される。本開示の細胞または組成物のこの投与は、実験およびスクリーニングアッセイのための所望される疾患、障害、または状態の動物モデルを生成するために行われ得る。
併用療法
本明細書に記載されている組成物は、第１線、第２線、第３線、第４線、または他の療法として投与され得、別の抗がん療法、例えば腫瘍縮小介入と組み合わせられ得る。それらは、処置を施す医師により決定されるように逐次的にまたは同時に投与され得る。一部の実施形態では、それらは、ＣＡＲまたはＢｓＡｂが結合する腫瘍または他の抗原の発現を上方調節し得る療法と組み合わせられ得る。一部の実施形態では、一部の臨床的な薬物は、標的化された抗原を増加させることができる。一部の実施形態では、それらは、がんまたは腫瘍の外科的除去と組み合わせられ得る。一部の実施形態では、腫瘍縮小療法は、化学療法、凍結療法、温熱療法、標的療法、または放射線療法の１つまたは複数を含むか、あるいはから本質的になるか、またはさらにからなる。組成物および療法は、他の療法、例えば、１回のサイクルを定義するリンパ球枯渇化学療法、および本療法の注入（例えば、４回の毎週注入）、続いて部分または完全奏効が見られるまでの、あるいは別のモダリティー、例えば造血幹細胞移植もしくはＣＡＲ Ｔ細胞療法に対する「ブリッジング」療法として利用される、追加のサイクルと組み合わせることができる。
キット
本明細書に記載されるように、本開示は、ＣＡＲまたはＢｓＡｂ ＣＡＲ細胞を産生および投与するための方法を提供する。１つの特定の態様では、本開示は、これらの方法を行うためのキット、ならびに本開示の方法、例えば細胞もしくは組織を収集すること、スクリーニング／形質導入などを実行すること、結果を分析すること、またはこれらの任意の組合せを実行するための説明書を提供する。
一態様では、キットは、本明細書に開示されているポリペプチド、本明細書に開示されているＣＡＲ、本明細書に開示されている二特異性抗体、本明細書に開示されているポリヌクレオチド、本明細書に開示されているベクター、本明細書に開示されているベクター系、本明細書に開示されている細胞、例えば単離された同種異系細胞、好ましくはＴ細胞もしくはＮＫ細胞、本明細書に開示されている細胞集団、本明細書に開示されている組成物、本明細書に開示されている単離された複合体、または本明細書に開示されている方法における、例えば、患者からの自家細胞の調達における使用のための必要に応じた説明書のいずれか１つまたは複数を含むか、あるいはから本質的になるか、またはさらにはからなる。そのようなキットはまた、ＣＡＲまたはＢｓＡｂ ＣＡＲ発現細胞の形質導入、選択、活性化、拡大増殖またはこれらの任意の組合せのために適切な培地および他の試薬、例えば本明細書に開示されるものを含むか、あるいはから本質的になるか、またはさらにはさらに含むものであってもよい。
一態様では、キットは、単離されたＣＡＲまたはＢｓＡｂ ＣＡＲ発現細胞またはその集団を含むか、あるいはから本質的になるか、またはさらにはからなる。一部の実施形態では、このキットの細胞は、それを必要とする対象への投与の前に活性化または拡大増殖または両方を要求してもよい。さらなる実施形態では、キットは、単離されたＣＡＲまたはＢｓＡｂ ＣＡＲ発現細胞を活性化または拡大増殖または活性化および拡大増殖の両方を行うための培地および試薬、例えば上記の開示にカバーされるものをさらに含むか、またはから本質的になるものであってもよい。一部の実施形態では、細胞は、ＣＡＲ療法のために使用される。さらなる実施形態では、キットは、ＣＡＲ療法を必要とする患者への単離された細胞の投与に関する説明書を含む。
本開示のキットはまた、例えば、緩衝化剤、保存剤またはタンパク質安定化剤を含むことができる。キットは、検出可能な標識を検出するために必要な成分、例えば、酵素または基質をさらに含むことができる。キットはまた、アッセイおよび試験試料との比較が可能な対照試料または対照試料のシリーズを含有することができる。キットの各成分は、個々の容器内への封入が可能であり、様々な容器の全ては、キットを使用して行われるアッセイの結果を解釈するための説明書と共に、単一のパッケージ内にあることができる。本開示のキットは、キット容器上または中の書面資料（ｗｒｉｔｔｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）を含有してもよい。書面資料は、キット中に含有される試薬を使用する方法を記載する。
適用可能な場合、これらの示唆されるキット成分は、当業者による使用のために慣習的な方式でパッケージ化されてもよい。例えば、これらの示唆されるキット成分は、溶液中でまたは液体分散体などとして提供されてもよい。
実験方法
以下の実施例は、本開示の実行における様々な事例において使用され得る手順の実例である。
（実施例１）
抗ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ二特異性エンゲージャー（ＢｉＴＥ）の分泌を伴う抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔは抗多発性骨髄腫（ＭＭ）有効性を増強する（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
多発性骨髄腫（ＭＭ）に対する免疫療法および標的選択
ＣＡＲ－Ｔ療法および二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）は、多発性骨髄腫に対して最近使用されている２つの普及した免疫療法戦略である。標的選択は免疫療法のために不可欠である。選択を行うための２つの基準は、多発性骨髄腫の発生における役割およびＭＭにおける特異的な発現である。Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）およびオーファンＧタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）は、多発性骨髄腫に対する最も普及した標的である。
出願人の盲検研究において、マウス抗ヒトＢＣＭＡおよびヒト化抗ＢＣＭＡの両方のＣＡＲ－Ｔ、ならびにＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ－Ｔは、ＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄ二重陽性ＭＭ細胞系ＭＭ１を劇的に殺滅することが見出された（データ示さず）。より重要なことに、多発性骨髄腫細胞上のＧＰＲＣ５Ｄ発現は、ＢＣＭＡ発現とは独立しており、ＧＰＲＣ５Ｄ標的化は、ＢＣＭＡ抗原喪失媒介性再発を克服することができることを示唆した。
特定の標的の同定のために、出願人は、４つの多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系、初代Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＴ細胞におけるＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄ表面発現のフロー分析を行った。ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２、Ｈ９２９、およびＲＰＭＩ８２２６は多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系であり、これらを完全ＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。新たに単離されたＢ細胞、ならびに活性化ＮＫ細胞およびＴ細胞をこの研究において使用した。全部で２×１０５個の細胞を、Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（商標）（Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を１：５０の希釈で使用してブロッキングし、次にＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄをそれらのアイソタイプ対照で染色した。ＮｏｖｏＣｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ３００５（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｉｎｃ）、およびＮｏｖｏＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア１．４．１を使用してデータを検出および分析した。ＢＣＭＡは、４つ全てのＭＭ細胞系の表面上に発現されるが、初代Ｂ細胞ならびに活性化ＮＫおよびＴ細胞の表面上には発現されないことをデータは実証した。ＧＰＲＣ５Ｄは、全ての初代Ｂ細胞、ＮＫ、およびＴ細胞を除く、３つのＭＭ細胞系ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２およびＨ９２９の表面上にのみ検出された（図１Ａ～１Ｂ）。
ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＴとＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄを標的化するＢｉＴＥとの「Ｔｗｏ ｉｎ Ｏｎｅ」の組合せ
出願人は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＴとＴ細胞上に発現されるＮＫＧ２ＤおよびＭＭ上の特異的な腫瘍抗原ＧＰＲＣ５Ｄの両方を標的化するＢｉＴＥとの「Ｔｗｏ ｉｎ Ｏｎｅ」の組合せは、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＴおよびＢｉＴＥ単独よりも性能が優れている進化した療法戦略であるという仮説を立てた。
抗ＢＣＭＡ従来型ＣＡＲならびに２つの抗ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ ＢｉＴＥ ＣＡＲレトロウイルスベクターの概略図表現およびダイアグラフを図２Ａ～３Ｃに図示した。
抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、マウス抗ヒトＢＣＭＡ抗体Ｃ１１Ｄ ５．３（ＷＯ ２０１５／１５８６７１ Ａ１）（図３Ａ）およびヒト化抗ヒトＢＣＭＡ（ＵＳ １０１７４０９５ Ｂ２における配列番号２７１）（図３Ｂ）の両方から抽出した。ＢｉＴＥのために、全長ヒトソースヒト抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体ＫＹＫ－２．０（ＵＳ２０１１０１５０８７０Ａ１）およびヒト抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体ＧＣ５Ｂ５９６（米国特許出願第２０１８００３７６５１号）を使用した。
ＢｉＴＥ成分中の第１のｓｃＦｖおよび第２のｓｃＦｖに差異を有する２つのＢｉＴＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物をこの研究において使用した。ＢｉＴＥにおいて使用されたヒトＩｇＧ４ Ｆｃは、分泌されるＢｉＴＥを安定化させることを目的とした。Ｆｃ受容体結合を回避するために、出願人は最初に、そのＦｃ領域中の３つの部位、ヒンジ領域内のＦ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、ならびにＣＨ２領域内のＮ２９７Ｑの置換でＩｇＧ４－Ｆｃを突然変異させた。上記４つ全ての挿入物をレトロウイルスベクターＰＣＩＲに５’ＬＴＲと３’ＬＴＲとの間でクローニングした。
上記の構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列を表１ａ～１ｈに提供した。
Figure 2023540222000002
Figure 2023540222000003
Figure 2023540222000004
Figure 2023540222000005
Figure 2023540222000006
Figure 2023540222000007
Figure 2023540222000008
Figure 2023540222000009
Figure 2023540222000010
指定されない限り、本開示中のデータはマウス抗ヒトＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔに基づいた。
要約すると、図１Ａ～１Ｅに示されるように、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ表面発現の発現が、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系、初代Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＴ細胞において実証された。図２Ａ～２Ｂは、抗ＢＣＭＡ従来型ＣＡＲならびに２つの抗ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ ＢｉＴＥ ＣＡＲレトロウイルスベクターの概略図表現を提供する。マウス抗ヒトＢＣＭＡ ｓｃＦｖをヒト化抗ヒトＢＣＭＡ ｓｃＦｖで置き換えている。図３Ａ～３Ｂは、アミノ酸およびヌクレオチド配列と共にＢｉＴＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲおよび対照のダイアグラフを提供する（表１ａ～１ｈ）。
富化の前および後にフローアッセイにより形質導入を評価し、純度を検出した。結果は、図４Ａ～４Ｂにおいて提供されている。Ｔ細胞から分泌された二特異性抗体の発現および濃度をウエスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡにより決定した。図５Ａ～５Ｃを参照されたい。安全性、増殖および生存研究をサイトカイン非依存性増殖実験を介して行い、ＣＡＲ Ｔ細胞は形質転換されていないことを確実にした。図６Ａ～６Ｂを参照されたい。ＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞系ＭＭ１．ＳまたはＯＰＭ２、およびＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ－ ＲＰＭＩ８２２６、ならびにＢＣＭＡ－／ＧＰＲＣ５Ｄ－ ＭＶ４１１を含有する混合物を用いて均一および不均一の両方の腫瘍標的環境中の２つの腫瘍標的についての特異的殺滅モデルを生成した。図７Ａ～７Ｃを参照されたい。ＢＣＭＡ陰性、ＧＰＲＣ５Ｄ陽性ＭＭ細胞系は、ＢＣＭＡ標的均一および不均一ＭＭ腫瘍環境を生成するために調査中である。平底を有する９６ウェルプレート中での均一および不均一の両方のモデルにおける長期殺滅活性を、ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメトリーを使用して評価した。図８Ａ～１１Ｄを参照されたい。詳細な議論は以下において提供される。
ＣＡＲ－Ｔ形質導入、富化、および拡大増殖
１．５：１．５：１の比で全てのＰＣＩＲプラスミドをＰＥＱ－ＰＥＭ ３（ｅ）でパッケージングし、ＢａｅｖＴＲでエンベロープ被覆し、ＰＥＩ ＭＡＸ ４０Ｋ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ、Ｃａｔ ＃２４７６５）を介して２９３ Ｔ細胞にトランスフェクトした。４８時間および７２時間でウイルス上清を収集し、ＨＴ１０８０細胞系を使用して滴定を試験した。４人のドナーのＴ細胞を、ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ヒト、１３０－０９８－１９３）を使用して単離し、Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ヒト、１３０－１１１－１６０）、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ヒト、ＣＴＰ００２３）、０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ヒト、１３０－０９５－７６５）、および５％のＡＢヒト血清（Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、ＢＰ２５２５１００）と共に培養した。
レトロネクチン試薬（ＴａｋａＲａ、Ｔ１００Ａ／Ｂ）を被覆した非組織培養プレートを使用して、出願人は上記の構築物（図３Ａ）を活性化Ｔ細胞（２～５日）にＭＯＩ３で形質導入した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＿１１５－６０５－００６）を使用してフロー分析により形質導入後６日目における形質導入率を決定し、ＰＥ抗ヒトＣＤ１９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３０２２０８）を使用してＢＣＭＡ－ＣＡＲおよび切断型ＣＤ１９発現を検出した（図４Ａ）。
２つのＢｉＴＥ－ ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔおよび１つの従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔ）を含む３つ全てのＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔの富化のために、細胞を一次抗体Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（長いスペーサー） ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（１１５－０６５－０７２ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で染色し、続いてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｍ－２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１１２０５Ｄ）で二次染色した。陽性選択をＤｙｎａＭａｇ（商標）－１５ Ｍａｇｎｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１２３０１Ｄ）上でさらに行った。
切断型ＣＤ１９エンプティ対照を含む形質導入されたＴ細胞の富化のために、ＲＥＡｌｅａｓｅ ＣＤ１９ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ヒト、１３０－１１７－０３４）を使用し、磁気的分離に進む前にＬＳカラムを用いて陽性選択をさらに行った。
高度に富化されたＣＡＲ－Ｔ細胞およびエンプティベクター対照があることをフロー分析は実証した（図４Ｂ）。
ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロッティングによりＴ細胞から分泌された二特異性抗体の発現および濃度を決定する
出願人は、全長ヒトソースｓｃＦｖ－抗ＮＫＧ２ＤおよびＧＰＲＣ５Ｄの濃度を検出するための特有のＥＬＩＳＡアッセイを開発した。最初に、出願人は、４度で終夜、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）平底プレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、４４－２４０４－２１）を、１００μｌのＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１４１９０）中に溶解させた１００ｎｇ／ウェルの組換えヒトＮＫＧ２Ｄ、アミノ酸Ｐｈｅ７８～Ｖａｌ２１６（受託＃ Ｐ２６７１８）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄｓ、＃７８１９０８）で被覆した。最終０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む１× ＤＰＢＳ緩衝剤で洗浄し、最終０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む１× ＤＰＢＳ緩衝剤中の１％のＢＳＡでブロッキングした後に、ブロッキング緩衝剤中の１００μｌの試料および標準品を各ウェルに加えた。このアッセイにおいて使用された標準品は、ヒト抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）－ＰＥ、ヒト、Ｃａｔ：１３０－１１１－６４５、組換えヒトＩｇＧ１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）である。検出のために、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ＨＲＰ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、Ｎ１００）、ならびに１－Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＃３４０２９）。使用された停止緩衝剤は１Ｍ Ｈ３ＰＯ４である。
６つの異なる商用のＴ細胞拡大培地、ＡＩＭ Ｖ（商標）（Ｇｉｂｃｏ（商標）、１２０５５０８３）、ＰＲＩＭＥ－ＸＶ Ｔ Ｃｅｌｌ ＣＤＭ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ、９１１５４）、Ｘ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ、ＢＥ０２－０５４Ｑ）、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（Ｔａｋａｒａ、ＷＫ５５２Ｓ）、ＴｅｘＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｉｎｅｎｙｉ、１３０－０９７－１９６）、およびＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ（商標）Ａ１０４８５０１）中の形質導入されたＢＩＴＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞培養物の濃縮されていない上清から検出可能なＢｉＴＥがあることをＥＬＩＳＡ分析は示した。データは、変化倍率としての４人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。図５Ａを参照されたい。ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）６２０－ＨＳＦ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｅｌｌｓ（Ｓｉｇｍａ：１４６２１Ｃ）中で培養された４人のドナーからのＴ細胞上清のプールを、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ａｎｔｉ－ＨＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ２６１８２）を使用して精製し、溶出の５つの画分に対してＥＬＩＳＡアッセイを行った（図５Ｂ）。
