CN111320703A - 靶向cd22的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向CD22的嵌合抗原受体及其应用。所述嵌合抗原受体序列选自如下两种结构中的一种，第一种结构：CD22抗原结合结构域与T细胞受体(TCR)的恒定结构域；第二种结构：顺序串联的跨膜蛋白信号肽、CD22抗原结合结构域、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4‑1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域；该嵌合抗原受体较传统CD28、4‑1BB共刺激结构域显示出了更有持续性的抗肿瘤活性，可与CD19嵌合抗原受体T细胞联合、序贯应用，提高CART细胞对肿瘤细胞的覆盖率，或于CD19嵌合抗原受体T细胞治疗白血病阴性复发时应用，在血液及淋巴系统恶性肿瘤的治疗上有良好的应用前景。

Description

靶向CD22的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明是关于生物医药技术领域，特别是关于一种靶向CD22的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
过继性免疫细胞治疗(adoptive cell therapy,ACT)是指从肿瘤患者分离免疫活性细胞，在体外进行扩增与功能鉴定后，然后再回输给患者，从而直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞。
免疫治疗(Immunotherapy)是继手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗方法。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞技术是新近迅速发展的一种细胞免疫治疗技术，CAR是一个人工合成的融合受体，在结构上包括胞外抗原结合区、跨膜区、胞内信号转导区与共刺激信号区。胞外区为识别肿瘤相关抗原的单克隆抗体序列(singlechain variable fragment，ScFV)，跨膜区连接胞外区与胞内区，常用的跨膜区分子有CD3、CD4、CD8与CD28等。胞内区具有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，最常用的是T细胞受体TCR/CD3ζ链和免疫球蛋白FC受体FCεRIγ，主要负责信号转导功能；人们通过分子克隆方法将上述元件在体外进行重组，形成重组质粒，通过病毒载体、电穿孔等手段将重组质粒转导入T细胞，继之在体外培养扩增，最后回输到病人体内，起到治疗肿瘤的目的，这种经过基因修饰与改造的T细胞即称为CAR-T细胞。CAR-T细胞通过ScFV段识别并结合肿瘤抗原，再通过CD3ζ链和共刺激信号区激活T细胞，这样改造的CAR-T细胞识别、杀伤肿瘤细胞就具有了两大特点：①靶向性；②克服了MHC限制性，即不再依赖MHC，因此突破了肿瘤细胞通过下调MHC的表达而发生免疫逃逸这一难题。
虽然靶向肿瘤表面抗原CD19的嵌合抗原受体T细胞在治疗急性B细胞白血病方面取得了高达93％的完全缓解(CR)率，但最终复发率也很高，文献以CD28为共刺激结构域的复发率高达50％，以4-1BB为共刺激结构域的复发率高达33％,所以有必要寻找新的靶点，作为CD19靶点的替代与补充。
肿瘤表面抗原CD22是一分子量为140kDa的糖蛋白，是唾液酸结合免疫球蛋白样免疫球蛋白样凝集素家族的一员，有几个Ig样的胞外区。它限制性表达在B细胞恶性肿瘤与正常B细胞中，60-80％的B细胞恶性肿瘤表达CD22。几乎所有的B前体细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)表达CD22，90％以上的弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和滤泡淋巴瘤(FL)表达CD22；慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、毛细胞白血病(HCL)也具有高水平的CD22表达。与CD19类似，CD22同样是B细胞限制性表达，实质细胞与造血干细胞皆不表达CD22，因此CD22是CAR-T治疗恶性B细胞血液肿瘤疗法中，继CD19之外的又一理想靶点，也是目前很多单抗药物的靶抗原。
经典的嵌和抗原受体(CAR)结构由信号肽、识别抗原的抗体单链可变区、铰链区、跨膜区、共刺激区以及CD3ζ链依次串联而成(图1)，常用的共刺激区是4-1BB或CD28。
T细胞受体(TCR)是T细胞的抗原识别受体，T细胞T淋巴细胞通过TCR-CD3分子复合体与抗原递呈细胞MHC-抗原肽结合，启动适应性免疫应答。TCRαβ(γδ)的胞外区与抗原识别、结合，抗原结合后，依赖于胞内区与CD3复合体(εδ、εγ与ζζ)相互作用，传递活化信号。TCR-CD3复合物有四个亚基，分别为TCRαβ、CD3εδ、CD3εγ、CD3ζζ，共同组成八聚体。TCRα与CD3εδ、TCRβ与CD3εγ相互作用主要发生在恒定区(图2)。文献表明TCR和CD3二聚体的胞外结构域之间并没有亲和力，决定它们组装的因素主要包括跨膜结构域和近膜茎部区域。恒定区最靠近细胞膜，其后为连接肽、跨膜区及短胞质尾。
从已知的TCR和Fab的三维结构及其差异来推测，在长期进化过程中形成的TCRαβ恒定区(Cα/Cβ)之间或者Fab(CL/CH)的配对效率应该优于Cα/CH或Cβ/CL。
外源转入TCR分子，一方面外源TCR分子可能与内源TCR分子α链、β链错配，由于没有经过胸腺的阴性选择，TCR分子错配可能会导致这些改造的T细胞对自身组织造成攻击，另一方面在与CD3复合体相互作用方面，外源TCR分子可能会跟内源性TCR分子存在竞争，影响TCR-CD3复合体的组装，影响T细胞活化信号传导，最终影响T细胞功能。
