JP2023118962A

JP2023118962A - 非ｈｌａ制限ｔ細胞受容体およびその使用

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Publication number: JP2023118962A
Application number: JP2023112162A
Authority: JP
Inventors: サデレインマイケル; Sadelain Michel; エー．マンシラ－ソトジョージ; A Mansilla-Soto Jorge; エイクムジャスティン; Eyquem Justin; ドブリンアントン; Dobrin Anton
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 2018-02-11
Filing date: 2023-07-07
Publication date: 2023-08-25
Also published as: CA3090791A1; US11229669B2; IL276554A; CN111886243A; BR112020016138A2; AU2019216982A1; US12036244B2; US20210030804A1; EP3749687A1; EP3749687A4; MX2020008390A; WO2019157454A1; RU2020129818A; US20220031754A1; JP2021513347A; US20200368283A1; KR20200120673A; SG11202007622SA; AU2019216982B2

Abstract

【課題】非ＨＬＡ制限Ｔ細胞受容体およびその使用の提供。【解決手段】本開示の主題は、がんおよび病原体に対する免疫応答を増強するための方法および組成物を提供する。本開示の主題は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の新規設計、およびそれを含む操作された免疫応答性細胞に関する。新規ＴＣＲは、ＨＬＡ非依存的に抗原に結合する。ある特定の実施形態では、新規ＴＣＲは、低い発現レベルを有する標的遺伝子に対する増強された感受性をもたらす。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／６２９，０７２号の優先権を主張し、その内容はその全体が参照により組み込まれ、それに対して優先権を主張する。

序論
本開示の主題は、がんおよび病原体に対する免疫応答を増強するための方法および組成物を提供する。それは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびそれを含む操作された免疫応答性細胞の新規設計に関する。新規ＴＣＲを含む操作された免疫応答性細胞は、抗原指向性である。

抗原認識受容体（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））を使用した養子免疫療法は、白血病の処置において注目すべき臨床結果を示しており、がんを処置するための最も有望な新たな戦略の１つである。ＣＡＲ療法を生成するために、現在の臨床プロトコールは、自己Ｔ細胞、ならびにガンマ－レトロウイルス、レンチウイルスおよびトランスポゾンを含むランダム組込みベクターを用い、これらは全て、導入遺伝子多様化（variegation）
のため、ＣＡＲの半ランダム組込みおよび可変的発現をもたらす。要するに、自己細胞調達およびランダムベクター組込みの協同は、可変的な効力を有する細胞産物を生成する傾向がある。したがって、低レベルの標的抗原を検出するための一貫した効力および増加した能力を有する抗原認識受容体の新規設計の必要がある。

本開示の主題は、一般に、ＨＬＡ非依存的に目的の抗原に結合する、ＨＬＡ非依存的（または非ＨＬＡ制限）Ｔ細胞受容体（「ＨＩ－ＴＣＲ」と称される）、およびそれを含む免疫応答性細胞を提供する。本開示の主題は、また、標的抗原に対する免疫応答を誘導および／もしくは増強する、ならびに／または新生物もしくは他の疾患／障害を処置および／もしくは防止するために、そのような細胞を使用する方法であって、抗原特異的免疫応答の増加が望ましい、方法を提供する。

本開示の主題は、細胞外抗原結合ドメインおよび定常ドメインを含む抗原結合鎖を含む、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、ＨＬＡ非依存的に抗原に結合する、組換えＴＣＲを提供する。

ある特定の実施形態では、定常ドメインは、天然もしくは改変ＴＲＡＣペプチドおよび／または天然もしくは改変ＴＲＢＣペプチドを含む。ある特定の実施形態では、定常ドメインは、別の定常ドメインとホモ二量体またはヘテロ二量体を形成することができる。

ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲは、免疫応答性細胞の内因性ＴＲＡＣ遺伝子座および／またはＴＲＢＣ遺伝子座に配置された発現カセットから発現される。ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲ発現カセットの配置は、免疫応答性細胞における天然ＴＣＲα鎖および／または天然ＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲの内因性発現を破壊または無効化する。ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲ発現カセットの配置は、免疫応答性細胞における組換えＴＣＲと、天然ＴＣＲα鎖および／または天然ＴＣＲβ鎖との間の誤対合を防止または排除する。ある特定の実施形態では、抗原結合鎖は、ＣＤ３ζポリペプチドと会合することができる。抗原結合鎖は、抗原に結合すると、抗原結合鎖に会合したＣＤ３ζポリペプチドを活性化することができる。ＣＤ３ζポリペプチドの活性化は、免疫応答性細胞を活性化することができる。ＣＤ３ζポリペプチドは、内因性または外因性であってもよい。ある特定の実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、内因性であり、天然ＣＤ３複合体に一体化（integrate）される。ある特定の実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、
外因性であり、ＣＤ２８ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＤＡＰ－１０ポリペプチド、およびその任意の組合せからなる群より選択される共刺激分子と必要に応じて一体化されている。ある特定の実施形態では、抗原結合鎖は、共刺激領域をさらに含み、組換えＴＣＲは、抗原に結合すると、免疫応答性細胞を刺激することができる。共刺激領域は、ＣＤ２８ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＤＡＰ－１０ポリペプチド、およびその任意の組合せからなる群より選択される共刺激分子を含むことができる。ある特定の実施形態では、共刺激領域は、ＣＤ２８ポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲは、ＣＤ３複合体と会合することができる。ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲは、ＣＤ３複合体と一体化し、ＨＬＡ非依存的抗原認識をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、ＣＤ３複合体は、内因性である。ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲは、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体における内因性ＴＣＲに置き換わる。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、別の細胞外抗原結合ドメインと二量体化することができる。細胞外抗原結合ドメインは、細胞表面受容体のリガンド、細胞表面リガンドの受容体、抗体の抗原結合部分もしくはその断片、またはＴＣＲの抗原結合部分を含むことができる。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）、またはラクダ科Ｖ_Ｈのみ抗体由来のＶＨＨおよび／もしくは抗体の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、別の細胞外抗原結合ドメインと二量体化することができる。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、抗体のＶ_Ｈを含み、ヒト、マウスまたはラクダ科Ｖ_Ｈは、抗体のＶ_Ｌを含む別の細胞外抗原結合ドメインと二量体化し、可変断片（fragmentvariable）（Ｆｖ）を形成することができる。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメイ
ンは、抗体のＶ_Ｌを含み、Ｖ_Ｌは、抗体のＶ_Ｈを含む別の細胞外抗原結合ドメインと二量体化し、可変断片（Ｆｖ）を形成することができる。

ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲは、腫瘍抗原に結合する。腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＡｌＸ、ＣＥＡ、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体－ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ－２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、Ｋ－軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ－Ａ１、メソテリン、ＥＲＢＢ２、ＭＡＧＥＡ３、ｐ５３、ＭＡＲＴ１、ＧＰ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳ０－１、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ－７２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＷＴ－１、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４Ｖ６、ＮＫＣＳ１、ＥＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩおよびＣＤ９９、ＣＤ７０、ＡＤＧＲＥ２、ＣＣＲ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ４、ＰＲＡＭＥおよびＥＲＢＢからなる群より選択することができる。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９である。

ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲは、同じ抗原を標的とするＣＡＲよりも高い抗原感受性を示す。ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲは、腫瘍細胞の表面に低密度で存在する抗原に結合すると、免疫応答を誘導することができる。ある特定の実施形態では、細胞表面に低密度で存在する抗原は、細胞１個当たり約２，０００分子を下回る。

本開示の主題は、さらに、本明細書に記載の組換えＴＣＲを含む免疫応答性細胞を提供する。ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲの少なくとも１種の抗原結合鎖の発現カセットは、免疫応答性細胞の内因性遺伝子座に配置されている。ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲの２種の抗原結合鎖の発現カセットは、免疫応答性細胞の内因性遺伝子座に配置され、２種の抗原結合鎖は、二量体化することができる。組換えＴＣＲの発現カセットの配置は、免疫応答性細胞における天然ＴＣＲα鎖および／または天然ＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲの内因性発現を破壊または無効化し、それによって、免疫応答性細胞における組換えＴＣＲと、天然ＴＣＲα鎖および／または天然ＴＣＲβ鎖との間の誤対合を防止または排除することができる。内因性遺伝子座は、ＣＤ３δ遺伝子座、ＣＤ３ε遺伝子座、ＣＤ２４７遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、ＴＲＢＣ遺伝子座またはＴＲＧＣ遺伝子座またはＴＲＤＣ遺伝子座であってもよい。ある特定の実施形態では、内因性遺伝子座は、ＴＲＡＣ遺伝子座および／またはＴＲＢＣ遺伝子座である。内因性遺伝子座は、改変された転写ターミネーター領域を含むことができる。ある特定の実施形態では、改変された転写ターミネーター領域は、ＴＫ転写ターミネーター、ＧＣＳＦ転写ターミネーター、ＴＣＲＡ転写ターミネーター、ＨＢＢ転写ターミネーター、ウシ成長ホルモン転写ターミネーター、ＳＶ４０転写ターミネーターおよびＰ２Ａエレメントからなる群より選択されるゲノムエレメントを含み；Ｐ２Ａエレメントは、標的化される遺伝子の内因性転写ターミネーターの使用を可能にする。ある特定の実施形態では、細胞における１個の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座が、組換えＴＣＲの少なくとも１種の抗原結合鎖を発現するように改変されている場合、細胞における１個または複数の他の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座は、内因性ＴＣＲ鎖の発現を排除するように改変されている。ある特定の実施形態では、１個または複数の他の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座は、目的の遺伝子を発現するようにさらに改変されている。目的の遺伝子は、抗腫瘍サイトカイン、共刺激分子リガンド、追跡用遺伝子または自殺遺伝子であり得る。ある特定の実施形態では、１個または複数の内因性ＴＣＲ遺伝子座は、共刺激シグナル伝達ドメインをコードする配列を取り込んで、カルボキシ末端にそのようなシグナル伝達ドメインを含有するＴＣＲ鎖を生成するようにさらに改変されている。

ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ヒト胚性幹細胞、およびリンパ系細胞を分化させることができる多能性幹細胞からなる群より選択される。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、自己のものである。

ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、少なくとも１種の外因性共刺激リガンドをさらに含む。ある特定の実施形態では、共刺激リガンドは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４１ＢＢＬ、ＣＤ２７５、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌおよびその任意の組合せからなる群より選択される。ある特定の実施形態では、細胞は、１種の外因性共刺激リガンドをさらに含む、またはそれからなる。ある特定の実施形態では、１種の外因性共刺激リガンドは、ＣＤ８０または４－１ＢＢＬである。ある特定の実施形態では、細胞は、２種の外因性共刺激リガンドをさらに含む、またはそれからなる。ある特定の実施形態では、２種の外因性共刺激リガンドは、ＣＤ８０および４－１ＢＢＬである。

ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、少なくとも１種のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）をさらに含む。ある特定の実施形態では、ＣＣＲは、ＣＤ２８ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＤＡＰ－１０ポリペプチド、およびその任意の組合せからなる群より選択される共刺激分子を含む。

本開示の主題は、また、本明細書に開示される免疫応答性細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、新生物の処置に使用することができる。

被験体における腫瘍負荷を低減させる方法がさらに提供される。加えて、本開示の主題は、新生物（例えば、がん）を有する被験体の生存を延ばす方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、被験体に、有効量の本明細書に記載の免疫応答性細胞または本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。

本開示の主題は、また、新生物を処置または防止する方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、被験体に、有効量の本明細書に記載の免疫応答性細胞または本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。新生物は、血液がん、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、および腺癌からなる群より選択することができる。ある特定の実施形態では、新生物は、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病、または非ホジキンリンパ腫であり、組換えＴＣＲは、ＣＤ１９に結合する。ある特定の実施形態では、新生物は、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病、腺癌、または非ホジキンリンパ腫であり、組換えＴＣＲは、ＣＤ１９、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＡｌＸ、ＣＥＡ、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体－ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ－２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、Ｋ－軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ－Ａ１、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＥＲＢＢ２、ＭＡＧＥＡ３、ｐ５３、ＭＡＲＴ１、ＧＰ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳ０－１、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ－７２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＷＴ－１、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４Ｖ６、ＮＫＣＳ１、ＥＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＣＤ９９、ＣＤ７０、ＡＤＧＲＥ２、ＣＣＲ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ４、ＰＲＡＭＥ、およびＥＲＢＢに結合する。ある特定の実施形態では、新生物は、ＣＤ１９＋ＡＬＬである。

本開示の主題は、抗原特異的免疫応答性細胞を産生するための方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、方法は、免疫応答性細胞に、本明細書に記載の組換えＴＣＲをコードする核酸配列を導入することを含む。核酸配列は、ベクター中に含まれ得る。ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲの少なくとも１種の抗原結合鎖の発現カセットは、免疫応答性細胞の内因性遺伝子座に配置されている。ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲの２種の抗原結合鎖の発現カセットは、免疫応答性細胞の内因性遺伝子座に配置され、２種の抗原結合鎖は、二量体化することができる。内因性遺伝子座は、ＣＤ３δ遺伝子座、ＣＤ３ε遺伝子座、ＣＤ２４７遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、ＴＲＢＣ遺伝子座、ＴＲＤＣ遺伝子座および／またはＴＲＧＣ遺伝子座であってもよい。ある特定の実施形態では、内因性遺伝子座は、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座である。ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲの発現カセットの配置は、免疫応答性細胞における天然ＴＣＲα鎖および／または天然ＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲの内因性発現を破壊または無効化し、それによって、免疫応答性細胞における組換えＴＣＲと、天然ＴＣＲα鎖および／または天然ＴＣＲ β鎖との間の誤対合を防止または排除する。ある特定の実施形態では、内因性遺伝子座は、改変された転写ターミネーター領域を含む。ある特定の実施形態では、改変された転写ターミネーター領域は、ＴＫ転写ターミネーター、ＧＣＳＦ転写ターミネーター、ＴＣＲＡ転写ターミネーター、ＨＢＢ転写ターミネーター、ウシ成長ホルモン転写ターミネーター、ＳＶ４０転写ターミネーターおよびＰ２Ａエレメントからなる群より選択されるゲノムエレメントを含む。ある特定の実施形態では、細胞における１個の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座が、組換えＴＣＲの少なくとも１種の抗原結合鎖を発現するように改変されている場合、細胞における１個または複数の他の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座は、内因性ＴＣＲ鎖の発現を排除するように改変されている。ある特定の実施形態では、１個または複数の他の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座は、目的の遺伝子を発現するようにさらに改変されている。ある特定の実施形態では、目的の遺伝子は、抗腫瘍サイトカイン、共刺激分子リガンド、追跡用遺伝子または自殺遺伝子である。

本開示の主題は、さらに、本明細書に記載の組換えＴＣＲをコードする核酸（nucleotideacid）、および本明細書に記載の組換えＴＣＲを含む核酸組成物を提供する。ある特定の実施形態では、核酸配列は、ベクター中に含まれる。本開示の主題はまた、本明細書に記載の核酸組成物を含むベクターを提供する。本明細書に記載の組換えＴＣＲ、本明細書に記載の免疫応答性細胞、本明細書に記載の医薬組成物、本明細書に記載の核酸組成物、または本明細書に記載のベクターを含むキットがさらに提供される。ある特定の実施形態では、キットは、新生物、病原体感染、自己免疫障害、または同種異系移植を処置および／または防止するための書面での指示をさらに含む。

本開示の主題を使用することができる例示的な新生物として、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ球性白血病）、真性多血症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに肉腫および癌腫などの固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（endotheliosarcoma）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫
（lymphangioendotheliosarcoma）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横
紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌（nileductcarcinoma）、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸部がん、子宮がん、精巣がん、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫（oligodenroglioma）、シュワン腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫および網膜芽腫）が挙げられるがこれらに限定されない。

本開示の主題は、さらに、治療における使用のための、本明細書に開示されるいずれかの組換えＴＣＲ、いずれかの医薬組成物またはいずれかの免疫応答性細胞の使用を提供する。

