CN112125974A - 靶向bcma蛋白的抗体、嵌合抗原受体和药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向BCMA蛋白的抗体、嵌合抗原受体和药物，涉及细胞免疫治疗技术领域。本发明提供的抗体具有SEQ ID NO.22‑24所示的重链CDR区和SEQ ID NO.30‑32所示的轻链CDR区，或者是，具有SEQ ID NO.54‑56所示的重链CDR区和SEQ ID NO.62‑64所示的轻链CDR区；该抗体具有特异性结合BCMA蛋白的能力，采用该抗体制备的嵌合抗原受体T细胞对BCMA蛋白呈阳性的靶细胞具有特异性的杀伤效果，可用于制备治疗或预防肿瘤的药物。

Description

靶向BCMA蛋白的抗体、嵌合抗原受体和药物
本申请是申请日为2018年9月25日、申请号为201811117340.7、发明名称为“靶向BCMA蛋白的抗体、嵌合抗原受体和药物”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及细胞免疫治疗技术领域，具体而言，涉及一种靶向BCMA蛋白的抗体、嵌合抗原受体和药物。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)是以克隆性浆细胞大量增生为特征的恶性肿瘤。目前MM治疗可诱导缓解，但几乎所有患者最终仍会复发并死亡。尽管一些单克隆抗体已经在临床前研究和早期临床试验中显示出治疗MM的希望，但并没有得到一致性仍可。显然，对MM的新的免疫治疗显然是非常需要的，并且为该疾病开发有效的抗原特异性过继性T细胞疗法将是重大进展。T细胞可以被遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，该受体包括抗原识别部分和T细胞活化结构域的融合蛋白。对于B系恶性肿瘤，最常用的是抗CD19 CAR的过继性T细胞方法。抗CD19-CAR转导的T细胞在小鼠中治愈了白血病和淋巴瘤，一些患者也在过继输注的抗CD19-CAR转导的T细胞的早期临床试验中获得缓解，但同时，用抗CD19 CAR转导的T细胞也会清除掉正常的B细胞，并且不幸的是，CD19很少在MM的恶性浆细胞中表达，因此用CAR表达的T细胞治疗MM将需要寻找其它更好的靶标。
MM的免疫治疗的一种候选抗原是B细胞成熟抗原(B Cell Maturation Antigen，BCMA，CD269)。BCMA RNA在MM细胞中普遍检测到，多发性骨髓瘤患者的浆细胞表面可检测到BCMA蛋白。BCMA是肿瘤坏死因子受体(TNF)超家族的成员，可结合B细胞激活因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)。据报道，在正常细胞中，BCMA主要由浆细胞和一部分成熟B细胞表达，而在大部分B细胞以及其它器官上都不表达。BCMA缺乏的小鼠看上去一切正常，似乎很健康，而且B细胞数量正常，但浆细胞却不能长期存活。因此，BCMA将是用于治疗具有CAR表达T细胞的MM的合适的靶抗原。
然而，目前针对BCMA的抗体类别较少。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供靶向BCMA蛋白的抗体，该抗体可特异性结合BCMA蛋白，用于制备靶向BCMA蛋白的嵌合抗原受体T细胞。
本发明的另一目的在于提供一种靶向BCMA蛋白的嵌合抗原受体，其可靶向BCMA蛋白，表达该嵌合抗原受体的T细胞可特异性杀伤BCMA呈阳性的靶细胞。
本发明的另一目的在于提供一种靶向BCMA蛋白的嵌合抗原受体T细胞，该T细胞可特异性地杀伤BCMA阳性的靶细胞，可用于治疗BCMA阳性的肿瘤。
本发明的另一目的在于提供一种核酸分子。
本发明的另一目的在于提供一种载体。
本发明的另一目的在于提供一种重组细胞。
本发明的另一目的在于提供一种治疗肿瘤的药物，该药物可用于治疗或预防BCMA呈阳性的肿瘤。
本发明是这样实现的：
本发明以人BCMA(hBCMA)蛋白作为抗原，结合噬菌体库展示技术，淘选得到4个现有技术未曾报道的scFV抗体。并经实验验证该4个scFV抗体均具有结合BCMA蛋白的能力，采用该scFV抗体制备的嵌合抗原受体T细胞对BCMA蛋白呈阳性的靶细胞具有特异性的杀伤效果。因此，该4个scFV抗体可用于制备靶向BCMA蛋白的嵌合抗原受体T细胞以及用于制备BCMA呈阳性的肿瘤。
基于此，一方面，本发明提供了一种靶向BCMA蛋白的抗体，其重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示，其轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ IDNO.32所示；
或者，所述抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.54、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56所示，其轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64所示。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示；
或者，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.53所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.61所示。
具有上述CDR序列的抗体可特异性结合BCMA蛋白，其用于制备靶向BCMA蛋白的嵌合抗原受体T细胞。
此外，将本发明提供的抗体用于制备检测BCMA蛋白的检测试剂，或者在本发明提供的抗体上添加标记用于检测BCMA蛋白，属于本发明的保护范围。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述抗体为全长抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的一种。
对于本领域技术人员而言，在本发明提供了可特异性结合BCMA蛋白的抗体的重链可变区和轻链可变区的基础上，容易构建得到可结合BCMA蛋白的全长抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任一种抗体类型；无论何种类型的抗体，只要含有上述的重链CDR序列和/或轻链CDR序列，均属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供了一种靶向BCMA蛋白的嵌合抗原受体，其含有上述的靶向BCMA蛋白的抗体的重链可变区和轻链可变区。
进一步，在本发明的一些实施方案中，该嵌合抗原受体还具有如下元件中的一种或几种的组合：
信号肽、linker、铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域。
进一步，在本发明的一些实施方案中，上述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.73所示。
进一步，在本发明的一些实施方案中，上述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.74所示。
进一步，在本发明的一些实施方案中，上述铰链区(hinge)的氨基酸序列如SEQ IDNO.75所示。
进一步，在本发明的一些实施方案中，上述CD8α跨膜结构域的氨基酸序列如SEQID NO.76所示。
进一步，在本发明的一些实施方案中，上述4-1BB共刺激信号传导区的氨基酸序列如SEQ ID NO.77所示。
进一步，在本发明的一些实施方案中，上述CD3ζ信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.78所示。
需要说明的是，在其他的实施例中，本领域技术人员可以根据实际情况或需要改变信号肽、linker、铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域的组合类别和序列，无论基于何种形式的改变，只要该嵌合抗原受体具有本发明上述抗体的轻链可变区的CDR序列或轻链可变区序列，和/或上述抗体的重链可变区的CDR序列或重链可变区序列，其均属于本发明的保护范围。
进一步，在本发明的一些实施方案中，信号肽、上述抗体的轻链可变区、linker、上述抗体的重链可变区、铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域以依次串联的方式构成该嵌合抗原受体。
该嵌合抗原受体可靶向BCMA蛋白，表达该嵌合抗原受体的T细胞可特异性杀伤BCMA呈阳性的靶细胞。
另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码上述的抗体，或者其编码上述的嵌合抗原受体。
另一方面，本发明提供了一种载体，其含有上述的核酸分子。
另一方面，本发明提供了一种重组细胞，其含有编码上述嵌合抗原受体的核酸分子，或上述的载体。
另一方面，本发明提供了一种靶向BCMA蛋白的嵌合抗原受体T细胞，其表达有上述的嵌合抗原受体。
该T细胞可特异性地杀伤BCMA呈阳性的靶细胞，可用于治疗BCMA阳性的肿瘤。
另一方面，本发明提供了一种治疗肿瘤的药物，其含有上述的嵌合抗原受体T细胞。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述肿瘤为BCMA呈阳性的肿瘤。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，BCMA呈阳性的肿瘤细胞包括：MM1S和NCI-H929。
该药物可用于治疗或预防BCMA呈阳性的肿瘤。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述药物还含有药学上可接受的辅料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为BCMA抗体2077/2082/2073/2079与人的BCMA蛋白的结合力检测结果。
图2为CAR-BCMA结构示意图。
图3为流式细胞仪显示CD4+CD8+T细胞感染72Hrs后CAR-BCMA阳性率。
图4A为效靶比为5/1时，表达CAR-BCMA的T细胞(CAR-BCMA-2073-T，CAR-BCMA-2079-T)与靶细胞H929共培养，靶细胞比例随时间变化的流式图。
图4B为效靶比为5/1时，表达CAR-BCMA的T细胞(CAR-BCMA-2077-T，CAR-BCMA-2082-T)与靶细胞H929共培养，靶细胞比例随时间变化的流式图。
图5为效靶比为5/1时，表达CAR-BCMA的T细胞(CAR-BCMA-2073-T，CAR-BCMA-2077-T，CAR-BCMA-2079-The CAR-BCMA-2082-T)与靶细胞H929共培养，靶细胞比例随时间变化的统计结果图。
图6A为效靶比为7/1时，表达CAR-BCMA的T细胞(CAR-BCMA-2073-T，CAR-BCMA-2079-T)与靶细胞K562-BCMA细胞共培养，靶细胞比例随时间变化的流式图。
图6B为效靶比为7/1时，表达CAR-BCMA的T细胞(CAR-BCMA-2077-T，CAR-BCMA-2082-T)与靶细胞K562-BCMA细胞共培养，靶细胞比例随时间变化的流式图。
图7效靶比为7/1时，表达CAR-BCMA的T细胞与靶细胞K562-BCMA细胞共培养，靶细胞比例随时间变化的的统计结果图。
图8为表达靶向BCMA嵌合抗原受体的T细胞在经BCMA阳性细胞刺激激活后的细胞因子释放检测。
图9为表达靶向BCMA嵌合抗原受体的T细胞在小鼠骨髓瘤移植模型中对BCMA阳性瘤的治疗情况。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
1噬菌体库淘选
使用生物素化的hBCMA蛋白作为全人源抗体库的淘选抗原。首先用封闭液(PBST/5％脱脂奶粉)室温封闭噬菌体抗体2h，噬菌体的投入量为2×1012phage，然后加入10μg抗原，室温孵育1h，孵育后加入50μl预封闭的
