CN104395463A - T细胞受体缺陷型t细胞组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及修饰的T细胞，制备和使用分离的、修饰的T细胞的方法以及使用所述分离的、修饰的T细胞来解决疾病和病症的方法。在一个实施方案中，本发明广义上涉及TCR缺陷型T细胞、其分离群体以及包含它们的组合物。在本发明的另一个实施方案中，所述TCR缺陷型T细胞被设计成表达功能性非TCR受体。本发明还涉及制备所述TCR缺陷型T细胞的方法，和使用所述TCR缺陷型T细胞、其群体或包含它们的组合物来减少或改善或预防或治疗疾病和病症的方法。

Description

T细胞受体缺陷型T细胞组合物

本发明在美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的合同号CA 130911的政府支持下进行。政府享有本发明的某些权利。

相关申请的交叉引用

本申请是2012年4月19日提交的美国专利申请号13/502,978的部分继续申请，该申请是2010年10月29日提交的国际专利申请号PCT/US2010/54846的国家阶段申请，其要求2009年10月29日提交的美国临时专利申请号61/255,980的优先权权益，所述申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。

发明背景

发明领域

本发明涉及TCR缺陷型T细胞、制备和使用TCR缺陷型T细胞的方法以及使用这些TCR缺陷型T细胞来解决疾病和病症的方法。在一个实施方案中，本发明广义上涉及TCR缺陷型T细胞、其分离群体以及包含它们的组合物。在本发明的另一个实施方案中，所述TCR缺陷型T细胞被进一步设计成表达功能性非TCR受体。本发明还涉及制备所述TCR缺陷型T细胞的方法和使用所述TCR缺陷型T细胞、其群体或包含它们的组合物来减少或改善或预防或治疗疾病和病症的方法。

相关技术描述

全球癌症负担在1975年与2000年之间加倍，并且癌症被预期到2010年成为世界范围内死亡的主要原因。根据美国癌症协会，预计到2020年再次加倍并且到2030年达到三倍。因此，需要更有效的疗法来治疗各种形式的癌症。理想地，任何癌症疗法应是有效的(杀死癌细胞)、靶向的(即选择性的，以避免杀死健康细胞)、永久的(以避免复发和转移)和可负担得起的。护理大多数癌症的目前标准无法满足这些标准中的一些或全部。

细胞免疫疗法已显示产生特异性肿瘤消除并且具有提供特异性和有效癌症疗法的潜力(Ho,W.Y.等2003.Cancer Cell 3:1318-1328；Morris,E.C.等2003.Clin.Exp.Immunol.131:1-7；Rosenberg,S.A.2001.Nature 411:380-384；Boon,T.和P.van der Bruggen.1996.J.Exp.Med.183:725-729)。T细胞由于其选择性识别和强大的效应机制而经常一直是用于癌症免疫疗法的选择的效应细胞。T细胞使用其T细胞受体(TCR)来识别在自身主要组织相容性复合物(MHC)背景下源自内部细胞蛋白质的特异性肽。

本领域公认TCR复合物通过二聚体形成和这些二聚体(TCR-α/β，CD3-γ/ε、CD3-δ/ε和CD3-ζ二聚体)缔合成可输出到细胞表面的一种TCR复合物来以精确方式缔合。任何这些复合物不能适当地形成将抑制TCR组装和表达(Call,M.E.等,(2007)Nature Rev.Immunol.,7:841-850；Call,M.E.等,(2005)Annu.Rev.Immunol.,23:101-125)。

相应TCR链中的特定氨基酸残基已被鉴别为对于正确二聚体形成和TCR组装来说重要的。具体地说，对于TCR-α来说，跨膜部分中的这些关键氨基酸是精氨酸(用于与CD3-ζ缔合)和赖氨酸(用于与CD3-ε/δ二聚体缔合)。对于TCR-β来说，跨膜部分中的关键氨基酸是赖氨酸(用于与CD3-ε/γ二聚体缔合)。对于CD3-γ来说，跨膜部分中的关键氨基酸是谷氨酸。对于CD3-δ来说，跨膜部分中的关键氨基酸是天冬氨酸。对于CD3-ε来说，跨膜部分中的关键氨基酸是天冬氨酸。对于CD3-ζ来说，跨膜部分中的关键氨基酸是天冬氨酸(Call,M.E.等,(2007)Nature Rev.Immunol.,7:841-850；Call,M.E.等,(2005)Annu.Rev.Immunol.,23:101-125)。

源自肿瘤中改变的或突变的蛋白质的肽可由特异性TCR识别。若干关键研究已导致与特定肿瘤相关的抗原的鉴别，所述抗原一直能够诱导患者中的有效细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答(Ribas,A.等2003.J.Clin.Oncol.21:2415-2432)。T细胞效应机制包括直接杀死肿瘤细胞的能力和产生活化其它宿主免疫细胞并且改变局部肿瘤微环境的细胞因子。理论上，T细胞能够鉴别并破坏表达单一突变肽的肿瘤细胞。使用对MART1或gp100具有特异性的CTL克隆与低剂量IL-2的过继性免疫疗法已有效降低或稳定一些患者中的肿瘤负担(Yee,C.等2002.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:16168-16173)。其它方法使用具有限定抗肿瘤受体的T细胞。这些方法包括用识别肿瘤肽和MHC、源自偶联至适当信号传导元件的单链抗体片段(scFv)的嵌合抗原受体(CARS)的新的抗原特异性T细胞受体来遗传修饰CTL或使用嵌合NK细胞受体(Ho,W.Y.等2003.Cancer Cell 3:431-437；Eshhar,Z.等1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:720-724；Maher,J.和E.T.Davies.2004.Br.J.Cancer 91:817-821；Zhang,T.等2005.Blood 106:1544-1551)。

基于细胞的疗法用于常规化学疗法或辐射治疗已失败或已复发(经常已尝试多于一种类型的疗法)的患者中。来自可能已经历几轮化学疗法的患有晚期癌症的患者的免疫细胞不如健康个体一样稳健地应答。此外，癌症患者经常是老年人并且可能患有其它疾病，所述其它疾病可限制其免疫细胞成为引发的效应细胞的潜力，甚至在体外活化和扩增之后。另外，每个癌症患者必须提供足够数量的其自身免疫细胞以便使所述免疫细胞被工程化来表达新的免疫受体。因为每种疗法必须针对患者进行定制，所以这一过程从作出决定进行所述疗法的时间起需要数周；同时，癌症继续生长。美国专利申请公布号US2002/0039576公开了一种用于调节T细胞活性的方法，其中所使用的T细胞具有CD3⁺-αβ-TcR⁺CD4^-CD8^-CD28^-NK1.1^-的表型。美国专利申请公布号US 2006/0166314公开了使用突变T细胞来治疗癌症，其中所述T细胞是具有T细胞应答介导的MDM2蛋白质特异性αβ-T细胞受体的T细胞。

癌症不是其中T细胞操作可为有效疗法的唯一疾病。已知T细胞上的活性T细胞受体对于刺激免疫系统活性的身体应答来说是关键的。例如，已显示T细胞受体多样性在移植物抗宿主病(GVHD)、特别是慢性GVHD中起作用(Anderson等(2004)Blood 104:1565-1573)。事实上，施用T细胞受体抗体已显示减少急性GVHD的症状(Maeda等(2005)Blood 106:749-755)。

仍然需要用于治疗某些疾病和病症的更有效的基于T细胞的疗法和基于设计新的T细胞类型的治疗方法。

发明概述

在一个实施方案中，本发明广义上涉及不表达功能性T细胞受体(TCR)的分离的、修饰的T细胞。在这个实施方案中，T细胞是在功能性TCR表达中缺乏TCR。在本发明的另一个实施方案中，TCR缺陷型T细胞被工程化以表达功能性非TCR受体，例如像嵌合受体。这些细胞还充当平台以允许其它靶向受体(例如可适用于特定疾病的受体)的表达，同时保留T细胞的效应子功能，但无有功能的TCR。

本发明考虑TCR缺陷型T细胞群体以及包含它们的组合物。本发明还考虑制备所述TCR缺陷型T细胞的方法和使用所述TCR缺陷型T细胞、其群体或包含它们的治疗性组合物来减少或改善或预防或治疗疾病和病症的方法。在一个实施方案中，所述组合物可用于治疗癌症、感染、一种或多种自身免疫性病症、放射病或用于预防或治疗经历移植手术的受试者中的移植物抗宿主病(GVHD)或移植排斥。

附图简述

图1示出本文所描述的嵌合NK受体。指示了细胞外(EC)部分、跨膜(TM)部分和细胞质(Cyp)部分。指示了所述受体的野生型(WT)形式和嵌合(CH)形式，其中NH₂指代N末端并且COOH指代C-末端。

图2示出TIM在与同种异体PBMC一起培养过程中减少人T细胞中的TCR识别和功能。图(A)示出与同种异体PMBC一起培养的TIM转导的T细胞具有IFN-γ产生的减少。示出总IFN-γ产生。图(B)示出在减去自体IFN-γ量之后的IFN-γ量。这一值表示通过识别同种异体PBMC产生的特异性IFN-γ。

图3示出使用癌症的重组靶向受体活化表达TIM的T细胞。识别许多类型的肿瘤细胞上的特异性配体的共表达嵌合NKG2D受体(chNKG2D)的表达TIM的T细胞在与RPMI8226骨髓瘤肿瘤细胞共培养之后产生增加量的IFN-γ。在一些孔中，包括封闭性NKG2D mAb以防止chNKG2D识别所述肿瘤细胞上的其配体，并且这证明这些T细胞中chNKG2D受体的特异性应答。

优选实施方案详述

定义

应了解，本发明不限于所描述的具体方法、方案、细胞系、动物种或属以及试剂，因为所述这些可以改变。还应了解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的而不意图限制本发明的范围，本发明的范围将仅受所附权利要求书限制。

除非上下文另外清楚地指明，否则如本文所用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数对象。因此，例如，提及“一个细胞”包括了多个此类细胞并且提及“所述蛋白质”包括了提及一种或多种蛋白质以及其为本领域技术人员所已知的等效物，诸如此类。除非另外清楚地指明，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

在本发明的上下文中，“TCR缺陷型T细胞”或类似短语意图是缺乏功能性TCR表达的一个或多个分离的T细胞，内在地能够抑制其自身TCR产生，并且此外其中所述一个或多个T细胞的子代也可被合理地预期内在地能够抑制其自身TCR产生。内在能力在其中TCR更新时标(约数小时)比可证实的功效时标(数天至数月)快得多的疗法的背景下是重要的，即需要内在能力来在治疗周期过程中维持所需表型。这例如可通过如下文所描述的不同方式完成，例如，通过工程化T细胞以使得它在其细胞表面上不表达任何功能性TCR，或通过工程化所述T细胞以使得它不表达包含功能性TCR的一个或多个亚基并且因此不产生功能性TCR，或通过工程化T细胞以使得它在其表面上产生非常少的功能性TCR，或其表达大体上受损的TCR，例如通过工程化所述T细胞以表达突变或截短形式的包含所述TCR的一个或多个亚基，从而使所述T细胞不能表达功能性TCR或产生表达大体上受损的TCR的细胞。包含功能性TCR的不同亚基在下文进行了描述。细胞是否表达功能性TCR可使用已知测定方法如本文所描述的本领域已知的测定方法来确定。使用“大体上受损的TCR”，申请人意指这种TCR大致上将不能引出宿主中的不利免疫反应，例如GVHD反应。

如在下文中所详细描述，任选地这些TCR缺陷型细胞可被工程化以包含其它突变或转基因，例如，影响T细胞生长或增殖的突变或转基因；导致所需基因或基因构建体的表达或表达不存在，例如，另一受体或细胞因子或其它免疫调节或治疗性多肽或选择标记，如显性选择标记基因，例如DHFR或新霉素转移酶。

“同种异体T细胞”是指来自具有匹配接受者的组织HLA类型的供体的T细胞。通常，匹配是在HLA基因的三个或更多个基因座处的变异性的基础上进行，并且这些基因座处的完全匹配是优选的。在一些情况下，同种异体移植物供体可以是相关的(通常是密切HLA匹配的同胞)、同系的(患者的单卵“相同”双胎)或不相关的(不相关并且被发现具有非常接近的HLA匹配程度的供体)。HLA基因属于两个类别(I型和II型)。一般来说，I型基因(即HLA-A、HLA-B或HLA-C)的错配增加移植排斥的风险。HLA II型基因(即HLA-DR或HLA-DQB1)的错配增加移植物抗宿主病的风险。