以下の詳細な説明は、例として示されるが、本開示の主題を記載の特定の実施形態に限定することを意図せず、添付の図面と共に理解され得る。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
細胞外抗原結合ドメインおよび定常ドメインを含む抗原結合鎖を含む組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、前記組換えＴＣＲが、ＨＬＡ非依存的に抗原に結合し、前記定常ドメインが、天然もしくは改変ＴＲＡＣペプチドおよび／または天然もしくは改変ＴＲＢＣペプチドを含む、組換えＴＣＲ。
（項目２）
免疫応答性細胞の内因性ＴＲＡＣ遺伝子座および／またはＴＲＢＣ遺伝子座に配置された発現カセットから発現される、項目１に記載の組換えＴＣＲ。
（項目３）
前記組換えＴＣＲ発現カセットの配置が、前記免疫応答性細胞における天然ＴＣＲα鎖および／または天然ＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲの内因性発現を破壊または無効化する、項目２に記載の組換えＴＣＲ。
（項目４）
前記組換えＴＣＲ発現カセットの配置が、前記免疫応答性細胞における前記組換えＴＣＲと、天然ＴＣＲα鎖および／または天然ＴＣＲβ鎖との間の誤対合を防止または排除する、項目２に記載の組換えＴＣＲ。
（項目５）
前記定常ドメインが、別の定常ドメインとホモ二量体またはヘテロ二量体を形成することができる、項目１から４のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲ。
（項目６）
前記抗原結合鎖が、ＣＤ３ζポリペプチドと会合することができる、項目１から５のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲ。
（項目７）
前記抗原結合鎖が、抗原に結合すると、前記抗原結合鎖に会合した前記ＣＤ３ζポリペプチドを活性化することができる、項目６に記載の組換えＴＣＲ。
（項目８）
前記ＣＤ３ζポリペプチドの活性化が、免疫応答性細胞を活性化することができる、項目７に記載の組換えＴＣＲ。
（項目９）
前記ＣＤ３ζポリペプチドが、内因性であり、天然ＣＤ３複合体に一体化されている、項目６に記載の組換えＴＣＲ。
（項目１０）
前記ＣＤ３ζポリペプチドが、外因性であり、ＣＤ２８ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＤＡＰ－１０ポリペプチド、およびその任意の組合せからなる群より選択される共刺激分子と必要に応じて一体化されている、項目６に記載の組換えＴＣＲ。
（項目１１）
前記抗原結合鎖が、共刺激領域をさらに含み、前記組換えＴＣＲが、抗原に結合すると、免疫応答性細胞を刺激することができる、項目１から１０のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲ。
（項目１２）
前記共刺激領域が、ＣＤ２８ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＤＡＰ－１０ポリペプチド、およびその任意の組合せからなる群より選択される共刺激分子を含む、項目１１に記載の組換えＴＣＲ。
（項目１３）
前記共刺激領域が、ＣＤ２８ポリペプチドを含む、項目１２に記載の組換えＴＣＲ。
（項目１４）
ＣＤ３複合体と一体化し、ＨＬＡ非依存的抗原認識をもたらすことができる、項目１から１３のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲ。
（項目１５）
前記ＣＤ３複合体が、内因性である、項目１４に記載の組換えＴＣＲ。
（項目１６）
ＣＤ３／ＴＣＲ複合体における内因性ＴＣＲに置き換わる、項目１５に記載の組換えＴＣＲ。
（項目１７）
前記細胞外抗原結合ドメインが、別の細胞外抗原結合ドメインと二量体化することができる、項目１から１６のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲ。
（項目１８）
前記細胞外抗原結合ドメインが、細胞表面受容体のリガンド、細胞表面リガンドの受容体、抗体の抗原結合部分もしくはその断片、またはＴＣＲの抗原結合部分を含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲ。
（項目１９）
前記細胞外抗原結合ドメインが、１個または２個の免疫グロブリン可変領域を含む、項目１から１８のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲ。
（項目２０）
前記細胞外抗原結合ドメインが、抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）を含む、項目１８に記載の組換えＴＣＲ。
（項目２１）
前記細胞外抗原結合ドメインが、抗体の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む、項目１８に記載の組換えＴＣＲ。
（項目２２）
前記細胞外抗原結合ドメインが、別の細胞外抗原結合ドメインと二量体化することができる、項目１８に記載の組換えＴＣＲ。
（項目２３）
前記細胞外抗原結合ドメインが、抗体のＶ_Ｈを含み、前記Ｖ_Ｈが、前記抗体のＶ_Ｌを含む別の細胞外抗原結合ドメインと二量体化し、可変断片（Ｆｖ）を形成することができる、項目２０に記載の組換えＴＣＲ。
（項目２４）
前記細胞外抗原結合ドメインが、抗体のＶ_Ｌを含み、前記Ｖ_Ｌが、前記抗体のＶ_Ｈを含む別の細胞外抗原結合ドメインと二量体化し、可変断片（Ｆｖ）を形成することができる、項目２１に記載の組換えＴＣＲ。
（項目２５）
腫瘍抗原に結合する、項目１から２４のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲ。
（項目２６）
前記腫瘍抗原が、ＣＤ１９、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＡｌＸ、ＣＥＡ、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＬＬ１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ－４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂ－Ｂ２、３、４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、葉酸受容体－ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＥＲ－２、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、Ｋ－軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ－Ａ１、メソテリン、ＥＲＢＢ２、ＭＡＧＥＡ３、ｐ５３、ＭＡＲＴ１、ＧＰ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳ０－１、癌胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ－７２、ＶＥＧＦ－Ｒ２、ＷＴ－１、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ４４Ｖ６、ＮＫＣＳ１、ＥＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩおよびＣＤ９９、ＣＤ７０、ＡＤＧＲＥ２、ＣＣＲ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ４、ＰＲＡＭＥおよびＥＲＢＢからなる群より選択される、項目２５に記載の組換えＴＣＲ。
（項目２７）
前記腫瘍抗原が、ＣＤ１９である、項目２５または２６に記載の組換えＴＣＲ。
（項目２８）
同じ抗原を標的とするＣＡＲよりも大きい抗原感受性を示す、項目１から２７のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲ。
（項目２９）
腫瘍細胞の表面に低密度で存在する抗原に結合すると、免疫応答を誘導することができる、項目１から２８のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲ。
（項目３０）
前記細胞表面に低密度で存在する前記抗原が、細胞１個当たり約１０，０００分子未満の密度を有する、項目１から２８のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲ。
（項目３１）
項目１から３０のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲを含む免疫応答性細胞。
（項目３２）
前記組換えＴＣＲの少なくとも１種の抗原結合鎖の前記発現カセットが、前記免疫応答性細胞の内因性遺伝子座に配置されている、項目３１に記載の免疫応答性細胞。
（項目３３）
前記組換えＴＣＲの２種の抗原結合鎖の発現カセットが、前記免疫応答性細胞の内因性遺伝子座に配置され、前記２種の抗原結合鎖が、二量体化することができる、項目３２に記載の免疫応答性細胞。
（項目３４）
前記内因性遺伝子座が、ＣＤ３δ遺伝子座、ＣＤ３ε遺伝子座、ＣＤ２４７遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、ＴＲＢＣ遺伝子座、ＴＲＤＣ遺伝子座および／またはＴＲＧＣ遺伝子座である、項目３１から３３のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
（項目３５）
前記内因性遺伝子座が、ＴＲＡＣ遺伝子座および／またはＴＲＢＣ遺伝子座である、項目３４に記載の免疫応答性細胞。
（項目３６）
前記組換えＴＣＲの前記発現カセットの配置が、前記免疫応答性細胞における天然ＴＣＲα鎖および／または天然ＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲの内因性発現を破壊または無効化し、それによって、前記免疫応答性細胞における前記組換えＴＣＲと、天然ＴＣＲα鎖および／または天然ＴＣＲβ鎖との間の誤対合を防止または排除する、項目３５に記載の免疫応答性細胞。
（項目３７）
前記内因性遺伝子座が、改変された転写ターミネーター領域を含む、項目３２から３６のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
（項目３８）
前記改変された転写ターミネーター領域が、ＴＫ転写ターミネーター、ＧＣＳＦ転写ターミネーター、ＴＣＲＡ転写ターミネーター、ＨＢＢ転写ターミネーター、ウシ成長ホルモン転写ターミネーター、ＳＶ４０転写ターミネーターおよびＰ２Ａエレメントからなる群より選択されるゲノムエレメントを含む、項目３７に記載の免疫応答性細胞。
（項目３９）
細胞における１個の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座が、前記組換えＴＣＲの前記少なくとも１種の抗原結合鎖を発現するように改変されている場合、前記細胞における１個または複数の他の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座が、内因性ＴＣＲ鎖の発現を排除するように改変されている、項目３２から３８のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
（項目４０）
前記１個または複数の他の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座が、目的の遺伝子を発現するようにさらに改変されている、項目３９に記載の免疫応答性細胞。
（項目４１）
前記目的の遺伝子が、抗腫瘍サイトカイン、共刺激分子リガンド、追跡用遺伝子または自殺遺伝子である、項目４０に記載の免疫応答性細胞。
（項目４２）
Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ヒト胚性幹細胞、およびリンパ系細胞に分化し得る多能性幹細胞からなる群より選択される、項目３１から４１のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
（項目４３）
自己のものである、項目３１から４２のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
（項目４４）
少なくとも１種の外因性共刺激リガンドをさらに含む、項目３１から４３のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
（項目４５）
前記外因性共刺激リガンドが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４１ＢＢＬ、ＣＤ２７５、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌおよびその任意の組合せからなる群より選択される、項目４４に記載の免疫応答性細胞。
（項目４６）
１種の外因性共刺激リガンドをさらに含む、またはそれからなる、項目４４または４５に記載の免疫応答性細胞。
（項目４７）
前記１種の外因性共刺激リガンドが、ＣＤ８０または４－１ＢＢＬである、項目４６に記載の免疫応答性細胞。
（項目４８）
２種の外因性共刺激リガンドをさらに含む、またはそれからなる、項目４４または４５に記載の免疫応答性細胞。
（項目４９）
前記２種の外因性共刺激リガンドが、ＣＤ８０および４－１ＢＢＬである、項目４８に記載の免疫応答性細胞。
（項目５０）
少なくとも１種のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）をさらに含む、項目３１から４９のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
（項目５１）
前記ＣＣＲが、ＣＤ２８ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＤＡＰ－１０ポリペプチド、およびその任意の組合せからなる群より選択される共刺激分子を含む、項目５０に記載の免疫応答性細胞。
（項目５２）
有効量の項目３１から４７のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
（項目５３）
新生物を処置するための、項目５２に記載の医薬組成物。
（項目５４）
被験体における腫瘍負荷を低減させる方法であって、前記被験体に、有効量の項目３１から５１のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞または項目５２もしくは５３に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
（項目５５）
新生物を処置または防止する方法であって、前記被験体に、有効量の項目３１から５１のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞または項目５２もしくは５３に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
（項目５６）
前記新生物が、血液がん、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、腺癌からなる群より選択される、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記新生物が、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病または非ホジキンリンパ腫であり、組換えＴＣＲが、ＣＤ１９に結合する、項目５５または５６に記載の方法。
（項目５８）
前記新生物が、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病または非ホジキンリンパ腫であり、組換えＴＣＲが、ＢＣＭＡ、ＡＤＧＲＥ２、ＣＣＲ１、ＣＤ２２、ＣＤ７０またはその組合せに結合する、項目５５または５６に記載の方法。
（項目５９）
前記新生物が、ＣＤ１９^＋ＡＬＬである、項目５５から５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
抗原特異的免疫応答性細胞を産生するための方法であって、免疫応答性細胞に、項目１から３０のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲをコードする核酸配列を導入することを含む、方法。
（項目６１）
前記核酸配列が、ベクター中に含まれる、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記組換えＴＣＲの少なくとも１種の抗原結合鎖の発現カセットが、前記免疫応答性細胞の内因性遺伝子座に配置されている、項目６０または６１に記載の方法。
（項目６３）
前記組換えＴＣＲの２種の抗原結合鎖の前記発現カセットが、前記免疫応答性細胞の内因性遺伝子座に配置され、前記２種の抗原結合鎖が、二量体化することができる、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記内因性遺伝子座が、ＣＤ３δ遺伝子座、ＣＤ３ε遺伝子座、ＣＤ２４７遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、ＴＲＢＣ遺伝子座、ＴＲＤＣ遺伝子座および／またはＴＲＧＣ遺伝子座である、項目６２または６３に記載の方法。
（項目６５）
前記内因性遺伝子座が、ＴＲＡＣ遺伝子座および／またはＴＲＢＣ遺伝子座である、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記組換えＴＣＲの前記発現カセットの配置が、前記免疫応答性細胞における天然ＴＣＲα鎖および／または天然ＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲの内因性発現を破壊または無効化し、それによって、前記免疫応答性細胞における前記組換えＴＣＲと、天然ＴＣＲα鎖および／または天然ＴＣＲβ鎖との間の誤対合を防止または排除する、項目６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記内因性遺伝子座が、改変された転写ターミネーター領域を含む、項目６２から６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記改変された転写ターミネーター領域が、ＴＫ転写ターミネーター、ＧＣＳＦ転写ターミネーター、ＴＣＲＡ転写ターミネーター、ＨＢＢ転写ターミネーター、ウシ成長ホルモン転写ターミネーター、ＳＶ４０転写ターミネーターおよびＰ２Ａエレメントからなる群より選択されるゲノムエレメントを含む、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
細胞における１個の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座が、前記組換えＴＣＲの前記少なくとも１種の抗原結合鎖を発現するように改変されている場合、前記細胞における１個または複数の他の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座が、内因性ＴＣＲ鎖の発現を排除するように改変されている、項目６２から６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記１個または複数の他の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座が、目的の遺伝子を発現するようにさらに改変されている、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記目的の遺伝子が、抗腫瘍サイトカイン、共刺激分子リガンド、追跡用遺伝子または自殺遺伝子である、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
新生物を有する被験体の生存を延ばす方法であって、前記被験体に、有効量の項目３１から５１のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞または項目５２もしくは５３に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目７３）
項目１から３０のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲをコードする核酸。
（項目７４）
項目１から３０のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲを含む核酸組成物。
（項目７５）
前記核酸配列が、ベクター中に含まれる、項目７４に記載の核酸組成物。
（項目７６）
項目７４または７５に記載の核酸組成物を含むベクター。
（項目７７）
項目１から３０のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲ、項目３１から５１のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞、項目５２もしくは５３に記載の医薬組成物、項目７４もしくは７５に記載の核酸組成物、または項目７６に記載のベクターを含むキット。
（項目７８）
新生物、病原体感染、自己免疫障害または同種異系移植を処置および／または防止するための書面での指示をさらに含む、項目７７に記載のキット。
（項目７９）
治療における使用のための、項目１から３０のいずれか一項に記載の組換えＴＣＲ。
（項目８０）
治療における使用のための、項目５１または５２に記載の医薬組成物。
（項目８１）
治療における使用のための、項目３１から５１のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
（項目８２）
被験体における腫瘍負荷を低減させるための、項目３１から５１のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞または項目５２もしくは５３に記載の医薬組成物の使用。
（項目８３）
新生物を処置または防止するための、項目３１から５１のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞または項目５２もしくは５３に記載の医薬組成物の使用。
（項目８４）
新生物（例えば、がん）を有する被験体の生存を延ばすための、項目３１から５１のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞または項目５２もしくは５３に記載の医薬組成物の使用。

図１Ａ～図１Ｅは、ＨＬＡ非依存的なＴＣＲに基づくキメラ抗原受容体ＨＩＴ（ＨＩＴ－ＣＡＲ、すなわち、ＨＩ－ＴＣＲまたはＨＩＴ）、およびヒトＴ細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座における遺伝子標的化戦略を示す。（Ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびＨＬＡ非依存的なＴＣＲに基づくキメラ抗原受容体（ＨＩＴ－ＣＡＲ、すなわち、ＨＩ－ＴＣＲまたはＨＩＴ）の略図。（Ｂ）ＴＲＡＣ遺伝子座への３種の受容体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により標的化された組込み。上：ＴＲＡＣ遺伝子座；中央：相同性アームに挟まれた異なる受容体カセットを含有するｒＡＡＶ６。（Ｃ）ＴＲＡＣ標的化の４日後の、代表的ＴＣＲ／マウスＦ（ａｂ’）２フローサイトメトリープロット。ＴＣＲ抗体エピトープは、ＴＣＲアルファおよびベータの定常鎖を認識する。（Ｄ）標的細胞としてホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）発現ＮＡＬＭ－６を使用した、１８時間生物発光アッセイを使用した細胞傷害活性（ｎ＝３）。（Ｅ）ＣＤ１９陽性標的細胞における１、２または４回（矢印）刺激後の、ＣＡＲＴ細胞の相対ＣＡＲＭＦＩ（１＝０時間でのＭＦＩ）。同上。同上。

図２Ａ～図２Ｂは、ＨＩ－ＴＣＲの発現および治療有効性を示す。（Ａ）ＴＲＡＣ標的化の４日後の、代表的ＴＣＲ／マウスＦ（ａｂ’）２フローサイトメトリープロット。（Ｂ）ＮＡＬＭ－６を有するマウスが、５×１０^５個のＣＡＲＴ細胞で処置された場合の、マウス生存のカプラン・マイヤー解析。

図３Ａ～図３Ｅは、ＮＹＥＳＯＴＣＲの遺伝子標的化戦略および発現を示す。（Ａ）ＴＣＲアルファまたはベータ鎖に組み込まれたＮＹＥＳＯＴＣＲ遺伝子の略図。（Ｂ）ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ標的化の４日後の、代表的ＴＣＲ－Ｖ－ベータ－１フローサイトメトリープロット。（Ｃ）標的細胞としてホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）発現ＰＣ３を使用した、１８時間生物発光アッセイを使用した細胞傷害活性（ｎ＝３）。（Ｄ）ＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータの両方への同時標的化の略図。（Ｅ）ＴＲＡＣおよびＴＲＢＣ同時標的化の４日後の、代表的ＴＣＲ－Ｖ－ベータ－１／４－１ＢＢＬフローサイトメトリープロット。同上。

図４Ａ～図４Ｃは、ＴＲＡＣ遺伝子座へのＣＡＲ組込み戦略、および様々な転写終結シグナル／３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）による発現のモジュレーションを示す。（Ａ）ＴＲＡＣ遺伝子座に組み込まれた１９２８ｚＣＡＲ遺伝子の略図。ポリＡ（黒いボックス）は、異なるウイルスおよび哺乳動物３’ＵＴＲを検査するために改変されたＣＡＲカセットのセグメントに対応する。（Ｂ）ＴＲＡＣの３日後の、代表的ＣＡＲフロープロット（左パネル）、ならびにＣＡＲ発現集団の幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）、ＭＦＩおよび中央値（右パネル）。ウシ成長ホルモンポリＡの本来の３’ＵＴＲ配列をボックスで囲む。（Ｃ）ＣＤ１９陽性標的細胞における１、２回刺激後のＣＡＲＴ細胞の絶対（上）および相対（下）ＣＡＲＭＦＩ（１＝０時間でのＭＦＩ）（図１に示す通り）。同上。同上。

図５Ａおよび図５Ｂは、異なる３’ＵＴＲ配列を有する遺伝的に組み込まれたＣＡＲの有効性を示す。（Ａ）ＦＦＬ－ＮＡＬＭ－６を有するマウスを、１×１０^５個のＣＡＲＴ細胞で処置し、この場合、腫瘍負荷は、Ｔ細胞注射後１４日目の動物１匹当たりで定量化される生物発光シグナルとして示される。１群当たりｎ＝６匹のマウス。（Ｂ）Ｔ細胞注射後７、１４および２１日目に定量化された、１×１０^５個のＣＡＲＴ細胞で処置されたＮＡＬＭ－６を有するマウスの腫瘍負荷（平均ラジアンス）（ｎ＝６；線＝１匹のマウス）。同上。

図６Ａ～図６Ｃは、ヒトＴ細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子座におけるＨＩＴ遺伝子標的化を示す。（Ａ）ＴＲＡＣ遺伝子座への、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により標的化されたＣＡＲまたはＨＩＴ遺伝子組込み。上、ＴＲＡＣ遺伝子座；中央、相同性アームに挟まれたＣＡＲカセットを含有するｒＡＡＶ６；下、相同性アームに挟まれたＨＩＴカセットを含有するｒＡＡＶ６。（Ｂ）Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびＴＲＡＣｇＲＮＡによるＴ細胞のトランスフェクション、ならびにＡＡＶ６の添加の４日後の、代表的ＣＡＲ／ＨＩＴフロープロット。ヤギ抗マウスＩｇＧを使用して、ＣＡＲおよびＨＩＴ表面タンパク質を検出した。（Ｃ）形質導入の４日後にＦＡＣＳによって解析された平均ＣＡＲ／ＨＩＴ平均蛍光強度（ＭＦＩ）（ｎ＝６回の独立した実験）。

図７Ａ～図７Ｂは、低い抗原レベルを発現する標的細胞の死滅において、ＨＩＴＴ細胞が、ＣＡＲＴ細胞よりも優れていることを示す。Ｎａｌｍ６細胞系（ホタルルシフェラーゼを発現する）を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＣＤ１９遺伝子座において遺伝子編集し、異なるＣＤ１９レベルを発現するクローンを生成した。（Ａ）各ＣＤ１９発現レベル群の代表的Ｎａｌｍ６クローンのＦＡＣＳ解析（Ｎｅｇ＝陰性）。（Ｂ）異なるＣＤ１９レベルを発現する標的細胞としてのＮＡＬＭ６、およびＣＡＲ（赤い四角）またはＨＩＴ（青い丸）Ｔ細胞を１：１エフェクター（Ｅ）：標的（Ｔ）比で使用した、４時間生物発光アッセイを使用した細胞傷害活性。

図８Ａ～図８Ｃは、低い抗原レベルを発現する標的細胞の死滅において、ＨＩＴＴ細胞が、ＣＡＲＴ細胞よりも優れていることを示す。異なるエフェクター（Ｅ）：標的（Ｔ）比で、形質導入されていないＴ細胞（Ａ）、ＣＡＲＴ細胞（Ｂ）およびＨＩＴＴ細胞（Ｃ）と共にインキュベートした、異なるＣＤ１９レベル（右に示す）を発現する標的細胞としてのＮＡＬＭ６を使用した、１８時間生物発光アッセイを使用した細胞傷害活性。

図９Ａ～図９Ｄは、非常に低いＣＤ１９レベルを有する確立されたＢ－ＡＬＬ腫瘍の制御において、共刺激リガンドを発現するＨＩＴＴ細胞が、ＣＡＲＴ細胞よりも優れていることを示す。ＮＡＬＭ－６を有するマウスを、４×１０５個の形質導入されていない（ＮＴ）、ＣＡＲまたはＨＩＴＴ細胞で処置した。ＢＬＩを使用して、５４日間の期間にわたって毎週、腫瘍負荷□を定量化した。定量化は、所与の全時点における動物１匹当たりの腹側および背側取得の平均光子計数である。各線は、１匹のマウスを表し、１群当たりｎ＝５匹のマウスである。（Ａ）形質導入されていない（黒）対ＣＡＲ（赤）Ｔ細胞。（Ｂ）ＣＡＲ（赤）対ＨＩＴ（緑）Ｔ細胞。（Ｃ）ＨＩＴ単独（緑）、ＨＩＴ＋ＣＤ８０共刺激リガンド（橙）、ＨＩＴ＋４１ＢＢＬ共刺激リガンド（桃）またはＨＩＴ＋ＣＤ８０＋４１ＢＢＬ共刺激リガンド（青）を発現するＴ細胞。（Ｄ）マウス生存解析。

図１０Ａ～図１０Ｃは、抗原遭遇後の細胞表面補充動態に影響を与えることなく、別個の３’ＵＴＲ配列によってベースラインＴＲＡＣ－ＣＡＲ発現を制御することができることを示す。（Ａ）ＴＲＡＣ遺伝子座への、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により標的化されたＣＡＲ遺伝子組込み。標的化構築物（ＡＡＶ）は、ＴＲＡＣ遺伝子座に相同な配列（ＬＨＡ□およびＲＨＡ、左および右相同性アーム）に挟まれた、１９２８ｚＣＡＲコード配列と、それに続く３’ＵＴＲ配列を含有する。（Ｂ）各３’ＵＴＲ配列は、異なるＣＡＲ表面レベルをもたらす（ＦＡＣＳによって測定）。ＴＫ：チミジンキナーゼ（短いバージョン）；ＧＣＳＦ：ｐＥＦ－ＢＯＳプラスミドに由来するヒトＧＣＳＦ；ＴＣＲａ：ＴＣＲアルファ、エクソン４；ＨＢＢ：ヒトＢ－グロビン；ＲＢＧ：ウサギＢ－グロビン；ＳＶ４０：サルウイルス４０ポリＡ；Ｐ２Ａ：ブタテッショウウイルス－１自己切断２Ａ配列；これは、内因性ＴＲＡＣポリＡ配列の使用を可能にした。（Ｃ）ＣＡＲＴ細胞を、ＣＤ１９発現３Ｔ３細胞により１回刺激し（赤い矢印で示す）、３日間の期間にわたって２４時間毎にＣＡＲＭＦＩを測定した。全ＣＡＲＴ細胞が、同様のＣＡＲ発現調節を示す。

本開示の主題は、ＨＬＡ非依存的に目的の抗原に結合する、ＨＬＡ非依存的（または非ＨＬＡ制限）Ｔ細胞受容体（「ＨＩ－ＴＣＲ」と称される）を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲは、ＴＣＲ可変ドメインが抗体由来の可変ドメイン（Ｆｖ）によって置き換えられてＦｖＴＣＲをもたらす、ＴＣＲ分子である。ある特定の非限定的な実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲは、腫瘍抗原または病原体抗原に結合することができる。本開示の主題は、また、本開示のＨＩ－ＴＣＲを含む遺伝子改変された免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞またはＣＴＬ細胞）を含む細胞を提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲによる抗原の結合は、免疫応答性細胞を活性化することができる。本開示の主題は、また、標的抗原に対する免疫応答を誘導および／もしくは増強する、ならびに／または抗原特異的免疫応答の増加が望まれる新生物もしくは他の疾患／障害を処置および／もしくは防止するために、そのような細胞を使用する方法を提供する。

