CN112321721A - 一种嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞及该免疫细胞在晚期胰腺癌治疗上的应用 - Google Patents

一种嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞及该免疫细胞在晚期胰腺癌治疗上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞及该免疫细胞在晚期胰腺癌治疗上的应用，该嵌合抗原受体由CD8leader、scFv(TGF‑β)、T2A、CD8leader、scFv(GPC‑1)和CD8的铰链区，CD28跨膜‑刺激结构域及CD3ζ刺激信号传导区依次串联构成；使用该嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法，包括分离免疫细胞、使用慢病毒质粒感染；该嵌合抗原受体中携带有两个抗体，将本发明的免疫细胞应用于晚期胰腺癌治疗，对阳性胰腺癌细胞的体外杀伤效率达90％以上，体内杀伤效率通过裸鼠实验可以看出，肿瘤快速缩小且在21天后裸鼠肿瘤全部消失。

Description

一种嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞及该免疫细胞在晚期 胰腺癌治疗上的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞及该免疫细胞在晚期胰腺癌治疗上的应用。
背景技术
胰腺癌是死亡率极高的消化系统恶性肿瘤，由于该病症早期缺乏特异性症状和有效的生物标记物，使得超过80％的患者确诊时已处于晚期，无法给予手术治疗，因此，胰腺癌被称为“癌中之王”，“21世纪医学界顽固堡垒”。
近年来，随着细胞生物学以及肿瘤免疫学的快速发展，肿瘤免疫在肿瘤的发生、发展和治疗中的重要作用也被逐渐证实，相应地发展出了嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)修饰免疫细胞等突破性的新型肿瘤免疫治疗技术。CAR是一种重组的抗原受体，兼具结合抗原和激活免疫细胞的功能。转入CAR的免疫细胞，携带识别肿瘤抗原特异性受体使免疫细胞具有靶向杀伤肿瘤细胞活性的个性化疗效。磷脂酰肌醇蛋白多糖-1(glypicans-1，GPC-1)作为跨膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖，在肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移中起着重要作用。Melo等研究发现，GPC-1在胰腺癌组织中选择性表达，但在良性胰腺肿瘤、胰腺炎和正常胰腺组织中不表达(Melo SA,Luecke LB,Kahlert C,et al.Glypican-1identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer.Nature.2015；523(7559):177–182)，因此，以GPC-1为靶点嵌合抗原受体为基础的细胞免疫治疗新策略会给胰腺癌患者带来新的希望。
目前的研究表明，嵌合抗原受体修饰免疫细胞治疗在血液瘤临床治疗中显示出了显著疗效，但是在治疗晚期胰腺癌的过程中遇到很多困难，其中一个很重要的原因就是转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)，TGF-β是一种免疫抑制因子，晚期胰腺癌细胞均可分泌，一旦TGF-β水平升高便可以阻断未成熟的T细胞向Th1细胞分化，促进其向Treg亚群的转化，并抑制树突状细胞的抗原递呈功能，从而导致肿瘤细胞的免疫逃逸。为了TGF-β诱导的免疫抑制，开发用于阻断TGF-β信号通路以TGF-β及其受体为靶标的小分子抑制剂是目前研究的重点。
因此，降低胰腺癌免疫抑制，提高嵌合抗原受体为基础的细胞免疫治疗的疗效，是目前的亟需解决的技术难题。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供了一种嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞及该免疫细胞在晚期胰腺癌治疗上的应用，该嵌合抗原受体中携带有两个抗体，分别为scFv(TGF-β)和scFv(GPC-1)，scFv(TGF-β)可有效封闭肿瘤细胞表面的TGF-β，阻断肿瘤的免疫逃逸；scFv(GPC-1)可靶向GPC-1的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞治疗的疗效。将本发明的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞应用于晚期胰腺癌治疗，通过实施例4的验证可以看出，对阳性胰腺癌细胞的体外杀伤效率达90％以上，体内杀伤效率通过裸鼠实验可以看出，肿瘤快速缩小且在21天后裸鼠肿瘤全部消失。可见，该嵌合抗原受体具有设计科学合理的优点，且使用效果显著。
本发明的技术方案如下：
一种嵌合抗原受体(CAR)，由CD8leader、scFv(TGF-β)、T2A、CD8leader、scFv(GPC-1)和CD8的铰链区，CD28跨膜-刺激结构域及CD3ζ刺激信号传导区依次串联构成，该嵌合抗原受体的完整核酸序列为SEQ ID NO.1所示序列。
优选的，所述scFv(TGF-β)由VH-VL构成，融合后的融合基因片CD8Leader-VH-VL的基因片段为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
优选的，所述scFv(TGF-β)的构建方法，过程如下：