抗原识别区与活化结构域融合这一人工合成的激活信号毕竟与内源性TCR-CD3复合体传递的信号有所不同，人工合成的CAR T细胞激活信号一方面会容易导致T细胞耗竭，另一方面有时会在病人体内产生大量的细胞因子，造成细胞因子风暴，严重时会引起病人死亡。已有研究表明，TCR-CD3复合体传递的内源性活化信号具有更强的T细胞杀伤活性，识别抗原的灵敏度更高，细胞因子释放更少。所以在研发工程化T细胞免疫疗法时，应用类似于TCR-CD3复合体内源性信号更具有治疗优势。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向CD22的嵌合抗原受体及其应用，该嵌合抗原受体利用抗体可变区结合靶细胞表面抗原，利用TCR的恒定结构域与内源性CD3分子间相互作用，传递信号(图4)，这样有利于T细胞在发挥杀伤作用时，利用自身的反馈调节机制，从而更安全。
为实现上述目的，本发明提供了一种靶向CD22的嵌合抗原受体，选自如下两种结构中的一种：第一种结构：包括顺序串联的CD22抗原结合结构域与T细胞受体(TCR)的恒定结构域；第二种结构：包括顺序串联的跨膜蛋白信号肽、CD22抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域；其中，所述CD22抗原结合结构域包括CD22抗体重链可变区、CD22抗体轻链可变区以及CD22抗体的ScFv；所述T细胞受体的恒定结构域包括TCRα恒定结构域、TCRβ恒定结构域、TCRδ恒定结构域、以及TCRγ恒定结构域。
在本发明的一实施方式中，所述第一种结构包括两条多肽链，在所述第一种结构两条多肽链中的CD22抗原结合结构域以CD22抗体重链可变区和CD22抗体轻链可变区相对应或者以两个CD22抗体的ScFv相对应，在第二种结构中的CD22抗原结合结构域以CD22抗体重链可变区和CD22抗体轻链可变区相串联；在第一种结构两条多肽链中的T细胞受体的恒定结构域以TCRα恒定结构域和TCRβ恒定结构域相对应，或以TCRδ恒定结构域和TCRγ恒定结构域相对应。
在本发明的一实施方式中，在所述第一种结构和第二种结构中，所述CD22抗体重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5中的一种或与其具有85％以上同源性的氨基酸序列，CD22抗体轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.2、SEQID NO.4、SEQ ID NO.6中的一种或与其具有85％以上同源性的氨基酸序列；其中在第一种结构中，SEQID NO.1与SEQ ID NO.2相对应，SEQID NO.3与SEQ ID NO.4相对应，SEQID NO.5与SEQ ID NO.6相对应；在第二种结构中，SEQID NO.1与SEQ ID NO.2相串联，SEQID NO.3与SEQ ID NO.4相串联，SEQID NO.5与SEQ ID NO.6相串联。
在本发明的一实施方式中，所述第一种结构每一条多肽链的N端还包括能引导其正确表达到细胞膜上的信号肽，所述信号肽以及第二种结构中的跨膜蛋白信号肽均选自CD8α信号肽或GM-CSFR信号肽中的一种；优选的，所述CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示，所述GM-CSFR信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
在本发明的一实施方式中，所述第一种结构中，TCRα恒定结构域、TCRβ恒定结构域、TCRδ恒定结构域、和TCRγ恒定结构域的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17所示或与其具有85％以上同源性的氨基酸序列。
在本发明的一实施方式中，所述第一种结构中，当CD22抗原结合结构域选为CD22抗体重/轻链可变区时，则在CD22抗原结合结构域与T细胞受体的恒定结构域之间还依次具有与CD22抗体重/轻链可变区所对应的CD22重/轻链恒定区以及间隔区(即一小段多肽linker，以便抗原结合区柔韧性更好，更好地结合抗原)，当CD22抗原结合结构域选为CD22抗体的ScFv段时，则在CD22抗原结合结构域与T细胞受体的恒定结构域之间只包括间隔区；优选的，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，间隔区选用(GGGS)1-n或(EAAK)1-n，多肽linker由少于10个氨基酸的序列组成，DNA序列如SEQ ID NO.18所示。
在本发明的一实施方式中，所述第一种结构中，两条多肽链之间选用昆虫病毒T2A序列连接，所述T2A序列的DNA序列如SEQ ID NO.33所示。
在本发明的一实施方式中，所述第一种结构中T细胞受体(TCR)的恒定结构域之后还可含有共刺激分子，这部分可来自TNF类配体包括4-1BB、OX40L、CD70、LIGHT和CD30L，还可来自CD28。
在本发明的一实施方式中，所述第二种结构中，CD22抗体重链可变区与CD22抗体轻链可变区之间由间隔区连接，间隔区选用(GGGS)1-n或(EAAK)1-n。
在本发明的一实施方式中，所述第二种结构中，CD8蛋白分子的铰链区及跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，4-1BB共刺激结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
本发明还提供了一种多核苷酸序列，其包含编码上述靶向CD22的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述多核苷酸序列，其中，第一种结构中的两条多肽链可以利用双启动子载体分别表达；优选的，所述重组表达载体为病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体；进一步优选的，所述重组表达载体为慢病毒载体。
本发明还提供了一种重组病毒，其是通过上述重组表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞所得到的；优选的，所述哺乳动物细胞选自293细胞或293FT细胞中的任意一种。
本发明还提供了一种T细胞，其包含上述嵌合抗原受体和/或上述重组病毒。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述嵌合抗原受体、上述多核苷酸序列、上述重组表达载体以及上述重组病毒中的至少一种，以及药学上接受的载体。