Figure BDA0002656502390000071
M-280 Streptavidin磁珠，室温孵育30min。
先用PBST洗去未结合的噬菌体，再用0.1M的HCl-Glycine洗脱结合在磁珠上的噬菌体，之后用Tris-HCl中和洗脱液，取部分噬菌体侵染对数生长期的大肠杆菌TG1，收集的噬菌体用于下一轮淘选。
逐渐增加每轮的筛选强度，富集度达到100倍以上时，终止淘选。
2采用phage Elisa筛选抗BCMA的单链抗体阳性克隆
(1)挑选四轮淘选后的噬菌体侵染的TGl单克隆，接种于96孔板中，培养基为2YT(含2％glucose、100μg/ml Ampicilline)。
(2)37℃、250rpm过夜培养后转接至新的培养基中，培养至对数生长期后加入M13K07辅助噬菌体，37℃静止侵染1h。
(3)4000rpm离心15min，使用2YT(含100μg/ml Ampicilline、70μg/ml Kanamycin)培养基30℃过夜培养，离心取噬菌体上清，进行ELISA鉴定克隆。
(4)用0.5μg/ml的hBCMA抗原包被Costar-9018酶标板，3％BSA 4℃封闭过夜，加入收集的噬菌体上清，4℃孵育2h。
(5)洗去未结合的噬菌体后加入Ml3 Bacteriophage抗体(HRP)，4℃孵育1h。洗涤后加入TMB显色液显色，用2M HCl终止反应。
(6)用酶标仪于450nm读数，选择OD450>1.5克隆进行测序，对序列进行Germline分析和PTMs位点分析，排除有潜在开发风险的分子后共得到了4个具有结合hBCMA蛋白特性的scFv单链抗体(后文也可称为BCMA抗体)。
这四个scFv单链抗体分别是：
抗BCMA单链抗体1(命名为抗体2073)：
其重链可变区氨基酸序列为：SEQ ID NO.5，对应的核苷酸编码序列为：SEQ IDNO.1；
其重链可变区的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8，对应的核苷酸编码序列为：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4；
其轻链可变区氨基酸序列为：SEQ ID NO.13，对应的核苷酸编码序列为：SEQ IDNO.9；
轻链可变区的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.14、SEQID NO.15、SEQ ID NO.16，对应的核苷酸编码序列为：SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12；
抗BCMA单链抗体2(命名为抗体2077)
其重链可变区氨基酸序列为：SEQ ID NO.21，对应的核苷酸编码序列为：SEQ IDNO.17；
其重链可变区的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24，分别对应的核苷酸编码序列为：SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20；
其轻链可变区氨基酸序列为：SEQ ID NO.29，对应的核苷酸编码序列为：SEQ IDNO.25；
其轻链可变区的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32，对应的核苷酸编码序列为：SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28。
抗BCMA单链抗体3(命名为抗体2079)
其重链可变区氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.37，对应的核苷酸编码序列为：SEQID NO.33；
其重链可变区的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40，对应的核苷酸编码序列分别为：SEQ ID NO.34、SEQ IDNO.35、SEQ ID NO.36；
其轻链可变区氨基酸序列为：SEQ ID NO.45，对应的核苷酸编码序列为：SEQ IDNO.41；
其轻链可变区的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48，对应的核苷酸编码序列分别为：SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.43、SEQ ID NO.44；
抗BCMA单链抗体4(命名为抗体2082)
其重链可变区氨基酸序列为：SEQ ID NO.53，其对应的核苷酸序列为：SEQ IDNO.49；
其重链可变区的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56，对应的核苷酸编码序列分别为：SEQ ID NO.50、SEQ IDNO.51、SEQ ID NO.52；
其轻链可变区氨基酸序列为：SEQ ID NO.61，对应的核苷酸编码序列为：SEQ IDNO.57；
其轻链可变区的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64，对应的核苷酸编码序列分别为：SEQ ID NO.58、SEQ IDNO.59、SEQ ID NO.60。
实施例2
检测实施例1得到的4个BCMA抗体即2073、2077、2079或2082与hBCMA蛋白的结合力
检测方法：
(1)hBCMA蛋白包被，自1μg/ml开始稀释，3倍梯度稀释，共8个梯度，浓度分别为1μg/ml，333ng/ml，111ng/ml，37ng/ml，12.3ng/ml，4.1ng/ml，1.37ng/ml，0.45ng/ml，分别用100μl hBCMA蛋白稀释液包被Costar-9018酶标板，4℃过夜。
(2)用3％BSA室温封闭2h后加入BCMA抗体即2073、2077、2079或2082对应噬菌体上清(10^10pfu)，室温孵育2h。
(3)洗去未结合的噬菌体后加入Ml3 Bacteriophage抗体(HRP)，4℃孵育1h。洗涤后加入TMB显色液显色，用2M HCl终止反应。
(4)用酶标仪于450nm读数，结果见图1。
从图1中结果可以看出，表达有BCMA抗体2073、2077、2079或2082的噬菌体与hBCMA蛋白的结合能力良好，表现出S曲线，呈现出剂量效应关系，说明实施例1得到的4个BCMA抗体即2073、2077、2079和2082均具有与hBCMA蛋白的结合能力。
实施例3
构建嵌合抗原受体表达载体
构建方法：
(1)全基因合成：信号肽(核酸序列SEQ ID NO.66，氨基酸序列SEQ ID NO.73)、BCMA抗体轻链可变区(2073、2077、2079或2082的轻链可变区)、linker(核酸序列SEQ IDNO.67，氨基酸序列SEQ ID NO.74)、BCMA抗体重链可变区(2073、2077、2079或2082的重链可变区)、铰链区(hinge)(核酸序列SEQ ID NO.68，氨基酸序列SEQ ID NO.75)、CD8α跨膜结构域(TM)(核酸序列SEQ ID NO.69，氨基酸序列SEQ ID NO.76)、4-1BB共刺激信号传导区(核酸序列SEQ ID NO.70，氨基酸序列SEQ ID NO.77)以及CD3ζ信号传导结构域(核酸序列SEQID NO.71，氨基酸序列SEQ ID NO.78)。将上述序列依次连接。分别得到4种嵌合抗原受体表达盒，分别命名为：2073嵌合抗原受体表达盒(全长核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示、氨基酸序列如SEQ ID NO.72所示)、2077嵌合抗原受体表达盒(全长核苷酸序列如SEQ ID NO.79所示、氨基酸序列如SEQ ID NO.82所示)、2079嵌合抗原受体表达盒(全长核苷酸序列如SEQID NO.80所示、氨基酸序列如SEQ ID NO.83所示)和2082嵌合抗原受体表达盒(全长核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示、氨基酸序列如SEQ ID NO.84所示)。
并在各表达盒最前端引入Kozac序列，表达盒结构如图2所示。
(2)全基因合成嵌合抗原受体表达盒的序列后，通过XbaI/EcoRI酶切位点连入空载体pCDH-EF1-MSC-T2A-copGFP上，得到嵌合抗原受体表达载体；得到4个嵌合抗原受体表达载体，经测序验证正确后，分别命名为：
pCDH-EF1-CAR-BCMA-2073-copGFP，含抗体2073的轻链可变区和重链可变区；
pCDH-EF1-CAR-BCMA-2077-copGFP，含抗体2077的轻链可变区和重链可变区；
pCDH-EF1-CAR-BCMA-2079-copGFP，含抗体2079的轻链可变区和重链可变区；
pCDH-EF1-CAR-BCMA-2082-copGFP，含抗体2082的轻链可变区和重链可变区。
实施例4
制备含嵌合抗原受体表达载体的菌种
方法：
(1)在-80℃冰箱取出DH5α感受态，冰上解冻。
(2)在感受态中加5ng质粒，轻轻混匀，冰上5分钟。
质粒：pCDH-EF1-CAR-BCMA-2073-copGFP、pCDH-EF1-CAR-BCMA-2077-copGFP、pCDH-EF1-CAR-BCMA-2079-copGFP、或者是pCDH-EF1-CAR-BCMA-2082-copGFP。
(3)42℃热击90秒，冰上30分钟。
(4)加0.5ml无抗性的LB，37℃，180rpm培养30分钟。
(5)涂到氨苄抗性的平板上。
(6)37℃倒置过夜培养。
(7)挑单克隆，在氨苄抗性的LB中37℃，200rpm培养9-12小时。
(8)菌液中加甘油，甘油终浓度为10％，-80℃冰箱保存菌种，备用，可用于后续大量提取质粒。
(9)将上述菌种在LB中大量培养后，使用质粒抽提试剂盒(北京天根生化科技有限公司无内毒素质粒抽提试剂盒)抽提质粒，以备感染使用。质粒抽提方法按说明书进行即可。
实施例5
病毒包装
PEI法转染细胞。转染前24小时胰酶消化293T细胞，4×106的293T细胞铺在一个10cm细胞培养皿中，细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中，37℃5％CO2培养箱中培养，不超过24小时，当细胞达到60-80％密度时可转染。
具体步骤如下：
(1)将质粒，PEI，DMEM培养基置于室温5min；
(2)取DMEM 450μl于1.5mlEP管中，再加入50μl PEI(1μg/μl)混匀，室温静置5min；
(3)取10μg质粒(pCDH-EF1-CAR-BCMA-2073copGFP、pCDH-EF1-CAR-BCMA-2077-copGFP、pCDH-EF1-CAR-BCMA-2079-copGFP、或是pCDH-EF1-CAR-BCMA-2082-copGFP)，10μgpsPAX2，5μg pMD2.G，加入DMEM至500μl，混匀，室温静置5min；
(4)将配好的步骤(2)的PEI-DMEM溶液加入到步骤(3)得到的含质粒的DMEM中，混匀，室温静置20min；得到DNA/PEI混合物；
(5)将1ml DNA/PEI混合物慢慢滴入293T培养皿中，轻轻混匀，37℃培养箱孵育6-8h小时；
(6)弃去原有培养基，更换新鲜培养基，放入37℃培养箱继续孵育；
(7)更换培养基48小时后，收集培养基，之后每皿各添加10ml新鲜培养基继续培养，24h后再次收集上清，与48小时收集的上清混合；
(8)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；
(9)以0.45μm滤器过滤得到的上清；
(10)将过滤后的上清进行切向流过滤；
(11)将切向流过滤后的病毒上清转入超速离心管中，25000rpm离心2h，用无血清培养基对超离后得到的病毒沉淀进行重悬，轻轻吹打直至完全溶解，得到病毒液，采用不同载体得到的病毒液分别命名为：