(1)构建并提取pLent-scFv(TGF-β)质粒：将设计的融合基因片CD8Leader-scFv(TGF-β)合成表达框，并插入pLent-C-GFP载体(Invitrogen)的NotI-AsiSI位点，构建成pLent-scFv(TGF-β)载体；将pLent-scFv(TGF-β)载体转入E.coli表达，提取并纯化质粒；
(2)收集scFv(TGF-β)：s1，在培养皿中培养293T细胞，备用；s2，用无血清的DMEM-HG培养基分别稀释步骤(1)的质粒和脂质体转染试剂，各自混匀后，将稀释后的脂质体转染试剂加入到稀释后的质粒溶液中，混匀，室温静置15min形成脂质体/DNA复合物，备用；s3，转染：将s2的脂质体/DNA复合物加入到s1的293T细胞培养基中，摇匀；在转染12-18h后，更换新鲜培养基，继续培养48h后，收集含有scFv(TGF-β)上清液；取上清液依照BCA蛋白浓度试剂盒说明测定蛋白浓度后，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，煮沸10min，-20℃保存备用。
优选的，所述scFv(GPC-1)是由VH-Linker[(GGGGS)3]-VL构成，融合后的scFv(GPC-1)核酸人工序列为SEQ ID NO.5所示序列。
优选的，所述CD8Leader核酸人工序列为SEQ ID NO.4所示序列；自裂解多肽T2A核酸人工序列为SEQ ID NO.3所示序列；CD8Hinge区的核酸人工序列为SEQ ID NO.6所示序列；CD28跨膜-刺激区的核酸人工序列为SEQ ID NO.7所示序列；CD3ζ刺激信号传导区的核酸人工序列为SEQ ID NO.8所示序列。
一种慢病毒质粒的构建方法，过程为：
向CAR合成的表达框中插入pLent-EF 1a-FH-CMV-RFP-P2A-Puro载体(Invitrogen)，构建pLent-CAR(TGF-β-GPC-1)，并转化到E.coli中表达，表达后经测序正确后提取并纯化质粒，获得慢病毒质粒。
一种嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法，过程为：首先，分离免疫细胞，备用；其次，使用慢病毒质粒感染获得的免疫细胞，并向其中加入polybrene，使polybrene在溶液中的浓度达到6μg/ml；感染后的免疫细胞12h后换液一次；第一次感染48h后，以同样的条件重复感染一次，第二次感染3d后，获得嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
优选的，封闭TGF-β的用于解除免疫抑制靶向GPC-1的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞选自自体的或转基因的T细胞、NK细胞、CIK细胞、细胞毒性T淋巴细胞或调节T细胞、巨噬细胞、记忆性T细胞。
使用上述免疫细胞制备方法获得的免疫细胞在治疗晚期胰腺癌上的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明的CAR，通过表达scFv(TGF-β)封闭肿瘤细胞表面的TGF-β，不但解除TGF-β对免疫细胞的抑制，阻断肿瘤的免疫逃脱，而且促进免疫细胞的浸润，提高靶向GPC-1的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞治疗的疗效。
2.本发明的scFv(TGF-β)是基于抗体GC1008可变区进行设计，对TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3都具有一定的亲和力，对TGF-β1的亲和力最高。此外，scFv(TGF-β)是VH的C端残基就直接与VL的N端残基相连，分泌到细胞外的两个ScFv分子构成一个二价的二聚体(Diabodies)，两端游离的VH、VL就与第三个ScFv分子构成一个三价的三聚体(Tribodies)。与常规的scFv相比，不但克服了ScFv在体内清除过快的不足，而且增加与抗原的高亲和力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明嵌合抗原受体原理设计图。
图2为scFv(TGF-β)对抗原TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3亲和力的蛋白印迹图。
图3为嵌合抗原受体CD8Leader-scFv(TGF-β)-T2A-CD8Leader-scFv(GPC-1)-CD8-CD28-CD3ζ的融合基因片段的设计图。
图4为慢病毒pLent-CAR(TGF-β-GPC-1)[CD8Leader-scFv(TGF-β)-T2A-CD8Leader-scFv(GPC-1)-CD8-CD28-CD3ζ]表达质粒的示意图。
图5为CAR(TGF-β-GPC-1)-T细胞的表达CAR的流式图。
图6为CAR(TGF-β-GPC-1)-T体外对GPC-1阳性BxPC-3、T3M-4和SUI T-2细胞系的杀伤结果图。
图7为CAR(TGF-β-GPC-1)-T细胞体内杀伤结果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1scFv(TGF-β)的构建及亲和力的验证
1、制备pLent-scFv质粒
选择抗体的VH-VL部位，与CD8Leader融合，获得融合基因片CD8Leader-VH-VL，基因片段为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