１．定義
別段の定義のない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本開示の主題において使用される多くの用語の一般的定義を当業者に提供する：Singletonet al., Dictionary of Microbiology and MolecularBiology(2nd ed. 1994)；TheCambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；The Glossary ofGenetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.),SpringerVerlag (1991)；およびHale &Marham, The Harper Collins Dictionary ofBiology(1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、別段の特定のない限り、以下のものに帰する意味を有する。

本明細書で使用される場合、用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定される特定の値に関する許容される誤差の範囲内であることを意味し、その値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定系の限界に一部依存するであろう。例えば、「約」は、当技術分野における実務あたり、３標準偏差以内または３を超える標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の約２０％まで、例えば、約１０％まで、約５％まで、または約１％までの範囲を意味してもよい。あるいは、特に生物システムまたはプロセスに関して、この用語は、ある値の１桁の範囲内、例えば、約５倍以内または約２倍以内を意味してもよい。

「免疫応答性細胞を活性化する」とは、免疫応答の開始をもたらす細胞中でのシグナル伝達の誘導またはタンパク質の変化を意味する。例えば、ＣＤ３鎖が、リガンド結合および免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）に応答してクラスター化する場合、シグナル伝達カスケードが産生される。ある特定の実施形態では、内因性ＴＣＲまたは外因性ＣＡＲが抗原に結合する場合、結合した受容体（例えば、ＣＤ４またはＣＤ８、ＣＤ３γ／δ／ε／ζなど）の近くで多くの分子のクラスター化を含む免疫学的シナプスの形成が起こる。膜結合型シグナル伝達分子のこのクラスター化により、ＣＤ３鎖内に含有されるＩＴＡＭモチーフはリン酸化されるようになる。このリン酸化は次に、Ｔ細胞活性化経路を開始させ、最終的にはＮＦ－κＢおよびＡＰ－１などの転写因子を活性化する。これらの転写因子は、Ｔ細胞の全体的な遺伝子発現を誘導して、マスター調節性Ｔ細胞タンパク質の増殖および発現のためのＩＬ－２産生を増加させ、Ｔ細胞媒介性免疫応答を開始させる。

「免疫応答性細胞を刺激する」とは、ロバストかつ持続的な免疫応答をもたらすシグナルを意味する。様々な実施形態では、これは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）活性化後に起こるか、または限定されるものではないが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＯＸ４０、ＣＤ４０およびＩＣＯＳを含む受容体を介して同時に媒介される。複数の刺激シグナルを受け取ることが、ロバストかつ長期間のＴ細胞媒介性免疫応答を開始させるのに重要であり得る。Ｔ細胞は、急速に阻害され、抗原に対して非応答性になり得る。これらの共刺激シグナルの効果は変化してもよいが、それらは一般的には、完全かつ持続的な根絶のために抗原にロバストに応答する、長期に生存し、増殖し、抗アポトーシス性のＴ細胞を生成するために遺伝子発現の増加をもたらす。

本明細書で使用される用語「抗原認識受容体」とは、抗原へのその結合に応答して免疫または免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化することができる受容体を指す。抗原認識受容体の非限定例としては、天然または内因性のＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）、およびキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、無傷抗体分子だけでなく、免疫原結合能力を保持する抗体分子の断片も意味する。そのような断片もまた当技術分野で周知であり、ｉｎｖｉｔｒｏとｉｎｖｉｖｏの両方で通常用いられる。したがって、本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、無傷免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性断片Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦａｂも意味する。Ｆ（ａｂ’）_２、および無傷抗体のＦｃ断片を欠くＦａｂ断片は、循環からより急速に消失し、無傷抗体の低い非特異的組織結合を有してもよい（Wahlet al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)）。本明細書で使用される場合、抗体は、天然抗体全体、二重特異性抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、単鎖Ｖ領域断片（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチド、および非定型抗体を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＶ_Ｈと省略）および重鎖定常（Ｃ_Ｈ）領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶ_Ｌと省略）および軽鎖定常Ｃ_Ｌ領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、Ｃ_Ｌから構成される。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域を、より保存された、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができる。それぞれのＶ_ＨおよびＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序で配置された３個のＣＤＲと４個のＦＲとをから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。

本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列と定義される。例えば、Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4thU.S. Department ofHealth and Human Services, National Institutes of Health(1987)を参照されたい。一般に、抗体
は、３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲまたは可変領域中のＣＤＲ領域を含む。ＣＤＲは、抗体の、抗原またはエピトープへの結合のための接触残基の大部分を提供する。ある特定の実施形態では、ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステムを使用して説明される（Kabat,E.A.,et al. (1991) Sequences of Proteins ofImmunological Interest, FifthEdition,U.S. Department of Health and HumanServices, NIH Publication No.91-3242）。

本明細書で使用される場合、用語「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、Ｖ_Ｈ：：Ｖ_Ｌヘテロ二量体を形成するように共有結合的に連結された免疫グロブリンの重鎖（Ｖ_Ｈ）および軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変領域の融合タンパク質である。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、直接連結されるか、またはＶ_ＨのＮ末端を、Ｖ_ＬのＣ末端と接続する、もしくはＶ_ＨのＣ末端を、Ｖ_ＬのＮ末端と接続する、ペプチドをコードするリンカー（例えば、１０、１５、２０、２５個のアミノ酸）によって連結される。リンカーは通常、可撓性のためにグリシンに富み、可溶性のためにセリンまたはトレオニンに富む。定常領域の除去およびリンカーの導入にも拘わらず、ｓｃＦｖタンパク質は、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。単鎖Ｆｖポリペプチド抗体を、Huston,et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)によって記載されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードする配列を含む核酸から発現させることができる。また、米国特許第５，０９１，５１３号、第５，１３２，４０５号および第４，９５６，７７８号；ならびに米国特許出願公開第２００５０１９６７５４号および第２００５０１９６７５４号も参照されたい。阻害活性を有するアンタゴニストｓｃＦｖが記載されている（例えば、Zhaoetal.,Hyrbidoma (Larchmt) 2008 27(6):455-51；Peter et
al., J CachexiaSarcopeniaMuscle 2012 August 12；Shieh et al., J Imunol2009183(4):2277-85；Giomarellietal., Thromb Haemost 2007 97(6):955-63；Fife eta., JClin
Invst2006116(8):2252-61；Brocks et al., Immunotechnology 1997 3(3):173-84；Moosmayeretal.,Ther Immunol 1995 2(10:31-40)を参照されたい）。刺激活性を有するアゴ
ニストｓｃＦｖが記載されている（例えば、Peteretal., J Bioi Chern 2003 25278(38):36740-7；Xie et al.,Nat Biotech199715(8):768-71；Ledbetter et al., Crit Rev Immunol199717(5-6):427-55；Ho etal.,BioChim Biophys Acta 2003 1638(3):257-66を参照されたい）。

本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、結合強度の尺度を意味する。親和性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の立体化学的適合の近さ、それらの間の接触領域のサイズ、ならびに／または荷電した基および疎水性の基の分布に依存してもよい。本明細書で使用される場合、用語「親和性」はまた、可逆性複合体の形成後の抗原－抗体結合の強度を指す「アビディティ」も含む。抗原に対する抗体の親和性を算出するための方法は、当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、様々な抗原結合実験、例えば、機能的アッセイ（例えば、フローサイトメトリーアッセイ）が挙げられる。

本明細書で使用される用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、免疫応答性細胞を活性化または刺激することができる細胞内シグナル伝達ドメインに融合された細胞外抗原結合ドメイン、および膜貫通ドメインを含む分子を指す。ある特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。ｓｃＦｖを、抗体の可変重鎖および軽鎖領域を融合することから誘導することができる。あるいは、またはさらに、ｓｃＦｖは、Ｆａｂ’に由来してもよい（抗体に由来する代わりに、例えば、Ｆａｂライブラリーから得られる）。ある特定の実施形態では、ｓｃＦｖを膜貫通ドメインに融合した後、細胞内シグナル伝達ドメインに融合する。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、抗原に対する高い結合親和性またはアビディティを有する。

本明細書で使用される場合、用語「核酸分子」は、目的のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。そのような核酸分子は、内因性核酸配列と１００％相同または同一である必要はないが、実質的な同一性を示してもよい。内因性配列に対して「実質的な同一性」または「実質的な相同性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、様々なストリンジェンシー条件下で、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子）、またはその一部との間で二本鎖分子を形成する対を意味する。（例えば、Wahl,G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399；Kimmel,A.R. (1987)Methods Enzymol. 152:507を参照されたい）。

例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、例えば、約５００ｍＭ未満のＮａＣｌおよび５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、または約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであろう。低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミドの非存在下で得られるが、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、例えば、少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得られる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、少なくとも約３７℃、または少なくとも約４２℃の温度を含むであろう。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、および担体ＤＮＡの含有または排除などの、変化する追加のパラメーターは、当業者には周知である。必要に応じてこれらの様々な条件を組み合わせることによって、様々なレベルのストリンジェンシーが達成される。ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および１％ＳＤＳ中、３０℃で行われる。ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭ
ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中、３７℃で行われる。ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、および２００μｇ／ｍｌｓｓＤＮＡ中、４２℃で行われる。これらの条件に対する有用な変形形態は、当業者には容易に明らかとなるであろう。

多くの適用について、ハイブリダイゼーション後の洗浄ステップも、ストリンジェンシーが変化するであろう。洗浄ストリンジェンシー条件を、塩濃度によっておよび温度によって定義することができる。上述のように、洗浄ストリンジェンシーを、塩濃度を低下させることによって、または温度を上昇させることによって増加させることができる。例えば、洗浄ステップのためのストリンジェントな塩濃度は、約３０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、例えば、約１５ｍＭ未満のＮａＣｌおよび１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであってよい。洗浄ステップのためのストリンジェントな温度条件は通常、少なくとも約２５℃、少なくとも約４２℃、または少なくとも約６８℃の温度を含むであろう。ある特定の実施形態では、洗浄ステップは、３０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中、２５℃で行われる。ある特定の実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中、４２℃で行われる。ある特定の実施形態では、洗浄ステップは、１５ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳ中、６８℃で行われる。これらの条件に対する追加の変形形態は、当業者には容易に明らかとなるであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者には周知であり、例えば、Bentonand Davis (Science 196:180, 1977)；Grunstein and Rogness(Proc.Natl. Acad. Sci.,USA 72:3961, 1975)；Ausubel et al. (Current ProtocolsinMolecular Biology,WileyInterscience, New York, 2001)；Berger and Kimmel(Guideto Molecular CloningTechniques, 1987, Academic Press, New York)；およびSambrooketal., MolecularCloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratoryPress, New Yorkに記載されている。

「実質的に同一」または「実質的に相同」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列のいずれか１つ）に対して少なくとも約５０％の相同性または同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。ある特定の実施形態では、そのような配列は、比較のために使用されるアミノ酸または核酸の配列と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％相同または同一である。

配列同一性を、配列分析ソフトウェア（例えば、ＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ
ＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅｏｆｔｈｅＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒ、１７１０ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＡｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用することによって測定することができる。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および／または他の改変に対して相同性の程度を割り当てることによって、同一の、または類似する配列を一致させる。保存的置換は、典型的には、以下の群：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン内の置換を含む。同一性の程度を決定するための例示的な手法では、ＢＬＡＳＴプログラムを、密接に関連する配列を示すｅ－３～ｅ－１００の確率スコアと共に使用することができる。

「アナログ」とは、参照ポリペプチドまたは核酸分子の機能を有する構造的に関連するポリペプチドまたは核酸分子を意味する。

本明細書で使用される用語「リガンド」とは、受容体に結合する分子を指す。ある特定の実施形態では、リガンドは、別の細胞上の受容体に結合し、細胞間認識および／または相互作用を可能にする。

本明細書で使用される用語「構成的発現」または「構成的に発現される」とは、あらゆる生理的条件下での発現または発現されることを指す。

「疾患」とは、細胞、組織、または臓器の正常な機能を損傷または妨害する任意の状態、疾患または障害、例えば、新生物、および細胞の病原体感染を意味する。

「有効量」とは、治療効果を有するのに十分な量を意味する。ある特定の実施形態では、「有効量」は、新生物の継続的な増殖、成長、または転移（例えば、侵入、または遊走）を停止、改善または阻害するのに十分な量である。

「寛容を強制すること」とは、移植された臓器または組織を標的とする自己反応性細胞または免疫応答性細胞の活性を防止することを意味する。

「内因性」とは、細胞または組織中で通常発現される核酸分子またはポリペプチドを意味する。

「外因性」とは、細胞中に内因性に存在しない、または過剰発現されたとき得られる機能的効果を達成するのに十分なレベルで存在しない核酸分子またはポリペプチドを意味する。したがって、用語「外因性」は、外来の、異種の、過剰発現される核酸分子およびポリペプチドなどの、細胞中で発現される任意の組換え核酸分子またはポリペプチドを包含する。「外因性」核酸とは、天然の野生型細胞中には存在しない核酸を意味し；例えば、外因性核酸は、配列によって、位置／場所によって、またはその両方によって内因性対応物と異なっていてもよい。明確性のために、外因性核酸は、その天然の内因性対応物と比較して同じか、または異なる配列を有してもよく；それを、遺伝子操作によって、細胞自体またはその前駆細胞に導入することができ、必要に応じて、非天然プロモーターまたは分泌配列などの、代替的な制御配列に連結してもよい。

「異種核酸分子またはポリペプチド」とは、細胞または細胞から得られた試料中に通常は存在しない核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子）またはポリペプチドを意味する。この核酸は、別の生物に由来してもよいか、またはそれは例えば、細胞もしくは試料中で通常は発現されないｍＲＮＡ分子であってもよい。

「免疫応答性細胞」は、免疫応答において機能する細胞、またはその前駆細胞もしくは子孫を意味する。

「モジュレートする」とは、正または負に変更することを意味する。例示的なモジュレーションとしては、約１％、約２％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、または約１００％の変化が挙げられる。

「増加」とは、少なくとも約５％正に変更することを意味する。変更は、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、約１００％またはそれより高くてもよい。

「減少」とは、少なくとも約５％負に変更することを意味する。変更は、約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、またはさらには約１００％であってもよい。

「単離された細胞」とは、細胞に天然に付随する分子および／または細胞成分から分離された細胞を意味する。

用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」とは、その天然状態で見出されるような通常はそれに伴う成分を変化する程度で含まない材料を指す。「単離する」は、元の供給源またはその周囲のものからの分離の程度を示す。「精製する」は、単離よりも高い分離の程度を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、不純物がタンパク質の生物学的特性に実質的に影響しない、または他の有害な結果を引き起こさないように十分に、他の材料を含まない。すなわち、核酸またはペプチドは、それが組換えＤＮＡ技術によって生産される場合には細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地、または化学的に合成される場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない場合、精製されている。純度および均一性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲル中で本質的には１つのバンドを生じることを示してもよい。改変、例えば、リン酸化またはグリコシル化にかけることができるタンパク質については、異なる改変は、別々に精製することができる、異なる単離されたタンパク質を生じてもよい。

本明細書で使用される用語「抗原結合ドメイン」とは、細胞上に存在する特定の抗原決定基または抗原決定基のセットに特異的に結合することができるドメインを指す。

本明細書で使用される場合、「リンカー」は、２つまたはそれより多いポリペプチドまたは核酸を、それらが互いに接続されるように共有結合的に結合させる官能基（例えば、化学物質またはポリペプチド）を意味するべきである。本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」とは、２つのタンパク質を一緒にカップリングさせる（例えば、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインをカップリングさせる）ために使用される１つまたは複数のアミノ酸を指す。ある特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３１）に記載の配列を含む。

「新生物」とは、細胞または組織の病理学的増殖および他の組織または臓器へのその後の遊走または侵入を特徴とする疾患を意味する。新生物増殖は、典型的には、制御されず、進行性であり、正常細胞の複製を惹起しない、またはその停止を引き起こす条件下で起こる。新生物は、限定されるものではないが、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、グリア、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、尿道、子宮、および膣からなる群より選択される臓器、またはその組織もしくは細胞型を含む、様々な細胞型、組織、または臓器に影響し得る。新生物は、肉腫、癌腫、または形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）などのがんを含む。ある特定の実施形態では、新生物は、固形腫瘍である。

本開示の主題を使用することができる例示的な新生物として、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ球性白血病）、真性多血症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに肉腫および癌腫などの固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸部がん、子宮がん、精巣がん、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、シュワン腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫および網膜芽腫）が挙げられるがこれらに限定されない。

「受容体」とは、１つまたは複数のリガンドに選択的に結合する細胞膜上に存在するポリペプチド、またはその一部を意味する。

「認識する」とは、標的に選択的に結合することを意味する。腫瘍を認識するＴ細胞は、腫瘍抗原に結合する受容体（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ）を発現することができる。

「参照」または「対照」とは、比較の基準を意味する。例えば、ＣＡＲおよびｓｃＦｖを発現する細胞によるｓｃＦｖ－抗原結合のレベルを、ＣＡＲのみを発現する対応する細胞中でのｓｃＦｖ－抗原結合のレベルと比較することができる。

「分泌される」とは、小胞体、ゴルジ体を通る分泌経路によって、および細胞形質膜で一過的に融合する小胞として細胞から放出され、タンパク質を細胞の外部に放出するポリペプチドを意味する。

「シグナル配列」または「リーダー配列」とは、分泌経路へのその進入を指令する新しく合成されたタンパク質のＮ末端に存在するペプチド配列（例えば、５、１０、１５、２０、２５または３０アミノ酸）を意味する。例示的なリーダー配列としては、限定されるものではないが、ＩＬ－２シグナル配列：ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号１２）（ヒト）、ＭＹＳＭＱＬＡＳＣＶＴＬＴＬＶＬＬＶＮＳ（配列番号１３）（マウス）；カッパリーダー配列：ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号１４）（ヒト）、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号１５）（マウス）；ＣＤ８リーダー配列：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号１６）（ヒト）；トランケートされたヒトＣＤ８シグナルペプチド：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡ（配列番号２８）（ヒト）；アルブミンシグナル配列：ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＳＳＡＹＳ（配列番号２９）（ヒト）；およびプロラクチンシグナル配列：ＭＤＳＫＧＳＳＱＫＧＳＲＬＬＬＬＬＶＶＳＮＬＬＬＣＱＧＶＶＳ（配列番号３０）（ヒト）が挙げられる。「可溶性」とは、水性環境中で自由に拡散し得る（例えば、膜に結合していない）ポリペプチドを意味する。

「特異的に結合する」とは、目的の生体分子（例えば、ポリペプチド）を認識し、これに結合するが、試料、例えば、本開示のポリペプチドを天然に含む生体試料中の他の分子を実質的に認識せず、これに結合しないポリペプチドまたはその断片を意味する。

本明細書で使用される用語「腫瘍抗原」とは、正常な、または非ＩＳ新生物細胞と比較して腫瘍細胞上でユニークに、または示差的に発現される抗原（例えば、ポリペプチド）を指す。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、抗原認識受容体を介して免疫応答を活性化もしくは誘導することができる（例えば、ＣＤ１９、ＭＵＣ－１６）または受容体－リガンド結合を介して免疫応答を抑制することができる（例えば、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２、Ｂ７．１／２）腫瘍によって発現される任意のポリペプチドを含む。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、米国特許法においてそれらに帰する広い意味を有することが意図され、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味してもよい。

本明細書で使用される場合、「処置」とは、処置される個体または細胞の疾患経過を変更する試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の経過中に実施することができる。処置の治療効果としては、限定されるものではないが、疾患の発症または再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の縮小、転移の防止、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善が挙げられる。疾患または障害の進行を防止することによって、処置は、罹患した、もしくは診断された被験体または障害を有することが疑われる被験体における障害に起因する悪化を防止することができるだけでなく、処置は、障害のリスクがある、または障害を有することが疑われる被験体における障害または障害の症状の開始を防止することもできる。

本明細書における「個体」または「被験体」は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、哺乳動物などの脊椎動物である。哺乳動物としては、これらに限定されないが、ヒト、霊長類、家畜、競技用動物（ｓｐｏｒｔａｎｉｍａｌ）、齧歯類およびペットが挙げられる。非ヒト動物被験体の非限定的な例としては、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどの齧歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、ならびに類人猿およびサルなどの非ヒト霊長類が挙げられる。

用語「免疫無防備状態の」は、本明細書で使用される場合、免疫不全である被験体を指す。この被験体は、健康な免疫系を有する人物において疾患を通常は引き起こさないが、不十分に機能するまたは抑制された免疫系を有する人々を冒すことができる生物に起因する感染である、日和見感染に対して非常に脆弱である。