本发明还提供了上述嵌合抗原受体在制备治疗血液肿瘤药物中的应用，优选地，所述血液肿瘤为CD22阳性的白血病与淋巴瘤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明所涉及的CD22嵌合抗原受体中的抗原结合结构域与肿瘤细胞上的CD22结合后，与之相连的TCR恒定结构域与CD3-TCR复合体的其它组分相互作用，传递信号，较传统CD28、4-1BB共刺激结构域显示出了更有持续性的抗肿瘤活性；
此外，该发明优化了设计，与经典CD22 CAR设计相比，识别抗原的灵敏度更高，细胞因子释放更少，因此临床应用更有效、更安全；
本发明所提供的CD22嵌合抗原受体可与CD19 CAR T联合或序贯应用，或在CD19CAR T治疗CD19阴性复发时应用，提高CAR的覆盖率，扩大CAR的使用范围，不仅有利于提高患者治愈率，而且能有效防止肿瘤复发，在血液及淋巴系统恶性肿瘤的治疗上有良好的应用前景。
附图说明
图1是现有技术中经典的嵌和抗原受体(CAR)结构；
图2是现有技术中CD3-TCR通过跨膜区与近膜区相互作用的示意图；
图3A是根据本发明一实施方式的靶向CD22的嵌合抗原受体的第二种结构示意图；
图3B是根据本发明一实施方式的靶向CD22的嵌合抗原受体的不包含间隔区时的第一种结构示意图；
图3C是根据本发明一实施方式的靶向CD22的嵌合抗原受体的包含间隔区时的第一种结构示意图；
图3D是根据本发明一实施方式的CD22抗原结合结构域选为CD22抗体的ScFv段时的第一种结构示意图；
图4A是根据本发明一实施方式的第二种结构CD22抗原结合结构域选为CD22抗体重/轻链可变区时的嵌合抗原受体与内源性CD3分子之间相互作用示意图；
图4B是根据本发明一实施方式的第二种结构CD22抗原结合结构域选为CD22抗体的DsFv段时嵌合抗原受体与内源性CD3分子之间相互作用示意图；
图5是根据发明一实施方式的CAR-T对靶细胞的杀伤效率。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。
下面对本发明所要求保护的CD22嵌合抗原受体从基因合成、载体构建、转导T细胞、T细胞毒性验证以及CD22嵌合抗原受体T细胞对小鼠急性B细胞白血病的治疗作用进行详细论述。
实施例1
基因序列合成
利用全基因合成的方式合成传统的以4-1BB为共刺激结构域、以CD3ζ链为胞内信号传导结构域的CD22嵌合抗原受体分子(CAR1)。跨膜蛋白信号肽、CD22抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域依次串联。信号肽序列选自人CD8分子，CD8信号肽基因序列如SEQ ID NO.19所示。CD22抗体单链可变区基因序列选自SEQ ID NO.23与SEQ ID NO.24。
实施例2
基因序列合成
利用全基因合成的方式合成传统的以4-1BB为共刺激结构域、以CD3ζ链为胞内信号传导结构域的CD22嵌合抗原受体分子(CAR2)。跨膜蛋白信号肽、CD22抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域依次串联。信号肽序列选自人GM-CSFR分子，GM-CSFR信号肽基因序列如SEQ ID NO.20所示。CD22抗体单链可变区基因序列选自SEQ ID NO.25与SEQ ID NO.26。
实施例3
基因序列合成
利用全基因合成的方式合成CD22嵌合抗原受体序列，包括信号肽、抗原识别区、TCR恒定区结构域(CAR3)，其中CD8信号肽基因序列如SEQ ID NO.19所示。CD22抗体单链可变区基因序列选自SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22。所述重链CH1基因序列如SEQ ID NO.27所示，所述轻链恒定区基因序列CL如SEQ ID NO.28所示；TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ恒定区的基因序列分别如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32所示。两条多肽链之间用T2A连接，SEQ ID NO.33所示。序列合成后利用酶切位点NheⅠ与SalⅠ克隆到优选的慢病毒载体中。所述慢病毒载体为PCDH-EF1α-MCS-PURO或其它任何一种慢病毒过表达载体。
实施例4
含靶向CD22嵌合抗原受体慢病毒载体的假慢病毒颗粒的制备
第0天铺板：0.25％胰酶消化293FT细胞，铺在含有10ml DMEM(含有10％FBS)的10cm培养皿中，37度，5％CO2恒温培养箱培养，保证24后细胞汇合度达到90-95％。
293T细胞转染：转染前2小时，293FT细胞换液。将实施例1-3中的基因序列构建到同一个靶向CD22嵌合抗原受体慢病毒载体上，将该靶向CD22嵌合抗原受体慢病毒载体以及辅助载体与PEI混合，吹打均匀，室温静置15min，得到DNA/PEI混合物。将制备好的DNA/PEI混合物逐滴加到293FT细胞中，继续培养4-6小时，换液。
靶向CD22嵌合抗原受体慢病毒制备
仕必纯中空纤维柱浓缩纯化：分别收集上述293FT细胞转染24小时与48小时的细胞上清，0.45μM滤器过滤后，仕必纯中空纤维柱浓缩20～100倍，将病毒分装，-80℃冻存病毒沉淀，待用。
高速离心法浓缩慢病毒：
1.将上清3000rpm离心，10min，0.45μM滤器过滤；
2.将上清25，000rpm离心，120min，0.45μM滤器过滤；
3.利用PBS将沉淀溶解，分装后，-80℃冻存，长期保存。
实施例5
慢病毒效价测定
293FT细胞铺于24孔板，1×105/孔，分别将0.25μL、0.5μL、1μL、2μL、4μL慢病毒悬液感染293FT细胞，48小时后，收集细胞，流式免疫荧光染色，上机分析，根据流式结果计算所获慢病毒滴度(Intergration units per ml，IU ml-1)计算公式如下：IU ml-1＝C╳N╳D╳1000/V其中C＝平均每基因组整合的病毒拷贝数，N感染时细胞数目，即1×105，D＝病毒载体的稀释倍数，V＝加入的病毒体积(μL)。病毒滴度大致在5*107～2*108之间，每批次病毒的滴度略微有差异。
