CN111886242A - 增强的嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开的主题提供用于增强对癌症和病原体的免疫应答的方法和组合物。它涉及嵌合抗原受体(CAR)的新型设计和包含其的工程化免疫应答细胞。包含新型CAR的工程化免疫应答细胞是抗原导向的并且具有延长的持久性而不损害功能。

Description

增强的嵌合抗原受体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年12月29日提交的美国临时申请号62/612,031的优先权，其全部内容并入以供参考，并要求其优先权。
技术领域
本公开的主题提供用于增强针对癌症和病原体的免疫应答的方法和组合物。它涉及嵌合抗原受体(CAR)的新型设计和包括该嵌合抗原受体的工程化免疫应答细胞。包含新型CAR的工程化免疫应答细胞是抗原导向的，并且具有延长的持久性而不会损害功能。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)疗法在针对血液系统恶性肿瘤方面取得了巨大的临床成功(PMID：23515080)。它基于具有抗原识别和信号转导功能两者的合成受体(PMID：20467460)。CAR中的单链可变片段(scFv)保留了原始单克隆抗体重链和轻链可变区的抗原识别特异性。同时，CAR构建体的信号转导很大程度上取决于原始免疫受体的信号传导结构域。目前，临床试验中所有版本的第二代CAR都具有两种信号传导能力/方式，因为它们包含来自两种免疫受体的结构域，一种是CD3ζ，另一种是共刺激受体，例如CD28或41BB(PMID：26129802)。从本质上讲，它会将由单独的受体转导的两个信号合并为一个合成受体。据推测，CAR中的信号转导可能类似于CD3ζ和CD28/41BB中的信号转导。
CD3ζ是多聚体T细胞抗原受体(TCR)复合体的一部分，其与抗原结合并跨质膜将该结合转导为细胞内信号。TCRαβ(或TCRγδ)亚基通过其特异性细胞外区域识别抗原的同时，CD3ζ通过其三个保守的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)(PMID：20516133)在复合物中主要执行信号转导功能。首先基于序列同源性鉴定，ITAM由两个连续的YxxL/I基序组成，这些基序由限定数量的氨基酸(YxxL/I-X6-8-YxxL/I)(PMID：2927501)隔开。ITAM通常在造血细胞表达的受体中发现，尤其是在TCR信号传导的背景下得到充分研究。TCR与肽-MHC的结合导致Src家族激酶Lck的激活，该激酶使CD3ζ中三个ITAM的每个中的两个酪氨酸残基磷酸化(PMID：25861978)。然后，每个双磷酸化的ITAM获得结合Syk家族激酶ZAP-70的两个串联SH2结构域的能力。这种相互作用使ZAP-70紧密靠近Lck，导致通过Lck使ZAP-70磷酸化和活化。活化的ZAP-70进一步磷酸化其下游靶标，例如衔接蛋白LAT和SLP-76。磷酸化的LAT和SLP-76为许多其它蛋白质例如PLC-γ、Grb2/Sos、Gads和Itk、Vav和Nck提供支架，最终导致钙动员、Ras/Erk激活和肌动蛋白细胞骨架重排，最终激活基因表达(PMID：20516133)。因此，CD3ζ中的三个ITAM不仅是TCR信号传导中的信号传导部分，也是主要的。
另一方面，CD28不包含任何ITAM。相反，其胞质结构域包含一个YMNM基序，一旦CD28与其配体CD80/CD86结合，YMNM基序就会被磷酸化，可以与PI3K和Grb2/Gads的p85亚基结合(PMID：20534709)。此外，CD28富含脯氨酸的区域可与Itk、Tec、Lck、Grb2/Vav和细丝蛋白A(PMID：20534709)相互作用。因此，通过CD3ζ的抗原结合引发的TCR信号传导和CD80/86结合引发的CD28信号传导共享许多共同的参与者，例如Grb2、Vav、Gads、Lck、Itk，这使得这两种通路之间的串扰成为可能。此外，这两种通路的激活都发生在免疫突触处质膜附近组装的信号传导复合物中，从而使来自这两种通路的信号传导分子在空间上物理结合在一起。最后但同样重要的是，CD28诱导的钙信号传导发生在TCR启动的细胞内钙升高之后的几秒钟(如果不是更快)，反映了两条通路在时间上的邻近/接近(PMID：18848472)。
发明内容
本公开提供与目的抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)。CAR可以结合肿瘤抗原或病原体抗原。在某些非限制性实施方式中，CAR包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的全部或部分，其中ITAM为ITAM1、ITAM2和ITAM3。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏ITAM2或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还缺乏ITAM3或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还缺乏ITAM1或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏ITAM1或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还缺乏ITAM3或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏ITAM3或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含ITAM2或其部分的缺失。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还包含ITAM3或其部分的缺失。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还包含ITAM1或其部分的缺失。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含ITAM1或其部分的缺失。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还包含ITAM3或其部分的缺失。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含ITAM3或其部分的缺失。
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还缺乏全部或部分的富碱性延伸(BRS)区，其中BRS区是BRS1、BRS2和BRS3。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS2或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还缺乏BRS3或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还缺乏BRS1或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS1或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还缺乏BRS3或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS3或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS1或其部分、BRS2或其部分以及BRS3或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含BRS2或其部分的缺失。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还包含BRS3或其部分的缺失。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还包含BRS1或其部分的缺失。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含BRS1或其部分的缺失。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还包含BRS3或其部分的缺失。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含BRS3或其部分的缺失。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含BRS1或其部分、BRS2或其部分以及BRS3或其部分的缺失。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含ITAM2、ITAM3、BRS2和BRS3的缺失。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏ITAM2、ITAM3、BRS2和BRS3。在某些实施方式中，CAR包含SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏富碱性延伸(BRS)区的全部或部分，其中BRS区是BRS1、BRS2和BRS3。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS2或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还缺乏BRS3或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还缺乏BRS1或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS1或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还缺乏BRS3或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS3或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS1或其部分、BRS2或其部分以及BRS3或其部分。
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含选自BRS1变体、BRS2变体和BRS3变体的BRS变体，其中该BRS变体包含一个或多个功能丧失的突变。
在某些实施方式中，以上公开的各种CAR中的任一种进一步包含铰链/间隔区，其中铰链/间隔区包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD40多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、CD84多肽、CD166多肽、CD8a多肽、CD8b多肽、ICOS多肽、ICAM-1多肽、CTLA-4多肽、CD27多肽、CD40/My88肽、NKGD2肽、或其组合。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD166多肽。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸489至527的CD166多肽。
在某些实施方式中，以上公开的各种CAR中任一种的跨膜结构域包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD40多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、CD84多肽、CD166多肽、CD8a多肽、CD8b多肽、ICOS多肽、ICAM-1多肽、CTLA-4多肽、CD27多肽、CD40/My88肽、NKGD2肽、或其组合。在某些实施方式中，跨膜结构域包含CD166多肽。在某些实施方式中，跨膜结构域包含具有SEQ ID NO：3的氨基酸528至527的CD166多肽。
在某些实施方式中，跨膜结构域和铰链/间隔区来源于相同分子。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD28多肽，并且跨膜结构域包含CD28多肽。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD84多肽，且跨膜结构域包含CD84多肽。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD166多肽，且跨膜结构域包含CD166多肽。在某些实施方式中，CAR包含SEQ ID NO：3的氨基酸489至553。
在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD8a多肽，且跨膜结构域包含CD8a多肽。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD8b多肽，且跨膜结构域包含CD8b多肽。
在某些实施方式中，跨膜结构域和铰链/间隔区来源于不同的分子。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD28多肽，而跨膜结构域包含ICOS多肽。
在某些实施方式中，以上公开的各种CAR中的任一种的细胞内信号传导结构域还包含共刺激性信号传导结构域。在某些实施方式中，共刺激信号传导结构域包含CD28多肽。
本公开的主题还提供嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、铰链/间隔区、跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中修饰的CD3ζ多肽包括包含一个或多个功能丧失的突变的ITAM变体，其中ITAM变体选自ITAM1变体、ITAM2变体和ITAM3变体。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD40多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、CD84多肽、CD166多肽、CD8a多肽、CD8b多肽、ICOS多肽、ICAM-1多肽、CTLA-4多肽、CD27多肽、CD40/My88肽、NKGD2肽、或其组合。在某些实施方式中，ITAM2变体具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，ITAM3变体具有SEQID NO：33所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，CAR包含CD166多肽的铰链/间隔区和CD166多肽的跨膜结构域。在某些实施方式中，CAR包含SEQ ID NO：3的氨基酸489至553。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽具有SEQ ID NO：43的氨基酸374至485。在某些实施方式中，CAR包含氨基SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列。
本公开的主题还提供一种包含本文公开的CAR的免疫应答细胞。在某些实施方式中，CAR是重组表达的。在某些实施方式中，CAR由载体表达。在某些实施方式中，将CAR置于免疫应答细胞的内源性基因座处。在某些实施方式中，内源性基因座是TRAC基因座、TRBC基因座或TRGC基因座。在某些实施方式中，内源性基因座是TRAC基因座。在某些实施方式中，CAR的放置破坏或消除TCR的内源性表达。
本公开的主题还提供包含两个或更多个CAR的免疫应答细胞。在某些实施方式中，免疫应答细胞包含：a)第一CAR，其包含与第一抗原结合的第一细胞外抗原结合结构域，第一跨膜结构域和第一细胞内信号传导结构域；和b)第二CAR，其包含与第二抗原结合的第二细胞外抗原结合结构域，第二跨膜结构域和第二细胞内信号传导结构域，其中第一CAR是上文公开的CAR或第一细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，该修饰的CD3ζ多肽包含一个或多个ITAM变体，该ITAM变体包含一个或多个功能丧失的突变，其中一个或多个ITAM变体中的每一个独立地选自ITAM1变体、ITAM2变体和ITAM3变体。在某些实施方式中，第一CAR进一步包含第一铰链/间隔区。在某些实施方式中，第二CAR进一步包含第二铰链/间隔区。在某些实施方式中，第一和第二铰链/间隔区中的每一个可以独立地选自本文公开的铰链/间隔区中的任一个。
在某些实施方式中，第二CAR是以上公开的CAR。在某些实施方式中，第二CAR的第二细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含一个或多个ITAM变体，该ITAM变体包含一个或多个功能丧失突变，其中该ITAM变体选自ITAM1变体、ITAM2变体和ITAM3变体。在某些实施方式中，第二CAR的第二细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其与包含在第一CAR的第一细胞内信号传导结构域中的修饰的CD3ζ多肽相同。在某些实施方式中，第二CAR的第二细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其不同于包含在第一CAR的第一细胞内信号传导结构域中的修饰的CD3ζ多肽。在某些实施方式中，第二CAR的第二细胞内信号传导结构域包含天然CD3ζ多肽。
在某些实施方式中，第一CAR的第一细胞内信号传导结构域与第二CAR的第二细胞内信号传导结构域相同。在某些实施方式中，第一CAR的第一细胞内信号传导结构域不同于第二CAR的第二细胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，第一抗原不同于第二抗原。
在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2变体和ITAM3变体，并且第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2或其部分的缺失和ITAM3或其部分的缺失。
在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2变体和ITAM3变体，并且第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体。
在某些实施方式中，细胞还包含第三CAR，其包含与第三抗原结合的第三细胞外抗原结合结构域，第三跨膜结构域和第三细胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2变体和ITAM3变体，第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2或其部分的缺失和ITAM3或其部分的缺失，且第三细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体。
在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2或其部分的缺失和ITAM3或其部分的缺失，第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2或其部分的缺失和ITAM3或其部分的缺失，且第三细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体。
在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2或其部分的缺失和ITAM3或其部分的缺失，第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体，且第三细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体。
在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体，第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体，且第三细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体。
在某些实施方式中，细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、人胚胎干细胞和可从中分化出淋巴样细胞的多能干细胞。在某些实施方式中，细胞是T细胞。在某些实施方式中，T细胞选自细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞和自然杀伤T(NKT)细胞。在某些实施方式中，免疫应答细胞是髓样细胞，例如巨噬细胞。在某些实施方式中，所述免疫应答细胞是自体的。在某些实施方式中，所述抗原是肿瘤抗原。在某些实施方式中，肿瘤抗原选自CD19、MUC16、MUC1、CA1X、CEA、CD8、CD7、CD10、CD20、CD22、CD30、CLL1、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD133、CD138、EGP-2、EGP-40、EpCAM、erb-B2,3,4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、叶酸受体a、GD2、GD3、HER-2、hTERT、IL-l3R-a2、K轻链、KDR、LeY、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、ERBB2、MAGEA3、p53、MART1、GP100、蛋白酶3(PR1)、酪氨酸酶、存活蛋白、hTERT、EphA2、NKG2D配体、NY-ES0-1、瘤胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、ROR1、TAG-72、VEGF-R2、WT-1、BCMA、CD123、CD44V6、NKCS1、EGF1R、EGFR-VIII和CD99、CD70、ADGRE2、CCR1、LILRB2、PRAME、CCR4、CD5、CD3、TRBC1、TRBC2、TIM-3、整合素B7、ICAM-1、CD70、Tim3、CLEC12A和ERBB。在某些实施方式中，所述抗原是CD19。
本公开的主题还提供一种药物组合物，其包含有效量的本文公开的免疫应答细胞和药学上可接受的赋形剂。在某些实施方式中，药物组合物用于治疗肿瘤。
本公开的主题还提供一种减轻受试者的肿瘤负荷的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的本文公开的免疫应答细胞或药物组合物。本公开的主题还提供一种方法，该方法包括向该受试者施用有效量的免疫应答细胞或其药物组合物，其中该免疫应答细胞包含嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、铰链/间隔区、跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中修饰的CD3ζ多肽包含一个或多个ITAM变体，该ITAM变体包含一个或多个功能丧失突变，其中一个或多个ITAM变体中的每一个独立地选自ITAM1变体、ITAM2变体和ITAM3变体。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含ITAM2变体和ITAM3变体。在某些实施方式中，ITAM2变体和ITAM3变体之一或两者包含两个功能丧失突变。在某些实施方式中，ITAM2变体具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，ITAM3变体具有SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，一个或多个功能丧失突变位于酪氨酸氨基酸残基处。在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域还包含共刺激信号传导结构域。在某些实施方式中，共刺激信号传导结构域包含CD28多肽。
在某些实施方式中，该方法减少了肿瘤细胞的数量。在某些实施方式中，该方法减小肿瘤大小。在某些实施方式中，该方法根除受试者中的肿瘤。
本公开的主题还提供治疗或预防肿瘤的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的免疫应答细胞或药物组合物。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用有效量的免疫应答细胞或其药物组合物，其中免疫应答细胞包含嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、铰链/间隔区、跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中该修饰的CD3ζ多肽包含一个或多个ITAM变体，该ITAM变体包含一个或多个功能丧失突变，其中一个或多个ITAM变体中的每一个独立地选自ITAM1变体、ITAM2变体和ITAM3变体。
本公开的主题还提供一种治疗患有肿瘤复发的受试者的方法，其中该受试者接受过包含抗原识别受体的免疫应答细胞，其中抗原识别受体包含4-1BB共刺激信号。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的免疫应答细胞或药物组合物。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用有效量的免疫应答细胞或其药物组合物，其中免疫应答细胞包含嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、铰链/间隔区、跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中该修饰的CD3ζ多肽包含一个或多个ITAM变体，该ITAM变体包含一个或多个功能丧失突变，其中该一个或多个ITAM变体中的每一个独立地选自ITAM1变体、ITAM2变体和ITAM3变体。在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域还包含共刺激信号传导结构域。在某些实施方式中，共刺激信号传导结构域包含CD28多肽。
在某些实施方式中，肿瘤(neoplasm)或瘤(tumor)选自血液癌症、B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤和卵巢癌。在某些实施方式中，该肿瘤是B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病或非霍奇金氏淋巴瘤，并且该CAR与CD19结合。在某些实施方式中，肿瘤是CD19+ALL。在某些实施方式中，肿瘤包含具有低表达水平肿瘤特异性抗原的肿瘤细胞。
本公开的主题还提供一种产生抗原特异性免疫应答细胞的方法，该方法包括将编码本文公开的CAR的核酸序列引入免疫应答细胞中。在某些实施方式中，该核酸序列包含在载体中。在某些实施方式中，该载体是逆转录病毒载体。
本公开的主题还提供一种编码本文公开的CAR的分离的核苷酸。在某些实施方式中，该分离的核苷酸还包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：47所示的核苷酸序列。
本公开的主题还提供一种包含本文公开的CAR的核酸组合物。在某些实施方式中，该核酸序列包含在载体中。在某些实施方式中，该载体是逆转录病毒载体。
本公开的主题还提供一种包含本文公开的核酸组合物的载体。
本公开的主题还提供一种试剂盒，其包含本文公开的CAR、免疫应答细胞、药物组合物、核酸组合物或载体。在某些实施方式中，试剂盒还包含用于治疗和/或预防肿瘤、病原体感染、自身免疫性疾病或同种异体移植的书面说明书。
附图说明
可以结合附图来理解以实施例的方式给出的以下详细描述，但并不旨在将本公开的主题限于所描述的特定实施方式。
图1描述了野生型、突变和截短的1928ζ(1928z)CAR的细胞质区域。A)不同的1928ζ(1928z)CAR的细胞质区域。将原始1928ζCAR的ζ链突变，以构建具有独特ζ信号传导结构域的1928ζCAR T细胞。从膜的近端到远端方向，ζ结构域中的三个ITAM基序分别命名为ITAM1、ITAM2和ITAM3。在1XX、X2X、XX3和X23 CAR中，相应ITAM中的两个酪氨酸残基(Y)点突变为所示ITAM的两个苯丙氨酸残基(F)。在D12和D23中，进行缺失突变以移除ITAM1和ITAM2(D12)或ITAM2和ITAM3(D23)。B)与原始的1928z结构相比具有改善的抗肿瘤功效的1928z CAR的细胞质区域。在1XX中，原始1928ζCAR的ζ链在ITAM2和ITAM3中是点突变的(从酪氨酸(T)突变为苯丙氨酸(F))，而氨基酸的富碱性延伸(BRS-1，-2，-3)仍然保留。在D12和D23中，删除了ITAM1和ITAM2(D12)或ITAM2和ITAM3(D23)；D23包括一个BRS区(BRS-1)，而D12中不存在BRS。C)代表性流式细胞术分析，其显示1928ζ和所示1928ζ突变体的CAR和LNGFR的表达水平。UT：未转导的T细胞用作对照。
图2A-2B描述了包含新型CAR设计或对照1928ζ(1928z)CAR的T细胞的治疗效力。1928ζ(1928z)CAR T细胞的治疗效力可通过CAR构建体中CD3ζ链的突变而提高。用0.05×106CAR T细胞治疗的荷NALM-6小鼠的肿瘤负荷(平均辐射)(n＝9-10，来自2个独立实验的汇总数据)。A)在其原始CAR位置具有未修饰的CD3ζ，ITAM3(XX3)，ITAM2(X2X)或ITAM2和ITAM3(X23)的组合以及剩余的ITAM基序的突变的1928ζ突变体的体内应答。B)用1928ζ突变体治疗的NALM-6小鼠的肿瘤负荷，该突变体由在第一位置的一个单个未突变的CD3ζ序列(对于D12为ITAM3，对于D23为ITAM1)和剩余的ζ链结构域的缺失组成。
图3A-3B描述了用相同剂量的表达1928ζ(1928z)对照或新型CAR构建体的CAR T细胞处理后的存活。用5×104CAR+T细胞治疗荷Nalm-6小鼠。A)和B)小鼠存活的Kaplan-Meier分析，比较了单剂量的1928z WT和1928z突变体XX3，X23和X2X(A)或1928z突变体D12，D23和1XX(B)的体内功效。来自2个独立实验的汇总数据，代表n＝10只小鼠。对照是指未治疗的小鼠(n＝3)。*p<0.05(对数秩Mantel-Cox检验)。
图4描述了荷瘤小鼠中CAR T细胞的计数。用5×104CAR T细胞(每组n＝10；来自2个独立实验的汇总数据)治疗荷NALM-6小鼠，并在输注后第17天实施安乐死；通过FACS分析和计数骨髓CAR T细胞和NALM-6细胞。所有数据均为平均值±SD。*P<0.05，***p<0.001，****p<0.0001(未配对学生t检验(student’s t test))。
图5A-5C描述了T细胞分化的分析。输注CAR后10天，小鼠骨髓中CD4+和CD8+CAR T细胞的表型(数据为平均值±SEM，每个柱代表n＝5只小鼠)。A)与1928ζWT相比，所示1928ζ突变体在CAR T细胞上CD62L/CD45RA表达的百分比。CD4+和CD8+CAR T细胞中B)中央记忆(CD62L+CD45RA-)和C)效应细胞(CD62L-CD45RA+)的百分比。将数据与1928ζWT进行比较。**P<0.01，***P<0.001(未配对学生t检验)。
图6描述了T细胞施用后10天和17天，小鼠骨髓中中央记忆CD4+CAR细胞(CAR+CD4+CD62L+CD45RA-)和表达IL7R的CD4+CAR T细胞的细胞数量分析(数据是平均值±SEM，每个柱代表n＝5只小鼠)。**P<0.01，***P<0.001(未配对学生t检验)。
图7描述了T细胞耗尽的分析。用5×104CAR T细胞(每组n＝9-10；来自两个独立实验的汇总数据)治疗荷NALM-6小鼠，并在CAR输注后第10天实施安乐死；通过FACS分析骨髓CAR T细胞。输注CAR后10天，通过FACS量化表达耗尽标志物的CD4+和CD8+CAR T细胞的百分比。数据是平均值±SEM，每个点代表一只小鼠。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，(未配对学生t检验)。
图8描述了CAR T细胞效力的体外功能测试。A)使用EL4-CD19作为靶标，通过4小时51Cr释放测定法测定的细胞毒性活性(n＝2个独立实验，重复三次，数据为平均值±SEM)。B)和C)使用表达萤火虫荧光素酶(FFL)的NALM-6作为靶标的18小时生物发光测定法的细胞毒活性。数据为平均值±SEM(n＝5个独立实验，重复三次)。实验在效应细胞在辐照的3T3-CD19上扩增后一周进行。
图9描述了CAR T细胞的体外细胞因子谱。用3T3-CD19刺激第二轮后通过细胞内细胞因子染色18小时确定的具有单(A)和双阳性Th1细胞因子阳性表达的CD4+和CD8+CAR T细胞的百分比(数据为平均值±SEM并与1928ζWT进行比较，配对学生t检验，n＝3-5个独立实验)。*P<0.05，**P<0.01。
图10描述了带有不同铰链(H)和跨膜结构域(TM)的1XX CAR的示意图。流式细胞术显示分别使用山羊IgG抗小鼠IgG(F(ab')2)片段和抗LNGFR的CAR和LNGFR表达。含有CD28/CD28 H/TM区的1928z-LNGFR CAR用作对照。
图11描述了每周刺激后从106细胞/ml CAR T细胞开始的积聚CAR T细胞计数。箭头指示刺激时间点。数据是平均值±SEM。n＝3。
图12描述了CAR T细胞的体外细胞毒性。在第三次刺激(D21)结束时使用4小时51Cr释放测定法测量CAR T细胞的细胞毒活性。T细胞和EL-4-CD19+靶细胞以不同的效应子:靶标比率(E:T)使用。数据是平均值±SEM。数据代表4个独立实验。
图13描述了使用NOD.Cg PrkdcscidI12rgtmlWj1/SzJ(NSG)小鼠的不同H/TM CART细胞的体内抗肿瘤能力。上图，在肿瘤负荷之后，每周定量生物发光信号。指示每种治疗的CAR构建体。下图，相同实验的小鼠的无肿瘤存活的Kaplan-Meier分析。使用对数秩(Mantel-Cox)检验进行存活比较，每组n＝7只小鼠。
图14描述了用于新型CAR构建体的示例性去免疫策略。J1和J2：没有来自WT接合点的修饰。J3：用Lys(K)取代CD28的最后一个氨基酸Ser(S)。J：接合点；X：点突变。
图15描述了经CAR T细胞治疗的小鼠的各种存活曲线。向NSG小鼠尾静脉注射5×105FFLuc-GFP NALM6细胞(前B ALL细胞系)，四天后再注射2×105 19BBz CAR T细胞。第一次T细胞注射(无效剂量仅延迟肿瘤进展)后十天，再次向小鼠注射19BBz CAR T细胞或交替注射1928z或(5×105/小鼠)。箭头指示输注CAR T细胞的时间。上图，肿瘤负荷后，每周定量生物发光信号。下图，相同实验的小鼠的无肿瘤存活的Kaplan-Meier分析。使用对数秩(Mantel-Cox)检验进行存活比较，每组n＝7只小鼠。
图16A-16E描述了1928ζiTAM差异地调节CAR T细胞效力。A)野生型和突变的1928ζCAR的细胞质区域。1928ζCAR的ζ链在其三个ζ信号传导结构域(从膜近端方向到膜远端方向命名为ITAM1、ITAM2和ITAM3)的一个或两个中发生了突变。在1XX，X2X，XX3和X23 CAR中，对于所示ITAM，将各自ITAM中的两个酪氨酸(Y)点突变为两个苯丙氨酸(F)。B)流式细胞术分析，显示了A)中描述的构建体的CAR和LNGFR的表达水平。数据代表至少五个具有相似结果的独立实验。未转导的T(UT)细胞用作对照。C)-E)用5×104CAR+T细胞治疗Nalm6小鼠。C)显示了小鼠的肿瘤负荷(平均辐射度)，比较了野生型1928ζ，1XX，X2X，XX3和X23的体内功效(每组n＝10只小鼠，结果是两个独立实验的汇总)。对照是指未治疗的小鼠(n＝6)。D)输注后第17天小鼠的骨髓中CAR T细胞的数目(结果来自两个独立实验汇总，每组n＝10只小鼠)。E)在CAR输注后10天，小鼠骨髓中CAR T细胞的表型，由TCM和TEFF细胞的百分比说明。显示了两个独立实验的代表性结果(每组n＝5只小鼠)。所有数据均为平均值±s.e.m。在D)和E)中，P值通过两尾曼恩-惠特尼(Mann-Whitney)U检验确定。
图17A-17E描述了1928ζCAR中的iTAM位置决定了抗肿瘤功效。A)1928ζCAR的细胞质结构域，其CD3ζ链缺失。在D12中，缺失突变删除了ITAM1和ITAM2，而在D23中删除了ITAM2和ITAM3。B)流式细胞术分析，显示了所示构建体的CAR和LNGFR的表达水平。数据代表至少五个具有相似结果的独立实验。UT，未转导的T细胞用作对照。C)-E)用5×104CAR+T细胞治疗荷Nalm6小鼠。C)用野生型1928ζ，D12或D23(野生型1928ζ和D23：n＝10；D12：n＝9；来自两个独立实验的汇总数据)治疗的小鼠的肿瘤负荷(平均辐射度)。D)输注后第17天小鼠的骨髓中CAR T细胞的数目(结果来自两个独立实验，每组n＝10只小鼠)。E)在CAR注入后10天，小鼠骨髓中CAR T细胞的表型，由TCM和TEFF细胞的百分比说明(来自两个独立实验的汇总数据，每组n＝10只小鼠)。所有数据均为平均值±s.e.m。在D)和E)中，P值通过两尾曼恩-惠特尼U检验确定。