本開示の主題の他の態様は、以下の開示に記載され、本開示の主題の範囲内にある。

２．ＨＬＡ非依存的Ｔ細胞受容体（ＨＩ－ＴＣＲ）
本開示は、ＨＬＡ非依存的に目的の抗原に結合するＨＩ－ＴＣＲを提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、抗原の結合は、ＨＩ－ＴＣＲを含む免疫応答性細胞を活性化することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲは、抗原結合鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合鎖は、細胞外抗原結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、マウス、ヒトまたはラクダ科（例えば、ラマ）起源のｓｃＦｖ、Ｆａｂまたは抗体に由来する。ある特定の実施形態では、抗原結合鎖は、定常ドメインをさらに含む。

２．１．抗原
ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲは、腫瘍抗原に結合する。任意の腫瘍抗原（抗原性ペプチド）を、本明細書に記載の腫瘍関連実施形態において使用することができる。抗原の供給源としては、限定されるものではないが、がんタンパク質が挙げられる。抗原を、ペプチドとして、または無傷タンパク質もしくはその一部として発現させることができる。無傷タンパク質またはその一部は、天然であっても、または変異誘発されていてもよい。腫瘍抗原の非限定例としては、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＬＬ１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ４４Ｖ６、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に感染した細胞の抗原（例えば、細胞表面抗原）、上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）、上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、受容体チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂーＢ２、３、４（ｅｒｂ－Ｂ２、３、４）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、胎児アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体－α、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ－２）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、インターロイキン－１３受容体サブユニットアルファ－２（ＩＬ－１３Ｒα２）、κ軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＫＤＲ）、ＬｅｗｉｓＹ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、黒色腫抗原ファミリーＡ、１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ムチン１（ＭＵＣ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＥＲＢＢ２、ＭＡＧＥＡ３、ｐ５３、ＭＡＲＴ１、ＧＰ１００、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、がん精巣抗原ＮＹ－ＥＳ０－１、がん胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ－７２）、血管内皮増殖因子Ｒ２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）、およびウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ－１）、ＢＣＭＡ、ＮＫＣＳ１、ＥＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ－ＶＩＩＩ、ＣＤ９９、ＣＤ７０、ＡＤＧＲＥ２、ＣＣＲ１、ＬＩＬＲＢ２、ＬＩＬＲＢ４、ＰＲＡＭＥおよびＥＲＢＢが挙げられる。

ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲは、ＣＤ１９に結合する。ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲは、ヒトＣＤ１９ポリペプチドに結合する。ある特定の実施形態では、ヒトＣＤ１９ポリペプチドは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む。

ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲは、ＣＤ１９タンパク質の細胞外ドメインに結合する。

ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲは、例えば、免疫無防備状態の被験体における、病原体感染または他の感染症の処置および／または防止における使用のために、病原体抗原に結合する。病原体の非限定例としては、疾患を引き起こし得るウイルス、細菌、真菌、寄生生物および原生動物が挙げられる。

ウイルスの非限定的な例としては、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ＨＩＶ－１（ＨＤＴＶ－ＩＩＩ、ＬＡＶＥまたはＨＴＬＶ－ＩＩＩ／ＬＡＶとも称される）またはＨＩＶ－ＩＩＩ、およびＨＩＶ－ＬＰなどの他の単離菌など、ヒト免疫不全ウイルス）；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）、Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、胃腸炎を引き起こす株）、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）、Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）、Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボラウイルス）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器多核体ウイルス）、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルス）、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ハンタンウイルス、ブニヤ（bunga）ウイルス、フレ
ボウイルスおよびナイロ（Naira）ウイルス）、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイ
ルス）、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、レオウイルス、オルビウイルス（orbiviurses
）およびロタウイルス）、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ（パルボウイルス）、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（大部分のアデノウイルス）、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）、およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）、ならびに未分類ウイルス（例えば、デルタ肝炎の病原因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられる）、非Ａ、非Ｂ型肝炎の病原因子（クラス１＝内部的に伝染、クラス２＝非経口的に伝染（すなわち、Ｃ型肝炎）、ノーウォークおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）が挙げられる。

細菌の非限定的な例としては、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が挙げられる。感染性細菌の具体例としては、これらに限定されないが、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｓｐｓ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ（B群連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ（緑色連鎖球菌（viridans）群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性ｓｐｓ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｓｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｒａｃｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｓｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、ＲｉｃｋｅｔｔｓｉａおよびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｉｓｒａｅｌｌｉが挙げられる。

ある特定の実施形態では、病原体抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に存在するウイルス抗原、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に存在するウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に存在するウイルス抗原、またはインフルエンザウイルスに存在するウイルス抗原である。

２．２．細胞外抗原結合ドメイン
ある特定の実施形態では、抗原結合鎖は、細胞外抗原結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、抗原、例えば、腫瘍抗原または病原体抗原、例えば、節２．１に開示されている抗原に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、別の細胞外抗原結合ドメインと二量体化する（例えば、可変断片（Ｆｖ）を形成する）ことができ、二量体化された抗原結合ドメイン（例えば、Ｆｖ）は、抗原、例えば、腫瘍抗原または病原体抗原に特異的に結合する。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、細胞表面受容体のリガンドを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、細胞表面リガンドの受容体を含む。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、抗原、例えば、腫瘍抗原または病原体抗原に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、抗原結合鎖は、別の抗原結合鎖と二量体を形成することができる。ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲは、２個の異なる抗原結合鎖を含むヘテロ二量体を含む。ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲは、２個の同一の抗原結合鎖を含むホモ二量体を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合鎖は、１個または複数のジスルフィド連結を介して二量体化する。ある特定の実施形態では、抗原結合鎖は、１個または複数の同一のまたは異なる抗原結合鎖と三量体またはオリゴマーを形成することができる。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、別の細胞外抗原結合ドメインと二量体化する（例えば、可変断片（Ｆｖ）を形成する）ことができ、二量体化された抗原結合ドメイン（例えば、Ｆｖ）は、抗原、例えば、腫瘍抗原または病原体抗原に特異的に結合する。

ある特定の非限定的な実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲの細胞外抗原結合ドメイン（例えば、Ｆｖまたはそのアナログ）は、約２×１０^－７Ｍまたはそれ未満の解離定数（Ｋ_ｄ）で抗原に結合する。ある特定の実施形態では、Ｋ_ｄは、約２×１０^－７Ｍもしくはそれ未満、約１×１０^－７Ｍもしくはそれ未満、約９×１０^－８Ｍもしくはそれ未満、約１×１０^－８Ｍもしくはそれ未満、約９×１０^－９Ｍもしくはそれ未満、約５×１０^－９Ｍもしくはそれ未満、約４×１０^－９Ｍもしくはそれ未満、約３×１０^－９Ｍもしくはそれ未満、約２×１０^－９Ｍもしくはそれ未満、または約１×１０^－９Ｍもしくはそれ未満である。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｋ_ｄは、約３×１０^－９Ｍまたはそれ未満である。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｋ_ｄは、約１×１０^－９Ｍ～約３×１０^－７Ｍである。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｋ_ｄは、約１．５×１０^－９Ｍ～約３×１０^－７Ｍである。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｋ_ｄは、約１．５×１０^－９Ｍ～約２．７×１０^－７Ｍである。

細胞外抗原結合ドメインの結合（例えば、Ｆｖまたはそのアナログ中での）を、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）、またはウェスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらのアッセイはそれぞれ、一般的には、目的の複合体に特異的な標識された試薬（例えば、抗体、またはＦｖ）を用いることによって、特定の目的のタンパク質－抗体複合体の存在を検出する。例えば、Ｆｖを放射標識し、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）において使用することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるWeintraub,B., Principles of Radioimmunoassays, SeventhTrainingCourse on
Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March,1986を参照されたい）。放射性アイソトープを、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用などの手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出することができる。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、蛍光マーカーを用いて標識される。蛍光マーカーの非限定例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、およびｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＣｙＰｅｔ）、および黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、およびＹＰｅｔ）が挙げられる。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、ＴＣＲの抗原結合部分を含む。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合部分またはその断片を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および／または軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、必要に応じて架橋されているＦａｂを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、Ｆ（ａｂ）_２を含む。ある特定の実施形態では、前記の分子のいずれかが、異種配列との融合タンパク質に含まれて、細胞外抗原結合ドメインを形成することができる。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および／または軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含み、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌは、ＶＬまたはＶＨを含む別の細胞外抗原結合ドメインと二量体化する（例えば、可変断片（Ｆｖ）を形成する）ことができる。ある特定の実施形態では、Ｆｖは、ヒトＦｖである。ある特定の実施形態では、Ｆｖは、ヒト化Ｆｖである。ある特定の実施形態では、Ｆｖは、マウスＦｖである。ある特定の実施形態では、Ｆｖは、抗原－Ｆｃ融合タンパク質によりＦｖファージライブラリーをスクリーニングすることにより同定される。

関心のある抗原を標的とする追加的な細胞外抗原結合ドメインは、同じ抗原を標的とする既存のｓｃＦｖまたは既存の抗体のＦａｂ領域を配列決定することにより得ることができる。

ある特定の実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲの二量体化された細胞外抗原結合ドメインは、マウスＦｖである。ある特定の実施形態では、二量体化された細胞外抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ１９ポリペプチドに結合するＦｖである。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、ヒトＣＤ１９ポリペプチド（例えば、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ１９ポリペプチド）に特異的に結合するＦｖである。ある特定の実施形態では、配列番号９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０に記載されている。

ある特定の実施形態では、Ｆｖは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）を含む。ある特定の実施形態では、Ｆｖは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む。ある特定の実施形態では、Ｆｖは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈおよび配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％）相同であるか、または同一アミノ酸配列を含むＶ_Ｈを含む。例えば、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相同であるかまたは同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号８と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも９０％、または少なくとも約９５％）相同であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。例えば、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号８と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相同であるかまたは同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％）相同であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、および配列番号８と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％）相同または同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、および配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。

ある特定の実施形態では、Ｆｖは、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）を含む。ある特定の実施形態では、Ｆｖは、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む。ある特定の実施形態では、Ｆｖは、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、および配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４４と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％）相同または同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈを含む。例えば、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４４と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相同または同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４４に記載のアミノ酸（amino）配列を含むＶ_Ｈを含む。
ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４５と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％）相同であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。例えば、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４５と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相同または同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４４と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％）相同であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、および配列番号４５と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％）相同または同一であるアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ、および配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌを含む。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶ_ＨＣＤＲ１、配列番号２に記載のアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶ_ＨＣＤＲ２、および配列番号３に記載のアミノ酸配列、その保存的改変を含むＶ_ＨＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ１、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ２、および配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４に記載のアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶ_ＬＣＤＲ１、配列番号５に記載のアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶ_ＬＣＤＲ２、および配列番号６に記載のアミノ酸配列またはその保存的改変を含むＶ_ＬＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ１、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ２、および配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ１またはその保存的改変、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ２またはその保存的改変、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ３またはその保存的改変、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ１またはその保存的改変、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ２またはその保存的改変、および配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ３またはその保存的改変を含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、配列番号１に記載の配列を有するアミノ酸を含むＶ_ＨＣＤＲ１、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ２、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＨＣＤＲ３、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ１、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ２、および配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むＶ_ＬＣＤＲ３を含む。

本明細書で使用される場合、用語「保存的配列改変」とは、アミノ酸配列を含む本開示のＨＩ－ＴＣＲの結合特性に有意に影響も変更もしないアミノ酸改変を指す。保存的改変は、アミノ酸置換、付加および欠失を含んでもよい。改変を、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発などの、当技術分野で公知の標準的な技術によって本開示のＨＩ－ＴＣＲのＦｖ中に導入することができる。アミノ酸を、電荷および極性などのその物理化学的特性に従って群に分類することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同じ群内のアミノ酸で置き換えられるものである。例えば、アミノ酸を電荷によって分類することができる：正に荷電したアミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジンを含み、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸を含み、中性荷電アミノ酸は、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンを含む。さらに、アミノ酸を、極性によって分類することができる：極性アミノ酸は、アルギニン（塩基性極性）、アスパラギン、アスパラギン酸（酸性極性）、グルタミン酸（酸性極性）、グルタミン、ヒスチジン（塩基性極性）、リシン（塩基性極性）、セリン、トレオニン、およびチロシンを含み；非極性アミノ酸は、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、およびバリンを含む。したがって、ＣＤＲ領域内の１つまたは複数のアミノ酸を、同じ群に由来する他のアミノ酸残基と置き換え、変更された抗体を、本明細書に記載の機能アッセイを使用して、保持された機能（すなわち、上の（ｃ）から（ｌ）に記載の機能）について試験することができる。ある特定の実施形態では、特定の配列またはＣＤＲ領域内の１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下の残基が変更される。

特定の配列（例えば、配列番号７および配列番号８）に対する少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％（例えば、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％）の相同性を有するＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌアミノ酸配列は、特定の配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有してもよいが、標的抗原（例えば、ＣＤ１９）に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、合計１～１０個のアミノ酸が、特定の配列（例えば、配列番号７および配列番号８）において置換、挿入および／または欠失される。ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、細胞外抗原結合ドメインのＣＤＲの外部の領域中（例えば、ＦＲ中）に存在する。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、その配列（配列番号７および配列番号８）の翻訳後改変を含む、配列番号７および配列番号８からなる群より選択されるＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ配列を含む。

本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、２つの配列間の同一性パーセントと等価である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要がある、ギャップの数、およびそれぞれのギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、相同性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定を、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。

２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントを、ＰＡＭ１２０残基重み付け表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Comput.Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)）を使用して決定することができる。さ
らに、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントを、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（J.Mol.Biol.48:444-453 (1970)）を使
用して決定することができる。

さらに、またはあるいは、本開示の主題のアミノ酸配列を、例えば、関連する配列を同定するために、公共データベースに対する検索を実行するための「クエリー配列」としてさらに使用することができる。そのような検索を、Altschul,et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実行することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行して、本明細書に開示される特定の配列（例えば、ｓｃＦｖｍ９０３、ｍ９０４、ｍ９０５、ｍ９０６、およびｍ９００の重鎖および軽鎖可変領域配列）と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためのギャップ付きアラインメントを得るために、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを、Altschuletal.,(1997) Nucleic Acids Res.
25(17):3389-3402に記載のように使用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。

２．３．定常ドメイン
ある特定の実施形態では、抗原結合鎖は、定常ドメインをさらに含む。ある特定の実施形態では、定常ドメインは、ヒンジ／スペーサー領域および膜貫通ドメインを含む。ある特定の実施形態では、定常ドメインは、別の定常ドメインとホモ二量体またはヘテロ二量体を形成することができる。ある特定の実施形態では、定常ドメインは、１個または複数のジスルフィド連結を介して二量体化する。ある特定の実施形態では、抗原結合鎖は、１個または複数の同一のまたは異なる定常ドメインと三量体またはオリゴマーを形成することができる。

ある特定の非限定的な実施形態では、定常ドメインは、Ｔ細胞受容体定常領域、例えば、Ｔ細胞受容体アルファ定常領域（ＴＲＡＣ）、Ｔ細胞受容体ベータ定常領域（ＴＲＢＣ、例えば、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２）、Ｔ細胞受容体ガンマ定常領域（ＴＲＧＣ、例えば、ＴＲＧＣ１またはＴＲＧＣ２）、Ｔ細胞受容体デルタ定常領域（ＴＲＤＣ）、またはその任意のバリアントもしくは機能的断片を含む。

ある特定の実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲの定常ドメインは、天然または改変ＴＲＡＣペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＴＲＡＣポリペプチドは、以下に提供される配列番号３８に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは少なくとも約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、もしくはその断片を含む、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個まで、もしくは３個までの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。

ある特定の実施形態では、ＴＲＡＣポリペプチドは、ＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋＩＤ：２８７５５、ＮＧ＿００１３３２．３、範囲９２５６０３～９３０２２９（以下に提供される配列番号２９）の遺伝子によって発現される転写物によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは少なくとも約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、もしくはその断片を有する、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個まで、もしくは３個までの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。

本開示の主題によれば、「ＴＲＡＣ核酸分子」は、ＴＲＡＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

ある特定の実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲの定常ドメインは、天然または改変ＴＲＢＣペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲの定常ドメインは、天然または改変ＴＲＢＣ２ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＴＲＢＣ２ポリペプチドは、以下に提供される配列番号３９に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは少なくとも約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、もしくはその断片を含む、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個まで、もしくは３個までの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。

ある特定の実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲの定常ドメインは、天然または改変ＴＲＢＣ１ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＴＲＢＣ１ポリペプチドは、以下に提供される配列番号４０に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは少なくとも約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、もしくはその断片を含む、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個まで、もしくは３個までの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。

ある特定の実施形態では、ＴＲＢＣポリペプチドは、ＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋＩＤ：２８６３９、ＮＧ＿００１３３３．２、範囲６４５７４９～６４７１９６（ＴＲＢＣ１、配列番号３０）、ＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋＩＤ：２８６３８、ＮＧ＿００１３３３．２範囲６５５０９５～６５６５８３（ＴＲＢＣ２、配列番号３１）の遺伝子によって発現される転写物によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは少なくとも約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、もしくはその断片を有する、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個まで、もしくは３個までの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。

本開示の主題によれば、「ＴＲＢＣ核酸分子」は、ＴＲＢＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

ある特定の実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲの定常ドメインは、天然または改変ＴＲＧＣペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲの定常ドメインは、天然または改変ＴＲＧＣ１ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＴＲＧＣ１ポリペプチドは、以下に提供される、配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相同または同一であるアミノ酸配列を有する。

ある特定の実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲの定常ドメインは、天然または改変ＴＲＧＣ２ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＴＲＧＣ２ポリペプチドは、以下に提供される、配列番号４３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相同または同一であるアミノ酸配列を有する。

ある特定の実施形態では、ＴＲＧＣポリペプチドは、ＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋＩＤ：６９６６、ＮＧ＿００１３３６．２、範囲１０８２７０～１１３８６０（ＴＲＧＣ１、配列番号３２）、ＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋＩＤ：６９６７、ＮＧ＿００１３３６．２、範囲１２４３７６～１３３９２４（ＴＲＧＣ２、配列番号３３）の遺伝子によって発現される転写物によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％相同または同一であるアミノ酸配列、もしくはその断片を有する、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個まで、もしくは３個までの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。

本開示の主題によれば、「ＴＲＧＣ核酸分子」は、ＴＲＧＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

ある特定の実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲの定常ドメインは、天然または改変ＴＲＤＣペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＴＲＤＣポリペプチドは、以下に提供される配列番号４１に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相同または同一であるアミノ酸配列を有する。

ある特定の非限定的な実施形態では、Ｔ細胞受容体定常領域は、細胞外抗原結合ドメインを定常ドメインに連結するヒンジ／スペーサー領域を含む。ヒンジ／スペーサー領域は、抗原認識を容易にするために抗原結合ドメインを異なる向きに方向付けるのに十分な可撓性を有してもよい。ある特定の非限定的な実施形態では、ヒンジ／スペーサー領域は、ＩｇＧ１、もしくは免疫グロブリンのＣＨ_２ＣＨ_３領域、およびＣＤ３の部分、ＣＤ２８ポリペプチドの部分、ＣＤ８ポリペプチドの部分由来のヒンジ領域、それらと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％相同または同一である前記のいずれかの変形形態、または合成スペーサー配列であってもよい。ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＡＲのヒンジ／スペーサー領域は、ＣＤ３ζポリペプチド、ＣＤ４０ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＣＤ１６６ペプチド、ＣＤ１６６ペプチド、ＣＤ８ａペプチド、ＣＤ８ｂペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＩＣＡＭ－１ペプチド、ＣＴＬＡ－４ペプチド、合成ペプチド（免疫応答に関連するタンパク質に基づかない）、またはその組合せの天然または改変ヒンジ領域を含んでもよい。

２．４．細胞内シグナル伝達ドメイン
ある特定の非限定的な実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲは、細胞内ドメインを含まない抗原結合鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合鎖は、ＣＤ３ζポリペプチドと会合することができる。ある特定の実施形態では、抗原結合鎖は、ＣＤ３ζポリペプチドと会合することができる定常ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、内因性である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、外因性である。ある特定の実施形態では、抗原への抗原結合鎖の結合は、抗原結合鎖に会合したＣＤ３ζポリペプチドを活性化することができる。ある特定の実施形態では、外因性ＣＤ３ζポリペプチドは、本明細書に開示されている共刺激分子に融合されているまたはこれと一体化されている。

ある特定の非限定的な実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲは、細胞内ドメインを含む抗原結合鎖を含む。ある特定の実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、抗原への抗原結合鎖の結合は、抗原結合鎖のＣＤ３ζポリペプチドを活性化することができる。

