CN114957481A - 针对cd19和cd22的双靶点star - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种针对双靶点的合成T细胞受体抗原受体(Snythetic T‑Cell Receptor and Antigen Receptor,STAR)及其应用。具体而言，本发明公开了一种针对CD19和CD22的双靶点STAR、包含所述双靶点STAR的T细胞以及它们的用途。

Description

针对CD19和CD22的双靶点STAR
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种针对双靶点的合成T细胞受体抗原受体(Snythetic T-Cell Receptor and Antigen Receptor,STAR)及其应用。具体而言，本发明公开了一种针对CD19和CD22的双靶点STAR、包含所述双靶点STAR的T细胞以及它们的用途。
发明背景
细胞治疗尤其是T细胞相关治疗发展迅速，其中以嵌合抗原受体T细胞(CAR-T) 治疗和TCR-T疗法备受关注。
CAR-T疗法基于在T细胞中表达CAR分子。CAR分子包含三大部分：胞外区是来源于抗体的抗原识别结构域，负责识别靶标抗原；跨膜区；胞内区是来源于T细胞受体的信号分子和共刺激信号分子，负责在接受刺激后传导T细胞激活信号。当CAR分子与其对应抗原结合的时候，CAR分子会发生聚集，启动T细胞的效应功能、杀伤靶标肿瘤细胞。
TCR-T疗法则基于T细胞受体(TCR)。TCR是T细胞的身份特征，根据TCR的类型可将T细胞分为αβT细胞和γδT细胞。在发育过程中，T前体细胞会先进行TCRγ和 TCRδ链的VDJ重排，若重排成功则发育成γδT细胞，若重排失败，前体细胞会进行 TCRα和TCRβ链的VDJ重组，继而发育成αβT细胞。αβT细胞占外周血T细胞的 90％-95％，而γδT细胞占外周血T细胞的5％-10％。两种类型的T细胞分别以MHC限制和MHC非限制的方式识别抗原，对病原体和肿瘤的免疫起着重要作用。
T细胞受体(TCR)复合物分子含有多条链，TCRα链和TCRβ链(或TCRγ链和TCRδ链)负责识别MHC-多肽分子，其它6个CD3亚基与TCRα/β链(或TCRγ/δ链)结合，起信号转导的功能。天然TCR复合体中共含有10个ITAM信号序列，理论上能传导比 CAR更强的信号。利用天然TCR的信号传导功能，将可能构建出一种新型受体来缓解 T细胞失能，使其能够更好地发挥抗实体肿瘤作用。TCR的胞外区和抗体的Fab结构域非常相似，因此可以把TCR可变区序列替换成抗体可变区序列，从而得到合成T细胞受体抗原受体(Synthetic TCR and AntigenReceptor，STAR)，其既具有抗体的特异性，也具有天然TCR的优越的信号传导功能，可以介导T细胞激活。
本领域中已经投入临床应用的细胞疗法仍然有限，因此仍然需要改进的T细胞疗法，例如基于STAR的T细胞疗法。
发明简述
在一方面，本发明提供一种针对CD19和CD22的合成T细胞受体抗原受体(STAR)，其包含α链和β链，所述α链包含第一恒定区，所述β链包含第二恒定区，
其中所述α链包含特异性结合CD19的抗原结合区，且所述β链包含特异性结合CD22的抗原结合区；或者所述α链包含特异性结合CD22的抗原结合区，且所述β链包含特异性结合CD19的抗原结合区。
在一些实施方案中，所述第一恒定区是经修饰的TCRα链恒定区。在一些实施方案中，所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠 TCRα链恒定区，在第48位的氨基酸例如苏氨酸T被突变为半胱氨酸C。在一些实施方案中，所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠 TCRα链恒定区，在第112位的氨基酸例如丝氨酸S被变成亮氨酸L，在114位的氨基酸例如甲硫氨酸M被变成异亮氨酸I，在第115位的氨基酸例如甘氨酸G被变成颉氨酸 V。在一些实施方案中，所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，在第48位的氨基酸例如苏氨酸T被突变为半胱氨酸C，在第112位的氨基酸例如丝氨酸S被变成亮氨酸L，在114位的氨基酸例如甲硫氨酸M被变成异亮氨酸I，在第115位的氨基酸例如甘氨酸G被变成颉氨酸V。在一些实施方案中，所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，第6位的氨基酸如E被D取代，第13位的K被R取代，且第 15-18位氨基酸被缺失。在一些实施方案中，所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠 TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，第6位的氨基酸如E被D取代，第13位的K被R取代，且第15-18位氨基酸被缺失，且在第48位的氨基酸例如苏氨酸 T被突变为半胱氨酸C，在第112位的氨基酸例如丝氨酸S被变成亮氨酸L，在114位的氨基酸例如甲硫氨酸M被变成异亮氨酸I，在第115位的氨基酸例如甘氨酸G被变成颉氨酸V。在一些实施方案中，所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，缺失恒定区的胞内区，例如缺失第136-137 位氨基酸。在一些实施方案中，所述经修饰的TCRα链恒定区包含SEQ ID NO:3-4和 39-41之一所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第二恒定区是经修饰的TCRβ链恒定区。在一些实施方案中，所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠 TCRβ链恒定区，在第56位的氨基酸例如丝氨酸S被突变为半胱氨酸C。在一些实施方案中，所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠 TCRβ链恒定区，其第3位的氨基酸如R被K取代，第6位的氨基酸如T被F取代，第 9位的K被E取代，第11位的S被A取代，第12位的L被V取代，且第17、21-25 位氨基酸被缺失。在一些实施方案中，所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRβ链恒定区，其第3位的氨基酸如R被K取代，第6位的氨基酸如T被F取代，第9位的K被E取代，第11位的S被A取代，第12 位的L被V取代，且第17、21-25位氨基酸被缺失，且在第56位的氨基酸例如丝氨酸S被突变为半胱氨酸C。在一些实施方案中，所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠 TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRβ链恒定区，缺失恒定区的胞内区，例如缺失第167-172位氨基酸。在一些实施方案中，所述经修饰的TCRβ链恒定区包含SEQ ID NO:7-8和42-44之一所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合区是单链抗体(如scFv)或单域抗体(如骆驼抗体)，优选所述抗原结合区是单链抗体例如scFv。
在一些实施方案中，所述单链抗体包含通过接头相连接的重链可变区和轻链可变区，例如，所述接头是(G4S)n接头，其中n代表1-10的整数，优选地，n是1或3。
在一些实施方案中，所述特异性结合CD19的抗原结合区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:25所示的VH CDR1、SEQ ID NO:26所示的VH CDR2、和SEQ ID NO:27所示的VH CDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28所示的VL CDR1、SEQ IDNO:29所示的VL CDR2、和SEQ ID NO:30所示的VL CDR3，
例如，所述特异性结合CD19的抗原结合区包含SEQ ID NO:9所示的重链可变区以及SEQ ID NO:10所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述特异性结合CD22的抗原结合区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:31所示的VH CDR1、SEQ ID NO:32所示的VH CDR2、和SEQ ID NO:33所示的VH CDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的VL CDR1、SEQ IDNO:35所示的VL CDR2、和SEQ ID NO:36所示的VL CDR3，
例如，所述特异性结合CD22的抗原结合区包含SEQ ID NO:11所示的重链可变区，以及SEQ ID NO:12所示的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述α链或β链的抗原结合区直接或间接融合至所述恒定区的N末端。
在一些实施方案中，所述α链或β链的抗原结合区通过接头融合至所述恒定区的N末端。
在一些实施方案中，所述α链或β链，优选β链的抗原结合区通过CD8铰链区融合至所述恒定区的N末端，例如，所述CD8铰链区包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述α链和/或β链在其C末端连接有至少一个外源胞内功能结构域。
在一些实施方案中，所述外源胞内功能结构域直接或通过接头连接至所述α链和/或β链的恒定区的C末端，例如，所述接头是(G4S)n接头，其中n代表1-10的整数，优选地，n是3。
在一些实施方案中，所述外源胞内功能结构域是共刺激分子的胞内结构域，优选OX40的胞内结构域，例如，所述OX40的胞内结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述α链包含SEQ ID NO:16或18或37所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述β链包含SEQ ID NO:17或19或38所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述α链包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，且所述β链包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述α链包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，且所述β链包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述α链包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，且所述β链包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在一方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其包含编码本发明的针对CD19和CD22的STAR的α链和/或β链的核苷酸序列。
在一方面，本发明提供一种表达载体，其包含与调控序列可操作连接的本发明的多核苷酸。
在一方面，本发明提供一种制备治疗性T细胞的方法，包括在T细胞中表达本发明的针对CD19和CD22的STAR。
在一方面，本发明提供一种治疗性T细胞，其包含本发明的针对CD19和CD22的STAR，或其通过本发明的制备治疗性T细胞的方法获得。
在一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的治疗性T细胞，和药物可接受的载体。
在一方面，本发明提供本发明的治疗性T细胞或本发明的药物组合物在制备用于在对象中治疗疾病的药物中的用途，例如所述疾病是CD19和/或CD22相关癌症。
附图简述
图1.示出对于M971 scFv，在其与恒定区之间添加CD8 hinge后对CD22靶细胞的杀伤效果显著提高。
图2.示出CD19-22 dual STAR(CT)对CD19和CD22单靶点细胞也有很好的杀伤效果。
图3.示出基于HA22和FMC63 scFV的CD19-22 dual STAR的优化并与基于M971 和FMC63 scFV的CD19-22 dual STAR的效果比较。
图4.示出两条链恒定区N末端截短提高CD19-22 dual STAR的杀伤效果。
图5.dual STAR-T细胞与靶细胞共培养后，具有显著升高的IL-2和IFN-γ细胞因子水平。
图6.示出FMC63和M971 scFv都能很好地在T细胞表面表达。
图7.示出添加了OX40共刺激因子的dual STAR对CD19/CD22靶细胞具有更强的杀伤效果。
图8.示出小鼠模型中，注射单靶点STAR-T不能有效抑制肿瘤生长，而注射dualSTAR-T能有效清除肿瘤细胞。
图9.示出各种构建体的图谱。
发明详述
除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook et al.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”；Lewin,“Genes VIII”；及Roitt et al.,“Immunology”(第8版)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。