图18A-18H描述了TRAC-1XX通过降低T细胞耗尽并发展为具有有效召回应答的长寿命记忆T细胞来增强T细胞效能。A)-D)，用1×105或5×105TRAC-CAR T细胞治疗荷Nalm6小鼠。A)与TRAC-1928ζ(TRAC-1928ζ和TRAC-XX3：n＝每组5只小鼠；TRAC-1XX：n＝7)相比，用1×105TRAC-1XX或TRAC-XX3治疗的小鼠的生存的Kaplan-Meier分析。对照是指未治疗的小鼠(n＝3)。通过单侧对数秩Mantel-Cox检验确定P值。B)用5×105(n＝每组5只小鼠)或l×105(TRAC-1928ζ：n＝10只小鼠，TRAC-1XX：n＝5只小鼠)TRAC-CAR T细胞治疗的小鼠生存的Kaplan-Meier分析。通过单侧对数秩Mantel-Cox检验确定P值。C)和D)确定了TRAC-1XX和TRAC-XX3的细胞数量(C)和耗尽标志物PD1+TIM3+LAG3+在骨髓CAR T细胞上的表达(D)，并与TRAC-1928ζ进行了比较。数据显示为平均值±s.e.m.，每个符号代表一只小鼠(n＝每组5只小鼠)。P值通过两尾曼恩-惠特尼U检验确定。E)-H)荷Nalm6小鼠用5×105TRAC编辑的幼稚T细胞治疗，并用Nalm6细胞(n＝每组5只小鼠)再攻击，如箭头所示。对照未进行进一步的肿瘤攻击(TRAC-1928ζ：n＝6只小鼠；TRAC-1XX：n＝7只小鼠)。E)小鼠的肿瘤负荷(平均辐射度)，比较在再次肿瘤攻击与未再次肿瘤攻击后TRAC-1928ζ和TRAC-1XX的体内功效。所有数据均为平均值±s.e.m。在CAR施用(TRAC-1928ζ：n＝4；TRAC-1XX：n＝5)后第59天，采用两尾未配对的学生t检验对肿瘤负荷进行统计学分析。F)和G)在CAR施用(再次攻击：TRAC-1928ζ：n＝4只小鼠，TRAC-1XX：n＝5只小鼠；无再次攻击：n＝每组5只小鼠)后63天所治疗的小鼠骨髓中的总CAR T细胞数(F)，TCM，TEFF和IL7R+CAR T细胞(G)数量。所有数据均为平均值±s.e.m。采用两尾未配对的学生t检验进行统计分析。H)耗尽标志物PD1+TIM3+LAG3+在骨髓CAR T细胞上的表达。所有数据均为平均值±s.e.m。P值由两尾未配对学生t检验确定。
图19A-19H描述了1928ζCAR中的CD3ζITAM突变建立了独特的转录特征。CD19+靶细胞刺激后24小时，CD8+TRAC-1928ζ，TRAC-1XX和TRAC-XX3 CAR T细胞(最初分类的幼稚T细胞)的基因表达谱。A)由GSEA使用MSigDB C7基因本体集确定的在1928ζ对比1XX和1928ζ对比XX3中(n＝每组3个重复)显著上调或下调的基因集的归一化富集得分。对于所有通路，错误发现率(FDR)q≤0.02。GSE数据集以括号表示。Stim，刺激的。B)分选的效应子和幼稚/记忆T细胞之间的差异表达基因(FDR q<0.05)(左)(n＝每组6个重复)和热图证明了CAR T细胞相同基因的表达谱(n＝每组3个重复)。TF，转录因子。C)涉及表型和功能性T细胞特征的显著富集基因集(FDR q≤0.03)的归一化富集得分，通过GSEA分析鉴定比较TRAC-1928ζ与TRAC-XX3，TRAC-1928ζ与TRAC-1XX和TRAC-1XX与TRAC-XX3(n＝每组3个重复)。JAK-STAT，Janus激酶信号转导子和转录激活子。D)1928ζCAR T细胞中定义的CD3z ITAM突变对效应子和记忆相关T细胞属性的影响。1XX CAR T细胞显示出平衡的效应子和记忆特征。
图20A-20E描述了ITAM突变的1928ζCAR对体外T细胞功能，T细胞分化和体内抗肿瘤活性的影响。A)在效应细胞在经辐照的3T3-CD19上扩增后1周，通过4小时51Cr释放测定法测定的细胞毒性活性(数据显示为n＝2个三次重复进行的独立实验的平均值)。B)每周用CD19+靶细胞刺激后，指示的CAR T细胞的累计细胞计数(n＝3个独立实验)。所有数据均为平均值±s.e.m.。P值是通过两尾配对的学生t检验计算得出的。C)用5×10 4CAR+T细胞治疗荷NALM6的小鼠。Kaplan-Meier生存分析，比较了野生型1928ζ或指定的1928ζ突变体(n＝10小鼠，来自两个独立实验的汇总数据)的体内功效。对照(Ctl)指未治疗的小鼠(n＝6)。通过单侧对数秩Mantel-Cox检验确定P值。D)在用CD19+靶细胞进行第二次刺激后48小时，通过中央记忆(CD62L+CD45RA-)和效应记忆(CD62L-CD45RA-)CD4+CAR T细胞百分比说明的CAR T细胞表型。进行两尾配对的学生t检验，数据表示为平均值±s.e.m.，n＝4个独立实验。E)用5×104CAR T细胞治疗荷NALM6小鼠，并在输注后第10天安乐死；通过FACS分析骨髓CAR T细胞。指示的CAR T细胞表型的代表性流式细胞术分析通过CD62L/CD45RA表达确定，门控在CAR+CD4+T细胞上。至少n＝2个独立实验中代表每组5只小鼠，结果相似。
图21A-21C描述了与野生型1928ζ相比在1928ζ突变体中的效应子功能的分析。A)使用表达FFL的NALM6细胞作为靶标的18小时生物发光测定法，与野生型1928ζ相比，1928ζ突变体的细胞毒活性。效应细胞在CD19+靶细胞上扩增后1周进行实验。数据为均值±s.e.m.(n＝4个三次重复的独立实验)。*P<0.05(21：P＝0.0273，2-1：P＝0.0387，2-2：P＝0.0125)，**P＝0.0018，由三次重复的平均值的两尾配对的学生t检验计算得出。B)和C)在用表达CD19的靶细胞第二次刺激后，CD8+CAR T细胞上的颗粒酶B(GrB)表达(n＝4个独立实验)(B)和CD4+和CD8+CAR T细胞的细胞因子分泌(C)。所有数据均为平均值±s.e.m.(IFNγ和IL2，n＝4；TNFα，n＝5个独立实验)。将未刺激的(Unstim.)野生型1928ζ细胞用作对照。通过两尾配对的学生t检验确定了与1928ζ相比的显著差异。
图22A-22D描述了1928ζCAR中ITAM位置对T细胞功能和治疗效力的影响。A)在效应细胞在经辐照的3T3-CD19上扩增后1周，通过4小时51Cr释放测定法测定的细胞毒性活性(数据为n＝2个重复三次的独立实验的平均值)。B)每周用CD19+靶细胞刺激后，指示的CAR T细胞的积聚细胞计数(n＝3个独立实验)。所有数据均为均值±s.e.m.；P值是通过两尾配对的学生t检验计算得出的。C)通过用表达FFL的NALM6细胞作为靶标的18小时生物发光测定法确定的与野生型1928ζ相比的D12和D23的细胞毒性活性。在效应细胞在CD19+靶细胞上扩增后1周进行实验。数据为均值±s.e.m.(n＝4个三次重复的独立实验)。P值是通过三次重复的平均值的两尾配对学生t检验计算得出的，并且对于所有E/T比，D12/D23与野生型1928ζ之间没有显著差异(P>0.05)。D)用5×104CAR T细胞治疗荷NALM6小鼠。Kaplan-Meier分析野生型1928ζ或所示1928ζ突变体(n＝每组10只小鼠)治疗的小鼠的存活。对照是指未治疗的小鼠(n＝6)。通过单侧对数秩Mantel-Cox检验计算P值。
图23A-23B描述了1928ζCAR中iTAM位置对体外效应子功能的影响。A)在CD8+CAR T细胞上的颗粒酶B(GrB)表达(n＝5个独立实验)。B)用表达CD19的靶细胞第二次刺激后，CD4+和CD8+CAR T细胞的细胞因子分泌。使用未刺激的野生型1928ζ细胞作为对照。所有数据均为平均值±s.e.m.(IFNγ和IL2，n＝4；TNFα，n＝5个独立实验)。每个单独的符号表示一个样本。通过两尾配对的学生t检验确定了与1928ζ相比的显著差异。
图24A-24F描述了TRAC编码的1928ζ突变体的T细胞分化和效应子功能。用1×105CAR T细胞治疗荷NALM6小鼠，并在输注后第17天实施安乐死。通过FACS分析并计数骨髓和脾脏CAR T细胞。A)CAR基因整合到TRAC基因座后4天，CAR表达的直方图和流式细胞术分析。代表四个独立实验，结果相似。B)CD4+和CD8+CAR T细胞的细胞数，C)CD8+TCM(CD62L+CD45RA-)的百分比以及CD62L/CD45RA在骨髓CD8+CAR T细胞上的表达的流式细胞术分析(在一个独立的实验中，n＝5只小鼠/组的代表)。D)CAR+IL7R+与肿瘤细胞的比例以及小鼠骨髓中IL7R+CAR T细胞的流式细胞术分析。E)计数小鼠脾脏中的CAR T细胞。在B)，C)，D)和E)中数据是平均值±s.e.m.，进行了两尾曼恩-惠特尼分析，n＝5只小鼠/每组。F)TRAC-1XX，TRAC-XX3和野生型TRAC-1928ζ的细胞毒活性(以表达FFL的NALM6为靶标的18小时生物发光测定法)。在转导后4天，每周用CD19抗原刺激的扩增后1周和3周进行实验。符号表示三次重复的平均值(一个代表性的供体)。
图25A-25G描述了与野生型TRAC-1928ζ相比，TRAC-1928ζ突变体的体内T细胞耗尽。A)荷NALM6小鼠用1×105CAR T细胞治疗，并在输注后第17天安乐死。FACS分析CAR+T细胞上的耗尽标志物的表达，在一个独立实验中代表n＝5只小鼠/组。B)-G)荷NALM6小鼠用1×105TRAC编辑的幼稚T细胞治疗。施用CAR后16天(B和C)和36天(E和G)，将来自骨髓和脾脏的TRAC-1928ζ和TRAC-1XX细胞暴露于NALM6或PMA/离子霉素(Iono)的离体刺激下。通过表达百分比和流式细胞术分析说明细胞因子和颗粒酶B(GrB)/CD107a在CART细胞上的表达，代表两个独立实验中n＝3只小鼠(B)和n＝3次重复(G)。与NALM6共培养10小时后，耗尽标志物PD1+LAG3+在CAR T细胞上的表达(D)和TRAC-1XX(第36天)的细胞毒活性(F)。所有数据均为平均值±s.e.m.，n＝3只小鼠/组。
图26A-26G描述了与野生型TRAC-1928ζ相比在TRAC-1XX中的T细胞记忆形成。用1×105或5×105TRAC编辑的幼稚T细胞治疗荷NALM6小鼠。在施用1×105TRAC-1928ζ和TRAC-1XX后16天和36天，从骨髓和脾脏中分离出CAR。A)-B)CAR T细胞(A)，中央记忆(TCM：CD62L+CD45RA-)，效应子(TEFF：CD62L-CD45RA+)和表达IL7R的骨髓CART细胞(B)的细胞数。所有数据均为平均值±s.e.m.，n＝3只小鼠/组。C)在一个独立实验中(n＝每组3只小鼠)在第36天在TRAC-1928ζ和TRAC-1XX骨髓CAR T细胞上的CD62L/CD45RA表达的代表性流式细胞术分析。D)-G)荷NALM6小鼠用5×105TRAC编辑的幼稚T细胞治疗，或者用NALM6细胞再次攻击(n＝每组5只小鼠)，或者不进行肿瘤再次攻击(TRAC-1928ζ，n＝6只小鼠；TRAC-1XX，n＝7只小鼠。D)-E)在CAR施用(再次攻击：TRAC-1928ζ，n＝4只小鼠；TRAC-1XX，n＝5只小鼠，无再次攻击，n＝5只小鼠/组)后63天，经治疗的小鼠的脾脏中的总CAR T细胞(D)，TCM，TEFF和IL7R+CART细胞(E)的细胞数。所有数据为平均值±s.e.m.；使用两尾未配对的学生t检验进行统计分析。F)在CAR注入后第63天在TRAC-1928ζ和TRAC-1XX CAR T细胞上的IL7R-，CD62L-和CD45RA-表达的FACS分析(在一个独立实验中代表n＝每组至少3只小鼠)。G)来自脾脏的CART细胞上的耗尽标志物PD1+TIM3+LAG3+的表达(再次攻击：TRAC-1928ζ，n＝4只小鼠；TRAC-1XX：n＝5只小鼠。无再次攻击，n＝5只小鼠/组)。所有数据均为平均值±s.e.m.；P值由两尾未配对的学生t检验确定。
图27A-27C描述了TRAC编码的1928ζ突变体和分选的对照T细胞的转录谱。A)用CD19靶细胞(左)和分选的对照T细胞子集(右)(TN，TSCM和TEFF)刺激后，CD8+TRAC-1XX、TRAC-XX3和TRAC-1928ζ的全局转录谱的主成分分析(PCA)。对每个CAR构建体进行了三次重复技术实验，对每个对照子集进行了6次重复实验。B)代表性的GSEA富集图(GSE10239)，展示了1928ζ对比1XX，1928ζ对比XX3(n＝3只小鼠/组)中涉及效应子相关基因的记忆和涉及效应子相关基因的幼稚的下调。C)与分选的对照T细胞子集(TEFF，TSCM和TN)的差异基因表达相比，如Gattinoni等所述，CD8+T细胞子集中900个差异表达基因的热图(左)。
图28A-28D描述了TRAC-1928ζ中CD3ζITAM突变对T细胞分化状态和效应子谱的影响。A)相对于源自GSE41867的幼稚或记忆CD8T细胞，在耗尽的CD8 T细胞中上调的前200个基因的标志的GSEA，表明TRAC-1928ζ对比TRAC-1XX或TRAC-XX3以及分选的对照TEFF对比TN和TSCM中耗尽标志的富集。对每个CAR构建体进行了三次重复技术实验，对每个对照子集进行了6次重复实验。B)基因本体分析表明在1928ζ对比XX3、1XX对比XX3以及1928ζ对比1XX(n＝3)中与炎症、细胞因子和趋化因子信号传导相关的基因组显著丰富。在将CAR基因整合到幼稚T细胞的TRAC基因座并用CD19+靶细胞刺激后进行转录分析。结果按-log10的重要性顺序显示(校正的P值)。通过一尾费舍尔精确检验(Fisher’s exact test)确定P值，并使用Benjamini-Hochberg方法校正多个假设检验。C)在CAR构建体之间与炎症、细胞因子和趋化因子活性有关的选定差异表达基因的热图。D)用CD19抗原刺激后CD8+CAR T细胞上的T细胞分化状态流式细胞术分析(代表n＝2个独立实验，结果相似)。
图29A-29B描述了门控策略，以分析从治疗小鼠的骨髓获得的CAR T细胞。A)-B)在CAR输注后第17天，与TRAC-1XX(B)相比，TRAC-1928ζ(A)的代表性流式细胞术分析。门控的放置基于FMO控件。
具体实施方式
本公开的主题提供新的CAR设计，其包括修饰的CD3ζ链和细胞，其包括包含所述CAR的遗传修饰的免疫应答细胞(例如T细胞、NK细胞或CTL细胞)。本公开的主题还提供使用这样的细胞来诱导和/或增强对靶抗原的免疫应答，和/或治疗和/或预防肿瘤或其它需要提高抗原特异性免疫应答的疾病/病症的方法。本公开的主题至少部分基于以下发现，即与包含常规CAR的对照细胞相比，包含本公开的CAR的免疫应答细胞表现出改善的治疗效力(例如，细胞耗尽减少)。
1.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。以下参考文献为技术人员提供对本公开的主题中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，《微生物学和分子生物学词典》(1994年第2版)；剑桥科学技术词典(Walker编辑，1988)；遗传学词汇，第5版，R.Rieger等(编辑)，Springer Verlag(1991)；和Hale&Marham，《哈珀·柯林斯生物学词典》(1991年)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有以下赋予它们的含义。
如本文所用，术语“约”或“近似”是指在特定值的可接受误差范围内，如本领域普通技术人员所确定的，其将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在3个或超过3个标准偏差之内。可替代地，“约”可以表示给定值的至多20％，例如，至多10％，至多5％或至多1％的范围。可替代地，特别是关于生物系统或方法，该术语可以意指在数值的一个数量级内，例如在一个值的5倍之内或在2倍之内。
“激活免疫应答细胞”是指信号转导的诱导或细胞中蛋白质表达的变化，导致免疫应答的启动。例如，当CD3链响应于配体结合和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(IT AM)聚集时，就会产生信号转导级联反应。在某些实施方式中，当内源性TCR或外源性CAR与抗原结合时，发生免疫突触的形成，其包括在结合受体(例如，CD4或CD8，CD3γ/δ/ε/ζ等)附近的许多分子的聚集。膜结合信号分子的这种聚集使CD3链中包含的ITAM基序磷酸化。该磷酸化反过来启动了T细胞激活通路，最终激活转录因子，例如NF-κB和AP-1。这些转录因子诱导T细胞的整体基因表达，从而增加IL-2的产生，促进主调节T细胞蛋白的增殖和表达，进而启动T细胞介导的免疫应答。
“刺激免疫应答细胞”是指导致强烈和持续的免疫应答的信号。在各种实施方式中，这发生在免疫细胞(例如，T细胞)激活之后或通过包括但不限于CD28、CD137(4-1BB)、OX40、CD40、CD27、CD40/My88、NKGD2和ICOS的受体同时介导。接收多种刺激信号对于建立强烈且长期的T细胞介导的免疫应答可能很重要。T细胞可以迅速被抑制并且对抗原无应答。尽管这些共刺激信号的作用可能有所不同，但它们通常会导致基因表达增加，从而产生长寿命、增殖性和抗凋亡性T细胞，其对抗原应答强烈，可彻底和持续根除。
如本文所用，术语“抗原识别受体”是指能够响应于其与抗原的结合而激活免疫或免疫应答细胞(例如，T细胞)的受体。抗原识别受体的非限制性实例包括天然或内源性T细胞受体(“TCR”)和嵌合抗原受体(“CAR”)。
如本文所用，术语“抗体”不仅是指完整的抗体分子，而且是指保留免疫原结合能力的抗体分子的片段。这样的片段在本领域中也是众所周知的，并且在体外和体内均经常使用。因此，如本文所用，术语“抗体”不仅是指完整的免疫球蛋白分子，而且是众所周知的活性片段F(ab')2和Fab。缺少完整抗体Fc片段的F(ab')2和Fab片段，从循环中清除得更快，并且可能具有更少的完整抗体的非特异性组织结合(Wahl等人，J.Nucl.Med.24:316-325(1983))。如本文所用，抗体包括完整的天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；Fab、Fab'、单链V区片段(scFv)、融合多肽和非常规抗体。在某些实施方式中，抗体是糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链。每条重链由重链可变区(在本文中简称为VH)和重链恒定(CH)区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中简称为VL)和轻链恒定CL区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布有更保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
如本文所用，“CDR”定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见，例如，Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第4版，美国国立卫生研究院卫生与公共服务部(1987)。通常，抗体在可变区中包含三个重链和三个轻链CDR或CDR区。CDR提供大多数接触残基，以使抗体与抗原或表位结合。在某些实施方式中，使用Kabat系统勾勒出CDR区域(Kabat，E.A，等(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生和公共服务部，NIH出版号91-3242)。
如本文所用，术语“单链可变片段”或“scFv”是共价连接以形成VH::VL异二聚体的免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。VH和VL直接连接或通过肽编码接头(例如10、15、20、25个氨基酸)连接，该接头将VH的N端与VL的C端或VH的C端与VL的N端相连。接头通常富含甘氨酸以提高柔韧性，并富含丝氨酸或苏氨酸以提高溶解度。尽管去除了恒定区并引入了接头，scFv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可以由如Huston等(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)所述的包括VH和VL编码序列的核酸表达。还参见美国专利第5,091,513号，第5,132,405号和第4,956,778号。以及美国专利公开号20050196754和20050196754。已经描述了具有抑制活性的拮抗scFv(参见，例如，Zhao等，Hyrbidoma(Larchmt)2008 27(6)：455-5l；Peter等，J Cachexia SarcopeniaMuscle 2012年8月12日；Shieh等，J Imunol 2009 183(4)：2277-85；Giomarelli等，ThrombHaemost 2007 97(6)：955-63；Fife等，J Clin Invst 2006 116(8)：2252-61；Brocks等，Immunotechnology1997 3(3)：173-84；Moosmayer等，Ther Immunol 1995 2(10：31-40)。已经描述了具有刺激活性的激动性scFv(参见，例如，Peter等，J Bioi Chern 2003 25278(38)：36740-7；Xie等，Nat Biotech 1997 15(8)：768-71；Ledbetter等，Crit Rev Immunol1997 17(5-6)：427-55；Ho等，BioChim Biophys Acta 2003 1638(3)：257-66)。
如本文所用，术语“亲和力”是指结合强度的量度。亲和力可取决于抗体结合位点和抗原决定簇之间立体化学拟合的紧密度，它们之间接触面积的大小和/或带电和疏水基团的分布。如本文所用，术语“亲和力”还包括“亲合力”，其是指在形成可逆复合物之后抗原-抗体键的强度。计算抗体对抗原的亲和力的方法是本领域已知的，包括但不限于各种抗原结合实验，例如功能测定法(例如流式细胞术测定法)。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指包含与能够激活或刺激免疫应答细胞的细胞内信号传导结构域融合的细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域的分子。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域包含scFv。scFv可以源自融合抗体的可变重和轻区。替代地或另外，scFv可以衍生自Fab’s(而不是抗体，例如获自Fab文库)。在某些实施方式中，将scFv融合至跨膜结构域，然后融合至细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，选择CAR以对抗原具有高结合亲和力或亲合力。
如本文所用，术语“核酸分子”包括编码目的多肽或其片段的任何核酸分子。这样的核酸分子不需要与内源性核酸序列100％同源性或同一性，而是可以表现出基本同一性。与内源性序列具有“基本同一性”或“基本同源性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”是指在各种严格条件下在互补多核苷酸序列(例如，本文描述的基因)或其部分之间形成双链分子的配对。(参见，例如，Wahl,G.M.和S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel，A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。
例如，严格的盐浓度通常将小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，例如小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，或小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。在没有有机溶剂例如甲酰胺的情况下可以获得低严格度的杂交，而在至少约35％的甲酰胺，例如至少约50％的甲酰胺的存在下可以获得高严格度的杂交。严格的温度条件通常将包括至少约30℃，至少约37℃，或至少约42℃的温度。改变其它参数，例如杂交时间、去污剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS))的浓度、以及包含或排除载体DNA是本领域技术人员众所周知的。通过根据需要组合这些各种条件来实现各种严格度。在某些实施方式中，杂交将在30℃下750mMNaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中进行。在某些实施方式中，杂交将在37℃下500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精DNA(ssDNA)中进行。在某些实施方式中，杂交将在42℃下250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/mlssDNA中进行。在这些条件下有用的变化对于本领域技术人员将是显而易见的。
对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤的严格度也会有所不同。洗涤严格条件可以通过盐浓度和温度来定义。如上所述，可以通过降低盐浓度或通过提高温度来提高洗涤严格度。例如，洗涤步骤的严格盐浓度可以小于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，例如，小于约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常将包括至少约25℃，至少约42℃或至少约68℃的温度。在某些实施方式中，洗涤步骤将在25℃下30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。在某些实施方式中，洗涤步骤将在42℃下15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。在某些实施方式中，洗涤步骤将在68℃下15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。这些条件的其它变化对于本领域技术人员将是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员众所周知的，并且描述于例如Benton和Davis(Science196:180，1977)；Grunstein和Rogness(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 72:3961，1975)；Ausubel等(《分子生物学最新研究方法》，威利科学出版社，纽约，2001年)；Berger和Kimmel(分子克隆技术指南，1987年，纽约学术出版社)；和Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》，纽约冷泉港实验室出版社。
“基本同一性”或“基本同源性”是指与参考氨基酸序列(例如，本文所述的任一氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文描述的任一核酸序列)表现出至少约50％同源性或同一性的多肽或核酸分子。在某些实施方式中，这样的序列与用于比较的氨基酸或核酸序的列为至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性。
序列同一性可以通过使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组的序列分析软件包，威斯康星州麦迪逊市53705大学大道1710号，BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)进行测量。这样的软件通过将同源性程度分配给各种取代、缺失和/或其它修饰来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e-3和e-100之间的概率得分指示密切相关的序列。
“类似物”是指具有参考多肽或核酸分子功能的结构相关的多肽或核酸分子。
如本文所用，术语“配体”是指与受体结合的分子。在某些实施方式中，配体与另一细胞上的受体结合，从而允许细胞间识别和/或相互作用。
如本文所用，术语“组成型表达”或“组成型表达的”是指在所有生理条件下表达或表达的。
“疾病”是指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何状况、疾病或病症，例如瘤形成和细胞的病原体感染。
“有效量”是指足以具有治疗作用的量。在某些实施方式中，“有效量”是足以阻止、改善或抑制瘤形成的持续增殖、生长或转移(例如，侵袭或迁移)的量。
“增强耐受性”是指阻止靶向移植的器官或组织的自反应性细胞或免疫应答性细胞的活性。
“内源性”是指核酸分子或多肽通常在细胞或组织中表达。
“外源性”是指核酸分子或多肽不是内源性存在细胞中的。因此，术语“外源性”将涵盖在细胞中表达的任何重组核酸分子或多肽，例如外源、异源和过表达的核酸分子和多肽。“外源性”核酸是指天然野生型细胞中不存在的核酸。例如，外源性核酸可通过序列、位置/定位或两者而不同于内源性对应物。为了清楚起见，外源性核酸相对于其天然内源性对应物可以具有相同或不同的序列。可以通过遗传工程将其引入细胞本身或其祖细胞，并且可以任选地将其连接至替代控制序列，例如非天然启动子或分泌序列。
“异源核酸分子或多肽”是指通常不存在于细胞或得自细胞的样品中的核酸分子(例如cDNA、DNA或RNA分子)或多肽。该核酸可以来自另一个生物，或者可以是例如通常不在细胞或样品中表达的mRNA分子。
“免疫应答细胞”是指在免疫应答或祖细胞或其后代中起作用的细胞。
“调节”是指正或负改变。示例性调节包括约1％、约2％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或约100％的变化。
“增加”是指正改变至少约5％。改变可以为约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％、约100％或更多。
“减少”是指负改变至少约5％。改变可以为约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％或甚至约100％。
“分离的细胞”是指与天然伴随细胞的分子和/或细胞组分分离的细胞。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上纯净的”是指物质在不同程度上不含在其原始状态下通常与其伴随的组分。“分离”表示与原始来源或环境的分离度。“纯化”表示分离度高于分离。“纯化的”或“生物纯净的”蛋白质充分不含其它物质，以使任何杂质均不会实质性地影响蛋白质的生物学特性或引起其它不利后果。也就是说，如果核酸或肽通过重组DNA技术生产而基本不含细胞材料、病毒材料或培养基，或者通过化学合成而基本不含化学前体或其它化学品，则其是纯化的。纯度和均质性通常使用分析化学技术确定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一个条带。对于可以进行修饰(例如磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离的蛋白质，可以将其分别纯化。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指能够特异性结合细胞上存在的特定抗原决定簇或抗原决定簇组的结构域。
如本文所用，“接头”应指共价连接两个或更多个多肽或核酸以使它们彼此连接的官能团(例如化学或多肽)。如本文所用，“肽接头”是指用于将两种蛋白质偶联在一起(例如，偶联VH和VL结构域)的一个或更多个氨基酸。在某些实施方式中，所述接头包含GGGGSGGGGSGGGGS[SEQ ID NO：66]所示的序列。
“肿瘤(neoplasm)”是指以细胞或组织的病理性增生及其随后向其它组织或器官的迁移或侵袭为特征的疾病。肿瘤的生长通常是不受控制的和进行性的，并且在不引起正常细胞增殖或者导致正常细胞增殖停止的条件下发生。肿瘤可影响多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于选自以下的器官：膀胱、骨骼、大脑、乳房、软骨、神经胶质、食道、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾脏、肝脏、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道，子宫和阴道、或其组织或细胞类型。肿瘤包括癌症，例如肉瘤、肿瘤或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。
“受体”是指存在于细胞膜上的选择性地结合一个或更多个配体的多肽或其一部分。
“识别”是指选择性地结合靶标。识别肿瘤的T细胞可以表达与肿瘤抗原结合的受体(例如TCR或CAR)。
“参考”或“对照”是指比较的标准。例如，可以将表达CAR和scFv的细胞的scFv-抗原结合水平与仅表达CAR的相应细胞的scFv-抗原结合水平进行比较。
“分泌的”是指多肽通过分泌通路通过内质网、高尔基体、以及作为在细胞质膜上瞬时融合从而将蛋白质释放到细胞外的囊泡而从细胞释放。
“信号序列”或“前导序列”是指存在于新合成的蛋白质的N-末端，指导它们进入分泌通路的肽序列(例如5、10、15、20、25或30个氨基酸)。示例性前导序列包括但不限于IL-2信号序列：MYRMQLLSCIALSLALVTNS[SEQ ID NO：67](人)，MYSMQLASCVTLTLVLLVNS[SEQ IDNO：68](小鼠)，κ前导序列：METPAQLLFLLLLWLPDTTG[SEQ ID NO：69](人)，METDTLLLWVLLLWVPGSTG[SEQ ID NO：70](小鼠)；CD8前导序列：MALPVTALLLPLALLLHAARP[SEQ ID NO：71](人)；截短的人CD8信号肽：MALPVTALLLPLALLLHA[SEQ ID NO：72](人)；白蛋白信号序列：MKWVTFISLLFSSAYS[SEQ ID NO：73](人)；催乳素信号序列：MDSKGSSQKGSRLLLLLVVSNLLLCQGVVS[SEQ ID NO：74](人)。在某些实施方式中，前导序列可以是IgG信号肽或GM-CSF信号肽。“可溶的”是指多肽在水性环境(例如，未与膜结合)中可自由扩散。
“特异性结合”是指多肽或其片段识别并结合目的生物分子(例如多肽)但基本上不识别并结合样品(例如生物样品，其自然包括本发明公开的多肽)中其它分子。
如本文所用，术语“肿瘤抗原”是指与正常或非IS赘生性细胞相比在肿瘤细胞上唯一或差异表达的抗原(例如，多肽)。在某些实施方式中，肿瘤抗原包括由肿瘤表达的任何多肽，其能够通过CAR(例如，CD19，MUC-16)激活或诱导免疫应答或能够通过受体-配体结合(例如CD47，PD-L1/L2，B7.1/2)抑制免疫应答。
术语“包含”，“包括”旨在具有美国专利法中赋予它们的广义含义，并且可以表示“含有”，“包含”等。
如本文所用，“治疗”是指试图改变所治疗的个体或细胞的疾病进程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程中进行。治疗的治疗作用包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态、和缓解或改善预后。通过预防疾病或病症的进展，治疗不仅可以预防在受影响或诊断的受试者或怀疑患有该病症的受试者中由于病症引起的恶化，而且治疗可以在有患病症或怀疑患有该病症风险的受试者中预防该病症的发作或该病症的症状。
本文中的“个体”或“受试者”是脊椎动物，例如人或非人动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、灵长类动物、农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。非人动物受试者的非限制性实例包括啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；兔子；狗；猫；绵羊；猪；山羊；牛；马；和非人灵长类动物，例如猿和猴子。如本文所用，术语“免疫受损的”是指具有免疫缺陷的受试者。该受试者非常容易遭受机会性感染，这种感染是由通常不会在免疫系统健康的人中引起疾病的生物体引起的，但是会影响免疫系统功能差或免疫系统受抑制的人。
在以下公开中描述了本公开主题的其它方面，并且在本公开主题的范围内。
2.嵌合抗原受体
本公开提供与目的抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)。CAR可以结合肿瘤抗原或病原体抗原。
2.1.抗原
在某些实施方式中，CAR与肿瘤抗原结合。任何肿瘤抗原(抗原肽)可以用于本文所述的肿瘤相关的实施方式中。抗原来源包括但不限于癌蛋白。抗原可以表达为肽或完整蛋白或其部分。完整蛋白或其部分可以是天然的或诱变的。肿瘤抗原的非限制性实例包括碳酸酐酶IX(CA1X)、癌胚抗原(CEA)、CD8、CD7、CD 10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CLL1、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD133、CD138、CD123、CD44V6、巨细胞病毒(CMV)感染细胞的抗原(例如细胞表面抗原)、上皮糖蛋白-2(EGP-2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2,3,4(erb-B2,3,4)、叶酸结合蛋白(FBP)、胎儿乙酰胆碱受体(AChR)、叶酸受体-α、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、白介素13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、路易斯Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1CAM)、黑色素瘤抗原家族A，1(MAGE-A1)、粘蛋白16(MUC16)、粘蛋白1(MUC1)、间皮素(MSLN)、ERBB2、MAGEA3、p53、MART1、GP100、蛋白酶3(PR1)、酪氨酸酶、存活蛋白、hTERT、EphA2、NKG2D配体、癌-睾丸抗原NY-ES0-1、瘤胚抗原(h5T4)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)和Wilms肿瘤蛋白(WT-1)、BCMA、NKCS1、EGF1R、EGFR-VIII、CD99、CD70、ADGRE2、CCR1、LILRB2、PRAME CCR4、CD5、CD3、TRBC1、TRBC2、TIM-3、整合素B7、ICAM-1、CD70、Tim3、CLEC12A和ERBB。