活性化されたＣＤ３ζポリペプチドは、免疫応答性細胞（例えば、リンパ系系列の細胞、例えば、Ｔ細胞）を活性化および／または刺激することができる。ＣＤ３ζは、３個の免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ１、ＩＴＡＭ２およびＩＴＡＭ３）、３個のベーシック・リッチ・ストレッチ（basic-richstretch）（ＢＲＳ）領域（ＢＲＳ１、ＢＲＳ２およびＢＲＳ３）を含み、抗原が抗原結合鎖に結合された後に、細胞（例えば、リンパ系系列の細胞、例えば、Ｔ細胞）に活性化シグナルを伝達する。ＣＤ３ζ－鎖の細胞内シグナル伝達ドメインは、内因性ＴＣＲ由来のシグナルの一次伝達物質である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿９３２１７０（配列番号１７）、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０００７２５．１（配列番号１８）を有する配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％相同であるアミノ酸配列、もしくはその断片を含むか、もしくは有する、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個まで、もしくは３個までの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。ある特定の非限定的な実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、少なくとも２０、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０、および最大１６４アミノ酸長である、配列番号１７の連続する部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいは、またはさらに、非限定的な様々な実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸１～１６４、１～５０、５０～１００、１００～１５０、または１５０～１６４のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、ＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸５２～１６４のアミノ酸配列を含むか、または有する。
配列番号１７は、以下に提供される：

ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζポリペプチドを含む。ヒトＣＤ３ζポリペプチドは、配列番号１８と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、もしくはその断片を含むか、もしくはこれを有してもよい、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個まで、最大３個までの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。配列番号１８は、以下に提供される：

配列番号１８のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、以下に提供される配列番号１９に記載される。

２．４．１．共刺激領域
ある特定の非限定的な実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲは、細胞内ドメインを含む抗原結合鎖を含み、細胞内ドメインは、共刺激領域を含む。ある特定の実施形態では、細胞内ドメインは、共刺激領域およびＣＤ３ζポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、細胞内ドメインは、共刺激領域を含み、ＣＤ３ζポリペプチドを含まない。

ある特定の実施形態では、共刺激領域は、最適なリンパ球活性化をもたらすことができる少なくとも１個の共刺激分子を含む。本明細書で使用される場合、「共刺激分子」とは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答にとって必要とされる抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子を指す。少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８ポリペプチド、４－１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＤＡＰ－１０ポリペプチド、またはその組合せを含んでもよい。共刺激分子は、その受容体への結合時に、共刺激応答、すなわち、抗原がそのＣＡＲ分子に結合するときに提供される刺激をもたらす細胞内応答を生成する細胞表面上に発現されるタンパク質である共刺激リガンドに結合することができる。共刺激リガンドとしては、限定されるものではないが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、および４－１ＢＢＬが挙げられる。一例として、４－１ＢＢリガンド（すなわち、４－１ＢＢＬ）は、ＣＡＲシグナルと共に、ＣＡＲ^＋Ｔ細胞のエフェクター細胞機能を誘導する細胞内シグナルを提供するために４－１ＢＢ（「ＣＤ１３７」としても知られる）に結合し得る。４－１ＢＢ、ＩＣＯＳまたはＤＡＰ－１０を含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４４６，１９０号に開示されている。

ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲの抗原結合鎖の共刺激領域は、ＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ＣＤ２８ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：Ｐ１０７４７もしくはＮＰ＿００６１３０（配列番号２０）を有する配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、もしくはその断片を含むか、もしくは有してもよい、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個まで、もしくは３個までの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。非限定的なある特定の実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、少なくとも２０、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０、および最大で２２０アミノ酸長である、配列番号２０の連続する部分であるアミノ酸配列を含むか、または有する。あるいは、またはさらに、非限定的な様々な実施形態では、ＣＤ２８ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸１～２２０、１～５０、５０～１００、１００～１５０、１１４～２２０、１５０～２００、または２００～２２０のアミノ酸配列を含むか、または有する。ある特定の実施形態では、共刺激領域は、配列番号２０のアミノ酸１８０～２２０のアミノ酸配列を含むか、または有するＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。

ある特定の実施形態では、共刺激領域は、ＣＤ２８のヒト細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ２８のヒト細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２１と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、もしくはその断片を含むか、もしくは有してもよい、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個まで、もしくは３個までの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。配列番号２１は、以下に提供される：

配列番号２１のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、以下に提供される配列番号２２に記載される。

ある特定の実施形態では、共刺激領域は、２個の共刺激分子を含む共刺激シグナル伝達領域、例えば、ＣＤ２８および４－１ＢＢの共刺激シグナル伝達領域、またはＣＤ２８およびＯＸ４０の共刺激シグナル伝達領域を含む。

４－１ＢＢは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドとして作用することができ、刺激活性を有する。４－１ＢＢポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：Ｐ４１２７３もしくはＮＰ＿００１５５２（配列番号２３）を有する配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、もしくはその断片を含むか、もしくはこれを有してもよい、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個まで、もしくは３個までの保存的アミノ酸置換を必要に応じて含んでもよい。
配列番号２３は、以下に提供される：

本開示の主題によれば、「４－１ＢＢ核酸分子」は、４－１ＢＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

ある特定の実施形態では、共刺激領域は、４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２４と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、もしくはその断片を含むもしくはこれを有してもよい、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個必要に応じて、もしくは３個までの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。配列番号２４は、以下に提供される：

配列番号２４のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は、以下に提供される配列番号２７に記載される。

ＯＸ４０ポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：Ｐ４３４８９もしくはＮＰ＿００３３１８（配列番号２５）を有する配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、もしくはその断片を含むか、もしくはこれを有してもよい、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個まで、もしくは３個までの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。
配列番号２５は、以下に提供される：

本開示の主題によれば、「ＯＸ４０核酸分子」は、ＯＸ４０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

ＩＣＯＳポリペプチドは、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０３６２２４（配列番号２６）を有する配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、もしくはその断片を含むか、もしくはこれを有してもよい、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個まで、もしくは３個までの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。
配列番号２６は、以下に提供される：

本開示の主題によれば、「ＩＣＯＳ核酸分子」は、ＩＣＯＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

ある特定の実施形態では、異なるタンパク質に由来するＣＡＲのドメイン／モチーフ／領域の間の変異部位および／または接合部は、脱免疫化される。異なるＣＡＲ部分間の接合部の免疫原性を、ＮｅｔＭＨＣ４．０サーバーを使用して予測することができる。次の部分に由来する少なくとも１ａａを含有するそれぞれのペプチドについて、全対立遺伝子に関するＨＬＡＡ、ＢおよびＣに対する結合親和性を予測することができる。それぞれのペプチドの免疫原性のスコアを、それぞれのペプチドに割り当てることができる。免疫原性スコアを、式：免疫原性スコア＝［（５０－結合親和性）＊ＨＬＡ頻度］_ｎを使用して計算することができる。ｎはそれぞれのペプチドに関する予測数である。

２．５．ＣＤ３複合体
ある特定の実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲは、ＣＤ３複合体と会合することができる（「Ｔ細胞共受容体」としても公知）。ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲおよびＣＤ３複合体は、天然ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と同様の抗原認識受容体複合体を形成する。ある特定の実施形態では、ＣＤ３複合体は、内因性である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３複合体は、外因性である。ある特定の実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲは、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体における天然および／または内因性ＴＣＲに置き換わる。ある特定の実施形態では、ＣＤ３複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２個のＣＤ３ε鎖を含む。

ある特定の実施形態では、ＣＤ３γ鎖は、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００００６４．１（以下に提供される配列番号３４）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、もしくはその断片を含むか、もしくはこれを有してもよい、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個まで、もしくは３個までの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。

ある特定の実施形態では、ＣＤ３δ鎖は、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０００７２３．１（以下に提供される配列番号３５）、ＮＰ＿００１０３５７４１．１（以下に提供される配列番号３６）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、もしくはその断片を含むか、もしくはこれを有してもよい、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個まで、もしくは３個までの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。

ある特定の実施形態では、ＣＤ３ε鎖は、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿０００７２４．１（以下に提供される配列番号３７）と少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、もしくは約１００％相同もしくは同一であるアミノ酸配列、もしくはその断片を含むか、もしくはこれを有する、および／または必要に応じて、１個まで、もしくは２個まで、もしくは３個までの保存的アミノ酸置換を含んでもよい。

ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲは、同じ抗原を標的とするＣＡＲよりも大きい抗原感受性を示す。ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲは、腫瘍細胞の表面に低密度で存在する抗原に結合すると、免疫応答を誘導することができる。ある特定の実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲを含む免疫応答性細胞を使用して、例えば、疾患の再発により、低い発現レベルの表面抗原を有する腫瘍細胞を有する被験体を処置することができ、被験体は、残存腫瘍細胞をもたらす処置を受けたことがある。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、腫瘍細胞の表面に低密度の標的分子を有する。ある特定の実施形態では、細胞表面に低密度で存在する標的分子は、細胞１個当たり約５，０００分子未満、細胞１個当たり約４，０００分子未満、細胞１個当たり約３，０００分子未満、細胞１個当たり約２，０００分子未満、細胞１個当たり約１，５００分子未満、細胞１個当たり約１，０００分子未満、細胞１個当たり約５００分子未満、細胞１個当たり約２００分子未満、または細胞１個当たり約１００分子未満の密度を有する。ある特定の実施形態では、細胞表面に低密度で存在する標的分子は、細胞１個当たり約２，０００分子未満の密度を有する。ある特定の実施形態では、細胞表面に低密度で存在する標的分子は、細胞１個当たり約１，５００分子未満の密度を有する。ある特定の実施形態では、細胞表面に低密度で存在する標的分子は、細胞１個当たり約１，０００分子未満の密度を有する。ある特定の実施形態では、細胞表面に低密度で存在する標的分子は、細胞１個当たり約４，０００分子～細胞１個当たり約２，０００分子の間、細胞１個当たり約２，０００分子～細胞１個当たり約１，０００分子、細胞１個当たり約１，５００分子～細胞１個当たり約１，０００分子、細胞１個当たり約２，０００分子～細胞１個当たり約５００分子、細胞１個当たり約１，０００分子～細胞１個当たり約２００分子、または細胞１個当たり約１，０００分子～細胞１個当たり約１００分子の密度を有する。

２．６．ＨＩ－ＴＣＲ１９
ある特定の実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲは、二量体化することができる２個の抗原結合鎖、例えば、ＶＬ－ＴＲＡＣおよびＶＨ－ＴＲＢＣを含み、ＨＩ－ＴＣＲは、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に結合する。

ＶＬ－ＴＲＡＣ
ある特定の実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲは、抗体のＶ_Ｌドメインの細胞外抗原結合ドメインおよびＴＲＡＣの定常ドメインを含む抗原結合鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に結合する。ある特定の実施形態では、抗原結合鎖は、「ＶＬ－ＴＲＡＣ」と命名される。

ＶＨ－ＴＲＢＣ
ある特定の実施形態では、本開示のＨＩ－ＴＣＲは、抗体のＶ_Ｈドメインの細胞外抗原結合ドメインおよびＴＲＢＣの定常ドメインを含む抗原結合鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、ＣＤ１９（例えば、ヒトＣＤ１９）に結合する。ある特定の実施形態では、抗原結合鎖は、「ＶＨ－ＴＲＢＣ」と命名される。

３．免疫応答性細胞
本開示の主題は、本開示のＨＩ－ＴＣＲを含む免疫応答性細胞を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲは、免疫応答性細胞を活性化することができる。抗原への結合により、免疫応答性細胞は、抗原を有する細胞に対する細胞溶解効果を示す。ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲを含む免疫応答性細胞は、同じ抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞と比較して、同等のまたはより良い治療効力を示す。ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲを含む免疫応答性細胞は、同じ抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞と比較して、同等のまたはより良い細胞溶解効果を示す。ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲを含む免疫応答性細胞は、抗腫瘍サイトカインを分泌する。免疫応答性細胞により分泌されるサイトカインとしては限定されるものではないが、ＴＮＦα、ＩＦＮγおよびＩＬ２が挙げられる。

本開示の主題の免疫応答性細胞は、リンパ系の細胞であってよい。Ｂ、Ｔおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含むリンパ系は、抗体生成、細胞性免疫系の調節、血液中の外来作用物質の検出、宿主にとって外来の細胞の検出などを可能にする。リンパ系の免疫応答性細胞の非限定的な例には、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫＴ）細胞、胚性幹細胞および多能性幹細胞を含むその前駆細胞が含まれる（例えば、リンパ系細胞を分化させることができるもの）。Ｔ細胞は、胸腺で成熟し、主に細胞媒介性免疫の役割を担うリンパ球であってよい。Ｔ細胞は、適応免疫系に関与する。本開示の主題のＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞（セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞（または、幹様メモリーＴ細胞）および２つのタイプのエフェクターメモリーＴ細胞：例えば、Ｔ_ＥＭ細胞およびＴ_ＥＭＲＡ細胞を含む）、調節性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞としても公知）、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連の不変Ｔ細胞およびγδＴ細胞を限定されずに含む、任意のタイプのＴ細胞であってよい。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬまたはキラーＴ細胞）は、感染した体細胞または腫瘍細胞の死を誘導することが可能なＴリンパ球のサブセットである。患者自身のＴ細胞は、ＨＩ－ＴＣＲの導入を通して特異的抗原を標的にするように遺伝子改変することができる。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞であってよい。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞である。

ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、外因性または組換えの少なくとも１種の共刺激リガンドを含む（例えば、細胞は、これを形質導入されている）。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、ＨＩ－ＴＣＲおよび少なくとも１種の外因性共刺激リガンドを同時発現する。ＨＩ－ＴＣＲおよび少なくとも１種の外因性共刺激リガンドの間の相互作用は、免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）の完全活性化に重要な非抗原特異的シグナルをもたらす。共刺激リガンドとして、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンドのメンバーが挙げられるがこれらに限定されない。ＴＮＦは、全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を刺激する。その主要な役割は、免疫細胞の調節にある。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、多数の共通特色を共有する。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの大部分は、短い細胞質セグメントおよび相対的に長い細胞外領域を含有するＩＩ型膜貫通タンパク質（細胞外Ｃ末端）として合成される。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーとして、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０Ｌ）／ＣＤ１５４、ＣＤ１３７Ｌ／４－１ＢＢＬ、ＴＮＦ－α、ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ２５２、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ３０Ｌ／ＣＤ１５３、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）／リンホトキシン－アルファ（ＬＴα）、リンホトキシン－ベータ（ＬＴβ）、ＣＤ２５７／Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）／Ｂｌｙｓ／ＴＨＡＮＫ／Ｔａｌｌ－１、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）およびＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）が挙げられるがこれらに限定されない。免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーは、細胞の認識、結合または接着プロセスに関与する、細胞表面および可溶性タンパク質の大きい群である。これらのタンパク質は、免疫グロブリンと構造的特色を共有し、それらは、免疫グロブリンドメイン（フォールド）を保有する。免疫グロブリンスーパーファミリーリガンドとして、両者ともＣＤ２８のリガンドである、ＣＤ８０およびＣＤ８６が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、少なくとも１種の共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬ、ＣＤ２７５、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＴＮＦＲＳＦ１４、およびその組合せからなる群より選択される。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、１種の外因性または組換え共刺激リガンドを含む、またはそれからなる。ある特定の実施形態では、１種の外因性または組換え共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬまたはＣＤ８０である。ある特定の実施形態では、１種の外因性または組換え共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬである。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、２種の外因性または組換え共刺激リガンドを含む、またはそれからなる。ある特定の実施形態では、２種の外因性または組換え共刺激リガンドは、４－１ＢＢＬおよびＣＤ８０である。

ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、少なくとも１種のキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）を含む、または形質導入することができる。本明細書で使用される場合、用語「キメラ共刺激受容体」または「ＣＣＲ」は、抗原に結合し、それが抗原に結合することにより、ＣＣＲを含む細胞（例えば、Ｔ細胞）に共刺激シグナルをもたらすが、単独では細胞に活性化シグナルをもたらさない、キメラ受容体を指す。ＣＣＲは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Krause,et al., J. Exp. Med. (1998);188(4):619-626およびＵＳ２００２００１８７８３に記載されている。ＣＣＲは、共刺激シグナルを模倣するが、ＣＡＲとは異なり、Ｔ細胞活性化シグナルをもたらさず、例えば、ＣＣＲは、ＣＤ３ζポリペプチドを欠如する。ＣＣＲは、抗原提示細胞における天然共刺激リガンドの非存在下で、共刺激、例えば、ＣＤ２８様シグナルをもたらす。コンビナトリアル抗原認識、すなわち、ＣＡＲと組み合わせたＣＣＲの使用は、二重抗原発現Ｔ細胞に対するＴ細胞反応性を増大させ、これにより、選択的腫瘍標的化を改善することができる。その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０５５６６８を参照されたい。Ｋｌｏｓｓらは、各抗原を個々に発現する細胞を温存しつつ、抗原の組合せを発現する標的細胞を排除するＴ細胞を生成するために、コンビナトリアル抗原認識、別々のシグナル伝達、ならびに重大な意味を持つことに、平衡を保たれた強度のＴ細胞活性化および共刺激を統合する戦略について記載する（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるKlossetal., Nature Biotechnololgy (2013);31(1):71-75）。このアプローチにより、Ｔ細胞
活性化は、ある１種の抗原のＣＡＲ媒介性認識を要求する一方、共刺激は、独立して、第２の抗原に特異的なＣＣＲによって媒介される。腫瘍選択性を達成するために、コンビナトリアル抗原認識アプローチは、第２の抗原の同時ＣＣＲ認識によってもたらされるレスキューなしで無効となるレベルまで、Ｔ細胞活性化の効率を縮小する。

ある特定の実施形態では、ＣＣＲは、第２の抗原に結合する細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも１個の共刺激分子を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、ＣＣＲは、単独では、細胞に活性化シグナルを送達しない。共刺激分子の非限定的な例として、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ－１０およびその任意の組合せが挙げられる。ある特定の実施形態では、ＣＣＲの共刺激シグナル伝達領域は、１個の共刺激シグナル伝達分子を含む。ある特定の実施形態では、１個の共刺激シグナル伝達分子は、ＣＤ２８である。ある特定の実施形態では、１個の共刺激シグナル伝達分子は、４－１ＢＢである。ある特定の実施形態では、ＣＣＲの共刺激シグナル伝達領域は、２個の共刺激シグナル伝達分子を含む。ある特定の実施形態では、２個の共刺激シグナル伝達分子は、ＣＤ２８および４－１ＢＢである。第２の抗原は、第１の抗原および第２の抗原の両方の発現が、標的化された細胞（例えば、がん性組織またはがん性細胞）に制限されるように選択される。ＣＡＲと同様に、細胞外抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、または細胞外抗原結合ドメインを形成するための異種配列を有する融合タンパク質であり得る。

ある特定の実施形態では、ＣＣＲは、ＣＣＲが結合する抗原とは異なる抗原に結合するＨＩ－ＴＣＲと同時発現され、例えば、ＨＩ－ＴＣＲは、第１の抗原に結合し、ＣＣＲは、第２の抗原に結合する。

本開示の主題のヒトリンパ球のタイプには、限定されずに、末梢ドナーリンパ球、例えば、Sadelain,M.,et al. 2003 Nat RevCancer 3:35-45（ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球を開示する）、Morgan,R.A.,et al. 2006Science 314:126-129（αおよびβヘテロ二量体を含む完全長腫瘍抗原認識Ｔ細胞受容体複合体を発現す
るように遺伝子改変された末梢ドナーリンパ球を開示する）、Panelli,M.C.,et al. 2000
J Immunol 164:495-504；Panelli, M.C., et al. 2000 JImmunol164:4382-4392（腫瘍生検における腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来するリンパ球培養を開示する）、およびDupont,J., etal. 2005Cancer Res 65:5417-5427；Papanicolaou, G.A., et al. 2003Blood102:2498-2505（人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）またはパルス処理樹状細胞を用いた選
択的にｉｎｖｉｔｒｏ増大させた抗原特異的末梢血白血球を開示する）に開示されるものが含まれる。免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）は、自己、非自己（例えば、同種異系）であってよく、または操作された前駆細胞もしくは幹細胞からｉｎｖｉｔｒｏで誘導することができる。

本開示の免疫応答性細胞は、腫瘍微小環境をモジュレートすることが可能である。腫瘍は、免疫認識および排除からそれ自身を保護するための悪性細胞による一連の機構を含む、宿主免疫応答に敵対する微小環境を有する。この「敵対的な腫瘍微小環境」は、浸潤調節ＣＤ４^＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、ＴＧＦ－βを含む免疫抑制サイトカインを含む様々な免疫抑制因子、および、活性化Ｔ細胞（ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１）によって発現される免疫抑制受容体を標的にするリガンドの発現を含む。免疫抑制のこれらの機構は、寛容の維持および不適当な免疫応答の抑制において役割を果たすが、腫瘍微小環境の中では、これらの機構は有効な抗腫瘍免疫応答を妨げる。まとめると、これらの免疫抑制因子は、標的化腫瘍細胞との遭遇の際に養子的に導入されるＣＡＲ改変Ｔ細胞の顕著なアナジーまたはアポトーシスを誘導することができる。

