CN111499767A - 一种合成t细胞受体抗原受体复合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种特异性结合CD19的合成T细胞受体抗原受体（STAR）、表达STAR的治疗性T细胞以及制备方法和应用。本发明所述的STAR与自身TCR更难错配，上膜效率更高，且体内体外对淋巴瘤均有很好的杀伤效果。

Description

一种合成T细胞受体抗原受体复合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种增强型T细胞受体STAR及其应用。具体而言，本发明公开了一种特异性结合CD19的合成T细胞受体抗原受体(Snythetic T-CellReceptor and Antigen Receptor，STAR)、包含所述合成T细胞受体抗原受体的T细胞以及它们的用途。

背景技术

人体中免疫细胞清除肿瘤细胞是通过以下途径：树突状细胞识别到肿瘤细胞的突变基因，并将这种突变信息展示给T细胞。T细胞随后会寻找携带该突变的肿瘤细胞并对其进行杀伤。有时，肿瘤细胞会下调能展示突变肽段的MHC分子，这样就能逃脱T细胞的杀伤，逐渐形成不可控制的癌症。

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗是近年来收获良好疗效的一种抗癌免疫疗法。不同于天然的T细胞识别肿瘤细胞的方式，CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别不依赖于MHC分子。CAR分子包含三大部分：胞外区是来源于抗体的抗原识别结构域，负责识别靶标抗原；跨膜区；胞内区是来源于T细胞受体的信号分子和共刺激信号分子，负责在接受刺激后传导T细胞激活信号。其工作原理如下：当CAR分子与其对应抗原结合的时候，CAR分子会发生聚集，从而局部磷酸化水平升高、激活下游信号，最终启动T细胞的效应功能、杀伤靶标肿瘤细胞。

靶向CD19蛋白的嵌合抗原受体T细胞(CD19-CAR-T)疗法已有两项临床应用在美国获批上市，用于复发难治性B细胞淋巴瘤的治疗。但是CAR-T疗法用于实体肿瘤治疗时遇到困难。CAR-T细胞疗法未能在实体瘤治疗中取得较好疗效有多重因素，其中一个重要原因是CAR-T细胞在肿瘤微环境中功能受到抑制、T细胞容易发生耗竭而凋亡。近来研究表明，这种T细胞的失能可能与嵌合抗原受体的信号通路性质有关。

T细胞受体(TCR)复合物分子含有多条链，TCRα链和TCRβ链负责识别MHC-多肽分子，其它6个CD3亚基与TCRα/β链结合，起信号转导的功能。天然TCR复合体中共含有10个ITAM信号序列，理论上能传导比CAR更强的信号。之前研究表明，TCR的信号虽然比CAR的信号传导得缓慢一些，但是TCR的信号更为持久。因此，利用天然TCR的信号传导功能，将可能构建出一种新型受体来缓解T细胞失能，使其能够更好地发挥抗实体肿瘤作用。

TCR的胞外区和抗体的Fab结构域非常相似，因此可以把TCR可变区序列替换成抗体可变区序列，从而得到合成T细胞受体抗原受体(Snythetic TCR and AntigenReceptor, STAR)，其既具有抗体的特异性，也具有天然TCR的优越的信号传导功能，可以介导完全的T细胞激活。

然而，衍生自天然TCR的STAR仍然存在膜稳定性差、较低的α/β链配对能力、与内源性TCR存在错配、难以导入T细胞等缺点。一方面会导致减少了STAR分子正确配对的效率、削弱其功能，另一方面增加了错配产生未知特异性的可能、增加了安全性风险。

因此，本发明提供了一种全新的针对CD19的scFv序列，用于制备优化的接近天然TCR结构的新型CAR结构（STAR），可以缓解T细胞失能，使其能够更好地发挥抗实体肿瘤作用，可以介导完全的T细胞激活。同时，本发明所述的STAR与自身TCR更难错配，上膜效率更高，且体内体外对淋巴瘤均有很好的杀伤效果。

发明内容

为解决现有技术的缺陷，本发明提供了一种与自身TCR更难错配，增强STAR分子转入人类T细胞后的功能，上膜效率更高，且体内体外对淋巴瘤均有很好的杀伤效果的STAR。具体的，本发明的第一方面，提供了一种特异性结合CD19的合成T细胞受体抗原受体(STAR)，其包含α链和β链，所述α链包含第一抗原结合区和第一恒定区，所述β链包含第二抗原结合区和第二恒定区，

其中，第一恒定区是天然T细胞受体α链恒定区的变体，其相对于天然T细胞受体α链恒定区包含半胱氨酸取代和疏水氨基酸取代，以及第二恒定区是天然T细胞受体β链恒定区的变体，其相对于天然T细胞受体β链恒定区包含半胱氨酸取代，

所述第一抗原结合区包含特异性结合CD19的抗体的重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：1所示重链CDR1、SEQ ID NO：2所示重链CDR2和SEQ ID NO:3所示重链CDR3，且所述第二抗原结合区包含特异性结合CD19的抗体的轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:4所示轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示轻链CDR3；或者，所述第一抗原结合区包含特异性结合CD19的抗体的轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4所示轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示轻链CDR3，且所述第二抗原结合区特异性结合CD19的抗体的重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1所示重链CDR1、SEQ ID NO:2所示重链CDR2和SEQ ID NO:3所示重链CDR3。

在一些实施方案中，所述抗原结合区融合至所述恒定区的N末端。

在一些实施方案中，所述α链和β链在T细胞内表达后，能够形成功能性STAR复合物。例如，所述α链和β链在T细胞表达后，能够与细胞内源的CD3分子(CD3εδ、CD3γε、CD3ζζ)相结合形成8个亚基的STAR复合物，所述STAR复合物展示在细胞表面，并且在与靶抗原结合后激活T细胞。功能性STAR复合物指的是其能够在与靶抗原特异性结合后，激活T细胞。

优选的，所述第一恒定区衍生自人T细胞受体α链恒定区、非人灵长类动物T细胞受体α链恒定区、啮齿动物T细胞受体α链恒定区。

示例性的，人T细胞受体α链恒定区包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列。

示例性的，小鼠T细胞受体α链恒定区包含SEQ ID NO:7所示氨基酸序列。

进一步优选地，所述第一恒定区衍生自人或小鼠T细胞受体α链恒定区。

在一些实施方式中，相对于天然T细胞受体α链恒定区，所述第一恒定区在第48位的苏氨酸被突变为半胱氨酸，所述氨基酸编号参考SEQ ID NO:7。

在一些具体实施方案中，所述包含半胱氨酸取代的第一恒定区包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列(衍生自人T细胞受体α链恒定区)。在一些具体实施方案中，所述包含半胱氨酸取代的第一恒定区包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列(衍生自小鼠T细胞受体α链恒定区)。(对应于TCRaC-Cys)。

在一些实施方案中，相对于天然T细胞受体α链恒定区，所述第一恒定区包含在跨膜区内的疏水氨基酸取代，所述跨膜区例如包含第111-119位的氨基酸序列，所述氨基酸编号参考SEQ ID NO:7。

