JP2023504560A - ｃ－Ｋｉｔ変異を発現する細胞およびその使用 - Google Patents

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Abstract

本開示は、がんおよび病原体に対する免疫応答を増強するための方法および組成物を提供する。本開示の主題は、がんおよび病原体に対する免疫応答を増強するための方法および組成物を提供する。本開示の主題は、ｃ－Ｋｉｔ変異体、例えば、活性化変異を含むｃ－Ｋｉｔ変異体を含む細胞に関する。細胞は、抗原認識受容体（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ））をさらに含み得る。本開示の主題は、処置、例えば、がんの処置のための細胞の使用に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、それに対する優先権が主張される、２０１９年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６２／９４３，０３２号に対する優先権を主張する。
配列表
本出願は、ＥＦＳ－ＷｅｂによってＡＳＣＩＩ形式で提出され、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年１２月３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０７２７３４１１７４＿ＳＴ２５という名称であり、５７，７９０バイトのサイズである。
１．緒言
本開示の主題は、がんおよび病原体に対する免疫応答を増強するための方法および組成物を提供する。本開示の主題は、ｃ－Ｋｉｔ変異体、例えば、活性化変異を含むｃ－Ｋｉｔ変異体を含む細胞に関する。細胞は、抗原認識受容体（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ））をさらに含み得る。本開示の主題は、処置、例えば、がんの処置のための細胞の使用に関する。
２．発明の背景
細胞ベースの免疫療法は、がんの処置のための治癒的潜在力を有する治療である。Ｔ細胞および他の免疫細胞は、選択された抗原に特異的な、自然のもしくは改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ばれる、抗原に対する合成受容体をコードする遺伝物質の導入を介して、腫瘍抗原を標的化するように改変され得る。患者操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は、様々な液性および固形悪性腫瘍に対する著しい有効性を実証している。
臨床および前臨床開発にあるＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８または４－１ＢＢを主に使用する。これらのＣＡＲの持続性、特に機能的持続性は、より良好な結果に関連することが示されている。既存のＣＡＲと比較して、共刺激ドメインなしに増強された増殖および持続性を有する、ならびに／または改善された効率および活性を有する改善されたＣＡＲへの要求は、満たされていない。
３．発明の概要
本開示の主題は、（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体、および（ｂ）ヒトｃ－Ｋｉｔの変異体を含む細胞を提供する。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ変異体は、活性化変異を含む。
ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔはヒトｃ－Ｋｉｔである。ある特定の実施形態では、活性化変異は、ヒトｃ－Ｋｉｔの細胞内領域内にある。ある特定の実施形態では、細胞内領域は、ヒトｃ－Ｋｉｔのアミノ酸５４４～９７７を含む。
ある特定の実施形態では、活性化変異は、ヒトｃ－Ｋｉｔのアミノ酸８１６～８２６内にある。ある特定の実施形態では、活性化変異は、アミノ酸８１６位またはアミノ酸８２２位にある。
ある特定の実施形態では、活性化変異は、ヒトｃ－Ｋｉｔのアミノ酸５５０～５７０内にある。ある特定の実施形態では、活性化変異は、ヒトｃ－Ｋｉｔのアミノ酸５６０位にある。
ある特定の実施形態では、活性化変異は、Ｄ８１６Ｖ、Ｄ８１６Ｙ、Ｄ８１６Ｈ、Ｄ８１６Ｆ、Ｎ８２２Ｋ、Ｖ５６０Ｇ、またはそれらの組合せから選択される。ある特定の実施形態では、活性化変異は、Ｄ８１６Ｖを含むかまたはそれからなる。
ある特定の実施形態では、ヒトｃ－Ｋｉｔは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
ある特定の実施形態では、変異体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、変異体は、配列番号２のアミノ酸５４３～９７６からなる。
ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ変異体は、誘導性プロモーターに作動可能に連結している。ある特定の実施形態では、誘導性プロモーターは、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）、転写応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーターおよびＩＬ－２プロモーターから選択される。
ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ変異体は、細胞の細胞持続性を増強する。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ変異体は、細胞のアポトーシスまたはアネルギーを低減する。
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、外因性または内因性である。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、組換え発現される。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ベクターから発現される。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ変異体は、ベクターから発現される。
ある特定の実施形態では、細胞は、免疫応答性細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、リンパ系列の細胞または骨髄系列の細胞である。ある特定の実施形態では、リンパ系列の細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞から選択される。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、γδＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、制御性Ｔ細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。
ある特定の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原または病原体抗原である。ある特定の実施形態では、抗原は腫瘍抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、メソテリン、ＣＤ１９、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥｐＣＡＭ、Ｅｒｂ－Ｂ２、ｅｒｂ－Ｂ３、Ｅｒｂ－Ｂ４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体－ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ－２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、Ｋ－軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＥＲＢＢ２、ＭＡＧＥＡ３、ＣＴ８３（ＫＫ－ＬＣ－１としても公知）、ｐ５３、ＭＡＲＴ１、ＧＰ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ－７２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＷＴ－１、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４Ｖ６、ＮＫＣＳ１、ＥＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＣＤ９９、ＣＤ７０、ＡＤＧＲＥ２、ＣＣＲ１、ＬＩＬＲＢ２、ＰＲＡＭＥ、ＨＰＶ Ｅ６腫瘍性タンパク質、ＨＰＶ Ｅ７腫瘍性タンパク質およびＥＲＢＢからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、抗原はメソテリンである。
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＴＣＲ様融合分子から選択される。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体はＣＡＲである。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲが、共刺激シグナル伝達領域を含まない。
さらに、本開示は、抗原特異的免細胞を生成するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体をコードする第１の核酸配列；および（ｂ）活性化変異を含むｃ－Ｋｉｔ変異体をコードする第２の核酸配列を、細胞内に導入するステップを含む。ある特定の実施形態では、第１の核酸配列は、第１のプロモーターに作動可能に連結している。ある特定の実施形態では、第２の核酸配列は、第２のプロモーターに作動可能に連結している。ある特定の実施形態では、第１および第２の核酸配列の一方または両方は、ベクター中に含まれる。ある特定の実施形態では、ベクターはレトロウイルスベクターである。
さらに、本開示は、ａ）活性化変異を含むヒトｃ－Ｋｉｔの変異体；およびｂ）抗原に結合する抗原認識受容体を含む組成物を提供する。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ変異体は、第１のプロモーターに作動可能に連結している。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、第２のプロモーターに作動可能に連結している。ある特定の実施形態では、第１および第２のプロモーターの一方または両方は、誘導性プロモーターである。ある特定の実施形態では、誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴ転写応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーターおよびＩＬ－２プロモーターから選択される。本開示は、本明細書に開示される組成物を含む細胞をさらに提供する。
さらに、本開示は、（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体をコードする第１のポリヌクレオチド、および（ｂ）活性化変異を含むヒトｃ－Ｋｉｔの変異体をコードする第２のポリヌクレオチドを含む核酸組成物を提供する。ある特定の実施形態では、核酸組成物は、ｃ－Ｋｉｔ変異体に作動可能に連結している第１のプロモーターをさらに含む。ある特定の実施形態では、核酸組成物は、抗原認識受容体に作動可能に連結している第２のプロモーターをさらに含む。ある特定の実施形態では、第１および第２のプロモーターの一方または両方は、誘導性プロモーターである。ある特定の実施形態では、誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴ転写応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーターおよびＩＬ－２プロモーターから選択される。ある特定の実施形態では、第１および第２のポリヌクレオチドの一方または両方は、ベクター中に含まれる。ある特定の実施形態では、ベクターはレトロウイルスベクターである。本開示は、本明細書に開示される核酸組成物を含む細胞をさらに提供する。
本開示は、本明細書に開示される核酸組成物を含むベクターをさらに提供する。本開示は、本明細書に開示されるベクターを含む細胞をさらに提供する。
本開示は、本明細書に開示される細胞ならびに薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物をさらに提供する。ある特定の実施形態では、組成物は、ｃ－Ｋｉｔの阻害剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔの阻害剤は、ダサチニブ（ＢＭＳ－３５４８２５）、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２）、ポナチニブ、イマチニブ、およびそれらの組合せから選択される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、新生物、病原体感染または感染疾患を処置および／または防止するためのものである。
本開示は、対象における腫瘍負荷を低減する方法をさらに提供する。本開示は、対象に、本明細書に開示される細胞または本明細書に開示される医薬組成物を投与するステップを含む、方法もまた提供する。ある特定の実施形態では、方法は、対象において、腫瘍細胞の数を低減する、腫瘍サイズを低下させる、および／または前記腫瘍を根絶する。
本開示は、新生物を処置および／または防止する方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、方法は、対象に、本明細書に開示される細胞または本明細書に開示される医薬組成物を投与するステップを含む。
本開示は、新生物を有する対象の生存時間を延長する方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、方法は、対象に、本明細書に開示される細胞または本明細書に開示される医薬組成物を投与するステップを含む。
ある特定の実施形態では、腫瘍または新生物は、固形腫瘍である。ある特定の実施形態では、固形腫瘍は、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）がん、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん、胆管癌、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、固形腫瘍は中皮腫である。ある特定の実施形態では、固形腫瘍は肺がんである。
ある特定の実施形態では、方法は、ｃ－Ｋｉｔの阻害剤を投与するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔの阻害剤は、ダサチニブ（ＢＭＳ－３５４８２５）、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２）、ポナチニブ、イマチニブ、およびそれらの組合せから選択される。
さらに、本開示は、本明細書に開示される細胞、本明細書に開示される組成物、本明細書に開示される核酸組成物または本明細書に開示されるベクターを含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、新生物、病原体感染または感染性疾患を処置および／または防止するための書面の指示をさらに含む。
４．図面の簡単な説明
例として与えられるが、本開示の主題を記載された特定の実施形態に限定することを意図するものではない、以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて理解することができる。
図１Ａおよび１Ｂは、本開示の主題のある特定の実施形態に従う組成物を示す。図１Ａに示される組成物、すなわち、「Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ」（「Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｍ」とも称される）は、ｃ－Ｋｉｔ変異体Ｄ８１６Ｖと、抗メソテリン（ＭＳＬＮ）ｓｃＦｖ、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞質シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む第２世代のＣＡＲとを含む。図１Ｂに示される組成物、すなわち、「Ｍｚ－ＫＩＴｖ」は、ｃ－Ｋｉｔ変異体Ｄ８１６Ｖと、抗メソテリン（ＭＳＬＮ）ｓｃＦｖ、ＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む第１世代のＣＡＲとを含む。ＬＴＲは、長鎖末端反復配列を示す。
図２は、Ｔ細胞への様々な構築物の形質導入効率を示す。 図２は、Ｔ細胞への様々な構築物の形質導入効率を示す。
図３Ａおよび３Ｂは、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ－Ｔが、活性化されたｐＫＩＴシグナル伝達を構成的に示したことを示す。図３Ａは、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ－ＴがＳＣＦなしにｐ－ＫＩＴ活性を示したが、Ｍ２８ｚがＫＩＴタンパク質を発現しなかったことを示すウエスタンブロット結果を示す。図３Ｂは、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ－Ｔが、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｗｔ対照よりも高いｐ－ＳＴＡＴ３およびｐ－ＳＴＡＴ５活性を示したことを示す。
図４は、連続共培養の間のＣＡＲ－Ｔ細胞の累積拡大を示す。矢印は、Ａ５４９ＧＭ腫瘍細胞によるＴ細胞再刺激（Ｅ：Ｔ＝３：１）の時点を示す。
図５は、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭ２８ｚ－ＫＩＴｍ ＣＡＲ Ｔ細胞の増強された増殖を示す。Ｆａｒ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ ７日 最初の抗原刺激（Ｅ：Ｔ＝２：１）。標的細胞は、Ａ５４９ＧＭ細胞であった。
図６は、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭ２８ｚ－ＫＩＴｍ ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を示す。Ｆａｒ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ ７日 最初の抗原刺激（Ｅ：Ｔ＝２：１）。標的細胞は、Ａ５４９ＧＭ細胞であった。
図７Ａおよび７Ｂは、ドナー１におけるＭｚ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｐ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞またはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞溶解活性を示す。図７Ａは、４時間の時点での細胞溶解活性を示す。図７Ｂは、１８時間の時点での細胞溶解活性を示す。標的細胞は、高ＭＬＳＮ Ａ５４９Ｍ細胞であった。
図８Ａおよび８Ｂは、４日毎の標的細胞（高ＭＬＳＮ Ａ５４９ＧＭ細胞）による２回の刺激（Ｅ：Ｔ＝３：１）後の、ドナー２におけるＭｚ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞またはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞溶解活性を示す。図８Ａは、２回目の抗原刺激の４時間後の時点での細胞溶解活性を示す。図８Ｂは、２回目の抗原刺激の１８時間後の時点での細胞溶解活性を示す。
図９は、Ｍｚ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞またはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞溶解活性を示す。標的細胞は、低ＭＳＬＮ Ａ５４９Ｇ細胞であった。
図１０Ａおよび１０Ｂは、Ａ５４９ＧＭ細胞による抗原刺激後のＭ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞またはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞のＰＤ１発現を示す。図１０Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。図１０Ｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。
図１１Ａおよび１１Ｂは、抗原刺激後のＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞表現型を示す。図１１Ａは、４日毎のＡ５４６ＧＭ細胞による刺激（Ｅ：Ｔ＝３：１）後のＭ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞またはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）細胞の表出を示す。図１１Ｂは、ＣＡＲ Ｔ細胞のＭＳＬＮ＋細胞との１８時間の共培養（Ｅ：Ｔ＝３：１）後の、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって評価した放出されたＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－２を示す。 図１１Ａおよび１１Ｂは、抗原刺激後のＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞表現型を示す。図１１Ａは、４日毎のＡ５４６ＧＭ細胞による刺激（Ｅ：Ｔ＝３：１）後のＭ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞またはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）細胞の表出を示す。図１１Ｂは、ＣＡＲ Ｔ細胞のＭＳＬＮ＋細胞との１８時間の共培養（Ｅ：Ｔ＝３：１）後の、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって評価した放出されたＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－２を示す。
図１２Ａ～１２Ｄは、低ＭＳＬＮ肺腫瘍に対するＭ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞またはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。樹立された低ＭＳＬＮ Ａ５４９Ｇ肺腫瘍を有するマウスを、Ｍ２８ｚ、Ｍｚ－ＫＩＴｖまたはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖを含む１×１０５個のＴ細胞の単一用量で処置した。ＵＴは、未処置の対照を示す。図１２Ａは、ＵＴについての結果を示す。図１２Ｂは、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞についての結果を示す。図１２Ｃは、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞についての結果を示す。図１２Ｄは、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞についての結果を示す。 図１２Ａ～１２Ｄは、低ＭＳＬＮ肺腫瘍に対するＭ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞またはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。樹立された低ＭＳＬＮ Ａ５４９Ｇ肺腫瘍を有するマウスを、Ｍ２８ｚ、Ｍｚ－ＫＩＴｖまたはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖを含む１×１０５個のＴ細胞の単一用量で処置した。ＵＴは、未処置の対照を示す。図１２Ａは、ＵＴについての結果を示す。図１２Ｂは、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞についての結果を示す。図１２Ｃは、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞についての結果を示す。図１２Ｄは、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞についての結果を示す。
図１３Ａ～１３Ｄは、高ＭＳＬＮ肺腫瘍に対するＭ２８ｚ、Ｍｚ－ＫＩＴｖまたはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖを含むＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。樹立された高ＭＳＬＮ Ａ５４９ＧＭ肺腫瘍を有するマウスを、Ｍ２８ｚ、Ｍｚ－ＫＩＴｖまたはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖを含む１×１０５個のＴ細胞の単一用量で処置した。ＵＴは、未処置の対照を示す。図１３Ａは、ＵＴについての結果を示す。図１３Ｂは、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞についての結果を示す。図１３Ｃは、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞についての結果を示す。図１３Ｄは、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞についての結果を示す。 図１３Ａ～１３Ｄは、高ＭＳＬＮ肺腫瘍に対するＭ２８ｚ、Ｍｚ－ＫＩＴｖまたはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖを含むＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。樹立された高ＭＳＬＮ Ａ５４９ＧＭ肺腫瘍を有するマウスを、Ｍ２８ｚ、Ｍｚ－ＫＩＴｖまたはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖを含む１×１０５個のＴ細胞の単一用量で処置した。ＵＴは、未処置の対照を示す。図１３Ａは、ＵＴについての結果を示す。図１３Ｂは、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞についての結果を示す。図１３Ｃは、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞についての結果を示す。図１３Ｄは、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞についての結果を示す。
図１４Ａ～１４Ｃは、図１２Ａ～１２Ｄおよび１３Ａ～１３Ｄに示されるｉｎ ｖｉｖｏ処置されたマウスについてのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。図１４Ａは、樹立された低抗原（メソテリン）発現肺腫瘍を有するマウスの生存曲線を示す。図１４Ｂは、樹立された高抗原（メソテリン）発現肺腫瘍を有するマウスの生存曲線を示す。図１４Ｃは、低メソテリン発現肺がん（Ａ５４９Ｇ）および高メソテリン発現肺がん（Ａ５４９ＧＭ）におけるメソテリン発現レベルのＦＡＣＳ測定値を示す。 図１４Ａ～１４Ｃは、図１２Ａ～１２Ｄおよび１３Ａ～１３Ｄに示されるｉｎ ｖｉｖｏ処置されたマウスについてのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。図１４Ａは、樹立された低抗原（メソテリン）発現肺腫瘍を有するマウスの生存曲線を示す。図１４Ｂは、樹立された高抗原（メソテリン）発現肺腫瘍を有するマウスの生存曲線を示す。図１４Ｃは、低メソテリン発現肺がん（Ａ５４９Ｇ）および高メソテリン発現肺がん（Ａ５４９ＧＭ）におけるメソテリン発現レベルのＦＡＣＳ測定値を示す。
図１５は、臨床的チロシンキナーゼ阻害剤に対するＭ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の感受性を示す。
図１６Ａ～１６Ｃは、高ＭＳＬＮ発現肺腫瘍に対するＭ２８ｚ、Ｍｚ－ＫＩＴｖまたはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。樹立された高ＭＳＬＮ Ａ５４９ＧＭ肺腫瘍を有するＮＳＧマウスを、１×１０５個のＭ２８ｚ、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖまたはＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一用量で処置した。ＵＴ：未処置の対照。図１６Ａは、バイオルミネセントイメージング（ＢＬＩ）を使用した、マウスにおける腫瘍負荷のｉｎ ｖｉｖｏモニタリングの結果を示す。図１６Ｂおよび１６Ｃは、異なるＣＡＲ Ｔ細胞のｉ．ｖ．投与のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す、マウスのカプラン・マイヤー生存分析を示す。＊、Ｐ＜０．０５。＊＊＊、Ｐ＜０．００１。 図１６Ａ～１６Ｃは、高ＭＳＬＮ発現肺腫瘍に対するＭ２８ｚ、Ｍｚ－ＫＩＴｖまたはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。樹立された高ＭＳＬＮ Ａ５４９ＧＭ肺腫瘍を有するＮＳＧマウスを、１×１０５個のＭ２８ｚ、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖまたはＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一用量で処置した。ＵＴ：未処置の対照。図１６Ａは、バイオルミネセントイメージング（ＢＬＩ）を使用した、マウスにおける腫瘍負荷のｉｎ ｖｉｖｏモニタリングの結果を示す。図１６Ｂおよび１６Ｃは、異なるＣＡＲ Ｔ細胞のｉ．ｖ．投与のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す、マウスのカプラン・マイヤー生存分析を示す。＊、Ｐ＜０．０５。＊＊＊、Ｐ＜０．００１。 図１６Ａ～１６Ｃは、高ＭＳＬＮ発現肺腫瘍に対するＭ２８ｚ、Ｍｚ－ＫＩＴｖまたはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。樹立された高ＭＳＬＮ Ａ５４９ＧＭ肺腫瘍を有するＮＳＧマウスを、１×１０５個のＭ２８ｚ、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖまたはＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一用量で処置した。ＵＴ：未処置の対照。図１６Ａは、バイオルミネセントイメージング（ＢＬＩ）を使用した、マウスにおける腫瘍負荷のｉｎ ｖｉｖｏモニタリングの結果を示す。図１６Ｂおよび１６Ｃは、異なるＣＡＲ Ｔ細胞のｉ．ｖ．投与のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す、マウスのカプラン・マイヤー生存分析を示す。＊、Ｐ＜０．０５。＊＊＊、Ｐ＜０．００１。
