JP3238447B2 - ヒト白血球株化細胞 - Google Patents
ヒト白血球株化細胞Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、新規なヒト白血球由来の株化細
胞に関する。本発明の株化細胞は白血病診断に用いられ
ているミエロペルオキシダーゼの生産、ＨＬ−６０細胞
の代わりに分化の研究や白血病の研究並びに抗ガン剤そ
の他各種検査薬及び治療薬の研究に用いることができ
る。
胞に関する。本発明の株化細胞は白血病診断に用いられ
ているミエロペルオキシダーゼの生産、ＨＬ−６０細胞
の代わりに分化の研究や白血病の研究並びに抗ガン剤そ
の他各種検査薬及び治療薬の研究に用いることができ
る。
【０００２】本願発明者らは、白血病の一種である骨髄
異形成症候群患者の末梢血から、新規な特徴を有する白
血球細胞を得、これを継代培養して株化することに成功
し、本発明を完成した。
異形成症候群患者の末梢血から、新規な特徴を有する白
血球細胞を得、これを継代培養して株化することに成功
し、本発明を完成した。
【０００３】すなわち、本発明は、下記特徴を有するヒ
ト白血球株化細胞を提供する。 (1) ブチレートエステラーゼ陽性 (2) ペルオキシダーゼ陽性 (3) 細胞表面マーカーＯＫＭ−１陽性 (4) Ｔ細胞レセプターβ鎖、免疫グロブリンＪＨ、ＪＫ
遺伝子再構成陰性 (5) ＧＭ−ＣＳＦ依存性有り (6) ミエロペルオキシダーゼのｍＲＮＡ量がＨＬ−６０
と少なくとも同等に発現している (7) ＶＮＴＲ解析によりＨＬ−６０とは異なる細胞であ
ることが示される。
ト白血球株化細胞を提供する。 (1) ブチレートエステラーゼ陽性 (2) ペルオキシダーゼ陽性 (3) 細胞表面マーカーＯＫＭ−１陽性 (4) Ｔ細胞レセプターβ鎖、免疫グロブリンＪＨ、ＪＫ
遺伝子再構成陰性 (5) ＧＭ−ＣＳＦ依存性有り (6) ミエロペルオキシダーゼのｍＲＮＡ量がＨＬ−６０
と少なくとも同等に発現している (7) ＶＮＴＲ解析によりＨＬ−６０とは異なる細胞であ
ることが示される。
【０００４】本発明の株化細胞は、骨髄異形成症候群患
者の末梢血から下記実施例に詳述する方法により得られ
た。
者の末梢血から下記実施例に詳述する方法により得られ
た。
【０００５】本発明の株化細胞は、白血球が貪食した細
菌を殺菌する酵素であるミエロペルオキシダーゼの生産
が正常白血球よりも増大しているので、感染症治療薬と
して用いられるこの酵素の生産に用いることができる。
また、本発明の株化細胞は、基本的な性質がＨｅｌａ細
胞の１種であるＨＬ−６０細胞と類似しており、ＨＬ−
６０細胞は、分化の研究、白血病の研究及び抗ガン剤そ
の他各種治療薬の研究に広く用いられているので、本発
明の株化細胞もＨＬ−６０細胞と同様、これらの研究に
用いることができる。
菌を殺菌する酵素であるミエロペルオキシダーゼの生産
が正常白血球よりも増大しているので、感染症治療薬と
して用いられるこの酵素の生産に用いることができる。
また、本発明の株化細胞は、基本的な性質がＨｅｌａ細
胞の１種であるＨＬ−６０細胞と類似しており、ＨＬ−
６０細胞は、分化の研究、白血病の研究及び抗ガン剤そ
の他各種治療薬の研究に広く用いられているので、本発
明の株化細胞もＨＬ−６０細胞と同様、これらの研究に
用いることができる。
【０００６】
(1) 株化細胞の取得 骨髄異形成症候群患者の末梢血をヘパリン採血し、４℃
で遠心分離（１５００ｒｐｍ、１０分間）を行ない、バ
フィコート（白血球層）を分離した。滅菌ＰＢＳで白血
球を２回洗浄した（４℃、１５００ｒｐｍ、１０分
間）。得られた白血球細胞の数を算定し、１ｘ１０6 細
胞／ｍｌの細胞密度で、ＧＭ−ＣＳＦ（granulocyte-ma
crophage colony stimulating factor) を１０単位／ｍ
ｌ含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃で１週間ごとの継
代培養を行なった。２０代の継代培養を行なった後、軟
寒天法によりコロニー形成を行ない、細胞のクローニン
グを行なった。クローニングした細胞をさらに上記条件
で１０代継代培養した後、再度軟寒天法により細胞をク
ローニングした。得られたクローンについて、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ依存性を調べた。すなわち、ＧＭ−ＣＳＦを含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地と含まない同培地でそれぞれ培養を
行ない、ＧＭ−ＣＳＦを含む培地中での増殖速度が含ま
ない培地中での増殖速度よりも大きいか否かを調べ、大
きいもの、すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ依存性のあるものを
選択した。得られた細胞の１つをＳＫＭ−１と命名し、
微工研に寄託した。受託番号は、微工研菌寄第１２６６
３号である。