在某些实施方式中，CAR结合CD19多肽。在某些实施方式中，CAR结合人CD19多肽。在某些实施方式中，人CD19多肽包含SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列。
Figure BDA0002655408740000301
在某些实施方式中，CAR结合至CD19蛋白的细胞外结构域。
在某些实施方式中，CAR结合病原体抗原，例如用于治疗和/或预防病原体感染或其它感染性疾病，例如在免疫受损的受试者中。病原体的非限制性实例包括能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫和原生动物。
病毒的非限制性实例包括逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒，例如HIV-1(也称为HDTV-III、LAVE或HTLV-III/LAV或HIV-III；以及其它分离株，例如HIV-LP)；小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；杯状病毒科(Calciviridae)(例如引起肠胃炎的菌株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(Coronoviridae)(例如冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如水疱性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流行性感冒病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如汉坦病毒、bunga病毒、静脉病毒和奈拉病毒)；沙粒病毒科(Arenaviridae)(出血热病毒)；呼肠病毒科(Reoviridae)(例如呼肠孤病毒、奥比病毒(orbiviruses)和轮状病毒)；双RNA病毒科(Birnaviridae)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(Parvoviridae)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(Herpesviridae)(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹膜病毒科(Iridoviridae)(例如非洲猪瘟病毒)；以及未分类的病毒(例如，丁型肝炎的病原体(被认为是乙肝病毒的缺陷卫星)，非甲、非乙型肝炎的病原体(类1＝内部传播；类2＝经肠胃外传播(即，丙型肝炎)；诺沃克和相关病毒，以及星状病毒)。
细菌的非限制性实例包括葡萄球菌(Staphylococci)、链球菌(Streptococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌属(Pseudomonas species)和沙门氏菌属(Salmonella species)。感染性细菌的具体实例包括但不限于幽门螺杆菌(Helicobacterpyloris)、伯氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophilia)、分枝杆菌属(Mycobacteria sp.)(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、奈瑟氏菌淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)、链球菌(viridans组)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌(厌氧属)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、致病性弯曲杆菌属(pathogenicCampylobacter sp.)、肠球菌属(Enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、无水芽孢杆菌(Bacillus antracis)、白喉棒状杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)、棒状杆菌属(corynebacterium sp.)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringers)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、多杀性巴斯德氏菌(Pasturella multocida)、拟杆菌属(Bacteroides sp.)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformis)、密螺旋体(Treponema pallidium)、雅司螺旋体(Treponema pertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)、立克次氏体(Rickettsia)和衣氏放线菌(Actinomycesisraelii)。
在某些实施方式中，病原体抗原是存在于巨细胞病毒(CMV)中的病毒抗原，存在于爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein Barr Virus)(EBV)中的病毒抗原，存在于人类免疫缺陷病毒(HIV)中的病毒抗原或存在于流感病毒中的病毒抗原。
2.2.嵌合抗受体(CAR)
CAR是工程化的受体，其将目的特异性移植或赋予免疫效应细胞。CAR可用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上；通过逆转录病毒载体促进其编码序列的转移。
共有三代CAR。“第一代”CAR通常由胞外抗原结合结构域(例如scFv)组成，该结构域与跨膜结构域融合，而跨膜结构域与细胞质/细胞内信号传导结构域融合。“第一代”CAR可以提供从头抗原识别，并通过单个融合分子中的CD3ζ链信号传导结构域激活CD4+和CD8+T细胞，而与HLA介导的抗原呈递无关。“第二代”CAR将来自各种共刺激分子(例如CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD27、CD40/My88和NKGD2)的细胞内信号传导结构域添加到CAR的胞质尾区，以向T细胞提供其它信号。“第二代”CAR包括提供共刺激(例如CD28或4-1BB)和激活(CD3ζ)的CAR。在某些实施方式中，CAR是第二代CAR。在某些实施方式中，CAR包含与抗原结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中细胞内信号传导结构域包括共刺激信号传导结构域。在某些实施方式中，CAR进一步包含铰链/间隔区。
在某些非限制性实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域(体现为例如scFv或其类似物)与抗原结合的解离常数(Kd)为约2×10-7M或更小。在某些实施方式中，Kd为约2×10-7M或更小，约1×10-7M或更小，约9×10-8M或更小，约1×10-8M或更小，约9×10-9M或更小，约5×10-9M或更小，约4×10-9M或更小，约3×10-9M或更小，约2×10-9M或更小，或约1×10-9M或更小。在某些非限制性实施方式中，Kd为约3×10-9M或更小。在某些非限制性实施方式中，Kd为约1×10-9M至约3×10-7M。在某些非限制性实施方式中，Kd为约1.5×10-9M至约3×10-7M。在某些非限制性实施方式中，Kd为约1.5×10-9M至约2.7×10-7M。在某些非限制性实施方式中，Kd为约1×10-4M至约1×10-6M。在某些非限制性实施方式中，Kd为约1×10-13M至约1×10-15M。
细胞外抗原结合结构域(例如，在scFv或其类似物中)的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、FACS分析法、生物测定法(例如生长抑制)或Western Blot测定法来测定。这些测定法中的每一种通常通过采用对目标复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体或scFv)来检测特定目标蛋白质-抗体复合物的存在。例如，scFv可以被放射性标记并用于放射免疫测定法(RIA)(参见，例如，Weintraub,B.，放射免疫测定的原理，放射配体测定技术的第七培训课程，内分泌学会，1986年3月，并入本文以供参考)。放射性同位素可通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器的方法或通过放射自显影来检测。在某些实施方式中，CAR的细胞外抗原结合结构域用荧光标志物标记。荧光标志物的非限制性示例包括绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite和mKalamal)、青色荧光蛋白(例如ECFP、Cerulean和CyPet)和黄色荧光蛋白(例如，YFP、Citrine、Venus和YPet)。
2.2.1.CAR的细胞外抗原结合结构域
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域特异性结合抗原。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scFv。在某些实施方式中，scFv是人scFv。在某些实施方式中，scFv是人源化的scFv。在某些实施方式中，scFv是鼠scFv。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是Fab，其任选地被交联。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是F(ab)2。在某些实施方式中，任何前述分子可包含在具有异源序列的融合蛋白中以形成细胞外抗原结合结构域。在某些实施方式中，通过用抗原-Fc融合蛋白筛选scFv噬菌体文库来鉴定scFv。scFv可以源自携带人VL和/或VH基因的小鼠。scFv也可以被骆驼科重链(例如骆驼，羊驼等的VHH)或细胞表面受体的部分天然配体取代。在某些实施方式中，抗原是肿瘤抗原，例如本文公开的一种。在某些实施方式中，抗原是病原体抗原，例如本文公开的一种。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是鼠scFv。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是与人CD19多肽结合的鼠scFv。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是鼠scFv，其包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列，并特异性结合人CD19多肽(例如，包含SEQID NO：75所示的氨基酸序列的人CD19多肽)。在某些实施方式中，编码SEQ ID NO：84的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：85所示。在某些实施方式中，鼠scFv包含重链可变区(VH)，其包含如SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，鼠scFV包含轻链可变区(VL)，其包含如SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，鼠scFv包含VH和VL，其中VH包含如SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列，VL包含如SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列，任选地在VH和VL之间具有(iii)接头序列，例如接头肽。在某些实施方式中，接头包含具有SEQ ID NO：66所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含VH，其包含与SEQ ID NO：82具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源性的氨基酸序列。例如，细胞外抗原结合结构域包含VH，其包含与SEQ ID NO：82具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含VH，其包含如SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含VL，其包含与SEQ ID NO：83具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源性的氨基酸序列。例如，细胞外抗原结合结构域包含VL，其包含与SEQ ID NO：83具有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含VL，其包含如SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列。某些实施方式，细胞外抗原结合结构域包含VH和VL，VH包含与SEQ ID NO：82具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列，VL包含与SEQ ID NO：83具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有如SEQ ID NO：82所示氨基酸序列的VH和含有如SEQ ID NO：83所示氨基酸序列的VL。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有如SEQ ID NO：76所示氨基酸序列或其保守修饰的VH CDR1，含有如SEQ ID NO：77所示氨基酸序列或其保守修饰的VH CDR2和含有如SEQ ID NO：78所示氨基酸序列或其保守修饰的VH CDR3。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有如SEQ ID NO：76所示氨基酸序列的VH CDR1，含有如SEQ ID NO：77所示氨基酸序列的VH CDR2和含有如SEQ ID NO：78所示氨基酸序列的VH CDR3。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有如SEQ IDNO：79所示氨基酸序列或其保守修饰的VL CDR1，含有如SEQ ID NO：80所示氨基酸序列或其保守修饰的VL CDR2和含有如SEQ ID NO：81所示氨基酸序列或其保守修饰的VL CDR3。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有如SEQ ID NO：79所示氨基酸序列的VLCDR1，含有如SEQ ID NO：80所示氨基酸序列的VL CDR2和含有如SEQ ID NO：81所示氨基酸序列的VL CDR3。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有如SEQ ID NO：76所示氨基酸序列或其保守修饰的VH CDR1，含有如SEQ ID NO：77所示氨基酸序列或其保守修饰的VH CDR2，含有如SEQ ID NO：78所示氨基酸序列或其保守修饰的VH CDR3，含有如SEQ IDNO：79所示氨基酸序列或其保守修饰的VL CDR1，含有如SEQ ID NO：80所示氨基酸序列或其保守修饰的VL CDR2和含有如SEQ ID NO：81所示氨基酸序列或其保守修饰的VL CDR3。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有如SEQ ID NO：76所示氨基酸序列的VHCDR1，含有如SEQ ID NO：77所示氨基酸序列的VH CDR2，含有如SEQ ID NO：78所示氨基酸序列的VH CDR3，含有如SEQ ID NO：79所示氨基酸序列的VL CDR1，含有如SEQ ID NO：80所示氨基酸序列的VL CDR2和含有如SEQ ID NO：81所示氨基酸序列的VL CDR3。
表1
Figure BDA0002655408740000361
如本文所用，术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变本公开的包含氨基酸序列的CAR(例如，CAR的细胞外抗原结合结构域)的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰可以包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本公开的CAR的人scFv中。氨基酸可根据其物理化学性质(例如电荷和极性)分为几组。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被相同组内的氨基酸取代的氨基酸取代。例如，氨基酸可以按电荷分类：带正电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸，中性电荷氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸，异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。另外，氨基酸可以按极性分类：极性氨基酸包括精氨酸(碱性极性)、天冬酰胺、天冬氨酸(酸性极性)、谷氨酸(酸性极性)、谷氨酰胺、组氨酸(碱性极性)、赖氨酸(碱性极性)、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；非极性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。因此，CDR区内的一个或更多个氨基酸残基可以被来自相同组的其它氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的抗体的保留功能(即，上述(c)至(l)中列出的功能)。在某些实施方式中，在指定序列或CDR区内不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个残基被改变。
相对于指定序列，含有与指定序列(例如，SEQ ID NO：82和83)具有至少约80％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％(例如，约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％)同源性或同一性的VH和/或VL氨基酸序列可以包含取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留结合靶抗原(例如，CD19)的能力。在某些实施方式中，在指定序列(例如，SEQ ID NO：82和83)中，总共1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方式中，取代、插入或缺失发生在细胞外抗原结合结构域的CDR之外的区(例如，在FR中)。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO：82和83(包括该序列(SEQ ID NO：82和83)的翻译后修饰)中的VH和/或VL序列。
如本文所用，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等同于两个序列之间的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是该序列共享的相同位置数的函数(即，％同源性＝相同位置数#/位置总数#×100)，其中考虑了空位数和每个空位的长度，需要引入这些空位以实现两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。
可以使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))的算法确定两个氨基酸序列之间的同源性百分比，该算法已合并到ALIGN程序(2.0版)中)，使用PAM120重量残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。此外，两个氨基酸序列之间的同源性百分比可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))算法来确定，该算法已被整合到GCG软件包(可从www.gcg.com获得)中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，并且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
另外或可替代地，本公开的主题的氨基酸序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索以例如识别相关序列。可以使用Altschul等((1990)J.Mol.Biol.215:403-10)的XBLAST程序(2.0版)执行此类搜索。可以使用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本文公开的指定序列(例如，scFv m903，m904，m905，m906和m900的重链和轻链可变区序列)同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述使用GappedBLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
2.2.2.CAR的跨膜结构域
在某些非限制性实施方式中，CAR的跨膜结构域包含跨膜的至少一部分的疏水性α螺旋。不同的跨膜结构域导致不同的受体稳定性。抗原识别后，受体聚集并且信号被传递到细胞。根据本公开的主题，CAR的跨膜结构域可以包括CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD40多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、CD84多肽、CD166多肽、CD8a多肽、CD8b多肽、ICOS多肽、ICAM-1多肽、CTLA-4多肽、CD27多肽、CD40/My88肽、NKGD2肽、合成肽(并非基于与免疫应答相关的蛋白质)或其组合的天然的或修饰的跨膜结构域。
CD8
在某些实施方式中，跨膜结构域包含CD8多肽。在某些实施方式中，CD8多肽包含或含有与含有如下提供的NCBI参考编号NP_001139345.1(SEQ ID NO：86)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性(本文中的同源性可以使用标准软件，例如BLAST或FASTA确定)的氨基酸序列或该序列的片段，和/或可以任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，CD8多肽包含或具有作为SEQ ID NO：86的连续部分的氨基酸序列，其为至少20或至少30或至少40或至少50且至多235个氨基酸长度。可替代地或另外地，在非限制性的各种实施方式中，CD8多肽包含或具有SEQ ID NO：86的氨基酸1至235、1至50、50至100、100至150、150至200或200至235的氨基酸序列。在某些实施方式中，本公开的CAR包含跨膜结构域，其包含CD8多肽，该CD8多肽包含或具有SEQ ID NO：86的氨基酸137至209的氨基酸序列。
Figure BDA0002655408740000391
在某些实施方式中，CD8多肽包含或含有与含有如下提供的NCBI参考编号AAA92533.1(SEQ ID NO：87)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性(本文中的同源性可以使用标准软件，例如BLAST或FASTA确定)的氨基酸序列或该序列的片段，和/或可以任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，CD8多肽包含或具有作为SEQ ID NO：87的连续部分的氨基酸序列，其为至少20、或至少30、或至少40、或至少50、或至少60、或至少70、或至少100、或至少200且至多247个氨基酸长度。可替代地或另外地，在非限制性的各种实施方式中，CD8多肽包含或具有SEQ ID NO：87的氨基酸1至247、1至50、50至100、100至150、150至200、151至219、或200至247的氨基酸序列。在某些实施方式中，本公开的CAR包含跨膜结构域，其包含CD8多肽，该CD8多肽包含或具有SEQ ID NO：87的氨基酸151至219的氨基酸序列。
Figure BDA0002655408740000392
在某些实施方式中，CD8多肽包含或具有如SEQ ID NO：88所示的氨基酸序列，其提供如下：
Figure BDA0002655408740000401
根据本公开的主题，“CD8核酸分子”是指编码CD8多肽的多核苷酸。
在某些实施方式中，编码具有如SEQ ID NO：88所示的氨基酸序列的CD8多肽的CD8核酸分子包含或具有如下提供的具有SEQ ID NO：89所示序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000402
CD28
在某些实施方式中，本公开的CAR的跨膜结构域包含CD28多肽。CD28多肽包含或含有与含有如下提供的NCBI参考编号P10747或NP_006130(SEQ ID NO：90)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或该序列的片段，和/或可以任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些非限制性实施方式中，CD28多肽包含或具有作为SEQ ID NO：90的连续部分的氨基酸序列，其为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且至多220个氨基酸长度。可替代地或另外地，在非限制性的各种实施方式中，CD28多肽包含或具有SEQ ID NO：90的氨基酸1至220、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200、或200至220的氨基酸序列。在某些实施方式中，包含在本公开的CAR的跨膜结构域中的CD28多肽包含或具有SEQ ID NO：90的氨基酸153至179的氨基酸序列。
SEQ ID NO：90提供如下：
Figure BDA0002655408740000403
根据本公开的主题，“CD28核酸分子”是指编码CD28多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，编码具有SEQ ID NO：90的氨基酸153至179的CD28多肽的CD28核酸分子包含或具有如下文提供的具有SEQ ID NO：91所示的序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000411
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含人CD28跨膜结构域。人CD28跨膜结构域可包含或具有与SEQ ID NO：92具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。SEQ ID NO：92提供如下：
Figure BDA0002655408740000412
编码SEQ ID NO：92的氨基酸序列的示例性核酸序列如SEQ ID NO：93所示，其提供如下：
Figure BDA0002655408740000413
CD84
在某些实施方式中，本公开的CAR的跨膜结构域包含CD84多肽的天然或修饰的跨膜结构域。CD84多肽可以具有与具有NCBI参考编号NP_001171808.1(SEQ ID No：1)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性的某些实施方式中，CD84多肽包含或具有作为SEQ ID NO：1的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且最多220个氨基酸。可替代地或另外地，在非限制性的各种实施方式中，CD84多肽包含或具有SEQ ID NO：1的氨基酸1至220、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200或200至220的氨基酸序列。在某些实施方式中，包含在本公开的CAR的跨膜结构域中的CD84多肽包含或具有SEQ ID NO：1的氨基酸226至250的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1提供如下：
Figure BDA0002655408740000421
根据本公开的主题，“CD84核酸分子”是指编码CD84多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，编码具有SEQ ID NO：1的氨基酸226至250的CD84多肽的CD84核酸分子包含或具有含有如下文提供的SEQ ID NO：2所示序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000422
CD166
在某些实施方式中，本公开的CAR的跨膜结构域包括CD166多肽的天然或修饰的跨膜结构域。CD166多肽可以具有与具有NCBI参考编号NP_001618.2(SEQ ID NO：3)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性某些实施方式中，CD166多肽包含或具有作为SEQ ID NO：3的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且至多220个氨基酸。可替代地或另外地，在非限制性的各种实施方式中，CD166多肽包含或具有SEQ ID NO：3的氨基酸1至220、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200或200至220的氨基酸序列。在某些实施方式中，包含在本公开的CAR的跨膜结构域中的CD166多肽包含或具有SEQ ID NO：3的氨基酸528至553的氨基酸序列。在某些实施方式中，本公开的CAR的跨膜结构域中包含的CD166多肽包含或具有SEQ ID NO：3的氨基酸528至549的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3提供如下：
Figure BDA0002655408740000431
根据本公开的主题，“CD166核酸分子”是指编码CD166多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，编码具有SEQ ID NO：3的氨基酸528至553的CD166多肽的CD166核酸分子包含或具有含有如下文提供的SEQ ID NO：4所示的序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000432
CD8a
在某些实施方式中，本公开的CAR的跨膜结构域包括CD8a多肽的天然或修饰的跨膜结构域。CD8a多肽可以具有与具有NCBI参考编号NP_001139345.1(SEQ ID NO：5)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性某些实施方式中，CD8a多肽包含或具有作为SEQ ID NO：5的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且至多220个氨基酸。可替代地或另外地，在非限制性的各种实施方式中，CD8a多肽包含或具有SEQ ID NO：5的氨基酸1至220、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200或200至220的氨基酸序列。在某些实施方式中，包含在本公开的CAR的跨膜结构域中的CD8a多肽包含或具有SEQ ID NO：5的氨基酸183至207的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5提供如下：
Figure BDA0002655408740000441
根据本公开的主题，“CD8a核酸分子”是指编码CD8a多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸183至207的CD8a多肽的CD8a核酸分子包含或具有含有如下文提供的SEQ ID NO：6所示的序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000442
CD8b
在某些实施方式中，本公开的CAR的跨膜结构域包括CD8b多肽的天然或修饰的跨膜结构域。CD8b多肽可以具有与具有NCBI参考编号NP_742099.1(SEQ ID NO：7)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性某些实施方式中，CD8b多肽包含或具有作为SEQ ID NO：7的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且至多220个氨基酸。可替代地或另外地，在非限制性的各种实施方式中，CD8b多肽包含或具有SEQ ID NO：7的氨基酸1至220、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200或200至220的氨基酸序列。在某些实施方式中，包含在本公开的CAR的跨膜结构域中的CD8b多肽包含或具有SEQ ID NO：7的氨基酸171至195的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7提供如下：
Figure BDA0002655408740000443
根据本公开的主题，“CD8b核酸分子”是指编码CD8b多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸171至195的CD8b多肽的CD8b核酸分子包含或具有含有如下文提供的SEQ ID NO：8所示的序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000451
ICOS
在某些实施方式中，本公开的CAR的跨膜结构域包括ICOS多肽的天然或修饰的跨膜结构域。ICOS多肽可以具有与具有NCBI参考编号NP_036224.1(SEQ ID NO：9)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性某些实施方式中，ICOS多肽包含或具有作为SEQ ID NO：9的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且至多220个氨基酸。可替代地或另外地，在非限制性的各种实施方式中，ICOS多肽包含或具有SEQ ID NO：9的氨基酸1至220、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200或200至220的氨基酸序列。在某些实施方式中，包含在本公开的CAR的跨膜结构域中的ICOS多肽包含或具有SEQ ID NO：9的氨基酸141至165的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9提供如下：
Figure BDA0002655408740000452
根据本公开的主题，“ICOS核酸分子”是指编码ICOS多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸141至165的ICOS多肽的ICOS核酸分子包含或具有含有如下文提供的SEQ ID NO：10所示的序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000453
CTLA-4
在某些实施方式中，本公开的CAR的跨膜结构域包括CTLA-4多肽的天然或修饰的跨膜结构域。CTLA-4多肽可以具有与具有NCBI参考编号NP_005205.2(SEQ ID NO：11)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性某些实施方式中，CTLA-4多肽包含或具有作为SEQ ID NO：11的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且至多220个氨基酸。可替代地或另外地，在非限制性的各种实施方式中，CTLA-4多肽包含或具有SEQ ID NO：11的氨基酸1至220、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200或200至220的氨基酸序列。在某些实施方式中，包含在本公开的CAR的跨膜结构域中的CTLA-4多肽包含或具有SEQ ID NO：11的氨基酸162至186的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11提供如下：