优选的，相对于天然T细胞受体α链恒定区，所述第一恒定区在第112位、114位和/或115位用疏水氨基酸取代，所述氨基酸编号参考SEQ ID NO:7。该突变增加了跨膜区的疏水性，抵消了TCR跨膜区携带正电荷所导致的不稳定性，使得STAR分子能在细胞膜上更为稳定地存在，进而获得更好的功能。

进一步优选的，相对于天然T细胞受体α链恒定区，所述第一恒定区在第112位的丝氨酸被亮氨酸取代，在114位的甲硫氨酸被异亮氨酸取代，和/或在115位的甘氨酸被缬氨酸取代，所述氨基酸编号参考SEQ ID NO:7。

优选的，所述第一恒定区包含SEQ ID NO:8所示跨膜区(衍生自小鼠T细胞受体α链恒定区)。

在一些具体实施方案中，所述包含疏水氨基酸取代的第一恒定区包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列(衍生自小鼠T细胞受体α链恒定区)。(对应于TCRaC-TM9)。

优选的，所述第一恒定区包含选自SEQ ID NO:9-11和19中的任一氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述第一恒定区衍生自小鼠T细胞受体α链恒定区，且相对于天然小鼠T细胞受体α链恒定区，在第48位的苏氨酸被突变为半胱氨酸，在第112位的丝氨酸被亮氨酸取代，在114位的甲硫氨酸被异亮氨酸取代，且在115位的甘氨酸被缬氨酸取代，所述氨基酸编号参考SEQ ID NO:7。在一些具体实施方案中，所述第一恒定区包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。(对应于TCRaC-Cys-TM9)。

优选的，所述的第二恒定区衍生自人T细胞受体β链恒定区、非人灵长类动物T细胞受体β链恒定区、啮齿动物T细胞受体β链恒定区。

示例性的，人T细胞受体β链恒定区包含SEQ ID NO:18所示氨基酸序列。

示例性的，小鼠T细胞受体β链恒定区包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列。

进一步优选地，所述第二恒定区衍生自人或小鼠T细胞受体β链恒定区。

优选的，相对于天然T细胞受体β链恒定区，所述第二恒定区在第56位的丝氨酸被突变为半胱氨酸，所述氨基酸编号参考SEQ ID NO:12。

在一些具体实施方案中，所述包含半胱氨酸取代的第二恒定区包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列(衍生自人T细胞受体β链恒定区)。

在一些具体实施方案中，所述包含半胱氨酸取代的第二恒定区包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列(衍生自小鼠T细胞受体β链恒定区)。(对应于TCRbC-Cys)。

在一些优选实施方案中，所述第一恒定区衍生自人T细胞受体α链恒定区，且相对于天然人T细胞受体α链恒定区，在SEQ ID NO:17上与SEQ ID NO:7第48位相应的苏氨酸被突变为半胱氨酸；所述第二恒定区衍生自人T细胞受体β链恒定区，且相对于天然人T细胞受体β链恒定区，在SEQ ID NO:18上与SEQ ID NO:12第56位相应的丝氨酸被突变为半胱氨酸。在一些具体实施方案中，所述第一恒定区包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列，所述第二恒定区包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列。

在一些优选实施方案中，所述第一恒定区衍生自小鼠T细胞受体α链恒定区，且相对于天然小鼠T细胞受体α链恒定区，在第48位的苏氨酸被突变为半胱氨酸，所述氨基酸编号参考SEQ ID NO:7；所述第二恒定区衍生自小鼠T细胞受体β链恒定区，且相对于天然小鼠T细胞受体β链恒定区，在第56位的丝氨酸被突变为半胱氨酸，所述氨基酸编号参考SEQ IDNO:12。在一些具体实施方案中，所述第一恒定区包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列，所述第二恒定区包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列。

在一些优选实施方案中，所述第一恒定区衍生自小鼠T细胞受体α链恒定区，且相对于天然小鼠T细胞受体α链恒定区，在第112位的丝氨酸被亮氨酸取代，在114位的甲硫氨酸被异亮氨酸取代，且在115位的甘氨酸被缬氨酸取代，所述氨基酸编号参考SEQ ID NO:7；所述第二恒定区衍生自小鼠T细胞受体β链恒定区，且相对于天然小鼠T细胞受体β链恒定区，在第56位的丝氨酸被突变为半胱氨酸，所述氨基酸编号参考SEQ ID NO:12。在一些具体实施方案中，所述第一恒定区包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列，所述第二恒定区包含SEQID NO:14所示氨基酸序列。

在一些优选实施方案中，所述第一恒定区衍生自小鼠T细胞受体α链恒定区，且相对于天然小鼠T细胞受体α链恒定区，在第48位的苏氨酸被突变为半胱氨酸，在第112位的丝氨酸被亮氨酸取代，在114位的甲硫氨酸被异亮氨酸取代，且在115位的甘氨酸被缬氨酸取代，所述氨基酸编号参考SEQ ID NO:7；所述第二恒定区衍生自小鼠T细胞受体β链恒定区，且相对于天然小鼠T细胞受体β链恒定区，在第56位的丝氨酸被突变为半胱氨酸，所述氨基酸编号参考SEQ ID NO:12。在一些具体实施方案中，所述第一恒定区包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，第二恒定区包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述第一抗原结合区包含特异性结合靶抗原的抗体的重链可变区，且所述第二抗原结合区包含所述抗体的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述第一抗原结合区包含特异性结合靶抗原的抗体的轻链可变区，且所述第二抗原结合区包含所述抗体的重链可变区。

优选的，所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO：15所示氨基酸序列，且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO：16所示氨基酸序列；或者，所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO：16所示氨基酸序列，且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO：15所示氨基酸序列。

优选的，所述第一抗原结合区包含特异性结合靶抗原的单链抗体(如scFv)或单域抗体(如骆驼抗体)，和/或所述第二抗原结合区包含特异性结合靶抗原的单链抗体(如scFv)或单域抗体(如骆驼抗体)。

优选的，所述第一抗原结合区和所述第二抗原结合区结合CD19的不同区域(如不同的表位)。

在一些优选实施方式中，所述抗原结合区衍生自由保藏号编号为CGMCC No.17095(于2019年1月21日保藏于地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)的杂交瘤细胞334产生的单克隆抗体334。

本发明的第二方面，提供了一种STAR复合物，所述的STAR复合物包含本发明所述的合成T细胞受体抗原受体，和CD3分子。优选的，所述的CD3分子选自CD3εδ、CD3γε或CD3ζζ。

本发明的第三方面，提供了一种核苷酸，所述的核苷酸包含编码本发明所述的合成T细胞受体抗原受体的α链和/或β链的核苷酸序列。

优选的，所述核苷酸包含在同一读码框内的i)编码所述α链的核苷酸序列、ii)编码所述β链的核苷酸序列和iii)位于i)和ii)之间的编码自裂解肽的核苷酸序列。

其中，编码所述α链的核苷酸序列可以位于编码所述β链的核苷酸序列的5’端或3’端。

优选的，所述的自裂解肽为任何在细胞内实现自剪切的肽。例如，所述自裂解肽可以包含蛋白酶识别位点，从而被细胞内的蛋白酶识别并特异性切割。或者，所述自裂解肽是2A多肽。