将预设计的融合基因片委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成其整个表达框，并插入pLent-C-GFP载体(Invitrogen)NotI-AsiSI位点，构建成pLent-scFv(TGF-β)载体(见图3)，转入E.coli(DH5α)表达，经测序正确后，使用Omega的Endo-Free Plasmid Maxi Kits试剂盒提取并纯化质粒，获得质粒pLent-scFv，并用Tecan Infinite 200PRO酶标仪测定抽提质粒的浓度(＞2mg/ml)及纯度(A260/A280为1.8-2.0)，此过程中的scFv(TGF-β)是基于抗体GC1008可变区VH-VL进行设计。
2、收集scFv(TGF-β)
s1，将293T细胞培养在10cm培养皿中，使其在转染前生长密度达到70％-80％，转染前1h将旧的培养基更换为新鲜培养基，备用；
s2，准备2只EP管，EP1管中装入质粒DNA，质粒DNA由5μg步骤1的质粒pLent-scFv、5μg质粒pLP1、5μg质粒pLP2和5μg质粒pLP/VSVG组成，EP2管中装入脂质体转染试剂60μl，用无血清的DMEM-HG培养基分别对EP1和EP2稀释，轻轻颠倒几次混匀液体，随后立即将稀释后的EP2管脂质体溶液加入到EP1管质粒DNA溶液中，混匀，室温静置15min形成脂质体/DNA复合物，备用；
s3，转染：将s2的脂质体/DNA复合物全部加入到s1的293T细胞培养基中，摇匀；在转染12-18h后，吸去含脂质体/DNA复合物的培养基，更换为新鲜的培养基继续培养细胞；继续培养48h后，收集上清液；取上清液依照BCA蛋白浓度试剂盒说明测定蛋白浓度后，加入上样缓冲液，煮沸10min，获得scFv(TGF-β)，-20℃保存备用。
3、scFv(TGF-β)亲和力的测定
制备3块SDS-PAGE胶，采用Tris-Glycine缓冲液，浓缩胶浓度5％，分离胶10％，上样10μL，浓缩胶电压130V，分离胶电压130V；Marker：Thermo PageRuler PrestainedProtein Ladder；考马斯亮蓝染色2h，脱色液脱色过夜；
将3块脱色后SDS-PAGE的胶，固定到Western blot转膜系统中，200mA转PVDF膜1.5h；5％脱脂奶粉TBST封闭1h；向3块胶中分别加入1μg/mL兔抗人TGF-β1单克隆抗体、兔抗人TGF-β2单克隆抗体和兔抗人TGF-β3单克隆抗体进行过夜孵育；第二日再取出PVDF膜，用TBST振摇漂洗5次，每次5min；然后再将PVDF膜放入含同浓度的山羊抗兔IgG工作液中室温振摇孵育2h；最后用TBST摇动洗膜5次，每次5min；取出膜，用显色试剂盒显迹后，用印记显影系统采集图像，见图2。结果表明，scFv(TGF-β)抗体与三种抗原都具有结合能力，其中，与TGF-β1的结合能力最强，与TGF-β2和TGF-β3结合形成二聚体、三聚体；这说明，本发明提供的CAR与抗原的亲和力高，且能够更全面的封闭TGF-β，进而避免肿瘤的免疫逃逸。
实施例2表达嵌合抗原受体蛋白的慢病毒质粒的构建
1、将融合基因片CD8Leader-scFv(TGF-β)-T2A-CD8Leader-scFv(GPC-1)-CD8-CD28-CD3ζ插入慢病毒表达载体pLent-EF1a-FH-CMV-RFP-P2A-Puro载体；
CD8Leader-scFv(TGF-β)-T2A-CD8Leader-scFv(GPC-1)-CD8-CD28-CD3ζ的CAR模块示意见图3(完整核酸序列见附录SEQ ID NO.1)；
CD8Leader-scFv(TGF-β)-T2A-CD8Leader-scFv(GPC-1)-CD8-CD28-CD3ζ的CAR各模块序列如下：
(1)自裂解多肽T2A核酸人工序列(SEQ ID NO.3)；
(2)scFv(TGF-β)的核酸人工序列(SEQ ID NO.2)；
(3)导引子CD8Leader核酸人工序列(SEQ ID NO.4)；
(4)scFv(GPC-1)核酸人工序列(SEQ ID NO.5)；
(5)CD8Hinge区核酸人工序列(SEQ ID NO.6)；
(6)CD28跨膜-刺激区核酸人工序列(SEQ ID NO.7)；
(7)CD3ζ刺激信号传导区核酸人工序列(SEQ ID NO.8)；
分别按导引子CD8Leader的核酸人工序列、scFv(TGF-β)的核酸人工序列、自裂解多肽T2A核酸人工序列、scFv(GPC-1)的核酸人工序列、CD8Hinge区的核酸人工序列、CD28跨膜-刺激区的核酸人工序列、CD3ζ刺激信号传导区的核酸人工序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成其整个表达框，并插入pLent-EF1a-FH-CMV-RFP-P2A-Puro载体(Invitrogen)(见图4)，构建pLent-CAR(TGF-β-GPC-1)，转化到E.coli(DH5α)，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体的高品质质粒。
2、慢病毒包装，滴度检测
ss1，将293T细胞培养在10cm培养皿中，使其在转染前生长密度达到70％-80％，转染前1h将旧的培养基更换为新鲜培养基，备用；
ss2，准备2只EP管，EP1管中装入质粒DNA，质粒DNA由5μg步骤1的质粒pLent-CAR(TGF-β-GPC-1)、5μg质粒pLP1、5μg质粒pLP2、5μg质粒pLP/VSVG组成，EP2管中装入脂质体转染试剂60μl，用无血清的DMEM-HG培养基分别对EP1和EP2稀释，轻轻颠倒几次混匀液体，随后立即将稀释后的EP2管脂质体溶液加入到EP1管质粒DNA溶液中，混匀，室温静置15min形成脂质体/DNA复合物，备用；