図１７Ａ～１７Ｃは、低ＭＳＬＮ発現肺腫瘍に対するＭ２８ｚ、Ｍｚ－ＫＩＴｖおよびＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。樹立された低ＭＳＬＮ Ａ５４９Ｇ肺腫瘍を有するＮＳＧマウスを、１×１０５個のＭ２８ｚ、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖまたはＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一用量で処置した。ＵＴ：未処置の対照。図１７Ａは、バイオルミネセントイメージング（ＢＬＩ）を使用した、マウスにおける腫瘍負荷のｉｎ ｖｉｖｏモニタリングの結果を示す。図１７Ｂおよび１７Ｃは、異なるＣＡＲ Ｔ細胞のｉ．ｖ．投与のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す、マウスのカプラン・マイヤー生存分析を示す。＊＊、Ｐ＜０．０１。 図１７Ａ～１７Ｃは、低ＭＳＬＮ発現肺腫瘍に対するＭ２８ｚ、Ｍｚ－ＫＩＴｖおよびＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。樹立された低ＭＳＬＮ Ａ５４９Ｇ肺腫瘍を有するＮＳＧマウスを、１×１０５個のＭ２８ｚ、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖまたはＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一用量で処置した。ＵＴ：未処置の対照。図１７Ａは、バイオルミネセントイメージング（ＢＬＩ）を使用した、マウスにおける腫瘍負荷のｉｎ ｖｉｖｏモニタリングの結果を示す。図１７Ｂおよび１７Ｃは、異なるＣＡＲ Ｔ細胞のｉ．ｖ．投与のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す、マウスのカプラン・マイヤー生存分析を示す。＊＊、Ｐ＜０．０１。 図１７Ａ～１７Ｃは、低ＭＳＬＮ発現肺腫瘍に対するＭ２８ｚ、Ｍｚ－ＫＩＴｖおよびＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。樹立された低ＭＳＬＮ Ａ５４９Ｇ肺腫瘍を有するＮＳＧマウスを、１×１０５個のＭ２８ｚ、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖまたはＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一用量で処置した。ＵＴ：未処置の対照。図１７Ａは、バイオルミネセントイメージング（ＢＬＩ）を使用した、マウスにおける腫瘍負荷のｉｎ ｖｉｖｏモニタリングの結果を示す。図１７Ｂおよび１７Ｃは、異なるＣＡＲ Ｔ細胞のｉ．ｖ．投与のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す、マウスのカプラン・マイヤー生存分析を示す。＊＊、Ｐ＜０．０１。
図１８Ａおよび１８Ｂは、胸膜中皮腫腫瘍モデルにおけるＭ２８ｚ、Ｍｚ－ＫＩＴｖまたはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の胸腔内投与のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を比較したカプラン・マイヤー生存分析を示す。樹立された高ＭＳＬＮ ＭＧＭ中皮腫を有するＮＳＧマウスを、５×１０４個のＰ２８ｚ、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖおよびＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一用量で処置した。＊、Ｐ＜０．０５。図１８Ａは、すべての群間での比較を示す。図１８Ｂは、Ｍ２８ｚ群とＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ群との間およびＭｚ群とＭｚ－ＫＩＴｖ群との間での比較を示す。 図１８Ａおよび１８Ｂは、胸膜中皮腫腫瘍モデルにおけるＭ２８ｚ、Ｍｚ－ＫＩＴｖまたはＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の胸腔内投与のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を比較したカプラン・マイヤー生存分析を示す。樹立された高ＭＳＬＮ ＭＧＭ中皮腫を有するＮＳＧマウスを、５×１０４個のＰ２８ｚ、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖおよびＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一用量で処置した。＊、Ｐ＜０．０５。図１８Ａは、すべての群間での比較を示す。図１８Ｂは、Ｍ２８ｚ群とＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ群との間およびＭｚ群とＭｚ－ＫＩＴｖ群との間での比較を示す。
図１９Ａおよび１９Ｂは、低ＭＳＬＮ発現中皮腫に対するＭ２８ｚ、Ｍｚ－ＫＩＴｖおよびＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。図１９Ａは、それぞれＭＧ－ＬＭおよびＭＧＭ細胞を生成するためのＭＳＴＯ細胞における低いまたは高いＭＳＬＮタンパク質の発現を示す。図１９Ｂは、樹立された低ＭＳＬＮ中皮腫（ＭＧ－ＬＭ）を有するＮＳＧマウスを５×１０４個のＰ２８ｚ、Ｍ２８ｚ、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖまたはＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一用量で処置したことを示す。カプラン・マイヤー生存分析は、異なるＣＡＲ Ｔ細胞の胸腔内投与のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を比較した。＊、Ｐ＜０．０５。＊＊、Ｐ＜０．０１。 図１９Ａおよび１９Ｂは、低ＭＳＬＮ発現中皮腫に対するＭ２８ｚ、Ｍｚ－ＫＩＴｖおよびＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示す。図１９Ａは、それぞれＭＧ－ＬＭおよびＭＧＭ細胞を生成するためのＭＳＴＯ細胞における低いまたは高いＭＳＬＮタンパク質の発現を示す。図１９Ｂは、樹立された低ＭＳＬＮ中皮腫（ＭＧ－ＬＭ）を有するＮＳＧマウスを５×１０４個のＰ２８ｚ、Ｍ２８ｚ、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖまたはＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一用量で処置したことを示す。カプラン・マイヤー生存分析は、異なるＣＡＲ Ｔ細胞の胸腔内投与のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を比較した。＊、Ｐ＜０．０５。＊＊、Ｐ＜０．０１。
図２０は、抗原刺激後のＣＡＲ Ｔ細胞のｐ－ＥＲＫシグナルを示す。５分間のＭＧＭ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ＝１：２）後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲ Ｔ細胞のｐ－ＥＲＫレベルを、ＦＡＣＳによって測定した。Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖおよびＭｚ－ＫＩＴｖのＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ４およびＣＤ８は共に、Ｍ２８ｚよりも強いｐ－ＥＲＫ活性を有した。 図２０は、抗原刺激後のＣＡＲ Ｔ細胞のｐ－ＥＲＫシグナルを示す。５分間のＭＧＭ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ＝１：２）後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲ Ｔ細胞のｐ－ＥＲＫレベルを、ＦＡＣＳによって測定した。Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖおよびＭｚ－ＫＩＴｖのＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ４およびＣＤ８は共に、Ｍ２８ｚよりも強いｐ－ＥＲＫ活性を有した。 図２０は、抗原刺激後のＣＡＲ Ｔ細胞のｐ－ＥＲＫシグナルを示す。５分間のＭＧＭ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ＝１：２）後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲ Ｔ細胞のｐ－ＥＲＫレベルを、ＦＡＣＳによって測定した。Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖおよびＭｚ－ＫＩＴｖのＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ４およびＣＤ８は共に、Ｍ２８ｚよりも強いｐ－ＥＲＫ活性を有した。
図２１Ａおよび２１Ｂは、マウスから得たＣＡＲ Ｔ細胞を、高メソテリン発現中皮腫細胞に曝露させ、ＰＤ１発現について分析したことを示す。図２１Ａは、異なるＥ：Ｔ比におけるＰＤ１発現の定量化を示す。図２１Ｂは、異なるＥ：Ｔ比におけるＰＤ１発現を測定するフローサイトメトリーグラフを示す。 図２１Ａおよび２１Ｂは、マウスから得たＣＡＲ Ｔ細胞を、高メソテリン発現中皮腫細胞に曝露させ、ＰＤ１発現について分析したことを示す。図２１Ａは、異なるＥ：Ｔ比におけるＰＤ１発現の定量化を示す。図２１Ｂは、異なるＥ：Ｔ比におけるＰＤ１発現を測定するフローサイトメトリーグラフを示す。
図２２Ａおよび２２Ｂは、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞における表現型的および機能的Ｔ細胞特色に関する富化された遺伝子セットを示す。２４時間のＭＳＬＮ＋腫瘍細胞との共培養後、Ｍ２８ｚおよびＭ２８ｚ－ＫＩＴｖのＣＤ８ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＡＲ Ｔパネル遺伝子についてのｎａｎｏ ｓｔｒｉｎｇによる分析のために収集した、各群についてｎ＝３。図２２Ａは、７８０個の検出された遺伝子のうち８７個が、有意な変化倍数を有したことを示す。図２２Ｂは、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞における表現型的および機能的Ｔ細胞特色に関する富化された遺伝子セットを示すＰａｔｈｗａｙスコアのヒートマップを示す。図２２Ｃは、ＫＩＴ ＣＡＲ Ｔ細胞中の上方調節された遺伝子経路を提供する。 図２２Ａおよび２２Ｂは、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞における表現型的および機能的Ｔ細胞特色に関する富化された遺伝子セットを示す。２４時間のＭＳＬＮ＋腫瘍細胞との共培養後、Ｍ２８ｚおよびＭ２８ｚ－ＫＩＴｖのＣＤ８ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＡＲ Ｔパネル遺伝子についてのｎａｎｏ ｓｔｒｉｎｇによる分析のために収集した、各群についてｎ＝３。図２２Ａは、７８０個の検出された遺伝子のうち８７個が、有意な変化倍数を有したことを示す。図２２Ｂは、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞における表現型的および機能的Ｔ細胞特色に関する富化された遺伝子セットを示すＰａｔｈｗａｙスコアのヒートマップを示す。図２２Ｃは、ＫＩＴ ＣＡＲ Ｔ細胞中の上方調節された遺伝子経路を提供する。 図２２Ａおよび２２Ｂは、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞における表現型的および機能的Ｔ細胞特色に関する富化された遺伝子セットを示す。２４時間のＭＳＬＮ＋腫瘍細胞との共培養後、Ｍ２８ｚおよびＭ２８ｚ－ＫＩＴｖのＣＤ８ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＡＲ Ｔパネル遺伝子についてのｎａｎｏ ｓｔｒｉｎｇによる分析のために収集した、各群についてｎ＝３。図２２Ａは、７８０個の検出された遺伝子のうち８７個が、有意な変化倍数を有したことを示す。図２２Ｂは、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞における表現型的および機能的Ｔ細胞特色に関する富化された遺伝子セットを示すＰａｔｈｗａｙスコアのヒートマップを示す。図２２Ｃは、ＫＩＴ ＣＡＲ Ｔ細胞中の上方調節された遺伝子経路を提供する。
図２３Ａ～２３Ｂは、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較したＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるインターフェロンシグナル伝達遺伝子の有意な上方調節を示す。２４時間のＭＳＬＮ＋がん細胞との共培養後、Ｍ２８ｚおよびＭ２８ｚ－ＫＩＴｖのＣＤ８ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＡＲ Ｔパネル遺伝子についてのｎａｎｏ ｓｔｒｉｎｇによる分析のために収集した、各群についてｎ＝３。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達遺伝子（図２３Ａ）およびＩＩ型インターフェロンシグナル伝達遺伝子（図２３Ｂ）の発現は、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞において有意に増加した。 図２３Ａ～２３Ｂは、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較したＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるインターフェロンシグナル伝達遺伝子の有意な上方調節を示す。２４時間のＭＳＬＮ＋がん細胞との共培養後、Ｍ２８ｚおよびＭ２８ｚ－ＫＩＴｖのＣＤ８ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＡＲ Ｔパネル遺伝子についてのｎａｎｏ ｓｔｒｉｎｇによる分析のために収集した、各群についてｎ＝３。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達遺伝子（図２３Ａ）およびＩＩ型インターフェロンシグナル伝達遺伝子（図２３Ｂ）の発現は、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞において有意に増加した。
５．発明の詳細な説明
本開示の主題は、ｃ－Ｋｉｔ変異体を含む細胞であって、ｃ－Ｋｉｔ変異体が、活性化変異を含む、細胞を提供する。細胞は、遺伝子改変された免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）であり得、細胞は、抗原認識受容体（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ））を含む。本開示の主題は、標的抗原に対する免疫応答を誘導および／もしくは増強するため、ならびに／または新生物、病原体感染もしくは他の疾患／障害（例えば、抗原特異的免疫応答における増加が所望される疾患／障害）を処置および／もしくは防止するための、このような細胞を使用する方法もまた提供する。本開示の主題は、ｃ－Ｋｉｔ変異体（例えば、ｃ－ＫｉｔＤ８１６Ｖ）が、抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲ）を含む細胞（例えば、Ｔ細胞）の細胞増殖を増強することができるという発見に、少なくとも一部基づく。
本開示の非限定的な実施形態は、本明細書および実施例によって記載される。
本開示の明確化のためであって、限定としてではなく、詳細な説明は、以下の下位項目に分けられる：
５．１．定義；
５．２．ｃ－Ｋｉｔ変異体；
５．３．細胞；
５．４．抗原認識受容体；
５．５．ドミナントネガティブ形態のプログラム死１（ＰＤ－１ ＤＮ）
５．６．組成物およびベクター；
５．７．ポリペプチドおよびアナログ；
５．８．投与；
５．９．製剤；
５．１０．処置方法；ならびに
５．１１．キット
５．１．定義
別段に規定されていなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に、本開示の主題において使用される用語の多くの一般的定義を提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２ｎｄ ｅｄ． １９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．， １９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｒ． Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ （１９９１）；およびＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ， Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、他に特定しない限り、それらに与えられた以下の意味を有する。
本明細書で使用される場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者によって決定される特定の値に対して許容される誤差範囲内を意味し、これは、その値が測定または決定される方法、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の実践ごとに、３または３を超える標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、例えば、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に、生物系またはプロセスに関して、この用語は、値の１桁の範囲内、例えば、５倍以内または２倍以内を意味し得る。
「免疫応答性細胞」とは、免疫応答において機能する細胞または前駆体、またはその子孫を意味する。
「免疫応答性細胞を活性化する」とは、免疫応答の開始をもたらす細胞におけるタンパク質発現のシグナル伝達または変化の誘導を意味する。例えば、ＣＤ３鎖が、リガンド結合および免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＡＭ）に応答してクラスターを形成する場合、シグナル伝達カスケードが生じる。ある特定の実施形態では、内因性ＴＣＲまたは外因性ＣＡＲが抗原に結合する場合、結合受容体付近に多くの分子（例えば、ＣＤ４またはＣＤ８、ＣＤ３γ／δ／ε／ζなど）がクラスター形成することを含む免疫シナプスの形成が生じる。膜結合シグナル伝達分子のこのようなクラスター形成は、ＣＤ３鎖内に含有されるＩＴＡＭモチーフがリン酸化されるのを可能にする。このリン酸化は、次に、ＮＦ－κＢおよびＡＰ－１などの転写因子を最終的に活性化するＴ細胞活性化経路を開始する。これらの転写因子は、Ｔ細胞の全般的遺伝子発現を誘導し、Ｔ細胞媒介性免疫応答を開始するために、マスター調節因子Ｔ細胞タンパク質（ｍａｓｔｅｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）の増殖および発現のためのＩＬ－２産生を増加させる。
「免疫応答性細胞を刺激する」とは、強力かつ持続性の免疫応答をもたらすシグナルを意味する。様々な実施形態では、これは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）活性化後に起こるか、または、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－ｌＢＢ）、ＯＸ４０、ＣＤ４０およびＩＣＯＳを含むがこれらに限定されない受容体を介して同時に媒介される。複数の刺激シグナルを投与されることは、強力かつ長期Ｔ細胞媒介性免疫応答を開始するのに重要であり得る。Ｔ細胞は即座に阻害され、抗原に対して応答できなくなり得る。これらの共刺激シグナルの作用は様々であり得るが、これらは一般的に、遺伝子発現の増加をもたらし、完全かつ持続的な根絶のために抗原に強く応答する、長期生存性、増殖性、かつ抗アポトーシス性のＴ細胞を生成する。
用語「抗原認識受容体」は、本明細書で使用される場合、抗原への結合に応答して、免疫または免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化することが可能である受容体を指す。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、無傷抗体分子だけではなく、免疫原結合能力を保持する抗体分子の断片もまた意味する。このような断片もまた、当技術分野で周知であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で通常用いられる。したがって、本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、無傷の免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性断片Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂもまた意味する。無傷抗体のＦｅ断片を欠くＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片は、循環からより迅速に消え去り、無傷抗体のより少ない非特異的組織結合を有し得る（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ （１９８３）； ２４：３１６－３２５）。本明細書で使用される場合、抗体には、天然の抗体全体、二特異性抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチドおよび非従来型の抗体が含まれる。ある特定の実施形態では、抗体は、ジスルフィド結合によって相互に接続した少なくとも２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）および重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）および軽鎖定常ＣＬ領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨ領域とＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存的である領域が点在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順に配列した３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の構成成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ４ｔｈ Ｕ． Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （１９８７）を参照されたい。一般に、抗体は、可変領域に３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲまたはＣＤＲ領域を含む。ＣＤＲは、抗体の抗原またはエピトープへの結合のための接触残基の大多数を提供する。ある特定の実施形態では、ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステムを使用して描写される（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）； ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ９１－３２４２）。
本明細書で使用される場合、用語「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を形成するために共有結合により連結された免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。ＶＨおよびＶＬは、直接的に接合されるか、またはペプチドをコードするリンカー（例えば、１０、１５、２０、２５個のアミノ酸）によって接合されるかのいずれかであり、これにより、ＶＨのＮ末端がＶＬのＣ末端に接続するか、またはＶＨのＣ末端がＶＬのＮ末端に接続する。リンカーは通常、可撓性に関してグリシンリッチであり、および可溶性に関してセリンまたはトレオニンリッチである。「リンカー」は、本明細書で使用される場合、２つまたはそれより多くのポリペプチドまたは核酸を、これらが互いに接続されるように、共有結合により結合させる官能基（例えば、化学物質またはポリペプチド）を意味するものとする。本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」は、２つのタンパク質を一緒に連結するために（例えば、ＶＨドメインとＶＬドメインとを連結するために）使用される１つまたは複数のアミノ酸を指す。ある特定の実施形態では、リンカーは、以下に提供される配列番号１６に示される配列を含む：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号１６］
ある特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号１７に示される：
ＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＡ［配列番号１７］
ある特定の実施形態では、配列番号１６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号１８に示される。
ＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＡ［配列番号１８］
定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質は、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。単鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、Ｈｕｓｔｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８８）；８５：５８７９－５８８３）によって記載されるＶＨおよびＶＬコード配列を含む核酸から発現され得、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号および同第４，９５６，７７８号；ならびに米国特許公開第２００５０１９６７５４号および同第２００５０１９６７５４号を参照されたい。阻害活性を有するアンタゴニストのｓｃＦｖが記載されている（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｙｒｂｉｄｏｍａ （Ｌａｒｃｈｍｔ） ２００８ ２７（６）：４５５－５１；Ｐｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃａｃｈｅｘｉａ Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ Ｍｕｓｃｌｅ（２０１３）； ４（１）：７９－８６；Ｓｈｉｅｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｕｎｏｌ（２００９）；１８３（４）：２２７７－８５；Ｇｉｏｍａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ（２００７）；９７（６）：９５５－６３；Ｆｉｆｅ ｅｔａ．， Ｊ Ｃ Ｉ（２００６）；１１６（８）：２２５２－６１；Ｂｒｏｃｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９７ ３（３）：１７３－８４；Ｍｏｏｓｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９５）；２（１０）：３１－４０）。刺激活性を有するアゴニストのｓｃＦｖが記載されている（Ｐｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００３）；２５２７８（３８）：３６７４０－７；Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ（１９９７）；１５（８）：７６８－７１；Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９７）；１７（５－６）：４２７－５５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＣｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ（２００３）；１６３８（３）：２５７－６６）。
本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、結合強度の尺度を意味する。親和性は、抗体結合部位（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）と抗原決定基の間の立体化学的適合の密接度、これらの間の接触領域のサイズ、ならびに／または荷電基および疎水性基の分布に依存し得る。本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、可逆的複合体形成後の抗原－抗体結合の強度を指す「アビディティ」も含む。抗原に対する抗体の親和性を計算するための方法は当技術分野で公知であり、様々な抗原結合実験、例えば、機能的アッセイ（例えば、フローサイトメトリーアッセイ）を含むがこれらに限定されない。
用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、本明細書で使用される場合、免疫応答細胞を活性化または刺激することが可能である細胞内シグナル伝達ドメイン、および膜貫通ドメインに融合した細胞外抗原結合ドメインを含む分子を指す。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。ｓｃＦｖは、抗体の可変重鎖および軽鎖領域に融合することに由来し得る。あるいはまたはさらに、ｓｃＦｖは、Ｆａｂに由来し得る（抗体に由来する代わりに、例えば、Ｆａｂライブラリーから得られた）。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、膜貫通ドメインに融合し、次いで、細胞内シグナル伝達ドメインに融合する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、抗原について高い結合親和性またはアビディティを有するように選択される。
本明細書で使用される場合、用語「核酸分子」は、目的のポリペプチドをコードする任意の核酸分子を含む。このような核酸分子は、内因性核酸配列と１００％相同であるか、またはそれと同一である必要はないが、実質的同一性を示し得る。
内因性配列に対する「実質的同一性」または「実質的相同性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズすることが可能である。「ハイブリダイズする」とは、様々なストリンジェンシー条件下で、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）、またはその部分間で二本鎖分子を形成する対を意味する。（Ｗａｈｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）；１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）；１５２：５０７）。
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、例えば、約５００ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、または約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下で得ることができるが、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、例えば、少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、少なくとも約３７℃、または少なくとも約４２℃の温度を含む。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、および担体ＤＮＡの包含または排除などの追加のパラメーターを変更することは、当業者に周知である。様々なレベルのストリンジェンシーが、必要とされる場合、これらの様々な条件を組み合わせることによって達成される。ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および１％のＳＤＳ中３０℃で行う。ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、および１００μｇ／ｍｌの変性したサケの精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中３７℃で行う。ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、および２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中４２℃で行う。これらの条件に関する有用な変動は、当業者には容易に明らかである。