ウエスタンブロッティングアッセイのために、「ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１－ＩｇＧ４ Ｆｃ」、「ＰＣＩＲ－ＢＣＮＧ２－ＩｇＧ４ Ｆｃ」、「ＰＣＩＲ－Ｔｃｄ１９－ＥＶ」、および「ＰＣＩＲ－ＢＣＭＡ ＣＡＲのみ」で形質導入されたＴ細胞からの全部で１０μｌの未精製上清（Ｕ）、フロースルー（Ｆ）、および溶出（Ｅ）を４～２０％ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）Ｐｒｅｃａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｇ、＃４５６１０９６）にロードした。使用された一次抗体はウサギ抗ＨＡ（ＣＳＴ、＃３７２４）であり、二次抗体はＬＩ－ＣＯＲ ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｌｉ－ＣＯＲ、＃９２６－３２２１１）であった。「ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１－ＩｇＧ４ Ｆｃ」および「ＰＣＩＲ－ＢＣＮＧ２－ＩｇＧ４ Ｆｃ」からの溶出においてのみ約７５ＫＤのＨＡタグ付加されたＢＩＴＥタンパク質バンドが予想されたが、試料「ＰＣＩＲ－Ｔｃｄ１９－ＥＶ」および「ＰＣＩＲ－ＢＣＭＡ ＣＡＲのみ」の上清からはされなかった。図５Ｃを参照されたい。
安全性、増殖、および生存研究－ＣＡＲ Ｔ細胞は形質転換されていないことを確実にするためのサイトカイン非依存性増殖実験
等しい数の細胞（１．５×１０４個の細胞）を、条件「サイトカインなし」および「サイトカインあり」（ＩＬ－２ ５０ＩＵ／ｍｌ；ＩＬ－１５ ０．５ｎｇ／ｍｌ）において５％のヒトＡＢ型血清を含有する培地Ｘ－ＶＩＶＯ １５を含む９６ウェルプレート中に播種した。ＮｏｖｏＣｙｔｅ ３００５ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを使用して細胞数をカウントした。１５０００個の出発細胞数に対する全ＤＡＰＩ陰性生細胞の変化倍率を使用して細胞生存および増殖を評価した。全てのウェルに、サイトカインありおよびなしの新鮮な培地を２日毎に供給して、増殖のための十分な栄養条件を提供した。
最初に、本明細書に開示されるデータは、サイトカインなしで、全ての形質導入されたＣＡＲ－Ｔおよび対照群は３日目に増殖減少パターンを示し、１０日目にほぼ死滅することを明確に示した（図６Ａ）。しかしながら、サイトカインを加え続けた場合、全ての群は１０日目に１００～２５０倍まで増殖し（図６Ｂ）、全ての形質導入されたＴ細胞の増殖はサイトカインに依存していることを示唆した。このアッセイは、これらの形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞についての安全性の証拠を提供し、それらが形質転換されていないことを示した。
より重要なことに、「ＰＣＩＲ－ＢＣＭＡ ＣＡＲのみ」、およびサイトカインなしの条件における「非形質導入」群の両方と比較して「ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１－ＩｇＧ４ Ｆｃ」および「ＰＣＩＲ－ＢＣＮＧ２－ＩｇＧ４ Ｆｃ」の生存および増殖における顕著に有益な効果があり、これは従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔと比較してこれらの非形質転換ＢｉＴＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞ｉｎ ｖｉｖｏ生存のために大きい利益を与え得ることを出願人は見出した（図６Ａ～６Ｂ）。
均一および模倣不均一の両方の腫瘍標的環境における２つの腫瘍標的のための特異的殺滅モデルの生成
多発性骨髄腫上の２つの腫瘍標的、ＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄでのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性のために、出願人は最初に、ＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ＋細胞系ＭＭ１．ＳまたはＯＰＭ２、およびＢＣＭＡ＋／ＧＰＲＣ５Ｄ－ ＲＰＭＩ８２２６、ならびにＢＣＭＡ－／ＧＰＲＣ５Ｄ－ ＭＶ４１１細胞系を含有する混合物を用いた均一および不均一の両方の腫瘍標的環境中の２つの腫瘍標的のための特異的殺滅モデルを生成した。図７Ａ～７Ｃを参照されたい。
フロー分析によりＭＭ１．ＳおよびＯＰＭ２はＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄ陽性ＭＭ細胞系であり、ＲＰＭＩ８２２６はＢＣＭＡ陽性であるがＧＰＲＣ５Ｄ陰性のＭＭ細胞系であることが決定された。この研究において使用されたＭＶ４１１はＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄ二重陰性ＡＭＬ細胞系である。図７Ａを参照されたい。ＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄの両方の標的の均一および不均一ＭＭ腫瘍環境の生成のために、出願人は、７５％のＭＭ１．ＳまたはＯＰＭ２を２５％のＭＶ４１１と、および４０％のＭＭ１．ＳまたはＯＰＭ２を６０％のＭＶ４１１と混合し（図７Ｂ）、長期１２０時間の殺滅アッセイを行った（図８Ａ～９Ｄ）。ＧＰＲＣ５Ｄ標的均一および不均一ＭＭ腫瘍環境の生成のために、７５％のＭＭ１．ＳまたはＯＰＭ２を２５％のＲＰＭＩ８２２６と混合し、４０％のＭＭ１．ＳまたはＯＰＭ２を６０％のＲＰＭＩ８２２６と混合した（図７Ｃ）。長期１２０時間の殺滅アッセイの結果は、図１０Ａ～１１Ｄにおいて提供されている。ＢＣＭＡ陰性の、ＧＰＲＣ５Ｄ陽性ＭＭ細胞系は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｂｌｏｃｋｅｒｓ（ＰＥＢＬ）を用いて構築中である。抗ＢＣＭＡ－ＰＥＢＬを使用してＢＣＭＡ標的均一および不均一ＭＭ腫瘍環境を生成する。
ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメトリーを使用した平底を有する９６ウェルプレート中の均一および不均一の両方のモデルにおける長期殺滅活性へアクセスする。
長期殺滅アッセイのために、出願人は、図７Ｂのようにエフェクターおよび腫瘍標的を含むプレートを準備し、エフェクターおよび標的の混合物中の生腫瘍細胞数を使用して殺滅活性を評価した。殺滅アッセイにおいて使用された全ての腫瘍にレンチまたはレトロウイルスシステムを使用してＬｕｃ．ＺＳＧｒｅｅｎプラスミドを導入し、ＮｏｖｏＣｙｔｅ ３００５ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを使用して４０μｌの試料を収集し、試料中のＺｓＧｒｅｅｎ陽性およびＤＡＰＩ陰性生腫瘍数をカウントした。
均一および不均一モデルにおいてエンプティ対照非形質導入Ｔ細胞と比較してＧＮ１－ＢｉＴＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲ（ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ）、ＮＧ２－ＢｉＴＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲ（ＰＣＩＲ－ＢＣＧＮ１ ＩｇＧ４－Ｆｃ）、および従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－Ｔについて顕著に腫瘍殺滅効果があった（図８Ａ～１１Ｄ）。しかしながら、ＢｉＴＥ ＢＣＭＡ－ＣＡＲは、従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲと比較して劇的に腫瘍殺滅効果を実証した（Ｐ＜０．０００１）。データは、腫瘍溶解としての４人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。両側スチューデントＴ検定を使用して２つの群の間の有意性を評価し、Ｐ値についてのインデックスは、＊ ｐ＜０．０５；＊＊ ｐ＜０．０１；＊＊＊ ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１であった。
（実施例２）
抗ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ二特異性ＮＫエンゲージャー（ＢｉＫＥ）の分泌、オンボードサイトカインおよび自殺遺伝子を伴う抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＮＫは抗多発性骨髄腫（ＭＭ）有効性を増強する（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
抗ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）の分泌を伴うＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔは抗多発性骨髄腫（ＭＭ）有効性を増強する。
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）およびオーファンＧタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）は、多発性骨髄腫のための最も普及した標的であり、多発性骨髄腫細胞上のＧＰＲＣ５Ｄ発現はＢＣＭＡ発現とは独立しており、ＧＰＲＣ５Ｄ標的化はＢＣＭＡ抗原喪失媒介性再発を克服できることを示唆した（図１）。
出願人の研究、例えば実施例１は、抗ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ二特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）の分泌を伴う抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔは、従来型の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較してＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄ二重陽性ＭＭ細胞系ＭＭ１．ＳおよびＯＰＭ２を劇的に殺滅することができることを実証した。
抗ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ二特異性ＮＫ細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）の分泌を伴うＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＮＫの開発。
ＣＡＲ－ＮＫにＩＬ－１５および自殺遺伝子を導入することは、ｉｎ ｖｉｖｏでの持続されたＣＡＲ－ＮＫの生存時間および安全性によりその有効性を増強する。
上記のＢｉＴＥ－ＣＡＲ－Ｔ構築物にオンボードサイトカインＩＬ－１５およびＩＬ－２１ならびに自殺遺伝子「切断型ＥＧＦＲ」（ｔＥＧＦＲ）を導入する改変を用いて（図２）、出願人は、抗ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ二特異性ＮＫ細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）の分泌を伴う抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＮＫを生成することを目的としたいくつかの構築物を作り出した。ＣＡＲ－ＮＫの概略図表現およびダイアグラフは図２および１２～１７Ｆに図示されている。
上記の構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は表２において提供されている。
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大サイズ（＞１１ｋｂ）ＬＴＲレトロウイルスプラスミド調製の最適化
この研究において、出願人は、ＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（商標）Ｓｔｂｌ２（商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０２６８０１９）を使用して、最適化された効率および質を有するサイズ＞１０Ｋｂを有するいくつかの構築物（Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１１Ｅ、Ｐ１２Ｅ、Ｐ６１、Ｐ６２、またはＰ７２）を増殖ざせた。
サイズ＜＝１０Ｋｂを有する他のプラスミド（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ１０Ｅ、Ｐ３６Ｅ、Ｐ３７Ｅ、Ｐ３８Ｅ、Ｐ３９Ｅ、Ｐ１７、Ｐ１８、Ｐ１９、Ｐ２０）のために、ＮＥＢ（登録商標）Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（ＮＥＢ、Ｃ３０３０Ｈ）を使用した。
全てのプラスミドコロニーをＬＢ寒天プレートおよび１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｃ２１３６）を含む液体培養物において３０度で選択した。増殖した液体培養物のために、シェーカー中の１８０ｒｐｍを使用した。
適正な酵素消化を用いて同定された概算されるバンドを有する候補プラスミドを、遺伝子シークエンシング（Ｒｅｔｒｏｇｅｎｅ Ｉｎｃ）を行うために送って、配列が正確であることを確認した。
ＣＡＲ－ＮＫ細胞の調製。
簡潔に述べれば、１．５：１．５：１の比で全てのＰＣＩＲプラスミドをＰＥＱ－ＰＥＭ ３（ｅ）でパッケージングし、ＢａｅｖＴＲでエンベロープ被覆し、ＰＥＩ ＭＡＸ ４０Ｋ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ、Ｃａｔ ＃２４７６５）を介して２９３ Ｔ細胞にトランスフェクトした。４人のドナーのＮＫ細胞を、ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９８－１８５）を使用して単離し、５０ＩＵ／ｍｌのヒトＩＬ－２、５％のＡＢヒト血清（Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、ＢＰ２５２５１００）および１：１の比の照射されたＫ５６２－ｍｂ２１－４１ＢＢＬフィーダーの存在下でＮＫ ＭＡＣＳ培地（１３０－１１４－４２９）を用いて培養した。
レトロネクチン試薬（ＴａｋａＲａ、Ｔ１００Ａ／Ｂ）を被覆した非組織培養プレートを使用して、出願人は、上記の構築物（図２および１２～１６）を活性化ＮＫ細胞に形質導入した（７日）。この研究において、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを含有する構築物（Ｐ１、Ｐ４、Ｐ７、Ｐ２、Ｐ５、Ｐ８、Ｐ３、Ｐ６、Ｐ９、Ｐ１０Ｅ、Ｐ１１Ｅ、Ｐ１２Ｅ、Ｐ１８、Ｐ１９、Ｐ２０、Ｐ６１、Ｐ６２、またはＰ７２）の富化のために、出願人は、これらの形質導入された細胞をＢＣＭＡタンパク質連結磁気ビーズ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＢＳ－Ｋ００４）で染色し、ＤｙｎａＭａｇ（商標）－１５ Ｍａｇｎｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１２３０１Ｄ）上で陽性選択をさらに行った。
切断型ＣＤ１９エンプティ対照で形質導入されたＮＫ細胞の富化のために、ＲＥＡｌｅａｓｅ ＣＤ１９ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、ヒト、１３０－１１７－０３４）を使用し、ＬＳカラムを用いて陽性選択をさらに行い、磁気的分離に進めた。
フロー分析では、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＿１１５－６０５－００６）およびＰＥ抗ヒトＣＤ１９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３０２２０８）を使用して形質導入率を決定して、ＢＣＭＡ－ＣＡＲおよび切断型ＣＤ１９発現を検出した（図１９Ａおよび１９Ｂ）。
ＥＬＩＳＡによる形質導入されたＮＫ細胞から分泌された二特異性抗体の発現および濃度の決定。
出願人は、全長ヒトソースＳｃＦＶ－抗ＮＫＧ２ＤおよびＧＰＲＣ５Ｄの濃度を検出するための特有のＥＬＩＳＡアッセイを開発した。最初に、出願人は、４度で終夜、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）平底プレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、４４－２４０４－２１）を、１００μｌのＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１４１９０）中に溶解させた１００ｎｇ／ウェルの組換えヒトＮＫＧ２Ｄ、アミノ酸Ｐｈｅ７８～Ｖａｌ２１６（受託＃ Ｐ２６７１８）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄｓ、＃７８１９０８）で被覆した。最終０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む１× ＤＰＢＳ緩衝剤で洗浄し、最終０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む１× ＤＰＢＳ緩衝剤中の１％のＢＳＡでブロッキングした後に、ブロッキング緩衝剤中の１００μｌの試料および標準品を各ウェルに加えた。このアッセイにおいて使用された標準品は、ヒト抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）－ＰＥ、ヒト、Ｃａｔ：１３０－１１１－６４５、組換えヒトＩｇＧ１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）であった。検出のために、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ＨＲＰ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、Ｎ１００）、ならびに１－Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液、（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＃３４０２９）。使用された停止緩衝剤は１Ｍ Ｈ３ＰＯ４である。
異なるオンボードサイトカイン改変を伴う５つ全ての群における形質導入されたＢＩＴＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＮＫ細胞培養物の濃縮されていない上清からの検出可能なＢｉＫＥがあることをＥＬＩＳＡ分析は示した。データは、平均±ＳＥＭとして４人の独立したドナーからの平均として示されている。（図１８）。
ＲＴＣＡ（リアルタイム細胞傷害性アッセイ）を使用した不均一腫瘍モデルのための特異的殺滅モデルの生成
ＲＴＣＡシステムでのｉｎ ｖｉｔｒｏ長期細胞傷害性アッセイのために、出願人は最初に、人工的な過剰発現ＧＰＲＣ５Ｄおよび二重陽性ＢＣＭＡ／ＧＰＲＣ５Ｄ抗原の混合物を伴う模倣不均一腫瘍標的環境中の２つの腫瘍標的のための特異的殺滅モデルを生成した。
ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄおよび二重ＢＣＭＡ／ＧＰＲＣ５Ｄ遺伝子を、改変されたレトロウイルス遺伝子送達システムを使用して２９３Ｔに形質導入した。２９３Ｔ－ＧＰＲＣ５Ｄの２つの部分（７６．７４％）ならびに２９３Ｔ－ＧＰＲＣ５Ｄ／ＢＣＭＡの３つの部分（７０．６２％の二重陽性、および２１．９７％のＢＣＭＡ＋）の混合物を用いて、出願人は、多発性骨髄腫の腫瘍環境を模倣するための不均一腫瘍モデルを生成した（図１９Ｃ）。
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡを使用した長期リアルタイム殺滅アッセイへのアクセス。
長期殺滅アッセイのために、全部で５０００個の標的をＥ－Ｐｌａｔｅ ９６ ＰＥＴ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＥＦ ３００６００９１０）上に播種し、３７度で５％のＣＯ２と共に約２０時間インキュベートし、次に全部で５００個のエフェクターを、標的を含むウェルに加えた。この研究において使用されたエフェクターおよび標的の比は１：１０であった。
データは、２人の独立したドナーからの細胞溶解％として示されている。細胞を３７℃の加湿された５％のＣＯ２雰囲気中でリアルタイムでモニターした。細胞インデックス（ＣＩ）データを１５分毎に１２０時間記録した。選択された正規化時点は播種後２０時間であった。標的単独群ｇｅｔについて最大細胞インデックスに達するまでの時間は約８０時間であったため、細胞溶解％をエフェクターの追加と共に約６０時間において算出し、比較した。
図２０は、可溶性サイトカイン（ＩＬ－１５）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を伴うＢｉＫＥ－ＣＡＲ－ＮＫについてのＲＴＣＡアッセイからの結果を示す。
図２１は、可溶性ＩＬ－１５およびＩＬ－１５受容体複合体（ＳＩＬ１５Ｃ）ならびに自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を伴うＢｉＫＥ－ＣＡＲ－ＮＫについてのＲＴＣＡアッセイからの結果を示す。
図２２は、膜結合ＩＬ－１５（ｍｂＩＬ１５）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を伴うＢｉＫＥ－ＣＡＲ－ＮＫについてのＲＴＣＡアッセイからの結果を示す。
図２３は、膜結合ＩＬ－２１（ｍｂＩＬ２１）および自殺遺伝子ｔＥＧＦＲ改変を伴うＢｉＫＥ－ＣＡＲ－ＮＫについてのＲＴＣＡアッセイからの結果を示す。
図２４は、改変なしのＢｉＴＥ－ＣＡＲ－ＮＫについてのＲＴＣＡアッセイからの結果を示す。
図２５は、ＲＴＣＡにより決定された従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＮＫと比較したＮＫＧ２ＤおよびＧＰＲＣ５Ｄ ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＮＫの細胞溶解の増加を示す。データは、６０時間の反応における腫瘍溶解としての２人の独立したドナーからの平均±ＳＤとして示されている。
（実施例３）
抗ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ二特異性ＮＫエンゲージャー（ＢｉＫＥ）の分泌、オンボードサイトカインおよび自殺遺伝子を伴う抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＮＫは抗多発性骨髄腫（ＭＭ）有効性を増強する（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
図２６～２７に図示されているベクターを構築した。ベクターにより発現されるポリペプチドは図２８に図示されている。ポリペプチドまたはその断片の発現を調べ、結果を図２９に示している。腫瘍細胞の殺滅におけるそのようなポリペプチドを発現する細胞の有効性をさらに評価し、結果を図３０～３１に示している。