如本文所用，术语“和/或”涵盖由该术语连接的项目的所有组合，应视作各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”涵盖了“A”、“A和B”以及“B”。例如，“A、B和/或C”涵盖“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B 和C”。
“包含”一词在本文中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。此外，本领域技术人员清楚多肽N端由起始密码子编码的甲硫氨酸在某些实际情况下(例如在特定表达系统表达时)会被保留，但不实质影响多肽的功能。因此，本申请说明书和权利要求书中在描述具体的多肽氨基酸序列时，尽管其可能不包含N端由起始密码子编码的甲硫氨酸，然而此时也涵盖包含该甲硫氨酸的序列，相应地，其编码核苷酸序列也可以包含起始密码子；反之亦然。
如本文所用，“氨基酸编号参考SEQ ID NO:x”(SEQ ID NO:x为本文所列的某一具体序列)指的是所描述的具体氨基酸的位置编号是该氨基酸在SEQ ID NO:x上对应的氨基酸的位置编号。不同序列中的氨基酸的对应性可以根据本领域公知的序列比对方法确定。例如氨基酸对应性可以通过EMBL-EBI的在线比对工具来确定 (https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)，其中两个序列可以使用Needleman-Wunsch算法，使用默认参数来对齐。例如，一多肽从其N末端起第46位的丙氨酸与SEQ ID NO:x的第 48位的氨基酸在序列比对中对齐，则该多肽中的该氨基酸在本文中也可以被描述为“在该多肽的第48位的丙氨酸，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:x”。在本发明中，涉及α链恒定区的氨基酸位置参考SEQ ID NO:2。在本发明中，涉及β链恒定区的氨基酸位置参考SEQ ID NO:6。
在一方面，本发明提供一种针对CD19和CD22的合成T细胞受体抗原受体(STAR)，其包含α链和β链，所述α链包含第一恒定区，所述β链包含第二恒定区，
其中所述α链包含特异性结合CD19的抗原结合区，且所述β链包含特异性结合CD22的抗原结合区；或者所述α链包含特异性结合CD22的抗原结合区，且所述β链包含特异性结合CD19的抗原结合区。
在一些实施方案中，所述α链和β链在T细胞内表达后，能够形成功能性TCR复合物。例如，所述α链和β链在T细胞表达后，能够与细胞内源的CD3分子(CD3εδ、 CD3γε、CD3ζζ)相结合形成8个亚基的TCR复合物，所述TCR复合物展示在细胞表面，并且在与靶抗原CD19和/或CD22结合后激活T细胞。功能性TCR复合物指的是其能够在与靶抗原特异性结合后，激活T细胞。
在一些实施方式中，所述第一恒定区是天然TCRα链恒定区，例如，天然人TCRα链恒定区或天然小鼠TCRα链恒定区。示例性的天然人TCRα链恒定区包含SEQ ID NO:1 所示氨基酸序列。示例性的天然小鼠TCRα链恒定区包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述第一恒定区是经修饰的TCRα链恒定区。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，在第48位的氨基酸例如苏氨酸T被突变为半胱氨酸C。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，在第112位的氨基酸例如丝氨酸S被变成亮氨酸L，在114位的氨基酸例如甲硫氨酸M被变成异亮氨酸I，在第115位的氨基酸例如甘氨酸 G被变成颉氨酸V。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，其第6位的氨基酸如E被D取代，第13位的K被 R取代，且第15-18位氨基酸被缺失。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，在第48位的氨基酸例如苏氨酸T被突变为半胱氨酸C，在第112位的氨基酸例如丝氨酸S被变成亮氨酸L，在114位的氨基酸例如甲硫氨酸M被变成异亮氨酸I，在第115位的氨基酸例如甘氨酸G被变成颉氨酸V。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，其第6位的氨基酸如E被D取代，第13位的K被 R取代，第15-18位氨基酸被缺失，在第48位的氨基酸例如苏氨酸T被突变为半胱氨酸C，在第112位的氨基酸例如丝氨酸S被变成亮氨酸L，在114位的氨基酸例如甲硫氨酸M被变成异亮氨酸I，在第115位的氨基酸例如甘氨酸G被变成颉氨酸V。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，缺失恒定区的胞内区，例如缺失第136-137位氨基酸。
在一些具体的实施方案中，所述经修饰的TCRα链恒定区包含SEQ ID NO:3-4和39-41之一所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述第二恒定区是天然TCRβ链恒定区，例如，天然人TCRβ链恒定区或天然小鼠TCRβ链恒定区。示例性的天然人TCRβ链恒定区包含SEQ ID NO:5 所示氨基酸序列。示例性的天然小鼠TCRβ链恒定区包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述第二恒定区是经修饰的TCRβ链恒定区。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRβ链恒定区，在第56位的氨基酸例如丝氨酸S被突变为半胱氨酸C。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRβ链恒定区，其第3位的氨基酸如R被K取代，第6位的氨基酸如T被F取代，第9位的K被E取代，第11位的S被A取代，第12位的L被V取代，且第17、21-25位氨基酸被缺失。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRβ链恒定区，在第56位的氨基酸例如丝氨酸S被突变为半胱氨酸C，第3位的氨基酸如R被K取代，第6位的氨基酸如T被F取代，第9位的K被 E取代，第11位的S被A取代，第12位的L被V取代，且第17、21-25位氨基酸被缺失。
在一些实施方案中，所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRβ链恒定区，缺失恒定区的胞内区，例如缺失第167-172位氨基酸。
在一些具体的实施方案中，所述经修饰的TCRβ链恒定区包含SEQ ID NO:7-8和42-44之一所示氨基酸序列。
如本文所用，“抗原结合区”意指其独自或者和另一抗原结合区组合可以特异性结合靶抗原。在一些实施方案中，所述抗原结合区衍生自特异性结合靶抗原的抗体，包括任何商业可获得的抗体。
在一些实施方案中，所述抗原结合区可以是特异性结合靶抗原的单链抗体(如scFv) 或单域抗体(如骆驼抗体)。在一些实施方案中，所述抗原结合区是单链抗体例如scFv。
在一些实施方案中，所述单链抗体包含通过接头相连接的重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，所述接头是(G4S)n接头，其中n代表1-10的整数，优选地，n 是1或3。
在一些实施方案中，所述特异性结合CD19的抗原结合区是scFv，例如衍生自抗体FMC63的scFv。在一些实施方案中，所述特异性结合CD19的抗原结合区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:25所示的VH CDR1、SEQ ID NO:26所示的VHCDR2、和SEQ ID NO:27所示的VH CDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28所示的VL CDR1、SEQ ID NO:29所示的VL CDR2、和SEQ ID NO:30所示的 VL CDR3。在一些实施方案中，所述特异性结合CD19的抗原结合区包含SEQ ID NO:9 所示的重链可变区，以及SEQ ID NO:10所示的轻链可变区。在一些实施方案中，SEQ ID NO:9所示的重链可变区和SEQ ID NO:10所示的轻链可变区通过(G4S)n接头连接，其中n代表1-10的整数，优选地，n＝3。
在一些实施方案中，所述特异性结合CD22的抗原结合区是scFv，例如衍生自抗体m971或HA22的scFv。在一些实施方案中，所述特异性结合CD22的抗原结合区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:31所示的VH CDR1、SEQ ID NO:32所示的VH CDR2、和SEQ ID NO:33所示的VH CDR3，所述轻链可变区包含 SEQ ID NO:34所示的VLCDR1、SEQ ID NO:35所示的VL CDR2、和SEQ ID NO:36 所示的VL CDR3。在一些实施方案中，所述特异性结合CD22的抗原结合区包含SEQ ID NO:11所示的重链可变区，以及SEQ ID NO:12所示的轻链可变区。在一些实施方案中，所述特异性结合CD22的抗原结合区包含SEQ IDNO:46所示的重链可变区，以及SEQ ID NO:45所示的轻链可变区。在一些实施方案中，所述重链可变区和所述轻链可变区通过(G4S)n接头连接，其中n代表1-10的整数，优选地，n＝3。
在一些实施方案中，所述α链或β链的抗原结合区直接或间接融合至所述恒定区的N末端。在一些优选实施方案中，所述α链或β链，优选β链的抗原结合区通过接头融合至所述恒定区的N末端。在一些实施方案中，所述接头是CD8铰链区。在一些实施方案中，所述CD8铰链区包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述α链和/或β链在其C末端连接有至少一个外源胞内功能结构域。在一些实施方案中，所述外源胞内功能结构域直接或通过接头连接至所述α链和/或β链的恒定区的C末端。在一些实施方案中，所述外源胞内功能结构域通过接头连接至胞内区缺失的所述α链和/或β链的恒定区的C末端。在一些实施方案中，所述接头是(G4S)n接头，其中n代表1-10的整数，优选地，n是3。
如本文所用，“外源”意指来自外来物种的蛋白或核酸序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或位置的显著改变的蛋白或核酸序列。
如本文所用，“外源胞内功能结构域”可以是共刺激分子的胞内结构域诸如CD40、OX40、ICOS、CD28、4-1BB、CD27、CD137的胞内结构域；也可以是共抑制分子的胞内结构域，例如TIM3、PD1、CTLA4、LAG3的胞内结构域；也可以是细胞因子受体如白细胞介素受体(如IL-2β受体、IL-7α受体或IL-21受体)、干扰素受体、肿瘤坏死因子超家族受体、集落刺激因子受体、趋化因子受体、生长因子受体或其他膜蛋白的细胞内结构域；或者胞内蛋白如NIK的结构域。
在一些优选实施方案中，所述外源胞内功能结构域是共刺激分子的胞内结构域，优选OX40的胞内结构域。在一些实施方案中，所述OX40的胞内结构域包含SEQ ID NO:14 的氨基酸序列。
在一些优选实施方案中，所述α链包含特异性结合CD19的抗原结合区以及经修饰的TCRα链恒定区，其中
特异性结合CD19的抗原结合区包含通过接头(G4S)3连接的SEQ ID NO:9所示的重链可变区以及SEQ ID NO:10所示的轻链可变区，
所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠 TCRα链恒定区，在第48位的氨基酸例如苏氨酸T被突变为半胱氨酸C，在第112位的氨基酸例如丝氨酸S被变成亮氨酸L，在114位的氨基酸例如甲硫氨酸M被变成异亮氨酸I，在第115位的氨基酸例如甘氨酸G被变成颉氨酸V。
在一些优选实施方案中，所述α链包含特异性结合CD19的抗原结合区以及经修饰的TCRα链恒定区，其中
特异性结合CD19的抗原结合区包含通过接头(G4S)3连接的SEQ ID NO:9所示的重链可变区以及SEQ ID NO:10所示的轻链可变区，
所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠 TCRα链恒定区，第6位的氨基酸如E被D取代，第13位的K被R取代，且第15-18 位氨基酸被缺失，且在第48位的氨基酸例如苏氨酸T被突变为半胱氨酸C，在第112 位的氨基酸例如丝氨酸S被变成亮氨酸L，在114位的氨基酸例如甲硫氨酸M被变成异亮氨酸I，在第115位的氨基酸例如甘氨酸G被变成颉氨酸V。
在一些优选实施方案中，所述α链包含特异性结合CD19的抗原结合区、经修饰的TCRα链恒定区以及OX40的胞内结构域，其中
特异性结合CD19的抗原结合区包含通过接头(G4S)3连接的SEQ ID NO:9所示的重链可变区以及SEQ ID NO:10所示的轻链可变区，
所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠 TCRα链恒定区，在第48位的氨基酸例如苏氨酸T被突变为半胱氨酸C，在第112位的氨基酸例如丝氨酸S被变成亮氨酸L，在114位的氨基酸例如甲硫氨酸M被变成异亮氨酸I，在第115位的氨基酸例如甘氨酸G被变成颉氨酸V，第136-137位氨基酸被缺失。
在一些优选实施方案中，所述α链包含特异性结合CD19的抗原结合区、经修饰的TCRα链恒定区以及OX40的胞内结构域，其中
特异性结合CD19的抗原结合区包含通过接头(G4S)3连接的SEQ ID NO:9所示的重链可变区以及SEQ ID NO:10所示的轻链可变区，
所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠 TCRα链恒定区，第6位的氨基酸如E被D取代，第13位的K被R取代，且第15-18 位氨基酸被缺失，且在第48位的氨基酸例如苏氨酸T被突变为半胱氨酸C，在第112 位的氨基酸例如丝氨酸S被变成亮氨酸L，在114位的氨基酸例如甲硫氨酸M被变成异亮氨酸I，在第115位的氨基酸例如甘氨酸G被变成颉氨酸V，第136-137位氨基酸被缺失。