ほとんどの適用では、ハイブリダイゼーションの後の洗浄ステップも、ストリンジェンシーが異なる。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度および温度によって定義することができる。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させること、または温度を上昇させることによって高めることができる。例えば、洗浄ステップに対するストリンジェントな塩濃度は、約３０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、例えば、約１５ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり得る。洗浄ステップに対するストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約２５℃、少なくとも約４２℃、または少なくとも約６８℃の温度を含む。ある特定の実施形態では、洗浄ステップは、３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中２５℃で行う。ある特定の実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中４２℃で行う。ある特定の実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％のＳＤＳ中６８℃で行う。これらの条件に関する追加の変動は、当業者には容易に明らかである。ハイブリダイゼーション技法は、当業者に周知であり、記載されている（Ｂｅｎｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７７）；１９６：１８０；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ（１９７５）；７２：３９６１）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００１）；Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｅｒｇｅｒら、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８７）；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
「実質的に同一」または「実質的に相同」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか１つ）と少なくとも約５０％相同または同一であることを示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。ある特定の実施形態では、このような配列は、比較のために使用されるアミノ酸または核酸の配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％相同または同一である。
配列同一性は、配列解析ソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５のＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用することによって測定することができる。このようなソフトウェアは、相同性の程度を様々な置換、欠失、および／または他の改変に割り当てることによって、同一または類似する配列をマッチさせる。保存的置換には、典型的には、以下の群内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定することに対する例示的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムを使用することができ、ｅ－３とｅ－１００の間の確率スコアは密接に関連する配列を示す。
「アナログ」とは、参照ポリペプチドまたは核酸分子の機能を有する構造的に関連するポリペプチドまたは核酸分子を意味する。
用語「リガンド」は、本明細書で使用される場合、受容体に結合する分子を指す。ある特定の実施形態では、リガンドは別の細胞上の受容体に結合し、細胞間の認識および／または相互作用を可能にする。
用語「構成的発現」または「構成的に発現される」は、本明細書で使用される場合、すべての生理学的条件下での発現またはその条件下で発現されることを指す。
「疾患」とは、細胞、組織、または臓器の正常機能に損傷を与えるか、またはそれを妨害する任意の状態、疾患または障害、例えば、新生物、および細胞の病原体感染を意味する。
「有効量」とは、治療効果を有するのに十分な量を意味する。ある特定の実施形態では、「有効量」は、新生物の継続的な増殖、成長、または転移（例えば、侵襲、または遊走）を停止、軽快、または阻害するのに十分な量である。
「忍容性を強化すること」とは、移植された臓器または組織を標的とする自己反応性細胞または免疫応答性細胞の活性を防止することを意味する。
「内因性」とは、細胞または組織において正常に発現される核酸分子またはポリペプチドを意味する。
「外因性」とは、細胞において内因的に存在しない核酸分子またはポリペプチドを意味する。したがって、用語「外因性」は、外来の、異種の、過剰発現される核酸分子およびポリペプチドなどの、細胞内で発現される任意の組換え核酸分子またはポリペプチドを包含する。「外因性」核酸とは、天然の野生型細胞には存在しない核酸を意味し、例えば、外因性核酸は、内因性のカウンターパートとは、配列、位置／場所、またはその両方によって異なり得る。明確化のために、外因性核酸は、その天然の内因性カウンターパートと比較して同じか、または異なる配列を有してもよく、遺伝子操作によって細胞自体またはその前駆体に導入されてもよく、必要に応じて、代替の対照配列、例えば、非天然のプロモーターまたは分泌配列に連結されてもよい。
「異種核酸分子またはポリペプチド」とは、細胞または細胞から得られる試料中に通常は存在しない核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）またはポリペプチドを意味する。この核酸は、別の生物に由来してもよく、または、例えば、細胞もしくは試料中で通常は発現されないｍＲＮＡ分子であってもよい。
「モジュレートする」とは、正に、または負に変更することを意味する。例示的なモジュレーションは、約１％、約２％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または約１００％の変化を含む。
「増加させる」とは、少なくとも約５％、正に変更することを意味する。変更は、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、約１００％またはそれより多くまでであってもよい。
「低下させる」とは、少なくとも約５％、負に変更することを意味する。変更は、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、またはさらに約１００％までであってもよい。
用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」は、天然の状態で見られるように、通常は付随する構成成分を様々な程度に含まない物質を指す。「単離する」は、元の供給源または環境からの分離の程度を示す。「精製する」は、単離よりも高度である分離の程度を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、いずれの不純物もタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を及ぼさず、他の有害な結果も引き起こさないように、他の物質を実質的に含まない。すなわち、核酸またはペプチドは、組換えＤＮＡ技法によって生成される場合には、細胞材料、ウイルス材料、および培養培地を、または化学的に合成される場合には、化学的前駆体や他の化学物質を実質的に含まないならば、精製されている。純度および均一性は、典型的には、分析化学の技法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じることを示し得る。改変、例えば、リン酸化またはグリコシル化に供され得るタンパク質では、様々な改変が様々な単離されたタンパク質に生じる可能性があり、これらを別々に精製することができる。
「単離された細胞」とは、天然に細胞に付随する分子および／または細胞構成成分から分離された細胞を意味する。
用語「抗原結合ドメイン」は、本明細書で使用される場合、細胞上に存在する特定の抗原決定基または抗原決定基のセットに特異的に結合することが可能なドメインを指す。
「新生物」とは、細胞または組織の病理学的増殖、およびその後の、他の組織または臓器への遊走またはその侵襲によって特徴付けられる疾患を意味する。新生物の成長は、典型的には、制御不能かつ進行的であり、正常細胞の分裂増殖（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を誘発しないか、またはその停止を引き起こす条件下で生じる。新生物は、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、グリア、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、尿道、子宮、および膣からなる群から選択される臓器、またはその組織もしくは細胞型を含むがそれらに限定されない種々の細胞型、組織、または臓器に影響を及ぼし得る。新生物には、がん、例えば、肉腫、癌、または形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）が含まれる。ある特定の実施形態では、新生物はがんである。ある特定の実施形態では、新生物は固形腫瘍である。
「受容体」とは、１つまたは複数のリガンドに選択的に結合する細胞膜上に存在するポリペプチドまたはその部分を意味する。
「認識する」とは、標的に選択的に結合することを意味する。腫瘍を認識すＴ細胞は、腫瘍抗原に結合する受容体（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ）を発現することができる。
「参照」または「対照」とは、比較の標準物質を意味する。例えば、ＣＡＲおよびｓｃＦｖを発現する細胞によるｓｃＦｖ抗原結合のレベルは、ＣＡＲを単独で発現する対応する細胞におけるｓｃＦｖ抗原結合のレベルと比較され得る。
「分泌された」とは、小胞体、ゴルジ装置を介する分泌経路によって、および細胞形質膜において一過的に融合し、細胞の外側にタンパク質を放出するベシクルとして、細胞から放出されるポリペプチドを意味する。
「シグナル配列」または「リーダー配列」は、分泌経路への進入を指示する、新たに合成されたタンパク質のＮ末端に存在するペプチド配列（例えば、５、１０、１５、２０、２５または３０アミノ酸）を意味する。例示的なリーダー配列として、ＩＬ－２シグナル配列：ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ［配列番号４３］（ヒト）、ＭＹＳＭＱＬＡＳＣＶＴＬＴＬＶＬＬＶＮＳ［配列番号４４］（マウス）；カッパリーダー配列：ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ［配列番号４５］（ヒト）、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ［配列番号４６］（マウス）；ＣＤ８リーダー配列：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ［配列番号４７］（ヒト）；短縮型ヒトＣＤ８シグナルペプチド：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡ［配列番号４８］（ヒト）；アルブミンシグナル配列：ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＳＳＡＹＳ［配列番号４９］（ヒト）；およびプロラクチンシグナル配列：ＭＤＳＫＧＳＳＱＫＧＳＲＬＬＬＬＬＶＶＳＮＬＬＬＣＱＧＶＶＳ［配列番号２０］（ヒト）が挙げられるがこれらに限定されない。「可溶性」とは、水性環境中で自由に拡散可能な（例えば、膜結合していない）ポリペプチドを意味する。
「特異的に結合する」とは、目的の生体分子（例えば、ポリペプチド）を認識し、それに結合するが、天然に本開示のポリペプチドを含む試料、例えば、生体試料中の他の分子を実質的に認識せず、それに実質的に結合しないポリペプチドまたはその断片を意味する。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、およびは、米国特許法においてそれらに与えられた広い意味を有することを意図し、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る。
本明細書で使用される場合、「処置」は、処置される個体または細胞の疾患経過を変更することを試みる治療介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程中のいずれかに実施することができる。処置の治療効果は、限定されないが、疾患の発生または再発を防止すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減弱、転移を防止すること、疾患進行速度を低下させること、疾患状態の軽快または緩和、および寛解または予後の改善を含む。疾患または障害の進行を防止することによって、処置は、罹患したか、もしくは診断された対象、または障害を有することが疑われる対象における障害による悪化を防止することができるが、また、処置は、障害に対するリスクにあるか、または障害を有することが疑われる対象における障害の開始または障害の症状を防止することができる。
「個体」または「対象」は、本明細書において、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、哺乳類などの脊椎動物である。哺乳類は、ヒト、霊長類、農場動物、狩猟動物、齧歯類および愛玩動物を含むがこれらに限定されない。非ヒト動物対象の非限定的な例としては、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどの齧歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、ならびに類人猿およびサルなどの非ヒト霊長類が挙げられる。用語「免疫不全状態の」は、本明細書で使用される場合、免疫不全を有する対象を指す。対象は、健康な免疫系を有する人において通常疾患を引き起こさないが、機能が乏しいか、または抑制された免疫系しか有さない人々を冒し得る生物によって引き起こされる感染症である日和見感染症に非常に罹り易い。
本開示の主題の他の態様は、以下の開示に記載され、本開示の主題の範囲内である。
５．２．ｃ－Ｋｉｔ変異体
癌原遺伝子ＫＩＴは、受容体チロシンキナーゼタンパク質であり、ＣＤ１１７；ＫＩＴ；ＰＢＴ；幹細胞成長因子受容体（ＳＣＦＲ）；ＭＡＳＴＣ．ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：３８１５（ヒト）、１６５９０（マウス）としても公知である。ＫＩＴのタンパク質産物には、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００２１３（ヒトアイソフォーム１）、ＮＰ ００１１２２７３３（マウスアイソフォーム１）が含まれるがこれらに限定されない。
ＣＤ１１７として公知のｃ－Ｋｉｔは、造血幹細胞ならびに他の細胞型の表面上で発現されるサイトカイン受容体である。ｃ－Ｋｉｔを介したシグナル伝達は、細胞の生存、増殖および分化において役割を果たす（Ｃｅｒｅｄｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ （２００２）； ２（１１）：８８８－９７）。
ｃ－Ｋｉｔは、幹細胞因子（ＳＣＦ）に結合する。結合の際に、ｃ－ＫｉｔおよびＳＣＦは、二量体を形成し、この二量体は、その固有のチロシンキナーゼ活性を活性化し、次いで、細胞においてシグナルを伝搬させるシグナル伝達分子をリン酸化および活性化する。本開示のｃ－Ｋｉｔ活性化変異（例えば、Ｄ８１６Ｖ変異）は、ＳＣＦなしに、例えば、ｃＫｉｔ／ＳＣＦ二量体を形成することなしに、構成的活性化を生じる（Ｈｉｒｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９８）；２７９（５３５０）：５７７－８０；Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｔ Ｒｅｓ （２００１）：１６５－７１）。
ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ変異体は、ヒトｃ－Ｋｉｔ変異体である。ある特定の実施形態では、ヒトｃ－Ｋｉｔタンパク質は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿０００２１３（配列番号１）を有する配列を含むかまたはそれからなる。配列番号１は、以下に提供される。
Figure 2023504560000002
本開示の主題の細胞は、ｃ－Ｋｉｔ変異体を含む。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ変異体は、活性化変異を含む。
ある特定の実施形態では、活性化変異は、機能獲得型変異である。ある特定の実施形態では、活性化変異は、その遺伝子産物が、このような変異を有さない遺伝子産物（例えば、野生型タンパク質）と比較して増強された効果からなる変異である。
ある特定の実施形態では、活性化変異（例えば、Ｄ８１６Ｖ変異）は、造血性細胞の初期系列において存在し、成熟の間に失われる。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔの活性化変異は、ｃ－Ｋｉｔのそのリガンド（例えば、ＳＣＦ）との相互作用とは独立してｃ－Ｋｉｔ活性化をもたらす。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔの活性化変異は、ｃ－Ｋｉｔリガンド、例えば、ＳＣＦなしにｃ－Ｋｉｔ活性化をもたらす。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔの活性化変異は、ｃ－Ｋｉｔの構成的活性化をもたらす。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔの活性化変異は、チロシンホスファターゼ－１（ＳＨＰ－１）および／またはチロシンホスファターゼ－２（ＳＨＰ－２）の阻害とは独立してｃ－Ｋｉｔ活性化をもたらす。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔの活性化変異は、ＳＨＰ－１および／またはＳＨＰ－２の阻害の存在下でｃ－Ｋｉｔ活性化をもたらす。
ｃ－Ｋｉｔの活性化変異は、ｃ－Ｋｉｔ変異体を含む細胞の増殖および抗アポトーシスを促進する。ｃ－Ｋｉｔの活性化変異は、ｃ－Ｋｉｔ変異体を含む細胞を、ＰＤ－Ｌ１／２－ＰＤ－１阻害に対して耐性にする。
ある特定の実施形態では、活性化変異は、ヒトｃＫＩＴ、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃＫＩＴの細胞内領域内にある。ある特定の実施形態では、ヒトｃＫＩＴの細胞内領域は、配列番号１のアミノ酸５４４～９７７を含む。ある特定の実施形態では、活性化変異は、ヒトｃＫＩＴ、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃＫＩＴのアミノ酸８１６～８２６内にある。ある特定の実施形態では、活性化変異は、アミノ酸８１６位またはアミノ酸８２２位にある。ある特定の実施形態では、活性化変異は、ヒトｃＫＩＴ、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトｃＫＩＴのアミノ酸５５０～５７０内にある。ある特定の実施形態では、活性化変異は、アミノ酸５６０位にある。ｃ－Ｋｉｔ活性化変異の非限定的な例には、Ｄ８１６Ｖ、Ｄ８１６Ｙ、Ｄ８１６Ｈ、Ｄ８１６Ｆ、Ｎ８２２Ｋ、Ｖ５６０Ｇ、またはそれらの組合せが含まれる。ある特定の実施形態では、活性化変異は、Ｄ８１６Ｖである。
ｃ－Ｋｉｔ変異体は、プロモーターに作動可能に連結していてもよい。プロモーターは、内因性または外因性であり得る。外因性プロモーターの非限定的な例には、伸長因子（ＥＦ）－１プロモーター、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびメタロチオネインプロモーターが含まれる。ある特定の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターの非限定的な例は、ＮＦＡＴ転写応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーターおよびＩＬ－２プロモーターから選択される。誘導性プロモーターは、ｃ－Ｋｉｔの活性化を制御することができ、例えば、誘導性プロモーターの制御により、ｃ－Ｋｉｔは、ｃ－Ｋｉｔ変異体を含む細胞（例えば、Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞）の活性化の際にのみ活性化される。
ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ変異体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、少なくとも約１００％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ変異体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ変異体は、少なくとも５０、または少なくとも１００、または少なくとも１５０、または少なくとも２００、または少なくとも２５０、または少なくとも３００、または少なくとも３５０、または少なくとも４００、または少なくとも４５０、または少なくとも５００、または少なくとも５５０、または少なくとも６００、または少なくとも６５０、または少なくとも７００、または少なくとも７５０、または少なくとも８００、または少なくとも８５０、または少なくとも９００、または少なくとも９５０、および最大９７６アミノ酸長である、配列番号２の連続部分であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。あるいはまたはさらに、非限定的な様々な実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ変異体は、配列番号２のアミノ酸１～９７６、１～２００、４００～９７６、５００～９７６または５４３～９７６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ変異体は、配列番号２のアミノ酸５４３～９７６を含むかまたはそれからなる。
配列番号２は、以下に提供される。
Figure 2023504560000003
Figure 2023504560000004
５．３．細胞
本開示の主題は、本明細書に開示されるｃ－Ｋｉｔ変異体（例えば、項目５．２に開示されるもの）を含む細胞を提供する。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ変異体は、外因性ｃ－Ｋｉｔ変異体である。
ある特定の実施形態では、細胞は、リンパ系列の細胞および骨髄系列の細胞から選択される。ある特定の実施形態では、細胞は、免疫応答性細胞である。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、リンパ系列の細胞である。
ある特定の実施形態では、細胞は、リンパ系列の細胞である。リンパ系列の細胞は、抗体の産生、細胞免疫系の調節、血中の外来の病原因子の検出、宿主に対して外来の細胞の検出などをもたらし得る。リンパ系列の細胞の非限定的な例としては、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、リンパ系細胞に分化し得る幹細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞）である。
ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、胸腺において成熟するリンパ球であってもよく、大部分が細胞媒介性免疫を担う。Ｔ細胞は、獲得免疫系に関与する。本開示の主題のＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞（セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞（または幹様メモリーＴ細胞）、および２型のエフェクターメモリーＴ細胞：例えば、ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞を含む）、制御性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞としても公知）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞、およびγδ Ｔ細胞を含むがこれらに限定されない、いずれかの型のＴ細胞であり得る。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬまたはキラーＴ細胞）は、感染した体細胞または腫瘍細胞の死を誘導することが可能なＴリンパ球のサブセットである。患者自身のＴ細胞は、抗原認識受容体、例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲの導入によって、特定の抗原を標的とするよう遺伝子改変され得る。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
ある特定の実施形態では、細胞は、ＮＫ細胞である。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞媒介性免疫の一部であり、自然免疫応答において作用するリンパ球であり得る。ＮＫ細胞は、標的細胞における細胞傷害性効果を発揮するために、事前の活性化を必要としない。
本開示の主題のヒトリンパ球の型としては、限定されないが、末梢ドナーリンパ球、例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ（２００３）；３：３５－４５（ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球を開示する）、Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ．Ａ．， ｅｔ ａｌ． ２００６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４：１２６－１２９（αおよびβヘテロ二量体を含む完全長腫瘍抗原認識Ｔ細胞受容体複合体を発現するよう遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球を開示する）、Ｐａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０００）；１６４：４９５－５０４；Ｐａｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０００）；１６４：４３８２－４３９２（腫瘍生検において腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来するリンパ球培養物を開示する）、およびＤｕｐｏｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２００５）；６５：５４１７－５４２７；Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ（２００３）；１０２：２４９８－２５０５（人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）またはパルスされた樹状細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで選択的に拡大された抗原特異的末梢血白血球を開示する）に開示されたものが挙げられる。
細胞（例えば、Ｔ細胞）は、自家、非自家（例えば、同種異系）であってもよく、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで、操作された前駆体または幹細胞に由来してもよい。ある特定の実施形態では、細胞は、同種異系細胞である。
本開示の主題の細胞は、骨髄系列の細胞であり得る。骨髄系列の細胞の非限定的な例には、単球、マクロファージ、好塩基球、好中球、好酸球、巨核球、肥満細胞、赤血球、血小板、および骨髄細胞がそこから分化し得る幹細胞が含まれる。
ある特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞）である。
ある特定の実施形態では、本開示の細胞は、腫瘍微小環境をモジュレートすることが可能である。腫瘍は、免疫認識および排除からそれら自体を保護するための悪性細胞による一連の機序が関与する、宿主免疫応答に対して敵対的な微小環境を有する。この「敵対的な腫瘍微小環境」は、浸潤性制御性ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、ＴＧＦ－βを含む免疫抑制性サイトカイン、および活性化されたＴ細胞によって発現される免疫抑制性受容体（ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１）に標的化されるリガンドの発現を含む、種々の免疫抑制因子を含む。免疫抑制のこれらの機序は、忍容性の維持および不適切な免疫応答の抑制において役割を果たすが、腫瘍微小環境内で、これらの機序は、有効な抗腫瘍免疫応答を防止する。集合的に、これらの免疫抑制因子は、標的化された腫瘍細胞との遭遇の際に、養子移入されたＣＡＲ改変されたＴ細胞の際立ったアネルギーまたはアポトーシスのいずれかを誘導し得る。
ある特定の実施形態では、本開示の細胞は、増加した細胞増殖および／または細胞持続性を有する。ある特定の実施形態では、本開示の免疫応答性細胞は、減少したアポトーシスおよび／またはアネルギーを有する。
ある特定の実施形態では、細胞は、抗原に結合する抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をさらに含む。細胞は、細胞が抗原認識受容体およびｃ－Ｋｉｔ変異体を共発現するように外因性に活性化する抗原認識受容体およびｃ－Ｋｉｔ変異体で形質導入され得る。
ｃ－Ｋｉｔ変異体は、第１のプロモーターに作動可能に連結していてもよい。抗原認識受容体は、第２のプロモーターに作動可能に連結していてもよい。第１のプロモーターは、第２のプロモーターと同じであり得る。あるいは、第１のプロモーターは、第２のプロモーターとは異なる。第１および第２のプロモーターは、内因性または外因性であり得る。外因性プロモーターの非限定的な例には、伸長因子（ＥＦ）－１プロモーター、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびメタロチオネインプロモーターが含まれる。ある特定の実施形態では、第１および第２のプロモーターの一方または両方は、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターの非限定的な例は、ＮＦＡＴ転写応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーターおよびＩＬ－２プロモーターから選択される。