（実施例４）
「二特異性抗体」との「ＣＡＲ－ＮＫ」の組合せの殺滅活性の有効性
調査中の構築物は図２８に図示されている。腫瘍細胞の殺滅におけるそのような構築物を発現する細胞の有効性をさらに評価し、結果を図３２～３３および３６に提供している。図３２は、「二特異性抗体」との「ＣＡＲ－ＮＫ」の組合せは「ＣＡＲ－ＮＫ」ベースの生成物よりも性能が優れていることを明確に示す。
「二特異性抗体」との「ＣＡＲ－ＮＫ」の組合せの２つの戦略を試験した：図３４Ａは戦略１「Ｔｗｏ ｉｎ Ｏｎｅ」を示し、図３４Ｂはウイルス混合物戦略２「Ｏｎｅ ｐｌｕｓ Ｏｎｅ」を示す。図３５は、高度に小型の選別－自殺レポーターＲＱＲ８およびＢｉＫＥ分泌のための強いアズロシジンシグナルペプチドを有する構築物「Ｔｗｏ ｉｎ Ｏｎｅ」の最適化を示す。改良後の導入遺伝子発現および抗腫瘍の有効性を試験している。
（実施例５）
抗ＧＰＲＣ５ＤおよびＮＫＧ２Ｄ二特異性ＮＫエンゲージャー（ＢｉＫＥ）の分泌を伴う抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＮＫは抗多発性骨髄腫（ＭＭ）有効性を増強する（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
抗ＢＣＭＡ従来型ＣＡＲならびに抗ＮＫＧ２ＤおよびＧＰＲＣ５Ｄ ＢｉＫＥ ＣＡＲレトロウイルスベクターの概略図表現を図３７に提供する。発現される相当するポリペプチドを図３８に図示している。実施例１～４は、ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＡＲ－ＮＫ細胞の両方についての抗ＮＫＧ２ＤおよびＧＰＲＣ５Ｄ二特異性抗体の分泌を伴うＢＣＭＡ ＣＡＲの「Ｔｗｏ ｉｎ Ｏｎｅ」戦略を使用する超抗多発性骨髄腫有効性を実証した。
この研究において、高度に小型の二重の役割の選択／自殺遺伝子「ＲＱＲ８」（４７１ｂｐ）を導入して切断型ＥＧＦＲ（１０７１ｂｐ）を置き換える改変を用いて、抗ＮＫＧ２ＤおよびＧＰＲＣ５Ｄ二特異性ＮＫ細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）の分泌を伴う抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＮＫを有する「Ｔｗｏ ｉｎ Ｏｎｅ」構築物の２つの新たなフォーマットを作り出したところ、ウイルス産生およびＮＫ細胞形質導入の能力を大きく改善することができた。
上記の構築物の各成分および全体配列についてのアミノ酸およびヌクレオチド配列は表３において提供されている。
大サイズ（＞１１ｋｂ）ＬＴＲレトロウイルスプラスミド調製の最適化
この研究において、ＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（商標）Ｓｔｂｌ２（商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０２６８０１９）を使用して、最適化された効率および質を有する構築物ＧＰＲＣ５Ｄ－ＮＫＧ２Ｄ ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＳＩＬ－１５－ＲＱＲ８－Ｐ６１およびＮＫＧ２Ｄ－ＧＰＲＣ５Ｄ ＢｉＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＳＩＬ－１５－ＲＱＲ８－Ｐ６２（挿入物サイズ＞１１Ｋｂ）を増殖させた。
サイズ＜１０Ｋｂを有する他のプラスミド（Ｐ６８、Ｐ６７）のために、ＮＥＢ（登録商標）Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（ＮＥＢ、Ｃ３０３０Ｈ）を使用した。
全てのプラスミドコロニーをＬＢ寒天プレートおよび１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｃ２１３６）を含む液体培養物において３０度で選択した。増殖した液体培養物のために、シェーカー中の１８０ｒｐｍを使用した。
適正な酵素消化を用いて同定された概算されるバンドを有する候補プラスミドを、遺伝子シークエンシング（Ｒｅｔｒｏｇｅｎｅ Ｉｎｃ）を行うために送って、配列が正確であることを確認した。
臍帯血由来ＣＡＲ－ＮＫ細胞の調製
臍帯血ＮＫ細胞を、ＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９８－１８５）を使用して単離し、５０ＩＵ／ｍｌのヒトＩＬ－２、５％のＡＢヒト血清（Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、ＢＰ２５２５１００）および１：１の比を有する照射されたフィーダー細胞の存在下でＮＫ ＭＡＣＳ培地（１３０－１１４－４２９）を用いて培養した。本明細書に開示されているポリペプチドを発現するウイルスを産生した。レトロネクチン試薬（ＴａｋａＲａ、Ｔ１００Ａ／Ｂ）を被覆した非組織培養プレートを使用して、上記の構築物（図３８）を活性化ＮＫ細胞にＭＯＩ１（７日）で形質導入した。
この研究において使用されたレポーターＲＱＲ８のためのＡＰＣ抗ヒトＣＤ３４抗体（ＱＢＥｎｄ１０）（アロフィコシアニン）（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＬＬＣ、＃ＦＡＢ７２２７Ａ）を使用して形質導入率をフロー分析により決定した（図３９）。
全ての構築物からのＩＬ－１５分泌およびＣＤ１９－ＢｉＫＥ－ＣＡＲのみからの二特異性抗体（ＢｉＫＥ）。
可溶性ＩＬ－１５分泌の評価のために、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－１５ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ ｐｌａｔｅ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ＃ Ｓ１５００）および生産者のプロトコールに従った。
全長ヒトソースＳｃｆｖ－抗ＮＫＧ２ＤおよびＧＰＲＣ５Ｄの濃度を検出するために特有のＥＬＩＳＡアッセイを開発した。最初に、４度で終夜、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）平底プレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、４４－２４０４－２１）を、１００μｌのＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１４１９０）中に溶解させた１００ｎｇ／ウェルの組換えヒトＮＫＧ２Ｄ、アミノ酸Ｐｈｅ７８～Ｖａｌ２１６（受託＃ Ｐ２６７１８）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄｓ、＃７８１９０８）で被覆した。最終０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む１× ＤＰＢＳ緩衝剤で洗浄し、最終０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む１× ＤＰＢＳ緩衝剤中の１％のＢＳＡでブロッキングした後に、ブロッキング緩衝剤中の１００μｌの試料および標準品を各ウェルに加えた。このアッセイにおいて使用された標準品は、ヒト抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）－ＰＥ、ヒト、Ｃａｔ：１３０－１１１－６４５、組換えヒトＩｇＧ１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）であった。検出のために、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ＨＲＰ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、Ｎ１００）、ならびに１－Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液、（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＃３４０２９）。使用された停止緩衝剤は１Ｍ Ｈ３ＰＯ４であった。
０．５～１×１０６個の形質導入されたＮＫ細胞（図３９）を無血清培地中に播種し、７２時間培養した。上清をその後に収集し、遠心分離し、ＩＬ－１５予備被覆ＥＬＩＳＡプレート（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｓ１５００）およびＮＫＧ２Ｄ融合タンパク質被覆プレートを備える自社開発したＢｉＫＥ検出ＥＬＩＳＡに直ちに加えた。ＥＬＩＳＡ分析は、各群において検出可能な可溶性ＩＬ－１５があることおよび培養７２時間において５つ全ての群において形質導入されたＢＩＫＥ－ＢＣＭＡ ＣＡＲ－ＮＫ細胞培養物の濃縮されていない上清からのＩＬ２ ＳＰ ＢｉＫＥがあることを示した。ここに示すデータは、平均±ＳＤとしての４人の独立したドナーからの平均濃度としてのものであった。
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡを使用した長期リアルタイム殺滅アッセイへアクセスする。
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＭＰ ｓｙｓｔｅｍの機器およびＲＴＣＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐｒｏ ２．３（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してＲＴＣＡを行い、分析した。ＲＴＣＡにおいて使用されたエフェクター細胞群および形質導入評価を図３９に図示しており、臍帯血細胞からの初代ＮＫ細胞をこの研究において使用した。ＨＴ１０８０上のＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡ遺伝子の強制的な発現をＲＴＣＡアッセイにおける腫瘍抗原標的として使用した。全部で５０００個の標的をＥ－Ｐｌａｔｅ ９６ ＰＥＴ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＥＦ ３００６００９１０）上に播種し、３７度で５％のＣＯ２と共に約２３時間インキュベートし、次に全部で５０００個のエフェクターをウェルに標的と共に加えた。等しい１２５０個の形質導入されたＮＫを、導入遺伝子発現にしたがって同じドナーからの形質導入されていないＮＫと調整することにより各群において使用した。この研究において使用された形質導入されたＮＫおよび標的の比は１：４であった。細胞インデックス（ＣＩ）データを１５分毎に１２０時間記録した。標的単独群ｇｅｔについて最大細胞インデックスに達するまでの時間は約５６時間であったため、細胞溶解％をエフェクターの追加と共に約２６時間において算出し、比較した。データは、従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＮＫ、およびその他と比較してＧＮ１ ＢｉＫＥ ＢＣＭＡ ＣＡＲ ＮＫの増強された腫瘍殺滅有効性があることを実証した（図４１）。
フローサイトメトリーによる長期リアルタイム殺滅アッセイへアクセスする。
フロー抗体抗ヒトＢＣＭＡ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ ＃３５７５０６）およびＧＰＲＣ５Ｄ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ６３００Ｐ－１００）をそれらのアイソタイプ対照と共に使用することにより多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系、ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２、Ｈ９２９およびＲＰＭＩ８２２６上のＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄ表面発現を評価した。データは、ＭＭ細胞の表面上にブロードなＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄがあることを実証した。エフェクターＣＡＲ－ＮＫ細胞およびそれらのモックエンプティベクター（Ｔｃｄ１９）対照、ならびに形質導入されていないＮＫを４つの多発性骨髄腫細胞系、ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２、Ｈ９２９、およびＲＰＭＩ８２２６と、形質導入されたＣＡＲ－ＮＫ：腫瘍の比１：８（全ＮＫ：腫瘍 １：２）で９６時間共培養した。データは、腫瘍溶解としての４人の独立したドナーからの平均±ＳＥＭとして示されている。両側スチューデントＴ検定を使用して２つの群の間の有意性を評価し、Ｐ値についてのインデックスは＊ ｐ＜０．０５；＊＊ ｐ＜０．０１であった。従来型ＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＮＫ、およびその他と比較して二特異性抗体ＧＰＲＣ５Ｄ－ＮＫＧ２Ｄ（ＧＮ１－ＢｉＫＥ）の分泌を伴うＢＣＭＡ－ＣＡＲ－ＮＫの劇的な腫瘍殺滅活性がある（図４２）。
Figure 2023540222000037
Figure 2023540222000038
Figure 2023540222000039
Figure 2023540222000040
開示の実施形態
実施形態１．（ｉ）（１）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識かつ結合する抗原結合性アミノ酸配列（抗ＴＡＡ抗原結合性配列）、
（２）ヒンジドメイン、
（３）膜貫通ドメイン、および
（４）細胞内ドメイン
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列；ならびに
（ｉｉ）（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）、および
（２）Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）
を含む二特異性抗体のアミノ酸配列
を含むポリペプチド。
実施形態２．抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列が、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ（配列番号１）またはその等価物を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）；
ＹＤＤＬＬＰＳ（配列番号２）またはその等価物を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）；
ＡＡＷＤＤＳＬＮＧＰＶ（配列番号３）またはその等価物を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）；
ＧＦＴＦＳＳＹ（配列番号４）またはその等価物を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）；
ＲＹＤＧＳＮ（配列番号５）またはその等価物を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）；および
ＤＲＧＬＧＤＧＴＹＦＤＹ（配列番号６）またはその等価物を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）
の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは５つまたは６つ全てを含み、
その等価物がＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する、実施形態１に記載のポリペプチド。
実施形態３．抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列が、
配列番号７またはその等価物を含む軽鎖可変領域；および／または
配列番号８またはその等価物を含む重鎖可変領域；
を含み、その等価物がＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する、実施形態１または２に記載のポリペプチド。
実施形態４．配列番号７または８の等価物が、それぞれ配列番号７または８と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、実施形態３に記載のポリペプチド。
実施形態５．配列番号１～８の等価物が、それぞれ配列番号１～８のＣ末端からＮ末端へのアミノ酸配列を含む、実施形態２または３に記載のポリペプチド。
実施形態６．抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列が、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間にペプチドリンカーをさらに含む、実施形態３から５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態７．抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列が、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間に配列番号９またはその等価物を含むペプチドリンカーをさらに含む、実施形態３から６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態８．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が、以下のＣＤＲ：
ＫＡＳＱＮＶＡＴＨＶＧ（配列番号１０）またはその等価物を含むＣＤＲＬ１；
ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号１１）またはその等価物を含むＣＤＲＬ２；
ＱＱＹＮＲＹＰＹＴ（配列番号１２）またはその等価物を含むＣＤＲＬ３；
ＧＹＳＦＴＧＹ（配列番号１３）またはその等価物を含むＣＤＲＨ１；
ＮＰＹＮＳＤ（配列番号１４）またはその等価物を含むＣＤＲＨ２；および
ＶＡＬＲＶＡＬＤＹ（配列番号１５）またはその等価物を含むＣＤＲＨ３
の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは５つまたは６つ全てを含み、
その等価物がＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する、実施形態１から７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態９．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が、
配列番号１６またはその等価物を含む軽鎖可変領域；および／または
配列番号１７またはその等価物を含む重鎖可変領域
を含み、その等価物がＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する、実施形態１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態１０．配列番号１６または１７の等価物が、それぞれ配列番号１６または１７と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、実施形態９に記載のポリペプチド。
実施形態１１．配列番号１０～１７の等価物が、それぞれ配列番号１０～１７のＣ末端からＮ末端へのアミノ酸配列を含む、実施形態８または９に記載のポリペプチド。
実施形態１２．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間にペプチドリンカーをさらに含む、実施形態９から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態１３．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間に配列番号９またはその等価物を含むペプチドリンカーをさらに含む、実施形態９から１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態１４．二特異性抗体が、免疫グロブリンの断片結晶性（Ｆｃ）領域、その変異体、またはその等価物をさらに含む、実施形態１から１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態１５．Ｆｃ領域またはその変異体が、ヒトＦｃ領域またはその変異体である、実施形態１４に記載のポリペプチド。
実施形態１６．Ｆｃ領域が、配列番号１８、または二特異性抗体を安定化させるその等価物を含む、実施形態１４または１５に記載のポリペプチド。
実施形態１７．Ｆｃ領域が、配列番号１９、または配列番号１９のアミノ酸（ａａ）１６、ａａ１７、およびａａ７９に相当する位置に突然変異を有し、二特異性抗体を安定化させるＦｃ等価物を含む、実施形態１４から１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態１８．二特異性抗体が、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列と抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列との間にペプチドリンカーをさらに含む、実施形態１から１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態１９．ペプチドリンカーがＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ（配列番号８１）またはその等価物を含む、実施形態１８に記載のポリペプチド。
実施形態２０．二特異性抗体がそのＮ末端にシグナルペプチドをさらに含む、実施形態１から１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態２１．シグナルペプチドが、ＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、またはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）、またはＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、またはＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）、または二特異性抗体、その断片もしくは等価物の分泌を促進するそのそれぞれの等価物を含む、実施形態２０に記載のポリペプチド。
実施形態２２．二特異性抗体が検出可能マーカーまたは精製マーカーをさらに含む、実施形態１から２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態２３．検出可能マーカーがＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号２２）を含む、実施形態２２に記載のポリペプチド。
