CN103097407A - T细胞受体 - Google Patents
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Abstract
一种T细胞受体(TCR)，其具有EVDPIGHLY HLA-A1复合体结合特性并包含特定的野生型T细胞受体(TCR)，所述TCR在TCRα可变结构域和/或TCRβ可变结构域具有特定突变以增强亲和力。所述TCR可用于过继治疗。
Description
本发明涉及结合EVDPIGHLY肽(源自MAGE-3蛋白)的T细胞受体(TCR)，所述肽以肽-HLA-A1复合体形式存在，所述TCR相对天然MAGE-A3 TCRα和/或β可变结构域进行突变，且对所述复合体所具有的结合亲和力和/或结合半衰期至少两倍于参比MAGE-A3 TCR。
背景技术
所述EVDPIGHLY(SEQ ID No:1)肽对应已知MAGE-3蛋白的氨基酸残基168-176。所述MAGE-3蛋白在多种肿瘤类型中有表达，包括黑色素瘤，以及其他固体肿瘤如头颈部鳞状细胞癌、肺癌、膀胱癌、胃癌和食道癌。所述MAGE-3肽EVDPIGHLY(SEQ ID No:1)是鉴定最充分的MAGE-3表位。它由HLA-A1和HLA-B35限制性T细胞识别。它能诱发细胞毒性抵御肽冲击，HLA-A1阳性靶细胞和MAGE-3-表达型HLA-A1阳性黑色素瘤细胞系。所述肽用作疫苗已表明可在一些患者中诱导肿瘤消退和诱发CTL反应。
因此，所述EVDPIGHLY HLA-A1复合体提供了本发明所述TCR可靶向的癌症标志物。比如，本发明的TCR可以转入T细胞内使其可以破坏呈递该HLA复合体的肿瘤细胞，用于在称作过继治疗的治疗过程中施于患者。为此，需要所述TCR相比所述肽-HLA复合体的特异性天然TCR而言对该复合体具有更高的亲和力和/或更低的解离速率。亲和力显著增加伴有TCR基因修饰的CD8T细胞丧失抗原特异性，这会导致非特异性激活这些TCR转染的CD8T细胞，因此过继治疗优选的TCR相比所述肽-HLA复合体的特异性天然TCR而言对该复合体的亲和力稍高和/或解离速率稍低，而非对所述肽-HLA复合体的亲和力显著高于和/或解离速率显著低于天然TCR(见Zhao等(2007)J Immunol.179:5845-54;Robbins等(2008)J Immunol.180:6116-31；也可见已公开的WO2008/038002)。
TCR采用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名法进行表述，并与TCR序列的IMGT公开数据库相链接。天然α-β杂二聚体TCR具有α链和β链。宽泛地，每个链包括可变区、连接区和恒定区，β链还通常在可变区和连接区之间含有短的多变区，不过该多变区常被视为连接区的一部分。每个可变区包括嵌于构架序列中的三个CDR(互补决定区)，一个是名为CDR3的高变区。共有几种类型的α链可变区(Vα)和几种类型的β链可变区(Vβ)，通过它们的构架，CDR1和CDR2序列，以及部分限定的CDR3序列进行区分。Vα类型在IMGT命名法中通过特有的TRAV数来定名。因此，“TRAV21”限定义的TCR Vα区具有独特的构架、CDR1和CDR2序列，以及部分由TCR相互之间保守的氨基酸序列限定但还包括TCR相互之间有变化的氨基酸序列的CDR3序列。同样地，“TRBV5-1”限定的TCR Vβ区具有独特的构架、CDR1和CDR2序列，以及仅部分限定的CDR3序列。
所述TCR的连接区类似地由特有的IMGT TRAJ和TRBJ命名法限定，而恒定区由IMGT TRAC和TRBC命名法限定。
β链多变区在IMGT命名法中由缩略语TRBD定名，并如提到的，连接好的TRBD/TRBJ区常一起被视为连接区。
一般认为αβTCR的α和β链各自含有两个“结构域”，即可变和恒定结构域。可变结构域由可变区和连接区的连接体组成。因此，本发明说明书和权利要求中，术语“TCRα可变结构域”指TRAV和TRAJ区的连接体，而术语TCRα恒定结构域指胞外TRAC区，或指C端截短的TRAC序列。类似的，术语“TCRβ可变结构域”指TRBV和TRBD/TRBJ区的连接体，而术语TCRβ恒定结构域指胞外TRBC区，或指C端截短的TRBC序列。