2073病毒液(含2073嵌合抗原受体表达盒)、2077病毒液(含2077嵌合抗原受体表达盒)、2079病毒液(含2079嵌合抗原受体表达盒)、2082病毒液(含2080嵌合抗原受体表达盒)；
(12)将各病毒液分装，置于-80℃冰箱保存，并预留5-10μl病毒浓缩液进行滴度测定。
实施例6
病毒滴度测定
方法：
消化并计数293T细胞，用含10％FBS的DMEM培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为4×105/ml，向24孔培养板的每孔中加入0.5ml细胞悬液。细胞贴壁培养8小时后，感染稀释100倍的病毒液1μl、10μl、20μl、30μl、50μl，24小时后换液，48小时后流式检测293T细胞阳性率。
离心、重悬并调节细胞密度为1×106/ml，50μl中加biotin-BCMA抗原，终浓度为1μg/ml，孵育30min后，DPBS清洗一次，重悬，染二抗APC-Streptavidin(购自BD)30min，清洗一次后DPBS重悬，流式检测。
实施例7
制备靶向人BCMA抗原的嵌合抗原受体的T细胞
1人外周血单核细胞PBMC的分离
使用抗凝管(购自BD)采集外周血约25ml，按照1：1的体积比加入到淋巴细胞分离液中，梯度离心25min，离心后取白膜层细胞，用DPBS洗两遍，得到人外周血单核细胞PBMC。
2CD4+CD8+T细胞富集及活化
重悬PBMC，调整密度为1×105/μl，按照50μl细胞悬液中加入CD4/CD8磁珠各10μl，通过磁极分离得到CD4+CD8+T细胞。
得到的CD4+CD8+T细胞，加入含有10％FBS的AIM-V完全培养基培养，用抗人CD3/CD28抗体(购自美天旎，10μl/ml)活化T细胞，IL-2浓度为200IU/ml。活化24小时后，换液，使用含有IL-2 200IU/ml的完全培养基继续培养。
3慢病毒感染
调节T细胞细胞密度为1×106/ml，按MOI＝10，用实施例6中得到的病毒液(2073病毒液、2077病毒液、2079病毒液或2082病毒液)感染活化48小时后的T细胞，24小时后换液，持续添加IL-2 200IU/ml，采用不同的病毒液，得到不同的可表达靶向人BCMA抗原的嵌合抗原受体的T细胞；分别命名为CAR-BCMA-2073-T，CAR-BCMA-2077-T，CAR-BCMA-2079-T，CAR-BCMA-2082-T。
4检测靶向人BCMA抗原的嵌合抗原受体(CAR-BCMA)表达情况
在培养过程中，取病毒感染后72小时的T细胞CAR-BCMA-2073-T，CAR-BCMA-2077-T，CAR-BCMA-2079-T，CAR-BCMA-2082-T)，离心、重悬并调节细胞密度为1×106/ml，50μl中加biotin-BCMA抗原，终浓度为0.2μg/ml，孵育30min后，DPBS清洗一次，重悬，染二抗APC-Streptavidin(购自BD)30min，清洗一次后DPBS重悬，流式检测CAR-BCMA的阳性率。
结果见图3，结果显示CAR-BCMA-2073-T，CAR-BCMA-2077-T，CAR-BCMA-2079-T，CAR-BCMA-2082-T均有表达靶向BCMA的嵌合抗原受体，其阳性率分别达到了45.1％、61.5％、22.3％、78.5％。
实施例8
体外共培养检测靶向人BCMA抗原的嵌合抗原受体的T细胞的肿瘤杀伤效果，靶细胞为NCI-H929。
取感染后72小时的T细胞(CAR-BCMA-2073-T，CAR-BCMA-2077-T，CAR-BCMA-2079-T或CAR-BCMA-2082-T)及BCMA+肿瘤细胞NCI-H929，计数，调节细胞密度为1×106/ml，按照效靶比5:1共培养，即：T细胞1×106，NCI-H929 2×105，对照细胞为未经病毒感染处理的CD4+CD8+T细胞，记为Ctrl-T细胞。分别在0H，24H，48H检测NCI-H929细胞在总细胞中的比例，使用抗体APC-conjugated Human BCMA/TNFRSF17 Antibody标记靶细胞，流式检测，结果见图4A和图4B；同时统计细胞杀伤效果，结果见图5。
结果显示，在CAR-BCMA-2073-T，CAR-BCMA-2077-T，CAR-BCMA-2079-T或CAR-BCMA-2082-T存在的情况下，随着时间的增加，靶细胞NCI-H929的比例明显减少；CAR-BCMA-2073-T：从15.4％减少至0.435％；CAR-BCMA-2079-T：从11.3％减少至6.63％；CAR-BCMA-2077-T：从19.6％减少至0.628％；CAR-BCMA-2082-T：从18.5％减少至0.185％。由此说明，4种嵌合抗原受体T细胞CAR-BCMA-2073-T，CAR-BCMA-2077-T，CAR-BCMA-2079-T和CAR-BCMA-2082-T均能很好的杀伤靶细胞NCI-H929。
实施例10
体外共培养检测CAR-BCMAT的肿瘤杀伤效果，靶细胞为K562-BCMA。
取感染后72小时的T细胞(CAR-BCMA-2073-T，CAR-BCMA-2077-T，CAR-BCMA-2079-T或CAR-BCMA-2082-T)及过表达BCMA的细胞K562-BCMA，计数，调节细胞密度为1×106/ml，按照效靶比7:1共培养，即：T细胞1×106，K562-BCMA 1.5×105，对照细胞为未经病毒液处理的CD4+CD8+T细胞，记为Ctrl-T细胞。分别在0H，24H，48H检测K562-BCMA细胞在总细胞中的比例，使用抗体APC-conjugated Human BCMA/TNFRSF17 Antibody标记靶细胞，结果见图6A和图6B，同时统计细胞杀伤效果，结果见图7。
结果显示，在CAR-BCMA-2073-T，CAR-BCMA-2077-T，CAR-BCMA-2079-T或CAR-BCMA-2082-T存在的情况下，随着时间的增加，靶细胞K562-BCMA的比例明显减少，在0-48h的时间段内，靶细胞K562-BCMA的比例降低幅度分别是：CAR-BCMA-2073-T：从8.69％减少至6.1％；CAR-BCMA-2079-T：从9.28％减少至8.69％；CAR-BCMA-2077-T：从8.95％减少至1.03％；CAR-BCMA-2082-T：从11.2％减少至0.676％；由此说明，4种嵌合抗原受体T细胞CAR-BCMA-2073-T，CAR-BCMA-2077-T，CAR-BCMA-2079-T和CAR-BCMA-2082-T均能很好的杀伤BCMAT呈阳性的靶细胞K562-BCMA。
实施例11
ELISA法检测细胞因子表达水平
方法：
样品准备：取感染后72小时的T细胞(CAR-BCMA-2073-T，CAR-BCMA-2077-T，CAR-BCMA-2079-T或CAR-BCMA-2082-T)及BCMA+肿瘤细胞NCI-H929，计数，调节细胞密度为1×106/ml，按照效靶比(E:T)1:1共培养，即T细胞1×106，NCI-H929 1×106，对照细胞为未经病毒液处理的CD4+CD8+T细胞，记为Ctrl-T细胞。在24H收集上清，-80℃保存备用。
检测：细胞因子INF-γ、TNF-α使用CBA方法检测，按照说明书进行。结果见图8。
从图中可以看出，4种嵌合抗原受体T细胞CAR-BCMA-2073-T，CAR-BCMA-2077-T，CAR-BCMA-2079-T和CAR-BCMA-2082-T的INF-γ和TNF-α含量均高于对照(Ctrl-T)。
实施例12
使用NSG小鼠，使用的肿瘤细胞是稳定表达萤火虫荧光素酶的BCMA阳性细胞系MM.1S(记为NCI-MM.1S-LUC)。治疗注射的效应细胞含有CAR-BCMA的T细胞(CAR-BCMA-2077-T或CAR-BCMA-2082-T)，对照组为未感染病毒的CD4+CD8+T细胞组。建模成功后3天尾静脉注射效应细胞5×106/只鼠，注射后每7天通过IVS活体成像系统拍照成像，显示肿瘤生长情况，称量小鼠的体重，同时观察小鼠的存活情况并记录。结果见图9。
从图9可以看出，接受CAR-BCMA-2077-T或CAR-BCMA-2082-T注射后的小鼠，在第3天和第7天其荧光面积显著减少，说明肿瘤细胞明显减少，表面，表达靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞CAR-BCMA-2077-T或CAR-BCMA-2082-T能够靶向BCMA，有效杀伤表达BCMA的肿瘤细胞，可实现治疗肿瘤目的。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海邦耀生物科技有限公司
<120> 靶向BCMA蛋白的抗体、嵌合抗原受体和药物
<130> PA18039243
<160> 84
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg cattatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
agaggcgcca gctcgtttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagt 357
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
agcaacagtg ctgcttggaa c 21
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
aggacatact acaggtccaa gtggtataat gattatgcat tatctgtgaa aagt 54
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
ggcgccagct cgtttgacta c 21
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Leu Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn
1 5
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Leu Ser Val
1 5 10 15
Lys Ser
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
Gly Ala Ser Ser Phe Asp Tyr
1 5
<210> 9
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaattgca agtccagcca gaatgtttta tacagctcca acaataggaa ctacttagct 120
tggtaccaac agaaacctgg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180
gagtccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatggttct 300
gttgtcactt tcggcggagg gaccaaggtg gaaatcaaa 339
<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
aagtccagcc agaatgtttt atacagctcc aacaatagga actacttagc t 51
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
tgggcatcta cccgggagtc c 21
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
cagcaatatt atggttctgt tgtcact 27
<210> 13
