CN111748043A

CN111748043A - 一种嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN111748043A
Application number: CN202010636413.4A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Shenzhen In Vivo Biomedicine Technology Ltd
Current assignee: Shenzhen In Vivo Biomedicine Technology Ltd
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2040-07-03
Also published as: CN111748043B

Abstract

本发明涉及一种嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域串联而成；其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤抗原为TGFβ，所述抗原结合结构域为针对肿瘤抗原TGFβ的单链抗体。本发明的嵌合抗原受体相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，且具有安全性和长效性，对于实体瘤确实达到很好的疗效。

Description

一种嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种嵌合抗原受体及其应用，具体为以肿瘤抗原TGFβ为基础的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞技术的构建方法及其在抗肿瘤治疗中的应用。

背景技术

随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。通常，CAR包含抗体的单链片段可变(Single chain fragmentvariable，scFv)区或对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)具有特异性的结合结构域，其通过铰链和跨膜区与T细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞活化部分包括与T细胞效应物功能触发(例如CD3ζ)部分串联的T细胞共刺激结构域。

CN 105452287A公开了表达至少嵌合TGFβ受体的细胞，该嵌合TGFβ受体包含TGFβII受体的外结构域和不来自TGFβ受体的内结构域，从而将T细胞增殖的TGFβ的负信号转化为T细胞激活信号。该嵌合TGFβ受体的细胞还携带一种或多种嵌合抗原受体。该专利过表达的是TGFβ受体，在亲和力还有待提高，在结构上，该专利过表达的是TGFβ受体需要与现有细胞治疗联合使用才有明显效果。

目前针对实体肿瘤而言，CAR-T细胞治疗主要遇到三大瓶颈：肿瘤的异质性；肿瘤微环境的免疫抑制；T细胞很难浸润进入肿瘤细胞。肿瘤细胞以及肿瘤相关的免疫抑制性细胞会分泌TGFβ来抑制CAR-T细胞对肿瘤的杀伤能力。目前已有针对TGFβ单抗药物，但单独用药效果不显著，与PD-1/PD-L1单抗药物联合有协同作用。

发明内容

针对目前CAR-T细胞对于实体瘤作用效果不明显的情况，本发明提供一种嵌合抗原受体及其应用，本发明制备的嵌合抗原受体靶向TGFβ，能够解除TGFβ对其的免疫抑制作用，从而发挥抗肿瘤能力。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域串联而成；

其中，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤抗原为TGFβ，所述抗原结合结构域为针对肿瘤抗原TGFβ的单链抗体。

本发明中，CAR-T细胞除了解除TGFβ的免疫抑制作用，同时还能激活CAR下游信号，进一步增强抗肿瘤能力，相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的竞争结合TGFβ抗原能力，具有更高的亲和力；不仅如此，发明人意外发现其具有很好的体内扩增能力，进一步增强抗肿瘤效果。

根据本发明，所述肿瘤抗原TGFβ的单链抗体的氨基酸序列选自：

(a)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或者，

(b)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合TGFβ和诱导T细胞信号传导功能的氨基酸序列。

本发明中，所述肿瘤抗原TGFβ的单链抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下：

SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSS

根据本发明，所述如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，优选为95％同一性的氨基酸序列，所述改造后的氨基酸序列仍然具有结合TGFβ和诱导T细胞信号传导功能。

所述90％同一性例如可以是90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

根据本发明，所述胞内结构域还包括胞内共刺激信号传导域和/或CD3ζ信号传导域。

根据本发明，所述胞内共刺激信号传导域包括人CD28胞内区、人4-1BB胞内区、人TLR1胞内区、人TLR2胞内区、人TLR3胞内区、人TLR4胞内区、人CD27胞内区、人CD28胞内区、人OX40胞内区、人CD30胞内区、人CD40胞内区、人PD-1胞内区、人ICOS胞内区、人淋巴细胞功能相关抗原1胞内区、人CD2胞内区、人CD7胞内区、人LIGHT胞内区、人NKG2C胞内区、人B7-H3胞内区或人CD83胞内区中的任意一种或至少两种的组合，优选为人CD28胞内区和人TLR2胞内区。