ss3，转染：将s2的脂质体/DNA复合物全部加入到s1的293T细胞培养基中，摇匀；在转染12-18h后，吸去含脂质体/DNA复合物的培养基，更换为新鲜的培养基继续培养细胞；继续培养48h后，收集上清液；0.45μm过滤后-20℃保存。根据Lenti-XTMGo StixTM试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司产品)测定病毒滴度，结果表明，重组慢病毒的滴度2.90×106pfu/mL。
实施例3CAR(TGF-β-GPC-1)-T细胞的制备与检测
1、Ficoll密度梯度离心法分离淋巴细胞，并进行CAR(TGF-β-GPC-1)-T细胞的制
健康成人志愿者签署知情同意书后，用EDTA抗凝管抽取30ml外周血，与生理盐水1﹕1混合；然后取等体积的淋巴细胞分离液，将稀释后的外周血标本轻轻加在分离液表面，避免外周血标本冲破分离液界面，于2500rpm室温离心20min；离心完毕后液面总共分为4层，由上到下依次为稀释的血浆层、单个核细胞层、分离液层和红细胞层；小心收集单个核细胞层，并将其转移到一个新的离心管中，用生理盐水重悬洗涤两次，于1200rpm离心10min；计数洗涤后的细胞，并用含10％FBS的KBM551培养基重悬，使细胞密度为2×10 6个/ml；
随后加入终浓度为1000IU/ml的IFN-γ，于37℃、5％CO2条件培养24h后，再加入终浓度为300IU/ml的IL-2和50ng/ml的OKT3再次刺激，每3天半量换液，补加等体积量的新培养液，保持IL-2终浓度为50IU/ml；在第13天时，按MOI＝8的比例将重组慢病毒(实施例2获取)感染T细胞，并加入终浓度为6μg/ml的polybrene；感染后的T细胞12h后换液一次；第一次感染48h后，以同样的条件重复感染一次，第二次感染3d后即可用。
2、检测
通过FC500流式细胞仪(购自BECKMAN公司)FL1通道检测嵌合抗原受体表达(图5)。以未感染的PBMC细胞作为阴性对照，重组慢病毒感染T其阳性率85.4％。
实施例4实施例3的CAR(TGF-β-GPC-1)-T细胞杀伤活性研究
1、CAR(TGF-β-GPC-1)-T细胞体外杀伤活性研究
GPC-1阳性胰腺癌细胞系的BxPC-3、T3M-4和SUIT-2作为靶细胞，效应细胞为CAR(TGF-β-GPC-1)-T细胞和空载慢病毒感染T。
接种100μl 1×105个/孔的靶细胞到96孔细胞培养板中，以1:2效靶比加入效应细胞，设置效应细胞对照组和靶细胞对照组；均置于5％CO2、37℃培养箱培养24h后，每孔加入20μL CCK-8，继续孵育2h后，用酶标仪检测，于450nm波长处读取OD值，杀伤率＝[1-(实验组A值-效应细胞对照组A值)/靶细胞对照组A值]×100％。以空载慢病毒感染T作为对照组(结果见图6)。结果表明，CAR(TGF-β-GPC-1)-T体外对GPC-1阳性BxPC-3、T3M-4和SUIT-2细胞系的杀伤效率都在90％以上，明显高于空载慢病毒感染T差异具有显著意义(p＜0.001)。
2、CAR(TGF-β-GPC-1)-T细胞体内杀伤活性研究
将6周龄雌性裸鼠饲养于动物房(室温23±2℃，湿度50％±10％)，收集对数期的GPC-1抗原表达细胞株BxPC-3，用生理盐水稀释至2×105个/mL；无菌条件下，裸鼠左腋下接种0.2mL细胞悬浮液，观察3-5d，待腋下出现米粒大小较硬的结节作为建模成功的标准。
肿瘤模型裸鼠(游标卡尺量取皮下肿瘤组织块的大小为90-100mm3)随机分成4组，每组20只，开始注射治疗实验。
实验组分别为：
对照组，尾部静脉注射同等体积的生理盐水；
治疗一组，尾部静脉注射2×106个细胞/只T细胞；
治疗二组，尾部静脉注射2×106个细胞/只CAR(GPC-1)-T细胞；
治疗三组，尾部静脉注射2×106个细胞/只CAR(TGF-β-GPC-1)-T细胞；
首次注射后7天，每组再进行第二次同剂量注射，实验以21天为周期。每3天通过游标卡尺量取各个实验组裸鼠皮下肿瘤组织块大，并记录，用肿块均值绘制肿瘤生长曲线图，见图7。
注射CAR(TGF-β-GPC-1)-T组，最早出现肿瘤缩小的现象且21天后该组裸鼠的肿瘤全部消失；注射CAR(GPC-1)-T组抑制了裸鼠肿瘤的生长，但21天后该组仅有65.0％裸鼠的肿瘤全部消失，这说明在靶点相同的情况下，封闭TGF-β特异性嵌合抗原受体修饰的T具备更强清除肿瘤的能力。
尽管通过参考优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
在本申请中，涉及到的基因序列如下：
SEQ ID NO.1
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATATACCTTCAGCAGCAACGTCATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGAGTCATCCCTATCGTCGACATCGCAAACTACGCACAGCGATTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCAGACAAATCCACGAGCACAACATACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGCACCCTGGGCCTGGTCCTGGACGCAATGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCAGAAACGGTGCTCACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTCTCGGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCCCAGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGCCGACTCACCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGAGAAGGCCGAGGGAGCCTGCTGACATGTGGCGATGTGGAGGAAAACCCAGGACCAATGGCTTGGGTGTGGACACTGCTGTTCCTGATGGCTGCTGCCCAGAGTATTCAGGCTCAGATTCAGCAGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGATGAGCGTGCTGACCCAGGTGCTGGCCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGGAGCCCGTTGCGACACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