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Gly Ser Val Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Arg Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
Gln Gln Tyr Tyr Gly Ser Val Val Thr
1 5
<210> 17
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180
aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
aggttagcct acgaagtacg ctccacagac tggtacttcg atctctgggg ccgtggcacc 360
ctggtcaccg tctcgagt 378
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
agcaacagtg ctgcttggaa c 21
<210> 19
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
aggacatact acaggtccaa gtggtataat gattatgcag tatctgtgaa aagt 54
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
ttagcctacg aagtacgctc cacagactgg tacttcgatc tc 42
<210> 21
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ala Tyr Glu Val Arg Ser Thr Asp Trp Tyr
100 105 110
Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn
1 5
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val
1 5 10 15
Lys Ser
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
Leu Ala Tyr Glu Val Arg Ser Thr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 25
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
cagcctgtgc tgactcagcc accctcggtg tctgaagccc ccaggcagag ggtcaccatc 60
tcctgttctg gaagcagctc caacatcgga aataatgctg taaactggta ccagcagctc 120
ccaggaaagg ctcccaaact cctcatctat tatgatgatc tgctgccctc aggggtctct 180
gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccag 240
tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggttgggtg 300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330
<210> 26
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 26
tctggaagca gctccaacat cggaaataat gctgtaaac 39
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 27
tatgatgatc tgctgccctc a 21
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 28
gcagcatggg atgacagcct gaatggttgg gtg 33
<210> 29
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 29
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ala Pro Arg Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 30
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 31
Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser
1 5
<210> 32
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 32
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr
1 5 10 15
Lys Leu Thr Val Leu
20
<210> 33
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 33
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtaaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120
cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc cacgtggtat 180
aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga ataaccatta acccagacac atccaagaac 240
cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300
aggggaactg gaacccttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagt 357
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 34
agcaacagtg ctgcttggaa c 21
<210> 35
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 35
aggacatact acaggtccac gtggtataat gattatgcag tatctgtgaa aagt 54
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 36
aggggaactg gaacccttga ctac 24
<210> 37
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Gly Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 38
Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn
1 5
<210> 39
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 39
Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val
1 5 10 15
Lys Ser
<210> 40
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 40
Arg Gly Thr Gly Thr Leu Asp Tyr
1 5
<210> 41
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 41
cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatg 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataagt atgtctcctg gtaccaacaa 120
cacccaggca aagcccccca actcatgatt catgatgtcc gtgagcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcattta caaacaacag cacttttgtc 300
ttcggaactg ggaccaaagt caccgtccta 330
<210> 42
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 42
actggaacca gcagtgacgt tggtggttat aagtatgtct cc 42
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 43
gatgtccgtg agcggccctc a 21
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 44
agctcattta caaacaacag cacttttgtc 30
<210> 45
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 45
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Met Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu
35 40 45
Met Ile His Asp Val Arg Glu Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Thr Asn Asn
85 90 95
Ser Thr Phe Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 46
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Lys Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 47
Asp Val Arg Glu Arg Pro Ser
1 5
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 48
Ser Ser Phe Thr Asn Asn Ser Thr Phe Val
1 5 10
<210> 49
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 49
caggtacagc tgcagcagtc aggtccagca ttggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60
acctgtgtca tctccgggga ctctgtctct agcaacagtg cttcttggac ctggatcagg 120
cagtcccctt cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacgt accgtcgggc cgacaggtgg 180
tattatgatt atgcactctc gctgaatagt cgactaacca tcaatccaga cacatccaaa 240
aaccatttcg ccctgcacct gacctctgtg actcccgagg acacggctgt ttattactgt 300