实施例6
转导T细胞
将上述构建好的靶向CD22嵌合抗原受体慢病毒载体转导T细胞以及CAR T细胞扩增。利用Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血PBMC，CD3、CD28抗体活化T细胞24小时，T细胞活化后，制备好的慢病毒以Moi 5～10的比例感染T细胞，感染72小时后，利用Protein L进行流式免疫荧光染色，分析CAR-T 22的感染效率，确定CD22嵌和抗原受体在T细胞上的表达。确定表达(感染效率在20～50％之间)后，继续在含有IL-2的无血清培养基中培养10～14天，即可完成靶向嵌合抗原受体T细胞制备。
上述技术方案中，CAR转导T细胞时可加入转导增强剂，比如鱼精蛋白或polybrene，以提高T细胞转导效率，两者的浓度为5～10μg/ml，转导增强剂对细胞有一定毒性，不同细胞对其敏感度不同，因此在使用时需要在孵育时间与使用浓度方面进行探索。
上述技术方案中，为提高CAR T细胞体系中中枢记忆性T细胞比例，可在培养体系中加入IL-7、IL-15，两者的浓度为10～50ng/ml。
上述技术方案中，无血清培养基可选用X-VIVO15(Lonza)、AIM-V(Invitrogen)、GT-T551(Takara)中的一种，无血清培养基中可加入浓度为1～10％的自体血清，即来源于与CAR T细胞同一供体的血清；或含有5％的人AB血清。
上述技术方案中，CD3、CD28抗体的浓度为50ng～5μg/ml；IL-2的浓度为100～500U/ml。
上述技术方案中，CAR T细胞培养扩增过程中，每隔2～3天补充新鲜无血清培养基、自体血清(或AB血清、IL-2)等，以保证细胞营养成分足够，扩增良好。
实施例7
CD22嵌合抗原受体T细胞细胞毒性功能验证
利用eFluor670对CD22阳性靶细胞NALM6进行活细胞标记，将制备好的CAR-T细胞与靶细胞以0.5:1、3:1、6:1的效靶比共培养，4小时后，收集细胞，7-AAD染色，流式分析eFluor670阳性细胞群中-AAD阳性细胞的比例，判断CAR-T对靶细胞的杀伤效率(图5)。从结果(图5)可以看出，三种CAR对靶细胞的杀伤效率均随着效靶比的增高而增高，并且CAR2、CAR3的杀伤效率优于CAR1。
实施例8
CD22嵌合抗原受体T细胞对小鼠急性B细胞白血病的治疗作用
将6～8周的雌性NOD/SCID小鼠随机分组，CAR T治疗组与对照组，尾静脉注射CD22阳性的B细胞白血病细胞株NALM6-LUC，建立白血病小鼠模型，注射NALM6-LUC后第6天，通过小动物成像观察建模情况，确定建模成功后，给予CD22 CAR T细胞治疗，尾静脉注射，1*107/只。分别在治疗后不同时间点(第4天、第11天、21天)进行小动物成像，观察白血病消退情况，每天观察小鼠毛发情况，每5天给小鼠称重，以此判断CAR T细胞对小鼠是否有毒性作用。记录各组小鼠生存期，绘制小鼠生存曲线，综合分析CD22CAR T细胞对小鼠白血病的治疗作用，结果表明与细胞水平的实验结果相一致，CAR2、CAR3治疗的小鼠生存期明显延长优于CAR1。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 北京双赢科创生物科技有限公司
<120> CD22的嵌合抗原受体及其应用
<130> P191106DD1F
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Ser His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser Gly Gln Ala Gly
225 230 235
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Phe Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Thr Gln Glu Arg Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Phe Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Arg Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Thr Gln Glu Arg Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Val Glu Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 7
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Phe Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Thr Gln Glu Arg Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro
115 120 125
Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg
130 135 140
Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp
145 150 155 160
Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val
165 170 175
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu
195 200 205
Gly Leu Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly
210 215 220
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
225 230
<210> 8