优选的，所述的2A多肽是一类来自病毒的短肽，其自切割发生在翻译期间。当用2A多肽连接两种不同目的蛋白在同一读码框表达时，几乎以1:1的比例生成两种目的蛋白。常用的2A多肽可以是来自猪捷申病毒（porcine techovirus-1）的P2A、来自明脉扁刺蛾β四体病毒（Thosea asigna virus）的T2A、马甲型鼻病毒（equine rhinitis A virus）的E2A或来自口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus）的F2A以及这些2A多肽的功能性变体。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的2A多肽为切割效率高的P2A多肽。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的表达STAR的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。

本发明的第四方面，提供了一种表达载体，其包含与调控序列可操作连接的本发明所述的核苷酸。

优选的，所述的表达载体包括但不限于慢病毒载体、逆转录病毒载体、蛋白表达载体、噬菌粒等等。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的表达载体是病毒载体，例如慢病毒载体。

本发明的第五方面，提供了一种治疗性T细胞，所述治疗性T细胞表达或包含本发明所述的合成T细胞受体抗原受体。

本发明的第六方面，提供了一种制备治疗性T细胞的方法，包括在T细胞中表达本发明所述的合成T细胞受体抗原受体。

优选的，所述的方法包括将本发明所述的核苷酸或表达载体导入T细胞。

本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，包含本发明所述的治疗性T细胞，和药物可接受的载体。

本发明的第八方面，提供了本发明所述的合成T细胞受体抗原受体、所述的核苷酸、所述的表达载体、所述的治疗性T细胞或所述的药物组合物在制备用于在对象中治疗疾病的药物中的用途。

优选的，所述的疾病为癌症。进一步优选的，所述的癌症选自肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤、骨肉瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤或环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症中的一种或两种及以上的组合。

本发明的第九方面，提供了一种在对象中治疗疾病例如癌症的方法，包括给所述对象施用治疗有效量的本发明的治疗性T细胞或本发明的药物组合物。

优选的，施用可以以任何方便的方式进行，包括通过注射、输注、植入或移植。进一步优选的，通过静脉内、淋巴内、皮内、肿瘤内、髓内、肌内或腹膜内施用。

在一个实施方案中，通过静脉内注射施用。

如本文所用，“氨基酸编号参考SEQ ID NO:x”(SEQ ID NO:x为本文所列的某一具体序列)指的是所描述的具体氨基酸的位置编号是该氨基酸在SEQ ID NO:x上对应的氨基酸的位置编号。不同序列中的氨基酸的对应性可以根据本领域公知的序列比对方法确定。例如氨基酸对应性可以通过EMBL-EBI的在线比对工具来确定(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)，其中两个序列可以使用Needleman-Wunsch算法，使用默认参数来对齐。例如，一多肽从其N末端起第46位的氨基酸与SEQ ID NO:x的第48位的氨基酸在序列比对中对齐，则该多肽中的该氨基酸在本文中也可以被描述为“在该多肽的第48位的丙氨酸，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:x”。

本发明所述的“抗原结合区”意指其独自或者和另一抗原结合区组合可以特异性结合CD19。

本发明所述的“表达载体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体，或者可以是能够翻译的RNA(如mRNA)。在一些优选实施方案中，所述表达载体是病毒载体，例如慢病毒载体。

本发明所述的“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。表达调控元件指的是能够控制核苷酸序列转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子、增强子或多腺苷酸化识别序列。

本发明所述的“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接，使得核苷酸序列的转录被所述转录调控元件控制和调节。用于将调控元件区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域已知的。

本发明所述的“T细胞”可以通过各种非限制性方法从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施方案中，T细胞可以衍生自健康供体或来自诊断为癌症的患者。在一些实施方案中，细胞可以是呈现不同表型特征的细胞的混合群体的一部分。例如，T细胞可以通过分离外周血单个核细胞(PBMC)，然后用特异性抗体活化、扩增获得。

在本发明各方面的一些实施方案中，所述T细胞衍生自对象的自体细胞。如本文所用，“自体”是指用于治疗对象的细胞、细胞系或细胞群源自所述对象。在一些实施方案中，所述T细胞衍生自异体细胞，例如源自与所述对象人类白细胞抗原(HLA)相容的供体。可以使用标准方案将来自供体的细胞转化为非同种异体反应性细胞，并根据需要进行复制，从而产生可以施用至一个或多个患者的细胞。

本发明所述的“对象”是指患有或者易于患有可以通过本发明的细胞、方法、或药物组合物治疗的疾病(如癌症)的生物体。非限制性例子包括人、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛、鹿，及其它非哺乳动物。在优选实施方案中，对象是人。

本发明所述的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。

本发明所述的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”或“有效量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或细胞的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。例如，“有效量”的本发明的治疗性T细胞或药物组合物优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的对象，“有效量”的本发明的治疗性T细胞或药物组合物优选地将肿瘤细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10%，优选至少约20%，更优选至少约30%，更优选至少约40%，更优选至少约50%，更优选至少约60%，更优选至少约70%，更优选至少约80%。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制肿瘤细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。

实际应用中，本发明药物组合物中治疗性T细胞的剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。

本发明所述的“包含”一词在本文中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。此外，本领域技术人员清楚多肽N端由起始密码子编码的甲硫氨酸在某些实际情况下(例如在特定表达系统表达时)会被保留，但不实质影响多肽的功能。因此，本申请说明书和权利要求书中在描述具体的多肽氨基酸序列时，尽管其可能不包含N端由起始密码子编码的甲硫氨酸，然而此时也涵盖包含该甲硫氨酸的序列，相应地，其编码核苷酸序列也可以包含起始密码子；反之亦然。

本发明所述的“半胱氨酸取代”或“疏水氨基酸取代”指的是所提及氨基酸序列(多肽或蛋白)中原始氨基酸被半胱氨酸或疏水氨基酸取代。其中疏水氨基酸取代可以是亲水氨基酸被疏水氨基酸取代，也可以是疏水性低的氨基酸被疏水性高的氨基酸取代。

除非另有指示或定义，否则所有所用术语均具有本领域中的通常含义，该含义将为本领域技术人员所了解。参考例如标准手册，如Sambrook et al.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”；Lewin,“Genes VIII”；及Roitt et al., “Immunology”(第8版)，以及本文中引用的一般现有技术；此外，除非另有说明，否则未具体详述的所有方法、步骤、技术及操作均可以且已经以本身已知的方式进行，该方式将为本领域技术人员所了解。亦参考例如标准手册、上述一般现有技术及其中引用的其他参考文献。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：示出STAR的结构。A、STAR的原型的结构示意图；B、改进的STAR的结构示意图。

图2：流式细胞检测334-STAR在T细胞表面上膜结果，其中指示蛋白为RFP与myc-FITC，Mock为对照组，其为只表达RFP的phage载体（phage-EF1a-IRES-RFP）。