根据本发明，所述跨膜结构域为CD28跨膜区和人TLR2胞内区。

根据本发明，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域(CD28细胞膜外和CD28细胞膜传导结构域)和人TLR2胞内区，在一些具体实施方案中，可以通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域。

本发明的嵌合抗原受体还包括启动子，所述启动子可以为EFla或任何一种高表达的启动子，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，在此不做特殊限定，启动子的存在不会对本发明的嵌合抗原受体的性能产生影响。

根据本发明，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和荧光蛋白串联而成。

第二方面，本发明提供编码如第一方面所述的嵌合抗原受体的核酸。

第三方面，本发明提供一种病毒载体，包括第一方面所述的嵌合抗原受体。

根据本发明，所述病毒载体为慢病毒载体和/或逆转录病毒载体，优选为慢病毒载体。

第四方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第三方面所述的病毒载体与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSVG共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

根据本发明，所述哺乳细胞为293细胞、293T细胞、TE671细胞或Jurkat细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第五方面，本发明制备如第四方面所述的重组慢病毒的方法，其包括将如第二方面所述的核酸引入细胞的步骤；优选地，所述细胞为T细胞或含有T细胞的细胞群。

本发明中，所述T细胞具有良好的抗肿瘤能力，同时能够释放低剂量免疫因子，具备低毒性高免疫杀伤反应性质。

第六方面，本发明提供如第一方面所述的嵌合抗原受体、如第三方面所述的病毒载体或如第四方面所述的重组慢病毒在制备嵌合抗原受体T细胞或免疫细胞及其在肿瘤治疗药物中的应用。

本发明中，绝大多数肿瘤都会表达TGFβ，尤其在恶性程度更高的肿瘤的TGFβ表达量更高。本嵌合抗原受体T细胞靶向的是活化性形式的TGFβ，因此，本嵌合抗原受体T细胞依赖于肿瘤的活化性TGFβ的表达量，可以用于治疗绝大部分的肿瘤。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明嵌合抗原受体既能拮抗TGFβ的作用，又能利用TGFβ激活CD28-CD3z等信号通路从而进一步增强抗肿瘤能力；

(2)本发明嵌合抗原受体靶向是可溶性分子，自体细胞回输安全性较好，无副作用；

(3)本发明嵌合抗原受体具有很好的体内扩增能力，解除TGFβ的免疫抑制作用，同时还能激活CAR下游信号，进一步增强抗肿瘤能力，相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的竞争结合TGFβ抗原能力。

附图说明

图1为本发明CAR载体的结构示意图；

图2为流式细胞仪检测Jurkat细胞CD69表达量；

图3为ELISA法检测Jurkat细胞分泌IL2的表达量；

图4为流式细胞仪检测鼠源CAR-T细胞的感染效率；

图5为流式细胞仪检测小鼠外周血T细胞比例；

图6为流式细胞仪检测小鼠外周血CAR-T细胞比例；

图7为流式细胞仪检测小鼠外周血B细胞比例；

图8为小鼠的生存曲线结果图；

图9为小鼠肿瘤体积变化结果图；

图10为小鼠外周血T细胞比例。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1：嵌合抗原受体的构建

(1)通过全基因合成CAR(1928z CAR和T28z CAR)结构域，如图1所示；

所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如下：

1928z CAR(SEQ ID NO.2):

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKSTSKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPASMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK*.

T28z CAR(SEQ ID NO.3):

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSSRDRIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSQAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKSTSKIVAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPASMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK*.