SEQ ID NO.2
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATATACCTTCAGCAGCAACGTCATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGAGTCATCCCTATCGTCGACATCGCAAACTACGCACAGCGATTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCAGACAAATCCACGAGCACAACATACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGCACCCTGGGCCTGGTCCTGGACGCAATGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCAGAAACGGTGCTCACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTCTCGGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCCCAGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGCCGACTCACCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGA
SEQ ID NO.3
GAAGGCCGAGGGAGCCTGCTGACATGTGGCGATGTGGAGGAAAACCCAGGACCA
SEQ ID NO.4
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGA
SEQ ID NO.5
ATGGCTTGGGTGTGGACACTGCTGTTCCTGATGGCTGCTGCCCAGAGTATTCAGGCTCAGATTCAGCAGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGATGAGCGTGCTGACCCAGGTGCTGGCCCTGCTGCTGCTGTGGCTGACCGGAGCCCGTTGCGAC
SEQ ID NO.6
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
SEQ ID NO.7
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
SEQ ID NO.8
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
序列表
<120> 一种嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞及该免疫细胞在晚期胰腺癌治疗上的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1657
<212> DNA
<213> System.Data.DataRowView
<400> 1
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
caggtccagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 120
tcctgcaagg cttctggata taccttcagc agcaacgtca tcagctgggt gcgacaggcc 180
cctggacaag ggcttgagtg gatgggagga gtcatcccta tcgtcgacat cgcaaactac 240
gcacagcgat tcaagggcag agtcacgatt accgcagaca aatccacgag cacaacatac 300
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagcaccctg 360
ggcctggtcc tggacgcaat ggactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420
gcttcagaaa cggtgctcac gcagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc aggggaaaga 480
gccaccctct cctgcagggc cagtcagagt ctcggcagca gctacttagc ctggtaccag 540
cagaaacctg gccaggctcc caggctcctc atctatggtg catccagcag ggccccaggc 600
atcccagaca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcactctcac catcagcaga 660