图3：表达334-STAR的T细胞对肿瘤的体外杀伤效果，图A为T细胞与靶细胞Raji按照效靶比1:1的比例，随着共培养时间的延长，肿瘤细胞存活率结果，图B为不同效靶比（10:1、5:1、1:1、1:5、1:10）共培养24h后，肿瘤细胞存活率结果，其中Mock为对照组。

图4：表达334-STAR及HD37-STAR的T细胞对肿瘤的体外杀伤能力比较。

图5：表达334-STAR的T细胞与靶细胞共孵育后，细胞因子IFNγ（图A）、IL-2（图B）、TNF-α（图C）的分泌结果，其中Mock为对照组。

图6：采用活体荧光成像方法检测表达334-STAR的T细胞对淋巴瘤小鼠的肿瘤体内杀伤效果，图中分别为第5、7、12、16、20、24及28天时，表达334-STAR的T细胞（导入pHAGE-EF1A-CD19-VL-TCRaC-TM9-P2A-VH-TCRbC-IRES-RFP的T细胞）对肿瘤的体内杀伤效果，其中RFP（导入pHAGE-EF1A-IRES-RFP的T细胞）为对照组。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：基于334-scFv的anti-CD19 STAR综合突变体的构建

将TCRα和β链(或TCRγ和δ链)的可变区（抗原结合区）替换为抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，在恒定区引入半胱氨酸C突变和跨膜区疏水突变，构建出合成T细胞受体抗体受体(Synthetic T-Cell Receptor and Antibody Receptor，STAR)，其结构见图1。

一、结构设计

1、STAR分子的半胱氨酸点突变引入分子间二硫键的设计

对STAR分子进行半胱氨酸点突变，以引入分子间二硫键，增强STAR分子两条链间的相互配对，减少与内源TCR的错配。具体方案阐述如下。

于TCRα链恒定区将48位苏氨酸T突变为半胱氨酸C(产生恒定区序列为humanTCRaC-Cys，SEQ ID NO:9；mouse TCRaC-Cys，SEQ ID NO:10)，于TCRβ链恒定区将56位丝氨酸S突变为半胱氨酸C(产生恒定区序列为human TCRbC-Cys，SEQ ID NO:13；mouse TCRbC-Cys，SEQ ID NO:14)。这两个新增的半胱氨酸会在STAR的两条链间形成二硫键，减少STAR两条链与内源性TCR链的错配，帮助STAR分子形成更加稳定的复合体，进而获得更好的功能。

2、STAR跨膜区疏水氨基酸替换的设计

为进一步优化STAR分子的设计，本发明对STAR分子中特定序列进行修改，具体为对STAR分子的跨膜区进行疏水氨基酸替换，以增加STAR分子的稳定性，帮助其发挥更持久功能。具体方案阐述如下。

在TCRα链恒定区跨膜区的111位至119位氨基酸区域内进行3个氨基酸位点的突变，将112位丝氨酸S变成亮氨酸L、114位甲硫氨酸M变成异亮氨酸I、115位甘氨酸G变成颉氨酸V。该区域整体氨基酸序列由LSVMGLRIL变为LLVIVLRIL，该修饰称作mouse TCRaC-TM9，产生恒定区序列为SEQ ID NO:11。这一设计增加了跨膜区的疏水性，抵消了TCR跨膜区携带正电荷所导致的不稳定性，使得STAR分子能在细胞膜上更为稳定地存在，进而获得更好的功能。

3、半胱氨酸修饰和跨膜区修饰的组合

发明人对上述的半胱氨酸修饰和跨膜区修饰进行了组合，设计了mouse TCRaC-Cys-TM9 (SEQ ID NO:19)。

4、抗原结合区

发明人获得了新的靶向CD19的单克隆抗体334，由保藏号编号为CGMCC No. 17095(于2019年1月21日保藏于地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)的杂交瘤细胞334产生。该抗体包含anti-CD19 334 VL (SEQ ID NO:16)和anti-CD19 334 VH (SEQ ID NO:15)，其中所述anti-CD19 334 VH包含SEQ ID NO:1所示重链CDR1、SEQ ID NO:2所示重链CDR2和SEQ IDNO:3所示重链CDR3，所述anti-CD19 334 VL包含SEQ ID NO:4所示轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示轻链CDR3。

5、不同组合获得构建体结构

STAR构建体的恒定区与抗原结合区的不同排列，可以获得不同构型但功能类似的构建体，具体见表1。

表1 STAR构建体的构成

例如，本实施例在pHAGE-IRES-RFP载体基础上构建myc-Cys-TM9-STAR-334-anti-CD19STAR结构。

使用的抗原结合序列为anti-CD19 334 VL (SEQ ID NO:16)和anti-CD19 334 VH(SEQ ID NO:15)。使用的第一恒定区mouse TCRaC-Cys-TM9 (SEQ ID NO:19)，第二恒定区mouse TCRbC-Cys（SEQ ID NO:14）。

6、STAR复合物

STAR分子的α链、β链在T细胞内表达后，会在内质网中与细胞内源的CD3εδ、CD3γε、CD3ζζ链相结合形成8个亚基的复合物，并以复合物的形式展示在细胞膜表面（参见图1）。免疫受体酪氨酸活化基序(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif，ITAM)是TCR分子中起到信号转导作用的基序，其保守序列为YxxL/V。CD3ε、δ、γ、ε链的胞内区含有1个ITAM序列，CD3ζ链的胞内区含有3个ITAM序列，所以一个完整STAR复合物共含有10个ITAM序列。当STAR受体的抗原识别序列与其特异性抗原结合后，胞内的ITAM序列会逐次被磷酸化，进而激活下游信号通路，激活NF-κΒ、NFAT和AP-1等转录因子，引发激活T细胞，产生效应功能。

二、构建步骤

1、质粒构建

慢病毒载体为pHAGE-EF1α-GFP，通过限制性内切酶NotI/ClaI获得pHAGR-EF1A-WPRE-AMP载体，信号肽、第一结合区、第二结合区、铰链区、第一恒定区、第二恒定区、标签蛋白等通过商业公司合成和PCR方法获得，其中编码STAR的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示，通过同源重组方法，在Gibsson/NEBuilder等重组酶作用下获得完整载体。

2、质粒提取方法

质粒提取采用碱裂解法，大致原理是细菌悬浮液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效沉淀下来，离心去除后，就可从上清液中回收质粒DNA。通常根据菌液多少分为小提(2-5mL)、小提中量(10-20mL)、大提(100-200mL)，质粒提取后通过260nm光吸收检测质粒浓度。初次测序结果正确的质粒，需要转化挑取单克隆，进行小提，并且酶切鉴定质粒是否正确。

通过以上方法获得质粒pHAGE-EF1A-IRES-RFP，恒定区分别为TCRaC-Cys-TM9、mouse TCRbC-Cys，以及获得了pHAGE-EF1A-CD19-VL-TCRaC-TM9-P2A-VH-TCRbC-IRES-RFP。