Figure BDA0002655408740000461
根据本公开的主题，“CTLA-4核酸分子”是指编码CTLA-4多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，编码具有SEQ ID NO：11的氨基酸162至186的CTLA-4多肽的CTLA-4核酸分子包含或具有含有如下文提供的SEQ ID NO：12所示的序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000462
ICAM-1
在某些实施方式中，本公开的CAR的跨膜结构域包括ICAM-1多肽的天然或修饰的跨膜结构域。ICAM-1多肽可以具有与具有NCBI参考编号NP_000192.2(SEQ ID NO：13)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性某些实施方式中，ICAM-1多肽包含或具有作为SEQ ID NO：13的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且至多220个氨基酸。可替代地或另外地，在非限制性的各种实施方式中，ICAM-1多肽包含或具有SEQ ID NO：13的氨基酸1至220、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200或200至220的氨基酸序列。在某些实施方式中，包含在本公开的CAR的跨膜结构域中的ICAM-1多肽包含或具有SEQ ID NO：13的氨基酸481至507的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13提供如下：
Figure BDA0002655408740000471
根据本公开的主题，“ICAM-1核酸分子”是指编码ICAM-1多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，编码具有SEQ ID NO：13的氨基酸481至507的ICAM-1多肽的ICAM-1核酸分子包含或具有含有如下文提供的SEQ ID NO：14所示的序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000472
2.2.3.铰链/间隔区
在某些非限制性实施方式中，CAR还可以包含将细胞外抗原结合结构域连接至跨膜结构域的铰链/间隔区。铰链/间隔区可以足够柔韧性以允许抗原结合结构域在不同方向上定向以促进抗原识别。在某些非限制性实施方式中，CAR的铰链/间隔区可以包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD40多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、CD84多肽、CD166多肽、CD8a多肽、CD8b多肽、ICOS多肽、ICAM-1多肽、CTLA-4多肽、CD27多肽、CD40/My88肽、NKGD2肽、合成多肽(并非基于与免疫应答相关的蛋白质)或其组合的天然或修饰的铰链区。铰链/间隔区可以是来自IgG1的铰链区，或者是免疫球蛋白的CH2CH3区和CD3的部分，CD28多肽的一部分(例如，SEQ ID NO：90的一部分)，CD8多肽的一部分(例如SEQ ID NO：86的一部分或SEQ ID NO：87的一部分)，与前述任一项具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％同源性或同一性的变体，或合成的间隔序列。
CD28
在某些实施方式中，本公开的CAR的铰链/间隔区包含本文所述的CD28多肽的天然或修饰的铰链区。在某些实施方式中，包含在本文公开的CAR的铰链/间隔区中的CD28多肽包含或具有SEQ ID NO：90的氨基酸114至152的氨基酸序列。在某些实施方式中，编码具有SEQ ID NO：90的氨基酸114至152的CD28多肽的CD28核酸包含或具有含有如下文提供的SEQID NO：15所示的序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000481
CD84
在某些实施方式中，本公开的CAR的铰链/间隔区包含本文所述的CD84多肽的天然或修饰的铰链区。在某些实施方式中，包含在本文公开的CAR的铰链/间隔区中的CD84多肽包含或具有SEQ ID NO：1的氨基酸187至225的氨基酸序列。在某些实施方式中，编码具有SEQ ID NO：1的氨基酸187至225的CD84多肽的CD84核酸包含或具有含有如下文提供的SEQID NO：16所示的序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000482
CD166
在某些实施方式中，本公开的CAR的铰链/间隔区包含本文所述的CD166多肽的天然或修饰的铰链区。在某些实施方式中，包含在本文公开的CAR的铰链/间隔区中的CD166多肽包含或具有SEQ ID NO：3的氨基酸489至527。在某些实施方式中，编码具有SEQ ID NO：3的氨基酸489至527的CD166多肽的CD166核酸包含或具有含有如下文提供的SEQ ID NO：17所示的序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000483
在某些实施方式中，包含在本公开的CAR的铰链/间隔区中的CD166多肽包含或具有SEQ ID NO：3的氨基酸484至527。在某些实施方式中，包含在本公开的CAR的铰链/间隔区中的CD166多肽包含或具有SEQ ID NO：3的506至527位氨基酸。在某些实施方式中，包含在本公开的CAR的铰链/间隔区中的CD166多肽包含或具有SEQ ID NO：3的氨基酸517至527。在某些实施方式中，包含在本公开的CAR的铰链/间隔区中的CD166多肽包含或具有SEQ IDNO：109或SEQ ID NO：110所示的氨基酸序列。
Figure BDA0002655408740000491
在某些实施方式中，本公开的CAR的铰链/间隔区和跨膜结构域中包含的CD166多肽包含或具有SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ IDNO：115、SEQ ID NO：116或SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列。
Figure BDA0002655408740000492
CD8a
在某些实施方式中，本公开的CAR的铰链/间隔区包含本文所述的CD8a多肽的天然或修饰的铰链区。在某些实施方式中，包含在本文公开的CAR的铰链/间隔区中的CD8a多肽包含或具有SEQ ID NO：5的氨基酸137至182。在某些实施方式中，编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸137至182的CD8a多肽的CD8a核酸包含或具有含有如下文提供的SEQ ID NO：18所示的序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000493
CD8b
在某些实施方式中，本公开的CAR的铰链/间隔区包含本文所述的CD8b多肽的天然或修饰的铰链区。在某些实施方式中，包含在本文公开的CAR的铰链/间隔区中的CD8b多肽包含或具有SEQ ID NO：7的氨基酸132至170。在某些实施方式中，编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸132至170的CD8b多肽的CD8b核酸包含或具有含有如下文提供的SEQ ID NO：19所示的序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000501
ICOS
在某些实施方式中，本公开的CAR的铰链/间隔区包含本文所述的ICOS多肽的天然或修饰的铰链区。在某些实施方式中，包含在本文公开的CAR的铰链/间隔区中的ICOS多肽包含或具有SEQ ID NO：9的氨基酸102至140。在某些实施方式中，编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸102至140的ICOS多肽的ICOS核酸包含或具有含有如下文提供的SEQ ID NO：20所示的序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000502
CTLA-4
在某些实施方式中，本公开的CAR的铰链/间隔区包含本文所述的CTLA-4多肽的天然或修饰的铰链区。在某些实施方式中，包含在本文公开的CAR的铰链/间隔区中的CTLA-4多肽包含或具有SEQ ID NO：11的氨基酸123至161。在某些实施方式中，编码具有SEQ IDNO：11的氨基酸123至161的CTLA-4多肽的CTLA-4核酸包含或具有含有如下文提供的SEQ IDNO：21所示的序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000503
ICAM-1
在某些实施方式中，本公开的CAR的铰链/间隔区包含本文所述的ICAM-1多肽的天然或修饰的铰链区。在某些实施方式中，包含在本文公开的CAR的铰链/间隔区中的ICAM-1多肽包含或具有SEQ ID NO：13的氨基酸442至480。在某些实施方式中，编码具有SEQ IDNO：13的氨基酸442至480的ICAM-1多肽的ICAM-1核酸包含或具有含有如下文提供的SEQ IDNO：22所示的序列的核酸。
Figure BDA0002655408740000504
在某些实施方式中，本公开的CAR包含铰链/间隔区。在某些实施方式中，铰链/间隔区位于细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间。在某些实施方式中，铰链/间隔区包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、CD166多肽、CD8a多肽、CD8b多肽、ICOS多肽、ICAM-1多肽、CTLA-4多肽、CD27多肽、CD40/My88肽、NKGD2肽、合成多肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)或其组合。在某些实施方式中，跨膜结构域包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、CD166多肽、CD8a多肽、CD8b多肽、ICOS多肽、ICAM-1多肽、CTLA-4多肽、CD27多肽、CD40/My88肽、NKGD2肽、合成多肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)或其组合。
在某些实施方式中，跨膜结构域和铰链/间隔区来源于相同分子。在某些实施方式中，跨膜结构域和铰链/间隔区来源于不同的分子。在某些实施方式中，CAR的铰链/间隔区包含CD28多肽、并且CAR的跨膜结构域包含CD28多肽。在某些实施方式中，CAR的铰链/间隔区包含CD28多肽，并且CAR的跨膜结构域包含CD28多肽。在某些实施方式中，CAR的铰链/间隔区包含CD84多肽，并且CAR的跨膜结构域包含CD84多肽。在某些实施方式中，CAR的铰链/间隔区包含CD166多肽，并且CAR的跨膜结构域包含CD166多肽。在某些实施方式中，CAR的铰链/间隔区包含CD8a多肽，并且CAR的跨膜结构域包含CD8a多肽。在某些实施方式中，CAR的铰链/间隔区包含CD8b多肽，并且CAR的跨膜结构域包含CD8b多肽。在某些实施方式中，CAR的铰链/间隔区包含CD28多肽，而CAR的跨膜结构域包含ICOS多肽。
2.2.4.CAR的细胞内信号传导结构域
在某些非限制性实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含可以激活或刺激细胞(例如淋巴谱系的细胞，例如T细胞)的CD3ζ多肽。野生型(“天然”)CD3ζ包含三个基于免疫受体酪氨酸的活化基序(“ITAM”)(例如ITAM1、ITAM2和ITAM3)，三个富碱性延伸(BRS)区(BRS1、BRS2和BRS3)，并在抗原结合后，将激活信号传递给细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如T细胞)。天然CD3ζ链的细胞内信号传导结构域是来自内源性TCR的信号的主要发送者。如本文实施方式中所用，CD3ζ不是天然的CD3ζ，而是修饰的CD3ζ。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含或具有与具有NCBI参考编号：NP_932170(SEQ ID No：94)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段。在某些非限制性实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含或具有作为SEQ ID NO：94的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20个、或至少30个、或至少40个、或至少50个、或至少100个、或至少110个、或至少113个、且至多163个氨基酸。可替代地或另外地，在非限制性的各种实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含或具有SEQ ID NO：94的氨基酸1至50、50至100、100至150、50至164、55至164或150至164的氨基酸序列。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含或具有SEQ ID NO：94的氨基酸52至164的氨基酸序列。
SEQ ID NO：94提供如下：
Figure BDA0002655408740000521
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的人CD3ζ多肽。修饰的人CD3ζ多肽可包含或具有与SEQ ID NO：95具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％的同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守性氨基酸取代。SEQ ID NO：95提供如下：
Figure BDA0002655408740000522
编码SEQ ID NO：95的氨基酸序列的示例性核酸序列列于下面提供的SEQ ID NO：96中。
Figure BDA0002655408740000531
基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)
在某些非限制性实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含一个，两个或三个ITAM。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1，其包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列。
Figure BDA0002655408740000532
编码SEQ ID NO：23的氨基酸序列的示例性核酸序列在SEQ ID NO：24中列出，其在下面提供。
Figure BDA0002655408740000533
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含ITAM1变体，其包含一个或多个功能丧失突变。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽具有包含两个功能丧失突变的ITAM1变体。在某些实施方式中，功能丧失突变包括ITAM1中酪氨酸残基的突变。在某些实施方式中，由两个功能丧失突变组成的ITAM1变体包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列，其在下文提供。
Figure BDA0002655408740000534
编码SEQ ID NO：25的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：26中给出。
Figure BDA0002655408740000535
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM2，其包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，其在下文提供。
Figure BDA0002655408740000536
编码SEQ ID NO：27的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：28中给出。
Figure BDA0002655408740000537
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含ITAM2变体，其包含一个或多个功能丧失突变。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽具有包含两个功能丧失突变的ITAM2变体。在某些实施方式中，功能丧失突变包括ITAM2中酪氨酸残基的突变。在某些实施方式中，由两个功能丧失突变组成的ITAM2变体包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，其在下文提供。
Figure BDA0002655408740000541
编码SEQ ID NO：29的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：30中给出。
Figure BDA0002655408740000542
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含天然的ITAM3，其包含以下提供的SEQ IDNO：31中列出的氨基酸序列。
Figure BDA0002655408740000543
编码SEQ ID NO：131的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：32中给出。
Figure BDA0002655408740000544
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含ITAM3变体，其包含一个或多个功能丧失突变。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽具有包含两个功能丧失突变的ITAM3变体。在某些实施方式中，功能丧失突变包括ITAM3中酪氨酸残基的突变。在某些实施方式中，由两个功能丧失突变组成的ITAM3变体包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，其在下文提供。
Figure BDA0002655408740000545
编码SEQ ID NO：33的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：34中给出。
Figure BDA0002655408740000546
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含或基本上由或由包含一个或多个功能丧失突变的ITAM1变体，包含一个或多个功能丧失突变的ITAM2变体，包含一个或多个功能丧失突变的ITAM3变体或其组合组成。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含含有一个或多个(例如，两个)功能丧失突变的ITAM2变体和含有一个或多个(例如，两个)功能丧失突变的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含天然ITAM1，包含两个功能丧失突变的ITAM2变体和包含两个功能丧失突变的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含具有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的天然ITAM1，具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的ITAM2变体和具有SEQ IDNO：33所示的氨基酸序列的ITAM3变体(例如，命名为“1XX”的构建体)。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含具有一个或多个(例如两个)功能丧失突变的ITAM1变体和具有一个或多个(例如两个)功能丧失突变的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含具有两个功能丧失突变的ITAM1变体，天然ITAM2和具有两个功能丧失突变的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含具有SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的ITAM1变体，具有SEQ ID NO：27所示氨基酸序列的天然ITAM2，具有SEQ ID NO：33所示氨基酸序列的ITAM3变体(例如，命名为“X2X”的构建体)。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含具有一个或多个(例如两个)功能丧失突变的ITAM1变体和具有一个或多个(例如两个)功能丧失突变的ITAM2变体。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含具有两个功能丧失突变的ITAM1变体，具有两个功能丧失突变的ITAM2变体和天然ITAM3。在某些实施方式，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含具有SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的ITAM1变体，具有SEQ ID NO：29所示氨基酸序列的ITAM2变体和具有SEQ ID NO：31所示氨基酸序列的天然ITAM3(例如，命名为“XX3”的构建体)。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含具有一个或多个(例如，两个)功能丧失突变的ITAM1变体。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含具有两个功能丧失突变的ITAM1变体，天然ITAM2和天然ITAM3。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含具有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的ITAM1变体，具有SEQ ID NO：29所示氨基酸序列的天然ITAM2和具有SEQ ID NO：31所示氨基酸序列的天然ITAM3(例如，命名为“X23”的构建体)。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含天然ITAM1，天然ITAM2和包含一个或多个(例如两个)功能丧失突变的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含天然ITAM1，天然ITAM2和包含两个功能丧失突变的ITAM1变体。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含具有SEQ ID NO：23所示氨基酸序列的天然ITAM1，具有SEQ IDNO：27所示氨基酸序列的天然ITAM2，具有SEQ ID NO：33所示氨基酸序列的ITAM3变体(例如，命名为“12X”的构建体)。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含天然ITAM1，包含一个或多个(例如，两个)功能丧失突变的ITAM2变体和天然ITAM3。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含天然ITAM1，包含两个功能丧失突变的ITAM2变体和天然ITAM3。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含具有SEQ ID NO：23所示氨基酸序列的天然ITAM1，具有SEQ IDNO：29所示氨基酸序列的ITAM2变体，具有SEQ ID NO：31所示氨基酸序列的天然ITAM3变体(例如，命名为“1X3”的构建体)。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含一个或两个ITAM的缺失。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含ITAM1和ITAM2的缺失，例如，修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM3或ITAM3变体，而不包含ITAM1或ITAM2。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含具有SEQ ID NO：31所示氨基酸序列的天然ITAM3，而不包含ITAM1(天然或修饰的)或ITAM2(天然或修饰的)(例如，D12)。
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含ITAM2和ITAM3的缺失，例如，修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1或ITAM1变体，而不包含ITAM2或ITAM3。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含具有SEQ ID NO：23所示氨基酸序列的天然ITAM1，而不包含ITAM2(天然或修饰的)或ITAM3(天然或修饰的)(例如，D23)。
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含ITAM1和ITAM3的缺失，例如，修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM2或ITAM2变体，而不包含ITAM1或ITAM3。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含具有SEQ ID NO：27所示氨基酸序列的天然ITAM2，而不包含ITAM1(天然或修饰的)或ITAM3(天然或修饰的)(例如，D13)。
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含ITAM1的缺失，例如，修饰的CD3ζ多肽包含天然的ITAM2或ITAM2变体以及天然的ITAM3或ITAM3变体，而不包含ITAM1(天然或修饰的)。
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含ITAM2的缺失，例如，修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1或ITAM1变体以及天然ITAM3或ITAM3变体，而不包含ITAM2(天然或修饰的)。
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含ITAM3的缺失，例如，修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1或ITAM1变体以及天然ITAM2或ITAM2变体，而不包含ITAM3(天然或修饰的)。
富碱性拉伸(BRS)区
在某些非限制性实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含一个，两个或三个BRS区(即BRS1、BRS2和BRS3)。BRS区可以是天然BRS或修饰的BRS(例如BRS变体)。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含天然BRS1区，其包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列，其在下文提供。
Figure BDA0002655408740000571
编码SEQ ID NO：35的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：36中给出。
Figure BDA0002655408740000572
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含BRS1变体，其包含一个或多个功能丧失突变。
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含天然BRS2，其包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列。
Figure BDA0002655408740000581
编码SEQ ID NO：37的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：38中给出。
Figure BDA0002655408740000582
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含具有一个或多个功能丧失突变的BRS2变体。
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含天然BRS3，其包含SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列。
Figure BDA0002655408740000583
编码SEQ ID NO：39的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：40中给出。
Figure BDA0002655408740000584
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含具有一个或多个功能丧失突变的BRS3变体。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含所有三个BRS区，即BRS1，BRS2区和BRS3区。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含天然BRS1，天然BRS2和天然BRS3。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含具有SEQ ID NO：35所示氨基酸序列的天然BRS1，具有SEQ ID NO：37所示氨基酸序列的天然BRS2，和具有SEQ ID NO：39所示氨基酸序列的天然BRS3，例如，构建体1XX中包含的修饰的CD3ζ多肽。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其包含一个或两个但不是全部三个BRS区。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含BRS1区和BRS2区，而不包含BRS3区。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含BRS1区和BRS3区，而不包含BRS2区。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含BRS2区和BRS3区，而不包含BRS1区。
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含BRS1区，而不包含BRS2区或BRS3区。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含具有SEQ ID NO：35所示氨基酸序列的天然BRS1，而并且不包含BRS2区或BRS3区，例如构建体D23中包含的修饰的CD3ζ多肽。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含BRS2区，而不包含BRS1区或BRS3区。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽包含BRS3区，而不包含BRS1区或BRS2区。
在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽不包含BRS区(天然或修饰的BRS1，BRS2或BRS3)，例如，所有三个BRS均被删除，例如，构建体D12中包含的修饰的CD3ζ多肽。
在某些非限制性实施方式中，CAR包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中该修饰的CD3ζ多肽缺乏全部或部分的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，其中ITAM是ITAM1、ITAM2和ITAM3。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏ITAM2或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽进一步缺乏ITAM3或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽还缺乏ITAM1或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏ITAM1或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽进一步缺乏ITAM3或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏ITAM3或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏全部或部分的富碱性拉伸(BRS)区，其中BRS区是BRS1、BRS2和BRS3。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS2或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽进一步缺乏BRS3或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽进一步缺乏BRS1或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS1或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽进一步缺乏BRS3或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS3或其部分。在某些实施例中，修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS1或其部分，BRS2或其部分以及BRS3或其部分。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽缺乏ITAM2、ITAM3、BRS2和BRS3。在某些实施方式中，CAR包含SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，CAR包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中该修饰的CD3ζ多肽缺乏全部或部分的富碱性拉伸(BRS)区，其中该BRS区是BRS1、BRS2和BRS3。在某些实施方式中，CAR包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中该修饰的CD3ζ多肽包含选自BRS1变体、BRS2变体、和BRS3变体的BRS变体，其中该BRS变体包含一个或多个功能丧失突变。
共刺激信号区域
在某些非限制性实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域还包含至少一个共刺激信号传导区。在某些实施方式中，所述共刺激信号传导区包含至少一种共刺激分子，其可以提供最佳的淋巴细胞活化。