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Phe Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Arg Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asp Thr Gln Glu Arg Ser Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
115 120 125
Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
130 135 140
Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp
145 150 155 160
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val
165 170 175
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Val Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe
195 200 205
Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly
210 215 220
Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
225 230
<210> 9
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 10
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 12
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Ser His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser Gly Gln Ala Gly
100 105 110
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 15
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Pro Leu Leu Ile Pro
20
<210> 16
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val
1 5 10 15
Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln
20 25 30
Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
35 40 45
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
50 55 60
<210> 17
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val
1 5 10 15
Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
20 25 30
Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg
35 40 45
Lys Asp Phe
50
<210> 18
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr Met Asp Pro Lys Asp Asn Cys Ser
1 5 10 15
Lys Asp Ala Asn Asp Thr Leu Leu Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala
20 25 30
Tyr Tyr Met Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Ala
35 40 45
Ile Ile Thr Cys Cys Leu Leu Arg Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly
50 55 60
Glu Lys Ser
65
<210> 19
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Glu Val Lys Thr Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu
1 5 10 15
Asn Thr Lys Gln Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val
20 25 30
His Thr Glu Lys Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg
35 40 45
Met Leu Phe Ala Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys
50 55 60
Leu Phe Phe Leu
65
<210> 20
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr Cys Gly Gly
1 5 10 15
Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Gly
20 25
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gccttaccag tgaccgcctt gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc cgccaggccg 60
<210> 22
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctgctgctcg tgacaagcct gctgctgtgc gagctgcccc accctgcctt tctgctgatc 60