tcaagagaat attggggagg ttcttttgat gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360
tcgagt 366
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 50
agcaacagtg cttcttggac c 21
<210> 51
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 51
aggacgtacc gtcgggccga caggtggtat tatgattatg cactctcgct gaatagt 57
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 52
gaatattggg gaggttcttt tgatgtc 27
<210> 53
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 53
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ser Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Arg Ala Asp Arg Trp Tyr Tyr Asp Tyr
50 55 60
Ala Leu Ser Leu Asn Ser Arg Leu Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys
65 70 75 80
Asn His Phe Ala Leu His Leu Thr Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Glu Tyr Trp Gly Gly Ser Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 54
Ser Asn Ser Ala Ser Trp Thr
1 5
<210> 55
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 55
Arg Thr Tyr Arg Arg Ala Asp Arg Trp Tyr Tyr Asp Tyr Ala Leu Ser
1 5 10 15
Leu Asn Ser
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 56
Glu Tyr Trp Gly Gly Ser Phe Asp Val
1 5
<210> 57
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 57
cagcctgtgc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtcgc ctggacagtc gatcaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttatgact atgtctcctg gtaccaacaa 120
cacccaggca aagcccccaa actcatgctt tatgaggtca ataatcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgagggtgc ttattactgc agctcatata caagcagcaa cactcatgtg 300
gtattcggcg gaggcaccca gctgaccgtc ctc 333
<210> 58
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 58
actggaacca gcagtgacgt tggtggttat gactatgtct cc 42
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 59
gaggtcaata atcggccctc a 21
<210> 60
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 60
agctcatata caagcagcaa cactcatgtg gta 33
<210> 61
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 61
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asp Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Leu Tyr Glu Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Gly Ala Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser
85 90 95
Asn Thr His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 62
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 62
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asp Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 63
Glu Val Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 64
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Asn Thr His Val Val
1 5 10
<210> 65
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 65
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccagaca tcgtgatgac ccagtctcca gactccctgg ctgtgtctct gggcgagagg 120
gccaccatca attgcaagtc cagccagaat gttttataca gctccaacaa taggaactac 180
ttagcttggt accaacagaa acctggacag cctcctaagc tgctcattta ctgggcatct 240
acccgggagt ccggggtccc tgaccgattc agtggcagcg ggtctgggac agatttcact 300
ctcaccatca gcagcctgca ggctgaagat gtggcagttt attactgtca gcaatattat 360
ggttctgttg tcactttcgg cggagggacc aaggtggaaa tcaaaggctc cacctctgga 420
tccggcaagc ccggatctgg cgagggatcc accaagggcc aggtacagct gcagcagtca 480
ggtccaggac tggtgaagcc ctcgcagacc ctctcactca cctgtgccat ctccggggac 540
agtgtctcta gcaacagtgc tgcttggaac tggatcaggc agtccccatc gagaggcctt 600
gagtggctgg gaaggacata ctacaggtcc aagtggtata atgattatgc attatctgtg 660
aaaagtcgaa taaccatcaa cccagacaca tccaagaacc agttctccct gcagctgaac 720
tctgtgactc ccgaggacac ggctgtgtat tactgtgcaa gaggcgccag ctcgtttgac 780
tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcgagtacca cgacgccagc gccgcgacca 840
ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcacag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 900
ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc 960
tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 1020
tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 1080
caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 1140
tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacaa gcagggccag 1200
aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 1260
agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1320
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1380
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1440
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 1485
<210> 66
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 66
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 67
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 67
ggctccacct ctggatccgg caagcccgga tctggcgagg gatccaccaa gggc 54
<210> 68
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 68
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc acagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 69
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 69
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 70
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 70
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 71
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 71
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 72
<211> 495
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 72