５．４．抗原認識受容体
ある特定の実施形態では、本開示の細胞は、抗原認識受容体をさらに含む。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、抗原に結合する。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ＴＣＲ様融合分子である。
５．４．１．抗原
抗原認識受容体は、腫瘍抗原または病原体抗原に結合することができる。
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、腫瘍抗原に結合する。任意の腫瘍抗原（抗原ペプチド）は、本明細書に記載の腫瘍に関連する実施形態において使用することができる。抗原の供給源には、がんタンパク質が含まれるがこれらに限定されない。抗原は、ペプチドとして、または無傷タンパク質もしくはその部分として発現され得る。無傷タンパク質またはその部分は、天然であっても、変異誘発されていてもよい。ある特定の実施形態では、抗原は、腫瘍組織において発現される。腫瘍抗原の非限定的な例として、メソテリン、ＣＤ１９、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥｐＣＡＭ、Ｅｒｂ－Ｂ２、Ｅｒｂ－Ｂ３、Ｅｒｂ－Ｂ４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体－α、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ－２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、Ｋ－軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＥＲＢＢ２、ＭＡＧＥＡ３、ＣＴ８３（ＫＫ－ＬＣ－１としても公知）、ｐ５３、ＭＡＲＴ１、ＧＰ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ－７２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＷＴ－１、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４Ｖ６、ＮＫＣＳ１、ＥＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＣＤ９９、ＣＤ７０、ＡＤＧＲＥ２、ＣＣＲ１、ＬＩＬＲＢ２、ＰＲＡＭＥ、ＨＰＶ Ｅ６腫瘍性タンパク質、ＨＰＶ Ｅ７腫瘍性タンパク質およびＥＲＢＢが挙げられる。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、メソテリンである。
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、メソテリンに結合する。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ＮＣＢＩ参照番号ＡＡＶ８７５３０．１（配列番号３）を有する配列またはその断片からなるヒトメソテリンに結合する。配列番号３は、以下に提供される：
Figure 2023504560000005
ある特定の実施形態では、例えば、免疫不全状態の対象における、例えば、病原体感染または他の感染性疾患を処置および／または防止する際に使用するための抗原認識受容体は、病原体抗原に結合する。病原体の非限定的な例としては、疾患を引き起こすことが可能なウイルス、細菌、真菌、寄生生物および原生生物が挙げられる。
ウイルスの非限定的な例としては、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ－１（ＨＤＴＶ－ＩＩＩ、ＬＡＶＥまたはＨＴＬＶ－ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ－ＩＩＩとも称される）；およびＨＩＶ－ＬＰなどの他の分離株）；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）；Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ハンタンウイルス、ブニヤウイルス（ｂｕｎｇａ ｖｉｒｕｓ）、フレボウイルスおよびナイラウイルス（Ｎａｉｒａ ｖｉｒｕｓ））；Ａｒｅｎａ ｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（ほとんどのアデノウイルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；ならびに未分類ウイルス（例えば、デルタ肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられる）、非Ａ非Ｂ型肝炎の因子（クラス１＝内部感染、クラス２＝非経口感染（すなわちＣ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルスならびにアストロウイルス、ヒトパピローマウイルス（すなわち、ＨＰＶ）、ＪＣウイルス、エプスタインバールウイルス、メルケル細胞ポリオーマウイルス）が挙げられる。
細菌の非限定的な例としては、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が挙げられる。感染性細菌の具体例としては、以下に限定されないが、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐｓ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ビリダンス群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅおよびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｌｉが挙げられる。
ある特定の実施形態では、病原体抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中に存在するウイルス抗原、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）中に存在するウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）中に存在するウイルス抗原、またはインフルエンザウイルス中に存在するウイルス抗原である。
５．４．２．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ＴＣＲである。ＴＣＲは、インバリアントＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現される２つの可変鎖からなるジスルフィド結合ヘテロ二量体タンパク質である。ＴＣＲは、Ｔ細胞表面に見られ、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとしての抗原の認識を担う。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、アルファ鎖およびベータ鎖（それぞれ、ＴＲＡおよびＴＲＢによってコードされる）を含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、ガンマ鎖およびデルタ鎖（それぞれ、ＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）を含む。
ＴＣＲの各鎖は、２つの細胞外ドメイン：可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域から構成される。定常領域は、細胞膜の近位に存在し、その後に、膜貫通領域および短い細胞質側末端が存在する。可変領域は、ペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。両鎖の可変ドメインはそれぞれ、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）からなる。
ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、３つの二量体シグナル伝達モジュールＣＤ３δ／ε、ＣＤ３γ／εおよびＣＤ２４７ ζ／ζまたはζ／ηと受容体複合体を形成することができる。ＴＣＲ複合体が、その抗原およびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と会合する場合、ＴＣＲ複合体を発現するＴ細胞は活性化される。
ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、内因性ＴＣＲである。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、天然に存在するＴＣＲである。
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、外因性ＴＣＲである。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、組換えＴＣＲである。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、天然に存在しないＴＣＲである。ある特定の実施形態では、天然に存在しないＴＣＲは、少なくとも１つのアミノ酸残基で、いずれかの天然に存在するＴＣＲと異なる。ある特定の実施形態では、天然に存在しないＴＣＲは、少なくとも約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００またはそれより多いアミノ酸残基で、いずれかの天然に存在するＴＣＲと異なる。ある特定の実施形態では、天然に存在しないＴＣＲは、少なくとも１つのアミノ酸残基で、天然に存在するＴＣＲから改変される。ある特定の実施形態では、天然に存在しないＴＣＲは、少なくとも約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００またはそれより多いアミノ酸残基で、天然に存在するＴＣＲから改変される。
５．４．３．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ＣＡＲである。ＣＡＲは、目的の特異性を免疫エフェクター細胞上に移植または付与する操作された受容体である。レトロウイルスベクターによりコード配列の移入を促進して、ＣＡＲを使用してモノクローナル抗体の特異性をＴ細胞上に移植することができる。
３つの世代のＣＡＲが存在する。「第１世代」のＣＡＲは、典型的には、細胞質／細胞内シグナル伝達ドメインに融合した膜貫通ドメインに融合した細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から構成される。「第１世代」のＣＡＲは、ｄｅ ｎｏｖｏ抗原認識を提供し、ＨＬＡ媒介性抗原提示とは無関係に、単一の融合分子において、それらのＣＤ３ζ鎖シグナル伝達ドメインを介してＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の活性化をもたらすことができる。「第２世代」のＣＡＲは、様々な共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０）由来の細胞内シグナル伝達ドメインをＣＡＲの細胞質側末端に付加し、さらなるシグナルをＴ細胞に提供する。「第２世代」のＣＡＲは、共刺激（例えば、ＣＤ２８または４－１ＢＢ）と活性化（ＣＤ３ζ）の両方を提供するものを含む。「第３世代」のＣＡＲは、複数の共刺激（例えば、ＣＤ２８および４－１ＢＢ）と活性化（ＣＤ３ζ）を提供するものを含む。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、第１世代のＣＡＲである。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを含まないＣＡＲである。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、第２世代のＣＡＲである。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み得、細胞外抗原結合ドメインは、腫瘍抗原または病原体抗原であり得る抗原に特異的に結合する。
５．４．３．１．ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン
ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、抗原に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、抗原は、メソテリンである。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒトｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化ｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、マウスｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、必要に応じて架橋したＦａｂである。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ）２である。ある特定の実施形態では、前記分子のいずれかは、異種配列を含む融合タンパク質内に含まれ、細胞外抗原結合ドメインを形成することができる。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、抗原－Ｆｃ融合タンパク質を用いてｓｃＦｖファージライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはそのアナログが具体化される）は、約２×１０－７Ｍまたはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）で抗原に結合する。ある特定の実施形態では、Ｋｄは、約２×１０－７Ｍもしくはそれ未満、約１×１０－７Ｍもしくはそれ未満、約９×１０－８Ｍもしくはそれ未満、約１×１０－８Ｍもしくはそれ未満、約９×１０－９Ｍもしくはそれ未満、約５×１０－９Ｍもしくはそれ未満、約４×１０－９Ｍもしくはそれ未満、約３×１０－９もしくはそれ未満、約２×１０－９Ｍもしくはそれ未満、または約１×１０－９Ｍもしくはそれ未満である。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｋｄは、約３×１０－９Ｍまたはそれ未満である。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｋｄは、約１×１０－９Ｍ～約３×１０－７Ｍである。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｋｄは、約１．５×１０－９Ｍ～約３×１０－７Ｍである。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｋｄは、約１．５×１０－９Ｍ～約２．７×１０－７Ｍである。
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ヒトメソテリンに対する高い結合特異性および高い結合親和性を有する。例えば、このような実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖで具体化される）は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した場合、約１ｎＭ～約２５ｎＭのＥＣ５０値でヒトメソテリンに結合する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ＥＬＩＳＡによって測定した場合、約２０ｎＭのＥＣ５０値を有する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，３５７，７８３号に記載される抗メソテリン抗体またはその抗原結合部分を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ヒトメソテリンに結合する抗体、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＦｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （２００９）；８（５）：１１１３－１１１８に開示された抗体ｍ９１２の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に由来する。抗体ｍ９１２は、組換えメソテリンに対してパニングすることによってヒトＦａｂライブラリーから単離された。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、Ｆａｂ（例えば、ヒトまたはマウスＦａｂライブラリー）に由来する。
ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインの結合（実施形態、例えば、ｓｃＦｖにおいて）は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害）、またはウエスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらのアッセイのそれぞれは、一般に、目的の複合体に対して特異的な標識された試薬（例えば、抗体、またはｓｃＦｖ）を用いることによって、特定の目的のタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。例えば、ｓｃＦｖは、放射性標識され、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において使用することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｂ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ， Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｍａｒｃｈ， １９８６を参照されたい）。放射性同位体は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。ある特定の実施形態では、メソテリン標的化細胞外抗原結合ドメインは、蛍光マーカーで標識される。蛍光マーカーの非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、およびｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、セルリアン、およびＣｙＰｅｔ）、および黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、シトリン、Ｖｅｎｕｓ、およびＹＰｅｔ）が挙げられる。一実施形態では、メソテリン標的化ヒトｓｃＦｖは、ＧＦＰで標識される。
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、約１，０００個またはそれより多くのメソテリン結合部位／細胞のメソテリンレベルを有するヒトメソテリンを認識するかまたはそれに結合する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、約１，０００～約５０，０００個のメソテリン結合部位／細胞のメソテリンレベルを有するヒトメソテリンを認識するかまたはそれに結合する。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、１，０００個未満のメソテリン結合部位／細胞のメソテリン発現レベルを有するヒトメソテリン、例えば、正常組織、例えば、正常な胸膜、心膜および腹膜組織において発現されるヒトメソテリンを認識もそれに結合もしない。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、５０，０００個よりも多くのメソテリン結合部位／細胞のメソテリン発現レベルを有するヒトメソテリンを認識もそれに結合もしない。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ中に含まれるヒトｓｃＦｖは、約１，０００～約５０，０００個のメソテリン結合部位／細胞のメソテリン発現レベルを有するヒトメソテリンを認識するかまたはそれに結合する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ中に含まれるヒトｓｃＦｖは、５０，０００個よりも多くのまたは１，０００個未満のメソテリン結合部位／細胞のメソテリン発現レベルを有するヒトメソテリンを認識もそれに結合もしない。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号４に示されるアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号６に示されるアミノ酸配列、その保存的改変を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号７に示されるアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号９に示されるアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号４に示されるアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号６に示されるアミノ酸配列、その保存的改変を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号７に示されるアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号９に示されるアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４に示される配列を有するアミノ酸を含むＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って同定される。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含み、必要に応じて（ｉｉｉ）前記ＶＨと前記ＶＬの間のリンカー配列、例えば、リンカーペプチドを伴う。ある特定の実施形態では、リンカーは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１０と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％）相同または同一であるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１０と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％相同または同一であるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１１と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％）相同または同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１１と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％相同または同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１０と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％）相同または同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１１と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％）相同または同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
配列番号１０のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、配列番号１２に示される。
配列番号１１のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、配列番号１３に示される。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％（例えば、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％）相同または同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、ヒトメソテリンポリペプチド（例えば、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むヒトメソテリンポリペプチド）に特異的に結合する。
ある特定の実施形態では、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする例示的なヌクレオチド配列は、配列番号１５に示される。
ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒトｓｃＦｖである。
配列番号４～１５は、以下に提供される：
Figure 2023504560000006
Figure 2023504560000007
本明細書で使用される場合、用語「保存的な配列の改変」は、アミノ酸配列を含む本開示のメソテリン標的化ＣＡＲ（例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン）の結合の特徴に有意に影響を及ぼさず、変更もしないアミノ酸改変を指す。保存的改変は、アミノ酸の置換、付加および欠失を含み得る。改変は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発などの当技術分野で公知の標準的技法によって、本開示のＣＡＲの細胞外抗原結合ドメイン中に導入され得る。アミノ酸は、電荷および極性などのそれらの物理化学的特性に従って群に分類され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同じ群にあるアミノ酸で置き換えられる置換である。例えば、アミノ酸は電荷によって分類することができる：正電荷アミノ酸には、リシン、アルギニン、ヒスチジンが含まれ、負電荷アミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸が含まれ、中性電荷アミノ酸には、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが含まれる。さらに、アミノ酸は、極性によって分類することができる：極性アミノ酸には、アルギニン（塩基性極性）、アスパラギン、アスパラギン酸（酸性極性）、グルタミン酸（酸性極性）、グルタミン、ヒスチジン（塩基性極性）、リシン（塩基性極性）、セリン、トレオニン、およびチロシンが含まれ、非極性アミノ酸には、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、およびバリンが含まれる。よって、ＣＤＲ領域内の１つまたは複数のアミノ酸残基は、同じ群に由来する他のアミノ酸残基で置き換えることができ、変更された抗体は、本明細書に記載の機能的アッセイを使用して、保持された機能（すなわち、上記（ｃ）から（ｌ）に示される機能）について試験することができる。ある特定の実施形態では、指定された配列内またはＣＤＲ領域内の１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、５つ以下の残基が変更される。
特定の配列（例えば、配列番号１０または配列番号１１）に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％（例えば、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％）の相同性または同一性を有するＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、指定された配列（複数可）に対して、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有し得るが、標的抗原（例えば、メソテリン）に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、合計１～１０個のアミノ酸が、特定の配列（例えば、配列番号１０または配列番号１１）において、置換、挿入および／または欠失される。ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、細胞外抗原結合ドメインのＣＤＲの外側の領域において（例えばＦＲにおいて）起こる。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、これらの配列（配列番号１０および配列番号１１）の翻訳後修飾を含む、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、２つの配列間の同一性パーセントと同等である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要のあるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた、これらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを使用して達成することができる。
２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み付き残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれるＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．， ４：１１－１７ （１９８８））のアルゴリズムを使用して決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにおいて利用可能）中に組み込まれた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４４－４５３ （１９７０））のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み付け、および１、２、３、４、５、または６の長さの重み付けを使用して決定することができる。
さらにまたはあるいは、本開示の主題のアミノ酸配列を「クエリー配列」としてさらに使用して、例えば、関連する配列を同定するために、公共のデータベースに対して検索を実施することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本明細書に開示される指定された配列（例えば、ｓｃＦｖ ｍ９０３、ｍ９０４、ｍ９０５、ｍ９０６、およびｍ９００の重鎖および軽鎖可変領域の配列）と相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３により実施することができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９－３４０２に記載されたギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。
５．４．３．２．ＣＡＲの膜貫通ドメイン
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、膜の少なくとも一部分に及ぶ疎水性アルファヘリックスを含む。様々な膜貫通ドメインは、様々な受容体安定性をもたらす。抗原認識後に、受容体がクラスター化し、シグナルが細胞に伝達される。本開示の主題によれば、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＮＫＧＤ２、合成ペプチド（免疫応答に関連するタンパク質をベースとしない）、またはそれらの組合せの天然のまたは改変された膜貫通ドメインを含み得る。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチド（例えば、ＣＤ８の膜貫通ドメイン）を含む。