如本文所用，“共刺激分子”是指淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。该至少一个共刺激信号传导区可包括CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、DAP-10多肽、CD27肽、CD40/My88肽、NKGD2肽或其组合。共刺激分子可以与共刺激配体结合，该共刺激配体是在细胞表面表达的蛋白质，与受体结合后会产生共刺激应答，即影响当抗原与它的CAR分子结合时产生的刺激的细胞内应答。共刺激性配体包括但不限于CD80、CD86、CD70、OX40L和4-1BBL。作为一个实例，4-1BB配体(即4-1BBL)可以结合4-1BB(也称为“CD137”)以提供细胞内信号，该细胞内信号与CAR信号一起诱导CAR+T细胞的效应细胞功能。在美国专利7,446,190(整体并入本文以供参考)中公开了包含细胞内信号传导结构域的CAR，该细胞内信号传导结构域包含具有4-1BB、ICOS或DAP-10的共刺激信号区域。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含具有CD28多肽的共刺激信号传导区。CD28多肽可包含或具有与具有NCBI参考编号：P10747或NP_006130(SEQ ID NO：90)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可以任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性的某些实施方式中，CD28多肽包含或具有作为SEQ ID NO：90的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且至多为220个氨基酸。可替代地或另外地，在非限制性的各种实施方式中，CD28多肽包含或具有SEQ ID NO：90的氨基酸1至220、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200或200至220的氨基酸序列。在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，其包含CD28多肽，该CD28多肽包含或具有SEQ ID NO：90的氨基酸180至220的氨基酸序列。
在某些实施方式中，CD28多肽包含或具有与具有NCBI参考编号NP_031668.3(SEQID NO：97)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可以任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性的某些实施方式中，CD28多肽包含或具有作为SEQ ID NO：97的连续部分的氨基酸序列，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50且至多218个氨基酸。可替代地或另外地，在非限制性的各种实施方式中，CD28多肽包含或具有SEQ ID NO：97的氨基酸1至218、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200、178至218、或200至220的氨基酸序列。在某些实施方式中，本公开的CAR的共刺激信号传导区包含CD28多肽，其包含或具有SEQ ID NO：97的氨基酸178至218。
SEQ ID NO：97提供如下：
Figure BDA0002655408740000611
根据本公开的主题，“CD28核酸分子”是指编码CD28多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，编码包含在本公开的CAR的共刺激信号传导区中的CD28多肽(例如，SEQ ID NO：97的氨基酸178至218)的CD28核酸分子包含或具有SEQ ID NO：98所示的核苷酸序列，其在下面提供。
Figure BDA0002655408740000621
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含CD28的鼠细胞内信号传导结构域。CD28的鼠细胞内信号传导结构域可包含或具有与SEQ ID NO：99具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可以任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。SEQ ID NO：99提供如下：
Figure BDA0002655408740000622
编码SEQ ID NO：99的氨基酸序列的示例性核酸序列如SEQ ID NO：100所示，其在下面提供。
Figure BDA0002655408740000623
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含CD28的人细胞内信号传导结构域。CD28的人细胞内信号传导结构域可包含或具有与SEQ ID NO：101具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可以任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。SEQ ID NO：101提供如下：
Figure BDA0002655408740000624
编码SEQ ID NO：70的氨基酸序列的示例性核酸序列如SEQ ID NO：102所示，其在下面提供。
Figure BDA0002655408740000625
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含CD28的去免疫的人细胞内信号传导结构域。CD28的去免疫的人细胞内信号传导结构域可包含或具有与SEQ ID NO：108具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可以任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。SEQ ID NO：108提供如下：
Figure BDA0002655408740000631
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包含两个共刺激分子，例如CD28和4-1BB的共刺激信号传导区或CD28和OX40的共刺激信号传导区。
4-1BB可以充当肿瘤坏死因子(TNF)配体并具有刺激活性。4-1BB多肽可包含或具有与具有NCBI参考编号：P41273或NP_001552(SEQ ID NO：103)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可以任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
SEQ ID NO：103提供如下：
Figure BDA0002655408740000632
根据本公开的主题，“4-1BB核酸分子”是指编码4-1BB多肽的多核苷酸。
在某些实施方式中，CAR的细胞内信号传导结构域包含4-1BB的细胞内信号传导结构域。4-1BB的细胞内信号传导结构域可以包含或具有与SEQ ID NO：104具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可以任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。SEQ ID NO：104提供如下：
Figure BDA0002655408740000633
编码SEQ ID NO：104的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：105中给出。
Figure BDA0002655408740000634
OX40多肽可包含或具有与具有NCBI参考编号：P43489或NP_003318(SEQ ID NO：106)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可以任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
SEQ ID NO：106提供如下：
Figure BDA0002655408740000641
根据本公开的主题，“OX40核酸分子”是指编码OX40多肽的多核苷酸。
ICOS多肽可以包含或具有与具有NCBI参考编号：NP_036224(SEQ ID NO：65)的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或其片段，和/或可以任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
SEQ ID NO：65提供如下：
Figure BDA0002655408740000642
根据本公开的主题，“ICOS核酸分子”是指编码ICOS多肽的多核苷酸。
在某些实施方式中，本公开的CAR还包含诱导型启动子，用于在人细胞中表达核酸序列。用于表达CAR基因的启动子可以是组成型启动子，例如泛素蛋白C(UbiC)启动子。
在某些实施方式中，来自不同蛋白质的CAR的结构域/基序/区域之间的突变位点和/或接合点被去免疫。可以使用NetMHC 4.0Server预测不同CAR部分之间的接合点的免疫原性。对于每个含有至少一个来自下一个部分的氨基酸的肽，可以预测对所有等位基因与HLAA、B和C的结合亲和力。每个肽的免疫原性得分可以被分配给每个肽。免疫原性得分可以使用公式计算：免疫原性得分＝[(50-结合亲和力)*HLA频率]n。n是每个肽的预测数。
1928z WT构建体
在某些实施方式中，本公开的CAR包含与CD19多肽(例如人CD19多肽)结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和来源于CD28多肽的铰链/间隔区，包含修饰的CD3ζ多肽(例如，修饰的人CD3ζ多肽)的细胞内信号传导结构域和包含CD28多肽(例如人CD28多肽)共刺激信号传导区，该修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1、天然ITAM2、天然ITAM3、天然BRS1、天然BRS2和天然BRS3，。在某些实施方式中，CAR被命名为“1928z WT”。在某些实施方式中，CAR(例如，1928z WT)包含与SEQ ID NO：41(其在以下提供)所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO：41在氨基酸1至18处包含CD8前导序列，并且能够结合CD19(例如人CD19)。
Figure BDA0002655408740000651
编码SEQ ID NO：41的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：42中列出。
Figure BDA0002655408740000661
1XX构建体
在某些实施方式中，本公开的CAR包含与CD19多肽(例如人CD19多肽)结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和来源于CD28多肽的铰链/间隔区，包含修饰的CD3ζ多肽(例如，修饰的人CD3ζ多肽)的细胞内信号传导结构域和包含CD28多肽(例如人CD28多肽)的共刺激信号传导区，该修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1、天然BRS1、天然BRS2、天然BRS3、具有两个功能丧失突变的ITAM2变体和具有两个功能丧失突变的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR被命名为“1XX”。在某些实施方式中，CAR(例如1XX)包含与SEQ ID NO：43(其在以下提供)所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO：43在氨基酸1至18处包含CD8前导序列，并且能够结合CD19(例如人CD19)。
Figure BDA0002655408740000671
编码SEQ ID NO：43的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：44中列出。
Figure BDA0002655408740000672
D12构建体
在某些实施方式中，本公开的CAR包含与CD19多肽(例如人CD19多肽)结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和来源于CD28多肽的铰链/间隔区，包含修饰的CD3ζ多肽(例如，修饰的人CD3ζ多肽)的细胞内信号传导结构域和包含CD28多肽(例如人CD28多肽)的共刺激信号传导区，其中修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM3并且不包含ITAM1(天然或修饰的)、ITAM2(天然或修饰的)、BRS1(天然或修饰的)、BRS2(天然或修饰的)或BRS3(天然或修饰的)。在某些实施方式中，CAR被命名为“D12”。在某些实施方式中，CAR(例如，D12)包含与SEQ ID NO：45(其在以下提供)所示的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性的氨基酸序列。SEQ ID NO：45在氨基酸1至18处包含CD8前导序列，并且能够结合CD19(例如人CD19)。
Figure BDA0002655408740000681
编码SEQ ID NO：45的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：46中给出。
Figure BDA0002655408740000682
D23构建体
在某些实施方式中，本公开的CAR包含与CD19多肽(例如人CD19多肽)结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和来源于CD28多肽的铰链/间隔区，包含具有ITAM1、BRS1以及ITAM2、ITAM3、BRS2和BRS3的缺失的修饰的CD3ζ多肽(例如，修饰的人CD3ζ多肽)的细胞内信号传导结构域和包含CD28多肽(例如人CD28)的共刺激信号传导区，其中该修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1和天然BRS1，并且不包含ITAM2(天然或修饰的)、ITAM3(天然或修饰的)、BRS2(天然或修饰的)或BRS3(天然或修饰的)。在某些实施方式中，CAR被命名为“D23”。在某些实施方式中，CAR(例如，D23)包含与下面提供的SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO：47在氨基酸1至18处包含CD8前导序列，并且能够结合CD19(例如人CD19)。
Figure BDA0002655408740000691
编码SEQ ID NO：47的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：48中给出。
Figure BDA0002655408740000701
XX3构建体
在某些实施方式中，本公开的CAR包含与CD19多肽(例如人CD19多肽)结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和来源于CD28多肽的铰链/间隔区，包含修饰的CD3ζ多肽(例如，修饰的人CD3ζ多肽)的细胞内信号传导结构域和包含CD28多肽(例如人CD28多肽)的共刺激信号传导区，该修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM3、天然BRS1、天然BRS2、天然BRS3、具有两个功能丧失突变的ITAM1变体和具有两个功能丧失突变的ITAM2变体。在某些实施方式中，CAR被命名为“XX3”。在某些实施方式中，CAR(例如XX3)包含与下文提供的SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性的氨基酸序列。SEQ ID NO：49在氨基酸1至18处包含CD8前导序列，并且能够结合CD19(例如人CD19)。
Figure BDA0002655408740000702
Figure BDA0002655408740000711
编码SEQ ID NO：49的氨基酸序列的示例性核酸序列在SEQ ID NO：50中给出，其在下面提供。
Figure BDA0002655408740000712
X23构建体
在某些实施方式中，本公开的CAR包含与CD19多肽(例如人CD19多肽)结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和来源于CD28多肽的铰链/间隔区，包含修饰的CD3ζ多肽(例如，修饰的人CD3ζ多肽)的细胞内信号传导结构域和包含CD28多肽(例如人CD28多肽)的共刺激信号传导区，该修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM2、天然ITAM3、天然BRS1、天然BRS2、天然BRS3和具有两个功能丧失突变的ITAM1变体。在某些实施方式中，CAR被命名为“X23”。在某些实施方式中，CAR(例如，X23)包含与下文提供的SEQ ID NO：51所示氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性的氨基酸序列。SEQ ID NO：51在氨基酸1至18处包含CD8前导序列，并且能够结合CD19(例如人CD19)。
Figure BDA0002655408740000721
编码SEQ ID NO：51的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：52中给出。
Figure BDA0002655408740000722
X2X构建体
在某些实施方式中，本公开的CAR包含与CD19多肽(例如人CD19多肽)结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和来源于CD28多肽的铰链/间隔区，包含修饰的CD3ζ多肽(例如，修饰的人CD3ζ多肽)的细胞内信号传导结构域和包含CD28多肽(例如人CD28多肽)的共刺激信号传导区，该修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM2、天然BRS1、天然BRS2、天然BRS3、具有两个功能丧失突变的ITAM1变体和具有两个功能丧失突变的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR被命名为“X2X”。在某些实施方式中，CAR(例如X2X)包含与下文提供的SEQ ID NO：53所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列。SEQ IDNO：53在氨基酸1至18处包含CD8前导序列，并且能够结合CD19(例如人CD19)。
Figure BDA0002655408740000731
编码SEQ ID NO：53的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：54中列出。
Figure BDA0002655408740000732
Figure BDA0002655408740000741
12X构建体
在某些实施方式中，本公开的CAR包含与CD19多肽(例如人CD19多肽)结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和来源于CD28多肽的铰链/间隔区，包含修饰的CD3ζ多肽(例如，修饰的人CD3ζ多肽)的细胞内信号传导结构域和包含CD28多肽(例如人CD28多肽)的共刺激信号传导区，该修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1、天然ITAM2、天然BRS1、天然BRS2、天然BRS3和具有两个功能丧失突变的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR被命名为“12X”。在某些实施方式中，CAR(例如12X)包含与下面提供的SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO：55在氨基酸1至18处包含CD8前导序列，并且能够结合CD19(例如人CD19)。
Figure BDA0002655408740000742
编码SEQ ID NO：55的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：56中列出。
Figure BDA0002655408740000751
D3构建体
在某些实施方式中，本公开的CAR包含与CD19多肽(例如人CD19多肽)结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和来源于CD28多肽的铰链/间隔区，包含具有ITAM1、ITAM2、BRS1、BRS2以及缺失ITAM3和BRS3的一部分的修饰的CD3ζ多肽(例如，修饰的人CD3ζ多肽)的细胞内信号传导结构域和包含CD28多肽(例如人CD28多肽)的共刺激信号传导区，其中修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1、天然ITAM2、天然BRS1和天然BRS2，并且不包含ITAM3(天然或修饰的)或天然BRS3。在某些实施方式中，CAR被命名为“D3”。在某些实施方式中，CAR(例如，D3)包含与下文提供的SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO：57在氨基酸1至18处包含CD8前导序列，并且能够结合CD19(例如人CD19)。
Figure BDA0002655408740000761
编码SEQ ID NO：57的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：58中给出。
Figure BDA0002655408740000762
[SEQ ID NO：58]
19-166-28z构建体
在某些实施方式中，本公开的CAR包含与CD19多肽(例如人CD19多肽)结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和来源于CD166多肽的铰链/间隔区，包含修饰的CD3ζ多肽(例如修饰的人CD3ζ多肽)的细胞内信号传导结构域和包含CD28多肽(例如人CD28多肽)的共刺激信号传导区，该修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1、天然ITAM2、天然ITAM3、天然BRS1、天然BRS2和天然BRS3。在某些实施方式中，CAR被命名为“19-166-28z”。在某些实施方式中，CAR(例如19-166-28z)包含与下文提供的SEQ ID NO：59所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO：59在氨基酸1至18处包含CD8前导序列，并且能够结合CD19(例如人CD19)。
Figure BDA0002655408740000771
编码SEQ ID NO：59的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：60中列出。
Figure BDA0002655408740000772
19-166-28z 1XX构建体
在某些实施方式中，本公开的CAR包含与CD19多肽(例如人CD19多肽)结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和来源于CD166多肽的铰链/间隔区，包含修饰的CD3ζ多肽(例如，修饰的人CD3ζ多肽)的细胞内信号传导结构域和包含CD28多肽(例如人CD28多肽)的共刺激信号传导区，该修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1、天然BRS1、天然BRS2、天然BRS3、具有两个功能丧失突变的ITAM2变体和具有两个功能丧失突变的ITAM3变体。在某些实施方式中，CAR被命名为“19-166-28z 1XX”。在某些实施方式中，CAR(例如19-166-28z1XX)包含与下文提供的SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO：61在氨基酸1至18处包含CD8前导序列，并且能够结合CD19(例如人CD19)。
Figure BDA0002655408740000781
编码SEQ ID NO：61的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：62中给出。
Figure BDA0002655408740000782
Figure BDA0002655408740000791
19-166-28z D23构建体
在某些实施方式中，本公开的CAR包含与CD19多肽(例如人CD19多肽)结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和来源于CD166多肽的铰链/间隔区，包含具有ITAM1、BRS1和缺失ITAM2、ITAM3、BRS2和BRS3的修饰的CD3ζ多肽(例如，修饰的人CD3ζ多肽)的细胞内信号传导结构域和包含CD28多肽(例如人CD28多肽)的共刺激信号传导区，其中该修饰的CD3ζ多肽包含天然ITAM1和天然BRS1，而不包含ITAM2(天然或修饰的)、ITAM3(天然或修饰的)、BRS2(天然或修饰的)或BRS3(天然或修饰的)。在某些实施方式中，CAR被命名为“19-166-28z D23”。在某些实施方式中，CAR(例如19-166-28z D23)包含与下文提供的SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列。SEQ IDNO：63在氨基酸1至18处包含CD8前导序列，并能够结合CD19(例如人CD19)。
Figure BDA0002655408740000801
编码SEQ ID NO：63的氨基酸序列的示例性核酸序列在下面提供的SEQ ID NO：64中列出。
Figure BDA0002655408740000802
3.免疫应答细胞
本公开的主题提供包含一个或多个本文公开的CAR的免疫应答细胞。在某些实施方式中，CAR能够激活免疫应答细胞。在某些实施方式中，CAR由内源基因座(例如TRAC)表达。
在某些实施方式中，与对照细胞相比，包含一个或多个本公开的CAR的免疫应答细胞表现出改善的治疗效力。在某些实施方式中，与对照细胞相比，包含一个或多个本公开的CAR的免疫应答细胞表现出相似的溶细胞作用。在某些实施方式中，与对照细胞相比，当施用于受试者时，包含一个或多个本公开的CAR的免疫应答细胞表现出增加的细胞积聚。在某些实施方式中，与对照细胞相比，当施用于受试者时，包含一个或多个本公开的CAR的免疫应答细胞表现出减少的细胞耗尽。免疫应答细胞耗尽标志物包括但不限于TIM3、LAG3和PD1。在某些实施方式中，与对照细胞相比，当施用于受试者时，包含本公开的CAR的免疫应答细胞维持较高的记忆免疫细胞群。记忆免疫细胞标记包括但不限于CD62L和CD45RA。在某些实施方式中，与对照细胞相比，包含一个或多个本公开的CAR的免疫应答细胞分泌相似水平的细胞因子。在某些实施方式中，免疫应答细胞分泌的细胞因子包括但不限于TNFα，IFNγ和IL2。在某些实施方式中，该对照细胞包含CAR，其包含具有修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中该修饰的CD3ζ多肽包含全部天然ITAM1-3和全部天然BRS1-3。
3.1包含两个或多个CAR的免疫应答细胞
在某些实施方式中，免疫应答细胞包含两个或更多个CAR。在某些实施方式中，两个或更多个CAR中的至少一个是本文公开的CAR。在某些实施方式中，免疫应答细胞包含两个CAR。在某些实施方式中，免疫应答细胞包含三个CAR。
在某些实施方式中，免疫应答细胞包含：a)第一CAR，其包含与第一抗原结合的第一细胞外抗原结合结构域，第一跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽(例如，一种本文公开的修饰的CD3ζ多肽)的第一细胞内信号传导结构域；b)第二CAR，其包含与第二抗原结合的第二细胞外抗原结合结构域，第二跨膜结构域和第二细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一CAR进一步包含第一铰链/间隔区。在某些实施方式中，第二CAR进一步包含第二铰链/间隔区。
在某些实施方式中，第二细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽(例如，一种本文公开的修饰的CD3ζ多肽)。在某些实施方式中，第二细胞内信号传导结构域包含天然CD3ζ多肽。在某些实施方式中，包含在第二细胞内信号传导结构域中的修饰的CD3ζ多肽与包含在第一细胞内信号传导结构域中的修饰的CD3ζ多肽相同。在某些实施方式中，包含在第二细胞内信号传导结构域中的修饰的CD3ζ多肽不同于包含在第一细胞内信号传导结构域中的修饰的CD3ζ多肽。在某些实施方式中，修饰的CD3ζ多肽选自：包含一个天然ITAM的CD3ζ多肽、包含两个天然ITAM的CD3ζ多肽、包含三个天然ITAM的CD3ζ多肽、包含本文公开的一个ITAM变体的CD3ζ多肽、包含本文公开的两个ITAM变体的CD3ζ多肽、包含一个天然BRS区的CD3ζ多肽、包含两个天然BRS区的CD3ζ多肽、包含三个天然BRS区的CD3ζ多肽、缺乏全部或部分的ITAM1、ITAM2、ITAM3和/或其任何部分的CD3ζ多肽，及其任何组合。
在某些实施方式中，包含在免疫应答细胞中的两个或更多个CAR是不同的(例如，第一CAR与第二CAR不同)。在某些实施方式中，包含在免疫应答细胞中的两个或更多个CAR是相同的(例如，第一CAR与第二CAR相同)。
在某些实施方式中，两个或更多个CAR结合不同的抗原(例如，第一抗原不同于第二抗原)。
在某些实施方式中，两个或更多个CAR包含不同的细胞内信号传导结构域(例如，第一细胞内信号传导结构域与第二细胞内信号传导结构域不同)。在某些实施方式中，两个或更多个CAR包含相同的细胞内信号传导结构域(例如，第一细胞内信号传导结构域与第二细胞内信号传导结构域相同)。
在某些实施方式中，两个或更多个CAR的细胞内信号传导结构域包含不同的共刺激信号传导区。在某些实施方式中，共刺激信号传导区选自CD28多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、ICOS多肽、DAP-10多肽、CD27肽、CD40/My88肽、NKGD2肽及其组合。在某些实施方式中，两个或更多个CAR的细胞内信号传导结构域包含相同的共刺激信号传导区。
在某些实施方式中，免疫应答细胞包含两个、三个或更多个本公开的CAR。在某些实施方式中，其中CAR的每个细胞内信号传导结构域独立地选自1928ζ、19ζ、1XX、X2X、XX3、X23、12X、D3、D12和D23的细胞内信号传导结构域。
细胞中包含的CAR的选择可取决于CAR靶向的抗原的密度、所有ITAM的总数、每个ITAM之间的距离、CAR的跨膜结构域和/或CAR的共刺激性信号传导域，如上所述，可以确定由每个CAR产生的激活信号的强度。
在某些实施方式中，免疫应答细胞包含两个CAR，其中第一CAR包含第一细胞内信号传导结构域，第二CAR包含第二细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一和第二细胞内信号传导结构域中的每一个选自1928ζ、19ζ、1XX、X2X、XX3、12X、X23、D3、D12和D23的细胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域与第二细胞内信号传导结构域相同。在某些实施方式中，第一和第二细胞内信号传导结构域中的每一个是1XX的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域和第二细胞内信号传导结构域是1XX的细胞内信号传导结构域和D23的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域和第二细胞内信号传导结构域是1XX的细胞内信号传导结构域和XX3的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域和第二细胞内信号传导结构域是D23的细胞内信号传导结构域和XX3的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域和第二细胞内信号传导结构域是1XX的细胞内信号传导结构域和X2X的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域和第二细胞内信号传导结构域是1XX的细胞内信号传导结构域和D12的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域和第二细胞内信号传导结构域是1XX的细胞内信号传导结构域和12X的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域和第二细胞内信号传导结构域是1XX的细胞内信号传导结构域和D3的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域和第二细胞内信号传导结构域是X2X的细胞内信号传导结构域和X2X的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域和第二细胞内信号传导结构域是1928ζ的细胞内信号传导结构域和1XX的细胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2变体和ITAM3变体，而第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2或其部分的缺失和ITAM3或其部分的缺失。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2变体和ITAM3变体，而第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体。
在某些实施方式中，两个CAR中包含的天然ITAM的总数不超过大约五个、不超过大约四个、不超过大约三个或不超过大约两个。
在某些实施方式中，免疫应答细胞包含三个CAR，其中第一CAR包含第一细胞内信号传导结构域，第二CAR包含第二细胞内信号传导结构域，并且第三CAR包含第三细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一、第二和第三细胞内信号传导结构域中的每一个独立地选自1928ζ、19ζ、1XX、X2X、XX3、X23、12X、D3、D12和D23的细胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域、第二细胞内信号传导结构域和第三细胞内信号传导结构域是1XX的细胞内信号传导结构域、D23的细胞内信号传导结构域和XX3的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域、第二细胞内信号传导结构域和第三细胞内信号传导结构域是D23的细胞内信号传导结构域、D23的细胞内信号传导结构域和XX3的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域、第二细胞内信号传导结构域和第三细胞内信号传导结构域是D23的细胞内信号传导结构域、XX3的细胞内信号传导结构域和XX3的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域、第二细胞内信号传导结构域和第三细胞内信号传导结构域是XX3的细胞内信号传导结构域、XX3的细胞内信号传导结构域和XX3的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域、第二细胞内信号传导结构域和第三细胞内信号传导结构域是1XX的细胞内信号传导结构域、1XX的细胞内信号传导结构域和1XX的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域、第二细胞内信号传导结构域和第三细胞内信号传导结构域是1XX的细胞内信号传导结构域、X2X的细胞内信号传导结构域和X2X的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域、第二细胞内信号传导结构域和第三细胞内信号传导结构域是1XX的细胞内信号传导结构域、1XX的细胞内信号传导结构域和X2X的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域、第二细胞内信号传导结构域和第三细胞内信号传导结构域是1XX的细胞内信号传导结构域、1XX的细胞内信号传导结构域和D12的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域、第二细胞内信号传导结构域和第三细胞内信号传导结构域是1XX的细胞内信号传导结构域、1XX的细胞内信号传导结构域和D23的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域、第二细胞内信号传导结构域和第三细胞内信号传导结构域是1XX的细胞内信号传导结构域、1XX的细胞内信号传导结构域和12X的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域、第二细胞内信号传导结构域和第三细胞内信号传导结构域是1XX的细胞内信号传导结构域、1XX的细胞内信号传导结构域和D3的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域、第二细胞内信号传导结构域和第三细胞内信号传导结构域是X2X的细胞内信号传导结构域、X2X的细胞内信号传导结构域和X2X的细胞内信号传导结构域。