在本发明的上下文中，“组织匹配的TCR缺陷型T细胞库”是指各自含有特定HLA同种异型的T细胞的不同组合物，所述组合物根据本发明被致使为TCR缺陷型的。理想地，所述库将包含含有广泛范围的为人群体的代表性的不同HLA类型的T细胞的组合物。工程化TCR缺陷型T细胞的所述库将是有用的，因为它将促进适用于不同接受者例如像癌症患者中的T细胞的利用率。本发明提供产生具有不同HLA单元型的TCR缺陷型T细胞库的方法。所述方法包括获得具有限定HLA单元型的分离T细胞的池，所述HLA单元型通过标准分型工序(例如，抗体、PCR或DNA测序)来确定；以及在这些T细胞中表达TCR抑制分子(TIM)，所述TCR抑制分子通过减少或阻断TCR复合物的组分的表达而使所述TCR复合物不稳定。针对从具有不同HLA单元型的多种不同个体获得的T细胞进行这一点。表达TIM的不同供体T细胞的这种合集包含TCR缺陷型T细胞库。所述T细胞库包含不同T细胞池，所述池各自含有特定HLA类型的TCR缺陷型T细胞。优选地，所述T细胞库包含多种不同的HLA类型，例如，至少10种不同的HLA组织类型、至少50种不同的HLA组织类型、至少100种不同的HLA组织类型。在一个实施方案中，所述T细胞库包含至少10种不同的HLA组织类型的T细胞。在另一个实施方案中，所述T细胞库包含至少100种不同的HLA组织类型的T细胞。

在本发明的上下文中，“治疗有效量”由本领域技术人员鉴别为当施用至患者时减轻疾病(例如，癌症、感染或GVHD)的病征和或症状的TCR缺陷型T细胞的量。有待施用的实际量可基于体外或体内进行的研究来确定，在所述研究中功能性TCR缺陷型T细胞表现出针对疾病的药理学活性。例如，所述功能性TCR缺陷型T细胞可在体外或体内抑制肿瘤细胞生长并且抑制所述生长的功能性TCR缺陷型T细胞的量被鉴别为治疗有效量。

“药物组合物”是指适合于向哺乳动物施用的化学或生物组合物。所述组合物可经过特定配制以经由许多途径中的一种或多种来施用，所述途径包括但不限于经颊、动脉内、心内、脑室内、皮内、肌肉内、眼内、腹膜内、脊柱内、鞘内、静脉内、口服、胃肠外、经由灌肠剂或栓剂而经直肠、皮下、真皮下、舌下、经皮、以及经粘膜。另外，施用可借助于注射剂、液体、凝胶剂、滴剂或其它施用方式来发生。

如本文所用，核酸构建体或核酸序列意图指可转化或引入至T细胞中并且可转录和翻译以产生产物(例如，嵌合受体或自杀性蛋白质)的DNA分子。

当使核酸与另一个核酸序列处于某种功能关系时，所述核酸是“可操作地连接”的。例如，如果信号序列的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白，那么所述信号序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么所述启动子或增强子与所述序列可操作地连接。一般来说，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列为毗连的，并且在分泌前导序列的情况下为毗连的且处于阅读框中。然而，增强子不必是毗连的。通过在适宜的限制性位点处连接或作为替代方案经由本领域技术人员熟悉的PCR/重组方法(技术；Invitrogen,Carlsbad California)来实现连接。如果不存在所述位点，那么根据常规惯例使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

本发明考虑用于减少或改善或预防或治疗疾病或病状如癌症、传染性疾病、GVHD、移植排斥、一种或多种自身免疫性病症或放射病的组合物和方法。在非限制性实施方案中，所述组合物是基于以下概念：提供可在患者需要之前且廉价地制造的分离的人T细胞(即TCR缺陷型T细胞)的同种异体来源。使用良好控制的过程在单个位点处产生单一治疗产物的能力就成本考虑和质量考虑两者而言是有吸引力的。T细胞的从自体至同种异体来源的变化提供显著优点。例如，据估计单个健康供体可提供在转导和扩增之后足以治疗许多患者的T细胞。

根据本发明，产生修饰的同种异体T细胞，所述T细胞不表达功能性T细胞受体(TCR)。应理解，TCR亚基/二聚体中的一些或甚至全部可在细胞表面上表达，但所述T细胞不表达足够的功能性TCR来在宿主中诱导不希望的反应。在其表面上无功能性TCR的情况下，同种异体T细胞不能发动针对宿主细胞的不希望的免疫应答。因此，这些TCR缺陷型T细胞不能造成例如GVHD，因为它们不能识别宿主MHC分子。另外，这些TCR缺陷型T细胞可被工程化以同时表达功能性、非TCR、疾病特异性受体。

如本领域技术人员所熟知，各种方法容易地可供用于从受试者分离同种异体T细胞。例如，使用细胞表面标记表达或使用可商购的试剂盒(例如，来自Pierce的ISOCELL^TM,Rockford,Ill.)。

对于癌症疗法来说，所述方法涵盖产生(例如所需组织同种异型的)TCR缺陷型的效应性T细胞的分离池，所述T细胞不表达其内源性TCR的功能形式或与野生型T细胞相比表达显著降低水平的内源性TCR以使得它们在施用时不会引出免疫应答(如GVHD)，而相反表达识别肿瘤细胞的功能性非TCR受体或表达不会明显地或根本不会攻击非疾病相关细胞的另一种多肽，所述非疾病相关细胞是例如不表达由肿瘤特异性受体识别的抗原或配体或相对于肿瘤细胞以降低的水平表达所述抗原或配体的正常(非肿瘤发生的)细胞。本领域技术人员将理解，某些肿瘤相关抗原在非癌组织中表达，但它们是荷瘤宿主中的可行治疗靶标。关于这一点，本领域技术人员通常理解的是，某些非TCR、肿瘤特异性受体在非癌组织中表达，但是荷瘤宿主中的可行治疗靶标，因为它们可在正常细胞中以与肿瘤细胞相比显著降低的水平表达。

虽然对于主题TCR缺陷型T细胞的大多数治疗性用途来说不必要，但在一些情况下，可能希望在供体T细胞已介导其抗肿瘤作用之后不久从宿主去除所述T细胞中的一些或全部。这可通过工程化所述T细胞以表达另外受体或标记(如GFP等)来促进，所述受体或标记有助于其在宿主中的去除和/或鉴别。虽然本发明应大体上消除接受者中的GVHD或其它不利免疫反应的任何可能性，但这可能在一些个体中是所需的。这不应危害功效，因为已经显示供体T细胞不需要长期保持在宿主中来启动长期抗肿瘤作用(Zhang,T.,等2007.Cancer Res.67:11029-11036；Barber,A.等2008.J.Immunol.180:72-78)。

在本发明的一个实施方案中，引入工程化T细胞中的核酸构建体进一步含有自杀性基因，如分别通过更昔洛韦(gancyclovir)、AP1903或5-氟胞嘧啶活化的I型HSV病毒(疱疹病毒)的胸苷激酶(TK)(Bonini,等(1997)Science 276:1719-1724)、基于Fas的“人工自杀性基因”(Thomis,等(2001)Blood 97:1249-1257)或大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因。自杀性基因有利地包括于本发明的核酸构建体中以提供在毒性情况下消除转导的T细胞并且一旦肿瘤已减少或消除就破坏嵌合构建体的机会。使用自杀性基因用于消除转化的或转导的细胞是本领域中熟知的。例如，Bonini,等((1997)Science 276:1719-1724)教导用HSV-TK自杀性基因转导的供体淋巴细胞在患者中提供抗肿瘤活性长达一年并且转导细胞的消除是使用更昔洛韦来实现。此外，Gonzalez,等，((2004)J.Gene Med.6:704-711)描述用遗传修饰以表达对L1-CAM上的表位具有特异性的嵌合scFvFc:ζ免疫受体的细胞毒性T淋巴细胞克隆来靶向成神经细胞瘤，其中所述构建体进一步表达潮霉素胸苷激酶(HyTK)自杀性基因以消除转基因克隆。

考虑自杀性基因可从与shRNA、小基因或非TCR受体相同的启动子或从不同启动子表达。然而，通常，编码自杀性蛋白质和shRNA、小基因或非TCR受体的核酸序列位于同一构建体或载体上。从与shRNA、小基因或非TCR受体相同的启动子表达自杀性基因可使用任何熟知的内部核糖体进入位点(IRES)来完成。可用于本发明的核酸构建体中的适合IRES序列包括但不限于，来自EMCV、c-myc、FGF-2、脊髓灰质炎病毒和HTLV-1的IRES。仅作为举例，用于表达嵌合受体的核酸构建体可具有以下结构：启动子->嵌合受体->IRES->自杀性基因。或者，可从与嵌合受体的启动子不同的启动子表达自杀性基因(例如，启动子1->嵌合受体->启动子2->自杀性基因)。

由于T细胞用于细胞疗法的广泛应用以及本发明的T细胞的改进的性质，所以本发明涵盖其中T细胞是治疗上令人希望的任何方法或组合物。所述组合物和方法包括用于减少或改善、或预防或治疗癌症、GVHD、移植排斥、感染、一种或多种自身免疫性病症、放射病或其它疾病或病状的那些，所述组合物或方法基于使用源自同种异体来源的缺乏功能性TCR表达的T细胞。

如所指示，本发明的其它实施方案包括所述TCR缺陷型T细胞中的受体(如嵌合NKG2D、嵌合Fv结构域、NKG2D或任何其它受体)的重组表达，以启动T细胞的信号，从而产生有效的、特异性效应性T细胞。本领域的技术人员能够基于有待治疗的疾病来选择待由TCR缺陷型T细胞表达的适当受体。例如，可由TCR缺陷型T细胞表达以用于治疗癌症的受体将包括已在癌细胞上被鉴别的配体的任何受体。所述受体包括但不限于，NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、LLT1、AICL、CD26、NKRP1、NKp30、NKp44、NKp46、CD244(2B4)、DNAM-1以及NKp80。

在本发明的另一个实施方案中，所述受体包括但不限于包含从NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、LLT1、AICL、CD26、NKRP1、NKp30、NKp44、NKp46、CD244(2B4)、DNAM-1以及NKp80获得的配体结合结构域，或抗肿瘤抗体如抗Her2neu或抗EGFR，以及从CD3-ξ、Dap10、CD28、41BB和CD40L获得的信号传导结构域的嵌合受体。示例性嵌合受体是chNKG2D，其中NKG2D连接至CD3ξ的细胞质结构域，并且与Dap10缔合以向T细胞提供第一和第二活化信号两者(Zhang,T.等2006.Cancer Res.66(11):5927-5933)。在本发明的一个实施方案中，嵌合受体结合MIC-A、MIC-B、Her2neu、EGFR、间皮素、CD38、CD20、CD19、PSA、MUC1、MUC2、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17、MUC19、MUC20、雌激素受体、黄体酮受体、RON、或ULBP/RAET1家族的一个或多个成员，包括ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6。

在本发明的方法中，患有癌症、GVHD、移植排斥、感染、一种或多种自身免疫性病症或放射病的患者被施用治疗有效量的包含所述TCR缺陷型T细胞的组合物。在本发明的另一个实施方案中，施用治疗有效量的包含所述TCR缺陷型T细胞的组合物以预防、治疗或减少GVHD、移植排斥或癌症。

产生TCR缺陷型T细胞的方法

根据本发明稳定地缺乏功能性TCR表达的T细胞可使用多种方法来产生。T细胞内化、分选并且降解作为复合物的整个T细胞受体，其中静止T细胞中半衰期为约10小时并且刺激T细胞中半衰期为约3小时(von Essen,M.等2004.J.Immunol.173:384-393)。TCR复合物的适当功能需要适当化学计量比的组成TCR复合物的蛋白质。TCR功能还需要两种起作用的具有ITAM基序的TCRζ蛋白质。TCR在接合其MHC-肽配体之后的活化需要接合同一T细胞上的几个TCR，所述TCR都必须正确地信号传导。因此，如果用不正确地缔合或不能最佳地信号传导的蛋白质使TCR复合物不稳定，那么T细胞将不能变得活化足以开始细胞应答。

本发明的方法包括表达T细胞中的TCR抑制分子(TIM)以通过阻断TCR复合物的必需组分的表达和/或中断TCR表达或功能来使所述TCR复合物不稳定。存在不同种类的TIM，包括但不限于，小发夹RNA(shRNA)和显性失活抑制蛋白，例如，缺乏重要信号传导基序的截短蛋白质；促进抑制信号的KIR融合蛋白；以及具有破坏与其它TCR组分的正确缔合和/或正确信号传导的突变的蛋白质。通常，TIM可用于通过防止细胞表面上任何或非常少的功能性TCR的表达来产生TCR缺陷型T细胞，和/或促进细胞表面上大体上受损的TCR的表达。