で遠心分離（１５００ｒｐｍ、１０分間）を行ない、バ
フィコート（白血球層）を分離した。滅菌ＰＢＳで白血
球を２回洗浄した（４℃、１５００ｒｐｍ、１０分
間）。得られた白血球細胞の数を算定し、１ｘ１０6 細
胞／ｍｌの細胞密度で、ＧＭ−ＣＳＦ（granulocyte-ma
crophage colony stimulating factor) を１０単位／ｍ
ｌ含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃で１週間ごとの継
代培養を行なった。２０代の継代培養を行なった後、軟
寒天法によりコロニー形成を行ない、細胞のクローニン
グを行なった。クローニングした細胞をさらに上記条件
で１０代継代培養した後、再度軟寒天法により細胞をク
ローニングした。得られたクローンについて、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ依存性を調べた。すなわち、ＧＭ−ＣＳＦを含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地と含まない同培地でそれぞれ培養を
行ない、ＧＭ−ＣＳＦを含む培地中での増殖速度が含ま
ない培地中での増殖速度よりも大きいか否かを調べ、大
きいもの、すなわち、ＧＭ−ＣＳＦ依存性のあるものを
選択した。得られた細胞の１つをＳＫＭ−１と命名し、
微工研に寄託した。受託番号は、微工研菌寄第１２６６
３号である。
【０００７】(2) ＳＫＭ−１細胞の特徴づけ (i) ブチレートエステラーゼ活性 常法であるエステラーゼ染色法（例えば、臨床検査法堤
要、第２９版に記載）により、α−ナフチルブチレート
を基質とするα−ナフチルブチレートエステラーゼ活性
を定性測定した。その結果、細胞は茶褐色に染色され、
本発明の株化細胞はブチレートエステラーゼが陽性であ
ることが判明した。
要、第２９版に記載）により、α−ナフチルブチレート
を基質とするα−ナフチルブチレートエステラーゼ活性
を定性測定した。その結果、細胞は茶褐色に染色され、
本発明の株化細胞はブチレートエステラーゼが陽性であ
ることが判明した。
【０００８】(ii)ペルオキシダーゼ活性 常法である東北小児科法（例えば、臨床検査法堤要、第
２９版）により、ペルオキシダーゼ染色を行ない、細胞
のペルオキシダーゼ活性を調べた。その結果、細胞は染
色され、ペルオキシダーゼ陽性であることが判明した。
この結果、本発明の細胞は骨髄系であることがわかっ
た。
２９版）により、ペルオキシダーゼ染色を行ない、細胞
のペルオキシダーゼ活性を調べた。その結果、細胞は染
色され、ペルオキシダーゼ陽性であることが判明した。
この結果、本発明の細胞は骨髄系であることがわかっ
た。
【０００９】(iii) 細胞表面マーカーＯＫＭ−１ リンパ球の細胞表面マーカーであるＯＫＭ−１（文献：
Leukocyte typing（ＣＤ分類に関する国際ワークショッ
プ）を有しているか否かを、抗ＯＫＭ−１モノクローナ
ル抗体（オーソ社より市販）を用いたフローサイトメト
リーにより分析した。その結果、本発明の細胞は、細胞
表面マーカーＯＫＭ−１を有していた。
Leukocyte typing（ＣＤ分類に関する国際ワークショッ
プ）を有しているか否かを、抗ＯＫＭ−１モノクローナ
ル抗体（オーソ社より市販）を用いたフローサイトメト
リーにより分析した。その結果、本発明の細胞は、細胞
表面マーカーＯＫＭ−１を有していた。
【００１０】(iv)Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）β鎖、免
疫グロブリンＪH 、ＪK 遺伝子再構成 Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）β鎖、免疫グロブリンＨ鎖
（ＪH 遺伝子）、免疫グロブリンＫ鎖（ＪK 遺伝子）の
再構成を調べた。市販のプローブ（ＯＮＣＯＲ社製、Ｊ
H プローブ、ＣT βプローブ及びＪK プローブをそれぞ
れ用い、該市販品の指示書に記載された条件でサザンブ
ロットハイブリダイゼーションを行なった。結果を図１
に示す。図１に示されるように、各プローブにより検出
されたバンドは、いずれも正常（再構成していない）な
バンドパターンを示していることから、本発明の細胞は
Ｔ細胞系、Ｂ細胞系の細胞ではないことが証明された。
疫グロブリンＪH 、ＪK 遺伝子再構成 Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）β鎖、免疫グロブリンＨ鎖
（ＪH 遺伝子）、免疫グロブリンＫ鎖（ＪK 遺伝子）の
再構成を調べた。市販のプローブ（ＯＮＣＯＲ社製、Ｊ
H プローブ、ＣT βプローブ及びＪK プローブをそれぞ
れ用い、該市販品の指示書に記載された条件でサザンブ
ロットハイブリダイゼーションを行なった。結果を図１
に示す。図１に示されるように、各プローブにより検出
されたバンドは、いずれも正常（再構成していない）な
バンドパターンを示していることから、本発明の細胞は