ctggagcctg aagattttgc agtgtattac tgtcagcagt atgccgactc accgatcacc 720
ttcggccaag ggacacgact ggagattaaa cgagaaggcc gagggagcct gctgacatgt 780
ggcgatgtgg aggaaaaccc aggaccaatg gcttgggtgt ggacactgct gttcctgatg 840
gctgctgccc agagtattca ggctcagatt cagcaggagg aggaggaagc ggaggaggag 900
gaagcggagg aggaggaaga tgagcgtgct gacccaggtg ctggccctgc tgctgctgtg 960
gctgaccgga gcccgttgcg acaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc 1020
caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg 1080
cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatttt tgggtgctgg tggtggttgg 1140
tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag 1200
gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg 1260
gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc 1320
cagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac aagcagggcc agaaccagct 1380
ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg 1440
ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa 1500
tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg 1560
ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac 1620
ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1657
<210> 2
<211> 747
<212> DNA
<213> System.Data.DataRowView
<400> 2
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
cagctggtgc aatctggggc tgaggtgaag aagcctgggt cctcggtgaa ggtctcctgc 120
aaggcttctg gatatacctt cagcagcaac gtcatcagct gggtgcgaca ggcccctgga 180
caagggcttg agtggatggg aggagtcatc cctatcgtcg acatcgcaaa ctacgcacag 240
cgattcaagg gcagagtcac gattaccgca gacaaatcca cgagcacaac atacatggag 300
ctgagcagcc tgagatctga ggacacggcc gtgtattact gtgcgagcac cctgggcctg 360
gtcctggacg caatggacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcttca 420
gaaacggtgc tcacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 480
ctctcctgca gggccagtca gagtctcggc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 540
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggcccc aggcatccca 600
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 660
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatgccg actcaccgat caccttcggc 720
caagggacac gactggagat taaacga 747
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> System.Data.DataRowView
<400> 3
gaaggccgag ggagcctgct gacatgtggc gatgtggagg aaaacccagg acca 54
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> System.Data.DataRowView
<400> 4
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
<210> 5
<211> 175
<212> DNA
<213> System.Data.DataRowView
<400> 5