ＣＴＬの精製されていない供給源は、当技術分野で公知の任意のもの、例えば、骨髄、胎児、新生児または成人または他の造血細胞供給源、例えば、胎児の肝臓、末梢血またはさい帯血であってよい。細胞を分離するために、様々な技術を用いることができる。例えば、負の選択方法は、最初に非ＣＴＬを除去することができる。正と負の両方の選択のための、特定の細胞系統および／または分化のステージに関連したマーカーを同定するために、ｍＡｂは特に有用である。

比較的粗い分離によって、大きな割合の最終分化細胞を最初に除去することができる。例えば、磁気ビーズ分離を最初に使用して多数の無関係な細胞を除去することができる。ある特定の実施形態では、全造血細胞の少なくとも約８０％、通常少なくとも約７０％が細胞単離の前に除去される。

分離の手順には、限定されずに、密度勾配遠心分離；再凝固（resetting）；細胞密度
を改変する粒子とのカップリング；抗体でコーティングされた磁気ビーズによる磁気分離；親和性クロマトグラフィー；補体および細胞毒素を限定されずに含む、ｍＡｂに連結されるかもしくはそれと併用される細胞傷害剤；ならびに、固体マトリックス、例えばプレート、チップに付着した抗体によるパニング、エラトリエーションまたは任意の他の便利な技術が含まれる。

分離および分析の技術には、限定されずにフローサイトメトリーが含まれ、それは様々な程度の洗練度、例えば、複数のカラーチャネル、低角度および鈍角の光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルを有することができる。

ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）などの死細胞に関連した色素を用いることによって、細胞を死細胞に対して選択することができる。ある特定の実施形態では、２％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）もしくは０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む培地、または任意の他の好適な、例えば、無菌の、等張性の培地で細胞は収集される。

４．ベクター
免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫＴ細胞）の遺伝子改変は、組換えＤＮＡ構築物によって実質的に均一な細胞組成物を形質導入することによって達成することができる。ある特定の実施形態では、細胞へのＤＮＡ構築物の導入のために、レトロウイルスベクター（ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルスのいずれか）が用いられる。例えば、ＨＩ－ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドをレトロウイルスベクターにクローニングすることができ、その内因性のプロモーターから、レトロウイルスの末端反復配列から、または目的の標的細胞型に特異的であるプロモーターから発現を引き起こすことができる。非ウイルスベクターを、同様に使用することができる。

最初に免疫応答性細胞を、ＨＩ－ＴＣＲを含むように遺伝子改変する場合、レトロウイルスベクターを一般的に形質導入のために使用するが、他の任意の適したウイルスベクターまたは非ウイルス送達系を使用することができる。ＨＩ－ＴＣＲは、単一の多シストロン発現カセットにおいて、単一のベクターの複数の発現カセットにおいて、または複数のベクターにおいて補助分子（例えば、サイトカイン）と共に構築することができる。ポリシストロニック発現カセットを作製するエレメントの例には、様々なウイルスおよび非ウイルスの配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ、例えば、ＦＧＦ－１ＩＲＥＳ、ＦＧＦ－２ＩＲＥＳ、ＶＥＧＦＩＲＥＳ、ＩＧＦ－ＩＩＩＲＥＳ、ＮＦ－κＢＩＲＥＳ、ＲＵＮＸ１ＩＲＥＳ、ｐ５３ＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、アフトウイルスＩＲＥＳ、ピコルナウイルスＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳ、および脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ）、および切断可能リンカー（例えば、２Ａペプチド、例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａペプチド）が挙げられるがこれらに限定されない。キャプシドタンパク質がヒト細胞に感染するために機能的である場合には、レトロウイルスベクターと適切なパッケージング系の組合せもまた適している。ＰＡ１２（Miller,et al.(1985)Mol. Cell. Biol. 5:431-437）；ＰＡ３１７（Miller,etal.(1986)Mol. Cell.Biol. 6:2895-2902）；およびＣＲＩＰ（Danos, et al. (1988) Proc.Natl.Acad. Sci. USA85:6460-6464）が挙げられるがこれらに限定されない様々な両栄養性ウイルス産生細胞株が公知である。非両栄養性粒子、例えばＶＳＶＧ、ＲＤ１１４またはＧＡＬＶエンベロープによってシュードタイプ化した粒子、および当技術分野で公知の他の任意の粒子もまた適している。

形質導入の可能な方法には、例えば、Bregni, et al.(1992)Blood 80:1418-1422の方法による産生細胞との細胞の直接の共培養、または、例えば、Xu,et al. (1994) Exp.Hemat.22:223-230；およびHughes, et al. (1992) J. Clin. Invest.89:1817の方法による、ウイルス上清だけとのもしくは適当な増殖因子およびポリカチオンを伴うまたは伴わない濃縮ベクターストックとの培養が含まれる。

免疫応答性細胞を改変するために、他の形質導入ウイルスベクターを使用することができる。ある特定の実施形態では、選択されるベクターは、高効率の感染と安定した組入れおよび発現を示す（例えば、Cayouetteet al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997；Kido etal.,Current Eye Research15:833-844, 1996；Bloomer et al., Journal ofVirology71:6641-6649, 1997；Naldiniet al., Science 272:263-267, 1996およびMiyoshietal.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.94:10319, 1997を参照）。使用することができる他のウイルスベクターには、例えば、アデノウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルスまたはヘルペスウイルス、例えばエプスタインバーウイルスが含まれる（例えば、Miller,HumanGeneTherapy 15-14, 1990；Friedman, Science 244:1275-1281, 1989；Eglitisetal.,BioTechniques 6:608-614, 1988；Tolstoshev et al., CurrentOpinioninBiotechnology 1:55-61, 1990；Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991；Cornettaetal.,Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987；Anderson,Science226:401-409,1984；Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991；Miller et al.,Biotechnology7:980-990,1989；LeGal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993およびJohnson,Chest107:77S-83S, 1995のベ
クターも参照）。レトロウイルスのベクターは特によく開発され、臨床場面で使用されている（Rosenberget al.,N. Engl. J. Med323:370, 1990；Anderson et al.、米国特許第５，３９９，３４６号）。

免疫応答性細胞の遺伝子改変のために、非ウイルスアプローチを用いることもできる。例えば、リポフェクションの存在下で核酸を投与することによって（Feigneret al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987；Onoetal., NeuroscienceLetters 17:259, 1990；Brigham et al., Am. J. Med.Sci.298:278, 1989；Staubinger etal., Methods
in Enzymology 101:512, 1983）、アシアロオロソムコイド－ポリリシンコンジュゲーション（Wuetal., Journal ofBiological Chemistry 263:14621, 1988；Wu et al., JournalofBiological Chemistry264:16985, 1989）、または外科的条件下のマイクロインジェクション（Wolff etal.,Science 247:1465, 1990）によって、核酸分子を免疫応答性細胞に導入することができる。遺伝子導入のための他の非ウイルス手段には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法およびプロトプラスト融合を使用したｉｎｖｉｔｒｏトランスフェクションが含まれる。細胞へのＤＮＡの送達のために、リポソームも潜在的に有益であり得る。被験体の罹患組織への正常な遺伝子の移植は、培養可能な細胞型（例えば、自己または異種初代細胞またはその後代）に正常な核酸をｅｘｖｉｖｏで導入することによって達成することもでき、その後、細胞（または、その後代）は、標的化組織に注射されるか、全身的に注射される。組換え受容体は、トランスポザーゼまたは標的化ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ）を使用して誘導するか得ることもできる。ＲＮＡ電気穿孔法によって、一時的な発現を得ることができる。ある特定の実施形態では、組換え受容体は、トランスポゾンに基づくベクターによって導入することができる。ある特定の実施形態では、トランスポゾンに基づくベクターは、トランスポゾン（別名、転移因子）を含む。ある特定の実施形態では、トランスポゾンは、トランスポサーゼによって認識することができる。ある特定の実施形態では、トランスポサーゼは、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙトランスポサーゼである。

クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、原核細胞で発見されたゲノム編集ツールである。ゲノム編集のために利用される場合、このシステムはＣａｓ９（そのガイドとしてｃｒＲＮＡを利用してＤＮＡを改変することができるタンパク質）、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９と活性複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ（一般的にヘアピンループの形態）に結合する領域とともにそれを宿主ＤＮＡの正しい部分に誘導するためにＣａｓ９によって使用されるＲＮＡを含有する）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡに結合してＣａｓ９と活性複合体を形成する）、およびＤＮＡ修復鋳型（特異的ＤＮＡ配列の挿入を可能にする細胞修復プロセスを誘導するＤＮＡ）の必要に応じた部分を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、標的細胞をトランスフェクトするために、プラスミドをしばしば用いる。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９が細胞の中の標的ＤＮＡを同定し、それに直接的に結合するために使用する配列であるので、各適用のために設計する必要がある。ＣＡＲ発現カセットを有する修復鋳型もまた、切断のいずれかの側の配列と重複し、挿入配列をコードしなければならないので、各適用のために設計する必要がある。複数のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを一緒にパッケージして、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成することができる。細胞にトランスフェクトさせるために、このｓｇＲＮＡをＣａｓ９遺伝子と一緒に連結させ、プラスミドにすることができる。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は人工制限酵素であり、それは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合性ドメインをＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることによって生成される。ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガーヌクレアーゼがゲノムの中の所望の配列を標的にすることを可能にする特異的ＤＮＡ配列を標的にするように操作することができる。個々のＺＦＮのＤＮＡ結合性ドメインは、複数の個々のジンクフィンガー反復配列を一般的に含有し、複数の塩基対を各々認識することができる。新しいジンクフィンガードメインを生成する最も一般的な方法は、公知の特異性のより小さいジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。ＺＦＮにおける最も一般的な切断ドメインは、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩからの非特異的切断ドメインである。内因性相同組換え（ＨＲ）機構およびＣＡＲ発現カセットを有する相同性ＤＮＡ鋳型を使用して、ＣＡＲ発現カセットをゲノムに挿入するためにＺＦＮを使用することができる。標的化配列がＺＦＮによって切断される場合、ＨＲ機構は損傷染色体と相同性ＤＮＡ鋳型の間の相同性を検索し、次に、染色体の２つの切断末端の間の鋳型の配列をコピーし、それによって相同性ＤＮＡ鋳型をゲノムに組み入れる。

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＤＮＡの特異的配列を切断するように操作することができる制限酵素である。ＴＡＬＥＮシステムは、ＺＦＮとほとんど同じ原理で作動する。それらは、転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合性ドメインをＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることによって生成される。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、特異的ヌクレオチドのために強力な認識を有する２つの可変位置を有する３３～３４アミノ酸の反復モチーフで構成される。これらのＴＡＬＥのアレイをアセンブルすることによって、所望のＤＮＡ配列に結合し、それによってゲノムの特異的位置で切断するようにヌクレアーゼを誘導するように、ＴＡＬＥＤＮＡ結合性ドメインを操作することができる。ポリヌクレオチド療法で使用するためのｃＤＮＡ発現は、任意の好適なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはメタロチオネインプロモーター）から誘導することができ、任意の適当な哺乳動物の調節エレメントまたはイントロン（例えば、伸長因子１ａエンハンサー／プロモーター／イントロン構造）によって調節することができる。例えば、所望により、核酸の発現を誘導するために、特異的細胞型において遺伝子発現を優先的に誘導することが公知のエンハンサーを使用することができる。使用されるエンハンサーには、限定されずに、組織または細胞特異的エンハンサーとして特徴付けられるものを含めることができる。あるいは、ゲノムクローンが治療構築物として使用される場合、同族の調節配列によって、または、所望により、上記のプロモーターまたは調節エレメントのいずれかを含む、異種供給源に由来する調節配列によって調節を媒介することができる。

結果として生じる細胞は未改変の細胞のためのものと類似した条件の下で成長させることができ、それによって、改変された細胞を様々な目的のために増大させ、使用することができる。

６．ゲノム編集方法
ある特定の非限定的な実施形態では、本明細書に開示されているＨＩ－ＴＣＲ、共刺激リガンド、ＣＣＲまたは他のいずれかの分子／導入遺伝子は、改変されたゲノム遺伝子座を介して、免疫応答性細胞によって発現される。ある特定の実施形態では、導入遺伝子の発現カセットは、標的化されたゲノム編集方法により、免疫応答性細胞の標的化されたゲノム遺伝子座に組み込まれる。ある特定の実施形態では、標的化されたゲノム遺伝子座は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ２４７、Ｂ２Ｍ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＧＣ１および／またはＴＲＧＣ２遺伝子座であり得る。

６．１．Ｔ細胞受容体遺伝子座の操作
ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲは、改変された内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座を介して、免疫応答性細胞によって発現される。ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲ発現カセットは、内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座に組み込まれる。ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲ発現カセットは、Ｔ細胞受容体アルファ遺伝子座（ＴＲＡ、ＧｅｎＢａｎｋ
ＩＤ：６９５５）内に組み込まれる。ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲ発現カセットは、Ｔ細胞受容体ベータ遺伝子座（ＴＲＢ、ＧｅｎＢａｎｋＩＤ：６９５７）内に組み込まれる。ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲ発現カセットは、Ｔ細胞受容体ガンマ遺伝子座（ＴＲＧ、ＧｅｎＢａｎｋＩＤ：６９６５）内に組み込まれる。

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインおよびＴＣＲ定常ドメインが、ＨＩ－ＴＣＲの１個の抗原結合鎖に含まれるように、ＨＩ－ＴＣＲ発現カセットは、ＴＣＲ定常ドメイン遺伝子座の第１のエクソンに組み込まれる細胞外抗原結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ定常ドメイン遺伝子座は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＧＣ１またはＴＲＧＣ２であり得る。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインおよびＴＲＡＣペプチドが、ＨＩ－ＴＣＲの第１の抗原結合鎖に含まれるように、ＨＩ－ＴＣＲ発現カセットは、ＴＲＡＣ遺伝子座の第１のエクソンに組み込まれる細胞外抗原結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲ発現カセットは、細胞外抗原結合ドメインおよびＴＲＢＣペプチドを必要に応じて含む第２の抗原結合鎖をさらに含む。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合ドメインおよびＴＲＢＣペプチドが、ＨＩ－ＴＣＲの第１の抗原結合鎖に含まれるように、ＨＩ－ＴＣＲ発現カセットは、ＴＲＢＣ遺伝子座の第１のエクソンに組み込まれる細胞外抗原結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＨＩ－ＴＣＲ発現カセットは、細胞外抗原結合ドメインおよびＴＲＡＣペプチドを必要に応じて含む第２の抗原結合鎖をさらに含む。ある特定の実施形態では、発現カセットは、ポリシストロニック発現カセットを作成するエレメント、例えば、切断可能ペプチド、例えば、２Ａペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲは、免疫応答性細胞の内因性ＴＲＡＣ遺伝子座および／またはＴＲＢＣ遺伝子座に配置された発現カセットから発現される。ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲ発現カセットの配置は、免疫応答性細胞における天然ＴＣＲα鎖および／または天然ＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲの内因性発現を破壊または無効化する。ある特定の実施形態では、組換えＴＣＲ発現カセットの配置は、免疫応答性細胞における組換えＴＣＲと、天然ＴＣＲα鎖および／または天然ＴＣＲβ鎖との間の誤対合を防止または排除する。

任意の適した遺伝的編集方法および系を、内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座の改変に使用することができる。節４に開示されるゲノム編集方法を、内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座の改変に使用することができる。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系が、Ｔ細胞受容体遺伝子座の改変に使用される。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ヒトＴＲＡＣ遺伝子座のエクソン１を標的とする。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ヒトＴＲＡＣ遺伝子座のエクソン１を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。

ある特定の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼが、内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座の改変に使用される。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥＮ系が、内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座の改変に使用される。

ある特定の実施形態では、細胞における１個の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座が、ＨＩ－ＴＣＲの１種または複数の抗原結合鎖を発現するように改変されている場合、細胞における１個または複数の他の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座は、内因性ＴＣＲ鎖の内因性発現を排除するように改変されている。ある特定の実施形態では、１個または複数の他の内因性Ｔ細胞受容体遺伝子座は、目的の遺伝子、例えば、抗腫瘍サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＴＮＦαおよびＩＮＦγ）、共刺激分子リガンド（例えば、４－１ＢＢＬ）、追跡用遺伝子（例えば、ｅＧＦＰ）または自殺遺伝子を発現するようにさらに改変されている。

６．２．プロモーターまたは転写ターミネーターのゲノム編集による遺伝子発現の改変
ある特定の非限定的な実施形態では、標的化されたゲノム遺伝子座に組み込まれたＨＩ－ＴＣＲ発現カセットの発現は、ゲノム遺伝子座の内因性プロモーター／エンハンサーによって駆動される。ある特定の実施形態では、標的化されたゲノム遺伝子座に組み込まれたＨＩ－ＴＣＲ発現カセットの発現は、ゲノム遺伝子座に導入された改変されたプロモーター／エンハンサーによって駆動される。任意の標的化されたゲノム編集方法を使用して、標的化されたゲノム遺伝子座のプロモーター／エンハンサー領域を改変し、これにより、免疫応答性細胞におけるＨＩ－ＴＣＲの発現を増強または改変することができる。ある特定の実施形態では、改変は、構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターによる内因性プロモーターの置換え、または標的化されたゲノム遺伝子座のプロモーター領域への構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターの挿入を含む。ある特定の実施形態では、構成的プロモーターが、標的化されたゲノム遺伝子座に設置されて、ＨＩ－ＴＣＲの遺伝子発現を駆動する。適格の構成的プロモーターとして、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ベータ－アクチンプロモーターおよびＣＡＧプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、またはさらに、条件的または誘導性（inducable）プロモーターが、標
的化されたゲノム遺伝子座に設置されて、ＨＩ－ＴＣＲの遺伝子発現を駆動する。条件的プロモーターの非限定的な例として、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーターおよびエストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）プロモーターが挙げられる。加えて、エンハンサーエレメントを、プロモーター領域以外の領域に配置することができる。

ある特定の非限定的な実施形態では、標的化されたゲノム遺伝子座に組み込まれたＨＩ－ＴＣＲ発現カセットの発現は、ゲノム遺伝子座の内因性転写ターミネーターによって調節される。ある特定の実施形態では、標的化されたゲノム遺伝子座に組み込まれたＨＩ－ＴＣＲ発現カセットの発現は、ゲノム遺伝子座に導入された改変された転写ターミネーターによって調節される。任意の標的化されたゲノム編集方法を使用して、標的化されたゲノム遺伝子座の転写ターミネーター領域を改変し、これにより、免疫応答性細胞におけるＨＩ－ＴＣＲの発現を改変することができる。ある特定の実施形態では、改変は、代替転写ターミネーターによる内因性転写ターミネーターの置換え、または標的化されたゲノム遺伝子座の転写ターミネーター領域への代替転写ターミネーターの挿入を含む。ある特定の実施形態では、代替転写ターミネーターは、遺伝子の３’ＵＴＲ領域またはポリ（ploy）Ａ領域を含む。ある特定の実施形態では、代替転写ターミネーターは、内因性である。ある特定の実施形態では、代替転写ターミネーターは、外因性である。ある特定の実施形態では、代替転写ターミネーターとして、ＴＫ転写ターミネーター、ＧＣＳＦ転写ターミネーター、ＴＣＲＡ転写ターミネーター、ＨＢＢ転写ターミネーター、ウシ成長ホルモン転写ターミネーター、ＳＶ４０転写ターミネーターおよびＰ２Ａエレメントが挙げられるがこれらに限定されない。

いずれかの標的化されたゲノム編集方法を、標的化されたゲノム遺伝子座のプロモーター／エンハンサー領域および／または転写ターミネーター領域の改変に使用することができる。ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系が、標的化されたゲノム遺伝子座のプロモーター／エンハンサー領域および／または転写ターミネーター領域の改変に使用される。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼが、標的化されたゲノム遺伝子座のプロモーター／エンハンサー領域および／または転写ターミネーター領域の改変に使用される。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥＮ系が、標的化されたゲノム遺伝子座のプロモーター／エンハンサー領域および／または転写ターミネーター領域の改変に使用される。

ゲノム編集剤／システムを送達するための方法は、必要性によって異なってもよい。ある特定の実施形態では、選択されるゲノム編集方法の構成成分は、１つまたは複数のプラスミドの中のＤＮＡ構築物として送達される。ある特定の実施形態では、構成成分は、ウイルスベクターを通して送達される。一般的な送達方法には、限定されずに、電気穿孔法、マイクロインジェクション、遺伝子銃、インパレフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、静水圧、連続的注入、超音波処理、マグネトフェクション、アデノ随伴ウイルス、ウイルスベクターのエンベロープタンパク質シュードタイプ化、複製能のあるベクターのシスおよびトランス作用性エレメント、単純ヘルペスウイルス、および化学的ビヒクル（例えば、オリゴヌクレオチド、リポプレックス、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）、ポリプレックス、デンドリマー、無機ナノ粒子および細胞透過性ペプチド）が含まれる。