Ｔ細胞系、Ｂ細胞系の細胞ではないことが証明された。
【００１１】(v) ＧＭ−ＣＳＦ依存性 ＳＫＭ−１細胞をＧＭ−ＣＳＦ１ｎｇ／ｍｌ添加ＦＣＳ
１０％加ＲＰＭＩ培地及びＧＭ−ＣＳＦを含まない同培
地に、２ｍｌ当り２ｘ１０5 細胞となるように調製し、
３７℃で２日、４日、７日間培養し、その時の細胞数を
測定した。結果を図２に示す。図２から、本発明の細胞
はＧＭ−ＣＳＦ依存性を有することがわかる。
１０％加ＲＰＭＩ培地及びＧＭ−ＣＳＦを含まない同培
地に、２ｍｌ当り２ｘ１０5 細胞となるように調製し、
３７℃で２日、４日、７日間培養し、その時の細胞数を
測定した。結果を図２に示す。図２から、本発明の細胞
はＧＭ−ＣＳＦ依存性を有することがわかる。
【００１２】 (vi)ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）のｍＲＮＡ発現 ＳＫＭ−１細胞より常法によりｍＲＮＡを抽出し、ＭＰ
ＯのｃＤＮＡをプローブとして用いる公知の方法（Hash
inaka et al., Biochemistry, vol. 27, No. 16, pp.59
06-5914 (1988)) に基づくノーザンブロットハイブリダ
イゼーション法によりＭＰＯのｍＲＮＡの発現量を調べ
た。対照として、ＨＬ−６０を用いて同様な試験を行な
った。結果を図３に示す。図３中、レーン１がＳＫＭ−
１についての結果を、レーン２がＨＬ−６０についての
結果を示す。図３より、本発明の細胞では、ＭＰＯのｍ
ＲＮＡの量がＨＬ−６０細胞よりも多いことがわかる。
ＯのｃＤＮＡをプローブとして用いる公知の方法（Hash
inaka et al., Biochemistry, vol. 27, No. 16, pp.59
06-5914 (1988)) に基づくノーザンブロットハイブリダ
イゼーション法によりＭＰＯのｍＲＮＡの発現量を調べ
た。対照として、ＨＬ−６０を用いて同様な試験を行な
った。結果を図３に示す。図３中、レーン１がＳＫＭ−
１についての結果を、レーン２がＨＬ−６０についての
結果を示す。図３より、本発明の細胞では、ＭＰＯのｍ
ＲＮＡの量がＨＬ−６０細胞よりも多いことがわかる。
【００１３】(vii) ＶＮＴＲ解析 ＳＫＭ−１細胞ＤＮＡのＶＮＴＲ（variable number of
tandem repeat) をＨＬ−６０細胞と比較した。すなわ
ち、ＳＫＭ−１細胞及び対照としてＨＬ−６０細胞より
常法に基づきＤＮＡを抽出し、市販のＤＮＡ分類用プロ
ーブであるＹＮＨ２４プローブ（Ｐｒｏｍｅｇａ社より
市販、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＧｅｎｅＰｒｉｎｔ誌Ｎｏ．
３に記載）を用い、常法に基づきサザンブロットハイブ
リダイゼーションを行なった。結果を図４に示す。図４
中、レーン１はＨＬ−６０のパターン、レーン２はＳＫ
Ｍ−１細胞のパターンを示す。図４から明らかなよう
に、両パターンは全く異なっており、本発明の細胞はＨ
Ｌ−６０細胞とは異なる細胞であることが示された。
tandem repeat) をＨＬ−６０細胞と比較した。すなわ
ち、ＳＫＭ−１細胞及び対照としてＨＬ−６０細胞より
常法に基づきＤＮＡを抽出し、市販のＤＮＡ分類用プロ
ーブであるＹＮＨ２４プローブ（Ｐｒｏｍｅｇａ社より
市販、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＧｅｎｅＰｒｉｎｔ誌Ｎｏ．
３に記載）を用い、常法に基づきサザンブロットハイブ
リダイゼーションを行なった。結果を図４に示す。図４
中、レーン１はＨＬ−６０のパターン、レーン２はＳＫ
Ｍ−１細胞のパターンを示す。図４から明らかなよう
に、両パターンは全く異なっており、本発明の細胞はＨ
Ｌ−６０細胞とは異なる細胞であることが示された。
【図１】Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）β鎖、免疫グロブ
リンＨ鎖（ＪH 遺伝子）、免疫グロブリンＫ鎖（ＪK 遺
伝子）の再構成を調べるために行なったサザンブロット
ハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
リンＨ鎖（ＪH 遺伝子）、免疫グロブリンＫ鎖（ＪK 遺
伝子）の再構成を調べるために行なったサザンブロット
ハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
【図２】本発明の細胞のＧＭ−ＣＳＦ依存性を示す増殖
曲線である。
曲線である。
【図３】本発明の細胞及びＨＬ−６０細胞のミエロペル
オキシダーゼｍＲＮＡ量を示すノーザンブロットハイブ
リダイゼーションの結果を示す図である。
オキシダーゼｍＲＮＡ量を示すノーザンブロットハイブ
リダイゼーションの結果を示す図である。
【図４】本発明の細胞及びＨＬ−６０細胞のＶＮＴＲ解
析の結果を示すサザンブロットハイブリダイゼーション
パターンである。