如由下文实验性实施例的结果所示，本发明人已证实可使用TIM(例如，shRNA和/或显性失活抑制剂)中断或消除TCR表达或功能，从而产生TCR缺陷型T细胞。这类TCR缺陷型细胞系非常适合用于在用以治疗癌症和其它疾病和病症的基于T细胞的疗法中使用，如以下所描述。

在本发明的一个实施方案中，使用靶向编码原代T细胞中的特异性TCR(例如，TCR-α和TCR-β)和/或CD3链(例如，CD3ζ)的核酸的小发夹RNA(shRNA)消除TCR表达。通过阻断这些蛋白质中的一种或多种的表达，T细胞将不再产生TCR复合物的一种或多种关键组分，从而使TCR复合物不稳定并且防止功能性TCR的细胞表面表达。虽然一些TCR复合物可被再循环至细胞表面，shRNA将防止新的TCR蛋白产生，从而导致整个TCR复合物的降解和去除，从而产生具有功能性TCR表达的稳定缺乏的T细胞。

原代T细胞中的shRNA表达可使用任何常规表达系统，例如慢病毒表达系统来实现。虽然慢病毒适用于靶向静止原代T细胞，但不是所有T细胞将表达shRNA。这些T细胞中的一些可能不表达足够量的shRNA来允许TCR表达的足够抑制以改变T细胞的功能活性。因此，在病毒转导之后保留中等至高度TCR表达的T细胞可例如通过细胞分选或分离技术去除，以使得剩余的T细胞在细胞表面TCR或CD3方面有缺陷，从而能够扩增在功能性TCR或CD3表达方面有缺陷的T细胞的分离群体。

在本发明的非限制性实施方案中，示例性靶向shRNA已针对TCR复合物的关键组分进行设计，如以下所列出(表1)。

表1

^a参照登录号EU030678。

^b参照登录号AY247834。

^c参照登录号NM_000733。

^d参照登录号NM_000732。

^e参照登录号NM_000073。

^f参照登录号NM_000734。

可使用多种靶向shRNA单独地或一起靶向TCR-α、TCR-β、TCR-γ、TCR-δ、CD3-γ、CD3-δ、CD3-ε或CD3-ζmRNA。TCR-β和TCR-α链由可变部分和恒定部分组成。已针对这些TCR/CD3序列的恒定部分设计了几种靶向shRNA。shRNA中的一种或其组合可用于每个分子靶标以鉴别TCR表达的最有效的抑制剂。使用已确立的方案，每个shRNA构建体被克隆至例如pLko.1质粒或pSMc2载体中，其中表达受本领域中常规使用的启动子(例如，U6p启动子)控制。可筛选所得构建体并且通过测序针对准确度进行确认。shRNA表达质粒然后可与用于包装的包装质粒和包膜质粒一起转染至任何适合的宿主细胞(例如，293T)中。从健康供体分离原代人外周血单核细胞(PBMC)并且将其用低剂量可溶性抗CD3和例如25U/ml至50U/mlrhulL-2活化72小时。虽然不需要活化T细胞以用于逆转录病毒转导，但转导更有效地起作用并且允许细胞在IL-2中继续扩增。洗涤并且转导活化的细胞，例如，使用在30℃下的1小时自旋-感染，接着7小时静止期。

在本发明的另一个实施方案中，过表达显性失活抑制蛋白能够中断TCR表达或功能。在本发明的这一实施方案中，制备并入编码TCR组分(例如，TCR-α、TCR-β、CD3-γ、CD3-δ、CD3-ε或CD3-ζ)中的一种的多核苷酸的部分或全部的小基因，但所述小基因进行修饰以使得：(1)它缺乏蛋白质功能所需的关键信号传导基序(例如，ITAM)；(2)被修饰以使得它不会与其其它天然TCR组分正确地缔合；或(3)可正确地缔合但不结合配体(例如，截短的TCRβ小基因)。另外，小基因可被改变以包括抑制信号基序，例如，来自KIR蛋白质的细胞质结构域，所述抑制信号基序通过磷酸酶(例如SHP1和SHP2)的募集改变细胞信号传导并且促进抑制信号。

这些小基因还可编码充当鉴别过表达的小基因的手段的蛋白质的一部分。例如，含有抗CD19mAb的结合位点的编码截短的CD19蛋白的多核苷酸可与小基因可操作地连接，以使得表达所述小基因的所得到的细胞将表达所编码的蛋白质并且可用抗CD19mAb鉴别。这种鉴别使能够确定小基因表达的程度并分离表达所述蛋白质的细胞(并且因此缺乏功能性TCR)。

在本发明的一个实施方案中，缺乏一个或多个信号传导基序的小基因的过表达导致在TCR由相对细胞上的其MHC-肽配体接合时不能正确地信号传导的TCR复合物。在本发明的非限制性实施方案中，这种小基因(和所编码的多肽)的高表达在TCR组分缔合时胜过天然完全蛋白质，从而产生不能信号传导的TCR复合物。在本发明的另一个实施方案中，小基因包含编码缺乏信号传导所需的ITAM基序的完全或部分CD3-ζ、CD3-γ、CD3-δ或CD3-ε多肽的多核苷酸或可替代地由所述多核苷酸组成。CD3-ζ蛋白含有细胞质部分中的三个ITAM基序，并且在本发明的一个实施方案中，通过截短去除所有这些可抑制并入所述修饰的蛋白质的任何复合物中的正确TCR信号传导。参见，例如，表2中的TIM5-8，其对应于SEQ ID NO:72-79。所述构建体可并入ITIM或其它信号传导基序，所述信号传导基序已知通过磷酸酶(如SHP1和SHP2)的募集而改变细胞信号传导并且促进抑制信号。参见，例如，表2中的TIM9-13，其对应于SEQ ID NO:80-89。

在本发明的一个实施方案中，小基因包含编码具有突变(例如，单核苷酸改变)的完全或部分CD3-ζ、CD3-γ、CD3δ或CD3-ε多肽的多核苷酸，所述突变导致由所述多核苷酸编码的氨基酸的改变。参见，例如，表2中的TIM14-19，其对应于SEQ ID NO:90-101。

在本发明的另一个实施方案中，对小基因的过表达进行修饰以使得所编码的多肽能够与其天然配偶体中的一些但不是全部缔合，从而形成与正常蛋白竞争那些相关联的蛋白质。在本发明的另一个非限制性假设中，小基因(和所编码的多肽)的高水平表达超过天然配偶体蛋白质并且防止功能性TCR复合物的组装，这需要所有组分以适当的比率缔合和蛋白质-蛋白质相互作用。在本发明的另一个实施方案中，小基因包含或可替代地由以下组成：编码全长蛋白质(例如，TCR-α、TCR-β、CD3-γ、CD3-δ、CD3-ε或CD3-ζ)、但在编码蛋白质的跨膜部分中的氨基酸的序列中含有选定缺失的多核苷酸的全部或部分，所述氨基酸已知是与其它TCR/CD3蛋白质组装所需的。

在本发明的一个优选实施方案中，编码蛋白质的跨膜部分中的氨基酸(所述氨基酸已知是与其它TCR/CD3蛋白质组装所需的)的序列中的选定缺失包括但不限于：TCR-α跨膜区中位置5处的精氨酸残基；TCR-α跨膜区中位置10处的赖氨酸残基；TCR-β跨膜区中位置9处的赖氨酸残基；CD3-γ的跨膜区中的谷氨酸残基；CD3-δ-ε的跨膜区中的天冬氨酸残基；CD3-ε的跨膜区中的天冬氨酸残基；以及CD3-ζ的跨膜区中的天冬氨酸残基。

截短的TCR-α、TCR-β、TCR-γ或TCR-δ蛋白质的过表达产生不能结合MHC-肽配体的TCR复合物，并且因此将不起作用来活化T细胞。参见图2，图(A)和图(B)。在本发明的另一个实施方案中，小基因包含或可替代地由以下组成：编码这些蛋白质的整个细胞质部分和跨膜部分以及细胞外区的多个部分的多核苷酸，但缺乏编码第一细胞外结构域(即，含有配体结合位点的最外部结构域)的全部或部分的多核苷酸。在一个优选实施方案中，所述小基因多核苷酸不编码TCR-α链和TCR-β链的Vα多肽和Vβ多肽。在一个实施方案中，所述小基因多核苷酸可以可操作地连接至编码蛋白质表位标签(例如，CD19)的多核苷酸，从而允许表达这些基因的细胞的mAb鉴别。

在另一个实施方案中，可使用强病毒启动子来表达这些小基因，所述启动子如逆转录病毒的5’LTR、或CMV或SV40启动子。通常，这种启动子紧邻小基因的上游并且导致小基因mRNA的高表达。在另一个实施方案中，所述构建体编码处于同一启动子(之间使用例如IRES DNA序列)或另一启动子控制下的第二多核苷酸序列。所述第二多核苷酸序列可编码功能性非TCR受体，从而提供针对T细胞的特异性。所述多核苷酸的实例包括但不限于，嵌合NKG2D、嵌合NKp30、嵌合NKp46或嵌合抗Her2neu。在另一实施方案中，启动子-小基因被构建至逆转录病毒或其它适合的表达质粒中并且使用标准方法直接转染或转导至T细胞中(Zhang,T.等,(2006)Cancer Res.,66(11)5927-5933；Barber,A.等,(2007)Cancer Res.,67(10):5003-5008)。

在使用先前所讨论的任何方法病毒转导和扩增之后，使用如先前所描述的Miltenyi筛选柱(Barber,A.等,(2007)Cancer Res.,67(10):5003-5008)使用抗CD3mAb和磁珠将仍表达TCR/CD3的任何T细胞去除。随后将T细胞洗涤并且在IL-2(25U/ml)中培养3至7天，以允许效应细胞以与用于体内使用细胞类似的方式扩增。

TCRαβ和CD3的表达可通过流式细胞术和定量实时PCR(qRT-PCR)来进行评估。TCR-α、TCR-β、CD3ε、CD3-ζ和GAPDH(作为对照)mRNA的表达可使用与Sentman,C.L.等((2004)J.Immunol.173:6760-6766)中所使用的那些方法类似的方法、使用ABI7300实时PCR仪器和基因特异性引物通过qRT-PCR来进行分析。细胞表面表达的变化可使用对TCR-α、TCR-β,、CD3ε、CD8、CD4、CD5和CD45具有特异性的抗体来确定。

有可能单个shRNA种类可能并不足以抑制细胞表面上的TCR表达。在这种情况下，可同时使用多种TCR shRNA以靶向TCR复合物的多种组分。每种组分都是细胞表面处TCR复合物组装所需的，因此这些蛋白质中的一种的损失可导致细胞表面处TCR表达的损失。虽然一些或甚至所有TCR表达可仍保持，但正是受体功能决定受体是否诱导免疫应答。功能缺陷而不是完整细胞表面不存在是关键措施。一般来说，TCR表达越低，足够TCR交联可发生以通过TCR复合物导致T细胞活化的可能性越低。虽然具体实施方案包括靶向TCR-α、TCR-β和CD3-ε，但还可靶向TCR复合物的其它组分，如CD3-γ、CD3-δ或CD3-ζ。

从细胞表面去除TCR的主要目的是防止不相容的MHC等位基因的T细胞的活化。为了确定在每种shRNA或小基因构建体的情况下TCR表达的降低是否足以改变T细胞功能，可针对以下各项对T细胞进行测试：(1)细胞体外存活；(2)在丝裂霉素C处理的同种异体PBMC存在下的增殖；和(3)响应于同种异体PBMC、抗CD3mAb或抗TCR mAb的细胞因子产生。

为了测试细胞存活，将转导的T细胞在具有rhuIL-2(例如，25U/ml至50U/ml)的完全RPMI培养基中繁殖。将细胞在开始培养时以相似密度接种并且可去除样品以用于每日细胞计数和存活力持续7天或更多天。为了确定T细胞是否表达足够的TCR以诱导针对同种异体细胞的应答，将转导的T细胞或对照T细胞与丝裂霉素C处理的同种异体或同系PBMC一起培养(例如，以4:1比例)。将所述T细胞预负载CFSE，所述CFSE是在分裂之后在子代细胞之间均分的细胞可渗透染料。细胞分裂的程度可通过流式细胞术容易地确定。T细胞活化的另一个标志是细胞因子的产生。为了确定每种shRNA构建体是否抑制T细胞功能，将转导的T细胞与不同剂量的抗CD3mAb(1.6至5000ng/ml)一起培养。在24小时之后，收集不含细胞的上清液，并且通过ELISA量化所产生的IL-2和/或IFN-γ的量。PMA/离子霉素用作阳性对照以刺激T细胞，并且单独T细胞用作阴性对照。