改変は、標的化されたゲノム遺伝子座内のいずれかの箇所で、または標的化されたゲノム遺伝子座の遺伝子発現に影響し得るいずれかの箇所で為すことができる。ある特定の実施形態では、改変は、標的化されたゲノム遺伝子座の転写開始部位の上流に発生する。ある特定の実施形態では、改変は、標的化されたゲノム遺伝子座の転写開始部位およびタンパク質コード領域の間に発生する。ある特定の実施形態では、改変は、標的化されたゲノム遺伝子座のタンパク質コード領域の下流に発生する。ある特定の実施形態では、改変は、標的化されたゲノム遺伝子座の転写開始部位の上流に発生し、この場合、改変は、新たな転写開始部位を産生する。

７．ポリペプチドおよびアナログ
免疫応答性細胞において発現された場合に、その抗新生物活性を増強するように改変された、ポリペプチド（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＧＣ１、ＴＲＧＣ２、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、およびＣＴＬＡ－４）またはその断片もまた、本開示の主題に含まれる。本開示の主題は、配列において変化を生じることによってアミノ酸配列または核酸配列を最適化するための方法を提供する。そのような変化は、ある特定の変異、欠失、挿入、または翻訳後改変を含み得る。本開示の主題は、本明細書に開示の任意の天然に存在するポリペプチド（ＣＤ１９、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ８４、ＣＤ１６６、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ－１、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＴＲＧＣ１、ＴＲＧＣ２、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、およびＣＴＬＡ－４を含むがこれらに限定されない）のアナログをさらに含む。アナログは、本明細書に開示の天然に存在するポリペプチドとはアミノ酸配列の差によって、翻訳後改変によって、またはその両方によって異なり得る。アナログは、本開示の主題の天然に存在するアミノ酸配列の全てまたは一部と少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれより高い相同性（homologous）を示すことができる。配列比較の長さは、少なくとも５、１０、１５もしくは２０アミノ酸残基、例えば、少なくとも２５、５０もしくは７５アミノ酸残基であり、または１００アミノ酸残基よりも長い。この場合も、同一性の程度を決定する例示的なアプローチにおいて、ＢＬＡＳＴプログラムを、近縁の配列を示すｅ^－３からｅ^－１００の間の確率スコアで使用してもよい。改変は、ポリペプチドのｉｎｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏ化学的誘導体化、例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、またはグリコシル化を含み、そのような改変は、ポリペプチド合成もしくはプロセシングの間に、または単離された改変酵素による処理後に起こり得る。アナログはまた、一次配列の変化によって天然に存在するポリペプチドとは異なり得る。これらには、天然および誘導型の両方の遺伝子バリアント（例えば、放射線照射もしくはエタンメチルスルフェートに対する曝露によるランダム変異誘発に起因する、またはSambrook,Fritsch
and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), CSHPress, 1989もしくはAusubelet al.、前記参照に記載される部位特異的変異誘発による）が含まれる。Ｌアミノ酸（amina acid）以外の残基、例えばＤアミノ酸または天然に存在しないもしくは合成アミノ酸、例えばβもしくはγアミノ酸を含有する、環化ペプチド、分子およびアナログも含まれる。

完全長ポリペプチドに加えて、本開示の主題はまた、本明細書に開示のポリペプチドまたはペプチドドメインのいずれか１つの断片も提供する。本明細書で使用される場合、用語「断片」は、少なくとも５、１０、１３、または１５アミノ酸を意味する。ある特定の実施形態では、断片は、少なくとも２０連続アミノ酸、少なくとも３０連続アミノ酸、または少なくとも５０連続アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、断片は、少なくとも６０～８０、１００、２００、３００、またはそれより多くの連続アミノ酸を含む。断片は、当業者に公知の方法によって生成することができるか、または通常のタンパク質プロセシングに起因し得る（例えば、生物活性にとって必要ではないアミノ酸の新生ポリペプチドからの除去、または選択的ｍＲＮＡスプライシングもしくは選択的タンパク質プロセシング事象によるアミノ酸の除去）。

非タンパク質アナログは、本明細書に開示のタンパク質の機能的活性を模倣するように設計された化学構造を有する。そのようなアナログは、元のポリペプチドの生理的活性を超えてもよい。アナログの設計方法は当技術分野で周知であり、アナログの合成は、得られたアナログが、免疫応答性細胞において発現された場合に元のポリペプチドの抗新生物活性を増加させるように化学構造を改変することによって、そのような方法に従って実施することができる。これらの化学的改変は、代替のＲ基を置換すること、および基準ポリペプチドの特定の炭素原子の飽和の程度を変化させることを含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、タンパク質アナログは、ｉｎｖｉｖｏでの分解に対して比較的抵抗性であり、投与した場合、より持続的な治療効果をもたらす。機能的活性を測定するためのアッセイは、以下の実施例に記載されるアッセイを含むがこれに限定されない。

８．投与
本開示の免疫応答性細胞を含む組成物は、抗原に対する免疫応答を誘導および／もしくは増強するために、ならびに／または新生物、病原体感染もしくは感染性疾患を処置および／もしくは防止するために、被験体に全身にまたは直接提供することができる。ある特定の実施形態では、本開示の免疫応答性細胞またはそれを含む組成物は、目的の臓器（例えば、新生物に罹患している臓器）に直接注射される。あるいは、本開示の免疫応答性細胞またはそれを含む組成物は、例えば循環器系（例えば、腫瘍の血管系）に投与することによって、目的の臓器に間接的に提供される。増大および分化剤を、細胞または組成物の投与の前、間、または後に提供して、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏでＴ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＣＴＬ細胞の産生を増加させることができる。

本開示の免疫応答性細胞は、任意の生理的に許容されるビヒクル中で、通常、血管内に投与することができるが、それらはまた、細胞が再生および分化のための適切な部位を見つけ得る、骨または他の都合のよい部位（例えば、胸腺）に導入してもよい。通常、少なくとも約１×１０^５個の細胞を投与し、最終的に約１×１０^１０個またはそれよりも多くに達する。本開示の免疫応答性細胞は、精製細胞集団を含み得る。当業者は、様々な周知の方法、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、集団における本開示の免疫応答性細胞のパーセンテージを容易に決定することができる。本開示の免疫応答性細胞を含む集団における適した純度範囲は、約５０％～約５５％、約５％～約６０％および約６５％～約７０％である。ある特定の実施形態では、純度は、約７０％～約７５％、約７５％～約８０％、または約８０％～約８５％である。ある特定の実施形態では、純度は、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、および約９５％～約１００％である。投薬量は、当業者によって容易に調整することができる（例えば、純度の減少は投薬量の増加を必要とし得る）。細胞は、注射、カテーテルなどによって導入することができる。

本開示の組成物は、本開示の免疫応答性細胞またはその前駆体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であり得る。投与は、自己または異種であり得る。例えば、免疫応答性細胞または前駆体を１つの被験体から得、これを同じ被験体または異なる適合性の被験体に投与することができる。末梢血由来の免疫応答性細胞またはその子孫（例えば、ｉｎｖｉｖｏ、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏ由来）を、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈内注射または非経口的投与を含む、局所注射を介して投与することができる。本開示の主題の治療組成物（例えば、本開示の免疫応答性細胞を含む医薬組成物）を投与する場合、これは単位投薬注射形態（溶液、懸濁物、エマルジョン）として製剤化することができる。

９．製剤
本開示の免疫応答性細胞を含む組成物は、滅菌液体調製物、例えば選択されたｐＨとなるように緩衝され得る等張水溶液、懸濁物、エマルジョン、分散物または粘性組成物として簡便に提供することができる。液体調製物は通常、ゲル、他の粘性組成物および固体組成物より容易に調製される。加えて、液体組成物は、特に注射によって投与するためにいくぶんより簡便である。一方、粘性組成物は、適切な粘度範囲内で製剤化され、特定の組織とのより長い接触期間を提供することができる。液体または粘性組成物は、担体を含むことができ、これは、例えば水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適した混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。

滅菌注射可能溶液は、望ましければ、他の成分の様々な量と共に適切な溶媒の必要量に遺伝子改変免疫応答性細胞を組み込むことによって調製することができる。そのような組成物は、適した担体、希釈剤、または賦形剤、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどと混合することができる。組成物はまた、凍結乾燥することもできる。組成物は、望ましい投与経路および調製物に応じて、補助物質、例えば湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝化剤、ゲル化または粘度増強添加剤、保存剤、矯味矯臭剤、着色料などを含有することができる。過度の実験法を行うことなく、適切な調製物を調製するために、標準的なテキスト、例えば参照により本明細書に組み込まれている、"REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985を参照してもよい。

抗菌保存剤、抗酸化剤、キレート化剤、および緩衝液を含む、組成物の安定性および無菌性を増強する様々な添加剤を添加することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって確保することができる。注射可能な医薬形態の持続的な吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。しかし、本開示の主題によれば、使用されるいかなるビヒクル、希釈剤、または添加剤も、遺伝子改変された免疫応答性細胞またはその子孫と適合性でなければならない。

組成物は、等張性であり得る、すなわちそれらは血液および涙液と同じ浸透圧を有し得る。組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、または他の薬学的に許容される作用物質、例えばデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、または他の無機もしくは有機溶質を使用して達成され得る。塩化ナトリウムは、特に、ナトリウムイオンを含有する緩衝液のためであり得る。

組成物の粘度は、望ましければ、薬学的に許容される増粘剤を使用して選択されるレベルで維持することができる。例えば、メチルセルロースは、容易で安価に入手することができ、作業が容易である。他の適した増粘剤には、例えばキサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の濃度は、選択される薬剤に依存し得る。重要な点は、選択された粘度を達成する量を使用することである。明らかに、適した担体および他の添加剤の選択は、正確な投与経路および特定の剤形の性質、例えば、液体剤形（例えば、組成物を溶液、懸濁物、ゲルまたは別の液体形態、例えば時限放出形態または液体充填形態に製剤化するか否か）に依存する。

投与される細胞の量は、処置される被験体に関して変化する。一実施形態では、約１０^４～約１０^１０個、約１０^５～約１０^９個、または約１０^６～約１０^８個の本開示の免疫応答性細胞がヒト被験体に投与される。より有効な細胞は、さらに少数で投与され得る。ある特定の実施形態では、少なくとも約１×１０^８、約２×１０^８、約３×１０^８、約４×１０^８、または約５×１０^８個の本開示の免疫応答性細胞が、ヒト被験体に投与される。有効用量と見なされる量の正確な決定は、特定の被験体のサイズ、年齢、性別、体重および状態を含む、各々の被験体に関して個別の要因に基づき得る。投薬量は、本開示および当技術分野での知識から当業者が容易に確認することができる。

当業者は、組成物中のおよび方法において投与される、細胞ならびに必要に応じた添加剤、ビヒクル、および／または担体の量を容易に決定することができる。典型的には、任意の添加剤（活性な細胞および／または薬剤に加えて）は、リン酸緩衝食塩水中に０．００１～５０％（重量）溶液の量で存在し、活性成分は、マイクログラムからミリグラムのオーダーで、例えば約０．０００１～約５重量％、約０．０００１～約１重量％、約０．０００１～約０．０５重量％または約０．００１～約２０重量％、約０．０１～約１０重量％、または約０．０５～約５重量％で存在する。動物またはヒトに投与される任意の組成物に関して、以下を決定することができる：適した動物モデル、例えばマウスなどの齧歯類における致死用量（ＬＤ）およびＬＤ５０の決定などによる毒性；適切な応答を誘発する組成物の投薬量、その中の構成要素の濃度、および組成物の投与時期。そのような決定は、当業者の知識、本開示、および本明細書に引用した文書により、過度の実験を必要としない。そして逐次投与の時間は、過度の実験を行うことなく確認することができる。

１０．処置方法
本開示の主題は、それを必要とする被験体における免疫応答を誘導および／または増加させるための方法を提供する。本開示の免疫応答性細胞およびそれを含む組成物は、被験体における新生物を処置および／または防止するために使用することができる。本開示の免疫応答性細胞およびそれを含む組成物は、新生物に罹患している被験体の生存を延長させるために使用することができる。本開示の免疫応答性細胞およびそれを含む組成物は、被験体、例えば免疫無防備状態のヒト被験体における病原体感染または他の感染性疾患を処置および／または防止するためにも使用することができる。そのような方法は、既存の状態の緩和であれ、再発の防止であれ、所望の効果を達成するために有効な量の本開示の免疫応答性細胞、またはそれを含む組成物（例えば、医薬組成物）を投与することを含む。処置の場合、投与される量は、所望の効果を生じるために有効な量である。有効量は、１つまたは一連の投与で提供することができる。有効量は、ボーラスでまたは連続注入によって提供することができる。

ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＨＩ－ＴＣＲを含む免疫応答性細胞を使用して、例えば、疾患の再発により、低い発現レベルの表面抗原を有する腫瘍細胞を有する被験体を処置することができ、被験体は、残存腫瘍細胞をもたらす処置を受けたことがある。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、腫瘍細胞の表面に低密度の標的分子を有する。ある特定の実施形態では、細胞表面に低密度で存在する標的分子は、細胞１個当たり約５，０００分子未満、細胞１個当たり約４，０００分子未満、細胞１個当たり約３，０００分子未満、細胞１個当たり約２，０００分子未満、細胞１個当たり約１，５００分子未満、細胞１個当たり約１，０００分子未満、細胞１個当たり約５００分子未満、細胞１個当たり約２００分子未満、または細胞１個当たり約１００分子未満の密度を有する。ある特定の実施形態では、細胞表面に低密度で存在する標的分子は、細胞１個当たり約２，０００分子未満の密度を有する。ある特定の実施形態では、細胞表面に低密度で存在する標的分子は、細胞１個当たり約１，５００分子未満の密度を有する。ある特定の実施形態では、細胞表面に低密度で存在する標的分子は、細胞１個当たり約１，０００分子未満の密度を有する。ある特定の実施形態では、細胞表面に低密度で存在する標的分子は、細胞１個当たり約４，０００分子～細胞１個当たり約２，０００分子、細胞１個当たり約２，０００分子～細胞１個当たり約１，０００分子、細胞１個当たり約１，５００分子～細胞１個当たり約１，０００分子、細胞１個当たり約２，０００分子～細胞１個当たり約５００分子、細胞１個当たり約１，０００分子～細胞１個当たり約２００分子、または細胞１個当たり約１，０００分子～細胞１個当たり約１００分子の密度を有する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＨＩ－ＴＣＲを含む免疫応答性細胞を使用して、疾患の再発を有する被験体を処置することができ、被験体は、４－１ＢＢポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ（例えば、４－１ＢＢｚＣＡＲ）を含む免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）を受けたことがある。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、腫瘍細胞の表面に低密度の腫瘍特異的抗原を有する。ある特定の実施形態では、疾患は、ＣＤ１９^＋ＡＬＬである。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、腫瘍細胞上に低密度のＣＤ１９を有する。そのような方法は、有効な量の本開示の免疫応答性細胞またはそれを含む組成物（例えば、医薬組成物）を投与して、所望の効果、既存の状態の軽減または再発の防止を達成することを含む。

「有効量」（または「治療有効量」）は、処置によって有益なまたは所望の臨床結果をもたらすために十分な量である。有効量は、１つまたは複数の用量で被験体に投与することができる。処置に関して、有効量は、疾患を緩和する、好転させる、安定化する、逆転させる、もしくはその進行を遅らせるために十分であるか、またはそうでなければ疾患の病理学的帰結を低減させるために十分である量である。有効量は、一般的に症例毎に医師によって決定され、当業者の技能の範囲内である。有効量を達成するための適切な投薬量を決定する場合、典型的にいくつかの要因を考慮に入れる。これらの要因は、被験体の年齢、性別、および体重、処置される状態、状態の重症度、ならびに投与される免疫応答性細胞の形態および有効濃度を含む。

抗原特異的Ｔ細胞を使用する養子免疫療法の場合、約１０^６～１０^１０個（例えば、約１０^９個）の範囲の細胞用量を典型的に注入する。本開示の細胞を宿主に投与してその後分化させると、特定の抗原に対して特異的に方向付けられたＴ細胞が誘導される。改変された細胞は、静脈内、皮下、節内、腫瘍内、髄腔内、胸膜内、腹腔内および胸腺への直接投与を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によって投与することができる。

本開示の主題は、被験体における新生物を処置および／または防止するための方法を提供する。方法は、新生物を有する被験体に、有効量の本開示の免疫応答性細胞またはそれを含む組成物を投与することを含み得る。

新生物の非限定的な例には、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、および骨髄腫）、卵巣がん、乳がん、膀胱がん、脳がん、結腸がん、腸がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、神経膠芽腫、咽頭がん、黒色腫、神経芽腫、腺癌、神経膠腫、軟部組織肉腫、および様々な癌腫（前立腺および小細胞肺がんを含む）が挙げられる。適した癌腫はさらに、星状細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、軟骨肉腫、骨原性肉腫、膵管腺癌、小細胞および大細胞肺腺癌、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、扁平上皮癌、気管支肺胞癌、上皮腺癌およびその肝臓転移、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、肝癌、胆管細胞癌、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、横紋筋肉腫、結腸癌、基底細胞癌、汗腺癌、乳頭状癌、皮脂腺癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、および重鎖病、乳管腺癌および小葉腺癌などの乳房腫瘍、子宮頸部の扁平上皮および腺癌、子宮および卵巣の上皮癌、前立腺腺癌、膀胱の移行扁平上皮癌、ＢおよびＴ細胞リンパ腫（結節性およびびまん性）、形質細胞腫、急性および慢性白血病、悪性黒色腫、軟部組織肉腫、ならびに平滑筋肉腫を含むがこれらに限定されない、腫瘍学の分野で公知の任意の癌腫を含む。ある特定の実施形態では、新生物は、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、および骨髄腫）、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、膀胱がん、脳がん、結腸がん、腸がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、神経膠芽腫、および咽頭がんからなる群より選択される。ある特定の実施形態では、本開示の免疫応答性細胞およびそれを含む組成物は、通常の治療介入を受けることができない血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、および骨髄腫）または卵巣がんを処置および／または防止するために使用することができる。ある特定の実施形態では、新生物は、固形腫瘍である。

被験体は、進行した形態の疾患を有し得、この場合、処置の目的は、疾患進行の緩和もしくは逆転および／または副作用の好転を含み得る。被験体は、それに対して既に処置されている状態の既往を有し得、この場合、治療目的は、典型的には、再発リスクの減少または遅延を含む。

治療に適したヒト被験体は、典型的には、臨床基準によって区別することができる２つの処置群を含む。「進行疾患」または「高い腫瘍負荷」を有する被験体は、臨床的に測定可能な腫瘍を有する被験体である。臨床的に測定可能な腫瘍は、腫瘍質量に基づいて検出することができる腫瘍である（例えば、触診、ＣＡＴスキャン、ソノグラム、マンモグラム、またはＸ線によって；生化学または組織病理学マーカー陽性は、単独ではこの集団を同定するために不十分である）。医薬組成物は、その状態を緩和する目的で、抗腫瘍応答を誘発するためにこれらの被験体に投与される。理想的には、腫瘍質量の低減が結果として起こるが、いかなる臨床的改善も利益を構成する。臨床的改善は、腫瘍の進行のリスクもしくは速度の減少、またはその病理学的帰結の低減を含む。

適した被験体の第２の群は、「アジュバント群」として当技術分野で公知である。これらは、新生物の既往を有するが、治療の別の様式に応答性であった個体である。以前の治療は、外科的切除、放射線療法、および従来の化学療法を含み得るこれらに限定されない。その結果として、これらの個体は、臨床的に測定可能な腫瘍を有しない。しかし、それらは、元の腫瘍部位近傍で、または転移によって、疾患の進行のリスクがあると疑われる。この群を、高リスク個体と低リスク個体にさらに細分することができる。細分は、初回処置の前または後で観察された特色に基づいて行われる。これらの特色は、臨床技術分野で公知であり、各々の異なる新生物について適切に定義される。高リスク亜群に典型的な特色は、腫瘍が隣接組織に浸潤するもの、またはリンパ節の関与を示すものである。

別の群は、新生物に対して遺伝的素因を有するが、まだ新生物の臨床徴候を示していない。例えば、乳がんに関連する遺伝子変異に関して試験陽性の女性で、まだ妊娠可能年齢の女性は、希望すれば、予防手術を実施することが適切となるまで、新生物の発生を防止するための予防的処置において本明細書に記載の免疫応答性細胞の１つまたは複数を受けることができる。

加えて、本開示の主題は、被験体、例えば免疫無防備状態の被験体において病原体感染（例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生生物感染、または原生生物感染）を処置および／または防止するための方法を提供する。方法は、病原体感染を有する被験体に、有効量の本開示の免疫応答性細胞またはそれ（thereof）を含む組成物を投与するこ
とを含み得る。処置に対して感受性がある例示的なウイルス感染には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびインフルエンザウイルス感染が挙げられるがこれらに限定されない。