ccc 63
<210> 23
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
caagtccaac tgcaacaatc aggtccaggt ctggttaaac catcacagac cctgtccctg 60
acctgcgcca taagtggtga ctccgtttcc agtaactcag ccgcatggaa ttggatcagg 120
cagagtccat caagaggcct ggagtggctg ggacgcacat actaccgcag caaatggtat 180
aacgactatg ctgtttcagt caagtctagg attactatca accctgacac ctctaagaat 240
cagtttagcc tccaactgaa cagcgttaca ccagaagata cagccgttta ctattgtgca 300
cgggaagtga ctggcgacct ggaggacgcc tttgacatct ggggacaggg tacaatggtc 360
actgtgagtt ct 372
<210> 24
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atggatatac aaatgaccca aagcccaagt tcactgtctg cctctgttgg cgatcgcgtg 60
acaatcacat gtagagccag tcagaccatc tggtcctacc tgaattggta tcagcaaagg 120
ccaggaaagg ctccaaacct gctcatctat gctgccagct ctctgcaatc tggagtgccc 180
tcccgcttta gcggtagagg gagcgggacc gactttactc tcacaatcag ttccctgcaa 240
gctgaagatt tcgctactta ctactgccag cagtcttata gtattcctca gacatttggt 300
cagggaacaa agctggaaat c 321
<210> 25
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
caagtgcaac tgcagcaacc cggcgccgaa ctcgtcagac ccggcgccag cgtcaagctc 60
agctgcaagg ccagcggata caccttcacc aactactgga tcaactgggt gaagcagaga 120
cccggacaag gactggagtg gattggcaac atctacccca gcgactcctt caccaattac 180
aaccagaaat tcaaggacaa ggccacactg acagtggaca agagcagctc caccgcctac 240
atgcagctgt cctcccctac ctccgaggat tccgccgtgt actactgcac cagagacaca 300
caagagagga gctggtattt cgatgtgtgg ggcgccggaa caaccgtgac agtgagcagc 360
<210> 26
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gatgtggtga tgacccagac ccctctctct ctgcccgtgt ctctgggcga tcaagcctcc 60
attagctgca gaagctccca gtctctggtg catagcaacg gcaacaccta tctgcactgg 120
tatctgcaga agcccggcca aagccccaag ctgctcatct acaaggtgtc caatagattt 180
tccggcgtgc ccgacagatt tagcggatcc ggatccggca cagacttcac actgaagatt 240
tctagagtgg aggccgagga tctgggactg tacttttgca gccagagcac ccatgtgcct 300
tggaccttcg gcggcggaac caagctggag ctcaaa 336
<210> 27
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gaggtgcagc tggtggaatc cggagccgag gtcaagaagc ccggcagctc cgtcaaagtg 60
agctgcaagg ccagcggcta cacatttacc aattactgga tcaactgggt gagacaagcc 120
cccggccaag gcctcgagtg gatcggcaac atctacccca gcgacagctt caccaactac 180
aaccagaagt tcaaggacag agccacactg accgtcgata agagcaccag caccgcctac 240
ctcgagctga ggaatctgag gtccgacgat acagccgtct actactgcac cagagacaca 300
caagagagga gctggtactt cgacgtgtgg ggccaaggca cactggtgac agtgtccagc 360
<210> 28
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gacattgtga tgacacagtc ccccgccaca ctgagcgtgt cccccggcga aagggccaca 60
ctcagctgca gaagctccca gtctctggtg cactccaatg gcaacacata tctgcactgg 120
taccagcaga agcccggcca agcccctaga ctcctcatct acaaggtgag caatagattc 180
agcggcgtgc ccgctagatt tagcggcagc ggatccggcg tcgagtttac actgacaatc 240