実施形態２４．ＴＡＡがＧＰＲＣ５Ｄではない、実施形態１から２３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態２５．ＴＡＡが、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＦＬＴ３、ＣＤ１９、メソテリン、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３３、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ＣＤ５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ムチン１、（Ｍｕｃ１）、エフリンＡ型受容体２前駆体（ＥｐｈＡ２）、上皮細胞増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、インターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ１３Ｒａ２）、ＣＤ１３３、グリピカン３（ＧＰＣ３）、上皮細胞接着分子前駆体（ＥｐＣａｍ）、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、がん／精巣（ＣＴ）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、腫瘍関連糖タンパク質－７２（ＴＡＧ－７２）、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）、およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１）から選択されるタンパク質またはポリペプチド由来のエピトープを含む、実施形態１から２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態２６．ＴＡＡがＢＣＭＡのエピトープを有している、実施形態１から２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態２７．ＢＣＭＡを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列）が、以下のＣＤＲ：
ＲＡＳＥＳＶＴＩＬＧＳＨＬＩＨ（配列番号２３）、ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号２４）、ＲＡＳＥＳＶＴＩＬＧＳＨＬＩＹ（配列番号２５）、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＬ１；
ＬＡＳＮＶＱＴ（配列番号２６）、ＹＴＳＮＬＨＳ（配列番号２７）、ＬＡＳＮＶＱＴ（配列番号２８）、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＬ２；
ＬＱＳＲＴＩＰＲＴ（配列番号２９）、ＱＱＹＲＫＬＰＷＴ（配列番号３０）、ＬＱＳＲＴＩＰＲＴ（配列番号３１）、そのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＬ３；
ＧＹＴＦＴＤＹ（配列番号３２）、ＧＧＴＦＳＮＹ（配列番号３３）、ＧＹＴＦＲＨＹ（配列番号３４）、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＨ１；
ＩＮＴＥＴＲＥ（配列番号３５）、ＹＲＧＨＳＤ（配列番号３６）、ＮＴＥＳＧＶ（配列番号３７）、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＨ２；および
ＤＹＳＹＡＭＤＹ（配列番号３８）、ＧＡＩＹＮＧＹＤＶＬＤＮ（配列番号３９）、ＤＹＬＹＳＬＤＦ（配列番号４０）、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＨ３
の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは５つまたは６つを含み、
その等価物がＢＣＭＡを認識かつ結合する、実施形態２５または２６に記載のポリペプチド。
実施形態２８．抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列が、
配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含む軽鎖可変領域および／または
配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含む重鎖可変領域
を含み、その等価物がＢＣＭＡを認識かつ結合する、実施形態２７に記載のポリペプチド。
実施形態２９．配列番号４１～４６の等価物が、それぞれ配列番号４１～４６と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、実施形態２８に記載のポリペプチド。
実施形態３０．配列番号２３～４６の等価物が、それぞれ配列番号２３～４６のＣ末端からＮ末端へのアミノ酸配列を含む、実施形態２７または２８に記載のポリペプチド。
実施形態３１．抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列またはその等価物が、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間にペプチドリンカーをさらに含む、実施形態２８から３０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態３２．抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列が、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間に、配列番号９またはその等価物を含むペプチドリンカーをさらに含む、実施形態２８から３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態３３．ヒンジドメインがＣＤ８αヒンジドメインまたはＩｇＧ１ヒンジドメインを含む、実施形態１から３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態３４．ＩｇＧ１ヒンジドメインがＬＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＤＰＫＧＴ（配列番号４７）またはその等価物を含む、実施形態３３に記載のポリペプチド。
実施形態３５．膜貫通ドメインがＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、実施形態１から３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態３６．細胞内ドメインが、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域、４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域、ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域、またはＯＸ４０共刺激領域から選択される１つもしくは複数または２つもしくはそれより多い共刺激領域を含む、実施形態１から３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態３７．ＣＡＲが、配列番号４８またはその等価物を含むＣＤ２８膜貫通および細胞質／細胞内ドメイン（例えばＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域）を含む、実施形態３５または３６に記載のポリペプチド。
実施形態３８．細胞内ドメインがＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをさらに含む、実施形態１から３７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態３９．ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインが配列番号４９またはその等価物を含む、実施形態３８に記載のポリペプチド。
実施形態４０．細胞内ドメインが、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ活性化ドメインを含むＩＬ２Ｒβまたはその断片をさらに含む、実施形態１から３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態４１．自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方をさらに含む、実施形態１から４０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態４２．自殺遺伝子産物が、ＨＳＶ－ＴＫ（ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ）、シトシンデアミナーゼ、ニトロリダクターゼ、カルボキシエステラーゼ、チトクロームＰ４５０もしくはＰＮＰ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）、切断型ＥＧＦＲ、または誘起可能なカスパーゼ（「ｉＣａｓｐ」）の１つまたは複数から選択される、実施形態４１に記載のポリペプチド。
実施形態４３．ＣＡＲが、必要に応じて二特異性抗体のＮ末端におけるシグナルペプチドとは異なるシグナルペプチドをそのＮ末端にさらに含む、実施形態１から４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態４４．シグナルペプチドが、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、ＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）、またはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）、またはＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、またはＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）、またはそのそれぞれの等価物を含む、実施形態４３に記載のポリペプチド。
実施形態４５．ＣＡＲが検出可能マーカーをさらに含む、実施形態１から４４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態４６．以下：
ＣＡＲ；
二特異性抗体（本明細書でＢｉＴＥ、二特異性Ｔ細胞エンゲージャー、またはＢｉＫＥ、二特異性ＮＫ細胞エンゲージャーとも称される）および
必要に応じた自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方
のいずれか２つの間に位置する切断可能なペプチドをさらに含む、実施形態１から４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態４７．切断可能なペプチドが自己切断性ペプチドである、実施形態４６に記載のポリペプチド。
実施形態４８．自己切断性ペプチドがＴ２Ａペプチドである、実施形態４７に記載のポリペプチド。
実施形態４９．切断可能なペプチドまたは自己切断性ペプチドまたはＴ２Ａペプチドが、ＨＶＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５０）、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１３３）、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１３４）、またはその１つもしくはそれぞれの等価物を含む、実施形態４６から４８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態５０．以下の配列：配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、および配列番号５４、またはその断片の１つまたは複数を含む、実施形態１から４９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態５１．（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）、および
（２）ＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）
を含み、断片がＮＫＧ２ＤとＧタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）の両方を認識し、これらに結合することを前提とする、二特異性抗体またはその断片。
実施形態５２．抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列が、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ（配列番号１）またはその等価物を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）；
ＹＤＤＬＬＰＳ（配列番号２）またはその等価物を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）；
ＡＡＷＤＤＳＬＮＧＰＶ（配列番号３）またはその等価物を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）；
ＧＦＴＦＳＳＹ（配列番号４）またはその等価物を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）；
ＲＹＤＧＳＮ（配列番号５）またはその等価物を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）；および
ＤＲＧＬＧＤＧＴＹＦＤＹ（配列番号６）またはその等価物を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）
の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは５つまたは６つ全てを含み、
その等価物がＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する、実施形態５１に記載の抗体または断片。
実施形態５３．抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列が、
配列番号７またはその等価物を含む軽鎖可変領域；および／または
配列番号８またはその等価物を含む重鎖可変領域；
を含み、その等価物がＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する、実施形態５１または５２に記載の抗体または断片。
実施形態５４．配列番号７または８の等価物が、それぞれ配列番号７または８と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、実施形態５３に記載の抗体または断片。
実施形態５５．配列番号１～８の等価物が、それぞれ配列番号１～８のＣ末端からＮ末端へのアミノ酸配列を含む、実施形態５２または５３に記載の抗体または断片。
実施形態５６．抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列が、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間にペプチドリンカーをさらに含む、実施形態５３から５５のいずれか一項に記載の抗体または断片。
実施形態５７．抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列が、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間に配列番号９またはその等価物を含むペプチドリンカーをさらに含む、実施形態５３から５６のいずれか一項に記載の抗体または断片。
実施形態５８．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が、以下のＣＤＲ：
ＫＡＳＱＮＶＡＴＨＶＧ（配列番号１０）またはその等価物を含むＣＤＲＬ１；
ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号１１）またはその等価物を含むＣＤＲＬ２；
ＱＱＹＮＲＹＰＹＴ（配列番号１２）またはその等価物を含むＣＤＲＬ３；
ＧＹＳＦＴＧＹ（配列番号１３）またはその等価物を含むＣＤＲＨ１；
ＮＰＹＮＳＤ（配列番号１４）またはその等価物を含むＣＤＲＨ２；および
ＶＡＬＲＶＡＬＤＹ（配列番号１５）またはその等価物を含むＣＤＲＨ３
の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは５つまたは６つ全てを含み、
その等価物がＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する、実施形態５１から５７のいずれか一項に記載の抗体または断片。
実施形態５９．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が、
配列番号１６またはその等価物を含む軽鎖可変領域；および／または
配列番号１７またはその等価物を含む重鎖可変領域
を含み、その等価物がＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する、実施形態５１から５８のいずれか一項に記載の抗体または断片。
実施形態６０．配列番号１６または１７の等価物が、それぞれ配列番号１６または１７と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、実施形態５９に記載の抗体または断片。
実施形態６１．配列番号１０～１７の等価物が、それぞれ配列番号１０～１７のＣ末端からＮ末端へのアミノ酸配列を含む、実施形態５８または５９に記載の抗体または断片。
実施形態６２．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間にペプチドリンカーをさらに含む、実施形態５９から６１のいずれか一項に記載の抗体または断片。
実施形態６３．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間に配列番号９またはその等価物を含むペプチドリンカーをさらに含む、実施形態５９から６２のいずれか一項に記載の抗体または断片。
実施形態６４．二特異性抗体が、免疫グロブリンの断片結晶性（Ｆｃ）領域、その変異体、またはその等価物をさらに含む、実施形態５１から６３のいずれか一項に記載の抗体または断片。
実施形態６５．Ｆｃ領域またはその変異体が、ヒトＦｃ領域またはその変異体である、実施形態６４に記載の抗体または断片。
実施形態６６．Ｆｃ領域が、配列番号１８、または二特異性抗体を安定化させるその等価物を含む、実施形態６４または６５に記載の抗体または断片。
実施形態６７．Ｆｃ領域が、配列番号１９、または配列番号１９のアミノ酸（ａａ）１６、ａａ１７、およびａａ７９に相当する位置に突然変異を有し、二特異性抗体を安定化させるＦｃ等価物を含む、実施形態６４から６６のいずれか一項に記載の抗体または断片。
実施形態６８．二特異性抗体が、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列と抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列との間にペプチドリンカーをさらに含む、実施形態５１から６７のいずれか一項に記載の抗体または断片。
実施形態６９．ペプチドリンカーがＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ（配列番号８１）またはその等価物を含む、実施形態６８に記載の抗体または断片。
実施形態７０．二特異性抗体がそのＮ末端にシグナルペプチドをさらに含む、実施形態５１から６９のいずれか一項に記載の抗体または断片。
実施形態７１．シグナルペプチドが、ＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、またはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）、またはＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、またはＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）、または二特異性抗体、その断片、もしくはその等価物の分泌を促進するそのそれぞれの等価物を含む、実施形態７０に記載の抗体または断片。
実施形態７２．二特異性抗体が検出可能マーカーまたは精製マーカーをさらに含む、実施形態５１から７１のいずれか一項に記載の抗体または断片。
実施形態７３．検出可能マーカーがＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号２２）を含む、実施形態７２に記載の抗体または断片。
実施形態７４．（１）Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）またはＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合することを前提としてその等価物、
（２）ヒンジドメイン、
（３）膜貫通ドメイン、および
（４）細胞内ドメイン
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
実施形態７５．非ＧＰＲＣ５Ｄ ＴＡＡを認識かつ結合する抗原結合性配列をさらに含む、実施形態７４に記載のＣＡＲ。
実施形態７６．ＴＡＡが、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＦＬＴ３、ＣＤ１９、メソテリン、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ３３、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ＣＤ５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン前駆体１（ＲＯＲ１）、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、ＣＤ３８、ムチン１、（Ｍｕｃ１）、エフリンＡ型受容体２前駆体（ＥｐｈＡ２）、上皮細胞増殖因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、インターロイキン１３受容体アルファ２（ＩＬ１３Ｒａ２）、ＣＤ１３３、グリピカン３（ＧＰＣ３）、上皮細胞接着分子受容体（ＥｐＣａｍ）、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、がん／精巣（ＣＴ）、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）、腫瘍関連糖タンパク質－７２（ＴＡＧ－７２）、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）、およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ１）から選択されるタンパク質またはポリペプチド由来のエピトープを含む、実施形態７５に記載のＣＡＲ。