评估了针对TCR复合物的关键组分(例如CD3-ε或CD3-ζ)设计的示例性TIM对效应T细胞功能的作用，所述TIM是例如，shRNA、截短的显性失活蛋白质、KIR融合显性失活蛋白质以及由于单核苷酸改变而具有改变的氨基酸序列的显性失活蛋白质，并且结果在以下表2中提供。这些结果证明TCR缺陷型T细胞可使用TIM产生。

有可能TCR-α或TCR-β组分的去除可允许TCR-γ/δT细胞的优先扩增。这些T细胞在血液中非常罕见，然而这些细胞的存在可用抗TCR-γ/δ抗体来确定。如果存在这些细胞的长出，那么可使用CD3-ε的靶向，其是细胞表面处的TCR-α/β和TCR-γ/δ两者的细胞表面表达所需的。IL-2和IFN-γ两者都是驱动T细胞扩增和巨噬细胞活化的关键效应细胞因子。因此，缺乏这些细胞因子的产生是功能失活的迹象。还可能测量其它细胞因子如TNF-α的变化。在消除TCR表达后T细胞存活的任何降低可通过将TCR缺陷型T细胞与PBMC一起培养来确定，所述PBMC更好地反映体内环境并且为T细胞存活提供支持。

产生表达功能性非T细胞受体的TCR缺陷型T细胞的方法

在本发明的另一个实施方案中，在功能性TCR表达方面稳定缺乏的T细胞表达功能性非TCR受体。在这个实施方案中，TCR功能的去除(如之前所描述)进一步与一种或多种外源非TCR靶向受体(例如像，嵌合NKG2D(chNKG2D)或Fv分子)的表达组合。这个实施方案提供“通用”细胞产物，所述细胞产物可被储存以用于患有任何类型的癌症的任何患者的未来治疗，其条件是采用适合的靶向受体。

本发明的其它实施方案包括所述TCR缺陷型T细胞中的受体(如chNKG2D、嵌合Fv结构域、NKG2D或任何其它受体)的重组表达，以启动T细胞的信号，从而产生有效的、特异性效应T细胞。本领域的技术人员能够基于有待治疗的疾病来选择待由TCR缺陷型T细胞表达的适当受体。例如，可由TCR缺陷型T细胞表达以用于治疗癌症的受体将包括已在癌细胞上被鉴别的配体的任何受体。所述受体包括但不限于，NKG2D(GENBANK登录号BC039836)、NKG2A(GENBANK登录号AF461812)、NKG2C(GENBANK登录号AJ001684)、NKG2F、LLT1、AICL、CD26、NKRP1、NKp30(例如，GENBANK登录号AB055881)、NKp44(例如，GENBANK登录号AJ225109)、NKp46(例如，GENBANK登录号AJ001383)、CD244(2B4)、DNAM-1以及NKp80。

在本发明的另一个实施方案中，所述受体包括但不限于包含从NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、LLT1、AICL、CD26、NKRP1、NKp30、NKp44、NKp46、CD244(2B4)、DNAM-1以及NKp80获得的配体结合结构域，或抗肿瘤抗体如抗Her2neu和抗EGFR，以及从CD3-ξ(CD3ξ)(例如，GENBANK登录号人NM__198053)(SEQ IDNO:62)、Dap10(例如，GENBANK登录号AF072845)、CD28、41BB和/或CD40L获得的信号传导结构域的嵌合受体。

在本发明的另一实施方案中，嵌合受体结合MIC-A、MIC-B、Her2neu、EGFR、间皮素、CD38、CD20、CD19、PSA、MUC1、MUC2、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17、MUC19、MUC20、雌激素受体、黄体酮受体、RON、或ULBP/RAET1家族的一个或多个成员，包括ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6。

仅作为说明，显示消除TCR复合物的细胞表面表达的shRNA或小基因通过一种或多种病毒载体与chNKG2D受体共表达。为了实现在一个载体中共表达，shRNA可由U6启动子驱动并且chNKG2D受体可由PGK启动子驱动。在另一个实施方案中，如果IRES序列用于分离遗传元件，则仅使用一种启动子。

特别适用于所述嵌合受体中的C型凝集素样NK细胞受体蛋白包括在自然杀伤细胞的表面上表达的受体，其中所述受体在与其一个或多个同源配体结合后改变NK细胞活化。所述受体可单独或与其它分子协同起作用。这些受体的配体通常在一种或多种肿瘤细胞类型的表面上表达，所述肿瘤细胞类型是例如，与结肠、肺、乳腺、肾、卵巢、宫颈和前列腺的癌症相关的肿瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；白血病；以及淋巴瘤(Wu,等(2004)J.Clin.Invest.114:60-568；Groh,等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:6879-6884；Pende,等(2001)Eur.J.Immunol.31:1076-1086)并且不在正常组织的细胞表面上广泛表达。

所述配体的实例包括但不限于，MIC-A、MIC-B、热激蛋白、ULBP结合蛋白(例如，ULPB 1-4)和非经典HLA分子如HLA-E和HLA-G，而经典MHC分子如HLA-A、HLA-B或HLA-C及其等位基因通常不被认为是本发明的C型凝集素样NK细胞受体蛋白的强配体。结合这些配体的C型凝集素样NK细胞受体通常具有II型蛋白质结构，其中所述蛋白质的N-末端是细胞内的。除了以上先前所列出的任何NK细胞受体外，这种类型的其它示例性NK细胞受体包括但不限于，Dectin-1(GENBANK登录号AJ312373或AJ312372)、肥大细胞功能相关的抗原(GENBANK登录号AF097358)、HNKR-P1A(GENBANK登录号U11276)、LLT1(GENBANK登录号AF133299)、CD69(GENBANK登录号NM__001781)、CD69同源物、CD72(GENBANK登录号NM__001782)、CD94(GENBANK登录号NM__002262或NM__007334)、KLRF1(GENBANK登录号NM__016523)、氧化LDL受体(GENBANK登录号NM__002543)、CLEC-1、CLEC-2(GENBANK登录号NM__016509)、NKG2D(GENBANK登录号BC039836)、NKG2C(GENBANK登录号AJ001684)、NKG2A(GENBANK登录号AF461812)、NKG2E(GENBANK登录号AF461157)、WUGSC:H_DJ0701016.2或骨髓DAP12-相关凝集素(MDL-1；GENBANK登录号AJ271684)。在本发明的一个优选实施方案中，所述NK细胞受体是人NKG2D(SEQ ID NO:58)或人NKG2C(SEQ ID NO:59)。

将适用于所述嵌合受体的相似I型受体包括NKp46(GENBANK登录号AJ001383)、NKp30(GENBANK登录号AB055881)或NKp44(GENBANK登录号AJ225109)。

作为C型凝集素样NK细胞受体蛋白的替代，与C型凝集素样NK细胞受体蛋白相关的蛋白质可用于所述嵌合受体蛋白中。一般来说，与C型凝集素样NK细胞受体相关的蛋白质被定义为与受体相互作用并自其转导信号的蛋白质。以这种方式起作用的适合人蛋白质进一步包括但不限于，DAP10(例如，GENBANK登录号AF072845)(SEQ ID NO:60)、DAP12(例如，GENBANK登录号AF019562)(SEQID NO:61)和FcRγ。

C型凝集素样NK细胞受体的N末端与具有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)(Asp/Glu)-Xaa-Xaa-Tyr*-Xaa-Xaa-(Ile/Leu)-Xaa_6-8-Tyr*-Xaa-Xaa-(Ile/Leu)(SEQ ID NO:55-57)的免疫信号传导受体融合，所述免疫信号传导受体通过免疫受体参与细胞应答的活化。类似地，当采用与C型凝集素样NK细胞受体相关的蛋白质时，免疫信号传导受体可与所述蛋白质的C-末端融合(图1)。用于本发明的嵌合受体中的适合免疫信号传导受体包括但不限于，T-细胞受体的ζ链，由于ζmRNA的选择性剪接而仅在其最C-末端外显子中不同于ζ链的

链，T细胞受体的δ、γ和ε链(CD3链)以及FcR1受体的γ亚基。在具体实施方案中，除先前所鉴别的免疫信号传导受体外，免疫信号传导受体是CD3-ζ(CD3ζ)(例如，GENBANK登录号人NM__198053和NM-000734)(分别SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:64)，或人Fcε受体-γ链(例如，GENBANK登录号M33195)(SEQ ID NO:63)或其胞质结构域或剪接变体。具体地说，例如，CD3-ζ具有编码不同同种型的2种选择性剪接的转录物变体，即，转录物变体1(SEQ IDNO:62)和转录物变体2(SEQ ID NO:64)。如与变体1相比，变体2(SEQ ID NO:65)的编码同种型缺失一种内部氨基酸。

在具体实施方案中，本发明的嵌合受体是NKG2D与CD3-ζ或Dap10与CD3-ζ之间的融合。

在本发明的核酸构建体中，启动子可操作地连接至编码本发明的嵌合受体的核酸序列，即它们被定位以便促进从编码所述嵌合受体的DNA转录信使RNA。启动子可具有基因组来源或可为合成产生的。用于T细胞中的多种启动子是本领域中熟知的(例如，由Marodon,等(2003)Blood 101(9):3416-23公开的CD4启动子)。启动子可以是组成型或诱导型的，其中诱导与特定细胞类型或特定成熟水平相关联。或者，多种熟知的病毒启动子也是适合的。目标启动子包括β-肌动蛋白启动子、SV40早期和晚期启动子、免疫球蛋白启动子、人巨细胞病毒启动子、逆转录病毒启动子以及弗兰德(Friend)脾病灶形成病毒启动子。启动子可以或可以不与增强子相关联，其中所述增强子可与特定启动子天然相关联或与不同启动子相关联。

编码嵌合受体的开放阅读框的序列可从基因组DNA来源、cDNA来源获得，或可以是合成的(例如，通过PCR),或其组合。取决于基因组DNA的大小和内含子的数目，可能希望使用cDNA或其组合，因为据发现内含子使mRNA稳定或提供T细胞特异性表达(Barthel和Goldfeld(2003)J.Immunol.171(7):3612-9)。此外，可能进一步有利地是使用内源性或外源性非编码区以使mRNA稳定。

对于本发明的嵌合受体的表达来说，编码所述嵌合受体的N-末端组分的核酸序列的天然存在的或内源转录起始区可用于在靶宿主中产生所述嵌合受体。或者，可使用外源转录起始区，所述区允许组成型或诱导型表达，其中可取决于靶宿主、所需的表达水平、靶宿主的性质等来控制表达。

同样地，引导嵌合受体至表面膜的信号序列可以是所述嵌合受体的N末端组分的内源信号序列。任选地，在一些情况下，可能需要将所述序列交换成不同的信号序列。然而，所选择的信号序列应为与T细胞的分泌途径相容的，以使得嵌合受体被呈递到T细胞的表面上。

类似地，终止区可由编码嵌合受体的C-末端组分的核酸序列的天然存在的或内源转录终止区提供。或者，终止区可源自不同来源。在大多数情况下，终止区的来源通常不被认为是对于重组蛋白的表达来说关键的，并且可采用多种多样的终止区而不会不利地影响表达。

如将由本领域技术人员所理解，在一些情况下，C型凝集素样自然杀伤细胞受体(或与其相关联的蛋白质)或免疫信号传导受体的端处的一些氨基酸可缺失，通常不超过10个、更通常不超过5个残基。此外，可能需要在边界处引入少量氨基酸，通常不超过10个、更通常不超过5个残基。氨基酸的缺失或插入将通常是由于构建需要，从而提供适宜的限制性位点、操作的方便性、表达水平的提高等。此外，用不同氨基酸取代一个或多个氨基酸可出于类似原因发生，通常在任一结构域中不取代超过约五个氨基酸。

编码嵌合受体的嵌合构建体可以常规方式来制备。因为在大多数情况下采用天然序列，所以在适当时所述天然基因被分离和操作(例如，当采用II型受体时，免疫信号传导受体组分可能必须反转)，以便允许不同组分的正确连接。因此，编码嵌合受体的N-末端和C-末端蛋白质的核酸序列可通过使用适当引物、采用聚合酶链式反应(PCR)来分离，所述引物导致基因的不想要的部分的缺失的。或者，克隆基因的限制性消化可用于产生嵌合构建体。在任一情况下，可选择序列以提供限制性位点，所述位点是平末端的或具有互补重叠。