由IMGT命名法限定的特有序列已为TCR领域相关人员熟知并可获取。例如，可在IMGT公共数据库中找到这些序列。“T cell Receptor Factsbook(《T细胞受体丛书》)”(2001)LeFranc和LeFranc,学术出版社(Acadamic Press),ISBN0-12-441352-8也公开了由IMGT命名法定义的序列，不过因为它的发表日期和时间间隔，有时需要通过参考IMGT数据库来确认信息。
我们已证实天然的MAGE-3 TCR(来源于比利时布鲁塞尔B-1200，希波克拉底斯大道74号UCL7459，鲁汶大学细胞遗传学部门Pierre G.Coulie博士的克隆EB81-103；另见Karanikas等(2003)"Monoclonal anti-MAGE-3 CTL responsesin melanoma patients displaying tumor regression after vaccination with arecombinant canarypox virus.(黑色素瘤患者中单克隆抗MAGE-3 CTL响应接种重组金丝雀痘病毒后显示肿瘤消退)"J.Immunol.171(9):4898-904))具有如下α链和β链可变、连接和恒定基因用法：
α链-TRAV21*01/TRAJ28/TRAC(SEQ ID No:2给出天然MAGE-A3 TCRα链的胞外序列)。
β链-TRBV5-1*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2(SEQ ID No:3给出天然MAGE-A3 TCRβ链的胞外序列)。(需注意，TRBV5-1序列有两个等位基因变体，IMGT命名法中分别称作TRBV5-1*01和*02，上面所指的天然MAGE-A3TCR克隆具有*01变异。同样地，TRBJ2-7序列有两个已知变体，上面所指的TCR克隆中存在*01序列。另注意，没有“*”限定符意味着相关序列只有一个已知等位基因。)
术语“野生型TCR”、“天然TCR”、“野生型MAGE-A3 TCR”和“天然MAGE-A3 TCR”在本文中同义使用，指天然产生的含有胞外α和β链SEQ IDNo:2和3的TCR。
发明内容
本发明提供一种T细胞受体(TCR)，其具有EVDPIGHLY(SEQ ID No:1)HLA-A1复合体结合特性且包含TCRα可变结构域和TCRβ可变结构域，其特征在于：所述TCRα可变结构域具有SEQ ID No:2从K1到P114的氨基酸序列，但存在至少一种以下突变：
50I突变为50V；
51Q突变为51R；
52S突变为52P；
53S突变为53Y；和/或
所述TCRβ可变结构域具有SEQ ID No:3从K1到T112的氨基酸序列，但存在至少一种以下突变：
50F突变为50T；
51S突变为51D；
52E突变为52M；
53T突变为53L；
54Q突变为54L。
本发明的TCR优选对EVDPIGHLY HLA-A1复合体的结合亲和力和/或结合半衰期至少两倍于参比MAGE-A3 TCR，所述参比MAGE-A3 TCR具有胞外α链序列SEQ ID No:6和胞外β链序列SEQ ID No:7。
需注意，SEQ ID No:6是天然α链胞外序列ID No:2但用C162替换后者的T162(即TRAC的T48)。同样，SEQ ID No:7是天然β链胞外序列ID No:3但用C169替换后者的S169(即TRBC2的S57)，用A187替换后者的C187以及用D201替换后者的N201。这些相对天然α和β链胞外序列的半胱氨酸取代使得能形成链间二硫键以稳定重折叠的可溶性TCR，即所述TCR经胞外α和β链重折叠形成。采用稳定的二硫键连接的可溶性TCR作为参比TCR能更便捷地评估结合亲和力和结合半衰期。α链SEQ ID No:6和β链SEQ ID No:7中相对天然α和β链SEQ ID No:2和3的其他突变为“沉默型”，就是说这些突变不会影响相对于天然序列的结合亲和力或结合半衰期。因此，若本发明的TCR对EVDPIGHLY HLA-A1复合体的结合亲和力和/或结合半衰期至少两倍于参比MAGE-A3 TCR，则意味着其相对于上面所指的天然MAGE-A3 TCR克隆也满足这些标准。