实施例2：TGFβ体外激活CAR-jurkat细胞

将实施例1中的1928z CAR-T细胞和T28z CAR-T细胞载体的表达质粒，再利用293T细胞制备表达CAR的慢病毒，最后感染Jurkat细胞，具体步骤如下：

(1)将10⁵CAR Jurkat细胞接种到48孔板，分别加入TGFβ(0,3,10,30ng/ml)，体积为200μl，37℃共培养24h；

(2)培养24h后，将48孔板取出，将细胞上清冻存于-20℃，用于检测IL2，细胞用于流式检测；

(3)将细胞用PBS清洗后，加入适量的APC标记human-CD69的抗体，室温孵育20min后，用PBS清洗后上流式细胞检测仪检测；

(4)细胞上清用ELISA试剂盒检测细胞上清IL2的表达。

结果如图2-3所示，从图2-3可以看出，TGFβ能够激活T28z CAR-Jurkat细胞的CD69和促进其分泌IL2。

实施例3：T28z CAR-T免疫小鼠无毒副作用

为了验证T28z CAR-T细胞的安全性，本实施例构建了鼠源的CAR-T细胞(由于的TGFβ的scFv同时能够被人源和鼠源的TGFβ激活，因此鼠源版本的T28z CAR-T的scFv能够通用),利用能够靶向小鼠B细胞的m1928z T细胞作为阳性对照，通过观察小鼠生理状态评估T28zT细胞的安全性，具体如下：

(1)利用逆转录病毒系统制备逆转录病毒，再从B6小鼠脾脏中分离出T细胞，最后用逆转录病毒感染小鼠T细胞，感染效率通过流式细胞仪检测；

(2)将制备完成的CAR-T细胞通过尾静脉注射到辐照后B6小鼠，每组3只小鼠，每只注射5×10⁵个CAR-T细胞，定期抽取小鼠的外周血检测小鼠T细胞和B细胞等生长情况，实验周期为4个月；实验结束后，将小鼠解剖，取出肺部，肝和肾进行HE染色评估小鼠的健康情况；

结果如图4-8所示，从图4-8可以看出T28z CAR-T细胞对免疫健全小鼠的生存期没有影响，而且小鼠的肺，肝和肾等内脏组织均没有变化，T28z CAR-T细胞在免疫健全小鼠体内是不会引起明显的副作用，安全性良好。

实施例4：T28z CAR-T细胞逆转TGFβ作用

为了进一步在荷瘤小鼠模型验证T28z CAR-T细胞的抗肿瘤能力，我们制备了1928z CAR-T细胞(阴性对照)，G28z CAR-T细胞(阳性对照，靶向GPC3阳性肿瘤)和T28zCAR-T细胞。在NSI免疫缺陷小鼠上构建HepG2肿瘤模型，待肿瘤长到50mm³左右，开始癌旁注射CAR-T细胞，每次注射5×10⁶个细胞，每周注射1次，共2周。每周测量2次肿瘤体积，每2周抽血检测外周血T细胞生长情况。

结果如图9-10所示，从图9-10可以看出T28z CAR-T细胞显著抑制HepG2细胞的生长，而且T28z CAR-T细胞在小鼠体内大量扩增。

综上所述，本发明的T28z CAR-T相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果，且具有安全性和长效性，对于实体瘤确实达到很好的疗效。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市体内生物医药科技有限公司

<120> 一种嵌合抗原受体及其应用

<130> 2020

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 265

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 1

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr

20 25 30

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly

65 70 75 80

Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Gln Tyr Ala Asp Ser Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu

115 120 125

Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

145 150 155 160

Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser

165 170 175

Asn Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Met Gly Gly Val Ile Pro Ile Val Asp Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Arg

195 200 205

Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Thr

210 215 220

Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Ser Thr Leu Gly Leu Val Leu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly

245 250 255

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260 265

<210> 2

<211> 918

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

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Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

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50 55 60

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

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Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala

145 150 155 160

Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu

165 170 175

Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser

195 200 205

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

210 215 220

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu

260 265 270

Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr

275 280 285

Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro

290 295 300

Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

305 310 315 320

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

325 330 335

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

340 345 350

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

355 360 365

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

370 375 380

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

385 390 395 400

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

405 410 415

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

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Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