実施形態７７．ＴＡＡがＢＣＭＡのエピトープを含む、実施形態７５または７６に記載のＣＡＲ。
実施形態７８．ＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列が、以下のＣＤＲ：
ＫＡＳＱＮＶＡＴＨＶＧ（配列番号１０）またはその等価物を含むＣＤＲＬ１；
ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号１１）またはその等価物を含むＣＤＲＬ２；
ＱＱＹＮＲＹＰＹＴ（配列番号１２）またはその等価物を含むＣＤＲＬ３；
ＧＹＳＦＴＧＹ（配列番号１３）またはその等価物を含むＣＤＲＨ１；
ＮＰＹＮＳＤ（配列番号１４）またはその等価物を含むＣＤＲＨ２；および
ＶＡＬＲＶＡＬＤＹ（配列番号１５）またはその等価物を含むＣＤＲＨ３
の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは５つまたは６つを含み、その等価物がＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する、実施形態７４から７７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態７９．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が、
配列番号１６もしくはその等価物を含む軽鎖可変領域；および／または
配列番号１７もしくはその等価物を含む重鎖可変領域を含み、
その等価物がＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する、実施形態７８に記載のＣＡＲ。
実施形態８０．配列番号１６または１７の等価物が、それぞれ配列番号１６または１７と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、実施形態７９に記載のＣＡＲ。
実施形態８１．配列番号１０～１７の等価物が、それぞれ配列番号１０～１７のＣ末端からＮ末端へのアミノ酸配列を含む、実施形態７８または７９に記載のＣＡＲ。
実施形態８２．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間にペプチドリンカーをさらに含む、実施形態７９から８１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態８３．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が、軽鎖可変領域またはその等価物と重鎖可変領域またはその等価物との間に配列番号９またはその等価物を含むペプチドリンカーをさらに含む、実施形態７９から８１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態８４．ヒンジドメインがＣＤ８αヒンジドメインまたはＩｇＧ１ヒンジドメインを含む、実施形態７４から８３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態８５．ＩｇＧ１ヒンジドメインがＬＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＤＰＫＧＴ（配列番号４７）またはその等価物を含む、実施形態８４に記載のＣＡＲ。
実施形態８６．膜貫通ドメインがＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、実施形態７４から８５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態８７．細胞内ドメインが、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域、４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域、ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域、またはＯＸ４０共刺激領域から選択される１つもしくは複数または２つもしくはそれより多い共刺激領域を含む、実施形態７４から８６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態８８．配列番号４８またはその等価物を含むＣＤ２８膜貫通および細胞質／細胞内ドメイン（例えばＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域）を含む、実施形態８６または８７に記載のＣＡＲ。
実施形態８９．細胞内ドメインがＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをさらに含む、実施形態７４から８８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態９０．ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインが配列番号４９またはその等価物を含む、実施形態８９に記載のＣＡＲ。
実施形態９１．細胞内ドメインが、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ活性化ドメインを含むＩＬ２Ｒβまたはその断片をさらに含む、実施形態７４から９０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態９２．自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方をさらに含む、実施形態７４から９１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態９３．自殺遺伝子産物が、ＨＳＶ－ＴＫ（ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ）、シトシンデアミナーゼ、ニトロリダクターゼ、カルボキシエステラーゼ、チトクロームＰ４５０もしくはＰＮＰ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）、切断型ＥＧＦＲ、または誘起可能なカスパーゼ（「ｉＣａｓｐ」）の１つまたは複数から選択される、実施形態９２に記載のＣＡＲ。
実施形態９４．必要に応じて二特異性抗体のＮ末端におけるシグナルペプチドとは異なるシグナルペプチドをそのＮ末端にさらに含む、実施形態７４から９３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態９５．シグナルペプチドが、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、ＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）、またはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）、またはＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、またはＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）、またはそのそれぞれの等価物を含む、実施形態９４に記載のＣＡＲ。
実施形態９６．検出可能マーカーをさらに含む、実施形態７４から９５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
実施形態９７．以下：実施形態１から５０のいずれか一項に記載のポリペプチド、実施形態５１から７３のいずれか一項に記載の二特異性抗体、または実施形態７４から９６のいずれか一項に記載のＣＡＲの１つまたは複数をコードするポリヌクレオチド。
実施形態９８．以下：
ポリペプチドの発現を方向付ける第１の制御配列；
二特異性抗体の発現を方向付ける第２の制御配列；および
ＣＡＲの発現を方向付ける第３の制御配列
のいずれか１つまたはいずれか２つまたは３つ全てをさらに含む、実施形態９７に記載のポリヌクレオチド。
実施形態９９．制御配列のそれぞれが、以下：プロモーター、イントロン、エンハンサー、またはポリアデニル化シグナルの１つまたは複数を含む、実施形態９８に記載のポリヌクレオチド。
実施形態１００．以下：
（Ｉ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号５５またはその等価物を含むヌクレオチド配列；
（ＩＩ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号５６またはその等価物を含むヌクレオチド配列；
（ＩＩＩ）リンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号５７またはその等価物を含むヌクレオチド配列；
（ＩＶ）抗ＢＣＭＡ軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、もしくは配列番号６１、またはその等価物から選択されるヌクレオチド配列；
（Ｖ）抗ＢＣＭＡ重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、もしくは配列番号６５、またはその等価物から選択されるヌクレオチド配列；
（ＶＩ）ヒンジドメインをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号６６またはその等価物を含むヌクレオチド配列；
（ＶＩＩ）膜貫通および細胞質／細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号６７またはその等価物を含むヌクレオチド配列；
（ＶＩＩＩ）シグナル伝達ドメインをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号６８またはその等価物を含むヌクレオチド配列；
（ＩＸ）自己切断性ペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号６９またはその等価物を含むヌクレオチド配列；
（Ｘ）リンカーをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号７０またはその等価物を含むヌクレオチド配列；
（ＸＩ）抗ＧＰＲＣ５Ｄ軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号７１またはその等価物を含むヌクレオチド配列；
（ＸＩＩ）抗ＧＰＲＣ５Ｄ重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号７２またはその等価物を含むヌクレオチド配列；
（ＸＩＩＩ）抗ＮＫＧ２Ｄ軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号７３またはその等価物を含むヌクレオチド配列；
（ＸＩＶ）抗ＮＫＧ２Ｄ重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号７４またはその等価物を含むヌクレオチド配列
（ＸＶ）変異体Ｆｃ領域をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号７５またはその等価物を含むヌクレオチド配列；
（ＸＶＩ）タグをコードするヌクレオチド配列であって、配列番号７６またはその等価物を含むヌクレオチド配列；
（ＸＶＩＩ）配列番号７７またはその等価物のヌクレオチド配列；
（ＸＶＩＩＩ）配列番号７８またはその等価物のヌクレオチド配列；
（ＸＩＸ）配列番号７９またはその等価物のヌクレオチド配列；および
（ＸＸ）配列番号８０またはその等価物のヌクレオチド配列
の１つまたは複数を含む、実施形態９７から９９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
実施形態１０１．自殺遺伝子産物もしくは検出可能マーカーまたはその両方をさらに含む、実施形態９７から１００のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
実施形態１０２．自殺遺伝子が、ＨＳＶ－ＴＫ（ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ）、シトシンデアミナーゼ、ニトロリダクターゼ、カルボキシエステラーゼ、チトクロームＰ４５０もしくはＰＮＰ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）、切断型ＥＧＦＲ、または誘起可能なカスパーゼ（「ｉＣａｓｐ」）の１つまたは複数から選択される産物をコードする、実施形態１０１に記載のポリヌクレオチド。
実施形態１０３．検出可能マーカーをさらに含む、実施形態９７から１０２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
実施形態１０４．実施形態９７から１０３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
実施形態１０５．非ウイルスベクターまたはウイルスベクターである、実施形態１０４に記載のベクター。
実施形態１０６．非ウイルスベクターがプラスミドである、実施形態１０５に記載のベクター。
実施形態１０７．ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターの群から選択される、実施形態１０５に記載のベクター。
実施形態１０８．ポリヌクレオチドの複製を方向付ける制御配列をさらに含む、実施形態１０４から１０７のいずれか一項に記載のベクター。
実施形態１０９．以下：実施形態１から５０のいずれか一項に記載のポリペプチド、実施形態５１から７３のいずれか一項に記載の二特異性抗体もしくはその断片、実施形態７４から９６のいずれか一項に記載のＣＡＲ、実施形態９７から１０３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または実施形態１０４から１０８のいずれか一項に記載のベクターの１つまたは複数を含む、単離された細胞。
実施形態１１０．原核生物細胞または真核生物細胞である、実施形態１０９に記載の単離された細胞。
実施形態１１１．真核生物細胞である、実施形態１０９または１１０に記載の単離された細胞。
実施形態１１２．真核生物細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ウシ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ネズミ細胞、ウマ細胞、またはヒト細胞から選択される、実施形態１１１に記載の単離された細胞。
実施形態１１３．真核生物細胞が免疫細胞、必要に応じて造血幹細胞（ＨＳＣ）および／または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導された、必要に応じてＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、骨髄性細胞、単球、またはマクロファージである、実施形態１１１または１１２に記載の単離された細胞。
実施形態１１４．二特異性抗体を分泌する、実施形態１０９から１１３のいずれか一項に記載の単離された細胞。
実施形態１１５．担体および以下：実施形態１から５０のいずれか一項に記載のポリペプチド、実施形態５１から７３のいずれか一項に記載の二特異性抗体もしくはその断片、実施形態７４から９６のいずれか一項に記載のＣＡＲ、実施形態９７から１０３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、実施形態１０４から１０８のいずれか一項に記載のベクター、または実施形態１０９から１１４のいずれか一項に記載の単離された細胞の１つまたは複数を含む組成物。
実施形態１１６．担体が薬学的に許容される担体である、実施形態１１５に記載の組成物。
実施形態１１７．以下：
がん細胞に結合した実施形態１から５０のいずれか一項に記載のポリペプチド、
がん細胞に結合した実施形態５１から７３のいずれか一項に記載の二特異性抗体もしくはその断片、
がん細胞に結合した実施形態７４から９６のいずれか一項に記載のＣＡＲ、および
がん細胞に結合した実施形態１０９から１１４のいずれか一項に記載の単離された細胞
の１つまたは複数を含む、単離された複合体。
実施形態１１８．細胞またはその集団に、実施形態９７から１０３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび／または実施形態１０４から１０８のいずれか一項に記載のベクターを形質導入することを含む、ＣＡＲ発現細胞を産生する方法。
実施形態１１９．細胞またはその集団に、実施形態９７から１０３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび／または実施形態１０４から１０８のいずれか一項に記載のベクターを形質導入することを含む、二特異性抗体を分泌する細胞を産生する方法。
実施形態１２０．細胞またはその集団に、実施形態９７から１０３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび／または実施形態１０４から１０８のいずれか一項に記載のベクターを形質導入することを含む、二特異性抗体を分泌するＣＡＲ発現細胞を産生する方法。
実施形態１２１．細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、または免疫細胞から選択される、実施形態１１８から１２０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１２２．細胞集団が、以下：ＨＳＣ、ｉＰＳＣ、または免疫細胞の１つまたは複数を含む、実施形態１１８から１２０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１２３．免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、骨髄性細胞、単球、またはマクロファージから選択される、実施形態１２１または１２２に記載の方法。
実施形態１２４．免疫細胞が、ＨＳＣまたはｉＰＳＣから誘導される、実施形態１２１から１２３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１２５．がん細胞または組織を、実施形態１０９から１１４のいずれか一項に記載の単離された細胞と接触させることを含む、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現するがん細胞またはがん細胞を含む組織の増殖を阻害する方法。
実施形態１２６．がん細胞または組織を、実施形態５１から７３のいずれか一項に記載の二特異性抗体またはその断片と接触させることをさらに含む、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１２７．接触させることがｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行われる、実施形態１２５または１２６に記載の方法。
実施形態１２８．接触させることがｉｎ ｖｉｖｏで行われ、単離された細胞が処置される対象に対して自家または同種異系である、実施形態１２５から１２７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１２９．接触させることがｉｎ ｖｉｖｏで行われ、単離された細胞が処置される対象に対して同種異系である、実施形態１２５から１２７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３０．がん細胞がＴＡＡまたはＢＣＭＡを発現する、実施形態１２５から１２９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３１．がん細胞がＴＡＡまたはＧＰＲＣ５Ｄを発現する、実施形態１２５から１３０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３２．がん細胞がＢＣＭＡとＧＰＲＣ５Ｄの両方を発現する、実施形態１２５から１３１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３３．がんまたは組織を、実施形態５１から７３のいずれか一項に記載の二特異性抗体またはその断片と接触させることを含む、ＧＰＲＣ５Ｄを発現するがん細胞またはがん細胞を含む組織の増殖を阻害する方法。
実施形態１３４．接触させることが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行われる、実施形態１３３に記載の方法。
実施形態１３５．がん細胞または組織を、有効量の腫瘍縮小療法またはがん細胞上のＴＡＡの発現を上方制御する療法と接触させることをさらに含む、実施形態１２５から１３４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１３６．接触させることがｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行われる、実施形態１３５に記載の方法。
実施形態１３７．実施形態１１３に記載の単離された細胞を対象に投与することを含む、それを必要とする対象においてがんを処置する方法。
実施形態１３８．対象から単離された試料中の１つまたは複数の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を決定すること、および１つまたは複数のＴＡＡを認識し、これらに結合するＣＡＲを発現する細胞を投与することによって、治療のために対象が選択される、実施形態１３７に記載の方法。
実施形態１３９．ＴＡＡの発現が、試料を抗ＴＡＡ抗体またはその抗原結合性断片とｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで接触させ、試料と抗ＴＡＡ抗体またはその抗原結合性断片との間の結合を検出することによって決定される、実施形態１３８に記載の方法。
実施形態１４０．抗ＴＡＡ抗体が検出可能マーカーを含む、実施形態１３９に記載の方法。
実施形態１４１．ＴＡＡの少なくとも１つがＢＣＭＡのエピトープを含む、実施形態１３８から１４０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１４２．ＴＡＡの少なくとも１つがＧＰＲＣ５Ｄのエピトープを含む、実施形態１３８から１４１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１４３．実施形態５１から７３のいずれか一項に記載の二特異性抗体またはその断片を対象に投与することをさらに含む、実施形態１３７から１４１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１４４．単離された細胞と二特異性抗体またはその断片が一緒に投与される、実施形態１４３に記載の方法。
実施形態１４５．単離された細胞と二特異性抗体またはその断片が個別に投与される、実施形態１４３に記載の方法。