在一些具体实施方案中，所述α链包含SEQ ID NO:16、18或37所示的氨基酸序列。
在一些优选实施方案中，所述β链包含特异性结合CD22的抗原结合区以及经修饰的TCRβ链恒定区，其中
特异性结合CD22的抗原结合区包含通过接头(G4S)3连接的SEQ ID NO:11所示的重链可变区以及SEQ ID NO:12所示的轻链可变区，
所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠 TCRβ链恒定区，在第56位的氨基酸例如丝氨酸S被突变为半胱氨酸C。
在一些优选实施方案中，所述β链包含特异性结合CD22的抗原结合区以及经修饰的TCRβ链恒定区，其中
特异性结合CD22的抗原结合区包含通过接头(G4S)3连接的SEQ ID NO:11所示的重链可变区以及SEQ ID NO:12所示的轻链可变区，
所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠 TCRβ链恒定区，在第56位的氨基酸例如丝氨酸S被突变为半胱氨酸C，
其中所述特异性结合CD22的抗原结合区通过CD8铰链区连接至所述经修饰的 TCRβ链恒定区。
在一些优选实施方案中，所述β链包含特异性结合CD22的抗原结合区以及经修饰的TCRβ链恒定区，其中
特异性结合CD22的抗原结合区包含通过接头(G4S)3连接的SEQ ID NO:11所示的重链可变区以及SEQ ID NO:12所示的轻链可变区，
所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠 TCRβ链恒定区，其第3位的氨基酸如R被K取代，第6位的氨基酸如T被F取代，第 9位的K被E取代，第11位的S被A取代，第12位的L被V取代，且第17、21-25 位氨基酸被缺失，且在第56位的氨基酸例如丝氨酸S被突变为半胱氨酸C，
其中所述特异性结合CD22的抗原结合区通过CD8铰链区连接至所述经修饰的 TCRβ链恒定区。
在一些优选实施方案中，所述β链包含特异性结合CD22的抗原结合区、经修饰的TCRβ链恒定区以及OX40的胞内结构域，其中
特异性结合CD22的抗原结合区包含通过接头(G4S)3连接的SEQ ID NO:11所示的重链可变区以及SEQ ID NO:12所示的轻链可变区，
所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠 TCRβ链恒定区，其第3位的氨基酸如R被K取代，第6位的氨基酸如T被F取代，第 9位的K被E取代，第11位的S被A取代，第12位的L被V取代，且第17、21-25 位氨基酸被缺失，且在第56位的氨基酸例如丝氨酸S被突变为半胱氨酸C，第167-172 位氨基酸被缺失，
其中所述特异性结合CD22的抗原结合区通过CD8铰链区连接至所述经修饰的 TCRβ链恒定区。
在一些具体实施方案中，所述β链包含SEQ ID NO:17、19或38所示的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，所述α链包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，且所述β链包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，所述α链包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，且所述β链包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，所述α链包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，且所述β链包含 SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，所述α链包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，且所述β链包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，所述α链包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列，且所述β链包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，所述α链包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，且所述β链包含 SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，所述α链包含SEQ ID NO:54 所示的氨基酸序列，且所述β链包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其包含编码本发明所述合成T细胞受体抗原受体(STAR)的α链和/或β链的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述多核苷酸包含在同一读码框内的i)编码所述α链的核苷酸序列、ii)编码所述β链的核苷酸序列和iii)位于i)和ii)之间的编码自裂解肽的核苷酸序列。编码所述α链的核苷酸序列可以位于编码所述β链的核苷酸序列的5’端或3’端。
如本文所用“自裂解肽”意指可以在细胞内实现自剪切的肽。例如，所述自裂解肽可以包含蛋白酶识别位点，从而被细胞内的蛋白酶识别并特异性切割。
或者，所述自裂解肽可以是2A多肽。2A多肽是一类来自病毒的短肽，其自切割发生在翻译期间。当用2A多肽连接两种不同目的蛋白在同一读码框表达时，几乎以1:1 的比例生成两种目的蛋白。常用的2A多肽可以是来自猪捷申病毒(porcine techovirus-1) 的P2A、来自明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)的T2A、马甲型鼻病毒(equinerhinitis A virus)的E2A和来自口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)的F2A。其中 P2A的切割效率最高，因此是优选的。本领域也已知多种这些2A多肽的功能性变体，这些变体也可以用于本发明。
在另一方面，本发明提供一种表达载体，其包含与调控序列可操作连接的本发明的多核苷酸。
本发明的“表达载体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体，或者可以是能够翻译的RNA(如mRNA)。在一些优选实施方案中，所述表达载体是病毒载体，例如慢病毒载体。
“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。表达调控元件指的是能够控制感兴趣的核苷酸序列转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子、增强子和多腺苷酸化识别序列。
如本文中所用，术语“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接，使得核苷酸序列的转录被所述转录调控元件控制和调节。用于将调控元件区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域已知的。
在另一方面，本发明提供一种制备治疗性T细胞的方法，包括在T细胞中表达本发明的合成T细胞受体抗原受体(STAR)。在一些实施方案中，所述方法包括将本发明的多核苷酸或本发明的表达载体导入T细胞。
在另一方面，本发明提供一种治疗性T细胞，其包含本发明的合成T细胞受体抗原受体(STAR)，或其通过本发明的方法获得。
本发明的T细胞可以通过各种非限制性方法从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施方案中，细胞可以衍生自健康供体或来自诊断为癌症的患者。在一些实施方案中，细胞可以是呈现不同表型特征的细胞的混合群体的一部分。例如，T细胞可以通过分离外周血单个核细胞(PBMC)，然后用特异性抗体活化、扩增获得。
在本发明各方面的一些实施方案中，所述T细胞衍生自对象的自体细胞。如本文所用，“自体”是指用于治疗对象的细胞、细胞系或细胞群源自所述对象。在一些实施方案中，所述T细胞衍生自异体细胞，例如源自与所述对象人类白细胞抗原(HLA)相容的供体。可以使用标准方案将来自供体的细胞转化为非同种异体反应性细胞，并根据需要进行复制，从而产生可以施用至一个或多个患者的细胞。
在另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的治疗性T细胞，和药物可接受的载体。
本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。
在另一方面，本发明提供本发明的治疗性T细胞或本发明的药物组合物在制备用于在对象中治疗疾病例如癌症的药物中的用途。
如本文所用“对象”是指患有或者易于患有可以通过本发明的细胞、方法、或药物组合物治疗的疾病(如癌症)的生物体。非限制性例子包括人、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛、鹿，及其它非哺乳动物。在优选实施方案中，对象是人。
在另一方面，本发明提供一种在对象中治疗疾病例如癌症的方法，包括给所述对象施用治疗有效量的本发明的治疗性T细胞或本发明的药物组合物。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”或“有效量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或细胞的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。例如，“有效量”的本发明的细胞或药物组合物优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的对象，“有效量”的本发明的细胞或药物组合物优选地将肿瘤细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制肿瘤细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。
实际应用中，本发明药物组合物中细胞的剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。
根据本发明的治疗性T细胞或药物组合物或药物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过注射、输注、植入或移植。本文所述的细胞或组合物施用可以通过静脉内、淋巴内、皮内、肿瘤内、髓内、肌内或腹膜内施用。在一个实施方案中，本发明的细胞或组合物优选通过静脉内注射施用。
在本发明各个方面的实施方案中，所述疾病是CD19和/或CD22相关疾病，例如CD19和/或CD22表达异常相关疾病，例如是CD19和/或CD22相关癌症。所述癌症可以是B细胞恶性肿瘤，例如慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、淋巴细胞性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、以及所述癌症的组合。在一些实施方案中，所述癌症是CD19和/或CD22 阳性癌症。
实施例
实验材料和方法
载体构建
本申请实施例中所用的慢病毒载体、慢病毒包装质粒均购买自商业公司或由商业公司合成。本申请实施例中采用的基因片段包括信号肽、抗体结合区、铰链区、TCR恒定区、标签蛋白等均来源于商业化公司合成。通过合成引物PCR方式，连接一段或多段目的片段获得相应功能序列。本发明使用中的慢病毒载体为pHAGE-EF1α-RFP，通过限制性内切酶NotI/Cla I获得pHAGE-EF1A-WPRE-AMP载体，片段基因通过合成和 PCR方法获得，通过同源重组方法，在重组酶作用下获得完整载体。
本申请实施例中构建了以下构建体：CD19-22 CAR、CD19-22 STAR(CT)、CD19-22STAR-OX40、CD19-STAR(CT)、CD22-STAR(CT)、M971(BspEI)ba、M971(CD8h)ba、 M971(EcoRI)ba、M971(G4S)ba、M971ba。各构建体的图谱见图8。
作为对照的CD19-22 CAR的氨基酸序列示于SEQ ID NO:24。
靶向CD22的抗原结合区选择M971的scFv，其中M971重链可变区(VH)的氨基酸序列示于SEQ ID NO:11；轻链可变区(VL)的氨基酸序列示于SEQ ID NO:12。靶向CD19 的抗原结合区选择FMC63的scFv，其中FMC63重链可变区(VH)的氨基酸序列示于SEQ ID NO:9；轻链可变区(VL)的氨基酸序列示于SEQ ID NO:10。连接VH和VL的接头为 GGGGSGGGGSGGGGS(即(G4S)3)。CD8铰链(hinge)区氨基酸序列示于SEQ ID NO:13。
α链恒定区为小鼠来源，野生型命名为TRAC，序列示于SEQ ID NO:2。TRAC(CT) 指的是48位苏氨酸T突变为半胱氨酸C且包含LSVMGLRIL变为LLVIVLRIL的突变的鼠源恒定区，其氨基酸序列示于SEQ ID NO:3。TRAC(NCT)指的是在TRAC(CT)的基础上进行N末端修饰，TRAC(NCT)氨基酸序列示于SEQ ID NO:4。
β链恒定区为小鼠来源，野生型命名为TRBC，序列示于SEQ ID NO:6。TRBC(CT) 指的是56位丝氨酸S突变为半胱氨酸C的鼠源恒定区，其氨基酸序列示于SEQ ID NO:7。TRBC(NCT)指的是在TRBC(CT)的基础上进行N末端修饰，TRBC(NCT)氨基酸序列示于SEQ ID NO:8。