atggcttggg tgtggacact gctgttcctg atggctgctg cccagagtat tcaggctcag 60
attcagcagg aggaggagga agcggaggag gaggaagcgg aggaggagga agatgagcgt 120
gctgacccag gtgctggccc tgctgctgct gtggctgacc ggagcccgtt gcgac 175
<210> 6
<211> 135
<212> DNA
<213> System.Data.DataRowView
<400> 6
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 7
<211> 204
<212> DNA
<213> System.Data.DataRowView
<400> 7
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180
cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204
<210> 8
<211> 336
<212> DNA
<213> System.Data.DataRowView
<400> 8
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

Claims (9)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，由CD8leader、scFv(TGF-β)、T2A、CD8leader、scFv(GPC-1)和CD8的铰链区，CD28跨膜-刺激结构域及CD3ζ刺激信号传导区依次串联构成，该嵌合抗原受体的完整核酸序列为SEQ ID NO.1所示序列。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述scFv(TGF-β)由VH-VL构成，融合后的融合基因片CD8Leader-VH-VL的基因片段为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述scFv(TGF-β)的构建方法，过程如下：
(1)构建并提取pLent-scFv(TGF-β)质粒：将设计的融合基因片CD8Leader-scFv(TGF-β)合成表达框，并插入pLent-C-GFP载体(Invitrogen)的NotI-AsiSI位点，构建成pLent-scFv(TGF-β)载体；将pLent-scFv(TGF-β)载体转入E.coli表达，提取并纯化质粒；
(2)收集scFv(TGF-β)：s1，在培养皿中培养293T细胞，备用；s2，用无血清的DMEM-HG培养基分别稀释步骤(1)的质粒和脂质体转染试剂，各自混匀后，将稀释后的脂质体转染试剂加入到稀释后的质粒溶液中，混匀，室温静置15min形成脂质体/DNA复合物，备用；s3，转染：将s2的脂质体/DNA复合物加入到s1的293T细胞培养基中，摇匀；在转染12-18h后，更换新鲜培养基，继续培养48h后，收集含有scFv(TGF-β)上清液；取上清液依照BCA蛋白浓度试剂盒说明测定蛋白浓度后，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，煮沸10min，-20℃保存备用。
4.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述scFv(GPC-1)是由VH-Linker[(GGGGS)3]-VL构成，融合后的scFv(GPC-1)核酸人工序列为SEQ ID NO.5所示序列。
5.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8Leader核酸人工序列为SEQID NO.4所示序列；自裂解多肽T2A核酸人工序列为SEQ ID NO.3所示序列；CD8Hinge区的核酸人工序列为SEQ ID NO.6所示序列；CD28跨膜-刺激区的核酸人工序列为SEQ ID NO.7所示序列；CD3ζ刺激信号传导区的核酸人工序列为SEQ ID NO.8所示序列。
6.如权利要求1-5任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，用于嵌合抗原受体表达的慢病毒质粒的构建方法，过程为：
向CAR合成的表达框中插入pLent-EF 1a-FH-CMV-RFP-P2A-Puro载体(Invitrogen)，构建pLent-CAR(TGF-β-GPC-1)，并转化到E.coli中表达，表达后经测序正确后提取并纯化质粒，获得慢病毒质粒。
7.一种使用权利要求1-5任一项所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于，制备方法为：首先，分离免疫细胞，备用；其次，使用慢病毒质粒感染获得的免疫细胞，并向其中加入polybrene，使polybrene在溶液中的浓度达到6μg/ml；感染后的免疫细胞12h后换液一次；第一次感染48h后，以同样的条件重复感染一次，第二次感染3d后，获得嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
8.如权利要求7所述的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于，该免疫细胞选自自体的或转基因的T细胞、NK细胞、CIK细胞、细胞毒性T淋巴细胞或调节T细胞、巨噬细胞、记忆性T细胞。
9.一种应用于治疗晚期胰腺癌的免疫细胞，其特征在于，该免疫细胞为使用权利要求7的制备方法获得的免疫细胞。
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