CN108341872A - 靶向bcma的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及BCMA的特异性抗体以及靶向BCMA的免疫效应细胞。本发明提供的BCMA特异性抗体对于BCMA具备优异的结合性能，且在制备成嵌合抗原受体修饰的T细胞之后，能够良好地呈现出对表达BCMA的细胞的杀伤作用。本发明还提供了利用所述抗体制备的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用。

Description

靶向BCMA的抗体及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗或诊断领域；更具体地，本发明涉及靶向BCMA的抗 体及其应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)是常见的恶性血液病，占所有癌症死亡例的2％。MM是一 种异质性疾病并且多数是由t(11；14)、t(4；14)、t(8；14)、del(13)、del(17)(除其他 外)的染色体易位引起的(Drach等,(1998)Blood 92(3):802-809；Gertz等,(2005) Blood 106(8):2837-2840；Facon等.,(2001)Blood 97(6):1566-1571)。多发性骨髓瘤 (MM)的主要病状是骨髓中的浆细胞无限度的扩增和富集，进而导致骨坏死。MM受 累患者可能经历因骨髓浸润、骨质破坏、肾衰竭、免疫缺陷以及癌症诊断的心理负 担而经历多种与疾病相关的症状。目前主要的治疗方案为化疗和干细胞移植，化疗 药物主要是类固醇、沙利度胺、来那度胺、硼替佐米或多种细胞毒素试剂的组合， 对于较年轻的患者可采用高剂量化疗理念配合自体干细胞移植。
BCMA(B-cell maturation antigen)是B细胞成熟抗原，由185个氨基酸残基组成的 III型跨膜蛋白，属TNF受体超家族，其配体属于TNF超家族，如增殖诱导配体 (APRIL)、B淋巴细胞刺激因子(BAFF)，BCMA与其配体结合后，可激活B细胞的增 殖和存活。BCMA特异地高表达于浆细胞和多发性骨髓瘤细胞表面，而在造血干细 胞和其他正常组织细胞中均不表达，因此BCMA可以作为MM的靶向性治疗的理想 靶点。
有鉴于此，本领域急需针对BCMA的特异性抗体以及靶向BCMA的免疫效应细胞。
发明内容
本发明目的在于提供针对BCMA的特异性抗体以及靶向BCMA的免疫效应细 胞。
在第一方面，本发明提供一种靶向BCMA的抗体，所述抗体选自下组：
(1)抗体，其包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1、60或62所 示的HCDR1，和/或包含SEQ ID NO:2、61或63所示的HCDR2，和/或包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中任一所示的HCDR3；
(2)抗体，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:6所示的 LCDR1，和/或包含SEQ ID NO:7所示的LCDR2，和/或包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中任一所示的LCDR3；
(3)抗体，包含(1)所述抗体的重链可变区及(2)所述抗体的轻链可变区；
(4)抗体，(1)～(3)中任一项所述的抗体的变体，且具备与(1)～(3)中任一项所述的抗体相同或相似的活性。
在具体的实施方式中，所述的抗体选自：
(1)抗体，其包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、 SEQ IDNO:3所示的HCDR3以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的 LCDR2、SEQ ID NO:8所示的LCDR3；
(2)抗体，其包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、 SEQ IDNO:4所示的HCDR3以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的 LCDR2、SEQ ID NO:9所示的LCDR3；
(3)抗体，SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:5所示的HCDR3以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2、 SEQ ID NO:10所示的LCDR3；
(4)抗体，其包含SEQ ID NO:60所示的HCDR1、SEQ ID NO:61所示的HCDR2、 SEQ IDNO:5所示的HCDR3以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的 LCDR2、SEQ ID NO:10所示的LCDR3；
(5)抗体，其包含SEQ ID NO:62所示的HCDR1、SEQ ID NO:63所示的HCDR2、 SEQ IDNO:5所示的HCDR3以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的 LCDR2、SEQ ID NO:10所示的LCDR3。
(6)抗体，(1)～(5)中任一项所述的抗体的变体，且具备与(1)～(5)中任一项所述的抗体相同或相似的活性。。
在具体的实施方式中，所述的抗体选自：
(1)抗体，所述的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列、 SEQID NO：17所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列、SEQ ID NO： 56所示的氨基酸序列、或者SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列；
(2)抗体，所述的抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列、 SEQID NO：15所示的氨基酸序列、或SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；
(3)抗体，包含(1)所述抗体的重链可变区及(2)所述抗体的轻链可变区；
(4)抗体，(1)～(3)中任一项所述的抗体的变体，且具备与(1)～(3)中任一项所述的抗体相同或相似的活性。
在具体的实施方式中，所述的抗体选自：
(1)抗体，所述的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列并 且所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
(2)抗体，所述的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列并 且所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；
(3)抗体，所述的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列并 且所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；
(4)抗体，所述的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列并 且所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；
(5)抗体，所述的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列并 且所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；
(6)抗体，(1)～(5)中任一项所述的抗体的变体，且具备与(1)～(5)中任一项所述的抗体相同或相似的活性。
在第二方面，本发明提供一种抗体，其与本发明第一方面所述的抗体识别相同 的抗原决定部位。
在第三方面，本发明提供编码本发明第一或第二方面所述的抗体的核酸。
在第四方面，本发明提供一种表达载体，其包含本发明第三方面所述的核酸。
在第五方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明第四方面所述的表达载 体或基因组中整合有本发明第三方面所述的核酸。
在第六方面，本发明提供本发明第一或第二方面所述的抗体的用途，用于制备 特异性靶向BCMA的肿瘤细胞的靶向性药物，抗体药物偶联物或多功能抗体；或
用于制备诊断肿瘤的试剂，该肿瘤表达BCMA；或
用于制备嵌合抗原受体修饰的免疫细胞；较佳地，所述免疫细胞包括：T淋巴 细胞、NK细胞或者NKT淋巴细胞。
在第七方面，本发明提供一种多功能免疫辍合物，所述的多功能免疫辍合物包括：
本发明第一或第二方面所述的抗体；以及
与之连接的功能性分子；所述的功能性分子选自：靶向肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物。
在具体的实施方式中，所述的抑制肿瘤的分子为抗肿瘤的细胞因子或抗肿瘤的毒素，较佳的，所述的细胞因子包括：IL-12、IL-15、I型干扰素、TNF-alpha。
在具体的实施方式中，所述的靶向免疫细胞的表面标志物的分子是结合免疫细胞表面标志物的抗体或配体；较佳地，所述的免疫细胞表面标志物包括：CD3，CD16， CD28，更佳的，所述的结合免疫细胞表面标志物的抗体是抗CD3抗体。
在具体的实施方式中，所述的靶向免疫细胞的表面标志物的分子是结合T细胞 表面标志物的抗体。
在第八方面，本发明提供编码本发明第七方面所述的多功能免疫辍合物的核 酸。
在第九方面，本发明提供本发明第七方面所述的多功能免疫辍合物的用途，用 于制备抗肿瘤药物，或
用于制备诊断肿瘤的试剂，该肿瘤表达BCMA；或
用于制备嵌合抗原受体修饰的免疫细胞；较佳地，所述免疫细胞包括：T淋巴 细胞、NK细胞或者NKT淋巴细胞。
在第十方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，包含胞外域、跨膜域及胞内信号 域，所述胞外域包含本发明第一或第二方面所述的抗体，该抗体优选单链抗体或结 构域抗体。
在具体的实施方式中，所述胞内信号域包含一个或多个共刺激信号域和/或初级信号域。
在具体的实施方式中，所述嵌合抗原受体还包括铰链域。
在具体的实施方式中，所述的跨膜域选自TCR的alpha、beta、zeta链，CD3ε， CD3ζ，CD4，CD5,CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45， CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD152，CD154，和PD1的跨膜区；和/或
所述共刺激信号域选自CARD11，CD2，CD7，CD27，CD28，CD30，CD40， CD54，CD83，OX40，CD137，CD134，CD150，CD152，CD223，CD270，PD-L2， PD-L1，CD278，DAP10，LAT，NKD2CSLP76，TRIM，FcεRIγ，MyD88，和41BBL 的胞内信号区；和/或
所述初级信号域选自TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε，CD5，CD22， CD79a，CD79b，CD278(也称作“ICOS”)和CD66d，和CD3ζ，
更佳的，
所述的跨膜域选自CD8α，CD4，CD45，PD1，CD154和CD28的跨膜域；和/ 或
所述共刺激信号域选自CD137，CD134，CD28和OX40；和/或
所述初级信号域选自CD3ζ，
最优的，所述的跨膜域选自CD8α或CD28，所述共刺激信号域选自CD137或 CD28的胞内信号域，所述初级信号域选自CD3ζ。
在具体的实施方式中，所述的嵌合抗原受体包括如下的顺序连接的抗体，跨膜 区和胞内信号区：
本发明第一或第二方面所述的抗体、CD8的跨膜区和CD3ζ；
本发明第一或第二方面所述的抗体、CD8的跨膜区、CD137的胞内信号区和 CD3ζ；
本发明第一或第二方面所述的抗体、CD28的跨膜区、CD28的胞内信号区和 CD3ζ；或
本发明第一或第二方面所述的抗体、CD28的跨膜区、CD28的胞内信号区、 CD137和CD3ζ。
在第十一方面，本发明提供编码本发明第十方面所述的嵌合抗原受体的核酸。
在第十二方面，本发明提供一种表达载体，其包含本发明第十一方面所述的核酸。
在第十三方面，本发明提供一种病毒，所述的病毒包含本发明第十二方面所述 的载体。
在优选的实施方式中，所述病毒是慢病毒。
在第十四方面，本发明提供本发明第十方面所述的嵌合抗原受体、或本发明第 十一方面所述的核酸、或本发明第十二方面所述的表达载体、或本发明第十三方面 所述的病毒的用途，用于制备靶向表达BCMA的肿瘤细胞的基因修饰的免疫细胞，
在优选的实施方式中，所述表达BCMA的肿瘤是多发性骨髓瘤。
在第十五方面，本发明提供一种基因修饰的免疫细胞，其转导有本发明第十一 方面所述的核酸，或本发明第十二方面所述的表达载体或本发明第十三方面所述的 病毒；或其表达有本发明第十方面所述的嵌合抗原受体，
所述的免疫细胞优选自T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞。
在具体的实施方式中，所述基因修饰的免疫细胞还表达有除本发明第十方面所述的嵌合抗原受体之外的其他序列，所述其他序列包括细胞因子、或另一种嵌合抗 原受体、或趋化因子受体、或降低PD-1表达的siRNA、或阻断PD-L1的蛋白、或TCR、 或安全开关；
较佳地，所述的细胞因子包括IL-12、IL-15、IL-21、或I型干扰素；
较佳地，所述趋化因子受体包括CCR2、CCR5、CXCR2、或CXCR4；
较佳地，所述安全开关包括iCaspase-9、Truancated EGFR或RQR8。
在第十六方面，本发明提供本发明第十五方面所述的基因修饰的免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备抑制肿瘤的药物，所述的肿瘤是表达BCMA的肿瘤，
在优选的实施方式中，所述表达BCMA的肿瘤是多发性骨髓瘤。
在第十七方面，本发明提供一种药物组合物，其包括：
本发明第一或第二方面所述的抗体或编码该抗体的核酸；或
本发明第七方面所述的免疫辍合物或编码该辍合物的核酸；或
本发明第十方面所述的嵌合抗原受体或编码该嵌合抗原受体的核酸；或
本发明第十五方面所述的基因修饰的免疫细胞。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中 具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限 于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了BCMA_huFc、BCMA_muFc的SDS电泳图(还原条件)。
图2-A，图2-B显示了FACs检测的稳转细胞系K562-BCMA中BCMA的表达情况。
图3显示了抗体7A12、7G2、23F10的ELISA测定结果。
图4显示了FACs检测的抗体7A12、7G2、23F10与K562-BCMA以及K562的结合 情况。
图5显示了SDS PAGE分析纯化的抗BCMA scFv_Fc抗体(还原条件)。
图6显示了FACs测定梯度稀释的纯化scFv_Fc与K562-BCMA的结合情况。
图7显示了Biacore测定的抗体7A12，7G2，23F10与BCMA的亲和力。
图8显示了FACs测定的抗体7A12，7G2，23F10与RPMI8226细胞系的结合情况。
图9显示了ELISA检测的抗体和APRIL竞争性结合BCMA情况。
图10显示了FACS检测的BCMA-CAR T病毒感染T淋巴细胞的阳性率。
图11A显示了BCMA-CAR T对BCMA表达阳性以及阴性细胞的体外毒性实验 结果，图11B显示了BCMA-CART的小鼠体内实验结果。
图12比较了克隆25C2、25D2及23F10的重链氨基酸序列。
图13A显示了抗体25C2聚集情况，图13B显示了抗体25D2的聚集情况，图13C 显示了抗体23F10和7A12的聚集情况。
图14A显示了25C2、25D2与K562-BCMA以及K562细胞的结合情况，图14B显 示了ELISA测定抗体23F10，25C2，25D2的特异性。图15显示了25C2-BBZ、 25D2-BBZ、7A12-BBZ、C11D5.3-BBZ以及sPD-1-7A12-BBZ的细胞杀伤的实验结果。
图16显示了25C2-BBZ、25D2-BBZ、C11D5.3-BBZ、7A12-BBZ的皮下移植瘤 结果。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现特异性结合BCMA的抗体，这 些抗体可以应用于制备各种靶向性抗肿瘤药物以及诊断肿瘤的药物。在此基础上完 成了本发明。
本文采用的科技术语具有与本领域技术人员常规理解的相同或相似的含义。为便于理解本发明，一些术语定义如下。
本文中的术语“BCMA”指B cell maturation antigen，其由184个氨基酸残基组成的III型跨膜蛋白(NCBI Reference Sequence:NP_001183.2)，氨基酸序列如SEQ ID No:37所示。在一具体实施例中，BCMA是指人BCMA。
本文中的术语“APRIL”指A proliferation-inducing ligand，其是增殖诱导配体， 由184个氨基酸残基组成(NCBI Reference Sequence:NP_003799.1)，属于TNF超家族
本文中的术语“抗体”指免疫系统的抗原结合蛋白。如本文提到的术语“抗体” 包括具有抗原结合区域的完整的全长抗体及其中“抗原结合部分”或“抗原结合区 域”保留的其任何片段、或其单链例如单链可变片段(scFv)。天然抗体指包含通过 二硫键互联的至少两条重(H)链和两条轻(L)链或其抗原结合片段的糖蛋白。术语 “抗体”还包括抗体(特别是本文所述抗体)的所有重组形式，例如在原核细胞中表 达的抗体，未糖基化的抗体以及与抗原结合的抗体片段和下文所诉的衍生物。每条 重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(本 文缩写为VL)和轻链恒定区组成。VH和VL可进一步细分为称为互补性决定区(CDR) 的高变区，他们散布在称为构架区(FR)的更保守区域中。每条VH和VL由三个CDR 和四个FR组成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、 FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括 免疫系统的多种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。
抗体片断包括但不限于：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段，包 括Fab’和Fab’-SH，(ii)VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iii)由单个抗体的VL和VH 结构域组成的Fv片段；(iv)由单个可变区组成的dAb片段(Ward等，1989，Nature 341：544-546)；(v)F(ab’)2片段，包含2个连接的Fab片段的二价片段；(vi)单链Fv分 子抗原结合位点(Bird等，1988，Science 242：423-426；Huston等，1988，Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A 85:5879-5883)；(vii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；(viii) “二体”或“三体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(Tomlinson等，2000， Methods Enzymol.326:461-479；WO94/13804；Holliger等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 90:6444-6448)；和(ix)与相同或不同抗体遗传融合的scFv(Coloma&Morrison, 1997,Nature Biotechnology 15,159-163)。