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser
20 25 30
Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
35 40 45
Gln Asn Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr
50 55 60
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser
65 70 75 80
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
85 90 95
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Ser Val Val Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro
130 135 140
Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser
145 150 155 160
Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala
165 170 175
Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile
180 185 190
Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr
195 200 205
Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Leu Ser Val Lys Ser Arg Ile
210 215 220
Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn
225 230 235 240
Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala
245 250 255
Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
275 280 285
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
290 295 300
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
305 310 315 320
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
325 330 335
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
340 345 350
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
355 360 365
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
370 375 380
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln
385 390 395 400
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
405 410 415
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
420 425 430
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
435 440 445
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
450 455 460
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
465 470 475 480
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490 495
<210> 73
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 73
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 74
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 74
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 75
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 75
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 76
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 76
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 77
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 77
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 78
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 78
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 79
<211> 1497
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 79
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccacagc ctgtgctgac tcagccaccc tcggtgtctg aagcccccag gcagagggtc 120
accatctcct gttctggaag cagctccaac atcggaaata atgctgtaaa ctggtaccag 180
cagctcccag gaaaggctcc caaactcctc atctattatg atgatctgct gccctcaggg 240
gtctctgacc gattctctgg ctccaagtct ggcacctcag cctccctggc catcagtggg 300
ctccagtctg aggatgaggc tgattattac tgtgcagcat gggatgacag cctgaatggt 360
tgggtgttcg gcggagggac caagctgacc gtcctaggct ccacctctgg atccggcaag 420
cccggatctg gcgagggatc caccaagggc caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga 480
ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct 540
agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg 600
ggaaggacat actacaggtc caagtggtat aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga 660
ataaccatca acccagacac atccaagaac cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact 720
cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca aggttagcct acgaagtacg ctccacagac 780
tggtacttcg atctctgggg ccgtggcacc ctggtcaccg tctcgagtac cacgacgcca 840
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcac agcccctgtc cctgcgccca 900
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 960
gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 1020
atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 1080
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 1140
gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 1200
aagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 1260
gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 1320
cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 1380
attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1440
agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1497
<210> 80
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 80
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccacagt ctgccctgac tcagcctgcc tccgtgtctg ggtctcctgg acagtcgatc 120
accatgtcct gcactggaac cagcagtgac gttggtggtt ataagtatgt ctcctggtac 180
caacaacacc caggcaaagc cccccaactc atgattcatg atgtccgtga gcggccctca 240
ggggtttcta atcgcttctc tggctccaag tctggcaaca cggcctccct gaccatctct 300
gggctccagg ctgaggacga ggctgattat tactgcagct catttacaaa caacagcact 360
tttgtcttcg gaactgggac caaagtcacc gtcctaggct ccacctctgg atccggcaag 420
cccggatctg gcgagggatc caccaagggc caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga 480
ctggtaaagc cctcgcagac cctctcactc acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct 540
agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg 600
ggaaggacat actacaggtc cacgtggtat aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga 660