3、包装包含质粒的病毒

将Lentix-293T细胞按照5×105个/mL接种至10cm培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞密度达到80%(在显微镜下观察)左右时进行转染。将三质粒按照PMD2.G :PSPAX:transfer plamid=1:2:3比例，与500μL无血清的DMEM混合均匀。(将四质粒按照PMD2.G :PRSV-Rev:PMDlg :transfer plamid=1:1:2:4比例，与500μL无血清的DMEM混合均匀)。将54μL PEI-max 与500μL无血清的DMEM混合均匀，室温静置5min(PEI-Max和质粒的体积质量比为3:1)。将PEI-max混合液缓慢加至质粒混合液中，轻轻吹打，混匀，室温静置15min。将最终混合液缓慢加入培养基中，充分混匀后，放回培养箱中继续培养12h-16h，换到6%FBS DMEM培养基中继续培养，收取48h、72h病毒液。

4、病毒滴度测量方法

将Jurkat-C5细胞以1.5×10^5个/mL接种在平底96孔板中，每孔中加入100μL含10%FBS、0.2μL 1000×polybrene的1640培养基。病毒稀释时用1640完全培养基进行10倍倍比稀释，若为病毒原液测定时第一个孔病毒量为100μL，若为浓缩液第一个孔病毒用量为1μL。将稀释好的细胞加入病毒孔中，100μL/well，混合，32℃，1500rpm，离心90min，37℃、5%CO2培养箱中培养72h。将96孔平底板上的细胞吸入到圆底96孔板上，4℃，1800rpm离心5min，弃上清。加入200μL 1×PBS后，4℃，1800rpm离心5min，弃上清。加入200μL 4%组织固定液，避光保存，上流式细胞仪。用流式细胞仪测感染效率，计算滴度时，选择感染率在2-30%的孔，计算公式为：滴度(TU/mL)=1.5×10^4×阳性率÷病毒体积(μL)×1000。

将上述包含载体pHAGE-EF1A-CD19-VL-TCRaC-TM9-P2A-VH-TCRbC-IRES-RFP的病毒感染T细胞，表达STAR。

实施例2：STAR受体及其突变体在T细胞中的表达及上膜检测

通过在STAR N端连接myc抗体，使用流式抗体检测STAR上膜效率。因为STAR的结构起源于TCR，因此STAR是否和内源TCR产生错配会影响完整STAR的表达丰度，通过RFP阳性比率与STAR myc阳性比率比较，评价错配效率。

1、Jurkat T细胞系的构建、培养和感染方法

1）TCRa/b敲除的Jurkat细胞系构建

基于TCR的结构和序列特征，在α链和β链的恒定区设计guide序列，构建TCRα-β-Jurkat细胞系。在NCBI分别获取TCRα链和β链的恒定区外显子序列，将α链和β链恒定区的外显子1的序列提交到tools.genome-engineering.org网站设计guide序列，根据结果合成oligo序列。然后构建sgRNA-Lenti CRISPR慢病毒载体，将CRISPR慢病毒载体用BsmBI限制性酶进行酶切，去除filter序列，暴露连接末端，同时将质粒用碱性磷酸酶37℃处理1h，以减少自连现象。酶切后的体系跑琼脂糖凝胶电泳进行胶回收，目的片段的质粒骨架约11500bp，同时在~2000bp处有切下来的filter条带；将合成的guide序列的oligo单链在体外用T4连接酶和T4 PNK处理，退火成双链和并在末端添加磷酸基团用于连接；将退火的双链guide序列用水稀释200倍，和BsmBI酶切的Lenti CRISPR进行连接，转化到Stbl3大肠杆菌，提取质粒用于包毒感染。α链的guide序列与Lenti CRISPR-puro进行连接，β链的guide序列与Lenti CRISPR-BSD进行连接。sgRNA-LentiCRISPR慢病毒的包装，浓缩：将HEK-293T提前铺到10cm dish，待细胞长至80%-90%时，配制转染体系，将转染体系加入HEK-293T后，把细胞放回37度培养箱，培养，计为0h；转染后12h后，换入新鲜10% FBS-DMEM。转染48h和72h可收病毒；将含有病毒的培养基离心并过滤，加入PEG8000混匀，在4度静置12h以上，然后3500rpm离心30min；弃上清，用合适体积的培养基重悬沉淀。-80冻存，或直接使用。Jurkat T细胞的感染，药杀筛选和单克隆细胞系的鉴定：将Jurkat T细胞接种在12或24孔板里；细胞密度不宜太大；同时加入合适体积的α链和β链的sgRNA-Lenti CRISPR病毒，以及聚凝胺(按总体积1:1000加入)，混匀。离心感染，1000rpm，32度离心90min。取出后放入37度培养箱，计为0h；10-12h后换液；48h后，加入嘌呤霉素和杀稻瘟菌素至合适的终浓度，药杀48h，可见未感染的对照组细胞全部死亡。将存活的细胞吸出，离心后用完全培养基培养，即为TCRα-β-Jurkat细胞库；将TCRα-β-Jurkat细胞库用流式Aria分选单细胞到96孔板中，培养两周后，将长起来的单克隆吸出，扩大培养；将单克隆细胞系分别用TCRα链和β链的抗体进行鉴定，两条链都缺陷的细胞系进行扩增，即获得内源性TCR敲除的Jurkat T细胞系。

2）Jurkat T细胞系用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养。培养密度为3*105/mL，最高不超过3*106/mL，隔1-2天进行传代，细胞计数后取所需量细胞，并补充培养基调整至上述密度，置于CO2培养箱培养。

3）Jurkat T细胞系的感染方法

细胞计数，取1*106/mL细胞离心换液，用1mL含10% FBS的RPMI 1640培养基重悬，加入24孔板中，加入适量病毒液，1500rpm，离心90min，置于CO2培养箱培养。感染12h后彻底换液为新鲜含10% FBS的RPMI 1640培养基，72h检测阳性率。

2、感染效率检测方法

将构建好的质粒通过Lentix-293T进行病毒包装，并进行病毒浓缩和滴度检测，然后感染Jurkat C5细胞，感染72h后，收集感染的细胞，使用FITC-anti-myc抗体、APC-anti-mTCR-β抗体进行染色，并使用流式细胞仪(BD Fortessa)检测流式RFP/FITC/APC荧光通道。若FITC或APC有明显的阳性细胞群，则说明STAR可以上膜表达，若二者都不表达则说明STAR没有上膜。

3、上膜结果

结果显示，使用二代包装质粒包装病毒后，感染Jurkat C5细胞，流式检测结果发现使用myc标签抗体染色后，感染效率指示蛋白RFP与myc-FITC呈现双阳表达，说明STAR可正常上膜（参见图2），且内源性TCR错配几率极低。

实施例3：基于334-scFv的anti-CD19 STAR综合突变体的体外杀伤能力

1、人原代T细胞的培养及感染方法

1）培养：用Ficoil分离法获得原代T细胞后，用含10% FBS及100 IU/mL IL-2的X-VIVO培养基培养，初始培养密度为1*106/mL，加入CD3及RetroNectin r-Fibronectin(终浓度均为5μg/mL)预包被的孔板中。后期培养密度为5*105/mL，最高不超过3*106/mL，隔1-2天进行传代。

2)感染：原代T细胞培养48h后用加入病毒液，MOI=20，1500rpm，离心90min，置于CO2培养箱培养。感染24h后补充含10% FBS及100 IU/mL IL-2的X-VIVO培养基并转孔，72h通过标签蛋白或者抗体检测感染效率。