本文中的术语“Fc”或“Fc区”包括包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域以外 的抗体恒定区的多肽。因而，Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结 构域，和IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，和这些结构域N端的柔性 铰链。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc包括免疫球蛋白结构域Cγ2和C γ3和在Cγ1和Cγ2之间的铰链。虽然Fc区的边界可以改变，但人IgG重链Fc区通常 定义为在其羧基端包含残基C226或P230，其中编号是根据Kabat的EU索引。对于人 IgG1，Fc在本文定义为包含残基P232至其羧基端，其中编号是根据Kabat中的EU索 引。Fc可以指分离的该区域，或者位于Fc多肽，例如抗体，环境中的该区域。上述“铰 链”包括包含在抗体的第一和第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。结构上， IgG CH1结构域中止于EU220位，IgG CH2结构域始于残基EU237位。因而，对于IgG， 本文中抗体铰链定义为包括221(IgG1的D221)至231(IgG1的A231)位，其中编号是根 据Kabat的EU索引。
本文中使用的术语“亲本抗体”或“亲本免疫球蛋白”包括未修饰的抗体，所 述抗体之后经修饰产生变体。所述亲本抗体可以使天然存在的抗体，或者天然存在 的抗体的变体或改造版本。亲本抗体可以指抗体本身，包含所述亲本抗体的组合物， 或其编码氨基酸序列。本文中使用的术语“亲本抗体”或“亲本免疫球蛋白”包括 之后经修饰产生人源化抗体的鼠抗体或嵌合抗体。
本文中使用的术语“变体抗体”或“抗体变体”包括由于相比亲本的至少一个 氨基酸修饰，而不同于亲本抗体序列的抗体序列。本文中的变体抗体序列优选的具 有与亲本抗体序列至少约80％，最优选至少约90％，更优选至少约95％的氨基酸序列 同一性。抗体变体可以指抗体本身，包含所述亲本抗体的组合物，或编码其地氨基 酸序列。
本文中使用的术语“变体”包括由于相比亲本的至少一个氨基酸修饰，而不同 于亲本抗体序列的抗体序列。在具体的实施方式中，本文中的变体抗体序列具有与 亲本抗体序列至少约80％、优选至少约90％、更优选至少约95％、更优选至少约97％、 更优选至少约98％、最优选至少约99％的氨基酸序列同一性。抗体变体可以指抗体 本身，包含所述亲本抗体的组合物，或编码其地氨基酸序列。术语“氨基酸修饰” 包括氨基酸取代、添加和/或缺失，“氨基酸取代”意指用另一种氨基酸替换亲本多 肽序列中特定位置上的氨基酸。例如，取代R94K指94位的精氨酸被赖氨酸替换，本 文中使用的“氨基酸插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置添加氨基酸。文中使 用的“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲本多肽序列中特定位置上的氨基酸。
本文中使用的术语“保守修饰”或“保守序列修饰”意指不显着影响或改变含 有所述氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、 插入和缺失。可通过本领域已知的标准技术将修饰导入本发明的抗体中，例如定点 诱变和PCR介导的诱变。保守的氨基酸取代是用具有相似侧链的氨基酸残基替换氨 基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包 括含碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨 酸、谷氨酸)、不带电的急性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪 氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨 酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨 酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因而，可以用其他 相同侧链家族的氨基酸残基替换本发明抗体的CDR区中或框架区中的一个或多个氨基酸残基，并可以测试所改变的抗体(变体抗体)保留的功能。
本发明中讨论的所有免疫球蛋白重链恒定区位置，都根据Kabat的EU索引编号(Kabat等，1991，sequences of proteins of immunological interest，第5版，UnitedStates Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda，通过引用全文整合)。 “Kabat的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号，如Edelman等人，1969，Biochemistry 63:78-85所述。
本文中使用的术语“抗原决定部位”又称抗原表位，可以由BCMA蛋白序列的 连续序列组成，也可以由BCMA蛋白序列不连续的三维结构组成。
本文中使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”指：包含能够结合抗原的胞外域、 跨膜域和使胞质信号传到结构域的多肽(即胞内信号域)，胞内信号域指经由确定的 信号传导途径通过产生第二信使而将信息传递到细胞内以调节细胞活性的蛋白质、 或通过相应于此类信使而作为效应子发挥作用的蛋白质，包含初级信号域，还可以 包括源自下文定义的刺激分子的功能信号传导结构域(即共刺激信号域)。胞内信号 域产生可以促进CAR的细胞(例如CART细胞)的免疫效应子功能的信号，免疫效应 子功能的例子，例如在CART细胞中，包括细胞裂解活性和辅助活性，包括细胞因 子分泌。
术语“初级信号域”以刺激性方式调节TCR复合物的初始活化。一方面，初级信 号域由例如TCR/CD3复合物与加载了肽的MHC分子的结合而引发，由此介导T细胞 反应(包括但不限于，增殖、活化、分化等)。以刺激性方式起作用的初级信号域可 以包含免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号传导基序。在本发明中尤其有用的包 含ITAM的初级信号域的例子包括但不限于，源自TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、 CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b，CD278(也称作“ICOS”)和CD66d的序列，在 特例的本发明CAR中，在任何一个或多个本发明CAR中胞内信号传导结构域包含胞 内信号传导序列，例如CD3ξ的初级信号域。
术语“共刺激信号域”指“共刺激分子”，为T细胞上的关连结合性配偶体，其特异性结合共刺激配体，由此介导T细胞的共刺激反应，例如，但不限于，增殖。共刺 激分子是有效免疫反应所需的、非抗原受体的细胞表面分子或其配体。共刺激分子 包括但不限于，MHCI类分子、BTLA和Toll配体受体、以及OX40、CD2、CD27、 CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。
在本发明中，一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述蛋白包含胞外抗原识别结 构域、跨膜结构域、和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域含有源自刺 激分子的功能信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述蛋白包含胞 外抗原识别结构域、跨膜结构域、和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构 域含有源自共刺激分子的功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导 结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨 膜结构域和胞内传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含源自一个或多个共刺激 分子的至少两个功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。 一方面，CAR在CAR融合蛋白的氨基酸(ND端)包含可选的前导序列。一方面，CAR 在胞外抗原识别结构域的N端还包含前导序列，其中前导序列任选地在CAR的细胞 加工和定位至细胞膜的过程中从抗原识别结构域(例如scFv)切下。
本文中术语“CD3ξ”定义为GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质、或来自非 人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。“CD3ξ结构域”定义为来自 ξ链的胞质结构域的氨基酸残基，其足以功能性地传递T细胞活化所需的初始信号。 一方面，ξ的胞质结构域包含GenBan登录号BAG36664.1的残基52至164、其功能性直 向同源物—来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。
本文中术语“4-1BB”指TNFR超家族的成员，其具有GenBank Acc.No. AAA62478.2的氨基酸序列、或来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等 价残基；“4-1BB共刺激结构域”定义为GenBank ACC.No.AAA62478.2的氨基酸序列 214-255，或来自非分类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。一方面， “4-1BB共刺激结构域”是SEQ ID NO：35中提供的序列、或来自非人物种例如小鼠、 啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。
本文中的术语“干扰素”是指全长干扰素，或者基本保持全长野生型干扰素的生物活性(例如保持全长至少80％、优选至少90％、更优选至少95％、98％或99％)的干 扰素片段(截断的干扰素)或干扰素突变体。干扰素包括I型干扰素(例如，干扰素α 和干扰素β)和II型干扰素(例如，干扰素γ)。
本发明的抗体或其变体可以被应用于制备各种靶向性抗肿瘤药物以及诊断肿 瘤的药物，特别是应用于制备靶向BCMA的免疫效应细胞。
抗BCMA的抗体
在本公开中，描述了具有基于scFv的抗原结合区域的抗原结合蛋白，包括抗体。其中使用重组BCMA，从人scFv噬菌体展示文库选择scFv。这些分子展示精细的特 异性。例如，该抗体仅识别稳定表达BCMA的K562细胞，不识别K562细胞。
在一些实施方案中，本发明包括具有scFv序列的抗体，所述scFv序列与一个或 多个重链恒定区域融合以形成具有人免疫球蛋白Fc区的抗体以产生双价蛋白，从而 增加抗体的总体亲和力和稳定性。此外，Fc部分允许将其他分子(包括但不限于荧光 染料、细胞毒素、放射性同位素等)与例如用于抗原定量研究中的抗体直接缀合，以 便固定抗体用于亲和力测量、用于定向递送治疗药、使用免疫效应细胞测试Fc介导 的细胞毒性和许多其它应用。
本文提供的结果突出本发明抗体在靶向BCMA时的特异性、灵敏性和效用。
本发明的分子基于使用噬菌体展示鉴定和选择单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段的氨基酸序列赋予分子针对BCMA的特异性并且形成本公开的全部抗原结 合蛋白的基础。因此，所述scFv可以用来设计一系列不同“抗体”分子，包括例如 全长抗体、其片段如Fab和F(ab’)2、融合蛋白(包括scFv_Fc)、多价抗体、即，具有针 对相同抗原或不同抗原的多于一种特异性的抗体，例如，双特异性T细胞结合抗体 (BiTE)、三抗体等(Cuesta等，Multivalent antibodies:when design surpasses evolution, Trends inBiotechnology 28:355-362,2010)。
在抗原结合蛋白是全长抗体的一个实施方案中，本发明抗体的重链和轻链可以是全长(例如，抗体可以包括至少一条并优选地两条完整重链，和至少一条并优选地 两条完整轻链)或可以包括抗原结合部分(Fab、F(ab’)2、Fv或scFv)。在其他实施方案 中，抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD 和IgE。抗体类型的选择将取决于所设计的抗体欲引发的免疫效应子功能。在构建重 组免疫球蛋白时，各种免疫球蛋白同种型的恒定区的适宜氨基酸序列和用于产生广 泛种类抗体的方法是本领域技术人员已知的。
在第一个方面，本发明提供了结合BCMA的抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：1，60，62任一氨基酸序列的重链CDR1，和/或包含SEQ ID NO：2，61，63任 一氨基酸序列的重链CDR2，和/或包含SEQ ID NO：3，4，5任一氨基酸序列的重链 CDR3。在另一个方面，本发明提供了结合BCMA的抗体或其片段，其包括包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的轻链 CDR2，和/或包含SEQ ID NO：8，9，10任一氨基酸序列的轻链CDR3。在另一方面， 本发明提供了结合BCMA的抗体或其片段，其包括包含SEQID NO：1，60，62任一 氨基酸序列的重链CDR1，和/或包含SEQ ID NO：2，61，63任一氨基酸序列的重链 CDR2，和/或包含SEQ ID NO：3，4，5任一的氨基酸序列的重链CDR3，和/或包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链CDR1，和/或包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列 的轻链CDR2，和/或包含SEQ ID NO：8，9，10任一的氨基酸序列的轻链CDR3。优 选的，所述结合BCMA的抗体或其片段包括包含SEQ ID NO：1，60，62任一氨基酸 序列的重链CDR1，和包含SEQ IDNO：2，61，63任一氨基酸序列的重链CDR2，和 包含SEQ ID NO：3，4，5任一的氨基酸序列的重链CDR3，和/或包含SEQ ID NO： 6的氨基酸序列的轻链CDR1，和包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的轻链CDR2，和 包含SEQ ID NO：8，9，10任一的氨基酸序列的轻链CDR3。更优选的，所述结合 BCMA的抗体或其片段包括包含SEQ ID NO：1，60，62的氨基酸序列的重链CDR1， 和包含SEQ ID NO：2，61，63的氨基酸序列的重链CDR2，和包含SEQ ID NO：3， 4，5任一的氨基酸序列的重链CDR3，和包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的轻链 CDR1，和包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的轻链CDR2，和包含SEQ ID NO：8，9， 10任一的氨基酸序列的轻链CDR3。
在另一方面，本发明提供了结合BCMA的抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO：13，17，21，56，58的重链可变区序列。
在另一方面，本发明提供了结合BCMA的抗体或其片段，其包括选自SEQ ID NO：11，15，19的轻链可变区序列。
考虑到这些重链和轻链可变区序列各自可以结合BCMA，可以“混合和匹配” 重链和轻链可变区序列来产生本发明的抗BCMA的结合分子。
在另一个方面，本发明提供了结合BCMA的抗体或其片段的变体。因而本发明 提供了抗体或其片段，具有与重链或轻链的可变区序列至少80％相同的重链和/或轻 链可变区。优选的，重链和/或轻链可变区的氨基酸序列同一性是至少85％，更优选 至少90％，最优选至少95％，特别是96％，更特别97％，甚至更特别98％，最特别99％， 包括例如80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％， 92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％。变体可以以本申请所述 的抗体为母本抗体，通过酵母库筛选、噬菌体库筛选、点突变等方法得到。如本申 请实施例10采用的方法，以抗体23F10为母本抗体，采用噬菌体库筛选的方法进行突 变改造。
在另一个方面，本发明提供了与前述的抗BCMA的抗体识别相同的抗原决定部 位的抗体。
抗BCMA的抗体特性
评估抗体例如抗BCMA的抗体的结合能力的标准测定是本领域已知的，包括例 如ELISA、biacore、Western印迹和流式细胞仪分析。合适的测定详细描述在实施例 中。
核酸、载体和宿主细胞
本发明还提供了编码结合BCMA的抗体和其片段分离的核酸、载体以及包含所 述核酸或载体的宿主细胞。核酸可位于完整细胞中、细胞裂解液中或者以部分纯化 的或基本纯化的形式。
可以使用标准的分子生物学技术获得本发明的核酸，例如可以通过标准的PCR 扩增或cDNA克隆技术，获得编码抗体的轻链和重链或者编码VH和VL区段的cDNA。 对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可以从文库 回收编码抗体的一种或多种核酸。向宿主细胞中导入外源核酸的方法是本领域普遍 已知的，并可随所使用的宿主细胞而变化。
优选的本发明核酸分子是编码轻链可变区的选自SEQ ID NO：12，16，20的那 些，和/或编码重链可变区的选自SEQ ID NO：14，18，22，57，59的那些。更优选 的是这样的核酸分子，所述核酸分子包含编码重链的SEQ ID NO：14序列，和包含 编码轻链的SEQ ID NO：12序列或者包含编码重链的SEQ ID NO：18序列，和包含 编码轻链的SEQ ID NO：16序列或者包含编码重链的SEQ ID NO：22序列，和包含 编码轻链的SEQ ID NO：20序列或者包含编码重链的SEQ ID NO：57序列，和包含 编码轻链的SEQ ID NO：20序列或者包含编码重链的SEQID NO：59序列，和包含 编码轻链的SEQ ID NO：20序列。
为了表达蛋白质，可以将编码本发明抗体的核酸整合到表达载体中。多种表达 载体可用于蛋白质表达。表达载体可包括自我复制的染色体外载体，或整合到宿主 基因组中的载体。用于本发明的表达载体包括但不限于使蛋白质能够在哺乳动物细 胞、细菌、昆虫细胞、酵母和体外系统中表达的那些。如本领域已知的，多种表达 载体是可商业或其他方式获得的。可用于本发明中来表达抗体。
免疫辍合物
本发明还提供了多功能免疫缀合物，其包含本文所述抗体以及进一步包含至少一种其它类型的功能性分子。所述的功能性分子选自但不限于：靶向肿瘤表面标志 物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物。 所述抗体与所述功能性分子可以通过共价连接、偶联、附着、交联等方式构成辍合 物。
作为一种优选方式，所述免疫缀合物可包含：本发明的抗体以及至少一种靶向 肿瘤表面标志物的分子或抑制肿瘤的分子。所述的抑制肿瘤的分子可以是抗肿瘤的 细胞因子，或抗肿瘤的毒素；较佳地，所述的细胞因子包括(但不限于)：IL-2、IL-7、 IL-12、IL-15、I型IFN、TNF-alpha。在具体的实施方式中，所述的靶向肿瘤表面标 志物的分子是靶向本发明抗体所靶向的相同肿瘤的表面标志物的分子。例如，所述 的靶向肿瘤表面标志物的分子可以是结合肿瘤表面标志物的抗体或配体，例如可以 与本发明的抗体协同作用，更精准地靶向肿瘤细胞。