ある特定の実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、以下に提供されるＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１１３９３４５．１（配列番号１９）を有する配列と、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、またはその断片を含むか、またはからなる（本明細書において、相同性は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどの標準的ソフトウェアを使用して決定することができる）、ならびに／あるいは、必要に応じて、最大１、または最大２、または最大３つの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。ある特定の実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、少なくとも２０、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０、および最大２３５アミノ酸長である、配列番号１９の連続部分であるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。あるいはまたはさらに、非限定的な様々な実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸１～２３５、１～５０、５０～１００、１００～１５０、１５０～２００、１３７～２０９、または２００～２３５のアミノ酸配列を含むか、またはからなる。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号１９のアミノ酸１３７～２０９を含むか、または有するＣＤ８ポリペプチドを含む。
Figure 2023504560000008
ある特定の実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、以下に提供されるＮＣＢＩ参照番号ＡＡＡ９２５３３．１（配列番号２０）を有する配列と、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、またはその断片を含むか、またはからなる（本明細書において、相同性は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどの標準的ソフトウェアを使用して決定することができる）、ならびに／あるいは、必要に応じて、最大１、または最大２、または最大３つの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。ある特定の実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、少なくとも約２０、または少なくとも約３０、または少なくとも約４０、または少なくとも約５０、または少なくとも約６０、または少なくとも約７０、または少なくとも約１００、または少なくとも約２００、および最大２４７アミノ酸長である、配列番号２０の連続部分であるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。あるいはまたはさらに、非限定的な様々な実施形態では、ＣＤ８ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸１～２４７、１～５０、５０～１００、１００～１５０、１５０～２００、１５１～２１９、または２００～２４７のアミノ酸配列を含むか、またはからなる。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号２０のアミノ酸１５１～２１９を含むか、または有するＣＤ８ポリペプチドを含む。
Figure 2023504560000009
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、以下に提供される配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むかまたは有するＣＤ８ポリペプチドを含む：
ＳＴＴＴＫＰＶＬＲＴＰＳＰＶＨＰＴＧＴＳＱＰＱＲＰＥＤＣＲＰＲＧＳＶＫＧＴＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡＬＬＬＳＬＩＩＴＬＩＣＹ［配列番号２１］
本開示の主題によれば、「ＣＤ８核酸分子」は、ＣＤ８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
ある特定の実施形態では、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤ８ポリペプチドをコードする例示的なＣＤ８核酸分子は、以下に提供される配列番号２２に示される。
Figure 2023504560000010
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチド（例えば、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン）を含む。
ＣＤ２８ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号Ｐ１０７４７またはＮＰ＿００６１３０（配列番号２）を有する配列と、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％もしくは１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、またはその断片を含むか、またはからなる、ならびに／あるいは、必要に応じて、最大１、または最大２、または最大３つの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。非限定的なある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、少なくとも２０、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０、および最大２２０アミノ酸長である、配列番号２３の連続部分であるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。非限定的な様々な実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸１～２２０、１～５０、５０～１００、１００～１５０、１５０～２００、１５３～１７９または２００～２２０のアミノ酸配列を含むか、またはからなる。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号２３のアミノ酸１５３～１７９を含むか、またはからなるＣＤ２８ポリペプチドを含む。配列番号２３は以下に提供される：
Figure 2023504560000011
本開示の主題によれば、「ＣＤ２８核酸分子」は、ＣＤ２８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
ある特定の実施形態では、配列番号２３のアミノ酸１５３～１７９からなるＣＤ２８ポリペプチドをコードする例示的なＣＤ２８核酸分子は、以下に提供される配列番号２４に示される。
ｔｔｔｔｇｇｇｔｇｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｔｇｇｔｇｇａｇｔｃｃｔｇｇｃｔｔｇｃｔａｔａｇｃｔｔｇｃｔａｇｔａａｃａｇｔｇｇｃｃｔｔｔａｔｔａｔｔｔｔｃｔｇｇｇｔｇ［配列番号２４］
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤ２８ポリペプチドを含む。配列番号２５は、以下に提供される：
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶ ＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶ ＡＦＩＩＦＷＶ［配列番号２５］
配列番号２５のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、以下に提供される配列番号２６に示される。
ＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧ［配列番号２６］
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサー領域をさらに含む。スペーサー領域は、抗原結合ドメインが、様々な方向に配向して、抗原認識を容易にすることが可能であるように十分に柔軟であり得る。
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲのヒンジ／スペーサー領域は、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＮＫＧＤ２、合成ポリペプチド（免疫応答に関連するタンパク質をベースとしない）、またはそれらの組合せの天然のまたは改変されたヒンジ領域を含む。ヒンジ／スペーサー領域は、ＩｇＧ１由来のヒンジ領域、または免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域およびＣＤ３の部分、ＣＤ２８ポリペプチドの部分（例えば、配列番号２３の部分）、ＣＤ８ポリペプチドの部分（例えば、配列番号１９の部分または配列番号２０の部分）、それと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約１００％相同または同一である前記のいずれかの変形形態、あるいは合成スペーサー配列であり得る。
５．４．３．３．ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメイン
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζポリペプチドを含む。ＣＤ３ζは、細胞（例えば、リンパ系列の細胞、例えば、Ｔ細胞）を活性化または刺激することができる。野生型（「天然の」）ＣＤ３ζは、３つの機能的な免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、３つの機能的な塩基性リッチストレッチ（ＢＲＳ）領域（ＢＲＳ１、ＢＲＳ２およびＢＲＳ３）を含む。ＣＤ３ζは、抗原が結合した後に、活性化シグナルを細胞（例えば、リンパ系列の細胞、例えば、Ｔ細胞）に伝達する。ＣＤ３ζ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインは、内因性ＴＣＲからのシグナルの主要なトランスミッターである。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、天然のＣＤ３ζを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿９３２１７０（配列番号２７）を有する配列と、少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％相同または同一であるアミノ酸配列、またはその断片を含むか、またはからなる、ならびに／あるいは、必要に応じて、最大１、または最大２、または最大３つの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、少なくとも２０、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０、および最大１６４アミノ酸長である、配列番号２７の連続部分であるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。あるいはまたはさらに、非限定的な様々な実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸１～１６４、１～５０、５０～１００、５２～１６４、１００～１５０、または１５０～１６４のアミノ酸配列を含むか、またはからなる。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２７のアミノ酸５２～１６４を含むか、または有するＣＤ３ζポリペプチドを含む。配列番号２７は以下に提供される：
Figure 2023504560000012
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、改変されたＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許公開番号ＷＯ２０１９／１３３９６９中に開示されたものである。
ある特定の実施形態では、改変されたＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号２８に示されるアミノ酸配列もしくはその断片と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、少なくとも約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得る。配列番号２８は、以下に提供される：
Figure 2023504560000013
配列番号２８のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、以下に提供される配列番号２９に示される。
Figure 2023504560000014
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。ある特定の実施形態では、共刺激領域は、少なくとも１つの共刺激分子またはその部分を含む。ある特定の実施形態では、共刺激シグナル伝達領域は、少なくとも１つの共刺激分子の細胞内ドメインまたはその部分を含む。
本明細書で使用される場合、「共刺激分子」は、抗原に対するリンパ球の効率的応答を提供し得る、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子を指す。ある特定の実施形態では、共刺激分子は、最適なリンパ球活性化を提供し得る。共刺激分子の非限定的な例としては、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ－１０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＮＫＧＤ２、ＣＤ２、およびこれらの組み合わせが挙げられる。共刺激分子は、その受容体に結合する際に共刺激応答、すなわち、抗原認識受容体（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））がその標的抗原に結合する場合に提供される刺激をもたらす細胞内応答を生じる細胞表面で発現されるタンパク質である、共刺激リガンドに結合することができる。一例として、４－１ＢＢリガンド（すなわち、４－１ＢＢＬ）は、ＣＡＲシグナルと組み合わせて、ＣＡＲ＋Ｔ細胞のエフェクター細胞機能を誘導する細胞内シグナルを与えるために、４－１ＢＢに結合し得る。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチド、例えば、ＣＤ２８の細胞内ドメインまたはその部分を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号２３に示されるアミノ酸配列もしくはその断片と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、少なくとも約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得る。非限定的なある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、少なくとも２０、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０、および最大２２０アミノ酸長である、配列番号２３の連続部分であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。あるいはまたはさらに、非限定的な様々な実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸１～２２０、１～５０、５０～１００、１００～１５０、１１４～２２０、１５０～２００、１８０～２２０または２００～２２０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２３のアミノ酸１８０～２２０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。
配列番号２３のアミノ酸１８０～２２０をコードする例示的な核酸配列は、以下に提供される配列番号３０に示される。
Figure 2023504560000015
ある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿０３１６６８．３（配列番号３１）を有する配列もしくはその断片と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、少なくとも約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなり、および／または必要に応じて、最大１つもしくは最大２つもしくは最大３つの保存的アミノ酸置換を含み得る。非限定的なある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、少なくとも約２０、または少なくとも約３０、または少なくとも約４０、または少なくとも約５０、および最大２１８アミノ酸長である、配列番号３１の連続部分であるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。あるいはまたはさらに、非限定的な様々な実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸１～２１８、１～５０、５０～１００、１００～１５０、１１４～２２０、１５０～２００、１７８～２１８または２００～２２０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲの共刺激シグナル伝達領域は、配列番号３１のアミノ酸１７８～２１８を含むかまたはそれからなるＣＤ２８ポリペプチドを含む。配列番号３１は、以下に提供される：
Figure 2023504560000016
配列番号３１のアミノ酸１７８～２１８をコードする例示的なヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号３２に示される。
Figure 2023504560000017
ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激分子またはそれらの部分（例えば、共刺激分子の細胞内ドメイン）、例えば、ＣＤ２８および４－１ＢＢの細胞内ドメイン、またはＣＤ２８およびＯＸ４０の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。
ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達領域を含まない、すなわち、ＣＡＲは、第１世代のＣＡＲである。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子、例えば、４－１ＢＢ、ＣＤ２８などの細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ＣＡＲ中に含まれる共刺激シグナル伝達ドメインは、制御不能な増殖を生じ得る。細胞中に含まれるｃ－Ｋｉｔの活性化は、制御され得る。例えば、項目５．２に開示されるように、ｃ－Ｋｉｔ変異体は、プロモーター、例えば、ｃ－Ｋｉｔの活性化を制御することができる誘導性プロモーターに作動可能に連結していてもよく、例えば、誘導性プロモーターの制御により、ｃ－Ｋｉｔは、ｃ－Ｋｉｔ変異体を含む細胞（例えば、Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞）の活性化の際にのみ活性化される。
５．４．３．４．例示的なＣＡＲ
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、メソテリン標的化ＣＡＲである。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む細胞外抗原結合ドメイン；（ｂ）ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、ならびに（ｃ）（ｉ）ＣＤ３ζポリペプチド、および（ｉｉ）ＣＤ２８ポリペプチド（例えば、ＣＤ２８の細胞内ドメイン）を含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、メソテリン標的化ＣＡＲである。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ ＣＤＲ３を含む細胞外抗原結合ドメイン；（ｂ）ＣＤ８の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン、ならびに（ｃ）ＣＤ３ζポリペプチドを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含み、共刺激シグナル伝達領域を含まない。
ある特定の実施形態では、本開示のＣＡＲは、ヒト細胞において核酸配列を発現するための、誘導性プロモーターをさらに含む。ＣＡＲ遺伝子を発現する際に使用するためのプロモーターは、ユビキチンＣ（ＵｂｉＣ）プロモーターなどの構成的プロモーターであり得る。
５．４．４．ＴＣＲ様融合分子
ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、ＴＣＲ様融合分子である。ＴＣＲ融合分子の非限定的な例には、ＨＬＡ非依存性ＴＣＲベースのキメラ抗原受容体（「ＨＩＴ－ＣＡＲ」としても公知、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１９／０１７５２５に開示されるもの）およびＴ細胞受容体融合構築物（ＴＲｕＣ）（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢａｅｕｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．， ”Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＴＲｕＣ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｅｎｇａｇｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ”， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌｕｍｅ １０， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ２０８７ （２０１９）に開示されるもの）が含まれる。
本開示の主題は、メソテリン標的化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびドミナントネガティブ形態のプログラム死１（ＰＤ－１ ＤＮ）を含むポリペプチド組成物を提供する。
５．５．ドミナントネガティブ形態のプログラム死１（ＰＤ－１ ＤＮ）
ある特定の実施形態では、本開示の主題の細胞は、ドミナントネガティブ形態のプログラム死１（「ＰＤ－１ ＤＮ」と称される）をさらに含む。
ＰＤ－１ ＤＮは、ＣＡＲを含む免疫応答性細胞の治療有効性を増強することができる。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、（ａ）リガンド結合領域を含むプログラム死１（ＰＤ－１）の細胞外ドメインの少なくとも一部分、および（ｂ）膜貫通ドメインを含む。
ある特定の実施形態では、細胞、例えばＴ細胞は、ドミナントネガティブ形態（ＤＮ形態）のＰＤ－１を発現するように操作される。
悪性細胞は、免疫認識および排除から細胞を保護する免疫抑制性微小環境を生成するように順応する（Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｓ． Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ． ８：３３７－３５０ （２０１５））。免疫抑制性微小環境は、免疫療法の方法に制限を課す。細胞媒介性免疫応答のＤＮ形態の阻害剤の詳細は、ＷＯ２０１７／０４０９４５およびＷＯ２０１７／１００４２８に開示され、そのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）は、内因性マクロファージおよび樹状細胞の上で発現される、その対応するリガンドＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２との結合による、活性化されたＴ細胞の負の免疫調節因子である。ＰＤ－１は、２６８アミノ酸のＩ型膜タンパク質である。ＰＤ－１は、Ｂ７ファミリーのメンバーである２つのリガンドＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２からなる。タンパク質の構造は、細胞外ＩｇＶドメインとその後の膜貫通領域および細胞内末端とを含む。細胞内末端は、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフおよび免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ中に位置する２つのリン酸化部位を含む。ＰＤ－１は、ＴＣＲシグナルを負に調節する。ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２ホスファターゼは、リガンド結合の際に、ＰＤ－１の細胞質側末端に結合する。ＰＤ－Ｌ１の上方調節は、宿主免疫系を回避するために腫瘍細胞が使用する１つの機序である。前臨床試験および臨床試験では、アンタゴニスト抗体によるＰＤ－１遮断は、宿主内因性免疫系を介して媒介される抗腫瘍応答を誘導した。
ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＰ＿００５００９．２（配列番号３３）を有するアミノ酸またはその断片からなる。ある特定の実施形態では、配列番号３３のアミノ酸１～２０は、ＰＤ－１のシグナルペプチド（またはペプチドシグナル）である。ある特定の実施形態では、配列番号３３のアミノ酸２１～１７０は、ＰＤ－１の細胞外ドメインである。ある特定の実施形態では、配列番号３３のアミノ酸１７１～１９１は、ＰＤ－１の膜貫通ドメインである。ある特定の実施形態では、配列番号３３のアミノ酸１９２～２８８は、ＰＤ－１の細胞内ドメインである。配列番号３３は、以下に提供される：
Figure 2023504560000018
ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の細胞外ドメインは、リガンド結合ドメイン（「細胞外リガンド結合ドメイン」と称される）を含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の細胞外リガンド結合ドメインは、１つまたは複数の異種ポリペプチド配列に融合される、すなわち、ＰＤ－１ ＤＮは、キメラ配列である。例えば、ＰＤ－１の細胞外リガンド結合ドメインは、必要に応じて本明細書に記載の様々なシグナルペプチドを含む異種シグナルペプチドであるシグナルペプチドに、そのＮ末端で融合され得る。さらに、ＰＤ－１ ＤＮは、必要に応じて本明細書に記載の様々な膜貫通ドメインのいずれかを含む異種膜貫通ドメインである膜貫通ドメインを含み得る。
ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、ＰＤ－１ポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、配列番号３３のアミノ酸２１～１７０）またはそのリガンド結合部分（例えば、配列番号３３のアミノ酸２１～１６５）を含む。このようなＰＤ－１ ＤＮを発現する細胞は、ＰＤ－１免疫チェックポイント経路においてシグナル伝達する能力を欠いていても、低減された能力を有していてもよい。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、細胞内ドメインの欠失を有する欠失変異体（例えば、ＰＤ－１ ＤＮは、配列番号３３のアミノ酸１９２～２８８を欠く）またはその部分である。細胞内ドメインの欠失を有するＰＤ－１は、ＰＤ－１によって媒介される免疫チェックポイント経路の低減または阻害を有し得る。
ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、ＰＤ－１の細胞外リガンド結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、ＰＤ－１ポリペプチドの細胞外リガンド結合ドメインおよびＰＤ－１ポリペプチドの膜貫通ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、配列番号３３のアミノ酸２１～１６５を含むかまたはそれからなる。
配列番号３３のアミノ酸２１～１６５をコードする例示的なヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号３４に示される。
Figure 2023504560000019
Figure 2023504560000020
ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、シグナルペプチドをさらに含み、例えば、ＰＤ－１ ＤＮは、ＰＤ－１ポリペプチドの細胞外リガンド結合ドメイン、ＰＤ－１ポリペプチドの膜貫通ドメインおよびＰＤ－１ポリペプチドのシグナルペプチドを含む。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３３のアミノ酸１～２０を含むかまたはそれからなる。配列番号３３のアミノ酸１～２０をコードする例示的なヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号３５に示される。
ＡＴＧＣＡＧＡＴＣＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＴＣＧＴＣＴＧＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＧＣＴＧＧＣＧＧ［配列番号３５］
ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、配列番号３３のアミノ酸１～１６５を含むかまたはそれからなる。
配列番号３３のアミノ酸１～１６５をコードする例示的なヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号３６に示される。
Figure 2023504560000021
ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、配列番号３３のアミノ酸２１～１５１を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、配列番号３３のアミノ酸１～１５１を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、配列番号３３のアミノ酸２１～１５１を含むかまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、配列番号３３のアミノ酸２１で開始し、配列番号３３のアミノ酸１５１～１６５の間のアミノ酸に至るまでのアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、ＣＤ８ポリペプチドをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、ＣＤ８の膜貫通ドメインおよび／またはヒンジドメインに融合したＰＤ－１の細胞外ドメインまたはその部分（例えば、細胞外リガンド結合ドメイン）を含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、ＣＤ８の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号１９のアミノ酸１８３～２０３）を含む。このような実施形態は、異なる（異種）ポリペプチド由来の膜貫通ドメインを含むキメラＤＮ形態を代表する。上記のように、異種ドメイン、例えば膜貫通ドメインを含むＰＤ－１ ＤＮは、異種ポリペプチド由来のさらなる配列を必要に応じて含み得る。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、膜貫通ドメインのＮ末端側に、異種ポリペプチド由来のさらなる配列を含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、ＣＤ８のヒンジドメインを含む。ある特定の実施形態では、異種配列は、ＣＤ８ポリペプチドのさらなるＮ末端配列（例えば、配列番号１９のアミノ酸１３７～１８２（または必要に応じて、アミノ酸１３８もしくは１３９で開始する））を含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、ＣＤ８の膜貫通ドメインのＣ末端側に、異種ポリペプチド由来のさらなる配列を含む。ある特定の実施形態では、さらなるＣ末端配列は、配列番号１９のアミノ酸２０４～２０９である。
ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、ＣＤ８ポリペプチドの膜貫通ドメイン（例えば、配列番号１９のアミノ酸１８３～２０３）、ＣＤ８ポリペプチドのヒンジドメイン（例えば、配列番号１９のアミノ酸１３７～１８２）およびＣＤ８ポリペプチドのさらなるＣ末端配列（例えば、配列番号１９のアミノ酸２０４～２０７）を含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、配列番号１９のアミノ酸１３７～２０７からなるＣＤ８ポリペプチドを含む。
配列番号１９のアミノ酸１３７～２０７をコードする例示的なヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号３７に示される：
Figure 2023504560000022
ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、ＣＤ８ポリペプチドの膜貫通ドメイン（例えば、配列番号１９のアミノ酸１８３～２０３）、ＣＤ８ポリペプチドのヒンジドメイン（例えば、配列番号１９のアミノ酸１３７～１８２）およびＣＤ８ポリペプチドのさらなるＣ末端配列（例えば、配列番号１９のアミノ酸２０４～２０９）を含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、配列番号１９のアミノ酸１３７～２０９を有するＣＤ８ポリペプチドを含む。
配列番号１９のアミノ酸１３７～２０９をコードする例示的なヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号３８に示される：
Figure 2023504560000023
ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、以下に提供される配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含む。
Figure 2023504560000024
Figure 2023504560000025
配列番号３９に示されるアミノ酸配列をコードする例示的なヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号４０に示される：
Figure 2023504560000026
ある特定の実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮは、以下に提供される配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含む。
Figure 2023504560000027
配列番号４１に示されるアミノ酸配列をコードする例示的なヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号４２に示される：
Figure 2023504560000028
ある特定の非限定的な実施形態では、ＰＤ－１ ＤＮの膜貫通ドメインは、膜の少なくとも一部分に及ぶ疎水性アルファヘリックスを含む。異なる膜貫通ドメインは、異なる受容体安定性を生じる。本開示の主題によれば、ＰＤ－１ ＤＮの膜貫通ドメインは、本明細書に開示される任意のポリペプチドの天然のまたは改変された膜貫通ドメイン、例えば、キメラ抗原受容体中に含まれ得る任意の膜貫通ドメインを含み得る。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、ＣＤ４０ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＣＤ８４ポリペプチド、ＣＤ１６６ポリペプチド、ＣＤ８ａポリペプチド、ＣＤ８ｂポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＩＣＡＭ－１ポリペプチド、ＣＴＬＡ－４ポリペプチド、ＣＤ２７ポリペプチド、ＣＤ４０／Ｍｙ８８ペプチド、ＮＫＧＤ２ペプチド、合成ポリペプチド（免疫応答に関連するタンパク質をベースとしない）、またはそれらの組合せである。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチドである。これらの膜貫通ドメインの詳細は、項目５．４に記載される。
５．６．組成物およびベクター
本開示の主題は、（ａ）本明細書に開示されるｃ－Ｋｉｔ変異体（例えば、項目５．２に開示される）および本明細書に開示される抗原認識受容体（例えば、項目５．４に開示される）を含む組成物を提供する。このような組成物を含む細胞も提供される。
ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ変異体は、第１のプロモーターに作動可能に連結している。ある特定の実施形態では、抗原認識受容体は、第２のプロモーターに作動可能に連結している。
さらに、本開示の主題（ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｄｉｓｃｌｏｓｅｓ ｓｕｂｊｅｃｔ ｍａｔｔｅｒ）は、本明細書に開示されるｃ－Ｋｉｔ変異体（例えば、項目５．２に開示される）をコードする第１のポリヌクレオチドおよび本明細書に開示される抗原認識受容体（例えば、項目５．４に開示される）をコードする第２のポリヌクレオチドを含む核酸組成物を提供する。このような核酸組成物を含む細胞も提供される。
ある特定の実施形態では、核酸組成物は、ｃ－Ｋｉｔ変異体に作動可能に連結した第１のプロモーターをさらに含む。ある特定の実施形態では、核酸組成物は、抗原認識受容体に作動可能に連結した第２のプロモーターをさらに含む。
ある特定の実施形態では、第１および第２のプロモーターの一方または両方は、内因性または外因性である。ある特定の実施形態では、外因性プロモーターは、伸長因子（ＥＦ）－１プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫプロモーター、およびメタロチオネインプロモーターから選択される。ある特定の実施形態では、第１および第２のプロモーターの一方または両方は、誘導性プロモーターである。ある特定の実施形態では、誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴ転写応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーターおよびＩＬ－２プロモーターから選択される。
組成物および核酸組成物は、対象に投与することができる、またはおよび／当技術分野で公知の方法によるかもしくは本明細書に記載されたように細胞内に送達することができる。細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の遺伝子改変は、組換えＤＮＡ構築物を実質的に均一な細胞組成物に形質導入することによって達成することができる。ある特定の実施形態では、レトロウイルスベクター（例えば、ガンマレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターのいずれか）が、ＤＮＡ構築物の細胞内への導入に用いられる。例えば、抗原認識受容体をコードするポリヌクレオチドをレトロウイルスベクター中にクローニングすることができ、その内因性プロモーターから、レトロウイルスの長鎖末端反復配列から、または目的の標的細胞型に特異的なプロモーターから、発現が駆動され得る。非ウイルスベクターも同様に使用することができる。
抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を含むための細胞の最初の遺伝子改変のために、レトロウイルスベクターが、一般に、形質導入のために用いられるが、しかし、任意の他の好適なウイルスベクターまたは非ウイルス送達系も使用することができる。抗原認識受容体およびｃ－Ｋｉｔ変異体は、単一のマルチシストロニック発現カセット、単一のベクターの複数の発現カセット、または複数のベクターにおいて構築することができる。ポリシストロニック発現カセットを生じるエレメントの例としては、以下に限定されないが、様々なウイルスおよび非ウイルスの配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ、例えば、ＦＧＦ－１ ＩＲＥＳ、ＦＧＦ－２ ＩＲＥＳ、ＶＥＧＦ ＩＲＥＳ、ＩＧＦ－ＩＩ ＩＲＥＳ、ＮＦ－κＢ ＩＲＥＳ、ＲＵＮＸ１ ＩＲＥＳ、ｐ５３ ＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ＩＲＥＳ、ペストウイルスＩＲＥＳ、アフトウイルスＩＲＥＳ、ピコルナウイルスＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳおよび脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ）ならびに切断可能なリンカー（例えば、２Ａペプチド、例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａペプチド）が挙げられる。レトロウイルスベクターと適切なパッケージング系の組合せは、キャプシドタンパク質が、ヒト細胞に感染するのに機能的である場合にも好適である。様々なアンホトロピックウイルス産生細胞系が公知であり、以下に限定されないが、ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．（１９８５）；５：４３１－４３７）；ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．（１９８６）；６：２８９５－２９０２）；およびＣＲＩＰ（Ｄａｎｏｓ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８８）；８５：６４６０－６４６４）が含まれる。非アンホトロピック粒子、例えば、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４またはＧＡＬＶエンベロープおよび当技術分野で公知の任意の他のものでシュードタイプ化された粒子も好適である。
形質導入の可能な方法には、細胞の産生細胞（Ｂｒｅｇｎｉ， ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ（１９９２）；８０：１４１８－１４２２）との直接的共培養、あるいはウイルス上清単独と、または適切な成長因子およびポリカチオン（Ｘｕ， ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔ．（１９９４）；２２：２２３－２３０；およびＨｕｇｈｅｓ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９２）；８９：１８１７）ありまたはなしの濃縮ベクターストックと培養することも含まれる。
他の形質導入ウイルスベクターを使用して、免疫応答性細胞を改変してもよい。ある特定の実施形態では、選択されたベクターは、感染の高い効率ならびに安定した組み込みおよび発現を示す（例えば、Ｃａｙｏｕｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：４２３－４３０， １９９７；Ｋｉｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：８３３－８４４， １９９６；Ｂｌｏｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６６４１－６６４９， １９９７；Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３－２６７， １９９６；およびＭｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４：１０３１９， １９９７を参照されたい）。使用することができる他のウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、またはヘルペスウイルス、例えば、エプスタインバーウイルス（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５－１４， １９９０；Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２７５－１２８１， １９８９；Ｅｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８－６１４， １９８８；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：５５－６１， １９９０；Ｓｈａｒｐ， Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３３７：１２７７－１２７８， １９９１；Ｃｏｒｎｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３６：３１１－３２２， １９８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：４０１－４０９， １９８４；Ｍｏｅｎ， Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ １７：４０７－４１６， １９９１；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９８０－９９０， １９８９；ＬｅＧａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８－９９０， １９９３；およびＪｏｈｎｓｏｎ， Ｃｈｅｓｔ １０７：７７Ｓ－ ８３Ｓ， １９９５のベクターも参照されたい）が挙げられる。レトロウイルスベクターは、特によく開発されており、臨床実践場面で使用されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ ３２３：３７０， １９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎらの米国特許第５，３９９，３４６号）。
非ウイルスアプローチも、免疫応答性細胞の遺伝子改変に用いることができる。例えば、リポフェクションの存在下で核酸を投与することによって（Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４：７４１３， １９８７；Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １７：２５９， １９９０；Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． ２９８：２７８， １９８９；Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：５１２， １９８３）、アシアロオロソムコイド－ポリリシンコンジュゲーション（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６３：１４６２１， １９８８；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４：１６９８５， １９８９）、または外科手術条件下でのマイクロインジェクション（Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５， １９９０）によって、核酸分子を免疫応答性細胞内に導入することができる。遺伝子移入のための他の非ウイルスによる手段には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、およびプロトプラスト融合を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションが含まれる。ＤＮＡの細胞内への送達には、リポソームも潜在的に有益であり得る。正常な遺伝子の、対象の罹患組織への移植は、正常な核酸を、ｅｘ ｖｉｖｏで培養可能な細胞型（例えば、自家または異種の初代細胞またはその後代）に移入し、その後、細胞（またはその子孫）を標的化組織に注射するか、または全身的に注射することによって達成され得る。組換え受容体はまた、トランスポサーゼまたは標的化されたヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ）を使用して誘導され得るか、または得ることができる。一過的発現は、ＲＮＡ電気穿孔によって得ることができる。
いずれかの標的化ゲノム編集方法を使用して、本明細書に開示されるｃ－Ｋｉｔ変異体および／または抗原認識受容体を細胞または対象に送達することができる。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して、本明細書に開示されるｃ－Ｋｉｔ変異体および／または抗原認識受容体を送達する。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、本明細書に開示されるｃ－Ｋｉｔ変異体および／または抗原認識受容体を送達する。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥＮ系を使用して、本明細書に開示されるｃ－Ｋｉｔ変異体および／または抗原認識受容体を送達する。
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、原核細胞において発見されたゲノム編集ツールである。ゲノム編集のために利用される場合、このシステムは、Ｃａｓ９（ｃｒＲＮＡをそのガイドとして利用してＤＮＡを改変することができるタンパク質）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９と活性複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ（一般に、ヘアピンループ形態の）に結合する領域と一緒に、宿主ＤＮＡの正しいセクションにそれをガイドするためにＣａｓ９によって使用されるＲＮＡを含有する）、ｔｒａｎｓ活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡに結合し、Ｃａｓ９と活性複合体を形成する）、およびＤＮＡ修復鋳型（特定のＤＮＡ配列の挿入を可能にする細胞修復プロセスをガイドするＤＮＡ）の必要に応じたセクションを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、標的細胞にトランスフェクトするためにプラスミドを用いることが多い。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９が、細胞内の標的ＤＮＡを特定し、それに直接結合するために使用する配列であるため、適用ごとに設計される必要がある。ＣＡＲ発現カセットを保有する修復鋳型も、それが、切断のいずれかの側の配列と重複し、かつ挿入配列をコードしなければならないため、適用ごとに設計される必要がある。複数のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを一緒にパッケージングして、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成することができる。このｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９遺伝子と一緒に接合され、プラスミドにされ、細胞内にトランスフェクトされ得る。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることによって生成される人工的制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、特定のＤＮＡ配列を標的とするように操作されてもよく、それにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼがゲノム内の所望の配列を標的とすることが可能になる。個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、複数の個々のジンクフィンガーリピートを含有し、それぞれ、複数の塩基対を認識することができる。新たなジンクフィンガードメインを生成するための最も一般的な方法は、公知の特異性のより小さなジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。ＺＦＮにおける最も一般的な切断ドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩ由来の非特異的切断ドメインである。内因性相同組換え（ＨＲ）機構およびＣＡＲ発現カセットを保有する相同ＤＮＡ鋳型を使用すると、ＺＦＮを使用して、ＣＡＲ発現カセットをゲノム内に挿入することができる。標的化配列がＺＦＮによって切断されると、ＨＲ機構は、損傷を受けた染色体と相同ＤＮＡ鋳型の間の相同性を検索し、次いで、染色体の２つの破壊された末端の間の鋳型の配列をコピーし、それによって、相同ＤＮＡ鋳型がゲノム内に組み込まれる。
転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＤＮＡの特定の配列を切断するよう操作され得る制限酵素である。ＴＡＬＥＮシステムは、ＺＦＮとほとんど同じ原理で作用する。これらは、転写アクチベーター様エフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることによって生成される。転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、特定のヌクレオチドに対する強力な認識を有する２つの可変位置を有する３３～３４アミノ酸反復モチーフから構成される。これらのＴＡＬＥのアレイをアセンブルすることによって、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを所望のＤＮＡ配列に結合するように操作し、それによって、ゲノム内の特定の場所で切断するようヌクレアーゼをガイドすることができる。ポリヌクレオチド治療方法において使用するためのｃＤＮＡ発現を、任意の好適なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、またはメタロチオネインプロモーター）から指示することができ、任意の適切な哺乳類調節エレメントまたはイントロン（例えば、伸長因子１ａエンハンサー／プロモーター／イントロン構造）によって調節することができる。例えば、所望の場合、特定の細胞型において遺伝子発現を優先的に指示することが公知のエンハンサーを使用して、核酸の発現を指示することができる。使用されるエンハンサーとしては、限定されないが、組織または細胞特異的エンハンサーとして特徴付けられるものを挙げることができる。あるいは、ゲノムクローンが治療用構築物として使用される場合、上記のプロモーターまたは調節エレメントのいずれかを含む、同族の調節配列によって、または所望の場合、異種供給源に由来する調節配列によって、調節が媒介され得る。
ゲノム編集剤／システムを送達するための方法は、その必要性に応じて変化し得る。ある特定の実施形態では、選択されたゲノム編集方法の構成成分は、１つまたは複数のプラスミドにおいてＤＮＡ構築物として送達される。ある特定の実施形態では、構成成分は、ウイルスベクターによって送達される。一般的な送達方法としては、以下に限定されないが、電気穿孔、マイクロインジェクション、遺伝子銃、インパルフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、静水圧、持続注入、超音波処理、マグネトフェクション、アデノ随伴ウイルス、ウイルスベクターのエンベロープタンパク質シュードタイプ化、複製コンピテントベクターｃｉｓおよびｔｒａｎｓ作用エレメント、単純ヘルペスウイルス、および化学的ビヒクル（例えば、オリゴヌクレオチド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、無機ナノ粒子、および細胞透過性ペプチド）が挙げられる。
５．７．ポリペプチドおよびアナログ
免疫応答性細胞内で発現される場合、それらの抗新生物活性を増強する方法で改変される、メソテリン、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ３ζ、およびｃ－Ｋｉｔポリペプチドまたはその断片も本開示の主題に含まれる。本開示の主題は、配列において変更を生じさせることによってアミノ酸配列または核酸配列を最適化するための方法を提供する。このような変更には、ある特定の変異、欠失、挿入、または翻訳後修飾が含まれてもよい。本開示の主題は、本明細書に開示される任意の天然に存在するポリペプチドのアナログをさらに含む。アナログは、アミノ酸配列の差異によって、翻訳後修飾によって、またはその両方によって、本明細書に開示される天然に存在するポリペプチド（メソテリン、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ３ζ、およびｃ－Ｋｉｔを含むがこれらに限定されない）と異なり得る。アナログは、本開示の主題の天然に存在するアミノ酸配列（ａｍｉｎｏ， ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のすべてまたはその一部と、少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれより高い割合で相同であることを示し得る。配列比較の長さは、少なくとも５、１０、１５もしくは２０アミノ酸残基、例えば、少なくとも２５、５０、もしくは７５アミノ酸残基、または１００を超えるアミノ酸残基である。ここでもやはり、同一性の程度を決定することに対する例示的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムを使用することができ、ｅ－３とｅ－１００の間の確率スコアは密接に関連する配列を示す。改変には、ポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの化学誘導体化、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、またはグリコシル化が含まれ、このような改変は、ポリペプチドの合成もしくはプロセシング中に、または単離された改変酵素を用いた処理の後に起こり得る。アナログは、一次配列の変更によっても天然に存在するポリペプチドと異なり得る。これらには、自然の、および誘導された遺伝学的バリアントの両方（例えば、放射線照射もしくはエタンメチルスルフェートへの曝露によるランダム変異誘発からもたらされるか、またはＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｄ ｅｄ．）， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ， １９８９、もしくはＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、上掲に記載されている部位特異的変異誘発による）が含まれる。例えば、Ｄ－アミノ酸または天然に存在しないかもしくは合成アミノ酸（例えば、βまたはγアミノ酸）のような、Ｌ－アミノ酸以外の残基を含有する環化ペプチド、分子、およびアナログも含まれる。
全長ポリペプチドに加えて、本開示の主題は、本明細書に開示されるポリペプチドまたはペプチドドメインのいずれか１つの断片も提供する。本明細書で使用される場合、用語「断片」は、少なくとも５、１０、１３、または１５アミノ酸を意味する。ある特定の実施形態では、断片は、少なくとも２０の連続するアミノ酸、少なくとも３０の連続するアミノ酸、または少なくとも５０の連続するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、断片は、少なくとも６０～８０、１００、２００、３００またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む。断片は、当業者に公知の方法によって生成されてもよく、または通常のタンパク質プロセシング（例えば、新生ポリペプチドからの、生物学的活性に必要とされないアミノ酸の除去、または選択的ｍＲＮＡスプライシングもしくは選択的タンパク質プロセシング事象によるアミノ酸の除去）から得られてもよい。
非タンパク質アナログは、本明細書に開示されるタンパク質（例えば、ｃ－Ｋｉｔ変異体）の機能的活性を模倣するように設計された化学構造を有する。このようなアナログは、元のポリペプチドの生理学的活性を超える場合がある。アナログ設計の方法は当技術分野で周知であり、アナログの合成は、得られたアナログが免疫応答性細胞内で発現された場合に、元のポリペプチドの抗新生物活性を増加させるように化学構造を改変することによって、このような方法に従って実施することができる。これらの化学的改変には、代替のＲ基を置換すること、および参照ポリペプチドの特定の炭素原子における飽和度を変更することが含まれるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、タンパク質アナログは、ｉｎ ｖｉｖｏでの分解に対して比較的耐性であり、投与の際により延長された治療効果をもたらす。機能的活性を測定するためのアッセイには、以下の実施例に記載されるものが含まれるがこれらに限定されない。
５．８．投与
本開示の主題は、本開示の細胞を含む組成物もまた提供する。
本開示の細胞を含む組成物は、抗原に対する免疫応答を誘導および／もしくは増強する、ならびに／または新生物、病原体感染、もしくは感染性疾患を処置および／もしくは防止するために、全身的または直接的に対象に与えられてもよい。ある特定の実施形態では、本開示の細胞またはそれを含む組成物は、目的の臓器（例えば、新生物に罹患した臓器）に直接注入される。あるいは、本開示の細胞またはそれを含む組成物は、例えば、循環系（例えば、腫瘍の血管系）への投与によって、目的の臓器に間接的に与えられる。増殖および分化剤（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の生成を増加させるために、細胞または組成物の投与前、その間またはその後に与えることができる。
本開示の細胞は、任意の生理学的に許容されるビヒクル中で、通常は血管内に投与され得るが、それらはまた、骨、または細胞が再生および分化のための適切な部位を見出し得る他の都合のよい部位（例えば、胸腺）に導入され得る。通常、少なくとも約１×１０５個の細胞が投与され、最終的に約１×１０１０個またはそれより多くに達する。本開示の細胞は、細胞の精製された集団を含み得る。当業者は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）などの様々な周知の方法を使用して、集団における本開示の細胞のパーセンテージを容易に決定することができる。本開示の免疫応答性細胞を含む集団における純度の好適な範囲は、約５０％～約５５％、約５％～約６０％、および約６５％～約７０％である。ある特定の実施形態では、純度は、約７０％～約７５％、約７５％～約８０％、または約８０％～約８５％である。ある特定の実施形態では、純度は、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、および約９５％～約１００％である。投薬量は、当業者によって容易に調整され得る（例えば、純度の低下には、投薬量の増加が必要とされ得る）。細胞は、注射、カテーテルなどによって導入することができる。