2、T细胞与靶细胞体外共培养方法

1）334-STAR对Raji细胞的杀伤作用。

Raji悬浮靶细胞和原代T细胞共孵育，同时取相应细胞数量使用靶细胞培养基混匀离心培养即可，具体步骤为：利用包装并纯化好的STAR病毒感染原代T细胞，共培养前一天使用流式检测感染效率，按照功能细胞与靶细胞10:1、5:1、1:1、1:5、1:10的比例，根据感染效率计算总T细胞数量，靶细胞一般使用量为4E5/孔(24孔板)。同时，对于效靶比1:1的实验，跟踪共培养12、24、36、48h后，334-STAR对Raji细胞的杀伤作用。

2）334-STAR与HD37-STAR对Raji细胞杀伤效率比较

试验组（334-STAR）

在pHAGE-IRES-RFP载体基础上构建myc-Cys-TM9-STAR-334-anti-CD19 STAR结构，结合区为anti-CD19 334 VL(SEQ ID NO:16)和anti-CD19 334 VH(SEQ ID NO:15)。

对照组（HD37-STAR）

HD37（SEQ ID NO:21，SEQ ID NO：22，对比抗体HD37）是一个开发多年的鼠单抗，类型为IgG1，是一个常见针对CD19的抗体，目前已有多篇报道在其基础上进行人源化及双抗的开发。

在pHAGE-IRES-RFP载体基础上构建myc-Cys-TM9-STAR-HD37-anti-CD19 STAR，结合区为anti-CD19 HD37 VL(SEQ ID NO：22)和anti-CD19 HD37 VH(SEQ ID NO:21)。

使用二代包装质粒包装病毒后，感染Jurkat C5细胞后检测上膜及与Raji和CD19结合能力。病毒感染原代细胞后，按照1：1和0.5：1效靶比，将HD37-STAR和334-STAR分别与靶细胞Raji共培养24h，检测杀伤效率。

3、检测方法：荧光素霉法或流式细胞仪检测

共培养后，轻轻吹匀细胞悬液，每孔取150μL细胞悬液加入到白色96孔板中，每孔取2个复孔，加入荧光素霉底物(promega)。振荡(低速)，共孵育10min后，使用多功能酶标仪检测化学发光值，增益值固定100。细胞杀伤计算：杀伤效率=100%-(效应细胞-靶细胞孔值/对照细胞-靶细胞孔值)。

4、试验结果

病毒感染原代T细胞后，T细胞与靶细胞Raji按照效靶比（效应T细胞:靶细胞）1:1分别共培养12、24、36、48h后，334-STAR可显著杀伤Raji细胞，并随着共培养时间增加杀伤效果增强（参见图3A），同时使用效靶比10:1、5:1、1:1、1:5、1:10分别与靶细胞共培养24h后也呈现明显的杀伤剂量依赖（参见图3B），效应细胞越多杀伤能力越好。

流式检测结果，表明HD37-STAR和334-STAR可正常上膜，与靶细胞Raji和抗原CD19蛋白结合可促进CD69、CD25等激活分子表达；病毒感染原代T细胞后，杀伤效率检测显示，在1：1和0.5：1效靶比的杀伤中，334-STAR的效果均明显强于HD37-STAR，即说明334-STAR的杀伤能力显著强于HD37（见图4）。

实施例4：基于334-scFv的anti-CD19 STAR综合突变体的细胞因子分泌情况

1、共培养方法

原代T细胞与靶细胞Raji、Jeko-1、LY-1、Raji-CD19KO及Raji-CD20KO共培养，如果是悬浮细胞，则同时取相应细胞数量使用靶细胞培养基混匀离心培养即可，若为贴壁靶细胞，则需提前一天接种靶细胞，然后再加入一定量的T细胞，具体步骤为：利用包装并纯化好的STAR病毒感染T细胞系或原代T细胞，共培养前一天使用流式检测感染效率，按照功能细胞与靶细胞以1:1的比例共培养24h，根据感染效率计算总T细胞数量，靶细胞一般使用量为4E5/孔(24孔板)。

2、检测步骤

T细胞激活过程中会释放大量细胞因子，以帮助T细胞杀伤靶细胞或者促进T细胞自身的扩增，常见的有TNF-α、IFN-γ、IL-2。T细胞经过与靶细胞或者抗原刺激后，收集T细胞，离心，取上清。TNF-α、IFN-γ、IL-2 ELISA试剂盒使用的为Human IL-2 Uncoated ELISA、Human TNF-α Uncoated ELISA、Human IFN-γ Uncoated ELISA(货号分别为88-7025、88-7346、88-7316)。具体步骤为：用ddH2O将10X Coating Buffer稀释为1X，加入包被抗体(250X)，混匀后加入96孔板(ELISA专用)，100μL/孔。保鲜膜密封后于4℃过夜，1X PBST(又名Wash Buffer，1X PBS中加0.05% Tween 20)洗3次，每次260μL/孔，用ddH2O将5X ELISA/ELISPOT Diluent稀释为1X，加入96孔板，200μL/孔，室温静置1h。PBST清洗1次，标曲稀释(范围分别为：2~250、4~500、4~500)，样品使用1xDiluent稀释20-50倍。加入样品和标曲，每孔100μL，两个复孔，常温孵育2h后，PBST清洗三次，加入1xDiluent稀释好的Detectionantibody，孵育1h后，PBST清洗3次，然后加入1xDiluent稀释的HRP，孵育30分钟后，清洗6次，加入TMB显色，显色时间不超过15min，加入2N H2SO4终止，450nm光吸收检测光吸收。

3、检测结果

T细胞与靶细胞Raji、Jeko-1、LY-1、Raji-CD19KO及Raji-CD20KO共培养，可明显刺激T细胞分泌IL-2、TNF-α和IFNγ（分别参见图5A、5B、5C）。

实施例5：基于334-scFv的anti-CD19 STAR综合突变体的体内杀伤力

1、淋巴瘤模型建立。

本实验采用NSG免疫缺陷型小鼠为模型。该小鼠基因型为NOD-Prkdcem26Il2rgem26/Nju，缺乏T细胞、B细胞、NK细胞，并且其巨噬细胞和树突状细胞也存在缺陷。NSG小鼠是目前免疫缺陷最完全的小鼠品系，因其不会对移植瘤、T细胞产生排斥反应，从而广泛应用于T细胞治疗的临床前研究。本实验将采用6～8周龄的雌性NSG小鼠，每批实验中小鼠体重差异控制在2g以内。小鼠饲养于无特定病原体(SPF)的清洁级屏障内的独立通风笼中，提供正常饮食和pH偏酸的饮用水，以防止病原体污染。