作为一种优选方式，所述免疫缀合物可包含：本发明的抗体以及可检测标记物。所述的可检测标记物包括但不限于：荧光标记物、显色标记物；如：酶、辅基、荧 光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺 磁性金属离子。也可包含一个以上的标记物。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于 标记抗体的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学 染色(组织)样品、流式细胞计量术等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方 法合适的标记为本领域技术人员所熟知。
作为一种优选方式，所述免疫缀合物可包含：本发明的抗体以及靶向免疫细胞 的表面标志物的分子。所述靶向免疫细胞的表面标志物的分子可以是结合免疫细胞 表面标志物的抗体或配体，能够识别免疫细胞，其携带本发明的抗体达到免疫细胞， 同时本发明的抗体可将免疫细胞靶向于肿瘤细胞，从而引发免疫细胞特异性地杀伤 肿瘤。所述的免疫细胞表面标志物可以选自CD3，CD16，CD28，更佳的，结合免 疫细胞表面标志物的抗体是抗CD3抗体。免疫细胞可选自T细胞、NK细胞、NKT细 胞。
作为通过直接或间接(例如通过接头)缀合而化学产生免疫缀合物的一种方式，所述免疫缀合物可以作为融合蛋白而产生，所述融合蛋白包含本发明的抗体及合适 的其它蛋白。融合蛋白可以通过本领域已知方法产生，例如通过构建核酸分子以及 随后表达所述核酸分子而重组产生，所述核酸分子包含符合读框的编码抗体的核苷 酸序列以及编码合适标记的核苷酸序列。
本发明另一方面提供了编码本发明的至少一种抗体、其功能变体或者免疫缀合物的核酸分子。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。 这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中 分离得到有关序列。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。 这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是 原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如 哺乳动物细胞。
含有抗BCMA抗体的嵌合抗原受体
本发明还提供多种嵌合抗原受体(CAR)，其中包含本发明的抗体或抗体片段， 该CAR-T细胞表现出抗肿瘤性质。一些实施案例中，用编码CAR的病毒载体转导细 胞(例如T细胞)。在一些实施案例中，病毒载体是慢病毒载体。一些实施方案中，细 胞可以稳定地表达CAR。
在一优选例中，CAR的BCMA结合部分是scFv抗体片段，与其所来自的IgG抗 体相比，保持等价的亲和结合力，例如其以相当的功效结合相同抗原。该抗体片段 是功能性的，由此其提供生物化学反应，例如激活免疫反应、抑制从其靶抗原的信 号传导起始、抑制激酶活性等。因此，本发明提供，经工程化导入T细胞中的，包 含WT1结合结构域的BCMA-CAR，以及将其用于过继免疫治疗的方法。
一方面，CAR的抗BCMA抗原结合结构域是，相对于其所源自的鼠序列scFv被 人源化的scFv抗体片段。
一方面，本发明CAR将特定抗体的抗原结合结构域和保内信号传导分子组合在 一起。例如，一些方面，胞内信号传导分子包括但不限于，CD3ξ链、4-1BB和CD28 信号传导模块及其组合。
一方面，BCMA-CAR包含至少一个胞内信号传导结构域，其选择CD137(4-1BB) 信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ξ信号结构域，及其任何组合。一方 面，BCMA-CAR包含至少一个胞内信号传导结构域，其来自一个或多个非 CD137(4-1BB)或CD28的共刺激分子。
作为示例性的，BCMA-CAR的序列可以是7A12-BBZ(SEQ ID NO：75)、 25C2-BBZ(SEQID NO：76)、25D2-BBZ(SEQ ID NO：77)、7G2-BBZ(SEQ ID NO： 78)、7A12-28Z(SEQ ID NO：79)、7A12-28BBZ(SEQ ID NO：80)、7G2-28Z(SEQ ID NO：81)、7G2-28BBZ(SEQ ID NO：82)、25C2-28Z(SEQ ID NO：83)、25C2-28BBZ(SEQ ID NO：84)、25D2-28Z(SEQ ID NO：85)、25D2-28BBZ(SEQ ID NO：86)，上述SEQ ID NO：75-86的跨膜域和胞内域本领域技术人员可以选择常规的跨膜域和胞内域进 行替换，且均落入本申请的保护范围。
嵌合抗原受体修饰的T细胞
本发明还提供了包含有本发明所述的嵌合抗原受体的免疫细胞。
在另一方面，本发明提供的嵌合抗原受体修饰的T细胞其还携带外源的细胞因 子的编码序列；较佳地，所述的细胞因子包括：IL-12，IL-15或IL-21。所述的免疫 细胞优选自T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞。
在另一方面本发明提供的嵌合抗原受体修饰的T细胞其还携带PD-L1阻断剂或 阻断PD-L1的蛋白，如天然PD-1，或能够与PD-L1结合的突变PD-1，或能够与PD-L1 结合的天然或突变PD-1的片段、或抗PD-L1的抗体。作为示例性的，PD-L1阻断剂可 以包含SEQ ID NO：70编码的氨基酸序列。
药物组合物
本发明的抗体、包含该抗体的免疫辍合物以及基因修饰的免疫细胞可以应用于制备药物组合物或诊断试剂。所述的组合物除了包括有效量的所述抗体、免疫辍合 物或免疫细胞，还可包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”是指当分 子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良 反应。
可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、 葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维 素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂， 如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉 米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻 酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、 稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、 体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式 例如可以采用注射或其它治疗方式。
本发明的优点：
1.本发明提供了针对BCMA的特异性抗体；
2.本发明提供了靶向BCMA的免疫效应细胞；和
3.本发明的抗体能够有效结合表达BCMA的肿瘤细胞，本发明的免疫效应细胞 对表达BCMA的肿瘤细胞表现出显着的杀伤能力，因此，本发明的抗体和免疫效应 细胞能够有效而安全地应用于多发性骨髓瘤的治疗，从而为多发性骨髓瘤的治疗奠 定了物质基础。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编着，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社， 2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.BCMA重组蛋白的制备
a.BCMA_huFc，BCMA_muFc表达质粒的构建
体外合成人BCMA的胞外段Met1-Ala54(SEQ ID NO：38)基因(SEQ ID NO： 39)，将该基因插入含有人IgG1重链恒定区的Fc段Asp104-Lys330的真核表达质粒 中，中间以“GS”相连接，形成融合表达蛋白BCMA_huFc(SEQ ID NO：40)，相对应 的基因序列如SEQ ID NO：41所示。
将BCMA胞外段基因(SEQ ID NO：39)插入含有鼠IgG1重链恒定区的Fc段 Arg100-Lys324的真核表达质粒中，中间以“GS”相连接，形成融合表达蛋白 BCMA_muFc(SEQ ID NO:42)，相对应的基因序列如SEQ ID NO：43所示。
b.瞬时转染表达BCMA_huFc、BCMA_muFc
1)转染前一天，接种6～7x105/ml 293F细胞于125ml培养瓶中；
2)转染当天，调整3x107细胞于28ml FreeStyleTM 293expression medium
3)按照下面的操作步骤制备lipid-DNA复合物：
用Opti-MEM I稀释30ug DNA，终体积1ml,充分混匀
用Opti-MEM I稀释60ul 293fectinTM,终体积1ml，充分混匀
室温孵育5分钟，
4)将稀释好的DNA与293fectinTM混合，温孵育20分钟
5)将2ml DNA-293fectin复合物加入28ml细胞中，37度，8％CO2，125rpm培养 3～4天，收取上清；
c.BCMA_huFc、BCMA_muFc的纯化
1)13000rpm离心培养上清15min
2)采用protein A填料进行亲和纯化，具体具体操作步骤如下：
平衡：10个柱体积的平衡buffer平衡protein A填料。
上样：0.45μm滤膜处理好的样品全部上样。
洗杂：20个柱体积平衡buffer洗杂，直至流穿无物质流出。
洗脱：加入10个柱体积的洗脱buffer洗脱目的蛋白(收集管中事先加入6％的中和buffer)。
溶液配方
平衡buffer：PBS pH 7.4
洗脱buffer：0.1M甘氨酸pH 2.6
中和buffer：1M Tris
3)洗脱用0.22um的膜过滤后，使用截流量为10KD的millipore超滤管进行浓 缩，浓缩至体积1ml以内，使用PD-Midi脱盐柱脱盐，收集1.5ml样品。通过OD280/1.47 测蛋白浓度。
取2ug跑SDS-PAGE，结果如图1所示。
实施例2.K562-BCMA稳转细胞系的构建
1.pWPT-BCMA包装质粒的构建
体外合成人BCMA的全长(SEQ ID NO：37)基因，并在引入酶切位点MluI， SalI(SEQID NO：44)。通过双酶切插入慢病毒包装质粒pWPT中。
2.慢病毒的包装
a)Lenti-x 293T消化后以8×106cells铺至10cm dish，置37℃培养
b)第二天上午：配制质粒/PEI混合液
pWPT-BCMA 5ug
psPAX.2 7.5ug
pMD2.G 2.5ug
加入800uL DMEM中孵育。对应PEI量为45uL，加入800uL OMEM中孵育5min。
c)将质粒混合液逐滴加入PEI孵育液中，并轻轻混匀，室温孵育20min。
d)将配制的质粒/PEI混合液混合液逐滴加入细胞中，混匀。5h后进行换液。
e)72h后收集病毒上清，以0.45um滤膜过滤后于4℃暂时保存。
3.BCMA病毒感染K562细胞
a)第一天下午：生长良好的K562细胞以1×105cells铺至6cm dish。
b)第二天下午：K562细胞上清弃去，加入3mL新鲜的完全培养基，再加入1mL 病毒原液，加入终浓度为6ug/mL的polybrene。
c)第三天上午：去除上清，加入5mL新鲜的完全培养基。
d)第六天上午：取部分细胞进行流式的检测。
4.K562-BCMA混合克隆鉴定
a)K562-BCMA混合克隆以及K562阴性细胞以1％NCS(含有1％小牛血清的PBS) 洗2遍后进行一抗孵育：huBCMA抗体(abcam，#17323)以1％NCS 1:1000稀释，每样 加入50uL 4℃孵育45min。
b)细胞以1％NCS洗2遍后进行二抗孵育：DyLight488标记的羊抗大鼠IgG(abcam，#ab98420)以1％NCS 1:200稀释，每样假如50uL，4℃孵育45min。
c)细胞以1％NCS洗3遍后重悬于1％NCS，使用Guava easyCyteTM HT System仪 器检测，结果如图2-A所示。
5.K562-BCMA单克隆铺板
a)将K562-BCMA混合克隆细胞计数，以有限稀释法进行单克隆铺板。
b)一周后观察克隆生长情况，并补加培养基。
c)两周后取单克隆生长的孔中细胞进行扩大培养
6.K562-BCMA单克隆鉴定
检测方法同混合克隆鉴定，实验结果如图2-B所示。其中4个单克隆为BCMA阳 性克隆。
实施例3.使用全人噬菌体展示文库筛选针对BCMA特异的scFv
本发明使用的噬菌体展示文库为本公司构建的全人的天然的scFv噬菌体文库,库容为1E+11。利用本领域技术人员已知的筛选方法得到针对BCMA高度特异的scFv 片段。简言之，分别包被10ug/ml抗原BCMA_huFc和人Fc段于免疫管。为了减少Fc 段的影响，将噬菌体文库加入包被了人Fc段的免疫管中结合1hr。取上清加入包被 BCMA_huFc的免疫管中结合1.5小时，随后将非特异性的噬菌体洗掉，将结合的噬 菌体洗脱下来并感染对数生长期的大肠杆菌TG1。扩大培养洗脱下来得噬菌体并使 用PEG/NaCl沉淀纯化扩大后的噬菌体文库用于下一轮的筛选。将淘选进行3-4个循 环以富集与BCMA特异性结合的scFv噬菌体克隆。通过针对BCMA_huFc的标准 ELISA方法确定阳性克隆。ELISA使用人Fc段做为无关抗原来验证抗体的特异性。 一共筛选了2470个克隆，其中160个克隆ELISA实验特异性的结合BCMA_huFc，不 结合人的Fc段。其中挑取76个信号值高的克隆送测序，得到23个单一的序列。表达 纯化这23个克隆，得到三个特异性的结合K562-BCMA细胞(图4)，克隆名称为7G2，7A12，23F10。经测序分析，7A12的重链可变区为SEQ ID NO：13所示的氨基酸序 列，轻链可变区为SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；7G2的重链可变区为SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；23F10 的重链可变区为SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，轻链可变区为SEQ ID NO：19 所示的氨基酸序列。
7A12的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)：
(黑体字加下划线示出了CDR序列)
7A12的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)：
GAGGTGCAATTGCTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGCGTTACCCATACCTGGCATTCGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT
7A12的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)
(黑体字加下划线示出了CDR序列)
7A12的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)：
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTACGGTTACCCACCATCTTACACGTTCGGCCAGGGG ACCAAAGTGGAAATCAAA
7G2的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)：
(黑体字加下划线示出了CDR序列)
7G2的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)：
GAGGTGCAATTGCTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAACTGTCTGGTGATGCAGCAATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT
7G2的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)：
(黑体字加下划线示出了CDR序列)
7G2的轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：16)：GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTACGGTTACCCACCAAGATACACGTTCGGCCAGGGGACCA AAGTGGAAATCAAA
23F10的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：21)：
(黑体字加下划线示出了CDR序列)
23F10的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)：
GAGGTGCAATTGCTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTAGCAGTTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAGTTCGTCCATTCTGGGGTACTTTCGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT
23F10的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)：
(黑体字加下划线示出了CDR序列)
23F10的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)：
GAAATCGTGTTAACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCTTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTACTTCAACCCACCAGAATACACGTTCGGCCAGGGG ACCAAAGTGGAAATCAAA
实施例4.抗BCMA scFv_Fc融合抗体的构建及其在真核细胞中的瞬转表达纯 化，活性鉴定
分别针对7G2，7A12，23F10的VH和VL片断设计引物，引入由15个柔性氨基酸(GGGGSGGGGSGGGGS)组成的linker连接组成scFv；在VH上游引入NheI的酶切位点 和保护碱基，在VL的下游引入BamHI的酶切位点和保护碱基。1％琼脂糖凝胶电泳 分析PCR产物并纯化回收。酶切后连接入V152(购自上海锐劲生物技术有限公司)真 核表达载体。采用293fectinTM Transfection reagent(Invitrogen,12347-019)或者聚乙烯 亚胺(PEI)(Sigma-Aldrich,408727)瞬时转染对数生长期的293F细胞。转染5-7天后收集 培养上清通过Protein A进行亲和纯化。通过SDS PAGE对得到的抗体进行定量和定性 分析(图5)。
通过流式细胞术测试抗体与稳定表达BCMA的K562的结合。FACs检测的具体 方法如下：收获细胞，用生长培养基洗涤细胞一次，重悬于PBS中，调整细胞浓度 为4E+5细胞/ml。在冰上将梯度稀释的scFv_Fc融合抗体与细胞育30分钟,抗体的起始 浓度为500nM,5倍稀释，一共7个梯度。其后与FITC标记的抗小鼠IgG第二抗体孵育。 两次洗涤步骤之后，使用Guava easyCyteTM HT System仪器检测。图6显示了抗体 7A12，7G2，23F10 scFv_Fc融合形式和K562-BCMA结合的情况。这三个抗体都有 浓度依赖的结合，EC50分别为3.13 nM,3.42nM,5.61 nM。
实施例5.利用表面等离子共振技术(SPR)测定抗体的亲和力
不同抗体针对BCMA的亲和力是使用biacoreT200测定的。具体做法如下：