ataaccatta acccagacac atccaagaac cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact 720
cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca aggggaactg gaacccttga ctactggggc 780
cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagtacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 840
gcgcccacca tcgcgtcaca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 900
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 960
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 1020
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 1080
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 1140
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 1200
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1260
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1320
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1380
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1440
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 1476
<210> 81
<211> 1476
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 81
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccacagt ctgccctgac tcagcctgcc tccgtgtctg ggtctcctgg acagtcgatc 120
accatgtcct gcactggaac cagcagtgac gttggtggtt ataagtatgt ctcctggtac 180
caacaacacc caggcaaagc cccccaactc atgattcatg atgtccgtga gcggccctca 240
ggggtttcta atcgcttctc tggctccaag tctggcaaca cggcctccct gaccatctct 300
gggctccagg ctgaggacga ggctgattat tactgcagct catttacaaa caacagcact 360
tttgtcttcg gaactgggac caaagtcacc gtcctaggct ccacctctgg atccggcaag 420
cccggatctg gcgagggatc caccaagggc caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga 480
ctggtaaagc cctcgcagac cctctcactc acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct 540
agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg 600
ggaaggacat actacaggtc cacgtggtat aatgattatg cagtatctgt gaaaagtcga 660
ataaccatta acccagacac atccaagaac cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact 720
cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca aggggaactg gaacccttga ctactggggc 780
cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagtacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 840
gcgcccacca tcgcgtcaca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 900
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 960
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 1020
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 1080
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 1140
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 1200
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1260
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1320
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1380
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1440
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 1476
<210> 82
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 82
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val
20 25 30
Ser Glu Ala Pro Arg Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser
35 40 45
Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly
65 70 75 80
Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu
85 90 95
Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala
100 105 110
Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Thr Val Leu Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
130 135 140
Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly
145 150 155 160
Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly
165 170 175
Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser
180 185 190
Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys
195 200 205
Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn
210 215 220
Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr
225 230 235 240
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ala Tyr Glu Val
245 250 255
Arg Ser Thr Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val
260 265 270
Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
275 280 285
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
290 295 300
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
305 310 315 320
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
325 330 335
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
340 345 350
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
355 360 365
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
370 375 380
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
385 390 395 400
Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
405 410 415
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
420 425 430
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
435 440 445
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
450 455 460
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
465 470 475 480
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
485 490 495
Pro Pro Arg
<210> 83
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 83
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val
20 25 30
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Met Ser Cys Thr Gly Thr Ser
35 40 45
Ser Asp Val Gly Gly Tyr Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro
50 55 60