析の結果を示すサザンブロットハイブリダイゼーション
パターンである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−210983（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−133885（ＪＰ，Ａ) Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．54，Ｎｏ．３, （1979），ｐ．413−733 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/00 - 5/28 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 下記特徴を有するヒト白血球株化細胞。 (1) ブチレートエステラーゼ陽性 (2) ペルオキシダーゼ陽性 (3) 細胞表面マーカーＯＫＭ−１陽性 (4) Ｔ細胞レセプターβ鎖、免疫グロブリンＪＨ 、Ｊ
Ｋ 遺伝子再構成陰性 (5) ＧＭ−ＣＳＦ依存性有り (6) ミエロペルオキシダーゼのｍＲＮＡ量がＨＬ−６０
と少なくとも同等に発現している (7) ＶＮＴＲ解析によりＨＬ−６０とは異なる細胞であ
ることが示される。 - 【請求項２】 微工研菌寄第１２６６３号である請求項
１記載の株化細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35931091A JP3238447B2 (ja) | 1991-12-31 | 1991-12-31 | ヒト白血球株化細胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35931091A JP3238447B2 (ja) | 1991-12-31 | 1991-12-31 | ヒト白血球株化細胞 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05176760A JPH05176760A (ja) | 1993-07-20 |
| JP3238447B2 true JP3238447B2 (ja) | 2001-12-17 |
Family
ID=18463850
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35931091A Expired - Fee Related JP3238447B2 (ja) | 1991-12-31 | 1991-12-31 | ヒト白血球株化細胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3238447B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7994298B2 (en) | 2004-09-24 | 2011-08-09 | Trustees Of Dartmouth College | Chimeric NK receptor and methods for treating cancer |
| US9273283B2 (en) | 2009-10-29 | 2016-03-01 | The Trustees Of Dartmouth College | Method of producing T cell receptor-deficient T cells expressing a chimeric receptor |
| WO2011059836A2 (en) | 2009-10-29 | 2011-05-19 | Trustees Of Dartmouth College | T cell receptor-deficient t cell compositions |
| US9833476B2 (en) | 2011-08-31 | 2017-12-05 | The Trustees Of Dartmouth College | NKP30 receptor targeted therapeutics |
| EP2847223B1 (en) | 2012-05-07 | 2019-03-27 | Trustees of Dartmouth College | Anti-b7-h6 antibody, fusion proteins, and methods of using the same |
-
1991
- 1991-12-31 JP JP35931091A patent/JP3238447B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ．３，（１９７９），ｐ．４１３−７３３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05176760A (ja) | 1993-07-20 |
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