将BCMA_huFc通过氨基偶联的方式包被在CM5芯片上，包被至500RU左右， 梯度稀释的抗体作为流动相以30ul/min的流速通过包被抗原的通道。运行缓冲液为HBS-N，温度为25度。实验数据通过BIAevaluation3.2进行分析，动力学曲线使用1： 1的langmuir模型进行拟合。其中7A12(scFv_Fc)的KD为663pM,7G2(scFv_Fc)的KD为 499pM，23F10(scFv_Fc)的KD为667pM(见图7)。具体参数如下表所示：
Clone ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
7G2 7.52E+04 3.75E-05 4.99E-10
7A12 9.84E+04 6.53E-05 6.63E-10
23F10 6.64E+04 4.43E-05 6.67E-10
实施例6.利用FACs测定抗体与肿瘤细胞系的结合。
RPMI8226是人多发性骨髓瘤外周血B淋巴细胞。FACs检测的具体方法如下： 收获细胞，用生长培养基洗涤细胞一次，重悬于PBS中，调整细胞浓度为4E+5细胞 /ml。在冰上将梯度稀释的scFv_Fc融合抗体与细胞育30分钟,抗体的起始浓度为 500nM,5倍稀释，一共7个梯度。其后与FITC标记的抗小鼠IgG第二抗体孵育。两次 洗涤步骤之后，使用GuavaeasyCyteTM HT System仪器检测。。如图8所示抗体7A12， 7G2，23F10scFv_Fc融合形式在细胞系RPMI8226上有浓度梯度依赖的结合。
实施例7.抗BCMA抗体与BCMA配体APRIL的竞争性结合实验
1.表达纯化重组APRIL融合蛋白
重组表达人APRIL His115-Leu250和人的IgG1重链恒定区的Fc段 Asp104-Lys330的融合蛋白，中间以“GS”相连接，融合蛋白APRIL_huFc(SEQ ID NO： 45)，相对应的基因序列如SEQ ID NO：46所示。如实施例1所述的方法进行瞬时转 染表达纯化。
2.竞争性ELISA
包被50ng/ml 100ul/空BCMA_muFc与ELISA板中，4度包被过夜。第二天，PBS 洗包被板3次，加入含有2％脱脂奶粉的PBS，室温封闭1小时。同时加入40ng/ml APRIL_huFc和梯度稀释的抗体7A12，7G2，或23F10(起始浓度200nM，3倍稀释，7 个梯度)。室温孵育1小时，PBST洗三次，PBS洗三次，加入1：1000稀释的HRP标记 的鼠抗人Fc抗体，室温孵育1小时，PBST洗三次，PBS洗三次。加入TMB显色并用 酶标仪读数。
实验结果如图9所示，7A12，7G2，23F10都能明显抑制APRIL和BCMA的结合。 说明本发明的抗体能抑制BCMA和其天然配体的结合。
实施例8.抗BCMA嵌合抗原受体质粒(CAR)的构建
a.抗BCMA抗体7A12嵌合抗原受体质粒的构建
以PRRLSIN-cPPT.EF-1α为载体，构建了表达抗体7A12的二代、三代嵌合抗原 受体的慢病毒质粒，包括PRRLSIN-cPPT.EF-1α-7A12-28Z、PRRLSIN-cPPT.EF-1α-7A12-BBZ以及PRRLSIN-cPPT.EF-1α-7A12-28BBZ。 7A12-28Z序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO：23)、7A12scFv(SEQ ID NO：47)、CD8 hinge(SEQ ID NO：25)、CD28跨膜区(SEQ ID NO：27)和胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：29)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO：31)组成；7A12-BBZ序列由CD8α 信号肽(SEQ ID NO：23)、7A12scFv(SEQ ID NO：47)、CD8hinge(SEQ ID NO：25)和跨膜区(SEQ ID NO：33)、CD137胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：35)以及 CD3ξ(SEQ IDNO：31)组成；7A12-28BBZ序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO：23)、 7A12-scFv(SEQ ID NO：47)、CD8hinge(SEQ ID NO：25)、CD28跨膜区(SEQID NO： 27)和胞内段(SEQ ID NO：29)、CD137胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：35)以及 CD3ξ组成(SEQ ID NO：31)。
b.抗BCMA抗体7G2嵌合抗原受体质粒的构建
以PRRLSIN-cPPT.EF-1α为载体，构建了表达抗体7G2的二代、三代嵌合抗原受 体的慢病毒质粒，包括PRRLSIN-cPPT.EF-1α-7G2-28Z、 PRRLSIN-cPPT.EF-1α-7G2-BBZ以及PRRLSIN-cPPT.EF-1α-7G2-28BBZ。7G2-28Z序 列由CD8α信号肽(SEQ ID NO：23)、7G2scFv(SEQ ID NO：48)、CD8hinge(SEQ ID NO：25)、CD28跨膜区(SEQID NO：27)和胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：29) 以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO：31)组成；7G2-BBZ序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO：23)、7G2scFV(SEQ ID NO：48)、CD8hinge(SEQ ID NO：25)和跨膜区(SEQID NO：33)、CD137胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：35)以及CD3ξ(SEQ ID NO：31) 组成；7G2-28BBZ序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO：23)、7G2-scFv(SEQ ID NO：48)、 CD8hinge(SEQID NO：25)、CD28跨膜区(SEQID NO：27)和胞内段(SEQ ID NO： 29)、CD137胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：35)以及CD3ξ组成(SEQ ID NO：31)。
实施例9.CAR-T细胞的制备
1.靶向BCMA CAR慢病毒载体的慢病毒包装、病毒浓缩及滴度测定
a.慢病毒包装
1)以将293T细胞接种于10cm细胞培养皿中，37℃，5％CO2培养过夜准备用于 转染，培养基为含10％胎牛血清(Gibico)的DMEM；
2)分别将目的基因质粒PRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP(Mock)或相关CAR质粒 5.4μg与包装质粒pRsv-REV 6.2μg、RRE-PMDLg 6.2μg、Vsvg 2.4μg溶入800μL空 白DMEM培养液，混匀；
3)将60μg PEI溶解于800μl的无血清DMEM培养液中，轻轻混匀(或1000rpm涡 旋5秒钟)，室温孵育5min；
4)转染复合物的形成：将质粒混合液加入PEI混合液中，加入后立即涡旋混合 或轻轻混匀，室温下孵育20min；
5)将转染复合物1.6ml滴加入含11ml DMEM培养基的10cm培养皿中(无需换 液)；4-5h小时后，用10％FBS的DMEM培基给转染的293T细胞换液；37℃孵育72h， 收集病毒液上清。
b.慢病毒浓缩
1)5X PEG8000NaCl配制：称取NaCl 8.766g、PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121℃30min湿热灭绝30min；保存在4℃；
2)使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000NaCl母液7.5ml；每20～30min混合一次，共进行3-5次；4℃放置过夜； 4℃，4000g，离心20min；
3)吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；加入适量的慢病毒溶解液溶 解慢病毒沉淀；分装后，储存在-80℃。
c.慢病毒滴度测定
1)以2×105细胞数目接种293T细胞于6孔培养板，1ml/孔；按0.6μl/ml加入初始浓度10ug/μl的polybrene溶液，终浓度6ug/ml；37℃，5％CO2培养1小时，培养液为 含10％胎牛血清的DMEM；
2)加10μL/孔的病毒浓缩液5倍稀释，3个梯度，37℃，5％CO2培养；
3)感染72h后，胰酶消化(30s)293T细胞，加1ml DMEM(10％FBS)终止消化，将 细胞悬液转移入2ml离心管中(二等分)，5000rpm，离心5min，弃上清；PBS(2％NBS) 洗两次；
4)对照组细胞加入50μl PE-SA(1:200稀释)抗体冰上孵育45min，PBS(2％NBS) 洗两次，重悬后作为对照；
5)检测组细胞+50μl 1：50稀释的biotin-Goat anti human IgG，F(ab’)2抗体，冰上孵育45min；PBS(2％NBS)洗两次；加入50μl PE-SA(1:200稀释)抗体冰上孵育 45min；
6)加入2ml PBS(2％NBS)重悬细胞，4℃，5000rpm/min，离心5分钟弃上清； 重复两次；
7)加入500μl PBS(2％NBS)，转移至流式管中。流式细胞仪检测PE通道，以阳 性率为5～20％的细胞数为宜，计算滴度(PFUs/mL)＝细胞数目×阳性率/病毒体积。
2.慢病毒转导T淋巴细胞------CAR阳性的T淋巴细胞的制备
1)T淋巴细胞活化：以约1×106/mL密度加入淋巴细胞培养基液培养，并按照磁珠:细胞比例为2:1加入同时包被有抗CD3和CD28抗体的磁珠(Invitrogen)和终浓度 500U/mL的重组人IL-2(上海华新生物高技术有限公司)刺激培养48h；
2)感染前一天，Retronectin包被24孔板，retronectin终浓度为5μg/ml，4度孵育过夜；
3)弃去24孔板中的retronectin溶液(PBS)，1ml PBS洗两次；
4)按照MOI＝10在PBMCs细胞中加入浓缩后的慢病毒，1000g，离心40min后， 转移至细胞培养箱中；
5)扩增培养：感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代，同时在 淋巴细胞培养液中补加终浓度500U/mL的重组人IL-2。
3.T淋巴细胞嵌合抗原受体表达
1)慢病毒感染的T淋巴细胞在培养第7天，取1×106的T细胞于离心管内；
2)4℃，5000rpm，离心5min，弃上清，PBS洗两次；
3)待检细胞加入50μl的biotin-Goat anti human IgG，F(ab’)2抗体(1：50稀释)，冰上孵育45min；PBS(2％NBS)洗两次；加入50μl PE-SA(1:200稀释)抗体冰上孵育 45min；
4)加入2ml PBS(2％NBS)重悬细胞，4℃，5000rpm/min，离心5分钟弃上清； 重复两次；
5)加入500μl PBS(2％NBS)，转移至流式管中。流式细胞仪检测PE通道，确定 CAR阳性的T细胞比例。
在进行体外毒性杀伤实验时Mock、7A12-28Z、7A12-BBZ、7A12-28BBZ、 7G2-28Z、7G2-BBZ以及7G2-28BBZ T细胞感染阳性率如图10所示，分别为72.8％、 60.8％、48.7％、57.4％、67.5％、68.8％、63.6％。
4.靶向BCMA CART细胞的细胞毒性测定
采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行，具体参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
靶细胞：分别接种75μl 2×105/mL的K562，K562-BCMA以及RPMI-8226细胞于96well板。效应细胞：按效靶比3:1、1:1或1:3加T-Mock及表达不同嵌合抗原受体的 CAR T细胞。各组均设4个复孔，取4个复孔的平均值。检测时间为细胞孵育18h。其 中各实验组和各对照组如下：
各实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的CART；
对照组1：靶细胞最大释放LDH；
对照组2：靶细胞自发释放LDH；
对照组3：效应细胞自发释放LDH；
细胞毒性计算公式为：细胞毒性％＝[(实验组–效应细胞对照–靶细胞对 照)/(靶细胞最大裂解量–靶细胞对照)]×100％
实验结果显示各表达不同嵌合抗原受体的CAR T细胞对BCMA阳性的 K562-BCMA以及RPMI-8226细胞均有显着的体外杀伤活性，尤其是对内源表达 BCMA的RPMI-8226细胞其杀伤毒性更强，而对BCMA阴性的K562细胞则几乎没有 杀伤作用(图11A)。
5、治疗荷多发性骨髓瘤外周血B淋巴细胞RPMI-8226的NOD/SCID小鼠皮下移 植瘤模型
分别接种RPMI-8226细胞于40只NOD/SCID小鼠，接种细胞数为8×106/只小鼠。 皮下接种肿瘤细胞后D12天，肿瘤体积平均75mm3，随机分为4组，分别尾静脉注射 1×107CART，注射前给予腹腔注射环磷酰胺，剂量为100mg/kg，预清除小鼠体内残 留的T细胞，CAR T注射第D17天，将小鼠引颈处死。
对小鼠的肿瘤大小进行分析，结果如图11B所示，与UTD组相比，7A12-28Z， 7A12-BBZ以及7A12-28BBZ治疗组抑瘤效果均非常明显，CAR T注射第D17天 7A12-28Z治疗组7只小鼠中肿瘤消退1只，7A12-BBZ治疗组7只小鼠中肿瘤消退2只， 7A12-28BBZ治疗组7只小鼠肿瘤全部消退，抑瘤率分别为：7A12-28Z(84.6％)， 7A12-BBZ(65.4％)以及7A12-28BBZ(100％)。
实施例10.抗体23F10的改造
本实施例以前述的23F10为母本抗体，采用噬菌体展示的方法来对23F10进行 改造。基于23F10的噬菌体文库的构建保留了轻链以及重链的CDR3区域，通过简 并引物，分别随机化轻链的CDR1和CDR2或者重链的CDR1和CDR2构建了两个 噬菌体文库。引物信息如下：
2.1 23F10突变体的构建
首先基于抗体23F10(scFv)(SEQ ID NO：55)构建模板质粒。对于轻链CDR1和 CDR2随机化的噬菌体文库，使用引物LMF和BL1R，PCR扩增片段1；使用引物 BL2F和FdR，PCR扩增片段2；然后通过搭桥PCR连接片段1和片段2得到还有 随机化序列的scFv全长，然后用NcoI和NotI酶切全长片段，通过T4连接酶连接 入同样酶切的模板质粒中。并电转化至TG1感受态细胞中，库容为1.50E+9。对于 重链CDR1和CDR2随机化的噬菌体文库，使用引物LMF和BH1R，PCR扩增片 段3；使用引物BH2F和FdR，PCR扩增片段4；然后通过搭桥PCR连接片段3和片段4得到还有随机化序列的scFv全长，然后用NcoI和NotI酶切全长片段，通过 T4连接酶连接入同样酶切的模板质粒中。并电转化至TG1感受态细胞中，库容为 2.2E+9。
噬菌体文库的筛选。参照本专利实施例3中方法。抗原BCMA_huFc的起始浓 度为20nM，5倍梯度稀释进行下一轮筛选。将淘选进行2-3个循环以富集与 BCMA_huFc特异性结合的scFv噬菌体克隆。通过针对BCMA_huFc的标准ELISA 方法确定阳性克隆。ELISA使用人Fc段做为无关抗原来验证抗体的特异性。一共挑 取80个ELISA阳性的克隆，重新诱导以后通过biacore测定诱导上清的解离常数 Kd。其中有两个克隆25C2，25D2的比母本克隆23F10低10倍，如下表所示：
克隆 解离常数(Kd,S-1)
23F10 3.43E-03
25C2 3.64E-04
25D2 3.74E-04
经测序，克隆25C2和25D2的轻链与23F10一样。图12比较了克隆25C2、 25D2及23F10的重链氨基酸序列，其中克隆25C2与母本抗体23F10相比重链上有 5个点突变(SEQID NO：56、57分别为25C2的重链可变区的氨基酸序列和核苷酸 序列，)其中CDR1上有2个，第31位丝氨酸变成甘氨酸，第32位酪氨酸变成天冬 酰氨。CDR2上有2个，第54位丝氨酸变成天冬酰氨，第59位酪氨酸变成苯丙氨 酸，框架区有一个，第30位丝氨酸变成甘氨酸。克隆25D2与母本抗体23F10相比 重链上有四个点突变(SEQ ID NO：58、59分别为25D2的重链可变区的氨基酸序列 和核苷酸序列，)，其中3个位于CDR2区，第54位丝氨酸变成甘氨酸，第57位丝 氨酸变成天冬酰氨，第59位酪氨酸变成苯丙氨酸，框架区有一个，第30位丝氨酸 变成精氨酸。
25C2的HCDR1的序列如SEQ ID NO：60所示，25C2的HCDR2的序列如SEQ ID NO：61所示。25D2的HCDR1的序列如SEQ ID NO：62所示，25D2的HCDR2 的序列如SEQ ID NO：63所示。25C2scFv的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：64、65所示，25D2scFv的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：66、 67所示。
2.2克隆25C2、25D2(scFv_Fc)的表达纯化
参照实施例4所示，在VH上游引入合适的酶切位点和保护碱基，在VL的下 游引入合适的酶切位点和保护碱基。1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并纯化回收。 酶切后连接入含有人Fc段的真核表达载体V152中(购自上海锐劲生物技术有限公 司)。通过293Fectin瞬时转染至293F细胞中并表达。
通过SEC分析25C2、25D2的聚集情况，如图13A和13B所示，单体形式的抗体 分别占比为91％、97％。与母本抗体23F10(30％单体率)相比分别提高了61％和67％， 聚集度明显降低。经超滤浓缩后，通过SDS PAGE对得到的抗体进行定量和定性分 析。产率分别为80ug/ml和60ug/ml(产率＝最终产物质量/转染体积)。
2.3克隆25C2、25D2的结合特性
使用稳定表达人BCMA的K562细胞(K562-BCMA)和K562，收集细胞，用完全 生长培养基洗涤细胞，并以约1～5×105个细胞/孔将细胞铺到U型底微量滴定板中。 在冰上将梯度稀释的scFv_Fc融合抗体与K562-BCMA/K562孵育30分钟，其后与 FITC标记的抗人Fc作为第二抗体孵育。两次洗涤步骤之后，使用Guava easyCyteTM HT System仪器分析，使用GraphPad Prism处理实验数据，得到EC50。图14显示了 25C2、25D2与K562-BCMA以及K562细胞的结合情况。结果表明稳定型提高，聚集 程度降低的两个克隆25C2、25D2与K562-BCMA的结合能力EC50分别为2.594nM和 1.891nM。与23F10相比，提高了3～4倍。
2.5克隆25C2、25D2的特异性测定
通过ELISA测定抗体23F10，25C2，25D2的特异性。
前一天包被2ug/ml重组human BCMA_Fc,mouse BCMA_Fc，TACI_huFc(R&D, #174TC),BAFF R(R&D,#1162-BR)于免疫板，4度过夜。第二天加入300ul/孔 2％MPBS封闭2小时，然后加入200nM纯化的抗体(scFv形式)，37度孵育1小时， PBST(含有0.05％Tween-20的PBS)洗三次，PBS洗三次，然后加入1：4000稀释的HRP 标记的抗Flag标签的抗体(sigma,#A8592-1MG)，37度孵育1小时，PBST(含有 0.05％Tween-20的PBS)洗三次，PBS洗三次。加入100ul/孔TMBS底物，显色10-15分 钟，加入50ul 2M硫酸终止反应。
结果如图14B所示，抗体7A12,23F10,25C2,25D2特异性的结合human BCMA, 不结合human TACI以及human BAFF R。其中抗体25C2，25D2和mouse BCMA有比 较弱的结合。
实施例11.25C2、25D2的CAR-T细胞的制备
参照实施例8的操作，分别构建得到25C2、25D2的嵌合抗原受体质粒。
a.25C2的嵌合抗原受体质粒的构建