本实验采用人类Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji细胞进行异种移植。Raji细胞为通过慢病毒载体表达了荧光素酶基因的细胞株，在小鼠体内通过荧光素化学发光、活体成像的方式实时监测Raji肿瘤的发展变化。该模型中，不同剂量(一般在1~3x106细胞左右)的Raji-荧光素酶(细胞通过尾静脉回输方式接种于6～8周的雌性NSG小鼠中。3天后给小鼠腹腔注射荧光素钾盐溶液，通过活体成像的方式检测到体内肿瘤细胞的荧光信号。Raji细胞在小鼠体内生长速度快，通过血液分布遍布全身，有一定几率侵染重要器官并形成实体肿瘤，引起小鼠体重降低等症状；在无治疗处理情况下，Raji肿瘤负担在30～40天左右导致小鼠死亡。

实验动物小鼠的操作方法包括：捉拿和固定、编号、麻醉、去毛、给药、取血、处死和解剖。其中，实验中使用了的编号方法包括：剪指号、打耳号以及毛色标记法。实验中使用了的麻醉方法包括：异氟烷吸入式麻醉和Avertin或戊巴比妥注射式麻醉。去毛方法包括：使用剪刀或剃刀对小鼠局部部位脱毛。给药方式包括：腹腔注射、尾静脉注射、皮下注射、眼底静脉丛注射、颅内注射等。取血方法包括：眼眶采血、摘眼球取血、尾静脉采血等。处死方式包括脱颈处死、二氧化碳处死等。所有操作均在实验动物研究和使用计划(Animalprotocol)的审批通过后进行。

2、检测方法：活体荧光成像方法。

带有荧光素酶基因的肿瘤细胞被打入动物体内定植。给小鼠腹腔注射荧光素钾盐溶液，该底物在酶的作用下发出特定波长的光，通过活体成像仪器敏感的CCD设备检测到体内肿瘤细胞的荧光信号。进一步，可以通过专业软件，对荧光信号进行定量分析和绘制热图，可以既直观又定量的反映肿瘤生长情况。

3、检测结果

以Raji细胞在NSG小鼠上建立淋巴瘤模型，使用anti-CD19 334-STAR T细胞作用于荷瘤小鼠后，与对照组相比，334-STAR可基本清除小鼠体内肿瘤细胞（参见图6）。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

序列表

<110> 华夏英泰（北京）生物技术有限公司

<120> 一种合成T细胞受体抗原受体复合物及其应用

<130> 1

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Phe Ile Phe Thr Asp Tyr Glu

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Phe His Pro Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Thr Arg Gln Leu Gly Pro Asp

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Ser Leu Leu Glu Ser Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Leu Val Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Trp Gln Gly Thr Gln Phe Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg

1 5 10 15

Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile

20 25 30

Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr

35 40 45

Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala

50 55 60

Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr

65 70 75 80

Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr

85 90 95

Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser

100 105 110

Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu

115 120 125

Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Leu Leu Val Ile Val Leu Arg Ile Leu

1 5

<210> 9

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys

1 5 10 15

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

20 25 30

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys

35 40 45

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala

50 55 60

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser

65 70 75 80

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp

85 90 95

Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe

100 105 110

Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala

115 120 125

Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135 140

<210> 10

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg

1 5 10 15

Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile

20 25 30

Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys

35 40 45

Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala

50 55 60

Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr

65 70 75 80

Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr

85 90 95

Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser

100 105 110

Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu

115 120 125

Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135

<210> 11

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg

1 5 10 15

Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile

20 25 30

Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr

35 40 45

Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala

50 55 60

Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr

65 70 75 80

Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr

85 90 95

Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu

100 105 110

Val Ile Val Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu

115 120 125

Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135

<210> 12

<211> 172

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser

1 5 10 15

Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala

20 25 30

Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly

35 40 45

Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu

50 55 60

Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr

65 70 75 80

Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His

85 90 95

Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val

100 105 110

Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile

115 120 125

Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr

130 135 140

Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr

145 150 155 160

Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser

165 170

<210> 13

<211> 176

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser

1 5 10 15

Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala

20 25 30

Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly

35 40 45

Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu

50 55 60

Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg

65 70 75 80

Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln

85 90 95

Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg

100 105 110

Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala

115 120 125

Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala

130 135 140

Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val

145 150 155 160

Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe

165 170 175

<210> 14

<211> 172

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser

1 5 10 15

Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala

20 25 30

Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly

35 40 45

Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu

50 55 60

Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr

65 70 75 80

Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His

85 90 95

Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val

100 105 110

Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile

115 120 125

Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr

130 135 140

Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr

145 150 155 160

Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser

165 170

<210> 15

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly Phe Ile Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Phe His Pro Gly Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr His Cys

85 90 95

Thr Arg Gln Leu Gly Pro Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Glu Ser

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly

85 90 95

Thr Gln Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys

1 5 10 15

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

20 25 30

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr

35 40 45

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala

50 55 60

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser

65 70 75 80

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp

85 90 95

Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe

100 105 110

Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala

115 120 125

Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135 140

<210> 18

<211> 176

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser

1 5 10 15

Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala

20 25 30

Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly

35 40 45

Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu

50 55 60

Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg

65 70 75 80

Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln

85 90 95

Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg

100 105 110

Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala

115 120 125

Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala

130 135 140

Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val

145 150 155 160

Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe

165 170 175

<210> 19

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg

1 5 10 15

Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile

20 25 30

Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys

35 40 45

Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala

50 55 60

Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr

65 70 75 80

Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr

85 90 95

Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu

100 105 110

Val Ile Val Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu

115 120 125

Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135

<210> 20

<211> 1818

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cttctcctgg tgacaagcct tctgctctgt gagttaccac acccagcatt cctcctgatc 60

ccacaggttc aactgcagca gtctggggct gagctggtga ggcctggggc ttcagtgaag 120

ctgtcctgca aggctttggg cttcatattt actgactatg agatacactg ggtgaagcag 180

acacctgtgc atggcctgga atggattgga gcttttcatc caggaagtgg tggttctgcc 240

tacaatcaga agttcaaggg caaggccaca ctgactgcag acaaatcctc cagcacagcc 300

tacatggagc tcagcagcct gacatttgag gactctgctg tctatcactg tacaagacag 360

ctcggtcccg actggggcca agggactctg gtcactgtct ctgaggattt aaggaacgtg 420

acccccccca aggtgtcttt attcgagccc agcaaggccg agatcgccaa caagcagaaa 480

gccactttag tgtgtttagc cagaggcttc tttcccgacc acgtggagct gagctggtgg 540

gtgaacggca aggaggtgca cagcggcgtg tgcaccgatc cccaagctta caaggagagc 600

aactacagct actgtttatc ctccagactg agggtgagcg ccaccttctg gcacaaccct 660

cgtaaccact ttcgttgcca agttcagttc cacggtttaa gcgaggagga caagtggccc 720

gaaggcagcc ccaagcccgt tacccagaac atcagcgctg aggcttgggg tcgtgctgat 780

tgcggcatca ccagcgccag ctatcagcaa ggtgtgctga gcgccaccat cctctacgag 840

attttactgg gcaaggccac tctgtacgcc gtgctggtga gcactttagt ggtgatggcc 900

atggtgaaga gaaagaacag ccggcggaaa cggagcggaa gcggagctac taacttcagc 960

ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag aaccctggac ctatgcttct cctggtgaca 1020