tcctctctgc agtccgagga ctttgccgtg tactactgtt cccagtccac acacgtccct 300
tggaccttcg gccaaggcac aagactggag atcaaa 336
<210> 29
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcctctacca aagggccatc tgtgttccca ctggctccct caagcaaatc cacctccgga 60
gggaccgctg ccctgggatg cctcgtgaag gactactttc cagaacctgt taccgtgtcc 120
tggaacagcg gagcactcac ttctggagtt catacatttc cagccgtgct gcaaagttca 180
gggctgtatt ccctgagcag tgtggtcaca gtgccctcct ctagcctggg tacacagaca 240
tacatctgta acgttagtca taaacccagc aacacaaagg ttgacaagaa ggtggagcca 300
aagtcatgcg ataagaccag cggacaggca ggt 333
<210> 30
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aagagaaccg ttgccgcacc aagcgtgttt atctttcctc catctgatga acagctgaag 60
agcggaacag cttccgttgt gtgcctgctg aacaatttct atcccaggga ggcaaaggtg 120
cagtggaaag ttgataatgc actccagagt gggaactccc aagagagcgt taccgagcag 180
gattccaaag acagcactta ctccctgagc agtaccctca ccctcagtaa ggccgattac 240
gagaaacaca aagtctatgc ctgtgaagtg acacaccagg gcctgagtag ccctgtcacc 300
aaatccttca atagaggaga gtgt 324
<210> 31
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atccccgagg acaccttctt ccccagcccc gagagcagct gcgacgtgaa gctggtggag 60
aagagcttcg agaccgacac caatttaaac ttccagaatt taagcgtgat cggctttcgt 120
attttactgc tgaaggtggc cggcttcaat ttactgatga ctttaaggct gtggagcagc 180
<210> 32
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ggtcgtgccg actgcggctt caccagcgtg agctaccagc aaggtgtgct gagcgccacc 60
attttatacg agattttact gggcaaggcc acactgtacg ccgtgctggt gagcgcttta 120
gtgctgatgg ccatggtgaa gaggaaggac ttc 153
<210> 33
<211> 201
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cccatcaaga ccgacgtgat caccatggac cccaaggaca actgcagcaa ggacgccaac 60
gacactttac tgctgcagct gaccaacacc agcgcctact acatgtactt actgctgtta 120
ctgaagagcg tggtgtactt cgccatcatc acttgttgtt tactgaggag gaccgccttc 180
tgctgcaacg gcgagaagag c 201
<210> 34
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gaggtgaaga ccgacagcac cgaccacgtg aagcccaagg agaccgagaa caccaagcag 60
cccagcaaga gctgccacaa gcccaaggcc atcgtgcaca ccgagaaggt gaacatgatg 120
tctttaaccg tgctgggttt aaggatgctg ttcgccaaga ccgtggccgt gaacttttta 180
ctgaccgcca agctgttctt ttta 204
<210> 35
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54

Claims (15)

1.一种靶向CD22的嵌合抗原受体，其特征在于，选自如下两种结构中的一种：
第一种结构：包括顺序串联的CD22抗原结合结构域与T细胞受体(TCR)的恒定结构域；
第二种结构：包括顺序串联的跨膜蛋白信号肽、CD22抗原结合结构域、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域；
其中，所述CD22抗原结合结构域包括CD22抗体重链可变区、CD22抗体轻链可变区以及CD22抗体的ScFv；所述T细胞受体的恒定结构域包括TCRα恒定结构域、TCRβ恒定结构域、TCRδ恒定结构域、以及TCRγ恒定结构域。
2.如权利要求1所述的靶向CD22的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一种结构包括两条多肽链，在所述第一种结构两条多肽链中的CD22抗原结合结构域以CD22抗体重链可变区和CD22抗体轻链可变区相对应或者以两个CD22抗体的ScFv相对应，在第二种结构中的CD22抗原结合结构域以CD22抗体重链可变区和CD22抗体轻链可变区相串联；在第一种结构两条多肽链中的T细胞受体的恒定结构域以TCRα恒定结构域和TCRβ恒定结构域相对应，或以TCRδ恒定结构域和TCRγ恒定结构域相对应。