以PRRLSIN-cPPT.EF-1α为载体，构建了表达抗体25C2的二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒PRRLSIN-cPPT.EF-1α-25C2-BBZ。以PRRLSIN-cPPT.EF-1α为载体，构建了 表达抗体25D2的二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒PRRLSIN-cPPT.EF-1α-25D2-BBZ。
25C2-BBZ序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO：23)、25C2scFv(SEQ ID NO：64)、CD8hinge(SEQ ID NO：25)和跨膜区(SEQ ID NO：33)、CD137胞内信号传导结构 域(SEQ IDNO：35)以及CD3ξ(SEQ ID NO：31)组成。
25D2-BBZ序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO：23)、25D2scFV(SEQ ID NO：66)、CD8hinge(SEQ ID NO：25)和跨膜区(SEQ ID NO：33)、CD137胞内信号传导结构 域(SEQ IDNO：35)以及CD3ξ(SEQ ID NO：31)组成。
参照实施例9的操作，分别将质粒PRRLSIN-cPPT.EF-1α-25C2-BBZ、 PRRLSIN-cPPT.EF-1α-25D2-BBZ进行慢病毒包装、T细胞感染、扩增，得到嵌合抗 原受体修饰的T细胞25C2-BBZ和25D2-BBZ。
实施例12.表达可溶性PD1的CAR-T细胞的制备
本实施例采用抗体7A12的scFv制备表达可溶性PD1的CAR-T细胞。制备方法为：
1、将PD-1的信号肽序列(SEQ ID NO:68)、PD-1胞外段序列(SEQ ID NO:69)、 CH3的序列(SEQ ID NO:70)进行全合成并克隆进T载体，得到质粒T-sPD1-Fc。
以T-sPD1-Fc质粒为模板，以上游引物 5’-acgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatgcagatcccacaggcgccc-3’(SEQ ID NO：71)，下游引物 5’-ctctcggggctgcccaccatacaccagggtttggaactggc-3’(SEQ ID NO：72)PCR扩增获得sPD1 序列；以上游引物5’-tatggtgggcagccccgagagccacag-3’(SEQ ID NO：73)，下游引物 5’-aaaattcaaagtctgtttcactttacccggagacagggag-3’(SEQ ID NO：74)扩增获得sPD1-CH3片段。
将sPD1-CH3片段和7A12-BBZ(SEQ ID NO：75)的片段PCR拼接和扩增，得到 sPD1-CH3-7A12-BBZ，7A12-BBZ的序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO：23)、7A12 scFv(SEQ ID NO：47)、CD8hinge(SEQ ID NO：25)和跨膜区(SEQ ID NO：33)、CD137 胞内信号传导结构域(SEQID NO：35)以及CD3ξ(SEQ ID NO：31)组成。
上述构建片段sPD1-CH3-7A12-BBZ的5’端带有MluI酶切位点，3’端带有SalI酶切位点。通过MluI和SalI双酶切，连入同样双酶切的PRRLSIN-cPPT.EF-1α载体中，得 到表达sPD-1-CH3蛋白的靶向BCMA的嵌合抗原受体的质粒。
参照实施例9的操作，得到表达sPD1和7A12-BBZ的T细胞sPD-1-7A12-BBZ。
实施例13.体外细胞杀伤实验
采用25C2-BBZ T细胞、25D2-BBZ T细胞、7A12-BBZ T细胞、C11D5.3-BBZ T 细胞以及sPD-1-7A12-BBZ T细胞作为效应细胞，进行体外杀伤实验，其中， C11D5.3-BBZ(SEQ IDNO：87)为采用抗BCMA的鼠抗C11D5.3(见CN201580073309.6) 制备的二代CAR。靶细胞为人骨髓瘤细胞NCI-H929和多发性骨髓瘤外周血B淋巴细 胞RPMI-8226。
采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行。具体方法参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
按效靶比3:1、1:1或1:3分别接种效应细胞于96孔板，分别接种50μL 2×105/mL的NCI-H929和RPMI-8226细胞到相应的96孔板。
每组均设置5个复孔，将培养板置于细胞培养箱中孵育18h。
其中各实验组及各对照组设置如下：实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的T淋巴细胞；对照组1：靶细胞最大释放LDH；对照组2：靶细胞自发释放LDH； 对照组3：效应细胞自发释放LDH。计算公式为：％细胞毒性＝[(实验组-效应细胞自 发组-靶细胞自发组)/(靶细胞最大-靶细胞自发)]*100。
细胞杀伤的实验结果如图15所示。
实施例14.小鼠体内细胞杀伤实验
分别接种8×106的RPMI-8226细胞于B-NDG小鼠右侧腋部皮下，皮下接种肿瘤 细胞后D18天，肿瘤平均体积约243mm3，得到荷多发性骨髓瘤外周血B淋巴细胞 RPMI-8226的B-NDG小鼠皮下移植瘤模型。
取小鼠皮下移植瘤模型分为3组，每组4只，分别注射25C2-BBZ、25D2-BBZ、 和未转染T细胞(UTD)，注射剂量为5×106，结果如下表所示，分别在肿瘤细胞接种 后D32和D36天，25C2-BBZ和25D2-BBZ治疗组4只小鼠的肿瘤均全部消退。
取小鼠皮下移植瘤模型分为3组，每组4只，分别注射25C2-BBZ、25D2-BBZ、C11D5.3-BBZ、7A12-BBZ和未转染的T细胞(UTD)，CAR T注射剂量为1×106，肿瘤 消退情况如下表和图16所示。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域 技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利 要求书所限定的范围。
序列表
<110> 科济生物医药（上海）有限公司
<120> 靶向BCMA的抗体及其应用
<130> P2018-0136
<150> CN201710058581.8
<151> 2017-01-23
<150> CN201710920346.7
<151> 2017-09-30
<160> 87
<170> PatentIn version 3.5
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cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtacggtt acccaccatc ttacacgttc 300
ggccagggga ccaaagtgga aatcaaa 327
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Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Arg Pro Phe Trp Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300
ccattctggg gtactttcga ctactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt 357
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 24
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 25
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 25
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 26
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 26
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 27
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 27
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 28
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 28
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 29
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 29
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 30
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 30
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggccaaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 31
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 31
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 32
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 32
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339
<210> 33
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 33
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 34
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 34
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
acc 63
<210> 35
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 35
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 36
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 36
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 37
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 37
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu
50 55 60
Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile
65 70 75 80
Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu
85 90 95
Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys
115 120 125
Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe
130 135 140
Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys
145 150 155 160
Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu
165 170 175
Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg
180
<210> 38
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 38
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala
50
<210> 39
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 39
atgctgcaga tggccggcca gtgcagccag aacgagtact tcgacagcct gctgcacgcc 60
tgcatcccct gccagctgcg gtgcagcagc aacacccccc ccctgacctg ccagcggtac 120
tgcaacgcca gcgtgaccaa cagcgtgaag ggcaccaacg cc 162
<210> 40
<211> 283
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 40
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
50 55 60
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
65 70 75 80
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
85 90 95
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
100 105 110
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
115 120 125
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
130 135 140
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
145 150 155 160
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
165 170 175
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
180 185 190
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
195 200 205
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
210 215 220
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
225 230 235 240
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
245 250 255
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
260 265 270
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 41
<211> 849
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 41
atgctgcaga tggccggcca gtgcagccag aacgagtact tcgacagcct gctgcacgcc 60
tgcatcccct gccagctgcg gtgcagcagc aacacccccc ccctgacctg ccagcggtac 120
tgcaacgcca gcgtgaccaa cagcgtgaag ggcaccaacg ccggatccga caaaactcac 180
acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 240
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 300
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 360
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 420
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 480
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 540
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 600
ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 660
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 720
ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 780
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 840
ccgggtaaa 849
<210> 42
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 42
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala Gly Ser Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
50 55 60
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
65 70 75 80
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
85 90 95
Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
100 105 110
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu
115 120 125
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
130 135 140
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
145 150 155 160
Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
165 170 175
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met
180 185 190
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro
195 200 205
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
210 215 220
Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
225 230 235 240
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
245 250 255
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
260 265 270