用于制备嵌合构建体的各种操作可在体外进行，并且在具体实施方案中，使用标准转化或转染方法将嵌合构建体引入载体中以用于在适当宿主中克隆和表达。因此，在每次操作后，克隆来自DNA序列的连接的所得构建体，分离载体并且筛选序列以确保所述序列编码所需嵌合受体。所述序列可通过限制性分析、测序等来筛选。

考虑嵌合构建体可作为裸DNA引入T细胞中或引入适合载体中。使用裸DNA通过电穿孔稳定地转染T细胞的方法是本领域中已知的。参见，例如，美国专利号6,410,319。裸DNA通常是指编码本发明的嵌合受体的DNA，其以表达的正确定向包含于质粒表达载体中。有利地，使用裸DNA减少产生表达本发明的嵌合受体的T细胞所需的时间。

或者，病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)可用于将嵌合构建体引入T细胞中。用于根据本发明的方法使用的适合载体是在受试者的T细胞中非复制的。基于病毒的大量载体是已知的，其中维持在细胞中的病毒的拷贝数是足够低的，以维持细胞的存活力。示例性载体包括对pFB-neo载体(STRATAGENE^TM)以及基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。一旦确认转染的或转导的T细胞能够将嵌合受体表达为具有所需调控和在所需水平下的表面膜蛋白，就可确定所述嵌合受体是否在宿主细胞中具有功能性以提供所需信号诱导(例如，在用适当配体刺激后产生Rantes、Mip1-α、GM-CSF)。

如上所述，从健康供体分离原代人PBMC并且用低剂量可溶性抗CD3(例如40ng/ml)和rhulL-2(例如50U/ml)、抗CD3/抗CD28珠粒和rhuIL-2、或辐射处理的抗原呈递细胞和rhuIL-2活化。然后将活化的T细胞洗涤并且用逆转录病毒转导，例如，在32℃下离心孵育(spinoculation)1小时，接着7小时静止期。虽然不需要活化T细胞以用于慢病毒转导，但转导更有效并且细胞在IL-2中继续扩增。如本文所描述将活化的细胞洗涤和转导，接着是静止期和进行选择，例如，G418持续3天。在选择之后，将细胞洗涤并且在IL-2中培养2至7天，以允许效应细胞以与用于体内使用细胞类似的方式扩增。使用对CD3、CD4、NKG2D或CD5具有特异性的抗体对受体的细胞表面表达的变化进行分析。预期外源性非TCR受体的表达将在已转导以表达特定受体的细胞中增加，例如，用表达chNKG2D的逆转录病毒转导的T细胞预期具有增加的chNKG2D表面表达水平。

TCRαβ、CD3和NKG2D的表达可通过如本文所讨论的流式细胞术和定量qRT-PCR来评估。还可确定CD4+和CD8+T细胞的数目。总细胞数目和TCR复合物缺陷型、TCR组分以及表达chNKG2D的T细胞的百分比可通过流式细胞术来确定。可将这些数目与已用shRNA或单独chNKG2D基因(作为对照)转导的PBMC进行比较。仅载体转导的细胞也可被包括作为对照。

在病毒转导和扩增之后，可在Miltenyi柱上通过具有磁珠的mAb分离TCR+和TCR-细胞，并且鉴别和分离表达chNKG2D受体的TCR缺陷型T细胞。例如，chNKG2D表达可使用针对chNKG2D受体的特异性引物通过QRT-PCR来进行验证(Zhang,T.等(2007)Cancer Res.67:11029-11036；Barber,A.等(2008)J.Immunol.180:72-78)。这些TCR缺陷型chNKG2D+细胞的功能可通过将所述细胞与同种异体PBMC或表达NKG2D配体的肿瘤细胞一起培养来确定。T细胞增殖和细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或IL-2)可分别通过流式细胞术和ELISA来确定。为了确定所述T细胞是否已损失TCR功能并且保留chNKG2D功能，转导的T细胞或对照T细胞将与抗CD3(1.6至5000ng/ml)、丝裂霉素C-处理的同种异体PBMC或同系PBMC一起培养。收集细胞上清液，并且通过ELISA确定细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或IL-2)的程度。所述T细胞可预负载CFSE，所述CFSE是在分裂之后在子代细胞之间均分的细胞可渗透染料。细胞分裂的程度可通过流式细胞术容易地确定。

T细胞活化的另一个标志是细胞因子的产生。为了确定TCR缺陷型chNKG2D+细胞是否诱导T细胞活化，将所述T细胞与丝裂霉素C处理的同种异体PBMC、同系PBMC或肿瘤细胞：P815-MICA(表达人MICA的鼠肿瘤，NKG2D的配体)、P815、A2008(人卵巢肿瘤细胞，NKG2D配体+)和U266(人骨髓瘤细胞系，NKG2D配体+)一起共培养。在24小时之后，收集不含细胞的上清液，并且通过ELISA量化所产生的IL-2和IFN-γ的量。单独T细胞和与同系PBMC一起培养用作阴性对照。在表达TIM7和TIM8的T细胞中观察到IFN-γ产生的大于40％减少，所述T细胞还共表达chNKG2D(结果未在图3中示出)。

随后，将转导的T细胞再引入或施用至受试者以活化所述受试者中的抗肿瘤应答。为了有助于施用，根据本发明的转导的T细胞可与适当的载体或稀释剂一起制成药物组合物或制成适用于体内施用的植入物，所述载体或稀释剂进一步可是药学上可接受的。制备所述组合物或植入物的手段已在本领域中进行了描述(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Mack,编辑(1980))。在适当的情况下，转导的T细胞可以用于其各自给药途径的通常方式被配制成呈半固体或液体形式的制剂，如胶囊、溶液、注射液、吸入剂或气雾剂。可使用本领域中已知的手段来防止或最小化组合物的释放和吸收直到其到达靶组织或器官，或确保组合物的定时释放。然而，理想的是，采用不会影响表达嵌合受体的细胞的药学上可接受的形式。因此，理想的是转导的T细胞可被制成含有平衡盐溶液、优选Hanks平衡盐溶液或生理盐水的药物组合物。

使用TCR缺陷型T细胞改善或减少疾病和病症的症状或治疗或预防疾病和病症的方法

本发明还涉及使用本文所描述的TCR缺陷型T细胞、其分离群体或包含它们的治疗性组合物来减少或改善、或预防或治疗疾病和病症的方法。在一个实施方案中，本文所描述的TCR缺陷型T细胞、其分离群体或包含它们的治疗性组合物用于减少或改善、或预防或治疗癌症、感染、一种或多种自身免疫性病症、放射病，或用于预防或治疗经历移植手术的受试者中的移植物抗宿主病(GVHD)或移植排斥。

本文所描述的TCR缺陷型T细胞、其分离群体或包含它们的治疗性组合物适用于改变自身免疫性病或移植排斥，因为这些效应细胞可在发育期间在TGF-β中生长并且将分化以成为诱导的调节性T细胞。在一个实施方案中，功能性非TCR用于给予这些诱导的调节性T细胞功能特异性，所述功能特异性是它们在疾病的组织部位处执行其抑制功能所需的。因此，大量抗原特异性调节性T细胞被生长以用于在患者中使用。为调节性T细胞分化所必需的FoxP3的表达可通过流式细胞术进行分析，并且通过这些调节性T细胞获得的T细胞增殖的功能性抑制可在共培养后抗CD3刺激之后通过检查T细胞增殖的减少来进行分析。

本发明的另一个实施方案涉及使用本文所描述的TCR缺陷型T细胞、其分离群体或包含它们的治疗性组合物用于预防或治疗放射病。在放射治疗或暴露(例如脏弹曝光、辐射泄露)或消除骨髓细胞的其它条件(某些药物疗法)之后的一个挑战是重建造血系统。在经历骨髓移植的患者中，移植后第15天的绝对淋巴细胞计数与成功结果相关。具有高淋巴细胞计数的那些患者良好重建，因此重要的是具有良好的淋巴细胞重建。这种作用的原因尚不清楚，但它可能是由于淋巴细胞防止感染和/或有利于造血重建的生长因子的产生。

在这个实施方案中，本文所描述的TCR缺陷型T细胞、其分离群体或包含它们的治疗性组合物导致不能响应于同种异体MHC抗原的大量T细胞的产生。因此，这些T细胞可用于重建人并且提供保护免于感染，从而导致由于辐射暴露所致的患有全部或部分骨髓消除的人的更快自我重建。在灾难或意外暴露于高剂量辐射的情况下，具有另一种功能性受体的本文所描述的TCR缺陷型T细胞、其分离群体或包含它们的治疗性组合物可被快速输注至患者中以提供其免疫应答和生长因子产生的一些重建持续数天至数周，直到其自身造血细胞已重建他们本身，或直到所述人已用另外造血干细胞来源(例如骨髓移植)进行治疗。

技术人员将了解如何基于其使用其它类型的T细胞的经验来治疗癌症、感染、移植排斥、一种或多种自身免疫性病症、放射病、或GVHD。

除本文所描述的示例性TCR缺陷型chNKG2D+T细胞外，考虑TCR缺陷型T细胞可进行修饰或发展以表达适用于治疗如之前所描述的疾病如癌症或感染的其它功能性受体。简言之，本发明的治疗方法考虑使用表达功能性非TCR受体(如chNKG2D、嵌合Fv结构域、NKG2D或任何其它受体)的TCR缺陷型T细胞来启动T细胞的信号，从而产生有效的、特异性效应T细胞。本领域的技术人员能够基于有待治疗的疾病来选择待由TCR缺陷型T细胞表达的适当受体。例如，可由TCR缺陷型T细胞表达以用于治疗癌症的受体将包括结合已在癌细胞上被鉴别的配体的任何受体。所述受体包括但不限于，NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、LLT1、AICL、CD26、NKRP1、NKp30、NKp44、NKp46、CD244(2B4)、DNAM-1以及NKp80。

在本发明的另一个实施方案中，所述受体包括但不限于包含从NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、LLT1、AICL、CD26、NKRP1、NKp30、NKp44、NKp46、CD244(2B4)、DNAM-1以及NKp80获得的配体结合结构域，或抗肿瘤抗体如抗Her2neu和抗EGFR，以及从CD3ξ、Dap10、CD28、41BB和CD40L获得的信号传导结构域的嵌合受体。

在本发明的另一实施方案中，嵌合受体结合MIC-A、MIC-B、Her2neu、EGFR、间皮素、CD38、CD20、CD19、PSA、MUC1、MUC2、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17、MUC19、MUC20、雌激素受体、黄体酮受体、RON、或ULBP/RAET1家族的一个或多个成员，包括ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6。

本发明还包括表达非TCR病原体-相关受体的TCR缺陷型T细胞和使用表达所述病原体受体的TCR缺陷型T细胞来治疗或预防传染性疾病。在这个实施方案中，非TCR受体结合在受感染细胞的表面上存在的病毒抗原或病毒诱导的抗原。有待预防或治疗的感染例如可由病毒、细菌、原生动物或寄生虫引起。可被治疗的病毒包括但不限于，HCMV、EBV、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、埃博拉病毒、VSV、流感病毒、水痘病毒、腺病毒、单纯性疱疹病毒I型(HSV-1)、单纯性疱疹病毒2型(HSV-2)、牛瘟病毒、鼻病毒、埃可病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、棘状病毒(echinovirus)、虫媒病毒、汉坦病毒、柯萨奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、脊髓灰质炎病毒和/或人免疫缺陷病毒1型或2型(HIV-1，HIV-2)。可使用TCR缺陷型T细胞治疗的非病毒性感染包括但不限于，感染性葡萄球菌属、肠球菌属、炭疽杆菌、乳杆菌属、李斯特氏菌属、白喉棒状杆菌、诺卡氏菌属、链球菌属、假单胞菌属、加德纳氏菌属、链霉菌属、普通高温放线菌、密螺旋体属、弯曲杆菌属、铜绿假单胞菌属(Raeruginosa sp.)、军团菌属、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、脑膜败血性黄色杆菌(F.meningosepticum)、芳香黄杆菌(F.odoraturn)、布鲁氏菌属、百日咳博德特氏杆菌、支气管炎博德特菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、肠杆菌属、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、液化沙雷氏菌(S.liquefaciens)、爱德华氏菌属、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、链杆菌属、R.ickettsfi、鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体、结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、M.folluiturn、麻风分枝杆菌(M.laprae)、鸟分枝杆菌(M.avium)、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌(M.africanum)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、鼠麻风分枝杆菌(M.lepraernurium)、锥虫、衣原体或立克次氏体。