実施形態１４６．単離された細胞と二特異性抗体またはその断片が同時に投与される、実施形態１４５に記載の方法。
実施形態１４７．単離された細胞と二特異性抗体またはその断片が１時間離して、４時間離して、２４時間離して、２日離して、３日離して、または１週間離して投与される、実施形態１４５に記載の方法。
実施形態１４８．実施形態１０９から１１４のいずれか一項に記載の単離された細胞を対象に投与することを含む、処置のために選択された対象におけるがんを処置する方法。
実施形態１４９．対象が、対象のがん細胞が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の１つまたは複数を発現するか否かによって選択される、実施形態１４８に記載の方法。
実施形態１５０．ＴＡＡの発現が、対象のがん細胞を抗ＴＡＡ抗体またはその抗原結合性断片とｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで接触させることによって決定される、実施形態１４９に記載の方法。
実施形態１５１．抗ＴＡＡ抗体が検出可能マーカーを含む、実施形態１５０に記載の方法。
実施形態１５２．ＴＡＡがＢＣＭＡである、実施形態１４９から１５１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１５３．ＴＡＡがＧＰＲＣ５Ｄである、実施形態１４９から１５２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１５４．実施形態５１から７３のいずれか一項に記載の二特異性抗体またはその断片を対象に投与することをさらに含む、実施形態１４８から１５３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１５５．単離された細胞と二特異性抗体またはその断片が一緒に投与される、実施形態１５４に記載の方法。
実施形態１５６．単離された細胞と二特異性抗体またはその断片が個別に投与される、実施形態１５４に記載の方法。
実施形態１５７．単離された細胞と二特異性抗体またはその断片が同時に投与される、実施形態１５６に記載の方法。
実施形態１５８．単離された細胞と二特異性抗体またはその断片が１時間離して、４時間離して、２４時間離して、２日離して、３日離して、または１週間離して投与される、実施形態１５６に記載の方法。
実施形態１５９．単離された細胞が、それを必要とする対象に対して自家または同種異系である、実施形態１３７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１６０．単離された細胞が、それを必要とする対象に対して同種異系である、実施形態１３７から１５８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１６１．実施形態５１から７３のいずれか一項に記載の二特異性抗体またはその断片を対象に投与することを含む、対象におけるＧＰＲＣ５Ｄ発現がんを処置する方法。
実施形態１６２．対象に、腫瘍縮小療法または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現を上方制御する療法を投与することをさらに含む、実施形態１３７から１６１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１６３．投与が対象に第１線療法、または第２線療法、または第３線療法、または第４線療法として適用される、実施形態１３７から１６２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１６４．腫瘍縮小療法が、以下：化学療法、凍結療法、温熱療法、標的療法、または放射線療法の１つまたは複数を含む、実施形態１３５または１６２に記載の方法。
実施形態１６５．対象が哺乳動物、イヌ、ネコ、ウマ、ネズミ、またはヒト患者である、実施形態１２８から１６４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１６６．がんが多発性骨髄腫（ＭＭ）である、実施形態１２５から１６５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１６７．必要に応じた使用のための説明書、ならびに以下：実施形態１から５０のいずれか一項に記載のポリペプチド、実施形態５１から７３のいずれか一項に記載の二特異性抗体もしくはその断片、実施形態７４から９６のいずれか一項に記載のＣＡＲ、実施形態９７から１０３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、実施形態１０４から１０８のいずれか一項に記載のベクター、または実施形態１０９から１１４のいずれか一項に記載の単離された細胞、実施形態１１５もしくは１１６に記載の組成物、または実施形態１１７に記載の単離された複合体の１つまたは複数を含むキット。
均等物
他に定義されなければ、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、この技術が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
実例的に本明細書に記載される本技術は、具体的に本明細書に開示されていない任意の要素（単数または複数）、限定（単数または複数）の非存在下で好適に実施され得る。そのため、例えば、「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、「含む」（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、「含有する」などの用語は、拡張的におよび限定なしに読まれるものとする。追加的に、本明細書において用いられる用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されており、そのような用語および表現の使用において、示され、記載される特徴またはその部分のあらゆる均等物を除外する意図はなく、様々な改変が、特許請求される本技術の範囲内で可能であることが認識される。
そのため、本明細書に提供される材料、方法、および例は、好ましい態様の代表であり、例示的なものであり、本技術の範囲に対する限定としては意図されないことが理解されるべきである。
本技術は、本明細書において広くおよび一般的に（ｇｅｎｅｒｉｃａｌｌｙ）記載されている。属（ｇｅｎｅｒｉｃ）の開示内に入るより狭い種（ｓｐｅｃｉｅｓ）および属より小さい（ｓｕｂ－ｇｅｎｅｒｉｃ）グループ分けのそれぞれもまた本技術の部分を形成する。これは、除外される材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から任意の主題を除外する但し書きまたは否定的限定と共に本技術の属の記載を含む。
追加的に、本技術の特徴または態様がマーカッシュ群の観点で記載される場合、本技術はまたそれにより、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの部分群の観点で記載されることを当業者は認識する。
本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それぞれが参照により個々に組み込まれている場合と同じ程度までそれらの全体が参照により明示的に組み込まれる。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が優先される。
他の態様は、以下の請求項内に記載されている。

Claims (137)

  1. （ｉ）（１）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を認識かつ結合する抗原結合性アミノ酸配列（抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列）、
    （２）ヒンジドメイン、
    （３）膜貫通ドメイン、および
    （４）細胞内ドメイン
    を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列；
    （ｉｉ）（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）、および
    （２）Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）
    を含む二特異性抗体のアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ）ＩＬ１５またはＩＬ－２１から選択されるサイトカインの必要に応じたアミノ酸配列；および
    （ｉｖ）検出可能マーカーおよび自殺遺伝子産物、必要に応じて切断型上皮細胞増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）またはＲＱＲ８の必要に応じたアミノ酸配列
    を含むポリペプチド。
  2. 前記二特異性抗体が、Ｎ末端からＣ末端へ、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列および前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記二特異性抗体が、Ｎ末端からＣ末端へ、前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列および前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列が、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
    ＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＮ（配列番号１）またはその等価物を含む軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）；
    ＹＤＤＬＬＰＳ（配列番号２）またはその等価物を含む軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）；
    ＡＡＷＤＤＳＬＮＧＰＶ（配列番号３）またはその等価物を含む軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）；
    ＧＦＴＦＳＳＹ（配列番号４）またはその等価物を含む重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）；
    ＲＹＤＧＳＮ（配列番号５）またはその等価物を含む重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）；および
    ＤＲＧＬＧＤＧＴＹＦＤＹ（配列番号６）またはその等価物を含む重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）
    の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは５つまたは６つ全てを含み、
    前記その等価物がＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. 前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列が、
    配列番号７またはその等価物を含む軽鎖可変領域；または
    配列番号８またはその等価物を含む重鎖可変領域
    の一方または両方を含み、前記その等価物がＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. 配列番号７または８の前記等価物が、それぞれ配列番号７または８と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、請求項５に記載のポリペプチド。
  7. 配列番号７の前記等価物が配列番号７のＣＤＲを保持し、配列番号８の前記等価物が配列番号８のＣＤＲを保持している、請求項５または６に記載のポリペプチド。
  8. 前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列が、前記軽鎖可変領域またはその等価物と前記重鎖可変領域またはその等価物との間に、ペプチドリンカーをさらに含む、請求項５から７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. 前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列が、前記軽鎖可変領域または前記その等価物と前記重鎖可変領域または前記その等価物との間に、配列番号９またはその等価物を含むペプチドリンカーをさらに含む、請求項５から８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. 前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が、以下のＣＤＲ：
    ＫＡＳＱＮＶＡＴＨＶＧ（配列番号１０）またはその等価物を含むＣＤＲＬ１；
    ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号１１）またはその等価物を含むＣＤＲＬ２；
    ＱＱＹＮＲＹＰＹＴ（配列番号１２）またはその等価物を含むＣＤＲＬ３；
    ＧＹＳＦＴＧＹ（配列番号１３）またはその等価物を含むＣＤＲＨ１；
    ＮＰＹＮＳＤ（配列番号１４）またはその等価物を含むＣＤＲＨ２；および
    ＶＡＬＲＶＡＬＤＹ（配列番号１５）またはその等価物を含むＣＤＲＨ３
    の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは５つまたは６つ全てを含み、
    前記その等価物がＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が、
    配列番号１６またはその等価物を含む軽鎖可変領域；または
    配列番号１７またはその等価物を含む重鎖可変領域
    の一方または両方を含み、前記その等価物がＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. 配列番号１６または１７の前記等価物が、それぞれ配列番号１６または１７と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、請求項１１に記載のポリペプチド。
  13. 配列番号１６の前記等価物が配列番号１６のＣＤＲを保持し、配列番号１７の前記等価物が配列番号１７のＣＤＲを保持している、請求項１１または１２に記載のポリペプチド。
  14. 前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が、前記軽鎖可変領域またはその等価物と前記重鎖可変領域またはその等価物との間に、ペプチドリンカーをさらに含む、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  15. 前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列が、前記軽鎖可変領域または前記その等価物と前記重鎖可変領域または前記その等価物との間に、配列番号９またはその等価物を含むペプチドリンカーをさらに含む、請求項１１から１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  16. 前記二特異性抗体が、免疫グロブリンの断片結晶性（Ｆｃ）領域、その変異体、またはその等価物をさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  17. 前記Ｆｃ領域またはその変異体が、ヒトＦｃ領域またはその変異体である、請求項１６に記載のポリペプチド。
  18. 前記Ｆｃ領域が、配列番号１８、または前記二特異性抗体を安定化させるその等価物を含む、請求項１６または１７に記載のポリペプチド。
  19. 前記Ｆｃ領域が、配列番号１９、または配列番号１９のアミノ酸（ａａ）１６、ａａ１７、およびａａ７９に相当する位置に突然変異を有し、前記二特異性抗体を安定化させるＦｃ等価物を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  20. 前記二特異性抗体が、前記抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列と前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列との間にペプチドリンカーをさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  21. 前記ペプチドリンカーがＰＳＧＱＡＧＡＡＡＳＥＳＬＦＶＳＮＨＡＹ（配列番号８１）またはその等価物を含む、請求項２０に記載のポリペプチド。
  22. 前記二特異性抗体がそのＮ末端にシグナルペプチドをさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  23. 前記シグナルペプチドが、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）、ＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、ＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）、ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号１２６）またはそのそれぞれの等価物を含むポリペプチドから選択される、請求項２２に記載のポリペプチド。
  24. 前記シグナルペプチドが配列番号２０からなる、請求項２２または２３に記載のポリペプチド。
  25. 前記二特異性抗体が、さらなる検出可能マーカーまたは精製マーカーをさらに含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  26. 前記検出可能マーカーがＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号２２）を含む、請求項２５に記載のポリペプチド。
  27. 前記抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列が、以下のＣＤＲ：
    ＲＡＳＥＳＶＴＩＬＧＳＨＬＩＨ（配列番号２３）、ＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号２４）、ＲＡＳＥＳＶＴＩＬＧＳＨＬＩＹ（配列番号２５）、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＬ１；
    ＬＡＳＮＶＱＴ（配列番号２６）、ＹＴＳＮＬＨＳ（配列番号２７）、ＬＡＳＮＶＱＴ（配列番号２８）、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＬ２；
    ＬＱＳＲＴＩＰＲＴ（配列番号２９）、ＱＱＹＲＫＬＰＷＴ（配列番号３０）、ＬＱＳＲＴＩＰＲＴ（配列番号３１）、そのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＬ３；
    ＧＹＴＦＴＤＹ（配列番号３２）、ＧＧＴＦＳＮＹ（配列番号３３）、ＧＹＴＦＲＨＹ（配列番号３４）、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＨ１；
    ＩＮＴＥＴＲＥ（配列番号３５）、ＹＲＧＨＳＤ（配列番号３６）、ＮＴＥＳＧＶ（配列番号３７）、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＨ２；および
    ＤＹＳＹＡＭＤＹ（配列番号３８）、ＧＡＩＹＮＧＹＤＶＬＤＮ（配列番号３９）、ＤＹＬＹＳＬＤＦ（配列番号４０）、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含むＣＤＲＨ３
    の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは５つまたは６つを含み、
    前記その等価物がＢＣＭＡを認識かつ結合する、請求項１から２６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  28. 前記抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列が、
    配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含む軽鎖可変領域および／または
    配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、またはそのそれぞれの等価物から選択される配列を含む重鎖可変領域
    を含み、前記その等価物がＢＣＭＡを認識かつ結合する、請求項２７に記載のポリペプチド。
  29. 配列番号４１～４６の前記等価物が、それぞれ配列番号４１～４６と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、請求項２７または２８に記載のポリペプチド。
  30. 配列番号４１～４６の前記等価物が、それぞれ配列番号４１～４６のＣＤＲを保持している、請求項２８または２９に記載のポリペプチド。
  31. 前記抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列またはその等価物が、前記軽鎖可変領域またはその等価物と前記重鎖可変領域またはその等価物との間にペプチドリンカーをさらに含む、請求項２８から３０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  32. 前記抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列が、前記軽鎖可変領域または前記その等価物と前記重鎖可変領域または前記その等価物との間に、配列番号９またはその等価物を含むペプチドリンカーをさらに含む、請求項２８から３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  33. 前記ヒンジドメインが、ＣＤ８αヒンジドメインまたはＩｇＧ１ヒンジドメインを含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  34. 前記ＩｇＧ１ヒンジドメインが、配列番号４７またはその等価物を含む、請求項３３に記載のポリペプチド。
  35. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  36. 前記細胞内ドメインが、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域、４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域、ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域、ＯＸ４０共刺激領域、ＤＡＰ１０共刺激領域、またはＤＡＰ１２共刺激領域から選択される１つもしくは複数または２つもしくはそれより多い共刺激領域を含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  37. 前記ＣＡＲが、配列番号４８またはその等価物もしくはそれぞれを含むＣＤ２８膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達領域を含む、請求項３５または３６に記載のポリペプチド。