agccttctgc tctgtgagtt accacaccca gcattcctcc tgatcccaga tgttgtgatg 1080

acccagactc cactcacttt gtcggttacc attggacaac cagcctccat ctcttgcaag 1140

tcaagtcaga gcctcttaga aagtgatgga aagacatatt tgaattggtt gttacagagg 1200

ccaggccagt ctccaaagcg cctaatctat ctggtgtcta aactggactc tggagtccct 1260

gacaggttca ctggcagtgg atcagggaca gatttcacac tgagaatcag cagagtggag 1320

gctgaagatt tgggagttta ttattgctgg caaggtacac agtttccgtg gacgttcggt 1380

ggaggcacca agctggaaat caaagatatc cagaaccccg agcccgccgt gtaccagctg 1440

aaggaccctc gtagccaaga tagcacttta tgtttattca ccgacttcga cagccagatc 1500

aacgtgccca agaccatgga gagcggcacc ttcatcaccg acaagtgcgt gctggacatg 1560

aaggccatgg acagcaagag caacggcgcc atcgcttgga gcaaccagac cagcttcact 1620

tgtcaagata tcttcaaaga gaccaacgcc acctacccta gcagcgatgt gccttgtgac 1680

gccactttaa ccgagaagag cttcgagacc gacatgaatt taaacttcca gaatttactc 1740

gtgatcgtct tacgtatttt actgctgaag gtggccggct tcaatttact gatgacttta 1800

aggctgtgga gctcctga 1818

<210> 21

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 22

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Glu

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Val Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims (20)

1.一种特异性结合CD19的合成T细胞受体抗原受体，其包含α链和β链，所述α链包含第一抗原结合区和第一恒定区，所述β链包含第二抗原结合区和第二恒定区，

其中，第一恒定区是天然T细胞受体α链恒定区的变体，其相对于天然T细胞受体α链恒定区包含半胱氨酸取代和疏水氨基酸取代，以及第二恒定区是天然T细胞受体β链恒定区的变体，其相对于天然T细胞受体β链恒定区包含半胱氨酸取代，

所述第一抗原结合区包含特异性结合CD19的抗体的重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：1所示重链CDR1、SEQ ID NO：2所示重链CDR2和SEQ ID NO:3所示重链CDR3，且所述第二抗原结合区包含特异性结合CD19的抗体的轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:4所示轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示轻链CDR3；或者，所述第一抗原结合区包含特异性结合CD19的抗体的轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4所示轻链CDR1、SEQ ID NO:5所示轻链CDR2和SEQ ID NO:6所示轻链CDR3，且所述第二抗原结合区特异性结合CD19的抗体的重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1所示重链CDR1、SEQ ID NO:2所示重链CDR2和SEQ ID NO:3所示重链CDR3。

2.根据权利要求1的合成T细胞受体抗原受体，其特征在于，所述第一恒定区衍生自人T细胞受体α链恒定区、非人灵长类动物T细胞受体α链恒定区、啮齿动物T细胞受体α链恒定区；所述的第二恒定区衍生自人T细胞受体β链恒定区、非人灵长类动物T细胞受体β链恒定区、啮齿动物T细胞受体β链恒定区。

3.根据权利要求2所述的合成T细胞受体抗原受体，其特征在于，相对于天然T细胞受体α链恒定区，所述第一恒定区在第48位的苏氨酸被突变为半胱氨酸，所述氨基酸编号参考SEQ ID NO:7。

4.根据权利要求2或3所述的合成T细胞受体抗原受体，其特征在于，相对于天然T细胞受体α链恒定区，所述第一恒定区在第112位、114位和/或115位用疏水氨基酸取代，所述氨基酸编号参考SEQ ID NO:7。

5.根据权利要求4所述的合成T细胞受体抗原受体，其特征在于，相对于天然T细胞受体α链恒定区，所述第一恒定区在第112位的丝氨酸被亮氨酸取代，在114位的甲硫氨酸被异亮氨酸取代，和/或在115位的甘氨酸被缬氨酸取代，所述氨基酸编号参考SEQ ID NO:7。

6.根据权利要求1-3和5任一所述的合成T细胞受体抗原受体，其特征在于，所述第一恒定区包含SEQ ID NO:8所示跨膜区。

7.根据权利要求1-3和5任一所述的合成T细胞受体抗原受体，其特征在于，所述第一恒定区包含选自SEQ ID NO:9-11和19中的任一氨基酸序列。

8.根据权利要求1或2所述的合成T细胞受体抗原受体，其特征在于，相对于天然T细胞受体β链恒定区，所述第二恒定区在第56位的丝氨酸被突变为半胱氨酸，所述氨基酸编号参考SEQ ID NO:12。

9.根据权利要求8所述的合成T细胞受体抗原受体，其特征在于，所述第二恒定区包含选自SEQ ID NO:13或14的氨基酸序列。

10.根据权利要求1-3、5和9任一所述的合成T细胞受体抗原受体，其特征在于，

i) 所述第一恒定区包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列，所述第二恒定区包含SEQ IDNO:13所示氨基酸序列；

ii) 所述第一恒定区包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列，所述第二恒定区包含SEQ IDNO:14所示氨基酸序列；

iii) 所述第一恒定区包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列，所述第二恒定区包含SEQID NO:14所示氨基酸序列；或

iv) 所述第一恒定区包含SEQ ID NO:19所示氨基酸序列，所述第二恒定区包含SEQ IDNO:14所示氨基酸序列。

11.根据权利要求1-3、5和9任一所述的合成T细胞受体抗原受体，其特征在于，所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO：15所示氨基酸序列，且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO：16所示氨基酸序列；或者，所述第一抗原结合区包含SEQ ID NO：16所示氨基酸序列，且所述第二抗原结合区包含SEQ ID NO：15所示氨基酸序列。

12.一种STAR复合物，其特征在于，所述的STAR复合物包含权利要求1-11中任一所述的合成T细胞受体抗原受体，和CD3分子，所述的CD3分子选自CD3εδ、CD3γε或CD3ζζ。

13.一种核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸包含编码权利要求1-11中任一所述的合成T细胞受体抗原受体的α链和/或β链的核苷酸序列。

14.根据权利要求13所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸包含在同一读码框内的i)编码所述α链的核苷酸序列、ii)编码所述β链的核苷酸序列和iii)位于i)和ii)之间的编码自裂解肽的核苷酸序列。

15.根据权利要求14所述的核苷酸，其特征在于，所述自裂解肽是2A多肽。

16.一种表达载体，其包含与调控序列可操作连接的权利要求13-15任一所述的核苷酸。

17.一种治疗性T细胞，其特征在于，所述治疗性T细胞表达权利要求1-11任一所述的合成T细胞受体抗原受体。

18.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求17所述的治疗性T细胞，和药物可接受的载体。

19.权利要求1-11任一所述的合成T细胞受体抗原受体、权利要求13-15任一所述的核苷酸、权利要求16所述的表达载体、权利要求17所述的治疗性T细胞或权利要求18所述的药物组合物在制备用于在对象中治疗疾病的药物中的用途。

20.根据权利要求19所述的用途，其特征在于，所述的疾病为癌症，所述的癌症选自肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤、骨肉瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤或环境诱发的癌症中的一种或两种及以上的组合。

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