本发明的组合物的功效可取决于正在开发的药物产品的类型在最适当的体内模型系统中证实。医学文献提供关于各种这样的这类模型的优点和用途的详细公开内容。例如，存在许多不同类型的常规地用于检查针对癌症的药物的药理学活性或甚至体外肿瘤细胞生长的抑制的癌症模型，如异种移植物小鼠模型(例如，Mattern,J.等1988.Cancer Metastasis Rev.7:263-284；Macor,P.等2008.Curr.Pharm.Des.14:2023-2039)。在GVHD的情况下，存在急性GVHD(例如，He,S.等2008.J.Immunol.181:7581-7592)和慢性GVHD(例如，Xiao,Z.Y.等2007.Life Sci.81:1403-1410)两者的小鼠中的模型。

一旦本发明的组合物已显示在动物中体内有效，可基于在动物中显示是安全和有效的剂量来设计临床研究。本领域技术人员可使用如教科书中所描述的标准方案设计这类临床研究，所述教科书如Spilker(2000.Guide to Clinical Trials.Lippincott Williams & Wilkins:Philadelphia)。

施用

在本发明的一个实施方案中，将TCR缺陷型T细胞以约10⁶个至约10¹¹个细胞之间的量施用至受体受试者。在本发明的一个优选实施方案中，将TCR缺陷型T细胞以约10⁸个至约10⁹个细胞之间的量施用至受体受试者。在本发明的一个优选实施方案中，将TCR缺陷型T细胞以每二十六周一次或更少、如每十六周一次或更少、每八周一次或更少或每四周一次或更少的频率施用至受体受试者。

这些值提供在优化本发明的方法以用于实施本发明时待由实践者使用的转导T细胞的范围的一般指导。所述范围的本文叙述决不排除使用更高或更低剂量的组分，这在特定应用中可能被考虑。例如，可取决于所述组合物是否与其它药物组合物组合施用或取决于个体间药物代谢动力学、药物处置和代谢方面的差异改变实际剂量和方案。本领域技术人员可根据具体情况的紧急性容易地作出任何必要的调整。

本领域技术人员将能够基于本领域的教义或通过常规实验来确定有效的剂量和给药频率，例如由本文的公开内容和以下中的教义指导：Goodman,L.S.,Gilman,A.,Brunton,L.L.,Lazo,J.S.,& Parker,K.L.(2006).Goodman & Gilman's the pharmacological basisof therapeutics.New York:McGraw-Hill；Howland,R.D.,Mycek,M.J.,Harvey,R.A.,Champe,P.C.,& Mycek,M.J.(2006).Pharmacology.Lippincott's illustrated reviews.Philadelphia:Lippincott Williams & Wilkins；和Golan,D.E.(2008).Principles of pharmacology:the pathophysiologic basis of drug therapy.Philadelphia,Pa.,[等]:Lippincott Williams & Wilkins。给药方案可基于良好确立的基于细胞的疗法(参见，例如Topalian和Rosenberg(1987)Acta Haematol.78增刊1:75-6；美国专利号4,690,915)或可采用替代连续输注策略。

在本发明的另一个实施方案中，将TCR缺陷型T细胞以药物制剂形式施用至受试者。

在本发明的一个实施方案中，TCR缺陷型T细胞可任选地与一种或多种活性剂组合施用。此类活性剂包括止痛剂、解热剂、抗炎剂、抗生素、抗病毒剂和抗细胞因子剂。活性剂包括激动剂；拮抗剂；以及TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、IFN-α、IFN-γ、BAFF、CXCL13、IP-10、VEGF、EPO、EGF、HRG、肝细胞生长因子(HGF)、铁调素的调节剂，包括针对前述任一种具有反应性的抗体和针对其受体中的任一种具有反应性的抗体。活性剂还包括2-芳基丙酸、醋氯芬酸、阿西美辛、乙酰水杨酸(阿司匹林)、阿氯芬酸、阿明洛芬、阿莫西普林(Amoxiprin)、氨基安替比林、芳基链烷酸、阿扎丙酮、扑炎痛/贝诺酯、苯噁洛芬、溴芬酸、卡布洛芬、塞来昔布、三水杨酸胆碱镁、氯非宗、COX-2抑制剂、右布洛芬、右酮洛芬、双氯芬酸、二氟尼柳、屈噁昔康、乙水杨胺、依托度酸、依他昔布、Faislamine、芬那酸、芬布芬、非诺洛芬、氟芬那酸、氟诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、异丁普生、吲哚美辛、吲哚洛芬、酮保泰松、酮洛芬、酮咯酸、氯诺昔康、洛索洛芬、罗美昔布、水杨酸镁、甲氯芬那酸、甲芬那酸、美洛昔康、安乃近、水杨酸甲酯、莫非布宗、萘丁美酮、甲氧萘丙酸、N-芳基氨茴酸、神经生长因子(NGF)、奥沙美辛、奥沙普秦、昔康类、羟基保泰松、帕瑞昔布、非那宗、保泰松(Phenylbutazone)、保泰松、吡罗昔康、吡洛芬、普鲁芬、丙谷美辛、吡唑烷衍生物、罗非昔布、水杨酸水杨酸酯、水杨酰胺、水杨酸盐、苯磺唑酮、舒林酸、舒洛芬、替诺昔康、噻洛芬酸、托芬那酸、托美汀和伐地昔布。

抗生素包括阿米卡星、氨基糖苷类、阿莫西林、氨苄西林、安沙霉素类、胂凡纳明、阿奇霉素、阿洛西林、氨曲南、杆菌肽、碳头孢烯、碳青霉烯类、羧苄青霉素、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢噻吩、头孢孟多、头孢唑啉、头孢地尼、头孢托仑、头孢吡肟、头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢西丁、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢吡普、头孢曲松、头孢呋辛、头孢菌素类、氯霉素、西司他丁、环丙沙星、克拉霉素、克林霉素、氯唑西林、粘杆菌素、复方新诺明、达福普汀、地美环素、双氯青霉素、地红霉素、多尼培南、多西环素、依诺沙星、厄他培南、红霉素、乙胺丁醇、氟氯西林、磷霉素、呋喃唑酮、夫西地酸、加替沙星、格尔德霉素、庆大霉毒、糖肽类、除莠霉素、亚胺培南、异烟肼、卡那霉素、左氧氟沙星、林可霉素、利奈唑胺、洛美沙星、氯碳头孢、大环内酯类、磺胺米隆、美罗培南、甲氧西林、灭滴灵、美洛西林、米诺环素、单环内酰胺类、莫西沙星、莫匹罗星、萘夫西林、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、苯唑西林、土霉素、巴龙霉素、青霉素、青霉素类、哌拉西林、平板霉素、多粘菌素B、多肽、百浪多息、吡嗪酰胺、喹诺酮类、奎奴普丁、利福平、利福平、罗红霉素、壮观霉素、链霉素、磺胺醋酰、磺胺甲二唑、磺胺二甲异噁唑(sulfanilamide)、硫氮磺胺吡啶、磺胺异噁唑、磺胺类、替考拉宁、泰利霉素、四环素、四环素类、替卡西林、替硝唑、托普霉素、甲氧苄氨嘧啶、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑、醋竹桃霉素、曲伐沙星和万古霉素。

活性剂还包括醛甾酮(Aldosterone)、倍氯米松(Beclometasone)、倍他米松(Betamethasone)、皮质类固醇(Corticosteroid)、皮质醇(Cortisol)、醋酸可的松(Cortisone acetate)、醋酸脱氧皮质酮(Deoxycorticosterone acetate)、地塞米松(Dexamethasone)、醋酸氟氢可的松(Fludrocortisone acetate)、糖皮质激素类(Glucocorticoid)、氢化可的松(Hydrocortisone)、甲基强的松龙(Methylprednisolone)、强的松龙(Prednisolone)、强的松(Prednisone)、类固醇、以及曲安西龙(Triamcinolone)。还涵盖了这些活性剂的任何适合的组合。

“药物赋形剂”或“药学上可接受的赋形剂”是载体，通常是液体，在所述载体中，对活性治疗剂进行配制。在本发明的一个实施方案中，活性治疗剂是TCR缺陷型T细胞的群体。在本发明的一个实施方案中，活性治疗剂是表达功能性、非TCR受体的TCR缺陷型T细胞的群体。赋形剂通常不会向制剂提供任何药理学活性，但它可提供化学和/或生物稳定性。示例性制剂可见于例如Remington’s PharmaceuticalSciences,第19版,Grennaro,A.编辑,1995中，所述出版物以引用的方式并入本文。

如本文所用，“药学上可接受的载体”或“赋形剂”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸收延迟剂。在一个实施方案中，载体适合于胃肠外施用。或者，载体可适合于静脉内施用、腹膜内施用、肌肉内施用或舌下施用。药学上可接受的载体包括用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌无菌水溶液或分散液。使用此类介质和试剂用于药物活性物质是本领域中熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在本发明的药物组合物中的使用。补充性活性化合物也可并入组合物中。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，适当载体包括但不限于汉克斯氏平衡盐溶液(HBSS)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、或具有例如10％DMSO和90％人血清的任何冷冻培养基。

药物组合物通常必须是无菌的和在制造和储存的条件下稳定的。本发明考虑药物组合物以冻干形式存在。所述组合物可被配制为溶液。所述载体可以是含有例如水的分散介质。

对于所述实施方案中的每一个，可通过多种剂型来施用化合物。涵盖了本领域普通技术人员已知的任何生物学上可接受的剂型及其组合。此类剂型的实例包括但不限于液体、溶液、混悬液、乳剂、注射剂(包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内)、输注剂以及其组合。

以上对本发明的各个所示实施方案进行的描述不意图是详尽的或将本发明限于所公开的精确形式。如相关领域的技术人员将认识到，虽然本文出于说明性目的描述了本发明的具体实施方案和实施例，但各种等效修改在本发明范围内是可能的。除了以上所描述的实施例之外，可将本发明的在本文中所提供的教义应用于其它目的。

可根据以上详细的描述对本发明作出这些和其它变化。总体而言，在以下权利要求书中，所使用的术语不应该被解释为将本发明限于在本说明书和权利要求书中所公开的具体实施方案。因此，本发明并不受本公开内容限制，而是本发明的范围完全由以下权利要求书确定。

本发明可以除在前述描述和实施例中所具体描述的那些方式以外的方式来实践。根据以上教义，本发明的众多修改和变化是可能的，并且因此在所附权利要求书的范围内。

某些与T细胞受体缺陷型T细胞组合物及其使用方法相关的教义公开于2009年10月29日提交的美国临时专利申请号61/255,980中，所述临时专利申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。

某些与产生表达嵌合受体的T细胞及其使用方法相关的教义公开于2010年2月4日提交的美国临时专利申请公布号US2010/0029749中，所述临时专利申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。

某些适用于产生本发明的T细胞受体缺陷型T细胞的多核苷酸序列公开于本专利申请文件所附的序列表中，并且所述序列表的公开内容以引用的方式整体并入本文。

在发明背景、详述以及实施例中所引用的每个文献(包括专利、专利申请、期刊论文、摘要、手册、书籍或其它公开物)的全部公开内容以引用的方式整体并入本文。

提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供如何作出和使用本发明的完整公开内容和描述，并且不意图限制被视为本发明者的范围。已努力确保关于所使用的数字(例如量、温度、浓度等)的准确性，但是应允许存在一些实验性误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份数，分子量是平均分子量，温度是以摄氏度为单位；并且压力等于或接近大气压。

实施例

实施例1：T细胞受体(TCR)缺陷型T细胞的产生

小基因在含有5’和3’LTR序列的逆转录病毒表达质粒(例如pFB-neo或pSFG)上编码。将所述质粒包装在逆转录病毒包装细胞系如PT67或PG13中，并且一旦所述包装细胞已生长至汇合就收集病毒颗粒。然后将T细胞在完全培养基(或不含血清的培养基)加rIL-2(25U/ml)中通过PHA、抗CD3或抗CD3/28mAb活化持续1至3天，并且将T细胞在纤维连接蛋白或聚凝胺存在下在32℃下通过离心孵育转导。在静止大约5至7小时之后，将所述细胞洗涤并且放置在新鲜培养基加IL-2中持续2至7天。将细胞定期计数以避免过度细胞浓度(即，>2×10⁶个细胞/ml)并且以7×10⁵个细胞/ml重新接种。任选地在2天之后使用选择培养基以去除未转导的T细胞持续3至5天的周期。将活细胞通过Lymphoprep^TM(Sentinel,Milan,Italy)梯度收获并且进一步扩增1至3天。