465 470 475 480

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Ala Lys Arg Lys Pro Arg

485 490 495

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<213> 人工合成序列

<400> 3

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1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr

20 25 30

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser

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Gln Ser Leu Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

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Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg

355 360 365

Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Gln Ala Lys Arg Lys Pro Arg Lys Ala

370 375 380

Pro Ser Arg Asn Ile Cys Tyr Asp Ala Phe Val Ser Tyr Ser Glu Arg

385 390 395 400

Asp Ala Tyr Trp Val Glu Asn Leu Met Val Gln Glu Leu Glu Asn Phe

405 410 415

Asn Pro Pro Phe Lys Leu Cys Leu His Lys Arg Asp Phe Ile Pro Gly

420 425 430

Lys Trp Ile Ile Asp Asn Ile Ile Asp Ser Ile Glu Lys Ser His Lys

435 440 445

Thr Val Phe Val Leu Ser Glu Asn Phe Val Lys Ser Glu Trp Cys Lys

450 455 460

Tyr Glu Leu Asp Phe Ser His Phe Arg Leu Phe Asp Glu Asn Asn Asp

465 470 475 480

Ala Ala Ile Leu Ile Leu Leu Glu Pro Ile Glu Lys Lys Ala Ile Pro

485 490 495

Gln Arg Phe Cys Lys Leu Arg Lys Ile Met Asn Thr Lys Thr Tyr Leu

500 505 510

Glu Trp Pro Met Asp Glu Ala Gln Arg Glu Gly Phe Trp Val Asn Leu

515 520 525

Arg Ala Ala Ile Lys Ser Thr Ser Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln

530 535 540

Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn

545 550 555 560

Pro Gly Pro Ala Ser Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly

565 570 575

Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys

580 585 590

Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu

595 600 605

Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro

610 615 620

Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr

625 630 635 640

Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu

645 650 655

Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr

660 665 670

Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg

675 680 685

Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly

690 695 700

His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala

705 710 715 720

Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn

725 730 735

Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr

740 745 750

Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser

755 760 765

Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met

770 775 780

Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp

785 790 795 800

Glu Leu Tyr Lys

Claims

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域串联而成；

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述肿瘤抗原TGFβ的单链抗体的氨基酸序列选自：

(a)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或者，

3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的氨基酸序列与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，优选为95％同一性的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内结构域还包括胞内共刺激信号传导域和/或CD3ζ信号传导域；

优选地，所述胞内共刺激信号传导域包括人CD28胞内区、人4-1BB胞内区、人TLR1胞内区、人TLR2胞内区、人TLR3胞内区、人TLR4胞内区、人CD27胞内区、人CD28胞内区、人OX40胞内区、人CD30胞内区、人CD40胞内区、人PD-1胞内区、人ICOS胞内区、人淋巴细胞功能相关抗原1胞内区、人CD2胞内区、人CD7胞内区、人LIGHT胞内区、人NKG2C胞内区、人B7-H3胞内区或人CD83胞内区中的任意一种或至少两种的组合，优选为人CD28胞内区和人TLR2胞内区。

5.根据权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域为CD28跨膜区和人TLR2胞内区。

6.编码如权利要求1-5任一项所述的嵌合抗原受体的核酸。

7.一种病毒载体，其特征在于，包括权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体；

优选地，所述病毒载体为慢病毒载体和/或逆转录病毒载体，优选为慢病毒载体。

8.一种重组慢病毒，其特征在于，将包含如权利要求7所述的病毒载体与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSVG共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒；

优选地，所述哺乳细胞为293细胞、293T细胞、TE671细胞或Jurkat细胞中的任意一种或至少两种的组合。

9.制备如权利要求8所述的重组慢病毒的方法，其包括将如权利要求6所述的核酸引入细胞的步骤；优选地，所述细胞为T细胞或含有T细胞的细胞群。

10.如权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体、如权利要求7所述的病毒载体或如权利要求8所述的重组慢病毒在制备嵌合抗原受体T细胞或免疫细胞及其在肿瘤治疗药物中的应用。