共刺激分子OX40胞质区的氨基酸序列示于SEQ ID NO:14。
慢病毒包装
将Lentix-293T细胞按照5×105个/mL接种至10cm培养皿中，置于37℃、5％CO2 培养箱中培养，待细胞密度达到80％(在显微镜下观察)左右时进行转染。将三质粒按照PMD2.G:PSPAX:transfer plamid＝1:2:3比例，与500uL无血清的DMEM混合均匀。将 54uLPEI-max与500uL无血清的DMEM混合均匀，室温静置5min(PEI-Max和质粒的体积质量比为3:1)。将PEI-max混合液缓慢加至质粒混合液中，轻轻吹打，混匀，室温静置15min。将最终混合液缓慢加入培养基中，充分混匀后，放回培养箱中继续培养 12h-16h，换到6％FBS DMEM培养基中继续培养，收取48h、72h病毒液。
T细胞的培养与感染
1)Jurkat T细胞系的培养方法
Jurkat T细胞系用含10％FBS的RPMI 1640培养基培养。培养密度为3*105/ml，最高不超过3*106/ml，隔1-2天进行传代，细胞计数后取所需量细胞，并补充培养基调整至上述密度，置于C02培养箱培养。
2)Jurkat T细胞系的感染方法
细胞计数，取1*106/ml细胞离心换液，用1ml含10％FBS的RPMI 1640培养基重悬，加入24孔板中，加入病毒液(MOI＝1)，1500rpm，离心90min，置于C02培养箱培养。感染12h后彻底换液为新鲜含10％FBS的RPMI 1640培养基，72h检测阳性率。
3)人原代T细胞的培养方法
用Ficoll分离法获得原代T细胞后，用含10％FBS及100IU/ml IL-2的X-VIVO培养基培养，初始培养密度为1*106/ml，加入CD3及RetroNectin(终浓度均为5μg/ml)预包被的孔板中。后期培养密度为5*105/ml，最高不超过3*106/ml，隔1-2天进行传代。
4)人原代T细胞的感染方法
原代T细胞培养48h后用加入病毒液，MOI＝20，1500rpm，离心90min，置于C02培养箱培养。感染24h后补充含10％FBS及100IU/ml IL-2的X-VIVO培养基并转孔， 72h通过标签蛋白或者抗体检测感染效率。
5)感染效率检测方法
感染72h后，细胞吹匀计数，取5*105/ml离心，弃上清，染色液为PBS+2％FBS+2 mMEDTA，加入对应抗体进行孵育，孵育30min，然后加入PBS清洗两次，上机检测。
STAR-T细胞的体外功能检测
取阳性T细胞与表达Luciferase的靶细胞(Raji细胞、CD19-KO Raji细胞或CD22-KO Raji细胞)以指定的效靶比共培养。
共培养24h后，轻轻吹匀细胞悬液，每孔取150μL细胞悬液加入到白色96孔板中，每孔取2个复孔，加入luciferase底物。振荡(低速)，共孵育10min后，使用多功能酶标仪检测化学发光值。计算细胞杀伤：杀伤效率＝100％-(效应细胞-靶细胞孔值/对照细胞 -靶细胞孔值)。或者，在共培养24h后，收集细胞培养上清液，通过商品化试剂盒检测细胞因子的含量。
STAR-T细胞的体内功能检测
采用NSG免疫缺陷型小鼠构建模型。该小鼠基因型为NOD-Prkdcem26Il2rgem26/Nju，缺乏T细胞、B细胞、NK细胞，并且其巨噬细胞和树突状细胞也存在缺陷。本实验将采用6～8周龄的雌性NSG小鼠，每批实验中小鼠体重差异控制在2g以内。小鼠饲养于无特定病原体(SPF)的独立通风笼中，提供正常饮食和pH偏酸的饮用水，以防止病原体污染。
采用人类Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji细胞进行异种移植构建肿瘤模型。Raji细胞为通过慢病毒载体表达了荧光素酶(luciferase)基因的细胞株，在小鼠体内通过荧光素化学发光、活体成像的方式实时监测Raji肿瘤的发展变化。该模型中，1～3x106细胞的Raji-luciferase细胞通过尾静脉回输方式接种于6～8周的雌性NSG小鼠中。通过给小鼠腹腔注射荧光素钾盐溶液，通过活体成像的方式检测体内肿瘤细胞的荧光信号。
实施例1、STAR结构及其优化
1)STAR设计
B细胞产生的分泌抗体(Antibody，Ab)或B细胞受体(BCR)与T细胞受体(TCR)在基因结构、蛋白结构和空间构象上有很大的相似性。抗体和TCR都是由可变区和恒定区组成，其中可变区起到抗原识别和结合的作用，而恒定区结构域起到结构互作和信号转导的作用。通过把TCRα和β链(或TCRγ和δ链)的可变区替换为抗体的重链可变区(VH) 和轻链可变区(VL)，可以构建出一种人工合成的嵌合分子，称为合成T细胞受体抗体受体(SyntheticT-Cell Receptor and Antibody Receptor,STAR)。
STAR分子有两条链，第一条链是抗原识别序列(如抗体的重链可变区VH)与T细胞受体α链(TCRα)的恒定区(Cα)相融合而得，第二条链是抗原识别序列(如抗体的轻链可变区VL)与T细胞受体β链(TCRβ)的恒定区(Cβ)相融合而得。该构建体中抗原识别结构域(如VH、VL或scFv等)与恒定区结构域(TCRα、β的恒定区)可以进行排列组合，组成多种构型不同但功能类似的构建体。
STAR分子的第一、二条链在T细胞内表达后，会在内质网中与细胞内源的CD3εδ、CD3γε、CD3ζζ链相结合形成8个亚基的复合物，并以复合物的形式展示在细胞膜表面。免疫受体酪氨酸活化基序(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif，ITAM)是 TCR分子中起到信号转导作用的基序，其保守序列为YxxL/V。CD3ε、δ、γ、ε链的胞内区含有1个ITAM序列，CD3ζ链的胞内区含有3个ITAM序列，所以一个完整STAR 复合体共含有10个ITAM序列。当STAR受体的抗原识别序列与其特异性抗原结合后，胞内的ITAM序列会逐次被磷酸化，进而激活下游信号通路，激活NF-κΒ、NFAT和AP-1 等转录因子，引发激活T细胞，产生效应功能。
2)STAR优化
STAR是根据TCR设计的结构，因为T细胞本身表达TCR，STAR可与内源TCR 发生错配，从而产生没有功能的新结构。本发明中通过恒定区鼠源化、半胱氨酸点突变、 N末端修饰、α链恒定区疏水氨基酸突变来改善STAR功能。
首先恒定区鼠源化修饰：由于人源、灵长类动物来源和鼠源TCRα/β链的恒定区序列的功能保守性较高，且关键氨基酸序列相同，所以可以相互替换。互换后一方面增加了STAR分子正确配对的效率，另一方面减少了错配产生未知特异性的可能，增加了安全性。
其次半胱氨酸点突变引入二硫键：于鼠源化TCRα链恒定区将48位苏氨酸T突变为半胱氨酸C，于鼠源化TCRβ链恒定区将56位丝氨酸S突变为半胱氨酸C。这两个新增的半胱氨酸会在STAR的两条链间形成二硫键，减少STAR两条链与内源性TCR 链的错配，帮助STAR分子形成更加稳定的复合体。
STAR跨膜区疏水氨基酸替换的设计：在TCRα链恒定区跨膜区的111位至119位氨基酸区域内进行3个氨基酸位点的突变，将112位丝氨酸S变成亮氨酸L、114位甲硫氨酸M变成异亮氨酸I、115位甘氨酸G变成颉氨酸V。该区域整体氨基酸序列由 LSVMGLRIL变为LLVIVLRIL。这一设计增加了跨膜区的疏水性，抵消了TCR跨膜区携带正电荷所导致的不稳定性，使得STAR分子能在细胞膜上更为稳定地存在，进而获得更好的功能。
为进一步优化STAR分子的设计，在恒定区鼠源化、半胱氨酸点突变和α链恒定区疏水氨基酸突变基础上对STAR分子恒定区N端进行特定重排，以获得更优效果。重排意为进行部分序列删除，同时对部分序列进行人源化突变。人源化突变的意义在于，在保证STAR分子功能的同时，尽可能减少STAR分子中的非人源序列，以最大程度规避 STAR-T细胞在临床应用中被受体排斥的可能。
TCRα链恒定区N端的18个氨基酸(鼠源序列为DIQNPEPAVYQLKDPRSQ)重排方案，通过氨基酸性质分析，发现鼠源和人源序列在E6D、K13R、R16K、Q18S这些位点均属同性质氨基酸替换，而在P15S位点属于非极性氨基酸替换为极性氨基酸，因此可认为该位点附近的蛋白质性质不保守、进而可以进行修改而不影响功能。综上，将1-14 位氨基酸序列保留并人源化、并删除15-18位氨基酸。
TCRβ链恒定区N端的25个氨基酸(鼠源序列为 DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQK)重排方案，通过氨基酸性质分析，发现鼠源和人源序列仅在R3K和L12V位点属同性质氨基酸替换，而在T6F、K8E、S11A、K17E、A21S、N22H和K23T位点均属不同氨基酸性质的替换，因此可认为该位点附近的蛋白质性质不保守、进而可以进行修改而不影响功能。综上，将1-16位氨基酸序列保留并人源化、并删除17、21-25位氨基酸。
此外，还测试了额外的铰链(hinge)结构对STAR的影响。具体而言，将靶向CD22 的M971的scFv构建在STAR的β链恒定区的N端，并在中间添加不同的铰链结构(分别为BspEI编码的氨基酸序列、EcoRI编码的氨基酸序列、CD8铰链区、G4S接头)。获得构建体M971(BspEI)ba、M971(CD8h)ba、M971(EcoRI)ba、M971(G4S)ba、M971ba。将所得构建体转导T细胞，获得相应的STAR-T细胞。测试包含所获得的不同的STAR-T 细胞对表达CD22的Raji细胞的特异性杀伤(分别采用了0.5：1和1:1的效靶比)。
实验结果如图1所示，发现对于使用针对CD22的M971 scFv的STAR来说，加上 CD8hinge后对CD22靶细胞的杀伤效果明显优于其他结构。
实施例2、靶向CD19和CD22的双靶点STAR
使用针对CD19的FMC63 scFv构建了靶向CD19的STAR，其中FMC63 scFv构建在β链恒定区的N端，β链恒定区C末端连接至共刺激分子OX40胞内域，该STAR结构命名为CD19-STAR(CT)。其中CT代表鼠源恒定区进行了实施例1所述的半胱氨酸修饰(C)和α链跨膜区疏水性修饰(T)。
使用针对CD22的M971 scFv构建了靶向CD19的STAR，其中M971 scFv构建在β链恒定区的N端，β链恒定区C末端连接至共刺激分子OX40胞内域，该STAR结构命名为CD22-STAR(CT)。
使用针对CD19的FMC63 scFv以及针对CD22的M971 scFv构建了同时靶向CD19 和CD22的双靶点STAR，即CD19-22 STAR(CT)。
然后，使用CRISPR-Cas9系统构建了CD19或CD22敲除的Raji细胞系用于检测CD19-22 STAR(CT)对单靶点的杀伤效果，CD19-STAR(CT)和CD22-STAR(CT)作为对照。结果如图2所示，可以看出CD19-22 STAR(CT)对CD19和CD22单靶点细胞也有很好的杀伤效果。
为进一步检测M971及FMC63 scFv对CD22/19靶点的特异性杀伤，使用不表达 CD19及CD22的人肾上皮细胞系293T作为靶细胞。293T细胞为通过慢病毒过表达了 luciferase-GFP的细胞，同时，在此细胞基础上通过慢病毒构建了过表达CD19及CD22 的293T-CD19/22靶细胞。
为了比较M971 scFv的杀伤效果，构建了另一个靶向CD22的HA22 scFv，使用针对CD19的FMC63 scFv构建了同时靶向CD19和CD22的双靶点STAR，STAR结构类似于上述FMC63-M971 STAR。在此基础上，对HA22 scFv的接头区(连接轻、重链的接头)及铰链区(连接scFv和TCR恒定区)也进行了优化，包括更换(G4S)3接头为M218结构、更换(G4S)3接头为(G4S)4结构、添加CD8铰链区获得HA22(M218)、HA22(4G4S)、 HA22(CD8h)双靶点STAR结构。将所得构建体转导T细胞，获得相应的STAR-T细胞。测试包含所获得的不同的STAR-T细胞分别对过表达CD19、CD22的293T细胞的特异性杀伤。
实验结果如图3所示，可以看出HA22双靶点STAR在优化前对CD22的杀伤效果较差；优化后添加CD8铰链区的双靶点STAR对CD22的杀伤效果增强，但同时对不表达CD22的293T细胞出现了较强的非特异杀伤。另外两种HA22双靶点STAR-T细胞对CD22的杀伤效果都较弱，同时这两种结构包括未优化的HA22双靶点STAR-T细胞对CD19靶细胞的杀伤效果较弱，可能原因是HA22构象影响了FMC63对CD19靶点的识别或结合。同时从实验结果可以看出，M971(CD8h)双靶点STAR结构对CD19/22 靶细胞的杀伤能力优于HA22的所有结构。
实施例3、通过恒定区N端修饰优化CD19-22 STAR
为了进一步改进CD19-22 STAR，对其结构进行了优化，特别是在CD19-22 STAR(CT) 基础上进一步将α链和β链的恒定区N末端进行如实施例1所述修饰，获得CD19-22STAR(NCT)：α链序列示于SEQ ID NO:37；β链序列示于SEQ ID NO:38。NCT中的N 代表N末端修饰。然后通过淋巴瘤细胞系Raji细胞、CD19敲除的Raji细胞、CD22敲除的Raji细胞测试了CD19-22 STAR(CT)、CD19-22 STAR(NCT)以及作为对照的 CD19-22 CAR的杀伤能力。
实验结果如图4所示，发现CD19-22 STAR(NCT)对CD19/CD22单靶点细胞的杀伤效果优于N末端未修饰的CD19-22 STAR(CT)及CD19-22 CAR。
此外，还检测量dual STAR对细胞因子分泌的影响。两种CD19-22 STAR-T细胞与靶细胞共培养24h后，收集培养基上清，检测细胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α。结果如图5所示，IL-2和IFN-γ细胞因子水平显著升高，而TNF-α水平则相对较低。
实施例4、通过添加共刺激因子优化CD19-22 STAR