在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2变体和ITAM3变体，第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2或其部分的缺失和ITAM3或其部分的缺失，而第三细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2或其部分的缺失和ITAM3或其部分的缺失，第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2或其部分的缺失和ITAM3或其部分的缺失，第三细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2或其部分的缺失和ITAM3或其部分的缺失，第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体，以及第三细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体。在某些实施方式中，第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体，第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体，并且第三细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体。
在某些实施方式中，包含在三个CAR中的天然ITAM的总数不超过大约五个、不超过大约四个、不超过大约三个。
在某些实施方式中，CAR的靶标彼此不同。
3.1免疫应答细胞的类型
本公开的主题的免疫应答细胞可以是淋巴谱系的细胞。包括B、T和自然杀伤(NK)细胞的淋巴谱系提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外源试剂的检测、宿主外源细胞的检测等。淋巴谱系的免疫应答细胞的非限制性实例包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、胚胎干细胞和多能干细胞(例如，可以从中分化成淋巴样细胞的那些)。T细胞可以是在胸腺中成熟的淋巴细胞，主要负责细胞介导的免疫。T细胞参与适应性免疫系统。本公开主题的T细胞可以是任何类型的T细胞，包括但不限于辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞(包括中央记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(或干样记忆T细胞)、和两种效应记忆T细胞：例如TEM细胞和TEMRA细胞)、调节性T细胞(也称为抑制性T细胞)、自然杀伤性T细胞、粘膜相关性不变T细胞和γδT细胞。细胞毒性T细胞(CTL或杀伤性T细胞)是能够诱导被感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的T淋巴细胞的一个子集。患者自身的T细胞可以被基因改造以通过CAR的引入靶向特定的抗原。在某些实施方式中，免疫应答细胞是T细胞。该T细胞可以是CD4+T细胞或CD8+T细胞。在某些实施方式中，T细胞是CD8+T细胞。
自然杀伤(NK)细胞可以是淋巴细胞，它是细胞介导的免疫力的一部分，并在先天免疫应答中起作用。NK细胞不需要事先激活即可对靶细胞执行细胞毒作用。
本公开主题的人淋巴细胞的类型包括但不限于外周供体淋巴细胞，例如在Sadelain,M.等,2003,Nat Rev Cancer 3:35-45(公开了经遗传修饰以表达CAR的外周供体淋巴细胞)，在Morgan,R.A.等,2006Science 314:126-129(公开了经遗传修饰以表达包含α和β异二聚体的全长肿瘤抗原识别性T细胞受体复合物的外周供体淋巴细胞)，在Panelli,M.C.,等.2000J Immunol 164:495-504；Panelli,M.C.,等.2000J Immunol 164:4382-4392(公开了在肿瘤活组织检查中衍生自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的淋巴细胞培养物)和在Dupont,J.,等.2005Cancer Res65:5417-5427；Papanicolaou,G.A.,等.2003Blood 102:2498-2505(选择性地公开了使用人工抗原呈递细胞(AAPC)或脉冲树突状细胞在体外扩增的抗原特异性外周血白细胞)中公开的那些。免疫应答细胞(例如，T细胞)可以是自体的、非自体的(例如，同种异体的)、或者是体外从工程化的祖细胞或干细胞衍生的。
本公开的免疫应答细胞能够调节肿瘤微环境。肿瘤具有对宿主免疫应答敌对的微环境，该微环境涉及恶性细胞保护自身免受免疫识别和消除的一系列机制。这种“敌对的肿瘤微环境”包含多种免疫抑制因子，其包括浸润性调节性CD4+T细胞(Tregs)、髓样衍生抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、包括TGF-b在内的免疫抑制细胞因子、以及靶向由活化的T细胞表达的免疫抑制受体(CTLA-4和PD-1)的配体的表达。这些免疫抑制机制在维持耐受性和抑制不适当的免疫应答中起作用，但是在肿瘤微环境内，这些机制阻止了有效的抗肿瘤免疫应答。这些免疫抑制因子在遇到目标肿瘤细胞后，可以共同诱导过继转移的CAR修饰的T细胞明显的无反应性或凋亡。
未纯化的CTL来源可以是本领域已知的任何来源，例如骨髓、胎儿、新生儿或成年或其它造血细胞来源，例如胎儿肝、外周血或脐带血。可以采用各种技术来分离细胞。例如，阴性选择法可以最初去除非CTL。mAb对于鉴定与特定细胞谱系和/或阳性和阴性选择的分化阶段相关的标志物特别有用。
最初可以通过相对粗略的分离除去大部分末端分化的细胞。例如，最初可以使用磁珠分离来去除大量不相关的细胞。在某些实施方式中，在分离细胞之前将去除总造血细胞的至少约80％，通常至少70％。
分离的程序包括但不限于密度梯度离心；重置；偶联至改变细胞密度的颗粒；用抗体包被的磁珠进行磁分离；亲和色谱；与mAb结合或结合使用的细胞毒性剂，包括但不限于补体和细胞毒素；并用附着在固体基质(例如板、芯片、淘析)上的抗体淘选或任何其它方便的技术。
分离和分析的技术包括但不限于流式细胞术，其可以具有不同的复杂程度，例如多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道。
通过使用与死细胞相关的染料，例如碘化丙啶(PI)，可以针对死细胞选择细胞。在某些实施方式中，将细胞收集在包含2％胎牛血清(FCS)或0.2％牛血清白蛋白(BSA)的培养基或任何其它合适的例如无菌等渗培养基中。
4.载体
免疫应答细胞(例如，T细胞或NK细胞)的遗传修饰可以通过用重组DNA构建体转导基本上均质的细胞组成来完成。在某些实施方式中，逆转录病毒载体(γ-逆转录病毒或慢病毒)用于将DNA构建体引入细胞。例如，可以将编码CAR的多核苷酸克隆到逆转录病毒载体中，并且可以从其内源启动子、逆转录病毒长末端重复序列或对目的靶细胞类型特异性的启动子驱动表达。也可以使用非病毒载体。
对于免疫应答细胞的初始遗传修饰以包括CAR，逆转录病毒载体通常用于转导，然而可以使用任何其它合适的病毒载体或非病毒递送系统。可以在单个多顺反子表达盒、单个载体的多个表达盒或多个载体中用辅助分子(例如细胞因子)构建CAR。产生多顺反子表达盒的元件的实例包括但不限于各种病毒和非病毒内部核糖体进入位点(IRES，例如，FGF-1IRES、FGF-2IRES、VEGF IRES、IGF-II IRES、NF-κB IRES、RUNX1 IRES、p53 IRES、甲型肝炎IRES、丙型肝炎IRES、瘟病毒IRES、无杆状病毒IRES、小核糖核酸病毒IRES、脊髓灰质炎病毒IRES和脑心肌炎病毒IRES)和可裂解的接头(例如2A肽，例如P2A、T2A、E2A和F2A肽)。在某些实施方式中，本文公开的任何载体或CAR可包含P2A肽，其包含GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：107)的氨基酸序列。逆转录病毒载体和合适的包装系的组合也是合适的，其中衣壳蛋白将具有感染人细胞的功能。已知各种产生两性病毒的细胞系，包括但不限于PA12(Miller等，(1985)Mol.Cell.Biol.5:431-437)；PA317(Miller等，(1986)Mol.Cell.Biol.6:2895-2902)；和CRIP(Danos等，(1988)Proc.Acad.Sci.USA85:6460-6464)。非两性粒子也是合适的，例如，用VSVG、RD114或GALV包膜和本领域已知的任何其它假型化的粒子。
可能的转导方法还包括细胞与生产细胞的直接共培养，例如通过Bregni等.(1992)Blood 80:1418-1422的方法，或单独用病毒上清液或含有或不含有适当生长因子和聚阳离子的浓缩载体原种培养，例如通过Xu,等.(1994)Exp.Hemat.22:223-230；和Hughes,等.(1992)J.Clin.Invest.89:1817的方法。
其它转导病毒载体可用于修饰免疫应答细胞。在某些实施方式中，所选择的载体表现出高的感染效率和稳定的整合和表达(参见，例如，Cayouette等,Human Gene Therapy8:423-430,1997；Kido等,Current Eye Research 15:833-844,1996；Bloomer等,Journalof Virology71:6641-6649,1997；Naldini等,Science 272:263-267,1996；和Miyoshi等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10319,1997)。可以使用的其它病毒载体包括，例如，腺病毒、慢病毒和与腺相关的病毒载体、牛痘病毒、牛乳头瘤病毒或疱疹病毒，例如爱泼斯坦-巴尔病毒(也参见例如Miller,Human Gene Therapy 15-14,1990；Friedman,Science 244:1275-1281,1989；Eglitis等,BioTechniques 6:608-614,1988；Tolstoshev等,CurrentOpinion in Biotechnology 1:55-61,1990；Sharp,The Lancet 337:1277-1278,1991；Cornetta等,Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322,1987；Anderson,Science 226:401-409,1984；Moen,Blood Cells 17:407-416,1991；Miller等,Biotechnology 7:980-990,1989；LeGal La Salle等,Science 259:988-990,1993；和Johnson,Chest l07:77S-83S,1995的载体)。逆转录病毒载体发展地特别好，并已用于临床(Rosenberg等,N.Engl.J.Med 323:370,1990；Anderson等,U.S.Pat.No.5,399,346)。
非病毒方法也可以用于免疫应答细胞的遗传修饰。例如，可以通过在脂质转染(Feigner等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413,1987；Ono等,Neuroscience Letters17:259,1990；Brigham等,Am.J.Med.Sci.298:278,1989；Staubinger等,Methods inEnzymology 101:512,1983)，脱唾液酸血清类粘蛋白-聚赖氨酸偶联(Wu等,Journal ofBiological Chemistry 263:14621,1988；Wu等,Journal of Biological Chemistry264:16985,1989)，或手术条件下的微注射(Wolff等,Science 247:1465,1990)的情况下施用核酸来将核酸分子引入免疫应答细胞中。其它非病毒的基因转移方法包括使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合的体外转染。脂质体也可能对将DNA递送到细胞中有益。也可以通过将正常核酸转移到可离体培养的细胞类型(例如，自体或异源原代细胞或其后代)中来完成将正常基因移植到受试者的受影响组织中，之后，将细胞(或其后代)注射到目标组织中或全身注射。重组受体也可以使用转座酶或靶向核酸酶(例如锌指核酸酶、大范围核酸酶或TALE核酸酶、CRISPR)衍生或获得。瞬时表达可通过RNA电穿孔获得。
成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统是在原核细胞中发现的基因组编辑工具。当用于基因组编辑时，该系统包括Cas9(一种能够使用crRNA作为其向导来修饰DNA的蛋白质)，CRISPR RNA(crRNA，包含Cas9用来引导其到达宿主DNA正确片段的RNA，以及与tracrRNA结合的区域(通常以发夹环形式)，与Cas9形成活性复合物)，反式激活crRNA(tracrRNA，与crRNA结合，与Cas9形成活性复合物)，以及DNA修复模板的可选片段(可指导细胞修复过程允许插入特定的DNA序列的DNA)。CRISPR/Cas9通常采用质粒转染靶细胞。crRNA需要针对每种应用进行设计，因为这是Cas9用来识别并直接结合细胞中靶DNA的序列。携带CAR表达盒的修复模板还需要针对每种应用进行设计，因为它必须与切口两侧的序列重叠，并为插入序列编码。多个crRNA和tracrRNA可以包装在一起以形成单向导RNA(sgRNA)。该sgRNA可以与Cas9基因连接在一起并制成质粒，以便被转染到细胞中。
锌指核酸酶(ZFN)是一种人工限制性酶，通过将锌指DNA结合结构域与DNA裂解结构域结合而产生。锌指结构域可以被工程化以靶向特定的DNA序列，其允许锌指核酸酶靶向基因组内的期望序列。各个ZFN的DNA结合结构域通常包含多个独立的锌指重复序列，并且每个都可以识别多个碱基对。产生新的锌指结构域的最常见方法是结合已知特异性的较小锌指“模块”。ZFN中最常见的裂解结构域是来自II型限制性核酸内切酶FokI的非特异性裂解结构域。使用内源性同源重组(HR)机器和带有CAR表达盒的同源DNA模板，ZFN可以用于将CAR表达盒插入基因组。当靶序列被ZFN酶切后，HR机器搜索受损染色体与同源DNA模板之间的同源性，然后在染色体的两个断裂末端之间复制模板的序列，从而将同源DNA模板整合到基因组。
转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)是限制性酶，可以工程化为切割DNA的特定序列。TALEN系统的工作原理几乎与ZFN相同。它们是通过将转录激活因子样效应物DNA结合结构域与DNA裂解结构域结合而产生的。
转录激活因子样效应物(TALE)由具有两个可变位置的33-34个氨基酸重复基序组成，这些位置对特定核苷酸有很强的识别能力。通过组装这些TALE的阵列，可以对TALE DNA结合结构域进行改造以结合所需的DNA序列，从而指导核酸酶切割基因组中的特定位置。用于多核苷酸疗法的cDNA表达可以从任何合适的启动子(例如人巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)或金属硫蛋白启动子)中进行指导，并由任何适当的哺乳动物调节元件或内含子(例如延伸因子1a增强子/启动子/内含子结构)调节。例如，如果需要的话，已知优先在特定细胞类型中指导基因表达的增强子可以用于指导核酸的表达。所使用的增强剂可以包括但不限于被表征为组织或细胞特异性增强子的那些。或者，如果将基因组克隆用作治疗构建体，则可以通过同源调控序列或，如果需要，通过衍生自包括上述任何启动子或调控元件的异源的调控序列来介导调控。
所得的细胞可以在与未修饰的细胞相似的条件下生长，由此修饰的细胞可以被扩增并用于多种目的。
5.基因组编辑方法
可以使用任何靶向的基因组编辑方法将本公开的CAR置于本公开的免疫应答细胞的一个或多个内源性基因位点。在某些实施方式中，CRISPR系统用于将本公开的CAR递送至本公开的免疫应答细胞的一个或多个内源性基因位点。在某些实施方式中，锌指核酸酶用于将本公开的CAR递送至本公开的免疫应答细胞的一个或多个内源性基因位点。在某些实施方式中，TALEN系统用于将本公开的CAR递送至本公开的免疫应答细胞的一个或多个内源性基因位点。
用于递送基因组编辑剂/系统的方法可以根据需要而变化。在某些实施方式中，选择的基因组编辑方法的组分作为DNA构建体在一个或多个质粒中递送。在某些实施方式中，通过病毒载体递送组分。常见的递送方法包括但不限于电穿孔、显微注射、基因枪、穿刺(impalefection)、流体静压力、连续输注、超声处理、磁转染、腺相关病毒、病毒载体的包膜蛋白假型、可复制的载体顺式和反式元件、单纯疱疹病毒和化学媒介物(例如寡核苷酸、脂复合物、聚合物小体、多复合物、树状聚合物、无机纳米颗粒和穿透细胞的肽)。
可以在任何内源性基因座处放置本公开的CAR。在某些实施方式中，内源性基因基因座是TRAC基因座、TRBC基因座或TRGC基因座。在某些实施方式中，内源性基因座是TRAC基因座。在某些实施方式中，CAR的放置破坏或消除TCR的内源性表达。
6.多肽和类似物
当在免疫应答细胞中表达时，以增强其抗肿瘤活性的方式修饰的CD19、CD8、CD28、CD3ζ、CD40、4-1BB、OX40、CD84、CD166、CD8a、CD8b、ICOS、ICAM-l、CD27、MY88、NKGD2和CTLA-4多肽或其片段也包括在本公开的主题中。本公开的主题提供通过产生序列改变来优化氨基酸序列或核酸序列的方法。这样的改变可以包括某些突变、缺失、插入或翻译后修饰。本公开的主题还包括本文公开的任何天然存在的多肽(包括但不限于CD19、CD8、CD28、CD3ζ、CD40、4-1BB、OX40、CD27、CD40/My88、NKGD2、CD84、CD166、CD8a、CD8b、ICOS、ICAM-l和CTLA-4)的类似物。类似物可以通过氨基酸序列差异、通过翻译后修饰或通过两者与本文公开的天然存在的多肽不同。类似物可表现出与本公开主题的全部或部分天然存在的氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的同源性。序列差异的长度是至少5、10、15或20个氨基酸残基，例如至少25、50或75个氨基酸残基，或超过100个氨基酸残基。同样，在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其概率得分在e-3和e-100之间，指示密切相关的序列。修饰包括多肽的体内和体外化学衍生，例如乙酰化、羧化、磷酸化或糖基化；这样的修饰可以在多肽合成或加工过程中或在用分离的修饰酶处理之后发生。类似物也可以通过天然序列的改变而不同于天然存在的多肽。这些包括天然和诱导的遗传变异(例如，如Sambrook,Fritsch和Maniatis,《分子克隆：实验室手册》(第2版),CSH出版社,1989，或Ausubel等，同上，中所述，是由于通过辐射或暴露于乙烷甲基硫酸盐中的随机诱变或通过位点特异性诱变而产生的)。还包括环化的肽、分子和类似物，其含有除L-氨基酸以外的残基，例如D-氨基酸或非天然存在的或合成的氨基酸，例如β或γ氨基酸。
除了全长多肽，本公开主题还提供本文公开的任何多肽或肽结构域的片段。如本文所用，术语“片段”是指至少5、10、13或15个氨基酸。在某些实施方式中，片段包含至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸或至少50个连续氨基酸。在某些实施方式中，片段包含至少60至80、100、200、300或更多个连续氨基酸。片段可以通过本领域技术人员已知的方法产生，或者可以由正常的蛋白质加工产生(例如，从新生多肽中去除生物活性不需要的氨基酸，或者通过替代性的mRNA剪接或替代性蛋白质加工事件去除氨基酸))。
非蛋白质类似物具有设计为模仿本文公开的蛋白质的功能活性的化学结构。这样的类似物可能超过原始多肽的生理活性。类似物设计的方法在本领域中是众所周知的，并且可以根据这样的方法通过修饰化学结构来进行类似物的合成，以使所得的类似物在免疫应答细胞中表达时增加原始多肽的抗肿瘤活性。这些化学修饰包括但不限于取代替代的R基团和改变参考多肽的特定碳原子处的饱和度。在某些实施方式中，蛋白质类似物对体内降解具有相对抗性，从而在给药后导致更长的治疗效果。用于测量功能活性的测定包括但不限于以下实施例中描述的那些。
7.给药
可以将包含本公开的免疫应答细胞的组合物系统地或直接提供给受试者，以诱导和/或增强对抗原的免疫应答和/或治疗和/或预防肿瘤、病原体感染或感染性疾病。在某些实施方式中，将本公开的免疫应答细胞或包含其的组合物直接注射到目的器官(例如，受瘤形成影响的器官)中。或者，例如通过向循环系统(例如，肿瘤脉管系统)给药，将本公开的免疫应答细胞或包含其的组合物间接地提供给目的器官。可以在施用细胞或组合物之前，之中或之后提供扩增和分化剂，以增加体外或体内T细胞、NK细胞或CTL细胞的产生。
可以在任何生理上可接受的载体中通常在血管内施用本公开的免疫应答细胞，然而它们也可以被引入骨骼或其它方便的部位，在这些部位细胞可以找到合适的再生和分化部位(例如胸腺)。通常，将施用至少约1×105个细胞，最终达到约1×1010个或更多。本公开的免疫应答细胞可以包含纯化的细胞群。本领域技术人员可以使用各种众所周知的方法，例如荧光激活细胞分选(FACS)，容易地确定群体中本公开的免疫应答细胞的百分比。在包含本公开的免疫应答细胞的群体中，纯度的合适范围是约50％至约55％、约5％至约60％、以及约65％至约70％。在某些实施方式中，纯度为约70％至约75％、约75％至约80％或约80％至约85％。在某些实施方式中，纯度为约85％至约90％，约90％至约95％以及约95％至约100％。剂量可以由本领域技术人员容易地调节(例如，纯度降低可能需要增加剂量)。可以通过注射、导管等引入细胞。
本公开的组合物可以是包含本公开的免疫应答细胞或其祖细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。给药可以是自体的或异体的。例如，可以从一个受试者获得免疫应答细胞或祖细胞，并将其施用于相同受试者或不同的相容受试者。外周血来源的免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或体外来源)可通过局部注射施用，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给药。当施用本公开的主题的治疗组合物(例如，包含本公开的免疫应答细胞的药物组合物)时，可以将其配制成单位剂量可注射形式(溶液剂、悬浮剂、乳剂)。
8.剂型
包含本公开的免疫应答细胞的组合物可以方便地以无菌液体制剂的形式提供，例如等渗水溶液剂、悬浮液、乳剂，分散剂或粘性组合物，其可以缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物在某种程度上更方便施用，尤其是通过注射。另一方面，可以在适当的粘度范围内配制粘性组合物以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。
可以通过将遗传修饰的免疫应答细胞掺入所需量的适当溶剂中，并根据需要掺入不同量的其它成分来制备无菌注射溶液。这样的组合物可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合。组合物也可以冻干。所述组合物可包含辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或增粘剂、防腐剂、矫味剂、颜料等，这取决于给药途径和所需制剂。可以参考标准文本，例如“REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE”，1985年第17版，以引用方式并入本文，以制备合适的制剂，而无需进行过多的实验。
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。可通过使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。然而，根据本公开的主题，所使用的任何媒介物、稀释剂或添加剂将必须与遗传修饰的免疫应答细胞或其祖细胞相容。
该组合物可以是等渗的，即它们可以具有与血液和泪液相同的渗透压。组合物的所需等渗性可以使用氯化钠或其它药学上可接受的试剂例如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机溶质来实现。氯化钠可以特别适用于含有钠离子的缓冲剂。
如果需要，可使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度保持在选定水平。例如，甲基纤维素容易且经济地获得并且易于使用。其它合适的增稠剂包括，例如，黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的浓度可以取决于选择的试剂。重要的是要使用能够达到所选粘度的用量。显然，合适载体和其它添加剂的选择将取决于确切的给药途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，是否将组合物配制成溶液剂、悬浮液、凝胶剂或其它液体形式，例如定时释放形式或液体填充形式)。
对于所治疗的受试者，要施用的细胞数量将有所不同。在一个实施方式中，向人受试者施用的本公开的免疫应答细胞为约104至约1010之间、约105至约109之间、或约106至约108之间。可以以更少的数量施用更有效的细胞。在某些实施方式中，向人受试者施用的本公开的免疫应答细胞为至少约1×108、约2×108、约3×108、约4×108或约5×108。在某些实施方式中，将约1×107至5×108之间的本公开的免疫应答细胞施用于人受试者。可以根据每个受试者的个体因素，包括其大小、年龄、性别、体重和具体受试者的状况，来确定有效剂量的精确确定。本领域技术人员从本公开和本领域知识中可以容易地确定剂量。
本领域技术人员可以容易地确定组合物中和在方法中施用的细胞和任选的添加剂、媒介物和/或载体的量。通常，任何添加剂(除一种或多种活性细胞和/或一种或多种试剂外)在磷酸盐缓冲盐水中的存在量为0.001％至50％(重量)溶液，并且活性成分按微克至毫克的顺序存在，例如约0.0001wt％至约5wt％、约0.0001wt％至约1wt％、约0.0001wt％至约0.05wt％或约0.001wt％至约20wt％、约0.01wt％至约10wt％或约0.05wt％至约5wt％。对于要施用于动物或人的任何组合物，可以确定以下结果：毒性，例如通过在合适的动物模型例如啮齿类动物如小鼠中确定致死剂量(LD)和LD50；组合物的剂量，其中的组分浓度和施用组合物的时间，引起合适的反应。根据技术人员，本公开和本文引用的文献的知识，这种确定不需要过度的实验。并且，可以确定连续给药的时间而无需过多的实验。
9.治疗方法
本公开的主题提供用于在需要其的受试者中诱导和/或增加免疫应答的方法。本公开的免疫应答细胞和包含其的组合物可以用于治疗和/或预防受试者的肿瘤。本公开的免疫应答细胞和包含其的组合物可以用于延长患有肿瘤的受试者的存活。本公开的免疫应答细胞和包含其的组合物也可以用于治疗和/或预防诸如免疫功能低下的人受试者的病原体感染或其它传染性疾病。在某些实施方式中，包含本文公开的CAR的免疫应答细胞可以用于治疗患有疾病复发的受试者，其中该受试者接受过导致残留肿瘤细胞的治疗。在某些实施方式中，该残余肿瘤细胞在肿瘤细胞表面上具有低密度的靶分子。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的靶分子具有每个细胞低于约10000个分子、每个细胞低于约8000个分子、每个细胞低于约6000个分子、每个细胞低于约4000个分子、每个细胞低于约2000个分子、每个细胞低于约1000个分子、每个细胞低于约500个分子、每个细胞低于约200个分子或每个细胞低于约100个分子。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的靶分子具有每个细胞约4000至约2000个分子或每个细胞约2000至约1000个分子。在某些实施方式中，包含本文公开的CAR的免疫应答细胞可以用于治疗患有疾病复发的受试者，其中该受试者接受过包含CAR的免疫应答细胞(例如，T细胞)，该CAR包含细胞内信号传导结构域，其包含含有4-1BB多肽的共刺激性信号传导结构域(例如4-1BBz CAR)。在某些实施方式中，肿瘤细胞在肿瘤细胞表面上具有低密度的肿瘤特异性抗原。在某些实施方式中，该疾病是CD19+ALL。在某些实施方式中，肿瘤细胞在肿瘤细胞上具有低密度的CD19。此类方法包括施用有效量的本公开的免疫应答细胞或包含其的组合物(例如药物组合物)以达到期望的效果，缓解现有病症或预防复发。为了治疗，施用的量是有效产生所需效果的量。可以一次或多次给药来提供有效量。可以大剂量或通过连续灌注来提供有效量。
“有效量”(或“治疗有效量”)是足以在治疗后产生有益或期望的临床结果的量。可以以一剂或多剂剂量将有效量施用于受试者。就治疗而言，有效量是足以缓解、改善、稳定、逆转或减慢疾病进展或以其它方式减少疾病病理后果的量。有效量通常由医师根据具体情况确定，并且在本领域技术人员的能力范围内。当确定合适的剂量以达到有效量时，通常要考虑几个因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、所治疗的疾病、疾病的严重程度以及所施用的免疫应答细胞的形式和有效浓度。
对于使用抗原特异性T细胞的过继免疫疗法，通常输注约106-1010(例如约109)范围内的细胞剂量。在将本公开的细胞施用于宿主并随后分化后，诱导特异性针对特定抗原的T细胞。免疫应答细胞可以通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于静脉内、皮下、结内、肿瘤内、鞘内、胸膜内、腹膜内和直接向胸腺施用。
本公开的主题提供用于治疗和/或预防受试者中的肿瘤的方法。该方法可以包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的本公开的免疫应答细胞或包含其的组合物。
瘤形成的非限制性实例包括血液癌症(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、胶质母细胞瘤、喉癌、黑素瘤、神经母细胞瘤、腺癌、神经胶质瘤、软组织肉瘤和各种癌(包括前列腺癌和小细胞肺癌)。合适的癌还包括肿瘤学领域中任何已知的癌，包括但不限于星形细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤(PNET)、软骨肉瘤、成骨肉瘤、胰腺导管腺癌、小细胞和大细胞肺腺癌、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、上皮腺癌及其肝转移灶、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、肝癌、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、基底细胞癌、汗腺癌、乳头状癌、皮脂腺癌、状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆小管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、Wilms’肿瘤、睾丸肿瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤、Waldenstrom’s巨球蛋白血症和重链疾病、诸如导管和小叶腺癌的乳腺肿瘤、子宫颈的鳞状和腺癌、子宫和卵巢上皮癌、前列腺腺癌、膀胱移行鳞状细胞癌、B和T细胞淋巴瘤(结节性和弥漫性)浆细胞瘤、急慢性白血病、恶性黑色素瘤、软组织肉瘤和平滑肌肉瘤。在某些实施方式中，瘤形成选自血液癌症(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、胶质母细胞瘤和喉癌。在某些实施方式中，本公开的免疫应答细胞和包含其的组合物可以用于治疗和/或预防常规治疗措施不适合的血液癌症(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)或卵巢癌。
受试者可以患有疾病的晚期形式，在这种情况下，治疗目标可以包括缓解或逆转疾病进展和/或减轻副作用。受试者可以具有已经对其进行过治疗的病史，在这种情况下，治疗目标通常包括降低或延迟复发风险。
用于治疗的合适的人受试者通常包括可以通过临床标准区分的两个治疗组。患有“晚期疾病”或“高肿瘤负荷”的受试者是携带临床上可测量的肿瘤的受试者。临床上可测量的肿瘤是一种可以根据肿瘤肿块检测到的肿瘤(例如，通过触诊、CAT扫描、超声检查、乳房X线照片或X射线；单独的阳性生化或组织病理学标志物不足以识别该人群)。向这些受试者施用药物组合物以引发抗肿瘤反应，以减轻其状况。理想地，结果是减小了肿瘤块，但是任何临床改善都可带来益处。临床改善包括降低风险或进展速度或减少肿瘤病理后果。
第二组合适的受试者在本领域中称为“佐剂组”。这些是有瘤形成史但对另一种治疗方式有反应的个体。先前的疗法可以包括但不限于手术切除、放射疗法和传统化学疗法。结果，这些个体没有临床上可测量的肿瘤。然而，他们被怀疑有在原发肿瘤部位附近或转移的疾病进展风险。该组可以进一步分为高风险和低风险的个体。根据在初始治疗之前或之后观察到的特征进行细分。这些特征在临床领域中是已知的，并且针对每种不同的肿瘤适当地定义。高危亚组的典型特征是肿瘤侵犯了邻近组织或淋巴结受累。
另一组具有肿瘤的遗传易感性，但尚未证实肿瘤的临床体征。例如，对于与乳腺癌相关的基因突变测试呈阳性但仍处于育龄的妇女，可能希望接受本文所述的一种或多种免疫应答细胞进行预防性治疗，以防止肿瘤的发生，直到适合进行预防性手术。
另外，本公开的主题提供用于在例如免疫受损的受试者中治疗和/或预防病原体感染(例如病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染或原生动物感染)的方法。该方法可以包括向患有病原体感染的受试者施用有效量的本公开的免疫应答细胞或包含其的组合物。易于治疗的示例性病毒感染包括但不限于巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和流感病毒感染。
可以对本公开的免疫应答细胞(例如，T细胞)进行进一步修饰，以避免或最小化免疫并发症(称为“恶性T细胞转化”)，例如移植物抗宿主病(GvHD)，或当健康组织表达与肿瘤细胞相同的靶抗原时，会导致类似于GvHD的结果的风险。该问题的潜在解决方案是将自杀基因改造到本公开的免疫应答细胞中。合适的自杀基因包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、诱导型Caspase 9自杀基因(iCasp-9)和截短的人表皮生长因子受体(EGFRt)多肽。在某些实施方式中，自杀基因是EGFRt多肽。EGFRt多肽可通过施用抗EGFR单克隆抗体(例如西妥昔单抗)来使T细胞消除。EGFRt可以共价连接至本公开的CAR的上游。自杀基因可以包含在包含编码本公开的CAR的核酸的载体内。以此方式，在恶性T细胞转化(例如，GVHD)过程中施用旨在激活自杀基因的前药(例如，前药(例如，可以激活iCasp-9的AP1903))，可以触发由自杀基因激活的表达CAR的T细胞的凋亡。将自杀基因掺入本公开的CAR中可提高安全性，并能够在很短的时间内消除大部分CAR T细胞。可以在CAR T细胞输注后的给定时间点抢先消除掺入了自杀基因的本公开的免疫应答细胞(例如，T细胞)，或在毒性的最早迹象时将其消除。
10.试剂盒
本公开的主题提供用于在受试者中诱导和/或增强免疫应答和/或治疗和/或预防肿瘤或病原体感染的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包含有效量的本公开的免疫应答细胞或包含其的药物组合物。在某些实施方式中，试剂盒包括无菌容器；这样的容器可以是盒子、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其它适合于容纳药物的材料制成。在某些非限制性实施方式中，试剂盒包括编码本公开的CAR的分离的核酸分子，该CAR分子以可表达的形式指向目的抗原，可以任选地包含在一种或多种载体中。
如果需要的话，将免疫应答细胞和/或核酸分子与将细胞或核酸分子施用于患有瘤形成或病原体或免疫疾病或有发展成瘤形成或病原体或免疫疾病的受试者的说明书一起提供。说明书通常包括有关组合物用于治疗和/或预防肿瘤或病原体感染的信息。在某些实施方式中，说明书包括以下至少一项：治疗剂的描述；用于治疗或预防瘤形成、病原体感染或免疫疾病或其症状的剂量表和给药；注意事项；警告；适应症；不适应症；用药信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考。这些说明书可以直接打印在容器上(如果有的话)，或者作为粘贴在容器上的标签，或者作为单独的纸页、小册子、卡片或文件夹提供在容器内或与容器一起。
实施例
除非另有说明，否则本公开的实践采用分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术(包括重组技术)，其在技术人员的能力范围内。在诸如“分子克隆：实验室手册”，第二版(Sambrook，1989)；“寡核苷酸合成”(Gait，1984)；“动物细胞培养”(Freshney，1987)；“酶学方法”“实验免疫学手册”(Weir，1996)；“哺乳动物细胞的基因转移载体”(Miller和Calos，1987年)；“分子生物学的当前方法”(Ausubel，1987年)；“PCR：聚合酶链式反应”，(Mullis，1994年)；“免疫学的当前方法”(Coligan，1991年)中充分地解释了这些技术。这些技术适用于本文公开的多核苷酸和多肽的产生，并且因此可以在制备和实施本公开的主题中考虑。在以下部分中将讨论用于具体实施方式的特别有用的技术。
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供有关如何制备和使用本公开的细胞和组合物的完整公开和描述，而不旨在限制发明人认作其发明的范围。
实施例1
简介