  38. 前記細胞内ドメインがＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  39. 前記ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインが、配列番号４９またはその等価物を含む、請求項３８に記載のポリペプチド。
  40. 前記ＣＡＲが、前記二特異性抗体のＮ末端における前記シグナルペプチドとは必要に応じて異なるシグナルペプチドをそのＮ末端にさらに含む、請求項１から３９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  41. 前記シグナルペプチドが、ＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）、ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号１２６）、または前記二特異性抗体、その断片もしくは等価物の分泌を促進するそのそれぞれの等価物を含む、請求項４０に記載のポリペプチド。
  42. 前記シグナルペプチドが配列番号２１からなる、請求項４０または４１に記載のポリペプチド。
  43. 前記サイトカインのアミノ酸配列が、配列番号１０６、配列番号１０４、配列番号１１７、配列番号１１８、もしくは配列番号１１６、またはそのそれぞれの等価物の少なくとも１つを含む、請求項１から４２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  44. 前記サイトカインのアミノ酸配列が配列番号１０６またはその等価物を含む、請求項１から４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  45. 前記サイトカインのアミノ酸配列が、配列番号１０６またはその等価物および配列番号１０７またはその等価物を含む、請求項１から４４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  46. 前記２つの配列がリンカーによって連結されている、請求項４５に記載のポリペプチド。
  47. 前記リンカーが配列番号１０８もしくは配列番号９、またはそのそれぞれの等価物を含む、請求項４６に記載のポリペプチド。
  48. 前記サイトカインが膜結合サイトカインである、請求項１から４７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  49. 前記サイトカインのアミノ酸配列が膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１から４８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  50. 前記膜貫通ドメインが、配列番号１１９またはその等価物を含む血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲβ）膜貫通ドメインを含む、請求項４９に記載のポリペプチド。
  51. 前記サイトカインがシグナルペプチドをさらに含む、請求項１から５０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  52. 前記シグナルペプチドが、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）、ＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）、ＭＲＳＳＰＧＮＭＥＲＩＶＩＣＬＭＶＩＦＬＧＴＬＶ（配列番号１２４）、ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号１２６）またはそのそれぞれの等価物を含む、請求項４６に記載のポリペプチド。
  53. 前記シグナルペプチドがＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号１２６）またはそのそれぞれの等価物からなる、請求項５１または５２に記載のポリペプチド。
  54. 前記ｔＥＧＦＲが配列番号１２０の配列またはその等価物を含む、請求項１から５３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  55. 前記ｔＥＧＦＲがシグナルペプチドをさらに含む、請求項１から５４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  56. 前記シグナルペプチドが、ＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）、ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号１２６）、または前記二特異性抗体、その断片もしくは等価物の分泌を促進するそのそれぞれの等価物を含む、請求項５５に記載のポリペプチド。
  57. 前記ＲＱＲ８が配列番号１３２またはその等価物を含む、請求項１から５３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  58. （ｉ）～（ｉｖ）のいずれか１つまたは複数のアミノ酸配列が、検出可能マーカーをさらに含む、請求項１から５７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  59. （ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）のいずれか２つの間に位置する切断可能なペプチドをさらに含む、請求項１から５８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  60. 前記切断可能なペプチドが自己切断性ペプチドである、請求項５９に記載のポリペプチド。
  61. 前記切断可能なペプチドがＴ２ＡペプチドまたはＰ２Ａから選択される、請求項６０に記載のポリペプチド。
  62. 前記切断可能なペプチドまたは自己切断性ペプチドが、ＨＶＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５０）、ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号５０のａａ３～ａａ２３）、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１３３）、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１３４）、ＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１３５）、またはそのそれぞれの等価物から選択されるペプチドを含む、請求項５９から６１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  63. ＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）もしくはＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号１２６）のアミノ酸配列、またはそのそれぞれの等価物を含むシグナルペプチド；
    配列番号４１もしくは配列番号４２またはそのそれぞれの等価物を含む軽鎖可変領域、配列番号９またはその等価物を含むペプチドリンカー、および配列番号４４もしくは配列番号４５またはそのそれぞれの等価物を含む重鎖可変領域を含み、前記可変領域の等価物が、ＢＣＭＡを認識かつ結合する、抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列；
    ＬＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＤＰＫＧＴ（配列番号４７）またはその等価物を含むヒンジドメイン；
    配列番号９１またはその等価物を含むＣＤ２８膜貫通ドメイン；
    配列番号９５またはその等価物を含むＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域；
    配列番号４９またはその等価物を含むＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン；
    配列番号５０もしくは配列番号５０のａａ３～ａａ２３またはその等価物を含むＴ２Ａ自己切断性ペプチド；
    ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）、ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号１２６）、またはそのそれぞれの等価物を含むシグナルペプチド；
    配列番号１６またはその等価物を含む軽鎖可変領域、配列番号９またはその等価物を含むペプチドリンカー、配列番号１７またはその等価物を含む重鎖可変領域を含み、前記可変領域の等価物がＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列；
    配列番号８１またはその等価物を含むヒト筋アルドラーゼ（ＨＭＡ）リンカー；
    配列番号７またはその等価物を含む軽鎖可変領域、配列番号９またはその等価物を含むペプチドリンカー、および配列番号８またはその等価物を含む重鎖可変領域を含み、前記可変領域の等価物がＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列；
    配列番号１９またはその等価物を含むＦｃ領域；
    ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１３４）もしくはＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１３５）またはその等価物を含むＴ２Ａ自己切断性ペプチド；
    ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）もしくはＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）もしくはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）もしくはＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号１２６）またはそのそれぞれの等価物を含むシグナルペプチド；
    配列番号１０６、配列番号１０４、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１６、またはそのそれぞれの等価物の少なくとも１つを含み、必要に応じて配列番号１１９またはその等価物を含む膜貫通ドメインをさらに含み、必要に応じて配列番号１０６またはその等価物、配列番号１０８もしくは配列番号９、またはそのそれぞれの等価物を含む必要に応じたペプチドリンカー、および配列番号１０７またはその等価物を含む、前記サイトカインのアミノ酸配列；
    配列番号１３３またはその等価物を含むＰ２Ａ自己切断性ペプチド；
    ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）、ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号１２６）、またはそのそれぞれの等価物を含む必要に応じたシグナルペプチド；および
    配列番号１２０もしくは配列番号１３２、またはそのそれぞれの等価物を含む、検出可能マーカーおよび自殺遺伝子産物
    を含む、請求項１から６２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  64. ＭＧＷＳＳＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨ（配列番号２１）またはＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号１２６）のアミノ酸配列を含むシグナルペプチド；
    配列番号４１または配列番号４２を含む軽鎖可変領域、配列番号９を含むペプチドリンカー、および配列番号４４または配列番号４５を含む重鎖可変領域を含む抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列；
    配列番号４７を含むヒンジドメイン；
    配列番号９１を含むＣＤ２８膜貫通ドメイン；
    配列番号９５を含むＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域；
    配列番号４９を含むＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン；
    配列番号５０を含むＴ２Ａ自己切断性ペプチド；
    配列番号２０または配列番号１２６を含むシグナルペプチド；
    配列番号１６を含む軽鎖可変領域、配列番号９を含むペプチドリンカー、および配列番号１７を含む重鎖可変領域を含む抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列；
    配列番号８１を含むヒト筋アルドラーゼ（ＨＭＡ）リンカー；
    配列番号７を含む軽鎖可変領域、配列番号９を含むペプチドリンカー、および配列番号８を含む重鎖可変領域を含む抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列；
    配列番号１９を含むＦｃ領域；
    配列番号１３４を含むＴ２Ａ自己切断性ペプチド；
    ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２０）またはＭＲＩＳＫＰＨＬＲＳＩＳＩＱＣＹＬＣＬＬＬＮＳＨＦＬＴＥＡ（配列番号１２３）またはＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳ（配列番号１２２）またはＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号１２６）を含むシグナルペプチド；
    配列番号１０６、配列番号１０４、配列番号１１７、配列番号１１８、または配列番号１１６の少なくとも１つを含み、必要に応じて配列番号１１９を含む膜貫通ドメインをさらに含み、必要に応じて配列番号１０６、配列番号１０８を含む必要に応じたペプチドリンカー、および配列番号１０７を含む、前記サイトカインのアミノ酸配列；
    配列番号１３３を含むＰ２Ａ自己切断性ペプチド；
    ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１２５）またはＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ（配列番号１２６）を含むシグナルペプチド；および
    配列番号１２０を含む自殺遺伝子産物
    を含む、請求項１から６３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  65. その成分が前記ポリペプチド中でＮ末端からＣ末端の順に記載されている、請求項６３または６４に記載のポリペプチド。
  66. その成分が前記ポリペプチド中でＣ末端からＮ末端の順に記載されている、請求項６３または６４に記載のポリペプチド。
  67. 前記軽鎖可変領域の１つまたは複数が同じ抗原結合性配列の前記重鎖可変領域と入れ替えられていることを除いて、その成分が前記ポリペプチド中でＮ末端からＣ末端、またはＣ末端からＮ末端の順に記載されている、請求項６３または６４に記載のポリペプチド。
  68. 前記抗原結合性配列の少なくとも２つが入れ替えられていることを除いて、その成分が前記ポリペプチド中でＮ末端からＣ末端、またはＣ末端からＮ末端の順に記載されている、請求項６３または６４に記載のポリペプチド。
  69. 前記抗原結合性配列の少なくとも２つが入れ替えられていることおよび前記軽鎖可変領域の１つまたは複数が同じ抗原結合性配列の前記重鎖可変領域と入れ替えられていることを除いて、その成分が前記ポリペプチド中でＮ末端からＣ末端、またはＣ末端からＮ末端の順に記載されている、請求項６３または６４に記載のポリペプチド。
  70. 表１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｆ、１ｇ、２ａ、２ｄ、２ｅ、２ｈ、２ｉ、２ｌ、２ｍ、２ｐ、２ｑ、２ｔ、２ｕ、３ａ、３ｂ、３ｃ、または３ｄのいずれか１つで開示されるアミノ酸配列の１つまたは複数を含み、必要に応じて検出可能マーカーを含まない、請求項１から６９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  71. 本明細書で開示される以下の配列またはその断片、Ｐ４～Ｐ９、Ｐ１１Ｅ、Ｐ１２Ｅ、Ｐ１９、Ｐ２０、Ｐ６１、Ｐ６２、またはＰ７２のアミノ酸配列の１つまたは複数を含み、必要に応じて検出可能マーカーを含まない、請求項１から７０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  72. 配列番号１３８または配列番号１３９のいずれか１つを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  73. 請求項１から７２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
    （ｉ）（１）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を認識かつ結合する抗原結合性アミノ酸配列（抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列）、
    （２）ヒンジドメイン、
    （３）膜貫通ドメイン、および
    （４）細胞内ドメイン
    を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列；
    （ｉｉ）（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）、および
    （２）Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）
    を含む二特異性抗体のアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ）ＩＬ１５またはＩＬ－２１から選択されるサイトカインの必要に応じたアミノ酸配列；および
    （ｉｖ）自殺遺伝子産物、必要に応じて切断型上皮細胞増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）またはＲＱＲ８の必要に応じたアミノ酸配列
    をコードするポリヌクレオチド。
  74. 配列番号５５またはその等価物を含むシグナルペプチドコード配列；
    配列番号５８もしくは配列番号５９またはそのそれぞれの等価物を含む軽鎖可変領域コード配列、配列番号５７またはその等価物を含むペプチドリンカーコード配列、および配列番号６２もしくは配列番号６３またはそのそれぞれの等価物を含む重鎖可変領域コード配列を含み、前記等価物がＢＣＭＡを認識かつ結合する可変領域をコードする、抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列コード配列；
    配列番号６６またはその等価物を含むヒンジドメインコード配列；
    配列番号９０またはその等価物を含むＣＤ２８膜貫通ドメインコード配列；
    配列番号９６またはその等価物を含むＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域コード配列；
    配列番号６８またはその等価物を含むＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインコード配列；
    配列番号６９もしくは配列番号１４０またはその等価物を含むＴ２Ａ自己切断性ペプチドコード配列；
    配列番号５６もしくは配列番号１２７またはその等価物を含むシグナルペプチドコード配列；
    配列番号７１もしくは配列番号１４１またはそのそれぞれの等価物を含む軽鎖可変領域コード配列、配列番号５７もしくは配列番号１４２またはそのそれぞれの等価物を含むペプチドリンカーコード配列、および配列番号７２もしくは配列番号１４３またはそのそれぞれの等価物を含む重鎖可変領域コード配列を含み、前記等価物がＧＰＲＣ５Ｄを認識かつ結合する可変領域をコードする、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列コード配列；
    配列番号７０もしくは配列番号１４１またはそのそれぞれの等価物を含むヒト筋アルドラーゼ（ＨＭＡ）リンカーコード配列；
    配列番号７３もしくは配列番号１４５またはそのそれぞれの等価物を含む軽鎖可変領域コード配列、配列番号５７もしくは配列番号１４６またはそのそれぞれの等価物を含むペプチドリンカーコード配列、および配列番号７４またはその等価物を含む重鎖可変領域コード配列を含み、前記等価物がＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する可変領域をコードする、抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列コード配列；
    配列番号７５もしくは配列番号１４７またはその等価物を含むＦｃ領域コード配列；
    配列番号１４８もしくは配列番号１４９またはそのそれぞれの等価物を含むＴ２Ａ自己切断性ペプチドコード配列；
    配列番号５６もしくは配列番号１５０もしくは配列番号２００、配列番号１２７、もしくは配列番号１５１、またはそのそれぞれの等価物を含むシグナルペプチドコード配列；
    配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、またはそのそれぞれの等価物の少なくとも１つを含み、必要に応じて配列番号１６４またはその等価物を含む膜貫通ドメインコード配列をさらに含み、必要に応じて配列番号１５２もしくは配列番号１５３またはそのそれぞれの等価物を含み、配列番号１６５もしくは配列番号１６６もしくは配列番号５７またはそのそれぞれの等価物を含む必要に応じたペプチドリンカーコード配列、および配列番号１６７またはその等価物を含むサイトカインコード配列；
    配列番号１５９もしくは配列番号１６０またはその等価物を含むＰ２Ａ自己切断性ペプチドコード配列；
    配列番号１６１もしくは配列番号１２７またはその等価物を含む必要に応じたシグナルペプチドコード配列；および
    配列番号１６２もしくは配列番号１６３またはそのそれぞれの等価物を含む、検出可能マーカーおよび自殺遺伝子産物コード配列または自殺遺伝子；