对CD19-22 STAR(CT)结构进行了进一步优化，在两条链缺失C端天然胞内区(对于衍生自小鼠的α链恒定区为C端最后2个氨基酸SS，对衍生自小鼠β链恒定区为C端最后6个氨基酸VKRKNS)，并通过接头(G4S)3添加了OX40共刺激因子，获得CD19-22 STAR-OX40(α链:SEQ ID NO:18；β链:SEQ ID NO:19)并测试其杀伤能力。CD19-22 STAR-OX40构建体转染T细胞后，用识别FMC63的R19(Anti-Mouse FMC63 scFv mAb (R19M))，和识别M971的CD22进行流式细胞术分析。结果如图6所示，FMC63和 M971 scFv都能在T细胞表面表达，并且和RFP表达基本一致，说明FMC63和M971 scFv 都能很好上膜。
靶细胞结果如图7所示，添加了OX40共刺激因子的CD19-22 STAR对CD19/CD22 靶细胞具有更强的杀伤效果。
实施例5、CD19-22 STAR-OX40的体内功能检测
NSG小鼠通过尾静脉注射单靶点及双靶点混合靶细胞 (90％Raji+5％Raji-CD19KO+5％Raji-CD22KO)7天后，注射CD19-STAR-OX40 T细胞、 CD22-STAR-OX40 T细胞及CD19-22 STAR-OX40 T细胞，其中这些STAR均包含α和β链胞内区缺失、通过接头(G4S)3添加了OX40共刺激因子且包含恒定区NCT修饰。结果如图8所示，注射单靶点STAR-T不能有效抑制肿瘤生长，而注射CD19-22 STAR-T 能有效清除肿瘤细胞，说明CD19-22 STAR在体内能有效杀伤CD19/22靶细胞。
序列表：
SEQ ID NO:1人T细胞受体α链恒定区
DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWS NKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLM TLRLWSS
SEQ ID NO:2小鼠T细胞受体α链恒定区
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWS NQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLR LWSS
SEQ ID NO:3包含半胱氨酸取代和疏水区改造的小鼠T细胞受体α链恒定区
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQT SFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:4包含N末端修饰、半胱氨酸取代和跨膜区疏水改造的小鼠T细胞受体α链恒定区
DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTS FTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:5人T细胞受体β链恒定区
DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQP ALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADC GFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
SEQ ID NO:6小鼠T细胞受体β链恒定区
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKES NYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITS ASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
SEQ ID NO:7包含半胱氨酸取代的小鼠T细胞受体β链恒定区
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKES NYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITS ASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
SEQ ID NO:8包含N末端修饰和半胱氨酸取代的小鼠T细胞受体β链恒定区
DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLS SRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGV LSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
SEQ ID NO:9 Anti-CD19 FMC63 VH
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSR LTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:10 Anti-CD19 FMC63 VL
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
SEQ ID NO:11 Anti-CD22 M971 VH
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAV SVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:12 Anti-CD22 M971 VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO:13 CD8铰链(hinge)区氨基酸序列
SHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO:14 OX40胞内域
RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQ ID NO:15(G4S)3接头
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:16 CD19-22 STAR(CT)α链
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLV APSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVF LKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDM KAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLL MTLRLWSS
SEQ ID NO:17 CD19-22 STAR(CT)β链
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLV KPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSK NQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSEFSHFVPVFLPAKPTTTPAPR PPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLV CLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQV QFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTL VVMAMVKRKNS
SEQ ID NO:18 CD19-22 STAR-OX40的α链(CT)
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLV APSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVF LKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLD MKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFN LLMTLRLWGGGGSGGGGSGGGGSRRDQ RLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQ ID NO:19 CD19-22 STAR-OX40的β链(CT)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLV KPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSK NQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSEFSHFVPVFLPAKPTTTPAPR PPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLV CLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQV QFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTL VVMAMGGGGSGGGGSGGGGSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQ ID NO:20 CD19-STAR(CT)的β链
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLV APSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVF LKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIAN KQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPR NHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATL YAVLVSTLVVMAMVKRKNSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQ ID NO:21 CD19-STAR(CT)或CD22-STAR(CT)或M971(CD8h)ba的α链
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQ TSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI*
SEQ ID NO:22 CD22-STAR(CT)或M971(CD8h)ba的β链
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLV KPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSK NQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSEFSHFVPVFLPAKPTTTPAPR PPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLV CLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQV QFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTL VVMAMVKRKNSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQ ID NO:23 CD22-STAR(CT)α链
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQT SFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQ ID NO:24 CD19-22 CAR
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTC AISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNS VTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGSTSGSGKPGSGEGSTKGDIQMTQSPSSLS ASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQ AEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGV SWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYY YGGSYAMDYWGQGTSVTVSSEFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEED GCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKP QRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:25FMC63重链可变区CDR1氨基酸序列
GVSLPDYG
SEQ ID NO:26FMC63重链可变区CDR2氨基酸序列
IWGSETT