3.如权利要求1所述的靶向CD22的嵌合抗原受体，其特征在于，在所述第一种结构和第二种结构中，所述CD22抗体重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3、SEQID NO.5中的一种或与其具有85％以上同源性的氨基酸序列，CD22抗体轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6中的一种或与其具有85％以上同源性的氨基酸序列；其中在第一种结构中，SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2相对应，SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4相对应，SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6相对应；在第二种结构中，SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2相串联，SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4相串联，SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6相串联。
4.如权利要求1所述的靶向CD22的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一种结构每一条多肽链的N端还包括信号肽，所述信号肽以及第二种结构中的跨膜蛋白信号肽均选自CD8α信号肽或GM-CSFR信号肽中的一种；优选的，所述CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述GM-CSFR信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
5.如权利要求1所述的靶向CD22的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一种结构中，TCRα恒定结构域、TCRβ恒定结构域、TCRδ恒定结构域、和TCRγ恒定结构域的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17所示或与其具有85％以上同源性的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的靶向CD22的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一种结构中，当CD22抗原结合结构域选为CD22抗体重/轻链可变区时，则在CD22抗原结合结构域与T细胞受体的恒定结构域之间还依次具有与CD22抗体重/轻链可变区所对应的CD22重/轻链恒定区以及间隔区，当CD22抗原结合结构域选为CD22抗体的ScFv段时，则在CD22抗原结合结构域与T细胞受体的恒定结构域之间只包括间隔区；优选的，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，间隔区选用(GGGS)1-n或(EAAK)1-n。
7.如权利要求1所述的靶向CD22的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一种结构中，两条多肽链之间选用昆虫病毒T2A序列连接，所述T2A序列的DNA序列如SEQ ID NO.33所示。
8.如权利要求1所述的靶向CD22的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第二种结构中，CD22抗体重链可变区与CD22抗体轻链可变区之间由间隔区连接，间隔区选用(GGGS)1-n或(EAAK)1-n。
9.如权利要求1所述的靶向CD22的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第二种结构中，CD8蛋白分子的铰链区及跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，4-1BB共刺激结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
10.一种多核苷酸序列，其特征在于，其包含编码权利要求1-9任一项所述的靶向CD22的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
11.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求10所述的多核苷酸序列；优选的，所述重组表达载体为病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体；进一步优选的，所述重组表达载体为慢病毒载体。
12.一种重组病毒，其特征在于，其是通过权利要求11所述的重组表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳动物细胞所得到的；优选的，所述哺乳动物细胞选自293细胞或293FT细胞中的任意一种。
13.一种T细胞，其特征在于，包含权利要求1-9任一项所述的嵌合抗原受体和/或权利要求12所述的重组病毒。
14.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-9任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求10所述的多核苷酸序列、权利要求11所述的重组表达载体以及权利要求12所述的重组病毒中的至少一种，以及药学上接受的载体。
15.如权利要求1所述的嵌合抗原受体在制备治疗血液肿瘤药物中的应用，优选地，所述血液肿瘤为CD22阳性的白血病与淋巴瘤。
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