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 43
<211> 843
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 43
atgctgcaga tggccggcca gtgcagccag aacgagtact tcgacagcct gctgcacgcc 60
tgcatcccct gccagctgcg gtgcagcagc aacacccccc ccctgacctg ccagcggtac 120
tgcaacgcca gcgtgaccaa cagcgtgaag ggcaccaacg ccggatccag ggattgtggt 180
tgtaagcctt gcatatgtac agtcccagaa gtatcatctg tcttcatctt ccccccaaag 240
cccaaggatg tgctcaccat tactctgact cctaaggtca cgtgtgttgt ggtagacatc 300
agcaaggatg atcccgaggt ccagttcagc tggtttgtag atgatgtgga ggtgcacaca 360
gctcagacgc aaccccggga ggagcagttc aacagcactt tccgctcagt cagtgaactt 420
cccatcatgc accaggactg gctcaatggc aaggagttca aatgcagggt caacagtgca 480
gctttccctg cccccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aaggcagacc gaaggctcca 540
caggtgtaca ccattccacc tcccaaggag cagatggcca aggataaagt cagtctgacc 600
tgcatgataa cagacttctt ccctgaagac attactgtgg agtggcagtg gaatgggcag 660
ccagcggaga actacaagaa cactcagccc atcatggaca cagatggctc ttacttcgtc 720
tacagcaagc tcaatgtgca gaagagcaac tgggaggcag gaaatacttt cacctgctct 780
gtgttacatg agggcctgca caaccaccat actgagaaga gcctctccca ctctcctggt 840
aaa 843
<210> 44
<211> 589
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 44
acgcgtccta gcgctaccgg tcgccaccat gttgcagatg gctgggcagt gctcccaaaa 60
tgaatatttt gacagtttgt tgcatgcttg cataccttgt caacttcgat gttcttctaa 120
tactcctcct ctaacatgtc agcgttattg taatgcaagt gtgaccaatt cagtgaaagg 180
aacgaatgcg attctctgga cctgtttggg actgagctta ataatttctt tggcagtttt 240
cgtgctaatg tttttgctaa ggaagataaa ctctgaacca ttaaaggacg agtttaaaaa 300
cacaggatca ggtctcctgg gcatggctaa cattgacctg gaaaagagca ggactggtga 360
tgaaattatt cttccgagag gcctcgagta cacggtggaa gaatgcacct gtgaagactg 420
catcaagagc aaaccgaagg tcgactctga ccattgcttt ccactcccag ctatggagga 480
aggcgcaacc attcttgtca ccacgaaaac gaatgactat tgcaagagcc tgccagctgc 540
tttgagtgct acggagatag agaaatcaat ttctgctagg taagtcgac 589
<210> 45
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 45
His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys Asp Asp
1 5 10 15
Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg Gly Arg
20 25 30
Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala Gly Val
35 40 45
Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe Thr Met
50 55 60
Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr Leu Phe
65 70 75 80
Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr Asn Ser
85 90 95
Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile Leu Ser
100 105 110
Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro His Gly
115 120 125
Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
130 135 140
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
145 150 155 160
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
165 170 175
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
180 185 190
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
195 200 205
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
210 215 220
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
225 230 235 240
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
245 250 255
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
260 265 270
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
275 280 285
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
290 295 300
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
305 310 315 320
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
325 330 335
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
340 345 350
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 46
<211> 1095
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 46
cacagcgtgc tgcacctggt gcccatcaac gccaccagca aggacgacag cgacgtgacc 60
gaggtgatgt ggcagcccgc cctgcggcgg ggccggggcc tgcaggccca gggctacggc 120
gtgcggatcc aggacgccgg cgtgtacctg ctgtacagcc aggtgctgtt ccaggacgtg 180
accttcacca tgggccaggt ggtgagccgg gagggccagg gccggcagga gaccctgttc 240
cggtgcatcc ggagcatgcc cagccacccc gaccgggcct acaacagctg ctacagcgcc 300
ggcgtgttcc acctgcacca gggcgacatc ctgagcgtga tcatcccccg ggcccgggcc 360
aagctgaacc tgagccccca cggcaccttc ctgggcttcg tgaagctggg atccgacaaa 420
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 480
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 540
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 600
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 660
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 720
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 780
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 840
gtcagcctgt ggtgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 900
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 960
tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1020
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1080
ctgtctccgg gtaaa 1095
<210> 47
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 47
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Pro Tyr Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
130 135 140
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
145 150 155 160
Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
165 170 175
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro
180 185 190
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
210 215 220
Gly Tyr Pro Pro Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
225 230 235 240
Lys Arg
<210> 48
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 48
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Ser Gly Asp Ala Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu
130 135 140
Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
145 150 155 160
Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
165 170 175
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile
180 185 190
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Gly Tyr Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 49
caggaaacag ctatgaccat gattac 26
<210> 50
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(45)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(48)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(51)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(54)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(57)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(60)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 50
tgagacccac tccagcccct tccctggagc ctggcggacc camnnmnnmn nmnnmnnmnn 60
aaaggtgaat ccggaggctg 80
<210> 51
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(19)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(25)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(28)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(31)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(34)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(40)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(46)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 51
ggctggagtg ggtctcannk attnnknnkn nknnkggtnn kacannktac gcagactccg 60
tgaaggg 67
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 52
gacgttagta aatgaatttt ctgtatgagg 30
<210> 53
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(45)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(51)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(54)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(57)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(60)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(63)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(66)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 53
gatgaggagc ctgggagcct ggccaggttt ctgctggtac camnntaamn nmnnmnnmnn 60
mnnmnnctga ctggccctgc aagag 85
<210> 54
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(24)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(27)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(36)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 54
ccaggctccc aggctcctca tcnnknnknn knnknnkagg gccactggca tcccagac 58
<210> 55
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 55
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Arg Pro Phe Trp Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr
130 135 140
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly
180 185 190
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Tyr Phe Asn Pro Pro Glu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg
<210> 56
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 56
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Gly Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Arg Pro Phe Trp Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 57
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 57
gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttggc ggtaatgcca tgtcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagca attagtggta atggtggtag tacattctac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300
ccattctggg gtactttcga ctactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt 357
<210> 58
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 58