SEQ ID NO:27FMC63重链可变区CDR3氨基酸序列
AK
SEQ ID NO:28FMC63轻链可变区CDR1氨基酸序列
QDISKY
SEQ ID NO:29FMC63轻链可变区CDR2氨基酸序列
HTS
SEQ ID NO:30FMC63轻链可变区CDR3氨基酸序列
QQGNTLP
SEQ ID NO:31M971重链可变区CDR1氨基酸序列
GDSVSSNSAA
SEQ ID NO:32 M971重链可变区CDR2氨基酸序列
TYYRSKWYN
SEQ ID NO:33 M971重链可变区CDR3氨基酸序列
AR
SEQ ID NO:34 M971轻链可变区CDR1氨基酸序列
QTIWSY
SEQ ID NO:35 M971轻链可变区CDR2氨基酸序列
AAS
SEQ ID NO:36 M971轻链可变区CDR3氨基酸序列
QQSYSIP
SEQ ID NO:37 CD19-22 STAR(NCT)α链
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLV APSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVF LKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTD FDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDA TLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
SEQ ID NO:38 CD19-22 STAR(NCT)β链
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPGLV KPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSK NQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSEFSHFVPVFLPAKPTTTPAPR PPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDEDLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFF PDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSE EDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM VKRKNS
SEQ ID NO:39缺失胞内区的小鼠T细胞受体α链恒定区
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWS NQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLR LW
SEQ ID NO:40缺失胞内区的并包含半胱氨酸取代和疏水区改造的小鼠T细胞受体α链恒定区
DIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQT SFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLW
SEQ ID NO:41缺失胞内区、包含N末端修饰、半胱氨酸取代和跨膜区疏水改造的小鼠T细胞受体α链恒定区
DIQNPDPAVYQLRDDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTS FTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLW
SEQ ID NO:42缺失胞内区的小鼠T细胞受体β链恒定区
DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKES NYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITS ASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM
SEQ ID NO:43缺失胞内区、包含半胱氨酸取代的小鼠T细胞受体β链恒定区DLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKES NYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITS ASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM
SEQ ID NO:44 缺失胞内区、包含N末端修饰和半胱氨酸取代的小鼠T细胞受体β链恒定区
DLKNVFPPEVAVFEPSAEIATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLS SRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAM
SEQ ID NO:45 Anti-CD22 HA22 VL
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKA
SEQ ID NO:46 Anti-CD22 HA22 VH
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGTYYPDTVKG RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO:47 HA22-FC63双靶点STARβ链
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSG TDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKAGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLKLS CAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCAR HSGYGSSYGVLFAYWGQGTLVTVSAEDLRNVTPPKVSLFEPSK AEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFW HNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRA DCGITSASYQQGVLSATILYEILL GKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNS
Figure BDA0002952381670000231
SEQ ID NO:48 HA22-FC63双靶点STARα链
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVT CTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAK HYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLC LFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
Figure BDA0002952381670000233
Figure BDA0002952381670000232
SEQ ID NO:49 HA22(M218)-FC63双靶点STARβ链
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKAGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESG GGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGTYYPDTVKGRFTISRDNA KNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQGTLVTVSAEDLRNVTPPKVSLFEPS KAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATF WHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEIL LGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQ ID NO:50 HA22(M218)-FC63双靶点STARα链
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLV APSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVF LKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLC LFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDV PCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSRRDQRLPPDAHKPPGGGSF RTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQ ID NO:51 HA22(4G4S)-FC63双靶点STARβ链
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQL VESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGTYYPDTVKGRFTIS RDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQGTLVTVSAEDLRNVTPPKVS LFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLR VSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATI LYEILLGKATLYAVLVSTLVVMAMVKRKNSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQ ID NO:52 HA22(4G4S)-FC63双靶点STARα链
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLV APSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVF LKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLC LFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDV PCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSRRDQRLPPDAHKPPGGGSF RTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQ ID NO:53 HA22(CD8h)-Fc63双靶点STARβ链
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKAGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGG GLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGGTYYPDTVKGRFTISRDNAK NTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQGTLVTVSAEFSHFVPVFLPAKPTTTPA PRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKAT LVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRC QVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLV STLVVMAMVKRKNSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQ ID NO:54 HA22(CD8h)-Fc63双靶点STARα链
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLV APSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVF LKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLC LFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKCVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDV PCDATLTEKSFETDMNLNFQNLLVIVLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSRRDQRLPPDAHKPPGGGSF RTPIQEEQADAHSTLAKI。
序列表
<110> 华夏英泰（北京）生物技术有限公司