    を含む、請求項７３に記載のポリヌクレオチド。
  75. 配列番号５５または配列番号１２７を含むシグナルペプチドコード配列；
    配列番号５８または配列番号５９を含む軽鎖可変領域コード配列、配列番号５７を含むペプチドリンカーコード配列、および配列番号６２または配列番号６３を含む重鎖可変領域コード配列を含む抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列コード配列；
    配列番号６６を含むヒンジドメインコード配列；
    配列番号９０を含むＣＤ２８膜貫通ドメインコード配列；
    配列番号９６を含むＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域コード配列；
    配列番号６８を含むＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインコード配列；
    配列番号６９を含むＴ２Ａ自己切断性ペプチドコード配列；
    配列番号５６または配列番号１２７を含むシグナルペプチドコード配列；
    配列番号７１を含む軽鎖可変領域コード配列、配列番号５７を含むペプチドリンカーコード配列、および配列番号７２を含む重鎖可変領域コード配列を含む抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列コード配列；
    配列番号７０を含むヒト筋アルドラーゼ（ＨＭＡ）リンカーコード配列；
    配列番号７３を含む軽鎖可変領域コード配列、配列番号５７を含むペプチドリンカーコード配列、および配列番号７４を含む重鎖可変領域コード配列を含む抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列コード配列；
    配列番号７５を含むＦｃ領域コード配列；
    配列番号１４８を含むＴ２Ａ自己切断性ペプチドコード配列；
    配列番号５６もしくは配列番号１５０もしくは配列番号２００、または配列番号１２７を含むシグナルペプチドコード配列；
    配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７の少なくとも１つを含み、必要に応じて配列番号１６４を含む膜貫通ドメインコード配列をさらに含み、必要に応じて配列番号１５２または配列番号１５３を含み、配列番号１６５または配列番号１６６または配列番号５７を含む必要に応じたペプチドリンカーコード配列、および配列番号１６７を含むサイトカインコード配列；
    配列番号１５９を含むＰ２Ａ自己切断性ペプチドコード配列；
    配列番号１６１または配列番号１２７を含むシグナルペプチドコード配列；および
    配列番号１６２を含む、自殺遺伝子産物コード配列または自殺遺伝子
    を含む、請求項７３または７４に記載のポリヌクレオチド。
  76. その成分が前記ポリヌクレオチド中で５’から３’の順に記載されている、請求項７４または７５に記載のポリヌクレオチド。
  77. その成分が前記ポリヌクレオチド中で３’から５’の順に記載されている、請求項７４または７５に記載のポリヌクレオチド。
  78. 前記軽鎖可変領域コード配列の１つまたは複数が同じ抗原結合性配列の前記重鎖可変領域コード配列と入れ替えられていることを除いて、その成分が前記ポリヌクレオチド中で５’から３’または３’から５’の順に記載されている、請求項７４または７５に記載のポリヌクレオチド。
  79. 前記抗原結合性配列コード配列の少なくとも２つが入れ替えられていることを除いて、その成分が前記ポリヌクレオチド中で５’から３’または３’から５’の順に記載されている、請求項７４または７５に記載のポリヌクレオチド。
  80. 前記抗原結合性配列コード配列の少なくとも２つが入れ替えられ、前記軽鎖可変領域コード配列の１つまたは複数が同じ抗原結合性配列の前記重鎖可変領域コード配列と入れ替えられていることを除いて、その成分が前記ポリヌクレオチド中で５’から３’または３’から５’の順に記載されている、請求項７４または７５に記載のポリヌクレオチド。
  81. 表１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｆ、１ｇ、２ａ、２ｄ、２ｅ、２ｈ、２ｉ、２ｌ、２ｍ、２ｐ、２ｑ、２ｔ、２ｕ、３ａ、３ｂ、３ｃ、または３ｄのいずれか１つで開示されるヌクレオチド配列の１つまたは複数を含み、必要に応じて検出可能マーカーを含まない、請求項７３から８０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  82. 本明細書で開示される以下の配列またはその断片、Ｐ４～Ｐ９、Ｐ１１Ｅ、Ｐ１２Ｅ、Ｐ１９、Ｐ２０、Ｐ６１、Ｐ６２、またはＰ７２のヌクレオチド配列の１つまたは複数を含み、必要に応じて検出可能マーカーを含まない、請求項７３から８１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  83. 配列番号１６８または１６９のいずれか１つを含む、請求項７３に記載のポリヌクレオチド。
  84. 前記ポリペプチドの発現または前記ポリペプチドの断片の発現を方向付ける１つまたは複数の制御配列をさらに含む、請求項７３から８３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  85. 前記制御配列が、以下：プロモーター、イントロン、エンハンサー、またはポリアデニル化シグナルの１つまたは複数を含む、請求項８４に記載のポリヌクレオチド。
  86. 前記ポリヌクレオチドの複製を方向付ける１つまたは複数の制御配列をさらに含む、請求項７３から８５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  87. 以下：キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列、抗体コード配列、サイトカインコード配列、または自殺遺伝子産物コード配列のいずれか２つの間に内部リボソーム進入部位の１つまたは複数をさらに含む、請求項７３から８６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  88. さらなる検出可能マーカーおよびさらなる自殺遺伝子、必要に応じて誘導可能なカスパーゼ（ｉＣａｓｐ）自殺遺伝子の１つまたは両方をさらに含む、請求項７３から８７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  89. 請求項７３から８８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  90. 非ウイルスベクター、必要に応じてプラスミドであり、または必要に応じてレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターの群から選択されるウイルスベクターである、請求項８９に記載のベクター。
  91. 前記ポリヌクレオチドの発現または複製を方向付ける制御配列をさらに含む、請求項８９から９０のいずれか一項に記載のベクター。
  92. ２つ以上のベクターを含むベクター系であって、前記ベクターが、
    （ｉ）（１）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を認識かつ結合する抗原結合性アミノ酸配列（抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列）、
    （２）ヒンジドメイン、
    （３）膜貫通ドメイン、および
    （４）細胞内ドメイン
    を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列；
    （ｉｉ）（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）、および
    （２）Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）
    を含む二特異性抗体のアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ）ＩＬ１５またはＩＬ－２１から選択されるサイトカインの必要に応じたアミノ酸配列；および
    （ｉｖ）自殺遺伝子産物、必要に応じて切断型上皮細胞増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）またはＲＱＲ８の必要に応じたアミノ酸配列
    をコードする、ベクター系。
  93. 少なくとも２つのベクターを含み、
    第１のベクターが、
    （ｉ）（１）Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を認識かつ結合する抗原結合性アミノ酸配列（抗ＢＣＭＡ抗原結合性配列）、
    （２）ヒンジドメイン、
    （３）膜貫通ドメイン、および
    （４）細胞内ドメイン
    を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ）ＩＬ１５またはＩＬ－２１から選択されるサイトカインの必要に応じたアミノ酸配列；および
    （ｉｖ）自殺遺伝子産物、必要に応じて切断型上皮細胞増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）またはＲＱＲ８の必要に応じたアミノ酸配列
    をコードし、
    第２のベクターが、
    （ｉｉ）（１）ＮＫＧ２Ｄを認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＮＫＧ２Ｄ抗原結合性配列）、および
    （２）Ｇタンパク質連結受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）を認識かつ結合する抗原結合性配列（抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合性配列）
    を含む二特異性抗体のアミノ酸配列；
    （ｉｉｉ）ＩＬ１５またはＩＬ－２１から選択されるサイトカインの必要に応じたアミノ酸配列；および
    （ｉｖ）自殺遺伝子産物、必要に応じて切断型上皮細胞増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）またはＲＱＲ８の必要に応じたアミノ酸配列
    をコードし、
    必要に応じて、前記第１のベクターの前記自殺遺伝子産物が前記第２のベクターの前記自殺遺伝子産物とは異なる、請求項９２に記載のベクター系。
  94. 以下：請求項１から７２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７３から８８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項８９から９１のいずれか一項に記載のベクター、または請求項９２もしくは９３に記載のベクター系の１つまたは複数を含む単離された細胞。
  95. 原核生物細胞または真核生物細胞である、請求項９４に記載の単離された細胞。
  96. 真核生物細胞である、請求項９４または９５に記載の単離された細胞。
  97. 前記真核生物細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ウシ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ネズミ細胞、ウマ細胞、またはヒト細胞から選択される、請求項９５または９６に記載の単離された細胞。
  98. 前記真核生物細胞が免疫細胞、必要に応じて造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導された、必要に応じてＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、骨髄性細胞、単球、またはマクロファージである、請求項９５から９７のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  99. 前記真核生物細胞が幹細胞、必要に応じて造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項９５から９７のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  100. 二特異性抗体を分泌する、請求項９４から９９のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  101. サイトカインを分泌または発現する、請求項９４から１００のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  102. ＣＡＲを発現する、請求項９４から１０１のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  103. 検出可能マーカーおよび自殺遺伝子産物を発現する、請求項９４から１０２のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  104. 請求項９４から１０３のいずれか一項に記載の１つまたは複数の単離された細胞を含む細胞集団。
  105. 均一または不均一である、請求項１０４に記載の細胞集団。
  106. 実質的に均一である、請求項１０４または１０５に記載の細胞集団。
  107. 担体および以下：請求項１から７２のいずれか一項に記載のポリペプチド、前記ポリペプチドの１つまたは複数の断片、請求項７３から８８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項８９から９１のいずれか一項に記載のベクター、または請求項９２もしくは９３に記載のベクター系、請求項９４から１０３のいずれか一項に記載の単離された細胞、または請求項１０４から１０６のいずれか一項に記載の細胞集団の少なくとも１つを含む組成物。
  108. 前記担体が薬学的に許容される担体である、請求項１０７に記載の組成物。
  109. 以下：がん細胞に結合した請求項１から７２のいずれか一項に記載のポリペプチド、
    がん細胞に結合した請求項９４から１０３のいずれか一項に記載の単離された細胞、
    請求項９４から１０３のいずれか一項に記載の単離された細胞および二特異性抗体に結合したがん細胞、
    サイトカインおよびがん細胞に結合した請求項９４から１０３のいずれか一項に記載の単離された細胞、または
    二特異性抗体およびサイトカインにさらに結合した請求項９４から１０３のいずれか一項に記載の単離された細胞に結合したがん細胞
    の１つまたは複数を含む、単離された複合体。
  110. 請求項７３から８８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドもしくは請求項８９から９１のいずれか一項に記載のベクター、または請求項９２もしくは９３に記載のベクター系を細胞またはその集団に形質導入すること、または請求項９４から１０３のいずれか一項に記載の細胞もしくは請求項１０４から１０６のいずれか一項に記載の細胞集団を培養することを含む、ＣＡＲおよび検出可能マーカーおよび必要に応じてｔＥＧＦＲまたはＲＱＲ８から選択される自殺遺伝子産物を発現し、二特異性抗体およびサイトカインを分泌する細胞を産生する方法。
  111. 前記細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、または免疫細胞から選択される、請求項１１０に記載の方法。
  112. 前記細胞集団が以下：ＨＳＣ、ｉＰＳＣ、または免疫細胞の１つまたは複数を含む、請求項１１０または１１１に記載の方法。
  113. 前記免疫細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、骨髄性細胞、単球、またはマクロファージから選択される、請求項１１１または１１２に記載の方法。
  114. 前記免疫細胞がＨＳＣまたはｉＰＳＣから誘導される、請求項１１１から１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. がん細胞または組織を請求項９４から１０３のいずれか一項に記載の単離された細胞または請求項１０４から１０６のいずれか一項に記載の細胞集団と接触させることを含む、ＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄの一方または両方を発現するがん細胞または前記がん細胞を含む組織の増殖を阻害する方法。
  116. 前記接触させることがｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行われる、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記接触させることがｉｎ ｖｉｖｏで行われ、前記単離された細胞が処置される対象に対して自家または同種異系である、請求項１１５または１１６に記載の方法。
  118. 前記接触させることがｉｎ ｖｉｖｏで行われ、前記単離された細胞が処置される対象に対して同種異系である、請求項１１５または１１６に記載の方法。
  119. 前記がん細胞または前記組織を有効量の腫瘍縮小療法または前記がん細胞上のＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄの一方または両方の発現を上方制御する療法と接触させることをさらに含む、請求項１１５から１１８のいずれか一項に記載の方法。
  120. 請求項９４から１０３のいずれか一項に記載の単離された細胞または請求項１０４から１０６のいずれか一項に記載の細胞集団を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法。
  121. 前記対象から単離された試料中のＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄの一方または両方の発現を決定すること、ならびにＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄの一方または両方を認識し、これらに結合するＣＡＲを発現する細胞またはその集団を投与することによって、前記治療のために対象が選択される、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記発現が、前記試料を抗ＢＣＭＡ抗体もしくはその抗原結合性断片または抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合性断片の一方または両方とｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで接触させ、前記試料と前記抗体もしくはその抗原結合性断片との結合を検出することによって決定される、請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記抗体が検出可能マーカーを含む、請求項１２２に記載の方法。
  124. 請求項９４から１０３のいずれか一項に記載の単離された細胞または請求項１０４から１０６のいずれか一項に記載の細胞集団を対象に投与することを含む、処置のために選択された対象におけるがんを処置する方法。
  125. 前記対象が、前記対象のがん細胞がＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄの一方または両方を発現するか否かを介して選択される、請求項１２４に記載の方法。
  126. 前記発現が、前記対象のがん細胞を抗ＢＣＭＡ抗体もしくは抗原結合性断片または抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合性断片の一方または両方とｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで接触させることによって決定される、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記抗体が検出可能マーカーを含む、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記単離された細胞が、それを必要とする対象に対して自家または同種異系である、請求項１２０から１２７のいずれか一項に記載の方法。
  129. 前記単離された細胞が、それを必要とする対象に対して同種異系である、請求項１２０から１２７のいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記対象に、腫瘍縮小療法またはＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄの一方もしくは両方の発現を上方制御する療法を投与することをさらに含む、請求項１２０から１２９のいずれか一項に記載の方法。
  131. 前記投与が前記対象に第１線療法、または第２線療法、または第３線療法、または第４線療法として適用される、請求項１２０から１３０のいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記細胞の投与の後で、自殺遺伝子産物、必要に応じてｔＥＧＦＲ（抗ｔＥＧＦＲ抗体）またはＲＱＲ８（抗ＲＱＲ８抗体）を認識し、これらに結合する抗体を投与し、それにより、自殺遺伝子産物を発現する細胞を除去することをさらに含む、請求項１２０から１３１のいずれか一項に記載の方法。
  133. 前記自殺遺伝子産物を認識かつ結合する前記抗体の投与が、前記細胞の投与の、約４週後、または約１．５か月後、または約２か月後、または約３か月後、または約４か月後、または約５か月後、または約６か月後、または約７か月後、または約８か月後、または約９か月後、または約１０か月後、または約１１か月後、または約１２か月後、また約１．５年後である、請求項１３２に記載の方法。
  134. 前記腫瘍縮小療法が、以下：化学療法、凍結療法、温熱療法、標的療法、または放射線療法の１つまたは複数を含む、請求項１１９または１３０に記載の方法。
  135. 前記対象が哺乳動物、イヌ、ネコ、ウマ、ネズミ、またはヒト患者である、請求項１１７から１３４のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記がんが多発性骨髄腫（ＭＭ）である、請求項１１５から１３５のいずれか一項に記載の方法。
  137. 必要に応じた使用のための説明書、ならびに以下：請求項１から７２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７３から８８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項８９から９１のいずれか一項に記載のベクター、請求項９２もしくは９３に記載のベクター系、請求項９４から１０３のいずれか一項に記載の単離された細胞、請求項１０４から１０６のいずれか一項に記載の細胞集団、請求項１０７もしくは１０８に記載の組成物、または請求項１０９に記載の単離された複合体の１つまたは複数を含むキット。
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