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Arg Pro Phe Trp Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 59
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 59
gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagg agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggcg gtggtggtaa cacattctac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300
ccattctggg gtactttcga ctactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagt 357
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 60
Gly Asn Ala Met Ser
1 5
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 61
Ala Ile Ser Gly Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 62
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 63
Ala Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 64
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 64
gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttggc ggtaatgcca tgtcctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagca attagtggta atggtggtag tacattctac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300
ccattctggg gtactttcga ctactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagtggt 360
ggaggcggtt caggcggagg tggttctggc ggtggcggat cggaaatcgt gttaacgcag 420
tctccaggca ccctgtcttt gtctccaggg gaaagagcca ccctctcttg cagggccagt 480
cagagtgtta gcagcagcta cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggctcccagg 540
ctcctcatct atggagcatc cagcagggcc actggcatcc cagacaggtt cagtggcagt 600
ggatccggga cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgaaga ttttgcagtg 660
tattactgtc agcagtactt caacccacca gaatacacgt tcggccaggg gaccaaagtg 720
gaaatcaaac gt 732
<210> 65
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 65
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Gly Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Arg Pro Phe Trp Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr
130 135 140
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly
180 185 190
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Tyr Phe Asn Pro Pro Glu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg
<210> 66
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 66
gaggtgcaat tgctggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagg agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggcg gtggtggtaa cacattctac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagttcgt 300
ccattctggg gtactttcga ctactggggc caaggaaccc tggtcaccgt ctcgagtggt 360
ggaggcggtt caggcggagg tggttctggc ggtggcggat cggaaatcgt gttaacgcag 420
tctccaggca ccctgtcttt gtctccaggg gaaagagcca ccctctcttg cagggccagt 480
cagagtgtta gcagcagcta cttagcctgg taccagcaga aacctggcca ggctcccagg 540
ctcctcatct atggagcatc cagcagggcc actggcatcc cagacaggtt cagtggcagt 600
ggatccggga cagacttcac tctcaccatc agcagactgg agcctgaaga ttttgcagtg 660
tattactgtc agcagtactt caacccacca gaatacacgt tcggccaggg gaccaaagtg 720
gaaatcaaac gt 732
<210> 67
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 67
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Arg Pro Phe Trp Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr
130 135 140
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly
180 185 190
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Tyr Phe Asn Pro Pro Glu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg
<210> 68
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 68
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
<210> 69
<211> 450
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 69
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gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 240
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 300
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 360
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 420
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg 450
<210> 70
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 70
cccccatgcc caccatgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 60
cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 120
gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 180
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 240
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 300
tccaacaaag gcctcccgtc c 321
<210> 71
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 71
acgcgtccta gcgctaccgg tcgccaccat gcagatccca caggcgccc 49
<210> 72
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 72
ctctcggggc tgcccaccat acaccagggt ttggaactgg c 41
<210> 73
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 73
tatggtgggc agccccgaga gccacag 27
<210> 74
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 74
aaaattcaaa gtctgtttca ctttacccgg agacagggag 40
<210> 75
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 75
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Pro Tyr Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
130 135 140
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
145 150 155 160
Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
165 170 175
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro
180 185 190
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
210 215 220
Gly Tyr Pro Pro Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
225 230 235 240
Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
275 280 285
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
290 295 300
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
305 310 315 320
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
325 330 335
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
340 345 350
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
355 360 365
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
370 375 380
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
385 390 395 400
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
405 410 415
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
420 425 430
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
435 440 445
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
450 455 460
Arg
465
<210> 76
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 76
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Gly Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Asn Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Arg Pro Phe Trp Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr
130 135 140
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly
180 185 190
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Tyr Phe Asn Pro Pro Glu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
260 265 270
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
275 280 285
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
290 295 300
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
305 310 315 320
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
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Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
340 345 350
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
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Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
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Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
385 390 395 400
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
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Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
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Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
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Pro Pro Arg
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Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
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Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
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Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
275 280 285
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Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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195 200 205
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225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
260 265 270
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
275 280 285
Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
290 295 300
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
305 310 315 320
Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
325 330 335
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
340 345 350
Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
355 360 365
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
370 375 380
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
385 390 395 400
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
405 410 415
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
420 425 430
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
435 440 445
Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
450 455 460
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