Gly Lys Ala Pro Gln Leu Met Ile His Asp Val Arg Glu Arg Pro Ser
65 70 75 80
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ser Ser Phe Thr Asn Asn Ser Thr Phe Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys
115 120 125
Val Thr Val Leu Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
130 135 140
Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly
145 150 155 160
Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly
165 170 175
Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser
180 185 190
Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr
195 200 205
Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn
210 215 220
Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr
225 230 235 240
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Gly Thr Leu
245 250 255
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
325 330 335
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
340 345 350
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
355 360 365
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
370 375 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405 410 415
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
420 425 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
435 440 445
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
450 455 460
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
465 470 475 480
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 84
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 84
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val
20 25 30
Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Met Ser Cys Thr Gly Thr Ser
35 40 45
Ser Asp Val Gly Gly Tyr Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro
50 55 60
Gly Lys Ala Pro Gln Leu Met Ile His Asp Val Arg Glu Arg Pro Ser
65 70 75 80
Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ser Ser Phe Thr Asn Asn Ser Thr Phe Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys
115 120 125
Val Thr Val Leu Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
130 135 140
Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly
145 150 155 160
Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly
165 170 175
Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser
180 185 190
Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr
195 200 205
Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn
210 215 220
Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr
225 230 235 240
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Gly Thr Leu
245 250 255
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr
260 265 270
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
275 280 285
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
290 295 300
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
305 310 315 320
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
325 330 335
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
340 345 350
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
355 360 365
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
370 375 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405 410 415
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
420 425 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
435 440 445
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
450 455 460
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
465 470 475 480
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490

Claims (14)

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:54所示的CDR1，
SEQ ID NO:55所示的CDR2，和
SEQ ID NO:56所示的CDR3；
优选的，所述重链可变区具有SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。
3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:62所示的CDR1，
SEQ ID NO:63所示的CDR2，和
SEQ ID NO:64所示的CDR3；
优选的，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。
5.一种靶向BCMA蛋白的抗体，其特征在于，所述抗体具有：
(1)如权利要求1所述的重链可变区；和
(2)如权利要求3所述的轻链可变区；
优选的，所述抗体具有：如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链。
6.一种靶向BCMA蛋白的嵌合抗原受体，其特征在于，其含有权利要求1所述的重链可变区和权利要求3所述的轻链可变区。
7.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1所述的重链可变区、权利要求2所述的重链、权利要求3所述的轻链可变区、权利要求4所述的轻链、或权利要求5所述的抗体，或者其编码权利要求6所述的嵌合抗原受体。
8.一种载体，其特征在于，其含有权利要求7所述的核酸分子。
9.一种重组细胞，其特征在于，其含有权利要求8所述的载体，或基因组中整合有权利要求7所述的核酸分子。
10.一种靶向BCMA蛋白的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，其表达有权利要求6所述的嵌合抗原受体。
11.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，其含有权利要求1所述的重链可变区、权利要求2所述的重链、权利要求3所述的轻链可变区、权利要求4所述的轻链、权利要求5所述的抗体、权利要求6所述的嵌合抗原受体、权利要求9所述的重组细胞或权利要求10所述的嵌合抗原受体T细胞。
12.一种体外检测样品中BCMA蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)在体外，将所述样品与如权利要求5所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在BCMA蛋白。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法是非诊断和非治疗的。
14.一种诊断试剂盒，其特征在于，包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有权利要求5所述的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有权利要求5所述的抗体的二抗。
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GR01 Patent grant
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Denomination of invention: Antibodies, chimeric antigen receptors, and drugs targeting BCMA protein

Granted publication date: 20220415

Pledgee: Bank of Nanjing Limited by Share Ltd. Shanghai branch

Pledgor: BIORAY LABORATORIES Inc.

Registration number: Y2024310001015