<120> 针对CD19 和CD22 的双靶点STAR
<130> I2020TC5148CB
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 141
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
20 25 30
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
85 90 95
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
100 105 110
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
115 120 125
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 2
<211> 137
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 2
Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg
1 5 10 15
Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile
20 25 30
Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr
65 70 75 80
Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr
85 90 95
Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser
100 105 110
Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
115 120 125
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135
<210> 3
<211> 137
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 3
Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg
1 5 10 15
Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile
20 25 30
Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys
35 40 45
Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr
65 70 75 80
Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr
85 90 95
Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu
100 105 110
Val Ile Val Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
115 120 125
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135
<210> 4
<211> 133
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 4
Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Asp Ser
1 5 10 15
Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys
20 25 30
Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met
35 40 45
Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln
50 55 60
Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr
65 70 75 80
Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe
85 90 95
Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile Val Leu
100 105 110
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
115 120 125
Arg Leu Trp Ser Ser
130
<210> 5
<211> 176
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
50 55 60
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
65 70 75 80
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
85 90 95
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
100 105 110
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
115 120 125
Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala
130 135 140
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
145 150 155 160
Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
165 170 175
<210> 6
<211> 172
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 6
Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu
50 55 60
Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr
65 70 75 80
Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His
85 90 95
Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val
100 105 110
Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile
115 120 125
Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr
130 135 140
Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr
145 150 155 160
Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
165 170
<210> 7
<211> 172
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 7
Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu
50 55 60
Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr
65 70 75 80
Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His
85 90 95
Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val
100 105 110
Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile
115 120 125
Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr
130 135 140
Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr
145 150 155 160
Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
165 170
<210> 8
<211> 166
<212> PRT
<213> mus musculus
<400> 8
Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Ala Glu Ile Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp
20 25 30
His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly
35 40 45
Val Cys Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys
50 55 60
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg
65 70 75 80
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp
85 90 95
Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala
100 105 110
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln
115 120 125
Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys
130 135 140
Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met
145 150 155 160
Val Lys Arg Lys Asn Ser
165
<210> 9
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>

Claims (48)

1.一种针对CD19和CD22的合成T细胞受体抗原受体(STAR)，其包含α链和β链，所述α链包含第一抗原结合区和第一恒定区，所述β链包含第二抗原结合区和第二恒定区，
其中所述第一抗原结合区是特异性结合CD19的抗原结合区，且所述第二抗原结合区是特异性结合CD22的抗原结合区；或者所述第一抗原结合区是特异性结合CD22的抗原结合区，且所述第二抗原结合区是特异性结合CD19的抗原结合区。
2.权利要求1的针对CD19和CD22的STAR，其中所述第一恒定区是经修饰的TCRα链恒定区。
3.权利要求2的针对CD19和CD22的STAR，其中所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，在第48位的氨基酸例如苏氨酸T被突变为半胱氨酸C。
4.权利要求2或3的针对CD19和CD22的STAR，其中所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，在第112位的氨基酸例如丝氨酸S被变成亮氨酸L，在114位的氨基酸例如甲硫氨酸M被变成异亮氨酸I，在第115位的氨基酸例如甘氨酸G被变成颉氨酸V。
5.权利要求2-4中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，在第48位的氨基酸例如苏氨酸T被突变为半胱氨酸C，在第112位的氨基酸例如丝氨酸S被变成亮氨酸L，在114位的氨基酸例如甲硫氨酸M被变成异亮氨酸I，在第115位的氨基酸例如甘氨酸G被变成颉氨酸V。
6.权利要求2-5中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，第6位的氨基酸如E被D取代，第13位的K被R取代，且第15-18位氨基酸被缺失。
7.权利要求2-6中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，第6位的氨基酸如E被D取代，第13位的K被R取代，且第15-18位氨基酸被缺失，且在第48位的氨基酸例如苏氨酸T被突变为半胱氨酸C，在第112位的氨基酸例如丝氨酸S被变成亮氨酸L，在114位的氨基酸例如甲硫氨酸M被变成异亮氨酸I，在第115位的氨基酸例如甘氨酸G被变成颉氨酸V。
8.权利要求2-6中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，缺失恒定区的胞内区，例如缺失第136-137位氨基酸。
9.权利要求1的针对CD19和CD22的STAR，所述经修饰的TCRα链恒定区包含SEQ ID NO:3-4和39-41之一所示氨基酸序列。
10.权利要求1-9中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述第二恒定区是经修饰的TCRβ链恒定区。
11.权利要求10的针对CD19和CD22的STAR，其中所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRβ链恒定区，在第56位的氨基酸例如丝氨酸S被突变为半胱氨酸C。