已经提出了CD3ζ和TCR复合体中的多个ITAM来放大TCR信号(PMID：20516133)。同时，CD28为TCR信号传导提供定量支持(PMID：14647476)。因此，信号传导结构域的数量和类型在TCR信号传导中很重要。在人T细胞中，CD28和TCR/CD3ζ在每个细胞以～6×104和～2×104个分子表达(PMID：14647476)。因此，三个分子的CD28可以为具有三个ITAM的一个分子的TCR/CD3ζ提供信号传导支持。然而，第二代CAR 1928z具有融合的CD28和CD3ζ胞质结构域(将它们的化学计量比固定为1)的设计。具有出色的杀伤和增殖能力的1928z CAR可以在体外、小鼠模型中和患者体内快速消除带有CD19的细胞。但是，为克服临床试验中的某些问题，有必要对当前的1928z CAR进行改进。一个问题是细胞因子释放综合征(CRS)，其特征是大量同步的T细胞活化和大量细胞因子的释放。尽管CRS的机制仍然难以捉摸，但它可能与1928z CAR T细胞的过度信号传导有关。另一个问题是CAR T细胞的耗尽和持久性。在输注后数周或数月，发现1928z CAR T细胞以少量和/或以表达耗尽标志物(例如PD-1)的功能失调状态存在，这可能是某些复发的原因。假设耗尽与过度激活有关(PMID：26331345)，这可能归因于1928z CAR的设计所固有的特性。
将1928z CAR信号传导与TCR信号传导进行比较，由于两个胞质结构域的融合而导致的一些主要差异是显而易见的。首先，在CAR中，CD28信号传导结构域与CD3ζ信号传导结构域顺式排列，而CD28被募集到突触中并与CD3ζ反式共定位。其次，CD28激活与CAR中的CD3ζ激活同时发生，而CD28共刺激是在TCR连接后的数秒。第三，三个CD28分子帮助一个TCR，而CAR中的比例则是一比一。前两个差异在当前的CAR设计下不容易修改，但第三个差异可以通过平衡共刺激信号和激活信号来解决，这可能有助于解决现有的过度刺激问题。由于融合设计，无法直接更改CD28/CD3ζ的比率，但是可以对CD3ζ中的ITAM数量进行突变以模仿TCR信号传导中的比率。CD3ζ中的三个ITAM在其一级氨基酸序列及其相对于质膜的位置(即从近端到远端的ITAM1、ITAM2、ITAM3)不同，因此它们被Lck磷酸化或在磷酸化后与ZAP70结合的能力不同(PMID：23555234)。以前对基于CD28的只有一个在第二位的ITAM的ErbB2 CAR的研究，显示出体外细胞凋亡减少(PMID：19843940)，但仍缺少进一步的CAR表征和体内研究。因此，设计了基于1928z CAR设计的新型CAR，其引入限定的ITAM数量和位置，以评估其功能，尤其是就上述问题而言，包括其对T细胞持久性、分化、耗尽和抗肿瘤活性的影响。分析了在1928z CAR环境中偶联CD28信号传导的每个ITAM是如何在体外和体内影响整体CAR功能。与CD28偶联的ITAM1不仅比与CD28偶联的ITAM2或ITAM3更好，而且更重要地在体内抗肿瘤功效方面也比原始的1928z CAR更好，这使其成为临床应用的理想候选者。所有研究均在人外周血T细胞中进行。
结果
1928ζCAR中的3ζITAM结构域发挥了定性差异性CAR T细胞功能
第一步是探索第2代1928z-CAR构建体中的每个CD3ζITAM是否有助于定性的独特功能，或者各个ITAM是否显示出重叠和功能冗余的特性。为了评估每个单独的ITAM对1928zCAR功能的贡献，产生了仅具有一个单一功能性ITAM结构域的1928z CAR(1XX、X2X和XX3，见图1A)。剩余的两个ITAM的信号传导被插入点突变而中断，该点突变将两个酪氨酸(Y)转化为苯丙氨酸(F)，从而使用于完全激活下游信号传导通路的磷酸化和ZAP70的连续募集失效。使用SFG逆转录病毒载体可有效转导T细胞，不同构建体之间的转导率相当(图1B)。
为了比较所产生的1928z突变体的治疗潜力，在先前描述的B前急性淋巴母细胞性白血病NALM-6小鼠模型中施用了次优的CAR T细胞剂量5×l04的CAR+T细胞，并与用1928z野生型(1928z WT)小鼠治疗的疗效进行了比较(图2)。
发现了小鼠在与相关功能性ITAM有关的肿瘤根除和存活方面的逐渐差异：与原始的1928z野生型(WT)中3个功能性ITAM相比，在其原始的1928z CAR位置的未修饰的ITAM1(1XX)或ITAM2(X2X)显示出改善的抗肿瘤活性。相反，ITAM3作为与功能失调的ITAM 1和2结合使用的唯一功能性ITAM(XX3)表现不佳，减少了肿瘤根除并降低了小鼠的存活率(图3)。
因此，在保持第2代的1928z结构中的原始位置时，1928z CAR中的单个ITAM发挥了定性的差异性功能。随着每个功能性ITAM的远端位置增加，消灭肿瘤的功效逐渐降低：1XX始终显示出快速根除肿瘤并实现长期完全缓解，而X2X的治疗延迟了肿瘤进展，优于1928zWT，但最终复发。XX3的未突变(天然)ITAM位于最远端，无法实现肿瘤控制，导致肿瘤快速进展并降低了存活率(图3)。总而言之，在第二或第三个ITAM位置(XX3、X2X、X23)具有1个或2个ITAM的1928z CAR活性较低或相对于1928z野生型没有治疗活性(体内)。
在正确位置的一个单一功能性CD3ζITAM足以实现有效的抗肿瘤活性
解决的下一个问题是在远端位置的两个功能性ITAM的组合ITAM2和ITAM3(X23，图1A)(假设它们对ZAP70的亲和力比ITAM1低)是否可以共同提高其相关的单个ITAM 1928ζ突变体(X2X/XX3)的功效。体内分析显示，用X23治疗的小鼠的肿瘤清除率和存活率不佳，与用XX3治疗的小鼠的结果相当(图2和3)。相反，如在肿瘤负荷和生存的进程中所反映，在仅具有第一(1XX)或第二(X2X)位置的一个单一功能性ITAM的1928z突变体CAR要优于具有两个(X23)或三个(WT)功能性ITAM的1928z CAR。1XX一直被证明是最有力的1928z突变体，即使在非常低的治疗剂量下也能快速、持久地根除肿瘤。因此，结果表明，一个单一ITAM足以有效杀伤，但也显示出CAR T细胞治疗能力的显著差异取决于CD3ζ中哪个ITAM是功能性的。
接下来分析的是，XX3中的CAR功能降低是归因于ITAM3的个体特异性，还是与在第2代CAR背景下与其自然位置相比的ITAM3的更远端位置相关。因此构建了带有完全相同的近端CAR位置(D12和D23)的ITAM1或ITAM3的1928z突变体CAR，并删除了剩余的CD3ζ链，使得可以在1928-CAR的背景下直接比较两个ITAM(图1)。结果表明，在更近端的位置的ITAM3(D12)足以快速且有效长期进行肿瘤清除(图2和3)，显示出与D23相当的结果。尽管共享相同的ITAM(ITAM3)，但D12明显胜过XX3，并实现了有效的抗肿瘤效力。因此，D12和XX3之间的治疗效能的显著差异证明了第2代CAR中ITAM位置的影响。总之，在第一个ITAM位上具有单个ITAM(1XX和D23中的ITAM1或D12中的ITAM3)的1928z CAR比1928z野生型更具治疗活性(体内)。
尽管D23和1XX共同具有ITAM1作为唯一的功能性ITAM，但与D23相比，1XX显示出改善的功能特性，导致更高的T细胞增殖和有利的T细胞表型(图4和5)。这支持了CD3ζ链(先前已显示出介导膜缔合和调节信号传导)内的富碱性延伸(BRS)可能归因于1928z CAR的功能特性(图1B)。
因此在1XX CAR结构中插入了的其它突变，从而中断了BRS-2和-3(＝1XX BRS阴性)的信号传导。结果表明，BRS区对于1XX的功能至关重要，因为1XX BRS阴性在体外和体内均显示出降低的增殖和杀伤功能。因此，我们证明了1XX中BRS区的功能重要性。
CD3ζITAM突变允许1928ζCAR中增强的T细胞增殖并限制T细胞分化和耗尽
体内研究表明，对于具有一个功能性ITAM和两个突变的ITAM区的所有CAR组的CART细胞积聚增强：与1928ζWT相比，17天后，XX3、X2X和1XX的细胞数在肿瘤部位的T细胞积聚明显更高(图4)。表达含有单个ITAM(XX3、X2X、1XX)的突变体1928z CAR的T细胞在体内的积聚水平高于表达野生型28z CAR的T细胞。相对于表达单个ITAM CAR(XX3、X2X、1XX、D23和D12)的T细胞，包含2个或更多个ITAM(1928z和X23)的CAR显示出减少的积聚。
较高的T细胞积聚与较少的T细胞分化有关，如在CD4+和CD8+CAR T细胞中的中央记忆(CD62L+CD45RA-)(TCM)和效应子(CD62L-CD45RA+)(TEFF)细胞的百分比所反映：与1928zWT相比，1XX显示出显著更高的TCM(与体内增殖潜能的改善相关T细胞表型)百分比-以及显著更低的最终分化的TEFF百分比(图5)。此外，CAR输注后第17天，在治疗小鼠的骨髓中，1XX显示TCM细胞和表达记忆相关标志物IL7R的T细胞数量明显增加。此外，从CAR施用后的第10天到第17天，两个T细胞群体均显示出显著增加(图6)。总体而言，1XX引起记忆T细胞的比例最大，而D23在长期体外试验中排名第二。重复暴露于抗原后，在体外也观察到延迟分化和表达IL7R的CAR T细胞增加(数据未显示)。
此外，1928z突变体的T细胞耗尽程度不同，如由与抗肿瘤活性降低相关的抑制性分子PD1、TIM3和LAG3的共表达所确定的。具有一个单一功能性ITAM和两个其它ITAM缺失(D12和D23)的1928z突变体组显示出显著更低的耗尽标志物表达(图7)。
XX3在肿瘤部位的CAR数量超过了1928z WT(图4)，并显示出高的TCM百分比，但这些细胞无法阻止肿瘤的进展。XX3治疗的小鼠表现出初始治疗应答，但短时间后复发。体外功能分析表明，XX3的杀伤活性降低，Th1细胞因子和颗粒酶B(GrB)分泌减少(图8和9)。图8表明，在标准的体外细胞毒性试验中，所有的CAR都类似地裂解肿瘤细胞，但XX3例外，其细胞溶解活性降低。尽管所有构建体在初始T细胞转导后均显示出相似且有效的细胞毒活性，但在重复Ag暴露的CAR扩增后出现差异(图8)。图9显示标准的体外细胞因子测定与体内功能特性不相关，但是1XX和D23显示出良好的特征(IL2和抗肿瘤细胞因子，例如IFNg和TNFa)
这些发现表明XX3中效应子和增殖功能的解偶联，并且表明CAR T细胞的扩增和持久性不足以有效根除肿瘤。相反，1928z WT发挥高的细胞毒活性，但能早期分化成效应细胞并增加抑制分子的上调，这导致1928z CAR的耗尽和持久性降低。
结论
在第2代的1928z CAR中，由于CD3ζ激活和CD28共刺激的组合，功能冗余和信号传导增强可能导致早期T细胞分化和耗尽，从而降低抗肿瘤活性。因此，分析了单个ITAM对CAR功能的贡献。CD3ζ链中的ITAM的位置、亲和力和数量差异影响1928z CAR T细胞的功能特性。总体而言，包含单个ITAM的1928z CAR可以指导优异的T细胞积聚、记忆形成和减少的耗尽(图4-7)，但是必须将单个ITAM放在第一位置以提供最高的治疗(抗肿瘤)活性(图2-3)。1XX包括效应细胞和记忆细胞两者的最有利特性，从而平衡了激活和分化。1XX调节结合的CD3ζ信号传导和CD28共刺激的强烈激活，并将强度微调为合适的细胞内信号，从而调节CAR介导的信号传导，从而长期优越根除肿瘤。
实施例2：CAR的可替代的铰链/间隔区和跨膜结构域
在CAR构建体中测试了可替代的铰链/间隔区和跨膜结构域。带有不同铰链(H)和跨膜结构域(TM)的1XX CAR的示意图如图10所示。所有测试的铰链和跨膜结构域均属于免疫球蛋白超家族(IgSF)，并且能够形成细胞表面同型二聚体。将所有构建体克隆到编码CAR和LNGFR的P2A双顺反子致癌逆转录病毒(oncoretroviral)载体(SFG)中。流式细胞术分析显示分别使用山羊IgG抗小鼠IgG(F(ab′)2)片段和抗LNGFR的CAR和LNGFR表达。从健康供体的PBMC(外周血单个核细胞)获得T细胞，活化后48小时稳定转导，并在多个时间点分析CAR表达。含有CD28/CD28 H/TM区的1928z-LNGFR CAR用作对照。
用ICOS/ICOS(H/TM)、CTLA-4/CTLA-4(H/TM)或ICAM-1/ICAM-1(H/TM)铰链替换CD28/CD28(H/TM)废除了CAR的细胞表面表达。然而，当CD28铰链融合至ICOS跨膜(CD28/ICOS；H/TM)时，CAR表达得以挽救。但是，CAR表达无法在CD28/CTLA-4(H/TM)构型中得到挽救。这些发现表明，发现能够有效进行CAR表达的H/TM组合并不明显。总之，具有CD84/CD84、CD166/CD166、CD8a/CD8a、CD8b/CD8b或CD28/ICOS(H/TM)区的1XX CAR在T细胞表面表达相似，其中3个无法与CD28形成二聚体：CD166-28z、CD8a-28z、CD8b-28z。
从106细胞/ml CAR T细胞开始，每周刺激后的积聚CAR T细胞计数如图11所示。首先在21天内体外评估每周暴露于CD19诱导的CAR T细胞增殖。在无任何外源性细胞因子的情况下，将CAR T细胞与经辐照的CD19+NIH 3T3共培养。每周，将106个细胞/ml CAR+T细胞添加到受辐照和新鲜的CD19+NIH 3T3中。带有CD28/CD28(H/TM)的1928z-lXX-LNGFR CAR用作参考。19-CD166-28z的体外增殖类似于1928z野生型。
基于CAR T细胞表面检测来组织数据。用含有ICOS/ICOS(H/TM)、CTLA-4/CTLA-4(H/TM)、ICAM-1/ICAM-1(或CD28/CTLA-4(H:TM))的CAR转导的T细胞在与CD19+NIH 3T3细胞共培养后无法积聚。具有CD84/CD84和CD8b/CD8b(H/TM)的CAR T细胞在经过两轮刺激后可积聚。然而，这些细胞在第三轮刺激后丧失了积聚能力。具有CD166(H/TM)、CD8a(H/TM)结构域和CD28/ICOS(H/TM)的CAR T细胞的积聚与对照1928z-1XX CAR T细胞一样有效。
在第三次刺激(D21)结束时使用4小时51Cr释放测定法测量了CAR T细胞的细胞毒活性，其结果如图12所示。T细胞和EL-4-CD19+靶细胞以不同的效应子:靶标比率(E:T)使用。EL-4-PSMA细胞用作对照。如预期的那样，所有表达良好的H/TM CD28/CD3ζ变体的体外细胞毒潜力均相似。具有CD166(H/TM)、CD8a(H/TM)结构域和CD28/ICOS(H/TM)的CAR T细胞的细胞毒能力与具有CD28/CD28(H/TM)的CAR T细胞相当。
使用NOD.Cg PrkdcscidIl2rgtmlWjl/SzJ(免疫缺陷型NSG)小鼠的不同H/TM CART细胞的体内抗肿瘤效力如图13所示。给小鼠尾静脉注射5×105FFLuc-GFP NALM6细胞(前BALL细胞系)，四天后跟随注射2×105CAR T细胞。肿瘤负荷后，每周定量生物发光信号。所有用于体内研究的选定构建体，CD166/CD166(H/TM)、CD8a/CD8a(H/TM)和CD28/ICOS(H/TM)能够完全根除肿瘤细胞。与对照组1928z CAR T细胞相比，在任何情况下均未观察到肿瘤负荷或存活率的显著差异。
实施例3-去免疫策略
人序列或其突变的并置(juxtaposition)具有产生新抗原的风险。因此对新的CD166接合点和1XX中的突变进行去免疫。使用NetMHC4.0Server可以预测不同CAR部分之间接合点的免疫原性。总共选择了26个氨基酸(第一部分为13个氨基酸，第二部分为13个氨基酸)。对于每个产生的肽(14、13、12、11、10、9和8聚体)，其至少包含来自下一个部分的1个氨基酸，对所有等位基因与HLA A、B和C的结合亲和力进行了预测。为每种肽分配每种肽的免疫原性得分。使用公式免疫原性得分＝[(50-结合亲和力)*HLA频率]n计算免疫原性得分。50nm用作强结合亲和力的截止值。使用高加索人群的HLA频率。n＝每个肽的预测数。排除总群体中低于1％的HLA频率。对于接合点去免疫，测试了形成接合点的两个氨基酸的改组或从接合点的两侧缺失氨基酸。先前描述的免疫原性预测策略用于每个新产生的肽。使用具有最小免疫原性得分的接合点构建去免疫的CAR。示例性的去免疫策略如图14所示。
实施例4：用4-lBBz CAR T细胞治疗后CD19低ALL的复发的挽救
简介
使用嵌合抗原受体(CAR)的过继免疫疗法已在白血病和淋巴瘤的治疗中显示出显著的临床结果，并且是原则上可应用于多种癌症的有希望的免疫疗法。临床上已成功引入了两种有前途的CAR设计，一种采用CD28的胞质结构域作为共刺激成分，另一种采用4-1BB的胞质结构域。在这两种情况下，T细胞活化都是通过CD3ζ链的融合胞质结构域启动的。尽管两种设计均取得了显著成果，但这些CAR结构的缺点限制了临床结果。表达基于CD28的CAR的T细胞有效但寿命短，而表达基于4-lBB的CAR的T细胞寿命更长，但可使表达低水平靶抗原的肿瘤细胞的抗原逃逸。因此，需要新型的CAR设计，其在不损害功能的情况下延长T细胞的持久性。
结果
本公开的CD28z CAR T细胞可以在用4-lBBz CAR T细胞治疗后挽救CD19低ALL的复发。这可能是4-lBBz CAR T细胞(除了那些CD19阴性稳定的细胞)治疗后发生的许多复发的主要挽救途径。
向NSG小鼠尾静脉注射5×105FFLuc-GFP NALM6细胞(前B ALL细胞系)，随后四天后注射2×105 19BBz CAR T细胞。第1次注射T细胞(一种无效剂量，只能延迟肿瘤进展)十天后，再次给小鼠注射19BBz CAR T细胞，或者注射1928z或(5×l05/小鼠)。各种存活曲线显示在图15中。仅基于I928z的CAR T细胞的新鲜注射(第2次注射)能够挽救用NALM-6治疗的小鼠的复发。注射新鲜的19BBz CAR T细胞后，未观察到存活率的显著提高。
总之，CD28z CAR T细胞可以挽救4-lBBz CAR T细胞的失败。鉴于以上实施例，本文公开的修饰的CD28z CAR T细胞，例如1XX、D23和D12 CAR T细胞(具有各种铰链/TM结构域，例如CD166铰链/TM结构域)在4-lBBz CAR T细胞的抢救失败中可以甚至比1928z CAR T更有效。
实施例5
该实施例是实施例1某些方面的更新和进一步研究。
嵌合抗原受体(CAR)是靶向并重编程T细胞以获得增强的抗肿瘤特性的合成受体1。包含CD28和CD3ζ信号传导基序的CD19特异性CAR2已在难治性白血病3-5和淋巴瘤6的患者中引起了显著的应答，并在最近获得了美国食品药品监督管理局的批准7。尽管它们赋予T细胞3-6,8有限的持久性，但这些CAR编程介导有效的肿瘤根除4,8的高性能效应子功能。在不损害其效能的情况下延长其功能持久性应改善当前的CAR疗法。强烈的T细胞活化会驱动耗尽9,10，这可能会因CD28和CD3ζ信号传导的冗余11,12以及第二代CAR2的结构所赋予的时空限制而加剧。因此，据推测，校准基于CD28的CAR的活化潜能将差异地重编程T细胞的功能和分化。在这里，编码单个基于免疫受体酪氨酸的活化基序的CAR通过平衡效应子和记忆程序将T细胞引导到不同的命运，从而产生具有增强治疗特性的CAR设计。
假设包含所有三个CD3基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的嵌合抗原受体(CAR)设计中CD28和CD3信号传导的冗余性11,13可能促进适得其反的T细胞分化和耗尽9,10。因此，通过突变酪氨酸残基以阻止其磷酸化和下游信号传导来校准ITAM活性14-17。为了研究三个CD3 ITAM对1928z工程改造的T细胞的功能、分化和治疗潜能的贡献，产生了含单个ITAM的1928z突变体，称为1XX、X2X和XX3(图16A)。在另外一个称为X23的突变体中，保留了两个远端ITAM(ITAM2和ITAM3)，这两个ITAM均显示出相对于ITAM113,18更低的酪氨酸蛋白激酶ZAP-70结合亲和力。所有突变体CAR均在逆转录病毒转导的人外周血T细胞中类似表达(图16B)；它们被发现在4小时铬51(51Cr)释放试验中具有难以区分的细胞毒性，并且在用CD19抗原每周三次刺激后均具有增殖作用(图20A-20B)。
值得注意的是，在建立良好的B前急性淋巴母细胞性白血病Nalm6小鼠模型8,19,20中，表达这些突变体CAR的CAR T细胞的治疗效果有明显不同。如先前在CAR应激测试8中所述，故意降低CAR T细胞剂量以更好地比较T细胞效能。相对于亲本1928，XX3显示出显著降低的抗肿瘤功效，仅实现了短暂的肿瘤负荷减轻，而1XX超过了1928z，从而在所有小鼠中诱导了长期缓解(图16C和图20C)。与1928相比，X2X和X23的治疗并未显著改变存活率(1928对比X2X：P＝0.6942；1928对比X23：P＝0.1085)。
因此，虽然一个(1XX、X2X、XX3)、两个(X23)或三个(1928z)功能性ITAM的存在并未显著改变短期体外功能，但在体内含单个ITAM的CAR的表现优于包含三个和两个ITAM的CAR。随着功能性ITAM远端定位的增加，根除肿瘤的功效逐渐降低。1XX CAR始终显示出快速根除肿瘤的能力，并且是唯一以最低T细胞剂量实现持久且完全缓解的CAR设计。与野生型1928z相比，使用X2X进行治疗可稍微延迟肿瘤的进展，但最终会复发。XX3 CAR未实现任何肿瘤控制，导致肿瘤快速进展并显著降低了存活(图16C和图20C)。
为了研究抗肿瘤功效中这些主要差异的功能基础，对这些CAR所赋予的应答进行了更深入的研究。在较低的效应子与靶标比率的延长的(18小时)细胞毒性试验中，XX3的活性低于1928z和其它突变体(图21A)。CD19+靶标刺激后减少的颗粒酶B(GrB)的表达(图21B)和单个和多功能1型T辅助细胞(TH1)细胞因子分泌减少(图21C)进一步证实了XX3的效应子功能减弱。如CD62L/CD45RA表达所确定的，包含单个ITAM(ITAM1、2或3)可限制T细胞分化，响应于用CD19+靶标重复体外刺激，导致中央记忆CAR T细胞分数增加和效应细胞比例降低(图20D)。
这些发现在体内得到了扩展，因为具有两个非活性CD3 ITAM结构域的CAR T细胞表现出增加的持久性(图16D)和延迟的T细胞分化(图16E)。1XX、X2X和XX3 CAR T细胞均显示出较高百分比的CD62L+CD45RA-中央记忆T细胞(TCM)和终末分化CD62L-CD45RA+效应细胞(TEFF)的分数降低(图16E和图20E)。CD4+和CD8+CAR T细胞中效应子分化的减弱与两个T细胞亚群在肿瘤部位的积聚增加有关(图16D)，确立了基于CD28的第二代CAR中减少CD3信号传导的益处。
接下来研究XX3的效力较低是ITAM3固有的还是由于其远端位置。因此，产生了通过缺失剩余的CD3ζ链而在相同的近端CAR位置处具有ITAM1或ITAM3的1928ζ突变体CAR(D12和D23，图17A-17B)。体外研究表明，在4小时和18小时试验中，所有构建体之间均具有同等的溶细胞活性，细胞因子和GrB分泌不减，在D12、D23和1928ζ之间具有相当的增殖潜力(图21和22)。但是，D12和D23在体内的性能均优于1928ζ，可以完全根除肿瘤(图17C和图22D)。相对于1928ζ，这两种CAR构建体均适度减少了T细胞分化，并促进了肿瘤部位更高的CAR T细胞积聚(图17D-17E)。这些发现表明了1928ζCAR中ITAM剂量和位置的重要性。单一功能性ITAM足以实现有效的抗肿瘤功效，并且优于含三个ITAM的野生型CD3ζ链所提供的功效。此外，在其各自的天然位置(XX3对于1XX)，ITAM3所赋予的治疗效力相比于ITAM1要小，但在相同的近端位置(D12与D23)相当。尽管共享相同的ITAM序列，但D12相对于XX3仍能更好地根除肿瘤，这表明了第二代CAR中ITAM定位的重要性。
为了排除由于不同的CAR表达水平而引起的潜在混杂影响，将CAR互补DNA(cDNA)靶向TRAC基因座19，从而使转基因调节和拷贝数正常化，同时去除内源性T细胞受体(TCR；图24A)。在这些条件下，1XX CAR T细胞再次超过了表达1928z或XX3的细胞的那些(图3a)。TRAC-1XX T细胞在21天内达到了完全缓解，而TRAC-XX3T细胞仅延迟了肿瘤的进展，无法实现肿瘤控制(图18A)。在CAR输注后17天对回收的CAR T细胞和肿瘤细胞进行分析，显示在CD4+和CD8+子集中，TRAC-1XX和TRAC-XX3 CAR T细胞的积聚要高于TRAC-1928z(图18C和图24B和24E)。CAR T细胞持久性增加与TCM更高的百分比和白介素7受体(IL7R)+CAR T细胞计数有关(图24C和24D)，从而增强了19280个突变体中T细胞分化延迟的发现。与逆转录病毒改造的T细胞相似，与TRAC-1928z和TRAC-1XX细胞相比，TRAC-XX3 T细胞随着时间的流逝失去了溶细胞潜力(图24F)。与TRAC-1928z相比，1928z突变体中的耗尽标志物表达降低，并且通过从经治疗的小鼠中分离CAR并离体再暴露于Nalm6细胞后的TH1细胞因子分泌和GrB/CD107a表达降低证实了TRAC-1928z的功能耗尽(图18D和图25)。TRAC-1XX保留了高的溶细胞功能和共同产生多种细胞因子的能力，而TRAC-1928z表现出进行性无力分泌与耗尽标志物表达增加相关的TH1细胞因子。
施用两种不同的T细胞剂量(5×105和1×105CAR+T细胞)后的长期随访研究明确证明了TRAC-1XX的治疗优势。虽然与肿瘤相关的死亡发生在少于60天(用5×105CAR+T细胞治疗)或少于40天(用1×105CAR+T细胞治疗)内，当在整个观察期内，用TRAC-1XX治疗的小鼠表现出完全的肿瘤根除和存活率的提高(图18B和图29)。
当将分选的幼稚T细胞用于体内治疗时，进一步证明了1XX发展成功能强大的长寿命记忆细胞的增强能力。TRAC-1XX显示，随着时间的推移，TCM的群体和表达IL7R的细胞(与高效CAR T细胞的持久性增强有关)将增加(图26A-26C)。重要的是，TRAC-1XX CAR能够引发有效的召回应答，在肿瘤再攻击后实现完全的肿瘤控制(图18E)。持续存在的1XX CAR T细胞包含数量增加的TCM、TEFF和IL7R+CAR(图18F和18G以及图26D-26F)。相反，TRAC-1928z更容易获得耗尽的表型(图3h和图7g的扩展数据)，其伴有减少的CAR T细胞的持久性，而没有记忆形成以及无法控制肿瘤再攻击。
为了进一步表征这些不同的表型和功能模式，在CD19抗原刺激TRAC编辑的幼稚T细胞后比较了1928z、1XX和XX3的全基因组转录谱。主成分分析表明，依赖于其CD3z突变的CAR T细胞具有明显的聚集性(图27A)。与功能研究一致，与T细胞功能、分化和耗尽相关的转录组谱出现了主要差异。基因集富集分析(GSEA)揭示了相对于XX3和1XX，1928z中幼稚/记忆相关基因的下调以及T细胞活化和效应子相关基因的富集(图19A和图27B)。如所预期的，1928z CAR T细胞显示出T细胞分化、耗尽和凋亡基因表达谱的最大上调(图19B和19C以及图28A)。基因本体论和GSEA分析发现，与XX3相比的1928z中和与XX3相比的1XX中，与炎症、细胞因子和趋化因子活性相关的基因集显著上调(图19C、图28B和28C)。相对于1XX，这些基因集也富集于1928z，尽管程度较小，这与相对于1928z和XX3的1XX的中间状态一致(图19B和19C以及图28B和28C)。为了比较TRAC编辑的CAR T细胞与非基因修饰的CD8+T细胞子集的效应子和记忆特征，从静止的外周血单核细胞中分选了幼稚(TN)、干细胞记忆(TSCM两个或更多)和TEFF，因为先前已经确定了它们的特征转录谱21(图27C)。与效应子对幼稚/记忆T细胞命运相关的差异表达基因(调整后的P<0.05)区分了这些CAR构建体(图19B)。有趣的是，与TRAC-1928z和TRAC-XX3 T细胞(分别与TEFF和TN细胞的相似性更高)相比，TRAC-1XX细胞与TSCM的相似性更高(图19B)。
效应子分化的关键调节因子例如T-bet(和T-bet:Eomes比率)、PR结构域锌指蛋白1(PRDM1)和DNA结合蛋白抑制剂ID-2(参考文献22-24)的上调，同时丢失幼稚/记忆相关的标志物(例如CCR7、CD27和IL7R21)证实了1928z所出现的效应子状态的快速获取(图19B和图28C和28D)。相反，在1XX中调节的信号传导强度导致T细胞分化减慢，并且重要的记忆相关转录因子如转录因子7(TCF7)、B细胞淋巴瘤6蛋白(BCL6)、淋巴增强剂结合因子1(LEF1)和Kriippel样因子2(KLF2)的表达得以保留23-26(图19B)，进一步反映在KLF2调控基因(如CCR7、CD62L、ITGB7和S1PR1)的上调(参考文献27,28)(图19B和图28D)。虽然1XX T细胞仅表现出向分化程度低的T细胞状态的部分转变，但XX3揭示了高水平的幼稚/记忆相关的基因，以及系统抑制编码T细胞分化和效应子功能的主要转录因子的基因(图19B-19D)。这些发现强调了ITAM剂量和位置在赋予不同T细胞命运方面的关键作用。它们进一步支持将细胞命运置于信号传导强度控制下的记忆形成模型24,29。
最近的报道支持这样的观念，即分化程度较低的T细胞子集和记忆特征与过继转移的T细胞的增加的抗肿瘤效力和持久性有关30,31。这些结果扩展了这些发现，证明了T细胞分化状态可以通过CAR T细胞的CD3z链中的突变内在控制。CD28和CD3z信号传导结构域被限制在CAR内的化学计量比为1:12，这与其自然时空关系不同11。先前对CD3ζ突变的研究仅限于未发现主要作用的体外比较32-34，与体内发现的关键结果相反(图16)。体内研究表明，基于从恒定基因组基因座表达的不同信号传导基序的比较，平衡T细胞分化和效应子功能的获得对于优化CAR T细胞的治疗效力至关重要(图18和19)。据信该实验设置对于定量CAR和TCR比较是最佳的19。
总之，在应激测试条件下，1XX诱导了强大的效应子功能而没有关闭记忆程序，并且表现优于1928ζ。通过XX3进一步降低T细胞活化潜能导致高度持久的T细胞，但由于对效应子功能的激发不足，其抗肿瘤活性中等。值得注意的是，在1XX中修饰的ITAM配置有利于功能强大的CAR的持久性，平衡长寿命记忆细胞的复制能力和获得有效的抗肿瘤功能。正在利用1XX CAR设计进行临床研究的准备工作。
方法
细胞系和培养条件。如之前所示8,20，Nalm6细胞转导表达萤火虫荧光素酶(FFLuc)-绿色荧光蛋白(GFP)，鼠胸腺瘤EL4细胞和NIH/3T3细胞转导表达人CD19。使用MycoAlert支原体检测试剂盒(Lonza)定期测试细胞的支原体，且结果呈阴性。
人T细胞的分离和扩增。来自匿名健康供体的血沉棕黄层是从纽约血液中心(机构审查委员会豁免)购买的，外周血是从健康志愿者那里获得的。所有血液样本均按照所需的道德和安全程序进行处理。通过密度梯度离心分离外周血单核细胞，并用植物血凝素(2μgml-1)激活，用于使用逆转录病毒载体进行的实验，或使用Pan T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec)纯化T细胞，并如前所述19用CD3/CD28 T细胞激活剂Dynabeads(Invitrogen)刺激，并在X-VIVO 15无血清造血细胞培养基(Lonza)中培养，该培养基补充有5％的人血清(Gemini Bio-Products)、5ng ml-1白介素-7(IL7)和5ng ml-1IL15(BioLegend)用于基因靶向实验。每2天更换一次培养基，将细胞以每毫升106个细胞铺板。
对于一些实验，幼稚(TCR+CD62L+CCR7+CD45RA+CD95-)，TSCM(TCR+CD62L+CCR7+CD45RA+CD95+)和TEFF细胞(TCR+CD62L-CCR7-CD45RA+CD95+)通过流式细胞术进行了分选。然后将CAR cDNA靶向已分选的幼稚T细胞的TRAC基因座，然后进行体外培养和TCR阴性纯化，如下所述。进行基因靶向后7天，用3T3-CD19刺激T细胞24小时以进行进一步分析，或将其注射到荷瘤小鼠中。
T细胞的遗传修饰。使用先前描述的20标准分子生物学技术制备编码SFGγ逆转录病毒载体35的质粒。将来自转导的gpg29成纤维细胞(H29)的水泡性口腔炎病毒糖蛋白G(VSV-G)假型逆转录病毒上清液用于构建稳定的逆转录病毒产生细胞系36。
先前已经描述了SFG-1928ζ的合成2,20,37；它包含特异于人CD19的单链可变片段，其前面是CD8a前导肽，其后是CD28铰链跨膜细胞内区域，以及与P2A序列相连的CD3ζ或ITAM突变/缺失的CD3ζ细胞内结构域，以诱导截短的低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)的共表达。使用标准分子生物学技术构建1928ζ突变体。引入CD3ζ链的ITAM中的酪氨酸到苯丙氨酸的点突变，以产生具有一或两个功能性ITAM的1928ζCAR。对于缺失突变，保留膜近端的ITAM序列(ITAM1)或用膜远端ITAM(ITAM3)序列替代，并删除剩余的CD3ζ结构域。启动T细胞活化后48小时，如前所述，在RetroNectin包被的平板(Takara)上通过离心，用逆转录病毒上清液转导T细胞。通过流式细胞术测定4天后的转导效率，并将CAR注射入荷瘤小鼠或用于体外实验。
如先前所述19进行基因靶向实验。简而言之，通过TriLink生物技术合成了靶向TRA基因恒定链的第一个外显子的修饰的向导RNA(gRNA)19和Cas9信使RNA(mRNA)。pAAV-TRAC-1928ζ是基于pAAV-GFP骨架(Cell Biolabs)克隆的。pAAV-TRAC-1928ζ包含1.9kb基因组TRAC，其位于gRNA靶向序列的两侧，自切割的P2A肽与TRAC的第一外显子，其后是如前所述的1928ζ或1928ζ突变体CAR。在CAR cDNA之后是牛生长激素polyA信号。
在启动T细胞活化后48小时磁性除去CD3/CD28珠。用AgilePulse MAX系统(BTX)通过Cas9 mRNA和gRNA的电转移来转染T细胞，并如前所述19在电穿孔后将重组AAV6供体载体(SignaGen Laboratories制造)加入培养物中。为了获得TCR阴性T细胞，使用磁性生物素抗TCRαβ、抗生物素微珠和LS柱(Miltenyi Biotec)从培养物中去除TCR阳性T细胞。
细胞毒性测定。通过标准51Cr释放测定法和基于荧光素酶的测定法来确定用CAR转导的T细胞的细胞毒性。对于51Cr释放测定法，如先前所述38，将表达CD19的EL4用作靶细胞。对于基于荧光素酶的测定法，表达FFLuc-GFP的Nalm6用作靶细胞。将效应子和肿瘤靶细胞以指定的效应子/靶标比率三次重复共培养，使用黑壁96孔板，每孔总体积100μl的Nalm6培养基中含有5×104个靶细胞。仅将靶细胞以相同的细胞密度铺板，以确定最大的荧光素酶表达(相对光单位(RLU))；18小时后，将100μl荧光素酶底物(Bright-Glo；Promega)直接加入到每个孔中。在发光板读取器中检测到发光。裂解确定为(1-(RLUsample)/(RLUmax))×100。
抗原刺激和增殖测定。转导后四天，将CAR T细胞与辐照的融合CD19+NIH/3T3在24孔组织培养板中以每ml 106CAR+共培养。每周在新鲜培养基中进行相同的刺激。计数总细胞并通过流式细胞术每周测定CAR表达。随后，在相同条件下对CAR T细胞进行再刺激。
小鼠全身肿瘤模型。根据纪念斯隆·凯特琳癌症中心(MSKCC)机构动物护理和使用委员会批准的方案，使用6至12周龄的NOD/SCID/IL-2Rγ空白雄性小鼠(杰克逊实验室)。遵守所有相关的动物使用指南和道德规范。通过尾静脉注射向小鼠接种0.5×106FFLuc-GFP NALM6细胞，注射4天后，然后注射5×104、1×105或5×105CAR T细胞。通过在指定的时间点以7-10天的间隔静脉内施用0.5×106、1×106或2×106FFLuc-GFP Nalm6细胞进行肿瘤再攻击实验。Nalm6产生非常均匀的肿瘤负荷，并且在治疗前没有排除任何小鼠。没有使用随机或盲法。使用IVIS成像系统(PerkinElmer)和Living Image软件(PerkinElmer)进行生物发光成像，以获取成像数据集。如先前所述评估肿瘤负荷39。
RNA提取，转录组测序和RNA序列分析。对分选的幼稚T细胞进行基因靶向后7天，用辐照的3T3-CD19刺激TRAC-1928ζ、TRAC-XX3和TRAC-1XX 24小时，然后磁选CD8+细胞(Miltenyi Biotec)。将洗涤的T细胞重悬于250μ1PBS中，并置于750μ1TRIzol LS Reagent(Thermo Fisher Scientific)中。按照制造商提供的说明使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)提取RNA。使用Agilent Bioanalyzer对RiboGreen RNA进行定量和质量控制后，按照制造商提供的说明(TruSeq链式mRNA LT试剂盒；Illumina)，使用8个PCR循环，对500ng总RNA进行polyA选择和TruSeq RNA文库的制备。使用HiSeq 3000/4000SBS试剂盒(Illumina)对样品进行条形码编码，并在HiSeq 4000(Illumina)上以50个碱基对(bp)/50bp的配对末端运行。每个样本平均产生3060万对配对读数。核糖体读数最多占产生的总读数的4.69％；mRNA碱基的百分比平均为69.3％。
使用STAR RNA-seq aligner(版本2.5.0a；两次通过方法)40将输出的FASTQ数据映射到目标基因组，从而解决了跨接合点的读取问题。第一次映射过程使用了Ensemble的已知带注释的接合点列表(https://www.ensembl.org/index.html)。然后将在第一遍中找到的接合点添加到已知接合点中，并使用RemoveNoncanonical标志完成第二次映射过程。映射后，使用PICARD工具(版本1.124；https://broadinstitute.github.io/picard/)处理了输出的SAM文件(SAMtools，版本0.1.19)以添加读取组和AddOrReplaceReadGroups，还对文件进行排序并将其转换为压缩的BAM格式。然后使用HTSeq(版本0.5.3；https://htseq.readthedocs.io/en/release_0.10.0/)和几种可能的基因模型数据库之一，从映射的读数中计算出表达计数矩阵。使用R(版本3.2.0)包DESeq(https://www.huber.embl.de/users/anders/DESeq/)既可以对整个数据集进行规范化，也可以分析样本组之间的差异表达。