在孵育之后，将细胞针对TCR的表达和功能进行分析。在适当情况下，还可在此时分析功能性非TCR受体表达。流式细胞术用于使用荧光染料标记的抗体针对TCR/CD3表达进行测试。将活细胞用针对CD5、CD8和CD4的抗体与针对CD3ε、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ的抗体组合染色。如果使用CD3或TCR基因的表达，那么TCR蛋白和CD3蛋白两者的表达与对照载体处理的T细胞相比应严重减少。同种型对照抗体用于针对背景荧光控制。为了鉴别T细胞，将细胞在CD5上门控，然后测定CD4、CD8、CD3和TCR的表达。多个样品用于每次处理并且使用荧光染料发射光谱的适当校正。另一种受体(例如chNKG2D)的表达使用特异性抗体和流式细胞术来测定，如本领域中先前所描述(Zhang,T.等,(2006)Cancer Res.,66(11)5927-5933；Barber,A.等,(2007)Cancer Res.,67(10):5003-5008)。

为了测试TCR的功能缺陷，在培养结束时使用效应细胞的抗CD3刺激以测量在24小时之后的干扰素(IFN)-γ产生。将T细胞(2×10⁵个)与可溶性抗CD3(OKT3)mAb在完全培养基中一起培养。在24小时之后，收集不含细胞的条件培养基并且通过ELISA针对IFN-γ进行测定。TCR表达或功能的变化应反映在减少的IFN-γ产生中。

为了测试功能性非TCR的功能，使用通过与表达或不表达其特异性配体的肿瘤细胞一起孵育的T细胞获得的特异性细胞因子产生。例如，为了测试chNKG2D的功能，将10⁵个T细胞与10⁵个P815-MICA肿瘤细胞(配体+)、10⁵个P815(配体-)细胞、10⁵个RPMI8226细胞(配体+)或单独T细胞一起孵育。在24小时之后，收集不含细胞的条件培养基并且通过ELISA测量IFN-g。嵌合NKG2D T细胞在与表达配体的肿瘤细胞一起培养之后产生IFN-γ(Zhang,T.等,(2006)Cancer Res.,66(11)5927-5933；Barber,A.等,(2007)Cancer Res.,67(10):5003-5008)。还有可能测试针对配体+肿瘤细胞的细胞毒性，如本领域中先前所描述(Zhang,T.等,(2006)Cancer Res.,66(11)5927-5933)。使用配体-肿瘤细胞或特异性受体封闭性mAb显示特异性。

实施例2：表达chNKG2D的T细胞受体(TCR)缺陷型T细胞的产生

在这个实施例中，进行chNKG2D受体的同时表达和内源性TCR表达的抑制。在这个实施例中，使用鼠chNKG2D受体，其包含NKG2D与N末端附接的CD3-ζ的组合。chNKG2D受体在鼠T细胞中产生和表达。NKG2D是II型蛋白质，其中N末端位于细胞内(Raulet(2003)Nat.Rev.Immunol.3:781-790)，而CD3-ζ链是I型蛋白质，其中C-末端在细胞质中(Weissman,等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:9709-9713)。为了产生嵌合NKG2D-CD3-ζ融合蛋白，将起始密码子ATG放置在CD3-ζ链的细胞质区的编码序列前面(无终止密码子TAA)，接着是野生型NKG2D基因。在表达后，CD3-ζ部分的定向在细胞内部反转。NKG2D细胞外结构域和跨膜结构域源自。还构建编码Dap10基因的第二嵌合基因，其后是编码CD3-ζ细胞质结构域的片段。图1呈现嵌合受体和野生型受体的结构。

shRNA在慢病毒载体中与chNKG2D受体可操作地连接。为了实现两种基因的表达，shRNA由U6启动子驱动并且chNKG2D受体由PGK启动子驱动。从健康供体分离原代人PBMC并且用低剂量可溶性抗CD3和25U/ml rhuIL-2活化48小时。虽然不需要活化T细胞以用于慢病毒转导，但转导将更有效地起作用并且允许细胞在IL-2中继续扩增。将活化的细胞洗涤并且在30℃下使用1小时自旋-感染、接着7小时静止期来进行转导。将细胞洗涤并且在25U/ml IL-2中培养3至7天，以允许效应细胞以与用于体内使用细胞类似的方式扩增。通过流式细胞术和定量实时PCR(QRT-PCR)来评估TCRαβ、CD3和NKG2D的表达。通过流式细胞术测定CD4+和CD8+T细胞的数目。通过流式细胞术测定总细胞数目和缺陷的和表达T细胞的TCR复合物的百分比。将这些数目与用shRNA或单独chNKG2D基因(作为对照)转导的PBMC进行比较。仅载体转导的细胞也被包括作为对照。

预期由于chNKG2D受体的共表达，在细胞表面不具有或具有很少TCR表达的那些细胞将表达更高量的细胞表面NKG2D。

作为替代方案，转导可同时用两种病毒发生，一种具有shRNA构建体并且一种具有chNKG2D受体。大量chNKG2D病毒用于确保缺乏TCR表达的那些T细胞中的chNKG2D的高表达。可仍保持的TCR+T细胞被去除以获得TCR-、chNKG2D+T细胞。

在病毒转导和扩增之后，将TCR+细胞和TCR-细胞在Miltenyi柱上通过具有磁珠的mAb分离。chNKG2D表达的验证使用针对chNKG2D受体的特异性引物通过QRT-PCR进行。

为了确定所述T细胞是否已损失TCR功能并且保留chNKG2D功能，将转导的或对照T细胞与丝裂霉素C-处理的同种异体PBMC或同系PBMC一起培养。将所述T细胞预负载CFSE，所述CFSE是在分裂之后在子代细胞之间均分的细胞可渗透染料。细胞分裂的程度可通过流式细胞术容易地确定。

为了确定shRNA构建体是否能够抑制TCR功能并且允许chNKG2D受体功能，将转导的T细胞与丝裂霉素C处理的同种异体PBMC、同系PBMC或肿瘤细胞：P815-MICA(表达人MICA的鼠肿瘤，NKG2D的配体)、P815、A2008(人卵巢肿瘤细胞，NKG2D配体+)和U266(人骨髓瘤细胞系，NKG2D配体+)一起培养。在48小时之后，收集不含细胞的上清液，并且将通过ELISA量化所产生的IL-2和IFN-γ的量。单独T细胞用作阴性对照。

实施例3：表达chNKG2D的T细胞受体(TCR)缺陷型T细胞的体内施用

在这个实施例中，将如在实施例2中产生的表达鼠chNKG2D受体的TCR缺陷型T细胞施用至小鼠以评估所述T细胞对某些癌症的体内治疗潜力。将携带嵌合NKG2D的T细胞(10⁶个)与RMA/Rae-1β肿瘤细胞(10⁵个)一起皮下共注射至C57BL/6小鼠。在30天之后不含肿瘤的或具有RMA/Rae-1β肿瘤的肿瘤抑制生长的携带嵌合NKG2D的TCR缺陷型T细胞处理的小鼠反映出在这些小鼠中的治疗性抗癌活性。

在第二并且更严格的模型中，将转导的T细胞(10⁷个)在于右侧腹中RMA/Rae-1β皮下肿瘤接种之前一天静脉内过继转移至B6小鼠中。与对照载体修饰的T细胞相比RMA/Rae-1β肿瘤(皮下)的生长抑制反映出在这些小鼠中的治疗性抗癌活性。至于用嵌合NKG2D-修饰的T细胞处理的毒性，预期当用携带嵌合NKG2D的T细胞处理时，动物将不会显示炎性损伤的任何明显证据(即，发皱的毛发、驼背或腹泻等)，这将是明显毒性的缺乏的反映。

在所建立的卵巢肿瘤(ID8)的更严格模型中，将转导的chNKG2DT细胞(5×10⁶个T细胞，腹膜内)注射至携带肿瘤的小鼠中持续5周。将小鼠在肿瘤激发后第7周和第9周时进一步注射T细胞。在这些条件下，用chNKG2D T细胞处理的小鼠将保持无肿瘤持续超过250天，而用对照T细胞根据类似计划处理的小鼠将在100天内死于肿瘤生长。至于用嵌合NKG2D-修饰的T细胞处理的毒性，预期当用携带嵌合NKG2D的T细胞处理时，动物将不会显示炎性损伤的任何明显证据(即，发皱的毛发、驼背或腹泻等)，这将是明显毒性的缺乏的反映。

在多发性骨髓瘤的模型中，将携带5T33MM肿瘤细胞的小鼠在肿瘤细胞输注之后第12天用chNKG2D T细胞(5×10⁶个细胞，静脉内)处理。这种处理将导致所有小鼠的寿命增加并且这些小鼠中的约一半将是长期、无肿瘤的存活者。用对照T细胞处理的小鼠将在30天内死于其肿瘤。将未观察到由于用chNKG2D T细胞处理所致的毒性的明显证据。

由于免疫系统可选择肿瘤变体，所以针对癌症的最有效的免疫疗法很可能是可诱导针对多种肿瘤抗原的免疫性的那些。在第三实验中，测试用携带嵌合NKG2D的T细胞处理是否将诱导针对野生型肿瘤细胞的宿主免疫。将用携带嵌合NKG2D的T细胞和5T33MM肿瘤细胞处理并且在80天后无肿瘤的小鼠用5T33MM肿瘤细胞激发。与在平均27天内死于肿瘤的对照未处理的小鼠相比，无肿瘤存活小鼠对5T33MM细胞(3×10⁵个)的随后激发具有抗性。然而，无肿瘤存活小鼠对RMA-Rae1肿瘤细胞(3×10⁵个)的随后激发不具有抗性，并且在与未处理小鼠类似的时间间隔(20天)中死于肿瘤。这指示携带嵌合NKG2D的T细胞的过继转移将允许宿主产生肿瘤特异性T细胞记忆。

在本发明中，提供了影响T细胞功能的四种类别的TCR抑制分子(TIM)。表2是19种不同的TIM响应于可溶性抗CD3(OKT3(200ng/ml))刺激(CD3)或与同种异体PBMC一起培养(Allo)对效应T细胞功能的作用的总结。左侧的命名是指TIM的类别。数值指示相对于对照pFB载体转导的T细胞，TCR抑制的减少百分比。NI：无抑制。ND：未进行。

表2.TCR抑制分子(TIM)对T细胞功能的作用的总结。

实施例4：使用靶向编码CD3-ε或CD3-ζ的核酸的shRNA产生T细胞受体(TCR)缺陷型T细胞

在这个实施例中，使用靶向编码CD3-ε或CD3-ζ的核酸的shRNA序列抑制内源TCR表达。

购买了克隆至逆转录病毒载体pSM2c中的shRNA序列(OpenBiosystems)，其中表达受U6启动子控制。这些shRNA构建体用于阻断CD3-ε和/或CD3-ζ蛋白的表达，以使得T细胞不再产生TCR复合物的关键组分中的一种。随后，使TCR复合物不稳定并且防止功能性TCR的细胞表面表达，从而导致通过TCR复合物减少T细胞功能。针对CD3-ε或CD3-ζ的shRNA的序列描述于表1中，其分别对应于SEQ ID NO:9-26和68-71

为了确定所述shRNA是否改变TCR功能，测量(i)响应于可溶性抗CD3刺激(CD3)或(ii)响应于与同种异体PBMC一起培养(Allo)的IFN-γ产生。具体地说，用TIM1或TIM3处理的T细胞在用200ng/ml的抗CD3单克隆抗体刺激之后分别具有TCR抑制的22.6％或14.9％减少。参见上文表2。

实施例4：使用CD3-ζ的显性失活抑制剂产生T细胞受体(TCR)缺陷型T细胞

在这个实施例中，显性失活抑制蛋白(即TIM)的过表达中断TCR表达和功能。内源TCR表达使用包含CD3-ζ的显性失活抑制蛋白进行抑制，所述蛋白被改变以包括来自KIR2DL1的抑制信号，并且所得到的T细胞中未响应于TCR刺激而被活化。