12.权利要求10或11的针对CD19和CD22的STAR，其中所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRβ链恒定区，其第3位的氨基酸如R被K取代，第6位的氨基酸如T被F取代，第9位的K被E取代，第11位的S被A取代，第12位的L被V取代，且第17、21-25位氨基酸被缺失。
13.权利要求10-12中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRβ链恒定区，其第3位的氨基酸如R被K取代，第6位的氨基酸如T被F取代，第9位的K被E取代，第11位的S被A取代，第12位的L被V取代，且第17、21-25位氨基酸被缺失，且在第56位的氨基酸例如丝氨酸S被突变为半胱氨酸C。
14.权利要求10-13中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRβ链恒定区，缺失恒定区的胞内区，例如缺失第167-172位氨基酸。
15.权利要求14的针对CD19和CD22的STAR，所述经修饰的TCRβ链恒定区包含SEQ IDNO:7-8和42-44之一所示氨基酸序列。
16.权利要求1-15中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述抗原结合区是单链抗体(如scFv)或单域抗体(如骆驼抗体)，优选所述抗原结合区是单链抗体例如scFv。
17.权利要求16的针对CD19和CD22的STAR，其中所述单链抗体包含通过接头相连接的重链可变区和轻链可变区，例如，所述接头是(G4S)n接头，其中n代表1-10的整数，优选地，n是1或3。
18.权利要求1-17中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述特异性结合CD19的抗原结合区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:25所示的VHCDR1、SEQ ID NO:26所示的VH CDR2、和SEQ ID NO:27所示的VH CDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:28所示的VL CDR1、SEQ ID NO:29所示的VL CDR2、和SEQ ID NO:30所示的VLCDR3，
例如，所述特异性结合CD19的抗原结合区包含SEQ ID NO:9所示的重链可变区以及SEQID NO:10所示的轻链可变区。
19.权利要求1-18中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述特异性结合CD22的抗原结合区包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:31所示的VHCDR1、SEQ ID NO:32所示的VH CDR2、和SEQ ID NO:33所示的VH CDR3，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:34所示的VL CDR1、SEQ ID NO:35所示的VL CDR2、和SEQ ID NO:36所示的VLCDR3，
例如，所述特异性结合CD22的抗原结合区包含SEQ ID NO:11所示的重链可变区，以及SEQ ID NO:12所示的轻链可变区。
20.权利要求1-19中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述α链或β链的抗原结合区直接或间接融合至所述恒定区的N末端。
21.权利要求1-20中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述α链或β链的抗原结合区通过接头融合至所述恒定区的N末端。
22.权利要求21的针对CD19和CD22的STAR，其中所述α链或β链，优选β链的抗原结合区通过CD8铰链区融合至所述恒定区的N末端，例如，所述CD8铰链区包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列。
23.权利要求1-22中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述α链和/或β链在其C末端连接有至少一个外源胞内功能结构域。
24.权利要求23的针对CD19和CD22的STAR，其中所述外源胞内功能结构域直接或通过接头连接至所述α链和/或β链的恒定区的C末端，
优选地，所述外源胞内功能结构域通过接头连接至胞内区缺失的所述α链和/或β链的恒定区的C末端，
优选地，所述接头是(G4S)n接头，其中n代表1-10的整数，优选地，n是3。
25.权利要求23或24的针对CD19和CD22的STAR，其中所述外源胞内功能结构域是共刺激分子的胞内结构域，优选OX40的胞内结构域，例如，所述OX40的胞内结构域包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列。
26.权利要求1-25中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述α链包含特异性结合CD19的抗原结合区以及经修饰的TCRα链恒定区，其中
特异性结合CD19的抗原结合区包含通过接头(G4S)3连接的SEQ ID NO:9所示的重链可变区以及SEQ ID NO:10所示的轻链可变区，
所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，在第48位的氨基酸例如苏氨酸T被突变为半胱氨酸C，在第112位的氨基酸例如丝氨酸S被变成亮氨酸L，在114位的氨基酸例如甲硫氨酸M被变成异亮氨酸I，在第115位的氨基酸例如甘氨酸G被变成颉氨酸V。
27.权利要求1-25中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述α链包含特异性结合CD19的抗原结合区以及经修饰的TCRα链恒定区，其中
特异性结合CD19的抗原结合区包含通过接头(G4S)3连接的SEQ ID NO:9所示的重链可变区以及SEQ ID NO:10所示的轻链可变区，
所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，第6位的氨基酸如E被D取代，第13位的K被R取代，且第15-18位氨基酸被缺失，且在第48位的氨基酸例如苏氨酸T被突变为半胱氨酸C，在第112位的氨基酸例如丝氨酸S被变成亮氨酸L，在114位的氨基酸例如甲硫氨酸M被变成异亮氨酸I，在第115位的氨基酸例如甘氨酸G被变成颉氨酸V。
28.权利要求1-25中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述α链包含特异性结合CD19的抗原结合区、经修饰的TCRα链恒定区以及OX40的胞内结构域，其中
特异性结合CD19的抗原结合区包含通过接头(G4S)3连接的SEQ ID NO:9所示的重链可变区以及SEQ ID NO:10所示的轻链可变区，
所述经修饰的TCRα链恒定区衍生自小鼠TCRα链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRα链恒定区，第6位的氨基酸如E被D取代，第13位的K被R取代，且第15-18位氨基酸被缺失，且在第48位的氨基酸例如苏氨酸T被突变为半胱氨酸C，在第112位的氨基酸例如丝氨酸S被变成亮氨酸L，在114位的氨基酸例如甲硫氨酸M被变成异亮氨酸I，在第115位的氨基酸例如甘氨酸G被变成颉氨酸V，第136-137位氨基酸被缺失。
29.权利要求1的针对CD19和CD22的STAR，其中所述α链包含SEQ ID NO:16或18或37所示的氨基酸序列。
30.权利要求1-27中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述β链包含特异性结合CD22的抗原结合区以及经修饰的TCRβ链恒定区，其中
特异性结合CD22的抗原结合区包含通过接头(G4S)3连接的SEQ ID NO:11所示的重链可变区以及SEQ ID NO:12所示的轻链可变区，
所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRβ链恒定区，在第56位的氨基酸例如丝氨酸S被突变为半胱氨酸C。
31.权利要求1-27中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述β链包含特异性结合CD22的抗原结合区以及经修饰的TCRβ链恒定区，其中
特异性结合CD22的抗原结合区包含通过接头(G4S)3连接的SEQ ID NO:11所示的重链可变区以及SEQ ID NO:12所示的轻链可变区，
所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRβ链恒定区，在第56位的氨基酸例如丝氨酸S被突变为半胱氨酸C，
其中所述特异性结合CD22的抗原结合区通过CD8铰链区连接至所述经修饰的TCRβ链恒定区。
32.权利要求1-27中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述β链包含特异性结合CD22的抗原结合区以及经修饰的TCRβ链恒定区，其中
特异性结合CD22的抗原结合区包含通过接头(G4S)3连接的SEQ ID NO:11所示的重链可变区以及SEQ ID NO:12所示的轻链可变区，
所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRβ链恒定区，第3位的氨基酸如R被K取代，第6位的氨基酸如T被F取代，第9位的K被E取代，第11位的S被A取代，第12位的L被V取代，且第17、21-25位氨基酸被缺失，且在第56位的氨基酸例如丝氨酸S被突变为半胱氨酸C，
其中所述特异性结合CD22的抗原结合区通过CD8铰链区连接至所述经修饰的TCRβ链恒定区。
33.权利要求1-27中任一项的针对CD19和CD22的STAR，其中所述β链包含特异性结合CD22的抗原结合区、经修饰的TCRβ链恒定区以及OX40的胞内结构域，其中
特异性结合CD22的抗原结合区是抗体m971的scFv，所述m971的scFv包含通过接头(G4S)3连接的SEQ ID NO:11所示的重链可变区以及SEQ ID NO:12所示的轻链可变区，
所述经修饰的TCRβ链恒定区衍生自小鼠TCRβ链恒定区，其相对于野生型小鼠TCRβ链恒定区，第3位的氨基酸如R被K取代，第6位的氨基酸如T被F取代，第9位的K被E取代，第11位的S被A取代，第12位的L被V取代，且第17、21-25位氨基酸被缺失，且在第56位的氨基酸例如丝氨酸S被突变为半胱氨酸C，第167-172位氨基酸被缺失，
其中所述特异性结合CD22的抗原结合区通过CD8铰链区连接至所述经修饰的TCRβ链恒定区。
34.权利要求1的针对CD19和CD22的STAR，所述β链包含SEQ ID NO:17或19或38所示的氨基酸序列。
35.权利要求1的针对CD19和CD22的STAR，其中所述α链包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，且所述β链包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
36.权利要求1的针对CD19和CD22的STAR，其中所述α链包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，且所述β链包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
37.权利要求1的针对CD19和CD22的STAR，其中所述α链包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，且所述β链包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
38.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-37中任一项的针对CD19和CD22的STAR的α链和/或β链的核苷酸序列。
39.权利要求38的多核苷酸，所述多核苷酸包含在同一读码框内的i)编码所述α链的核苷酸序列、ii)编码所述β链的核苷酸序列和iii)位于i)和ii)之间的编码自裂解肽的核苷酸序列。
40.权利要求39的多核苷酸，其中所述自裂解肽是2A多肽，例如P2A多肽。
41.一种表达载体，其包含与调控序列可操作连接的权利要求38-40中任一项的多核苷酸。
42.权利要求41的表达载体，其是病毒载体，例如慢病毒载体。
43.一种制备治疗性T细胞的方法，包括在T细胞中表达权利要求1-37中任一项的针对CD19和CD22的STAR。
44.权利要求41的方法，所述方法包括将权利要求38-40中任一项的多核苷酸或权利要求41或42的表达载体导入T细胞。
45.一种治疗性T细胞，其包含权利要求1-37中任一项的针对CD19和CD22的STAR，或其通过权利要求43或44的方法获得。
46.一种药物组合物，其包含权利要求45的治疗性T细胞，和药物可接受的载体。
47.权利要求45的治疗性T细胞或权利要求46的药物组合物在制备用于在对象中治疗疾病的药物中的用途，例如所述疾病是CD19和/或CD22相关癌症。
48.权利要求47的用途，其中所述癌症可以是B细胞恶性肿瘤，例如慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、淋巴细胞性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、以及所述癌症的组合。
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