免疫学的合併症（「悪性のＴ細胞形質転換」として公知）、例えば移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを防ぐもしくは最小限にするために、または健康な組織が腫瘍細胞と同じ標的抗原を発現して、ＧｖＨＤと類似の転帰をもたらす場合には、さらなる改変を、本開示の免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入することができる。この問題の可能性がある解決策は、本開示の免疫応答性細胞へと自殺遺伝子を操作することである。適した自殺遺伝子には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｓｖ－ｔｋ）、誘導型カスパーゼ９自殺遺伝子（ｉＣａｓｐ－９）、および切断型ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲｔ）ポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、自殺遺伝子は、ＥＧＦＲｔポリペプチドである。ＥＧＦＲｔポリペプチドは、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（例えば、セツキシマブ）の投与によってＴ細胞の排除を可能し得る。ＥＧＦＲｔは、本開示のＣＡＲの抗原認識受容体の上流に共有結合により接合することができる。自殺遺伝子は、本開示のＣＡＲをコードする核酸を含むベクター内に含めることができる。このようにして、悪性Ｔ細胞形質転換（例えばＧＶＨＤ）の際に自殺遺伝子を活性化するように設計されたプロドラッグ（例えばプロドラッグ（例えば、ｉＣａｓｐ－９を活性化することができるＡＰ１９０３）の投与は、自殺遺伝子活性化ＣＡＲ発現Ｔ細胞においてアポトーシスを誘発する。自殺遺伝子を本開示のＣＡＲに組み込むことは、非常に短期間でＣＡＲＴ細胞の大多数を排除することができ、追加の安全性レベルを与える。自殺遺伝子を組み込んだ本開示の免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＡＲＴ細胞注入後の所与の時点で予め先制して排除することができるか、または毒性の最も早期の徴候時に根絶することができる。

１１．キット
本開示の主題は、被験体において免疫応答を誘導および／もしくは増強する、ならびに／または新生物もしくは病原体感染を処置および／もしくは防止するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、有効量の本開示の免疫応答性細胞またはそれを含む医薬組成物を含む。ある特定の実施形態では、キットは、滅菌容器を含み；そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当技術分野で公知の他の適した容器形態であり得る。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属ホイル、または医薬を保持するために適した他の材料で作製することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キットは、必要に応じて１つまたは複数のベクターに含まれ得る、発現可能な（expessible）形態で、目的の抗原に対する本明細書に開示されるＨＩ－ＴＣＲをコードする単離核酸分子を含む。

望ましければ、免疫応答性細胞および／または核酸分子は、新生物または病原体または免疫障害を有するまたは発症するリスクがある被験体に、細胞または核酸分子を投与するための指示と共に提供される。指示は一般的に、新生物または病原体感染の処置および／または防止のための組成物の使用に関する情報を含む。ある特定の実施形態では、指示は、以下の少なくとも１つを含む：治療剤の説明；新生物、病原体感染または免疫障害、またはその症状の処置または防止のための投薬スケジュールおよび投与；注意事項；警告；適応；禁忌；過量の情報；有害反応；動物の薬理学；臨床研究；および／または参考文献。指示は、容器（存在する場合）に直接印刷してもよく、または容器に貼付されたラベルとして、または容器の中にもしくは容器と共に供給される個別のシート、パンフレット、カード、もしくはフォルダーとして存在してもよい。

本開示の実施は、特に示していない限り、十分に当業者の技能範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の通常の技術を使用する。そのような技術は、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition(Sambrook,1989)；"Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984)；"AnimalCellCulture" (Freshney, 1987)；"Methods in Enzymology""Handbookof Experimental Immunology" (Weir, 1996)；"GeneTransfer Vectors forMammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)；"CurrentProtocols inMolecular Biology" (Ausubel, 1987)；"PCR: The PolymeraseChainReaction", (Mullis, 1994)；"Current Protocols inImmunology"(Coligan, 1991)などの文献に十分に説明されている。これらの技術は、本明細書に開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に応用可能であり、そのため、本開示の主題の作製および実施において考慮され得る。特定の実施形態に関して特に有用な技術を、続く節で考察する。

以下の実施例は、本開示の細胞および組成物を作製および使用する方法に関する完全な開示および説明を当業者に提供するために述べられており、本発明者らが本発明であると見なす範囲を限定することを意図しない。

（実施例１内因性非ＨＬＡ制限Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体によるＴ細胞の標的化）
緒言
Ｔ細胞活性化を生理学的に制御および調節するそのＣＤ３複合体を破壊または迂回することなく、ヒトＴ細胞の抗原特異性を変更するように設計されたＴＣＲ遺伝子座における特異的な改変を行った。このアプローチにおいて、Ｔ細胞は、その内因性Ｔ細胞受容体を失い、ＣＡＲを使用する際の他の事例では迂回されるそのＣＤ３複合体を活用して、ＨＬＡから独立して抗原を認識する能力を獲得した。これは、天然ＣＤ３複合体の全ての構成要素をその天然の構造で保存するような仕方での、ＴＲＡＣ遺伝子座への抗原結合ドメインの導入と組み合わせた、内因性ＴＣＲの標的化された破壊により達成された。組換えＴＣＲ様分子（すなわち、ＨＩ－ＴＣＲ、ＦｖＴＣＲまたはＨＩＴ－ＣＡＲ）は、抗原認識を方向付けるための、免疫グロブリン遺伝子に由来する可変ドメインまたは代替リガンドを有することができる。ＣＤ３複合体を介した組み換えられた受容体シグナルは、無傷であっても（すなわち、その生理学的組成である）、または共刺激ドメインの非共有結合的取込みにより増大されていてもよい。

結果
所定の抗原のための別個の可変ドメインを有するＴＣＲまたはＴＣＲ様遺伝子を組み込むことにより、ＴＣＲおよびＴＣＲ様Ｔ細胞の一段階生成のための新規戦略を開発した。これは、内因性ＴＣＲの表面発現の付随する破壊により、内因性ＴＣＲプロモーター（アルファ、ベータまたはその両方）の制御下での新たなＴＣＲ／ＴＣＲ様遺伝子の発現をもたらした。

ＴＣＲアルファ定常鎖（ＴＲＡＣ）第１のエクソンにおけるプロモーター不含（less）ＣＡＲ遺伝子カセットの組込みを標的化することにより、ユニバーサルＣＡＲＴ細胞の一段階生成のための戦略を開発した。これは、細胞表面におけるＴＣＲ発現の欠如をもたらすＴＣＲアルファ遺伝子発現の付随する破壊により、内因性ＴＣＲアルファプロモーターの制御下でのＣＡＲ発現をもたらした。ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＣＡＲ遺伝子標的化は、部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）およびＡＡＶドナー鋳型を使用することにより相同組換え（ＨＲ）により達成された。ＨＲに基づく遺伝子標的化を使用して、本戦略は、特異的抗原結合ドメインを含有するキメラＴＣＲ受容体によってコードされた、特有の特異性を有するＴ細胞の生成を可能にした。抗原結合ドメインは、免疫グロブリン（すなわち、Ｆｖ断片）、細胞表面受容体のリガンドまたはＴＣＲ（αβまたはγδ）のいずれかに由来した。ハイブリッド免疫グロブリン－ＴＣＲキメラ抗原受容体（すなわち、ＨＩＴ－ＣＡＲ、ＦｖＴＣＲまたはＨＩ－ＴＣＲ）またはγδＴＣＲは、Ｔ細胞が、ＨＬＡ非依存的に標的細胞を認識することを可能にした。新たなαβＴＣＲの挿入は、同じようにして達成することができたが、ＨＬＡ制限抗原認識をもたらすであろう。

例えば、図１Ａは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、およびＨＬＡ非依存的なＴＣＲに基づくキメラ抗原受容体（すなわち、ＨＩＴ－ＣＡＲ、ＦｖＴＣＲまたはＨＩ－ＴＣＲ）の略図を示す。ＴＲＡＣ遺伝子座への３種の受容体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により標的化された組込みを図１Ｂに示す。操作されたＨＩＴ－ＣＡＲは、ＣＤ１９を標的とする。ＴＲＡＣ遺伝子座からのＨＩＴ－ＣＡＲ（すなわち、ＨＩ－ＴＣＲ）の細胞表面発現を図１Ｃに示す。ＨＩＴ－ＣＡＲ（すなわち、ＨＩ－ＴＣＲまたはＦｖＴＣＲ）Ｔ細胞の細胞溶解効果および増殖をそれぞれ図１Ｄおよび図１Ｅに示す。

図２Ａに示す通り、単一ステップにおける標的遺伝子破壊およびＨＩＴ－ＣＡＲ（すなわち、ＨＩ－ＴＣＲまたはＦｖＴＣＲ）標的化挿入を組み合わせて、最大６５％のＨＩＴ－ＣＡＲ（すなわち、ＨＩ－ＴＣＲまたはＦｖＴＣＲ）Ｔ細胞を得るための条件を確立した。これらのＴ細胞は、図２Ｂに示す通り、１９２８ｚＣＡＲを発現する以前に特徴付けされたＴＲＡＣ－ＣＡＲＴ細胞と同様のｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ腫瘍溶解活性を示した。加えて、抗原相互作用は、ＨＩＴ－ＣＡＲ（すなわち、ＨＩ－ＴＣＲまたはＦｖＴＣＲ）Ｔ細胞の下方調節を誘導し、これは、抗原依存性刺激の数に依存した。内因性ＴＣＲ発現は、細胞表面において排除されるため、これらのＨＩＴ－ＣＡＲ（すなわち、ＨＩ－ＴＣＲまたはＦｖＴＣＲ）Ｔ細胞は、既製の（off-the-shelf）免疫療法
の開発に有用であった。

ＣＤ１９以外の標的を免疫療法に用いることができる。ＴＣＲアルファまたはベータ鎖に組み込まれたＮＹＥＳＯＴＣＲ遺伝子の略図を図３Ａに示す。ＴＲＡＣ－ＮＹＥＳＯ－ＴＣＲおよびＴＲＢＣ－ＮＹＥＳＯ－ＴＣＲ（すなわち、ＨＩ－ＴＣＲまたはＦｖＴＣＲ）の細胞表面発現を図３Ｂに示す。ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ標的化の４日後の、代表的ＴＣＲ－Ｖ－ベータ－１フローサイトメトリープロットを図３Ｂに示す。操作されたＴ細胞の細胞傷害活性を図３Ｃに示す。ＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータの両方への同時標的化の代替設計の略図を図３Ｄに示し、それによると、ＮＹＥＳＯ－ＨＩ－ＴＣＲは、ＴＲＡＣ遺伝子座に配置され、４－１ＢＢＬ発現カセットは、ＴＲＢＣ遺伝子座に配置された。ＴＲＡＣ－ＮＹＥＳＯ－ＴＣＲおよびＴＲＢＣ－４－１ＢＢＬの細胞表面発現を図３Ｅに示す。

超生理学的抗原感知および活性化をもたらす、共刺激ドメインがＣＤ３複合体に非共有結合により挿入された、バリアントアプローチも提供された。これは、共刺激ドメインを一方または両方のＴＣＲ鎖に融合することにより達成される。さらに、共刺激ドメインを一方または両方の改変ＴＣＲ鎖（すなわち、抗原結合鎖）のいずれかに融合することにより、２種の共刺激投薬量が可能である。

さらに、ＨＩ－ＴＣＲは、ＣＡＲと比較してより優れた感受性を示した。内因性ＴＣＲをＨＩ－ＴＣＲに置き換えるように編集されたヒトＴ細胞は、より低い抗原密度に係合し、そのような細胞を死滅させる能力を獲得した。例えば、表２は、ＨＩ－ＴＣＲ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ細胞傷害活性を示す。ＨＩ－ＴＣＲまたはＣＤ１９－ＣＡＲを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集およびＡＡＶ６ドナーベクターにより、ヒト末梢Ｔ細胞の内因性ＴＲＡＣ遺伝子座に導入した。遺伝子標的化５日後に、Ｔ細胞（６千、３万または１５万個）を、異なるＣＤ１９レベル（非常に低い～高いレベル）を発現する２５万個のＮａｌｍ６白血病細胞と共にインキュベートした。細胞を、血清を含有する（ＩＬ２なし）５００ｕｌのＸ－Ｖｉｖｏ培地において２２時間インキュベートした。計数ビーズの存在下でＦＡＣＳによって共培養物を解析して、Ｎａｌｍ６細胞の総数を決定した。細胞傷害活性は、死滅したＮａｌｍ６のパーセンテージとして示す。Ｅ／Ｔ：エフェクター（Ｔ細胞）の標的（Ｎａｌｍ６）に対する比。データは、ＨＩ－ＴＣＲが、ＣＡＲよりも低いレベルのＣＤ１９抗原を検出することができることを明らかに実証する。この特色は、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＣＲ１、ＣＤ７０など、中等度または低い発現を有する抗原に非常に有用であり得、再発腫瘍細胞は、その表面に低下した抗原密度を高頻度で示すため、いずれかの抗原に対するＣＡＲ療法後の再発の処置に有用であり得る。

さらに、外因性および内因性３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）のパネルは、ＴＣＲ遺伝子座における正確かつ予測可能な遺伝子発現を調節することができると見出された。例えば、図４Ａは、ＴＲＡＣ遺伝子座に組み込まれたＣＤ２８ｚＣＡＲ遺伝子の略図を示す。ポリＡ（黒いボックス）は、異なるウイルスおよび哺乳動物３’ＵＴＲを検査するために改変されたＣＡＲカセットのセグメントに対応する。モデルとしてＣＤ２８ｚＣＡＲを発現するＴＲＡＣ－ＣＡＲＴ細胞を使用して、ある特定の３’ＵＴＲは、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡ配列と比較してＣＡＲ発現を低減することが示され（図４Ｂおよび図４Ｃ）、これは、ｉｎｖｉｖｏ細胞傷害活性が損なわれたＣＡＲ－Ｔ細胞を生じた（図５Ａおよび図５Ｂ）。内因性ＴＲＡＣ３’ＵＴＲを含むある特定の他の３’ＵＴＲは、ＣＡＲ表面発現レベルを増加させることが示され（図４Ｂおよび図４Ｃ）、これは、ｉｎｖｉｖｏ細胞傷害活性が改善されたＣＡＲ－Ｔ細胞を産生した（図５Ａおよび図５Ｂ）。これらの３’ＵＴＲを使用して、本明細書に開示されているいずれかのＨＩ－ＴＣＲの正確かつ予測可能な遺伝子発現を調節することもできる。

ＴＲＡＣ遺伝子座における上述の遺伝子改変は、生理学的ＴＣＲに似ているがＣＡＲとは異なる最適レベルのＨＩ－ＴＣＲを発現するＴ細胞の生成を可能にし、内因性Ｔ細胞活性化機構（ＣＤ３複合体および下流シグナル伝達エレメント）を活用する。このアプローチは、自己および同種異系Ｔ細胞療法の両方を進歩させることができる。

ＴＣＲ遺伝子編集が関連する適用を有する別の関連する分野は、Ｔ－ｉＰＳ由来のＴ細胞である。Ｔ－ｉＰＳ細胞は、末梢Ｔリンパ球のリプログラミングにより得られる多能性幹細胞である。したがって、これらのＴ－ｉＰＳ細胞は、遺伝子編集技術を使用して改変することができる、αβまたはγδＴＣＲのいずれかである再編成されたＴ細胞受容体を含有する。方向付けられた分化によりＴ－ｉＰＳ細胞から得られるＴ細胞は、検出および配列決定することができる、再編成されたＴＣＲを発現する。この配列を使用して、Ｔ－ｉＰＳ細胞のゲノムにおける再編成された可変ドメインの正確な場所を決定することができる。この再編成された可変ドメインを特異的に標的とするヌクレアーゼおよび特異性が既知のＴＣＲ可変ドメインを含有するドナーＤＮＡを使用して、内因性可変ドメインを新たな可変ドメインに置き換えることができる。このアプローチは、２ステップの遺伝子編集を要求する：一方は、α（またはγ）鎖を標的とし、他方は、β（またはδ）鎖を標的とする。アプローチは、２個の対立遺伝子のみが改変される必要があるため、単一ステップで実施することができる。加えて、初代ヒトＴ細胞について記載された戦略と同様の戦略を使用して、本明細書に開示されるいずれかのＨＩ－ＴＣＲを発現するようにＴＣＲ鎖を改変することができる。

（実施例２）
ＴＲＡＣ遺伝子座への３種の受容体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により標的化された組込みを図１Ａに示す。操作されたＨＩＴ－ＣＡＲは、ＣＤ１９を標的とする。ＴＲＡＣ遺伝子座からのＨＩＴ－ＣＡＲ（すなわち、ＨＩ－ＴＣＲ）の細胞表面発現を図６Ｂおよび図６Ｃに示す。ＨＩＴ－ＣＡＲ（すなわち、ＨＩ－ＴＣＲまたはＦｖＴＣＲ）Ｔ細胞の細胞溶解効果および増殖を図７Ａ、図７Ｂおよび図８Ａ～図８Ｃに示す。特に、これらのデータは、低い抗原レベルを発現する標的細胞の死滅において、ＨＩＴＴ細胞が、ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも優れていたことを示す。

さらに、図９Ａ～図９Ｄに示す通り、ＨＩ－ＴＣＲＴ細胞は、共刺激リガンドを同時発現するように操作された。この特異的な実験において、ＴＲＡＣ遺伝子座へのＨＩ－ＴＣＲの標的化の翌日に、Ｔ細胞に、ＣＤ８０、４１ＢＢＬまたはその両方をコードするレトロウイルスＳＦＧベクターを移入した。これらの細胞をｅｘｖｉｖｏで増やしてから５日後に、４ｅ５個のＴＲＡＣ－ＣＡＲまたはＴＲＡＣ－ＨＩ－ＴＣＲ陽性Ｔ細胞を、非常に低いレベルのＣＤ１９を発現するＮＡＬＭ６細胞を有するＮＳＧマウスに注射した。ＴＲＡＣ－ＨＩ－ＴＣＲＴ細胞は、ＣＤ８０、４１ＢＢＬもしくは両方のリガンドを発現していたまたはいずれも発現していなかった。生物発光を使用して、腫瘍負荷を毎週評価し、マウスの生存を追跡した。

ＴＲＡＣ－ＣＡＲＴ細胞が、非常に低いレベルのＣＤ１９を有する腫瘍を制御することができず、３０日目までに全マウスが病状末期となったことが観察された。この低い用量では、ＨＩ－ＴＣＲＴ細胞は、腫瘍負荷を初期に制御したが、マウスは、１０日目までに再発し、４０日目までに病状末期となった。ＨＩ－ＴＣＲＴ細胞が、ＣＤ８０および４－１ＢＢＬを同時発現した場合、ＨＩ－ＴＣＲＴ細胞への共刺激リガンドの添加は、最適応答による抗腫瘍活性を改善した。この改善された活性は、非常に低いレベルのＣＤ１９を発現するＮＡＬＭ６の長期制御をもたらした。

図１０Ａ～図１０Ｃは、抗原遭遇後の細胞表面補充動態に影響を与えることなく、別個の３’ＵＴＲ配列によってベースラインＴＲＡＣ－ＣＡＲ発現を制御することができることをさらに実証する。全構築物が、ＴＲＡＣ内因性プロモーターの転写制御下に置かれるように、以前に記載されたものと同じように、ＴＲＡＣ－ＣＡＲＴ細胞を操作した。３’ＵＴＲ（ポリＡシグナルを含む）を改変することにより、ベースライン発現レベルがモジュレートされたことが観察された（図１０Ｂ）。これらの異なるＴＲＡＣ－ＣＡＲＴ細胞が、ＣＤ１９発現腫瘍細胞の上で培養された場合、ＣＡＲ細胞表面発現の低減と、それに続く補充がフローサイトメトリーによって観察された（図１０Ｃ）。異なる３’ＵＴＲは、ベースライン発現レベルを変化させたが、同じ補充動態を保持し、最終発現レベルは、ベースラインと同様であった。

さらに、ＣＤ７０を標的とするＨＩ－ＴＣＲおよびＣＤ２２を標的とするＨＩ－ＴＣＲも作製した。同じ抗原を標的とする既存の抗体の既存のｓｃＦｖまたはＦａｂ領域を配列決定して、細胞外抗原結合ドメインを得ることにより、関心のある抗原を標的とするＨＩ－ＴＣＲを作成することができる。

本開示の主題の実施形態
前述の説明から、本開示の主題に、様々な使用および条件にそれを採用するために、変形および改変を行ってもよいことは明らかである。そのような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲内である。

本明細書の変数の任意の定義における要素の一覧の列挙は、任意の単一の要素としてのまたは記載の要素の組合せ（または小組合せ）としてのその変数の定義を含む。本明細書の実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態としてのまたは他の任意の実施形態もしくはその一部との組合せとしてのその実施形態を含む。

本明細書において言及した全ての特許および刊行物は、各々の独立した特許および刊行物が参照により本明細書に組み込まれることが具体的に個々に示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれている。

Claims

明細書に記載の発明。