465 470 475 480
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
485 490 495
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 85
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 85
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Arg Pro Phe Trp Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr
130 135 140
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly
180 185 190
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Tyr Phe Asn Pro Pro Glu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
260 265 270
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
275 280 285
Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
290 295 300
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
305 310 315 320
Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
325 330 335
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
340 345 350
Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
355 360 365
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
370 375 380
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
385 390 395 400
Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
405 410 415
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
420 425 430
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
435 440 445
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
450 455 460
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 86
<211> 512
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 86
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asn Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Arg Pro Phe Trp Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr
130 135 140
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly
180 185 190
Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Tyr Phe Asn Pro Pro Glu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
245 250 255
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
260 265 270
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
275 280 285
Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
290 295 300
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
305 310 315 320
Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
325 330 335
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
340 345 350
Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
355 360 365
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370 375 380
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
385 390 395 400
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
405 410 415
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
420 425 430
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
435 440 445
Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
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Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
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Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
485 490 495
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 87
<211> 412
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 87
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
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Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
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Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala
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355 360 365
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
370 375 380
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
385 390 395 400
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
405 410

Claims (28)

1.一种靶向BCMA的抗体，其特征在于，所述抗体选自下组：
(1)抗体，其包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1、60或62所示的HCDR1，和/或包含SEQ ID NO:2、61或63所示的HCDR2，和/或包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQID NO:5中任一所示的HCDR3；
(2)抗体，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:6所示的LCDR1，和/或包含SEQ ID NO:7所示的LCDR2，和/或包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中任一所示的LCDR3；
(3)抗体，包含(1)所述抗体的重链可变区及(2)所述抗体的轻链可变区；
(4)抗体，(1)～(3)中任一项所述的抗体的变体，且具备与(1)～(3)中任一项所述的抗体相同或相似的活性。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体选自：
(1)抗体，其包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:3所示的HCDR3以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2、SEQ ID NO:8所示的LCDR3；
(2)抗体，其包含SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:4所示的HCDR3以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2、SEQ ID NO:9所示的LCDR3；
(3)抗体，SEQ ID NO:1所示的HCDR1、SEQ ID NO:2所示的HCDR2、SEQ ID NO:5所示的HCDR3以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2、SEQ ID NO:10所示的LCDR3；
(4)抗体，其包含SEQ ID NO:60所示的HCDR1、SEQ ID NO:61所示的HCDR2、SEQ ID NO:5所示的HCDR3以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2、SEQ ID NO:10所示的LCDR3；
(5)抗体，其包含SEQ ID NO:62所示的HCDR1、SEQ ID NO:63所示的HCDR2、SEQ ID NO:5所示的HCDR3以及SEQ ID NO:6所示的LCDR1、SEQ ID NO:7所示的LCDR2、SEQ ID NO:10所示的LCDR3。
(6)抗体，(1)～(5)中任一项所述的抗体的变体，且具备与(1)～(5)中任一项所述的抗体相同或相似的活性。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体选自：
(1)抗体，所述的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列、或者SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列；
(2)抗体，所述的抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列、或SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；
(3)抗体，包含(1)所述抗体的重链可变区及(2)所述抗体的轻链可变区；
(4)抗体，(1)～(3)中任一项所述的抗体的变体，且具备与(1)～(3)中任一项所述的抗体相同或相似的活性。
4.如权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述的抗体选自：
(1)抗体，所述的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列并且所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
(2)抗体，所述的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列并且所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列；
(3)抗体，所述的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列并且所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；
(4)抗体，所述的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列并且所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；
(5)抗体，所述的抗体的重链可变区具有SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列并且所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列；
(6)抗体，(1)～(5)中任一项所述的抗体的变体，且具备与(1)～(5)中任一项所述的抗体相同或相似的活性。
5.抗体，与权利要求1-4中任一项所述的抗体识别相同的抗原决定部位。
6.编码权利要求1-5中任一所述的抗体的核酸。
7.一种表达载体，其包含权利要求6所述的核酸。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求7所述的表达载体或基因组中整合有权利要求6所述的核酸。
9.权利要求1-5任一所述的抗体的用途，用于制备特异性靶向BCMA的肿瘤细胞的靶向性药物，抗体药物偶联物或多功能抗体；或
用于制备诊断肿瘤的试剂，该肿瘤表达BCMA；或
用于制备嵌合抗原受体修饰的免疫细胞；较佳地，所述免疫细胞包括：T淋巴细胞、NK细胞或者NKT淋巴细胞。
10.一种多功能免疫辍合物，其特征在于，所述的多功能免疫辍合物包括：
权利要求1-5任一所述的抗体；以及
与之连接的功能性分子；所述的功能性分子选自：靶向肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物。
11.如权利要求10所述的多功能免疫辍合物，其特征在于，其中，所述的抑制肿瘤的分子为抗肿瘤的细胞因子或抗肿瘤的毒素，较佳的，所述的细胞因子包括：IL-12、IL-15、I型干扰素、TNF-alpha。
12.如权利要求10所述的多功能免疫辍合物，其特征在于，所述的靶向免疫细胞的表面标志物的分子是结合免疫细胞表面标志物的抗体或配体；较佳地，所述的免疫细胞表面标志物包括：CD3，CD16，CD28，更佳的，所述的结合免疫细胞表面标志物的抗体是抗CD3抗体。
13.如权利要求12所述的多功能免疫辍合物，其特征在于，所述的靶向免疫细胞的表面标志物的分子是结合T细胞表面标志物的抗体。
14.编码权利要求10-13任一所述的多功能免疫辍合物的核酸。
15.权利要求10-13任一所述的多功能免疫辍合物的用途，用于制备抗肿瘤药物，或
用于制备诊断肿瘤的试剂，该肿瘤表达BCMA；或
用于制备嵌合抗原受体修饰的免疫细胞；较佳地，所述免疫细胞包括：T淋巴细胞、NK细胞或者NKT淋巴细胞。
16.嵌合抗原受体，包含胞外域、跨膜域及胞内信号域，其特征在于，所述胞外域包含权利要求1-5任一所述的抗体，该抗体优选单链抗体或结构域抗体。
17.根据权利要求16所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号域包含一个或多个共刺激信号域和/或初级信号域。
18.根据权利要求16所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括铰链域。
19.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，其特征在于，
所述的跨膜域选自TCR的alpha、beta、zeta链，CD3ε，CD3ζ，CD4，CD5,CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD152，CD154，和PD1的跨膜区；和/或
所述共刺激信号域选自CARD11，CD2，CD7，CD27，CD28，CD30，CD40，CD54，CD83，OX40，CD137，CD134，CD150，CD152，CD223，CD270，PD-L2，PD-L1，CD278，DAP10，LAT，NKD2C SLP76，TRIM，FcεRIγ，MyD88，和41BBL的胞内信号区；和/或
所述初级信号域选自TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε，CD5，CD22，CD79a，CD79b，CD278(也称作“ICOS”)和CD66d，和CD3ζ，
更佳的，
所述的跨膜域选自CD8α，CD4，CD45，PD1，CD154和CD28的跨膜域；和/或
所述共刺激信号域选自CD137，CD134，CD28和OX40；和/或
所述初级信号域选自CD3ζ，
最优的，所述的跨膜域选自CD8α或CD28，所述共刺激信号域选自CD137或CD28的胞内信号域，所述初级信号域选自CD3ζ。
20.如权利要求16所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包括如下的顺序连接的抗体，跨膜区和胞内信号区：
权利要求1-5任一所述的抗体、CD8的跨膜区和CD3ζ；
权利要求1-5任一所述的抗体、CD8的跨膜区、CD137的胞内信号区和CD3ζ；
权利要求1-5任一所述的抗体、CD28的跨膜区、CD28的胞内信号区和CD3ζ；或
权利要求1-5任一所述的抗体、CD28的跨膜区、CD28的胞内信号区、CD137和CD3ζ。
21.编码权利要求16-20中任一所述的嵌合抗原受体的核酸。
22.一种表达载体，其特征在于，其包含权利要求21所述的核酸。
23.一种病毒，其特征在于，所述的病毒包含权利要求22所述载体。
24.权利要求16-20任一所述的嵌合抗原受体、或权利要求21所述的核酸、或权利要求22所述的表达载体、或权利要求23所述的病毒的用途，用于制备靶向表达BCMA的肿瘤细胞的基因修饰的免疫细胞。
25.一种基因修饰的免疫细胞，其特征在于，其转导有权利要求21所述的核酸，或权利要求22所述的表达载体或权利要求23所述的病毒；或其表达有权利要求16-20中任一所述的嵌合抗原受体，
所述的免疫细胞优选自T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞。
26.如权利要求25所述的基因修饰的免疫细胞，其特征在于，还表达有除权利要求16-20中任一所述的嵌合抗原受体之外的其他序列，所述其他序列包括细胞因子、或另一种嵌合抗原受体、或趋化因子受体、或降低PD-1表达的siRNA、或阻断PD-L1的蛋白、或TCR、或安全开关；
较佳地，所述的细胞因子包括IL-12、IL-15、IL-21、或I型干扰素；
较佳地，所述趋化因子受体包括CCR2、CCR5、CXCR2、或CXCR4；
较佳地，所述安全开关包括iCaspase-9、Truancated EGFR或RQR8。
27.权利要求25-27中任一所述的基因修饰的免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备抑制肿瘤的药物，所述的肿瘤是表达BCMA的肿瘤。
28.药物组合物，其特征在于，其包括：
权利要求1-5中任一所述的抗体或编码该抗体的核酸；或
权利要求10-15中任一所述的免疫辍合物或编码该辍合物的核酸；或
权利要求16-20中任一所述的嵌合抗原受体或编码该嵌合抗原受体的核酸；或
权利要求25-26任一所述的基因修饰的免疫细胞。
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