从Gattinoni等人21检索了T细胞子集(TN、TCM、TSCM、TEFF细胞)之间差异表达的基因。GSEA是使用预先排序的文件执行的，该文件使用来自Broad Institute分子签名数据库(http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/)的选定途径基因集上的log2(倍数变化)产生。所展示的基因签名来自免疫签名C7，Reactome，KEGG和基因本体论(BiologicalProcess)基因集。GSE41867用于耗尽的对幼稚/记忆CD8 T细胞的GSEA，并用于管理相对于记忆和幼稚细胞在耗尽的CD8 T细胞(在淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染后30天)中上调的200个基因的签名。使用R包richR(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)，将经鉴定为在实验条件之间差异表达的基因(调整后的P值<0.05和绝对log2(倍数变化)>1)用于基因本体分析。
抗体和细胞内染色。使用以下结合了荧光团的抗体。来自BD Biosciences：APC-Cy7小鼠抗人CD8；APC-Cy7小鼠抗人CD45；BUV395小鼠抗人CD4；PE小鼠抗人CD4；BB515小鼠抗人CD4；BV421小鼠抗人CD62L；BV650小鼠抗人类CD45RA；BV421小鼠抗人CD45RA；BV480小鼠抗人CD279(PD-1)；BV650小鼠抗人CD279(PD-1)；BUV737小鼠抗人CD19；BV421小鼠抗人TIM3(CD366)；BB515小鼠抗人CD95；APC-H7小鼠抗人CD27；PE小鼠抗人CD271(LNGFR)。来自BioLegend：APC抗人CD8a；APC/Cy7抗人CD62L；FITC抗人CD45RA；Brillian Violet 785抗人CD366(Tim-3)；PE抗人CD127(IL-7Rα)；Alexa Fluor 488抗人CD127(IL-7Rα)；PerCP/Cyanine5.5抗人CD197(CCR7)；Brillian Violet 650抗人CD28。来自Invitrogen：CD8a单克隆抗体(RPA-T8)、PE-花菁7；CD223(LAG-3)单克隆抗体(3DS223H)PerCP-eFluor 710；CD223(LAG-3)单克隆抗体(3DS223H)，APC；InvitrogenTCRα/β单克隆抗体(IP26)，PE-花菁7。来自Miltenyi Biotec：人单克隆抗TCRα/β-PE。将7-AAD(BD Biosciences)和LIVE/DEAD固定的紫罗兰色死细胞染色试剂盒(Invitrogen)用作活性染料。
为了进行CAR染色，使用了Alexa Fluor 647AffmiPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG，其为F(ab')2片段特异性抗体(Jackson ImmunoResearch)。对于细胞计数，根据制造商的说明添加了CountBright Absolute Counting Beads(Invitrogen)。对于体内实验，使用小鼠FcR阻断剂(Miltenyi Biotec)阻断Fc受体。
为了进行细胞内细胞因子分泌测定，将T细胞与3T3-CD19或Nalm6在高尔基塞蛋白转运抑制剂(BD Biosciences)的存在下共培养最后4小时。对于CD107a染色，将BrilliantViolet 650抗人CD107a(LAMP-1)抗体(BioLegend)加入到共培养物中。对于体外细胞因子分析，从经治疗小鼠的骨髓和脾脏中获得CAR T细胞，并使用小鼠细胞耗竭试剂盒(Miltenyi Biotec)进行纯化。将样品以生物学三次重复(d16)进行处理或合并(由于1928ζ治疗的小鼠中细胞数低)，并进行了技术性三次重复(d36)。以豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(PMA)/离子霉素(Invitrogen)刺激作为阳性对照。随后按照制造商的说明使用Cytofix/Cytoperm固定/透化溶液试剂盒(BD Biosciences)洗涤T细胞、对细胞表面标志物进行染色、固定和透化。用BV421大鼠抗人IL2、BV650小鼠抗人TNF、BUV395小鼠抗人TNF、BUV395小鼠抗人IFN-γ或FITC小鼠抗人IFN-γ(所有来自BD Biosciences)，以及APC或PE颗粒酶B单克隆抗体(GB12，均来自Invitrogen)进行细胞内细胞因子染色。
在LSR II或LSRFortessa仪器(BD Biosciences)上进行流式细胞术，并使用FACSAria分选仪(BD Biosciences)进行细胞分选。使用FlowJo软件v.10.1(FlowJo LLC)分析数据。
统计分析。所有统计分析均使用Prism 7(GraphPad)软件进行。没有使用统计方法来预先确定样本量。两组之间的统计比较是通过两尾参数或非参数(曼恩-惠特尼U检验)t检验来确定未配对数据或通过两尾配对学生t检验来确定匹配的样本。对于体内实验，总体存活用Kaplan-Meier曲线表示，对数秩检验用于比较各组之间的存活差异。P值<0.05被认为具有统计学意义。每个图所用的统计检验在相应的图例中描述。
报告总结。有关研究设计的更多信息，请参见与本文链接的自然研究报告总结。
数据可用性
RNA-seq数据已经保存在Gene Expression Omnibus中，并且可以以登录号GSE121226获得。原稿中的图形原始数据将根据要求提供给相应的作者。
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本公开的主题的实施方式
从前面的描述中，将显而易见的是，可以对本公开的主题进行变型和修改以将其应用于各种用途和条件。这样的实施方式也在所附权利要求的范围内。
本文所述变量定义中的元素列表包括将变量定义为列出的元素的任何单个元素或组合(或子组合)。本文所述实施方式包括将该实施方式作为任何单一实施方式或与任何其它实施方式或其部分相结合。
本说明书中提到的所有专利和出版物都以相同的程度并入本文以供参考，就如同每个独立的专利和出版物都被具体地和单独地指出以并入以供参考一样。

Claims (139)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中所述修饰的CD3ζ多肽缺乏全部或部分的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，其中所述ITAM是ITAM1、ITAM2和ITAM3。
2.根据权利要求1所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽缺乏ITAM2或其部分。
3.根据权利要求2所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽还缺乏ITAM3或其部分。
4.根据权利要求2所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽还缺乏ITAM1或其部分。
5.根据权利要求1所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽缺乏ITAM1或其部分。
6.根据权利要求5所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽还缺乏ITAM3或其部分。
7.根据权利要求1所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽缺乏ITAM3或其部分。
8.根据权利要求1所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含ITAM2或其部分的缺失。
9.根据权利要求8所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽还包含ITAM3或其部分的缺失。
10.根据权利要求8所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽还包含ITAM1或其部分的缺失。
11.根据权利要求1所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含ITAM1或其部分的缺失。
12.根据权利要求11所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽还包含ITAM3或其部分的缺失。
13.根据权利要求1所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含ITAM3或其部分的缺失。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽缺乏全部或部分的富碱性拉伸(BRS)区，其中所述BRS区是BRS1、BRS2和BRS3。
15.根据权利要求14所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS2或其部分。
16.根据权利要求15所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽还缺乏BRS3或其部分。
17.根据权利要求16所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽还缺乏BRS1或其部分。
18.根据权利要求14所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS1或其部分。
19.根据权利要求18所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽还缺乏BRS3或其部分。
20.根据权利要求14所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS3或其部分。
21.根据权利要求14所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS1或其部分、BRS2或其部分、和BRS3或其部分。
22.根据权利要求1所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽缺乏ITAM2、ITAM3、BRS2和BRS3。
23.根据权利要求14所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含BRS2或其部分的缺失。
24.根据权利要求23所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽还包含BRS3或其部分的缺失。
25.根据权利要求24所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽还包含BRS1或其部分的缺失。
26.根据权利要求14所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含BRS1或其部分的缺失。
27.根据权利要求26所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽还包含BRS3或其部分的缺失。
28.根据权利要求14所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含BRS3或其部分的缺失。
29.根据权利要求14所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含以下的缺失：BRS1或其部分、BRS2或其部分、和BRS3或其部分。
30.根据权利要求1所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含以下的缺失：ITAM2、ITAM3、BRS2和BRS3。
31.根据权利要求1所述的CAR，其中所述CAR包含如SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列。
32.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中所述修饰的CD3ζ多肽缺乏全部或部分的富碱性拉伸(BRS)区，其中所述BRS区是BRS1、BRS2和BRS3。
33.根据权利要求32所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS2或其部分。
34.根据权利要求33所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽还缺乏BRS3或其部分。
35.根据权利要求34所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽还缺乏BRS1或其部分。
36.根据权利要求35所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS1或其部分。
37.根据权利要求36所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽还缺乏BRS3或其部分。
38.根据权利要求37所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS3或其部分。
39.根据权利要求32所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽缺乏BRS1或其部分、BRS2或其部分、和BRS3或其部分。
40.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含选自BRS1变体、BRS2变体和BRS3变体的BRS变体，其中所述BRS变体包含一个或多个功能丧失突变。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的CAR，其还包含铰链/间隔区，其中所述铰链/间隔区包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、CD166多肽、CD166多肽、CD8a多肽、CD8b多肽、ICOS多肽、ICAM-1多肽、CTLA-4多肽、CD27多肽、CD40/My88肽、NKGD2肽、或其组合。
42.根据权利要求41所述的CAR，其中所述铰链/间隔区包含CD166多肽。
43.根据权利要求42所述的CAR，其中所述CD166多肽具有SEQ ID NO：3的氨基酸489至527。
44.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、铰链/间隔区、跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域，
其中所述修饰的CD3ζ多肽包含一个或多个ITAM变体，所述ITAM变体包含一个或多个功能丧失突变，其中所述一个或多个ITAM变体中的每一个独立地选自ITAM1变体、ITAM2变体和ITAM3变体，和
其中所述铰链/间隔区包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、CD166多肽、CD166多肽、CD8a多肽、CD8b多肽、ICOS多肽、ICAM-1多肽、CTLA-4多肽、CD27多肽、CD40/My88肽、NKGD2肽、或其组合。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含ITAM2变体和ITAM3变体。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述ITAM2变体具有如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述ITAM3变体具有如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列。
48.根据权利要求44-47中任一项所述的CAR，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含SEQ IDNO：43的氨基酸374至485或由其组成。
49.根据权利要求44-48中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含如SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列。
50.根据权利要求45-49中任一项所述的方法，其中所述ITAM2变体和ITAM3变体中之一或两者包含两个功能丧失突变。
51.根据权利要求44-50中任一项所述的方法，其中所述一个或多个功能丧失突变位于酪氨酸氨基酸残基处。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含CD8多肽、CD28多肽、CD3ζ多肽、CD4多肽、4-1BB多肽、OX40多肽、CD166多肽、CD166多肽、CD8a多肽、CD8b多肽、ICOS多肽、ICAM-1多肽、CTLA-4多肽、CD27多肽、CD40/My88肽、NKGD2肽、或其组合。
53.根据权利要求52所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含CD166多肽。
54.根据权利要求53所述的CAR，其中所述CD166多肽包含SEQ ID NO：3的氨基酸528至553。
55.根据权利要求44-54中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域和所述铰链/间隔区来源于相同分子。
56.根据权利要求44-55中任一项所述的CAR，其中所述铰链/间隔区包含CD28多肽，且所述跨膜结构域包含CD28多肽。
57.根据权利要求44-56中任一项所述的CAR，其中所述铰链/间隔区包含CD84多肽，且所述跨膜结构域包含CD84多肽。
58.根据权利要求44-57中任一项所述的CAR，其中所述铰链/间隔区包含CD166多肽，且所述跨膜结构域包含CD166多肽。
59.根据权利要求58所述的CAR，其中所述CAR包含SEQ ID NO：3的氨基酸489至553。
60.根据权利要求44-59中任一项所述的CAR，其中所述铰链/间隔区包含CD8a多肽，且所述跨膜结构域包含CD8a多肽。
61.根据权利要求44-60中任一项所述的CAR，其中所述铰链/间隔区包含CD8b多肽，且所述跨膜结构域包含CD8b多肽。
62.根据权利要求44-54中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域和所述铰链/间隔区来源于不同分子。
63.根据权利要求62所述的CAR，其中所述铰链/间隔区包含CD28多肽，且所述跨膜结构域包含ICOS多肽。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域还包含共刺激信号传导结构域。
65.根据权利要求65所述的CAR，其中所述共刺激信号传导结构域包含CD28多肽。
66.一种免疫应答细胞，其包含权利要求1-65中任一项所述的CAR。
67.根据权利要求66所述的免疫应答细胞，其中所述CAR是重组表达的。
68.根据权利要求66或67所述的免疫应答细胞，其中所述CAR由载体表达。
69.根据权利要求66-68中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述CAR置于所述免疫应答细胞的内源性基因座。
70.根据权利要求69所述的免疫应答细胞，其中所述内源性基因座是TRAC基因座、TRBC基因座或TRGC基因座。
71.根据权利要求69或70所述的免疫应答细胞，其中所述内源性基因座是TRAC基因座。
72.根据权利要求69-71中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述CAR的放置破坏或消除TCR的内源性表达。
73.根据权利要求66-72中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、髓样细胞、人胚胎干细胞、和可从中分化出淋巴样细胞的多能干细胞。
74.根据权利要求66-73中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞是自体的。
75.根据权利要求66-74中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述抗原是肿瘤抗原。
76.根据权利要求75所述的免疫应答细胞，其中所述肿瘤抗原选自CD19、MUC16、MUC1、CA1X、CEA、CD8、CD7、CD10、CD20、CD22、CD30、CLL1、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD133、CD138、EGP-2、EGP-40、EpCAM、erb-B2,3,4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、叶酸受体-a、GD2、GD3、HER-2、hTERT、IL-13R-a2、K-轻链、KDR、LeY、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、ERBB2、MAGEA3、p53、MART1、GP100、蛋白酶3(PR1)、酪氨酸酶、存活蛋白、hTERT、EphA2、NKG2D配体、NY-ES0-1、癌胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、ROR1、TAG-72、VEGF-R2、WT-1、BCMA、CD123、CD44V6、NKCS1、EGF1R、EGFR-VIII、和CD99、CD70、ADGRE2、CCR1、LILRB2、PRAME、CCR4、CD5、CD3、TRBC1、TRBC2、TIM-3、整合素B7、ICAM-1、CD70、Tim3、CLEC12A和ERBB。
77.根据权利要求77所述的免疫应答细胞，其中所述抗原是CD19。
78.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求66-77中任一项所述的免疫应答细胞和药学上可接受的赋形剂。
79.根据权利要求78所述的药物组合物，其用于治疗肿瘤。
80.一种降低受试者中肿瘤负荷的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求66-77中任一项所述的免疫应答细胞或权利要求78或79所述的药物组合物。
81.一种降低受试者中肿瘤负荷的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的免疫应答细胞或包含其的药物组合物，其中所述免疫应答细胞包含：
嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含一个或多个ITAM变体，所述ITAM变体包含一个或多个功能丧失变体，其中所述一个或多个ITAM变体中的每一个独立地选自ITAM1变体、ITAM2变体和ITAM3变体。
82.根据权利要求81或82所述的方法，其中所述方法减少肿瘤细胞的数量。
83.根据权利要求81-83中任一项所述的方法，其中所述方法减小肿瘤大小。
84.根据权利要求81-84中任一项所述的方法，其中所述方法根除所述受试者中的肿瘤。
85.一种治疗或预防肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求66-77中任一项所述的免疫应答细胞或权利要求78或79所述的药物组合物。
86.一种治疗或预防肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的免疫应答细胞或包含其的药物组合物，其中所述免疫应答细胞包含：
嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含一个或多个ITAM变体，所述ITAM变体包含一个或多个功能丧失突变，其中所述一个或多个ITAM变体中的每一个独立地选自ITAM1变体、ITAM2变体和ITAM3变体。
87.根据权利要求80-86中任一项所述的方法，其中所述肿瘤或瘤选自血癌、B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、和卵巢癌。
88.根据权利要求80-87中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病或非霍奇金氏淋巴瘤，并且所述CAR结合CD19。
89.根据权利要求80-87中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病或非霍奇金氏淋巴瘤，并且所述CAR结合BCMA、ADGRE2、MSLN、PSMA、或其组合。
90.一种治疗患有肿瘤复发的受试者的方法，其中所述受试者患有疾病的复发，其中所述受试者接受过导致残留肿瘤细胞的治疗，或所述受试者接受过包含抗原识别受体的免疫应答细胞，其中所述抗原识别受体包含4-1BB共刺激信号，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求66-77中任一项所述的免疫应答细胞或权利要求78或79所述的药物组合物。
91.一种治疗患有肿瘤复发的受试者的方法，其中所述受试者患有疾病的复发，其中所述受试者接受过导致残留肿瘤细胞的治疗，或所述受试者接受过包含抗原识别受体的免疫应答细胞，其中所述抗原识别受体包含4-1BB共刺激信号，所述方法包括向所述受试者施用有效量的免疫应答细胞或包含其的药物组合物，其中所述免疫应答细胞包含：
嵌合抗原受体(CAR)，其包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含一个或多个ITAM变体，所述ITAM变体包含一个或多个功能丧失突变，其中所述一个或多个ITAM变体中的每一个独立地选自ITAM1变体、ITAM2变体和ITAM3变体。
92.根据权利要求90或91所述的方法，其中所述肿瘤选自血癌、B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金氏淋巴瘤。
93.根据权利要求90-92中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病或非霍奇金氏淋巴瘤，并且所述CAR结合CD19。
94.根据权利要求90-93所述的方法，其中所述肿瘤是CD19+ALL。
95.根据权利要求90-94所述的方法，其中所述肿瘤包含在肿瘤细胞表面上具有低密度肿瘤特异性抗原的肿瘤细胞。
96.权利要求66-77中任一项所述的免疫应答细胞或权利要求78或79所述的药物组合物，其用于减轻肿瘤负荷、治疗或预防肿瘤、和/或治疗患有肿瘤复发的受试者。
97.一种嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含修饰的CD3ζ多肽的细胞内信号传导结构域，其中所述修饰的CD3ζ多肽包含一个或多个ITAM变体，所述ITAM变体包含一个或多个功能缺失突变，其中所述一个或多个ITAM变体中的每一个独立地选自ITAM1变体、ITAM2变体和ITAM3变体，所述CAR用于减轻肿瘤负荷、治疗或预防肿瘤、和/或治疗患有肿瘤复发的受试者。
98.一种产生抗原特异性免疫应答细胞的方法，所述方法包括将编码权利要求1-65中任一项所述的CAR的核酸序列导入免疫应答细胞。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述核酸序列包含在载体中。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述载体是逆转录病毒载体。
101.一种分离的核苷酸，其编码权利要求1-65中任一项所述的CAR。
102.根据权利要求101所述的分离的核苷酸，其包含如SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：47所示的核苷酸序列。
103.一种核酸组合物，其包含权利要求1-65中任一项所述的CAR。
104.根据权利要求103所述的核酸组合物，其中所述核酸序列包含在载体中。
105.根据权利要求104所述的核酸组合物，其中所述载体是逆转录病毒载体。
106.一种载体，其包含权利要求103-105中任一项所述的核酸组合物。
107.一种试剂盒，其包含权利要求1-65中任一项所述的CAR、权利要求66-77中任一项所述的免疫应答细胞、权利要求78或79所述的药物组合物、权利要求103-105中任一项所述的核酸组合物、或权利要求106所述的载体。
108.根据权利要求107所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含用于治疗和/或预防肿瘤、病原体感染、自身免疫性疾病或同种异体移植的书面说明书。
109.一种免疫应答细胞，其包含a)第一CAR，其包含结合第一抗原的第一细胞外抗原结合结构域、第一跨膜结构域和第一细胞内信号传导结构域；b)第二CAR，其包含结合第二抗原的第二细胞外抗原结合结构域、第二跨膜结构域和第二细胞内信号传导结构域，其中所述第一CAR是权利要求1-65中任一项所述的CAR，或所述第一细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，所述修饰的CD3ζ多肽包含一个或多个ITAM变体，所述ITAM变体包含一个或多个功能丧失突变，其中所述一个或多个ITAM变体中的每一个独立地选自ITAM1变体、ITAM2变体、和ITAM3变体。
110.根据权利要求109所述的免疫应答细胞，其中所述第二CAR是权利要求1-65中任一项所述的CAR。
111.根据权利要求109所述的免疫应答细胞，其中所述第二CAR的所述第二细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，所述修饰的CD3ζ多肽包含一个或多个ITAM变体，所述ITAM变体包含一个或多个功能丧失突变，其中所述一个或多个ITAM变体中的每一个独立地选自ITAM1变体、ITAM2变体、和ITAM3变体。
112.根据权利要求109所述的免疫应答细胞，其中所述第二CAR的所述第二细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其与包含在所述第一CAR中的所述第一细胞内信号传导结构域中的修饰的CD3ζ多肽相同。
113.根据权利要求109所述的免疫应答细胞，其中所述第二CAR的所述第二细胞内信号传导结构域包含修饰的CD3ζ多肽，其不同于包含在所述第一CAR中的所述第一细胞内信号传导结构域中的修饰的CD3ζ多肽。
114.根据权利要求109所述的免疫应答细胞，其中所述第二CAR的所述第二细胞内信号传导结构域包含天然CD3ζ多肽。
115.根据权利要求109-113中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一CAR的所述第一细胞内信号传导结构域与所述第二CAR的所述第二细胞内信号传导结构域相同。
116.根据权利要求109-114中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一CAR的所述第一细胞内信号传导结构域不同于所述第二CAR的所述第二细胞内信号传导结构域。
117.根据权利要求109-116中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一抗原不同于所述第二抗原。
118.根据权利要求109-117中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一CAR还包含第一铰链/间隔区。
119.根据权利要求109-118中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第二CAR还包含第二铰链/间隔区。
120.根据权利要求109-119中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2变体和ITAM3变体，且所述第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2或其部分的缺失和ITAM3或其部分的缺失。
121.根据权利要求109-119中任一项所述的免疫应答细胞，其中所述第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2变体和ITAM3变体，且所述第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体。
122.根据权利要求109-121中任一项所述的免疫应答细胞，其还包含第三CAR，其包含结合第三抗原的第三细胞外抗原结合结构域、第三跨膜结构域和第三细胞内信号传导结构域。
123.根据权利要求122所述的免疫应答细胞，其中所述第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2变体和ITAM3变体，所述第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2或其部分的缺失和ITAM3或其部分的缺失，且所述第三细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体。
124.根据权利要求122所述的免疫应答细胞，其中所述第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2或其部分的缺失和ITAM3或其部分的缺失，所述第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2或其部分的缺失和ITAM3或其部分的缺失，且所述第三细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体。
125.根据权利要求122所述的免疫应答细胞，其中所述第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM2或其部分的缺失和ITAM3或其部分的缺失，所述第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体，且所述第三细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体。
126.根据权利要求122所述的免疫应答细胞，其中所述第一细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体，所述第二细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体，且所述第三细胞内信号传导结构域包含或具有ITAM1变体和ITAM2变体。
127.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求109-126中任一项所述的免疫应答细胞和药学上可接受的赋形剂。
128.根据权利要求109-126中任一项所述的免疫应答细胞或权利要求127所述的药物组合物，其用于减轻肿瘤负荷、治疗或预防肿瘤、和/或治疗患有肿瘤复发的受试者。
129.一种降低受试者中肿瘤负荷的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求109-126中任一项所述的免疫应答细胞或权利要求127所述的药物组合物。
130.根据权利要求129所述的方法，其中所述方法减少肿瘤细胞的数量、减小肿瘤大小、和/或根除所述受试者中的肿瘤。
131.一种治疗或预防肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求109-126中任一项所述的免疫应答细胞或权利要求127所述的药物组合物。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述肿瘤或瘤选自血癌、B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金氏淋巴瘤和卵巢癌。
133.根据权利要求131或132所述的方法，其中所述肿瘤是B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病或非霍奇金氏淋巴瘤，并且所述CAR结合CD19。
134.根据权利要求131-133中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病或非霍奇金氏淋巴瘤，并且所述CAR结合BCMA、ADGRE2、MSLN、PSMA、或其组合。
135.一种治疗患有肿瘤复发的受试者的方法，其中所述受试者患有疾病的复发，其中所述受试者接受过导致残留肿瘤细胞的治疗，或所述受试者接受过包含抗原识别受体的免疫应答细胞，其中所述抗原识别受体包含4-1BB共刺激信号，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求109-126中任一项所述的免疫应答细胞或权利要求127所述的药物组合物。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述肿瘤选自血癌、B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金氏淋巴瘤。
137.根据权利要求135或136所述的方法，其中所述肿瘤是B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病或非霍奇金氏淋巴瘤，且所述CAR结合CD19。
138.根据权利要求135-137所述的方法，其中所述肿瘤是CD19+ALL。
139.根据权利要求135-138所述的方法，其中所述肿瘤包含在肿瘤细胞表面上具有低密度肿瘤特异性抗原的肿瘤细胞。
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