本開示の組成物は、本開示の細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であってもよい。投与は、自家または異種であってもよい。例えば、細胞は、１つの対象から得られ、同じ対象または異なる、適合性の対象に投与されてもよい。末梢血由来の細胞またはそれらの後代（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ由来）は、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈内注射、または非経口投与を含む局所注射によって投与され得る。本開示の組成物（例えば、本開示の細胞を含む医薬組成物）を投与する場合、これは、注射可能な単位剤形（液剤、懸濁剤、乳剤）に製剤化され得る。
ある特定の実施形態では、組成物は、ｃ－Ｋｉｔの阻害剤（「ｃ－Ｋｉｔ阻害剤」と称される）をさらに含む。ｃ－Ｋｉｔ阻害剤は、ｃ－Ｋｉｔの活性（例えば、キナーゼ活性）を阻害することができる。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔは、ｃ－Ｋｉｔ変異体、例えば、ｃ－Ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖを特異的に阻害する。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ阻害剤は、マルチチロシンキナーゼ阻害剤である。ｃ－Ｋｉｔ阻害剤の非限定的な例には、ダサチニブ、ミドスタウリン、ポナチニブ、イマチニブが含まれる。
５．９．製剤
本開示の細胞を含む組成物は、滅菌液体調製物、例えば、等張水性液剤、懸濁剤、乳剤、分散液剤、または粘性組成物（選択されたｐＨに緩衝され得る）として、好都合に提供され得る。液体調製物は、通常、ゲル剤、他の粘性組成物、および固体組成物よりも調製するのが容易である。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与するのが、多少なりともより都合がよい。一方、粘性組成物は、適切な粘度範囲内で製剤化され、特定の組織とより長い接触期間を得ることができる。液体または粘性の組成物は、担体を含んでもよく、担体は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。
滅菌注射用液剤は、所要量の適切な溶媒に、遺伝子改変された細胞を、所望の場合、様々な量の他の成分と共に組み込むことによって調製することができる。このような組成物は、好適な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、ブドウ糖などと混合されてもよい。組成物は、凍結乾燥されてもよい。組成物は、補助物質、例えば、所望の投与経路および調製物に応じて、湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または増粘添加剤、防腐剤、着香剤、着色剤などを含有することができる。不要な実験をすることなく、好適な調製物を調製するために、参照により本明細書に組み込まれる、”ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ”， １７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８５などの標準的なテキストを参照してもよい。
抗微生物防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝剤を含む、組成物の安定性および滅菌性を増強する様々な添加剤を添加してもよい。微生物活動の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確実にすることができる。注射可能な医薬形態の吸収の延長は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。しかし、本開示の主題によれば、使用される任意のビヒクル、希釈剤、または添加剤は、遺伝子改変された細胞と適合性でなければならない。
組成物は、等張性であってもよく、すなわち、これらは、血液および涙液と同じ浸透圧を有してもよい。組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、あるいは他の薬学的に許容される剤、例えば、ブドウ糖、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたは他の無機もしくは有機溶質を使用して達成することができる。塩化ナトリウムは、特に、ナトリウムイオンを含有する緩衝剤のためのものであり得る。
組成物の粘度は、所望の場合、薬学的に許容される増粘剤を使用して、選択されたレベルに維持することができる。例えば、メチルセルロースは、容易かつ経済的に利用可能であり、共に作用し易い。他の好適な増粘剤としては、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の濃度は、選択される剤に依存し得る。重要な点は、選択された粘度を達成する量を使用することである。明らかに、好適な担体および他の添加剤の選択は、正確な投与経路および特定の剤形、例えば、液体剤形の性質（例えば、組成物が、液剤、懸濁剤、ゲル剤または別の液体形態、例えば、持続放出（ｔｉｍｅ ｒｅｌｅａｓｅ）形態もしくは液体充填形態に製剤化されるべきかどうか）に依存する。
投与される細胞の量は、処置される対象に対して変化する。一つの実施形態では、本開示の免疫応答性細胞の約１０４～約１０１０個の間、約１０４～約１０６個の間、約１０５～約１０９個の間、または約１０６～約１０８個の間がヒト対象に投与される。より効果的な細胞は、さらにより少ない数で投与される場合がある。ある特定の実施形態では、本開示の細胞の少なくとも約１×１０５、約２×１０５、約３×１０５、約４×１０５、または約５×１０５個がヒト対象に投与される。有効用量と考えられるものの正確な決定は、それらのサイズ、年齢、性別、体重、および特定の対象の状態を含む、各対象に固有の要因に基づいてもよい。投薬量は、本開示および当技術分野における知識から、当業者によって容易に確認され得る。
当業者は、組成物中の、および方法において投与されるべき、細胞ならびに必要に応じた添加剤、ビヒクル、および／または担体の量を容易に決定することができる。典型的には、任意の添加剤（活性細胞（複数可）および／または剤（複数可）に加えて）は、リン酸緩衝食塩水中、０．００１～５０％（重量）溶液の量で存在し、活性成分は、マイクログラムからミリグラムのオーダーで、例えば、約０．０００１～約５ｗｔ％、約０．０００１～約１ｗｔ％、約０．０００１～約０．０５ｗｔ％または約０．００１～約２０ｗｔ％、約０．０１～約１０ｗｔ％、または約０．０５～約５ｗｔ％で存在する。動物またはヒトに投与されるべき任意の組成物に関して、以下のものを決定することができる：好適な動物モデル、例えば、マウスなどの齧歯類において、致死用量（ＬＤ）およびＬＤ５０を決定することなどによる毒性；好適な応答を誘発する組成物（複数可）の投薬量、その中の構成成分の濃度および組成物（複数可）を投与するタイミング。このような決定は、当業者の知識、本開示および本明細書において引用される文書から、不要な実験を必要としない。そして、逐次的投与のための時間は、不要な実験を用いずに確認することができる。
５．１０．処置方法
本開示の主題の細胞およびそれを含む組成物は、新生物、病原体感染、感染性疾患、炎症性疾患または移植片拒絶の処置および／または防止のために使用され得る。このような細胞は、固形腫瘍（例えば、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）がん、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がんおよび／または胆管癌）の処置または防止のために、それを必要とする対象（例えば、ヒト対象）に投与され得る。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。
ある特定の実施形態では、新生物または腫瘍の細胞は、高い発現レベルのメソテリンを有する（「高ＭＳＬＮ発現細胞」と称される）。ある特定の実施形態では、高ＭＳＬＮ発現細胞は、正常細胞のメソテリン発現レベルと比較して、約５０倍もしくはそれより高い、約５０倍もしくはそれより高い、約６０倍もしくはそれより高い、約７０倍もしくはそれより高い、約８０倍もしくはそれより高い、約９０倍もしくはそれより高い、約１００倍もしくはそれより高い、約１５０倍もしくはそれより高い、約２００倍もしくはそれより高い、約３００倍もしくはそれより高い、約４００倍もしくはそれより高い、または約５００倍もしくはそれより高い発現レベルでメソテリンを発現する細胞である。
ある特定の実施形態では、新生物または腫瘍の細胞は、低い発現レベルのメソテリンを有する（「低ＭＳＬＮ発現細胞」と称される）。ある特定の実施形態では、低ＭＳＬＮ発現細胞は、正常細胞のメソテリン発現レベルと比較して約５０分の１もしくはそれ未満、約４０分の１もしくはそれ未満、約３０分の１もしくはそれ未満、約２０分の１もしくはそれ未満、約１０分の１もしくはそれ未満、約５分の１もしくはそれ未満、約４分の１もしくはそれ未満、約３分の１もしくはそれ未満、または約２分の１もしくはそれ未満の発現レベルでメソテリンを発現する細胞である。
ある特定の実施形態では、固形腫瘍は、肺がんである。
ある特定の実施形態では、固形腫瘍は、中皮腫である。ある特定の実施形態では、中皮腫細胞は、高ＭＳＬＮ発現細胞である。ある特定の実施形態では、高ＭＳＬＮ発現中皮腫細胞の処置において使用される細胞は、共刺激シグナル伝達領域を含まないＣＡＲ（例えば、第１世代のＣＡＲ）を含む。
本開示の主題は、それを必要とする対象において免疫応答を誘導および／または増加させるための方法を提供する。本開示の細胞およびそれを含む組成物は、治療または医薬において使用することができる。本開示の細胞およびそれを含む組成物は、対象において新生物を処置および／または防止するために使用することができる。本開示の細胞およびそれを含む組成物は、新生物を患っている対象の生存時間を延長するために使用することができる。本開示の細胞およびそれを含む組成物は、対象、例えば、免疫不全状態のヒト対象における病原体感染または他の感染性疾患を処置および／または防止するために使用することもできる。このような方法は、細胞またはそれを含む組成物（例えば、医薬組成物）を投与し、所望の効果（たとえそれが、既存の状態の緩和または再発の防止であっても）を達成するステップを含む。処置では、投与される量は、所望の効果を生じるのに有効な量である。有効量は、１回または一連の投与において与えることができる。有効量は、ボーラスで、または連続的潅流によって与えることができる。
「有効量」（すなわち、「治療有効量」）は、処置の際に、有益な、または所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の用量で対象に投与することができる。処置に関して、有効量は、疾患の進行を軽減するか、軽快させるか、安定化させるか、逆転させるか、もしくは遅らせる、またはそうでなければ、疾患の病理学的結果を低減させるのに十分な量である。有効量は、一般に、個々の場合に応じて医師によって決定され、当業者の技術の範囲内である。有効量を達成するために適切な投薬量を決定する場合には、典型的には、いくつかの要因が考慮される。これらの要因には、対象の年齢、性別および体重、処置される状態、状態の重症度ならびに投与される細胞の形態および有効濃度が含まれる。
抗原に特異的なＴ細胞を使用する養子免疫療法では、約１０６～１０１０（例えば、約１０９）個の範囲の細胞用量が、典型的に注入される。本開示の細胞の宿主への投与、およびその後の分化の際に、特異的抗原に対して特異的に方向付けられるＴ細胞が誘導される。改変された細胞は、胸膜投与、静脈内投与、皮下投与、リンパ節内投与、腫瘍内投与、髄腔内投与、胸腔内投与、腹腔内投与、および胸腺への直接投与が含まれるがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によって投与され得る。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞およびそれを含む組成物は、それを必要とする対象に胸膜投与される。本開示の主題は、細胞（例えば、Ｔ細胞）またはそれを含む組成物を使用する様々な方法を提供する。例えば、本開示の主題は、対象における腫瘍負荷を低減する方法を提供する。ある特定の実施形態では、腫瘍負荷を低減する方法は、本開示の細胞またはそれを含む組成物を対象に投与するステップを含む。本開示の細胞は、対象において、腫瘍細胞の数を低減する、腫瘍サイズを低下させる、および／または腫瘍を根絶することができる。腫瘍は、固形腫瘍であり得る。固形腫瘍の非限定的な例には、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）がん、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がんおよび胆管癌が含まれる。
本開示の主題は、新生物を有する対象の生存時間を増加または延長する方法もまた提供する。ある特定の実施形態では、新生物を有する対象の生存時間を増加または延長する方法は、本開示の免疫応答性細胞またはそれを含む組成物の有効量を対象に投与するステップを含む。方法は、対象において腫瘍負荷を低減または根絶することができる。さらに、本開示の主題は、対象における免疫応答を増加させるための方法であって、本開示の細胞またはそれを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。本開示の主題は、対象における新生物を処置および／または防止するための方法であって、本開示の細胞またはそれを含む組成物を対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。
本明細書で使用される場合、用語「新生物」は、細胞または組織の病理学的増殖、およびその後の、他の組織または臓器への遊走またはその侵襲によって特徴付けられる疾患を指す。新生物の成長は、典型的には、制御不能かつ進行的であり、正常細胞の分裂増殖を誘発しないか、またはその停止を引き起こす条件下で生じる。新生物は、膀胱、結腸、骨、脳、乳房、軟骨、グリア、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、胸膜、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、尿道、子宮および膣からなる群から選択される臓器、またはその組織もしくは細胞型を含むがそれらに限定されない種々の細胞型、組織または臓器に影響を及ぼし得る。新生物には、がん、例えば、肉腫、癌または形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）が含まれる。一実施形態では、新生物は、固形腫瘍である。新生物は、原発性腫瘍または原発性がんであり得る。さらに、新生物は、転移状態にあり得る。
その成長が本開示の主題の免疫応答性細胞を使用して阻害され得るがんは、典型的には免疫療法に対して応答性のがんを含む。処置のためのがんの非限定的な例には、中皮腫、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、膵臓がん、卵巣がん、乳がん（例えば、転移性乳がん、転移性三重陰性乳がん）、結腸がん、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）がん、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん、胆管癌、子宮頸がんおよび唾液腺がんが含まれる。さらに、本開示の主題は、その成長が本開示の主題の免疫応答性細胞を使用して阻害され得る抵抗性または再発性の悪性腫瘍を含む。
本開示の主題の方法を使用して処置され得る他の新生物またはがんの例には、骨がん、腸がん、肝臓がん、皮膚がん、頭部または頸部のがん、黒色腫（皮膚または眼球内悪性黒色腫）、腎がん（例えば、明細胞癌）、咽頭がん、前立腺がん（例えば、ホルモン抵抗性前立腺腺癌）、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫および骨髄腫）、子宮がん、直腸がん、肛門領域のがん、膀胱がん、脳がん、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん、精巣がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸部の癌、膣の癌、外陰部の癌、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ球性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、石綿によって誘導されたものが含まれる環境的に誘導されたがんが含まれ、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに固形腫瘍、例えば、肉腫および癌（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、ヘパトーマ、胆管癌（ｎｉｌｅ ｄｕｃｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、唾液腺がん、子宮がん、精巣がん、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｒｏｇｌｉｏｍａ）、シュワン細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫および網膜芽腫）が含まれる。
対象は、進行した形態の疾患を有する場合があり、この場合には、処置の目的は、疾患進行の軽減もしくは逆転、および／または副作用の軽快を含み得る。対象は、既に処置された状態の病歴を有する場合があり、この場合には、治療目的は、典型的には、再発リスクの低下または遅延を含む。
治療に対して好適なヒト対象は、典型的には、臨床基準によって識別され得る２つの処置群を含む。「進行した疾患」または「高い腫瘍負荷」を有する対象は、臨床的に測定可能な腫瘍を有する対象である。臨床的に測定可能な腫瘍は、腫瘍量（ｔｕｍｏｒ ｍａｓｓ）に基づいて検出され得る腫瘍である（例えば、触診、ＣＡＴスキャン、ソノグラム、マンモグラムまたはＸ線によって；それら自体の正の生化学的マーカーまたは組織病理学的マーカーは、この集団を特定するのに不十分である）。医薬組成物は、これらの対象に投与され、これらの状態を軽減する目的で、抗腫瘍応答を誘発する。理想的には、腫瘍量の低減が結果として生じるが、いずれの臨床的改善も利益を構成する。臨床的改善には、進行のリスクもしくは速度の低下、または腫瘍の病理学的結果における低減が含まれる。
第２の群の好適な対象は、「アジュバント群」として当技術分野で公知である。これらは、新生物の病歴を有しているが、別の治療方式に対して応答性であった個体である。以前の治療には、外科的切除、放射線治療、および伝統的な化学療法が含まれ得るが、これらに限定されない。結果として、これらの個体は、臨床的に測定可能な腫瘍を有さない。しかし、これらは、元の腫瘍部位付近で、または転移によるかのいずれかで、疾患の進行に関するリスクがあると疑われる。この群は、高リスクの個体と低リスクの個体へとさらに細分することができる。細分は、初期の処置の前後に観察された特色（ｆｅａｔｕｒｅ）に基づいてなされる。これらの特色は、臨床の技術分野で公知あり、それぞれ異なる新生物に対して好適に定義される。高リスクサブグループの典型的な特色は、腫瘍が隣接する組織を侵襲しているか、またはリンパ節の関与を示すものである。
別の群は、新生物に対する遺伝的素因を有するが、新生物の臨床徴候を未だ明示していない。例えば、乳がんに関連する遺伝子変異に関する試験に陽性であるが、依然として妊娠可能年齢である女性は、予防手術を実施するのに好適となるまで、新生物の出現を防止するために予防的な処置において、本発明に記載の免疫応答性細胞の１つまたは複数を受けることを希望することができる。
腫瘍抗原に結合する抗原認識受容体および免疫応答性細胞の抗腫瘍効果を増強するｃ－Ｋｉｔ変異体の発現の結果として、養子移入されたＴまたはＮＫ細胞は、腫瘍部位で増大された選択的な細胞溶解活性を与えられる。さらに、腫瘍またはウイルス感染に対するそれらの局在化およびそれらの増殖に引き続いて、Ｔ細胞は、腫瘍またはウイルス感染部位を、生理学的抗腫瘍または抗ウイルス応答に関与する広範囲の免疫細胞（腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、およびマクロファージ）に対する高度に伝導性の環境に変える。
さらに、本開示の主題は、対象、例えば、免疫不全状態の対象における病原体感染（例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生生物感染、または原生生物感染）を処置および／または防止するための方法を提供する。本方法は、本開示の細胞またはそれを含む組成物の有効量を、病原体感染を有する対象に投与するステップを含み得る。処置に感受性の例示的なウイルス感染としては、以下に限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびインフルエンザウイルス感染が挙げられる。
さらなる改変は、本開示の免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入され、免疫学的合併症（「悪性Ｔ細胞形質転換」として公知）、例えば、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスク、または健康な組織が腫瘍細胞と同じ標的抗原を発現する場合、ＧｖＨＤと同様の転帰をもたらすことのリスクを回避するかまたは最小限にすることができる。この問題に対する潜在的な解決は、本開示の免疫応答性細胞へ自殺遺伝子を操作することである。好適な自殺遺伝子としては、以下に限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｓｖ－ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９自殺遺伝子（ｉＣａｓｐ－９）、および短縮型ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）ポリペプチドが挙げられる。ある特定の実施形態では、自殺遺伝子は、ＥＧＦＲｔポリペプチドである。ＥＧＦＲｔポリペプチドは、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（例えば、セツキシマブ）を投与することによってＴ細胞排除を可能にし得る。ＥＧＦＲｔは、本開示のＣＡＲの抗原認識受容体の上流に共有結合により接合されてもよい。自殺遺伝子は、本開示のＣＡＲをコードする核酸を含むベクター内に含まれてもよい。この方法では、悪性Ｔ細胞形質転換（例えば、ＧＶＨＤ）の間に自殺遺伝子を活性化するように設計したプロドラッグ（例えば、プロドラッグ（例えば、ｉＣａｓｐ－９を活性化し得るＡＰ１９０３））の投与は、自殺遺伝子活性化ＣＡＲ発現Ｔ細胞中でアポトーシスを誘発する。自殺遺伝子の本開示のＣＡＲへの組み込みにより、非常に短い期間内にＣＡＲ Ｔ細胞の大多数を排除する能力と共にさらなるレベルの安全性が与えられる。自殺遺伝子を組み込まれた本開示の免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＡＲ Ｔ細胞注入後の所与の時点で先制して排除されるか、または毒性の最も早い徴候の時点で根絶され得る。
さらに、本開示の主題は、対象において炎症性疾患を防止および／または処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、本開示の細胞またはそれを含む組成物を対象に投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、細胞は、免疫阻害細胞である。ある特定の実施形態では、免疫阻害細胞は、制御性Ｔ細胞である。一実施形態では、炎症性疾患は、膵炎である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、臓器移植のレシピエント、例えば、膵臓移植のレシピエントである。
さらに、本開示の主題は、臓器移植のレシピエントである対象において移植片拒絶を防止する方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、本開示の細胞またはそれを含む組成物を対象に投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、細胞は、免疫阻害細胞である。ある特定の実施形態では、免疫阻害細胞は、制御性Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。さらなる実施形態では、対象は、膵臓移植のレシピエントである。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、対象にｃ－Ｋｉｔの阻害剤を投与するステップ（例えば、項目５．８に開示されるもの）をさらに含む。ｃ－Ｋｉｔ阻害剤は、ｃ－Ｋｉｔの活性（例えば、キナーゼ活性）を阻害することができる。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔは、ｃ－Ｋｉｔ変異体、例えば、ｃ－Ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖを特異的に阻害する。ある特定の実施形態では、ｃ－Ｋｉｔ阻害剤は、マルチチロシンキナーゼ阻害剤である。ｃ－Ｋｉｔ阻害剤の非限定的な例には、ダサチニブ、ミドスタウリン、ポナチニブ、イマチニブが含まれる。
５．１１．キット
本開示の主題は、対象における免疫応答を誘導および／または増強、および／または新生物、または病原体感染、または免疫障害を処置および／または防止するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、本開示の細胞またはそれを含む組成物を含む。ある特定の実施形態では、キットは、滅菌容器を含み；このような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当技術分野で公知の他の好適な容器形態であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属ホイル、または医薬を保持するために好適な他の材料から作製することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キットは、目的の抗原に対する抗原認識受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をコードする単離された核酸分子および発現可能な形態でｃ－Ｋｉｔ変異体をコードする単離された核酸分子（これらは、必要に応じて、同じかまたは異なるベクターに含まれてもよい）を含む。
所望の場合、細胞および／または核酸分子は、新生物または病原体免疫障害を有するかもしくは発症するリスクのある対象に、細胞または核酸分子を投与するための指示と一緒に提供される。指示は、一般に、新生物または病原体感染の処置または防止のための組成物の使用についての情報を含む。ある特定の実施形態では、指示は、以下のうちの少なくとも１つを含む：治療剤の説明；新生物、病原体感染、もしくは免疫障害またはその症状の処置または防止のための投薬スケジュールおよび投与；使用上の注意；警告；適応症；禁忌；過量情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；ならびに／あるいは参考文献。指示は、容器（存在する場合）に直接印刷されてもよく、あるいは容器に貼付されるラベルとして、または容器の中に、もしくは容器と一緒に供給される別個のシート、パンフレット、カード、もしくはフォルダーとして印刷されてもよい。
６．実施例
本開示の実践には、別段に指定されていない限り、十分に当業者の範囲内にある分子生物学（組み換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法が用いられる。このような技法は、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ， １９８９）；”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” （Ｇａｉｔ， １９８４）；”Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” （Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， １９８７）；”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” ”Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” （Ｗｅｉｒ， １９９６）；”Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ” （Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ， １９８７）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” （Ａｕｓｕｂｅｌ， １９８７）；”ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”， （Ｍｕｌｌｉｓ， １９９４）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” （Ｃｏｌｉｇａｎ， １９９１）などの文献において十分に説明されている。これらの技法は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本開示の主題を作製および実践する際に考慮され得る。特定の実施形態に関する特に有用な技法は、以降の項目において議論される。
以下の実施例は、本開示の細胞および組成物を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために示されるものであり、本発明者らが自らの発明と考えるものの範囲の限定を意図するものではない。
（実施例１）
構築物の生成
本開示の主題の２つの構築物を生成した。１つの構築物は、「Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ」（「Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｍ」とも称される）として示される。Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖの構造は、図１Ａに示される。図１Ａに示されるように、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖは、ｃ－Ｋｉｔ変異体（例えば、ｃ－Ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖ）と、抗ＭＳＫＮ ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ポリペプチドを含む膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはその部分）、ＣＤ３ζおよびＣＤ２８ポリペプチドを含む細胞内ドメイン（例えば、ＣＤ２８の細胞内ドメイン）を含む第２世代のＣＡＲとを含む。別の構築物は、「Ｍｚ－ＫＩＴｖ」として示される。Ｍｚ－ＫＩＴｖの構造は、図１Ｂに示される。図１Ｂに示されるように、Ｍｚ－ＫＩＴｖは、ｃ－Ｋｉｔ変異体（例えば、ｃ－Ｋｉｔ Ｄ８１６Ｖ）と、抗ＭＳＫＮ ｓｃＦｖ、ＣＤ２８ポリペプチドを含む膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはその部分）、ＣＤ３ζを含む細胞内ドメインを含む第１世代のＣＡＲとを含む。
（実施例２）
構築物の形質導入、ｐＫＩＴシグナル伝達の活性化、拡大および増殖
Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖおよびＭｚ－ＫＩＴｖの形質導入、ｐＫＩＴシグナル伝達の活性化、拡大および増殖を試験した。Ｍ２８ｚは、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖと同じＣＡＲ構築物を含むが、Ｋｉｔ変異体は含まない。形質導入結果は、図２に示される。図２に示されるように、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖおよびＭｚ－ＫＩＴｖは共に、良好な形質導入を有した。Ｍ２８ｚを含むＴ細胞についてのＭＦＩ値は、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖを含むＴ細胞（「Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞」と称される）またはＭｚ－ＫＩＴｖを含むＴ細胞（「Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞」と称される）よりも高かった。
ｐＫＩＴシグナル伝達を活性化する能力についての構築物の結果は、図３Ａおよび３Ｂに示される。図３Ａおよび３Ｂに示されるように、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は、活性化されたｐＫＩＴシグナル伝達を構成的に示した。図３Ａに示されるように、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＳＣＦなしにｐＫＩＴ活性を示したが、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＫＩＴタンパク質を発現しなかった。図３Ｂに示されるように、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｗｔ ＣＡＲ Ｔ細胞対照よりも高いｐ－ＳＴＡＴ３およびｐ－ＳＴＡＴ５活性を示した。
ＣＡＲ Ｔ細胞の拡大結果は、図４に示される。図４は、連続共培養の間のＣＡＲ Ｔ細胞の累積拡大を示す。Ｔ細胞を、Ａ５４９ＧＭ腫瘍細胞で再刺激した（Ｅ：Ｔ＝３：１）。図４に示されるように、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞は、類似する拡大レベルを示したが、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は、より少ない拡大を示した。Ａ５４９ＧＭは、ＧＦＰ－ルシフェラーゼおよびメソテリンの過剰発現を有する非小細胞肺がん細胞系であった。
増殖結果は、図５および６に示される。ＣＡＲ Ｔ細胞のＦａｒ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ染色を、最初の抗原刺激（Ｅ：Ｔ＝２：１）の７日後に測定する。標的細胞は、Ａ５４９ＧＭであった。図５および６に示されるように、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｍ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較してより高い増殖を示した。
したがって、ｃＫＩＴ共刺激構築物は、首尾よい形質導入、および抗原特異的活性化、および増殖を実証した。
（実施例３）
本開示の構築物のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞溶解活性
高ＭＳＬＮ発現細胞および低ＭＳＬＮ発現細胞に対するＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞溶解活性を評価した。結果は、図７Ａ～７Ｂ、８Ａ～８Ｂおよび９に示される。図７Ａ～７Ｂおよび８Ａ～８Ｂに示されるように、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも速く高ＭＳＬＮ腫瘍細胞を死滅させ、例えば、４時間の時点で、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも多くの腫瘍細胞を死滅させ、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｍｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも多くの腫瘍細胞を死滅させたが（図７Ａおよび８Ａを参照されたい）、１８時間の時点では、有意な差異は見られなかった（図７Ｂおよび８Ｂを参照されたい）。
しかし、低ＭＳＬＮ発現腫瘍細胞、すなわち、Ａ５４９Ｇ細胞について、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は、死滅能力の増加を示した。１８時間の時点で、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも多くの低ＭＳＬＮ Ａ５４９Ｇ腫瘍細胞を死滅させた。
（実施例４）
抗原刺激後の構築物のＰＤ１発現およびＴ細胞ステータス
抗原刺激後のＰＤ１発現を評価した。４日毎のＡ５４９ＧＭ細胞による刺激（Ｅ：Ｔ＝３：１）後、ＦＡＣＳを測定した。ＰＤ１発現についての結果は、図１０Ａおよび１０Ｂに示される。図１０Ａおよび１０Ｂに示されるように、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１０Ａを参照されたい）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図１０Ｂを参照されたい）の両方において、抗原刺激後により少ないＰＤ１＋発現を示した。Ｔ細胞ステータスについての結果は、図１１Ａに示される。図１１Ａに示されるように、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は、抗原刺激後により多くの幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ細胞）を示した。ＴＳＣＭ細胞は、腫瘍細胞を死滅させるより高い潜在力を有する。Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞およびＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＩＬ－２はより少ないものの、Ｍ２８ｚおよびＭｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも高いＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αを分泌した（図１１Ｂ）。したがって、ｃＫＩＴ共刺激構築物は、首尾よいエフェクター－サイトカイン分泌を実証した。
抗原刺激後のＣＡＲ Ｔ細胞のｐ－ＥＲＫシグナルもまた検査した。５分間のＭＧＭ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ＝１：２）後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＡＲ Ｔ細胞のｐ－ＥＲＫレベルを、ＦＡＣＳによって測定した。Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖおよびＭｚ－ＫＩＴｖのＣＤ４およびＣＤ８ ＣＡＲ Ｔ細胞は共に、Ｍ２８ｚよりも強いｐ－ＥＲＫ活性を有した（図２０）。
（実施例５）
本開示の構築物のｉｎ ｖｉｖｏ活性
低メソテリン発現肺がん細胞（Ａ５４９Ｇ）および高メソテリン発現肺がん細胞（Ａ５４９ＧＭ）を、ＮＳＧマウスにおいて肺腫瘍を樹立するのに使用した（図１４Ｃ）。樹立された低ＭＳＬＮ Ａ５４９Ｇ肺腫瘍を有するマウスを、１×１０５個のＭ２８ｚ、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖおよびＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一用量で処置した。ｉｎ ｖｉｖｏ ＢＬＩを使用して、ＮＳＧマウスにおける腫瘍負荷をモニターした。結果は、図１２Ａ～１２Ｄに示される。図１２Ａ～１２Ｄに示されるように、低抗原（メソテリン）発現を有するがん細胞から生じた腫瘍負荷を有するマウスを処置すると、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスは、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞またはＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞または形質導入されていないＴ細胞（ＵＴ）で処置したマウスと比較して、より良好な長く続く腫瘍退縮を示した。マウス生存データは、図１４Ａにおいてカプラン・マイヤー生存曲線として示される。図１４Ａに示されるように、低抗原（メソテリン）発現腫瘍を有するマウスを処置すると、最良の生存が、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一用量で処置したマウスにおいて達成され、例えば、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスは、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスと比較して延長された生存時間を示した。
樹立された高ＭＳＬＮ Ａ５４９ＧＭ肺腫瘍を有するマウスを、１×１０５個のＭ２８ｚ、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖおよびＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一用量で処置した。ｉｎ ｖｉｖｏ ＢＬＩを使用して、ＮＳＧマウスにおける腫瘍負荷をモニターした。結果は、図１３Ａ～１３Ｄに示される。図１３Ａ～１３Ｄに示されるように、高抗原（メソテリン）発現を有するがん細胞から生じた腫瘍負荷を有するマウスを処置すると、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスは、より良好な長く続く腫瘍根絶を示した。さらに、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスは、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスと同等な、長く続く腫瘍退縮を示した。メソテリンＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかで処置したマウスは、形質導入されていない（ＵＴ）Ｔ細胞で処置したマウスと比較して、印象的な腫瘍退縮を示した。マウス生存データは、図１４Ｂにおいてカプラン・マイヤー生存曲線として示される。図１４Ｂに示されるように、高抗原（メソテリン）発現腫瘍を有するマウスを処置すると、最良の生存が、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスと比較した場合、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖまたはＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかの単一用量で処置したマウスにおいて達成された。３つすべての群のマウスにおいて、形質導入されていない（ＵＴ）Ｔ細胞で処置したマウスと比較して、生存時間中央値には達しなかった。
（実施例６）
構築物のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性
Ａ５４９ＧＭ細胞による刺激（Ｅ：Ｔ＝３：１）の７日後、ＣＡＲ Ｔを、５００ｎＭもしくは５μＭのダサチニブ（Ｄａｓａ）、５００ｎＭもしくは５μＭのポナチニブ（Ｐｏｎａ）、または１００ｎＭもしくは１μＭのＰＫＣ４１２で７２時間処置し、次いで、生存細胞をＦＡＣＳによって測定した。図１５に示されるように、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔは、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、チロシンキナーゼ阻害剤に対して感受性であった。
（実施例７）
本開示の構築物のｉｎ ｖｉｖｏ活性
肺腫瘍を、高い発現レベルのメソテリン（ＭＳＬＮ）を有するＡ５４９ＧＭ腫瘍細胞または低い発現レベルのメソテリン（ＭＳＬＮ）を有するＡ５４９Ｇ腫瘍細胞を使用して、ＮＳＧマウスにおいて樹立した。次いで、マウスを、１×１０５個のＭ２８ｚ、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖまたはＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一用量で処置した。Ｍｚ－ＫＩＴｖおよびＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は共に、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも、高メソテリン発現肺がん細胞に対する高い抗腫瘍有効性を有した（図１６Ａ～１６Ｃ）。低ＭＳＬＮ Ａ５４９Ｇ肺がんでは、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して増強された抗腫瘍活性を有したが、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｍ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも低い抗腫瘍活性を有した（図１７Ａ～１７Ｃ）。
ＭＳＴＯ細胞に、低いおよび高いＭＳＬＮタンパク質を過剰発現させて、それぞれ、ＭＧ－ＬＭ細胞およびＭＧＭ細胞を生成した（図１９Ａ）。胸膜中皮腫腫瘍モデルでは、中皮腫を、高ＭＳＬＮ発現中皮腫（ＭＧＭ）腫瘍細胞または低ＭＳＬＮ発現中皮腫（ＭＧ－ＬＭ）腫瘍細胞の胸膜注射を介して、ＮＳＧマウスにおいて樹立した。次いで、これらのマウスに、５×１０４個のＰ２８ｚ、Ｍｚ、Ｍ２８ｚ、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖまたはＭｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞の単一用量を胸腔内投与した。高ＭＳＬＮ発現中皮腫では、Ｍｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｍｚ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも増加した抗腫瘍活性を有したが、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞とＭ２８ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞との間では、有意な差異は検出されなかった（図１８Ａおよび１８Ｂ）。ＣＡＲ Ｔ細胞用量を、クリニックで見られた低いＥ：Ｔ比を模倣するように、意図的に低減した。低減されたｃＫＩＴ ＣＡＲ Ｔ細胞用量は、ＣＤ２８ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、同等な抗腫瘍有効性を生じた。これは、非常に低いＥ：Ｔ比におけるＰＤＬ１／ＰＤ１経路関連の消耗に起因し得る。Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞は、低ＭＳＬＮ発現中皮腫に対する増強された抗腫瘍活性もまた有した（図１９Ｂ）。
マウスから得たＣＡＲ Ｔ細胞を、高メソテリン発現中皮腫細胞に曝露させ、ＰＤ１発現について分析した。ＰＤ１上方調節は、高いＥ：Ｔ比では低かったが、低いＥ：Ｔ比では類似していた（図２１Ａおよび２１Ｂ）。
（実施例８）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｎａｎｏ ｓｔｒｉｎｇ分析
ＭＳＬＮ＋腫瘍細胞と共に２４時間共培養した後、ＣＤ８＋Ｍ２８ｚおよびＭ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＡＲ Ｔパネル遺伝子のｎａｎｏ ｓｔｒｉｎｇ分析のために収集した。７８０個の検出された遺伝子のうち８７個は、有意な変化倍数を有した（図２２Ａ）。Ｐａｔｈｗａｙスコアのヒートマップは、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞における表現型的および機能的Ｔ細胞特色に関する富化された遺伝子セットを示した（図２２Ｂ）。Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞中の上方調節された遺伝子経路が、図２２Ｃに列挙される。Ｉ型インターフェロンシグナル伝達遺伝子（図２３Ａ）およびＩＩ型インターフェロンシグナル伝達遺伝子（図２３Ｂ）の発現は、Ｍ２８ｚ－ＫＩＴｖ ＣＡＲ Ｔ細胞において有意に増加した。
本開示の主題の実施形態
前記記載から、様々な使用および条件に本開示の主題を採用するために、本開示の主題に対して変更および修正がなされ得ることが明らかである。このような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本明細書において、変数についてのいずれかの定義における要素の列挙についての記載は、任意の単一の要素または列挙された要素の組合せ（または下位の組合せ）としてのその変数の定義を含む。本明細書において、実施形態についての記載は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその部分と組み合わせた、その実施形態を含む。
この明細書において言及されるすべての特許および刊行物は、それぞれ独立した特許および刊行物が、具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (71)

  1. （ａ）抗原に結合する抗原認識受容体、および
    （ｂ）活性化変異を含むｃ－Ｋｉｔの変異体
    を含む細胞。
  2. 前記ｃ－Ｋｉｔがヒトｃ－Ｋｉｔである、請求項１に記載の細胞。
  3. 前記活性化変異が、ヒトｃ－Ｋｉｔの細胞内領域内にある、請求項２に記載の細胞。
  4. 前記細胞内領域が、ヒトｃ－Ｋｉｔのアミノ酸５４４～９７７を含む、請求項３に記載の細胞。
  5. 前記活性化変異が、ヒトｃ－Ｋｉｔのアミノ酸８１６～８２６内にある、請求項２から４のいずれか一項に記載の細胞。
  6. 前記活性化変異が、アミノ酸８１６位またはアミノ酸８２２位にある、請求項２から５のいずれか一項に記載の細胞。
  7. 前記活性化変異が、ヒトｃ－Ｋｉｔのアミノ酸５５０～５７０内にある、請求項２から４のいずれか一項に記載の細胞。
  8. 前記活性化変異が、ヒトｃ－Ｋｉｔのアミノ酸５６０位にある、請求項２から４および７のいずれか一項に記載の細胞。
  9. 前記活性化変異が、Ｄ８１６Ｖ、Ｄ８１６Ｙ、Ｄ８１６Ｈ、Ｄ８１６Ｆ、Ｎ８２２Ｋ、Ｖ５６０Ｇ、またはそれらの組合せから選択される、請求項２から４に記載の細胞。
  10. 前記活性化変異が、Ｄ８１６Ｖを含むかまたはそれからなる、請求項２から４および９のいずれか一項に記載の細胞。
  11. 前記ヒトｃ－Ｋｉｔが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項２から１０のいずれか一項に記載の細胞。
  12. 前記変異体が、配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその部分を含むかまたはそれからなる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞。
  13. 前記変異体が、配列番号２のアミノ酸５４３～９７６からなる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の細胞。
  14. 前記ｃ－Ｋｉｔ変異体が、誘導性プロモーターに作動可能に連結している、請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞。
  15. 前記誘導性プロモーターが、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）、転写応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーターおよびＩＬ－２プロモーターから選択される、請求項１４に記載の細胞。
  16. 前記ｃ－Ｋｉｔ変異体が、前記細胞の細胞持続性を増強する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の細胞。
  17. 前記ｃ－Ｋｉｔ変異体が、前記細胞のアポトーシスまたはアネルギーを低減する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の細胞。
  18. 前記抗原認識受容体が、外因性または内因性である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の細胞。
  19. 前記抗原認識受容体が、組換え発現される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の細胞。
  20. 前記抗原認識受容体が、ベクターから発現される、請求項１から１９のいずれか一項に記載の細胞。
  21. 前記ｃ－Ｋｉｔ変異体が、ベクターから発現される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の細胞。
  22. 免疫応答性細胞である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の細胞。
  23. リンパ系列の細胞または骨髄系列の細胞である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の細胞。
  24. リンパ系列の前記細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞から選択される、請求項２３に記載の細胞。
  25. Ｔ細胞である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の細胞。
  26. 前記Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、γδＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、制御性Ｔ細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項２４または２５に記載の細胞。
  27. 前記抗原が、腫瘍抗原または病原体抗原である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の細胞。
  28. 前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の細胞。
  29. 前記腫瘍抗原が、メソテリン、ＣＤ１９、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥｐＣＡＭ、Ｅｒｂ－Ｂ２、ｅｒｂ－Ｂ３、Ｅｒｂ－Ｂ４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体－ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ－２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、Ｋ－軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＥＲＢＢ２、ＭＡＧＥＡ３、ＣＴ８３（ＫＫ－ＬＣ－１としても公知）、ｐ５３、ＭＡＲＴ１、ＧＰ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、腫瘍胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ－７２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＷＴ－１、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４Ｖ６、ＮＫＣＳ１、ＥＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＣＤ９９、ＣＤ７０、ＡＤＧＲＥ２、ＣＣＲ１、ＬＩＬＲＢ２、ＰＲＡＭＥ、ＨＰＶ Ｅ６腫瘍性タンパク質、ＨＰＶ Ｅ７腫瘍性タンパク質およびＥＲＢＢからなる群から選択される、請求項２８に記載の細胞。
  30. 前記抗原がメソテリンである、請求項２９に記載の細胞。
  31. 前記抗原認識受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＴＣＲ様融合分子から選択される、請求項１から３０のいずれか一項に記載の細胞。
  32. 前記抗原認識受容体がＣＡＲである、請求項１から３１のいずれか一項に記載の細胞。
  33. 前記ＣＡＲが、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達領域を含む、請求項３２に記載の細胞。
  34. 前記ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインが、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、請求項３３に記載の細胞。
  35. 前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８ポリペプチドを含む、請求項３４に記載の細胞。
  36. 前記ＣＡＲが、共刺激シグナル伝達領域を含まない、請求項３３に記載の細胞。
  37. 抗原特異的免疫応答性細胞を生成するための方法であって、（ａ）抗原に結合する抗原認識受容体をコードする第１の核酸配列；および（ｂ）活性化変異を含むｃ－Ｋｉｔ変異体をコードする第２の核酸配列を、細胞内に導入するステップを含む、方法。
  38. 前記第１の核酸配列が、第１のプロモーターに作動可能に連結している、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記第２の核酸配列が、第２のプロモーターに作動可能に連結している、請求項３７または３８に記載の方法。
  40. 前記第１および前記第２の核酸配列の一方または両方が、ベクター中に含まれる、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項３４１に記載の方法。
  42. ａ）活性化変異を含むヒトｃ－Ｋｉｔの変異体；およびｂ）抗原に結合する抗原認識受容体を含む組成物。
  43. 前記ｃ－Ｋｉｔ変異体が、第１のプロモーターに作動可能に連結している、請求項４２に記載の組成物。
  44. 前記抗原認識受容体が、第２のプロモーターに作動可能に連結している、請求項４２または４３に記載の組成物。
  45. 前記第１および第２のプロモーターの一方または両方が、誘導性プロモーターである、請求項４３または４４に記載の組成物。
  46. 前記誘導性プロモーターが、ＮＦＡＴ転写応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーターおよびＩＬ－２プロモーターから選択される、請求項４５に記載の組成物。
  47. （ａ）抗原認識受容体をコードする第１のポリヌクレオチドおよび（ｂ）活性化変異を含むヒトｃ－Ｋｉｔの変異体をコードする第２のポリヌクレオチドを含む核酸組成物。
  48. 前記ｃ－Ｋｉｔ変異体に作動可能に連結している第１のプロモーターをさらに含む、請求項４７に記載の核酸組成物。
  49. 前記抗原認識受容体に作動可能に連結している第２のプロモーターをさらに含む、請求項４７または４８に記載の核酸組成物。
  50. 前記第１および第２のプロモーターの一方または両方が、誘導性プロモーターである、請求項４８または４９に記載の核酸組成物。
  51. 前記誘導性プロモーターが、ＮＦＡＴ転写応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＣＤ６９プロモーター、ＣＤ２５プロモーターおよびＩＬ－２プロモーターから選択される、請求項５０に記載の核酸組成物。
  52. 前記第１および第２のポリヌクレオチドの一方または両方が、ベクター中に含まれる、請求項４７から５１のいずれか一項に記載の核酸組成物。
  53. 前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項５２に記載の核酸組成物。
  54. 請求項４７から５３のいずれか一項に記載の核酸組成物を含むベクター。
  55. 請求項４２から４６のいずれか一項に記載の組成物または請求項４７から５３のいずれか一項に記載の核酸組成物または請求項５４に記載のベクターを含む細胞。
  56. 請求項１から３６および５５のいずれか一項に記載の細胞ならびに薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  57. ｃ－Ｋｉｔの阻害剤をさらに含む、請求項５６に記載の医薬組成物。
  58. ｃ－Ｋｉｔの前記阻害剤が、ダサチニブ（ＢＭＳ－３５４８２５）、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２）、ポナチニブ、イマチニブ、およびそれらの組合せから選択される、請求項５７に記載の医薬組成物。
  59. 新生物、病原体感染または感染疾患を処置および／または防止するための、請求項５６から５８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  60. 対象における腫瘍負荷を低減する方法であって、前記対象に、請求項１から３６および５５のいずれか一項に記載の細胞または請求項５６から５９のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  61. 前記対象において、腫瘍細胞の数を低減する、腫瘍サイズを低下させる、および／または前記腫瘍を根絶する、請求項６０に記載の方法。
  62. 新生物を処置および／または防止する方法であって、前記対象に、請求項１から３６および５５のいずれか一項に記載の細胞または請求項５６から５９のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  63. 新生物を有する対象の生存時間を延長する方法であって、前記対象に、請求項１から３６および５５のいずれか一項に記載の細胞または請求項５６から５９のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
  64. 前記腫瘍または新生物が、固形腫瘍である、請求項６０から６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記固形腫瘍が、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）がん、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん、胆管癌、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記固形腫瘍が中皮腫である、請求項６４または６５に記載の方法。
  67. 前記固形腫瘍が肺がんである、請求項６４または６５に記載の方法。
  68. ｃ－Ｋｉｔの阻害剤を投与するステップをさらに含む、請求項５０から６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. ｃ－Ｋｉｔの前記阻害剤が、ダサチニブ（ＢＭＳ－３５４８２５）、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２）、ポナチニブ、イマチニブ、およびそれらの組合せから選択される、請求項６８に記載の方法。
  70. 請求項１から３６および５５のいずれか一項に記載の細胞、請求項４２から４６のいずれか一項に記載の組成物、請求項４７から５３のいずれか一項に記載の核酸組成物または請求項５４に記載のベクターを含むキット。
  71. 新生物、病原体感染または感染性疾患を処置および／または防止するための書面の指示をさらに含む、請求項７０に記載のキット。
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