并入编码CD3-ζ的修饰的多核苷酸的全部或一部分的小基因构建体使用购自Open Biosystems(Huntsville,AL)的CD3-ζ和KIR2DL1cDNA模板(分别对应于SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:66)通过PCR来产生。所有PCR使用高保真度DNA聚合酶Phusion(New EnglandBiolabs,Ipswich,MA)来进行，并且引物通过整合的DNA技术(Coralville,IA)来合成。使用已确立的方案，将每个构建体克隆至逆转录病毒载体pFB-neo(Stratagene)中，其中表达受5’LTR控制。将所得到的构建体进行筛选并且通过测序针对准确度进行确认，并且通过DNA dynamo(Blue Tractor Software Ltd)进行分析。所述DNA序列及其预测的蛋白质序列对应于SEQ ID NO:68-101。

使用逆转录病毒表达系统在原代T细胞中表达TIM。两种不同的包装细胞系用于产生具有低或高滴度的病毒。低滴度病毒由GP2-293T细胞产生，所述细胞用所述包装质粒和包膜质粒瞬时转染。在72小时之后，收获病毒上清液并且通过在用G418选择之后感染NIH-3T3细胞来测量滴度。由所述系统产生的病毒的滴度在5x10⁵与1x10⁷CFU/ml之间。为了产生高滴度病毒，病毒由GP2-293T系统产生以转导PT67包装细胞。在用G418处理5天下选择感染病毒颗粒的PT67细胞。将表达TIM的PT67细胞扩增并且用于病毒产生。在细胞达到汇合之后72小时，收获病毒上清液并且在NIH-3T3中测量滴度。通过所述系统获得的病毒的滴度在7x10⁷至2x10⁸CFU/ml的范围内。

为了转导人T细胞，从健康供体分离原代人PBMC并且用40ng/ml的可溶性抗CD3和50U/ml rhuIL-2活化72小时。将活化的T细胞洗涤并且用由低滴度病毒或高滴度病毒产生的逆转录病毒在32℃下使用1小时自旋-感染、接着6小时静止期进行转导。将细胞洗涤并且在50U/ml IL-2中培养48小时，并且然后进行选择持续3天。在选择之后，使用Lymphoprep(Mediatech)分离活细胞，并且将效应细胞在50U/ml IL-2中扩增48小时，此时将细胞用于功能性测定。通过定量实时PCR(qRT-PCR)对用shRNA转导的细胞中CD3-ε和CD3-ζ的内源细胞表达和由shRNA表达基因的减少进行分析。简言之，从转导的T细胞提取RNA，并且将0.5-1ug总RNA使用QuantiTectRev.转录试剂盒(Qiagen)进行逆转录。所得到的cDNA与SYBR绿(Applied Biosystems)一起用于qRT-PCR分析，并且将数据标准化至甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)水平。使用对CD3、CD8、CD4和CD5具有特异性的抗体对细胞表面表达的变化进行分析，并且与载体对照相比，在表达TIM的T细胞中未观察到这些细胞表面分子的表达差异。

为了确定在每种shRNA或小基因构建体(其去除或破坏细胞表面上的TCR)情况下TCR表达的减少是否足以防止T细胞针对TCR刺激的活化，将所述T细胞针对以下进行测试:(1)体外细胞存活；和(2)响应于同种异体PBMC和/或抗CD3mAb的细胞因子产生。

为了测试细胞存活，将转导的T细胞在具有rhuIL-2(50U/ml)的完全RPMI培养基中繁殖。将细胞在开始培养时以相似密度接种并且去除样品以用于每日细胞计数和存活力持续7天或更多天。与相应表达载体对照的T细胞相比，在表达TIM的T细胞的生长中未观察到差异。为了确定T细胞是否表达足够的TCR以诱导针对同种异体细胞的应答，将转导的T细胞或对照T细胞与同种异体或同系PBMC一起培养(以4:1的比例)。在24小时之后，收集不含细胞的上清液，并且通过ELISA量化所产生的IFN-γ的量。单独T细胞，包括PBMC和转导的细胞，用作阴性对照。在所分析的TCR抑制分子之中，鉴别了能够显著降低T细胞中的TCR功能的两种小基因(TIM7和TIM8)。参见，图2。使用表达TIM7或TIM8的19种不同的供体进行同种异体测定，其中将每个供体与3种不同的同种异体PBMC一起培养。在表达TIM7的T细胞中观察到平均49％的IFN-γ产生的减少，并且在表达TIM8的T细胞中观察到平均60％的减少。

为了确定每种TIM是否通过TCR复合物的直接抗体刺激来抑制T细胞功能，将TIM转导的T细胞用一系列不同浓度的抗CD3mAb(1.6至5000ng/ml)进行处理。在24小时之后，收集不含细胞的上清液，并且通过ELISA量化所产生的IFN-γ的量。单独T细胞用作阴性对照。当将细胞用200ng/ml的抗CD3mAb刺激24小时时，分别在表达TIM7和TIM8的T细胞中观察到44％和58％的IFN-γ产生的最大减少。总而言之，这指示TCR表达的减少，例如使用TIM来去除或破坏TCR足以改变T细胞功能。

实施例5：表达chNKG2D的T细胞受体(TCR)缺陷型T细胞的产生

在这个实施例中，进行了显性失活TCR抑制蛋白(即TIM)的同时过表达，和嵌合肿瘤靶向受体的表达。具体地说，内源TCR表达使用TIM进行抑制，并且表达了chNKG2D嵌合受体，即与CD3-ζ的细胞质结构域连接的NKG2D。NKG2D与Dap10缔合以提供T细胞的第一和第二活化信号两者。参见，Zhang,T.等2006.Cancer Res.66(11):5927-5933。NKG2D的配体由大多数人肿瘤细胞表达，但不在大多数正常细胞上表达。

为了测试TIM和嵌合肿瘤靶向受体两者的表达，从健康供体分离原代人PBMC并且将其用40ng/ml的可溶性抗CD3和50U/mlrhuIL-2活化72小时。将活化的T细胞洗涤并且在32℃下使用1小时离心孵育、接着7小时静止期用高滴度逆转录病毒进行转导。相等量的TIM和chNKG2D病毒用于转导。将细胞洗涤并且在50U/ml IL-2中培养48小时，并且然后进行G418选择持续3天。在选择之后，使用Lymphoprep(Mediatech)分离活细胞，并且将效应细胞在50U/mlIL-2中扩增48小时，此时将细胞用于功能性测定。使用对CD3、CD4、NKG2D和CD5具有特异性的抗体对细胞表面表达的变化进行分析。与载体对照相比，在表达TIM的T细胞中的这些细胞表面分子的表达中未观察到显著差异，除了在用chNKG2D病毒转导的细胞中更高的NKG2D受体表达，如所预期。

为了确定TIM+chNKG2D+细胞是否将具有针对同种异体细胞的减少的应答，但针对肿瘤细胞的增加的应答，将T细胞与同种异体PBMC、同系PBMC或肿瘤细胞：RPMI8226(人骨髓瘤细胞系，NKG2D配体+)、PANC-1(人胰腺细胞系，NKG2D+)或NIH-3T3(正常小鼠成纤维细胞细胞系，NKG2D配体-)(作为阴性对照)一起共培养。在24小时之后，收集不含细胞的上清液，并且通过ELISA量化所产生的IFN-γ的量。单独T细胞和与同系PBMC一起培养用作阴性对照。

根据同种异体测定，与表达载体对照的细胞相比，在表达TIM7的T细胞中观察到IFN-γ产生的45％减少，并且在具有chNKG2D的共表达的表达TIM8的T细胞中观察到IFN-γ产生的44％减少。当与肿瘤细胞一起培养时，与仅表达TIM的细胞相比，在TIM+chNKG2D+细胞中观察到响应于肿瘤细胞IFN-γ产生的量的显著增加(当肿瘤细胞表达NKG2D配体(RPMI8226和PANC-1)时)，但当与配体缺陷的肿瘤细胞(NIH-3T3)一起培养时未观察到。参见图3，其示出使用RPMI8226的代表性实验。同一实验还证明更高IFN-γ产生是NKG2D依赖性的，因为与NKG2D的封闭性mAb一起孵育未导致IFN-γ产生的增加。

Claims (33)

1.一种产生分离的T细胞受体(TCR)缺陷型T细胞的方法，其包括在所述T细胞中表达TCR抑制分子(TIM)，所述TCR抑制分子通过减少或阻断所述TCR复合物的组分的表达而使所述TCR复合物不稳定，其中所述细胞任选地进一步工程化以表达嵌合肿瘤靶向受体。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述TCR缺陷型T细胞缺乏所述TCR复合物的至少一种组分的细胞表面表达。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述TCR缺陷型T细胞缺乏所述TCR复合物的所有组分的细胞表面表达。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述TCR缺陷型T细胞不表达功能性TCR。

5.如权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述TCR缺陷型T细胞中表达至少一种功能性非TCR受体。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述至少一种功能性非TCR受体是包含附接至信号传导结构域的配体结合结构域的嵌合受体。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述配体结合结构域从NKG2D、NKG2A、NKG2C、NKG2F、LLT1、AICL、CD26、NKRP1、NKp30、NKp44、NKp46、CD244(2B4)、DNAM-1或NKp80获得。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述配体结合结构域从抗肿瘤嵌合抗原受体或抗肿瘤抗体获得。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述抗肿瘤抗体从抗Her2neu抗体或抗EGFR抗体获得。

10.如权利要求6所述的方法，其中所述信号传导结构域从CD3ζ、Dap10、CD28、41BB或CD40L获得。

11.如权利要求5所述的方法，其中所述至少一种功能性非TCR受体结合MIC-A、MIC-B、Her2neu、EGFR、间皮素、CD38、CD20、CD19、PSA、MUC1、MUC2、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17、MUC19、MUC20、雌激素受体、黄体酮受体、RON、或ULBP/RAET1家族的一个或多个成员。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述ULBP/RAET1家族的所述一个或多个成员包括ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6。

13.如权利要求5所述的方法，其中所述至少一种功能性非TCR受体结合在受感染细胞的表面上存在的病毒抗原或病毒诱导的抗原。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述病毒选自HCMV、HIV、EBV、HBV、HCV、埃博拉病毒、汉坦病毒或VSV。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述T细胞是人T细胞。

16.如权利要求1所述的方法，其进一步包括在所述T细胞中表达显性选择标记。

17.如权利要求1所述的方法，其中所述TIM是小发夹RNA。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述TIM是显性失活抑制蛋白。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述显性失活抑制蛋白由并入编码至少一种全长或截短的TCR组分的多核苷酸的小基因编码，所述小基因被修饰成缺乏信号传导基序、破坏与其它TCR组分的缔合、破坏配体结合或包括抑制信号传导基序。

20.如权利要求6所述的方法，其中所述嵌合受体包含来自NKG2D的配体结合结构域和来自CD3-ζ的信号传导结构域。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述嵌合受体是chNKG2D。

22.一种产生具有不同HLA单元型的TCR缺陷型T细胞库的方法，其包括：

获得具有特定HLA单元型的分离T细胞的池；

在具有所述特定HLA单元型的所述T细胞中表达TCR抑制分子(TIM)，所述TCR抑制分子通过减少或阻断所述TCR复合物的组分的表达而使所述TCR复合物不稳定；以及

将具有所述特定HLA单元型的所述TCR缺陷型T细胞池与具有另一种特定HLA单元型的另一个TCR缺陷型T细胞池组合，其中所述T细胞库包含各自含有特定HLA类型的TCR缺陷型T细胞的不同T细胞池。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述T细胞库包含至少10种不同的HLA组织类型的T细胞。

24.如权利要求22所述的方法，其中所述T细胞库包含至少100种不同的HLA组织类型的T细胞。

25.如权利要求22所述的方法，其中所述T细胞稳定地缺乏所述T细胞受体复合物的至少一种组分的细胞表面表达。

26.如权利要求21所述的方法，其中所述TCR抑制分子是TIM1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19中的一种或其组合。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述TCR抑制分子具有选自SEQ ID NO:80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或101之一的序列或其片段或变体。

28.如权利要求1或22所述的方法，其中所述抑制信号基序包含KIR多肽。

29.如权利要求1或22所述的方法，其中TCR表达使用包含CD3-ζ的显性失活抑制蛋白进行抑制，所述蛋白被改变以包括来自KIR2DL1的抑制信号。

30.如权利要求1或22所述的方法，其中TCR表达使用至少两种TCR抑制分子的组合进行抑制。

31.如权利要求1或22所述的方法，其中TCR表达使用TIM7与TIM8的组合进行抑制。

32.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所得T细胞被施用至患者。

33.如权利要求30所述的方法，其中所治疗的所述患者具有癌症或病毒感染。