“具有胞外α链序列SEQ ID No:6和胞外β链序列SEQ ID No:7的参比MAGE-A3 TCR”在下文中与“参比TCR”或“参比MAGE-A3 TCR”同义使用。
结合亲和力(与平衡常数KD成反比)和结合半衰期(表述为T1/2)可用任何适当的方法来确定。应了解，TCR亲和力翻倍导致KD减半。T1/2由ln2除以解离速率(koff)计算得到。因此T1/2翻倍使得koff减半。TCR的KD和koff值通常针对可溶形式的TCR测定，即经截短以除去疏水性跨膜结构域残基的那些形式。因此可理解为，若给定TCR的可溶形式满足针对EVDPIGHLY HLA-A1复合体的结合亲和力和/或结合半衰期的要求，则该TCR即满足这些要求。优选使用相同检测方法多次，例如3次或更多次，测量给定TCR的结合亲和力和半衰期并取结果的平均值。在优选实施方式中，这些测量采用本文实施例3的表面等离子体共振(BIAcore)法进行。用该方法测得参比MAGE-A3 TCR的KD约为250μM，koff约为0.2s-1(即T1/2约为3s)。
本发明所述TCR对EVDPIGHLY HLA-A1复合体的结合亲和力和/或结合半衰期至少两倍于参比MAGE-A3 TCR，但保留可接受的EVDPIGHLYHLA-A1复合体特异性，例如与参比MAGE-A3 TCR相似。与参比MAGE-A3TCR相比，过继治疗用T细胞转染所需的TCR对所述EVDPIGHLY HLA-A1复合体具有稍高的亲和力和/或稍长的结合半衰期(尽管仍分别至少两倍于天然TCR)。
例如，本发明所述TCR对所述复合体的KD从约6μM到约70μM，和/或对所述复合体的结合半衰期(T1/2)从约1秒到约11秒。
为达本发明的目的，TCR为具有至少一个TCRα和/或TCRβ可变结构域的部分。它们一般包含TCRα可变结构域和TCRβ可变结构域。它们可能是αβ杂二聚体或可能是单链形式。为了用于过继治疗，举例而言，αβ杂二聚体TCR可能以含胞质和跨膜结构域的全长链来进行转染。如果需要，相应恒定结构域之间可能存在引入的二硫键(参见如WO2006/000830)。
无论何种形式，相对具有胞外α和β链SEQ ID No:2和3的天然MAGE-A3TCR，本发明所述TCR在其α可变结构域(SEQ ID No:2的K1到P114)和/或β可变结构域(SEQ ID No:3的K1到T112)中有突变。天然MAGE-A3或参比MAGE-A3 TCR可用作模板，引入能导致本发明所述TCR与EVDPIGHLYHLA-A1复合体之间相互作用的高亲和力和/或慢解离速率的多种突变。本发明的实施方式包括相对SEQ ID No:2的K1到P114的α可变结构域和/或SEQ IDNo:3的K1到T112的β可变结构域在至少一个互补决定区(CDR)和/或其可变结构域构架区有突变的TCR。
可采用任何适当方法进行突变，包括但不限于：基于聚合酶链式反应(PCR)、限制性酶基克隆，或不依赖连接反应的克隆(LIC)过程的那些方法。这些方法在许多标准分子生物学文本中有详细描述。关于聚合酶链式反应(PCR)诱变和限制性酶基克隆的进一步细节见Sambrook和Russell,(2001)MolecularCloning-A Laboratory Manual(《分子克隆－实验室手册》)(第三版)CSHL出版社。LIC过程的进一步信息可参见(Rashtchian,(1995)Curr Opin Biotechnol6(1):30-6)。
产生本发明的高亲和性MAGE-3 TCR的一种方法是从WO2004/044004公开的展示此类TCR的噬菌体颗粒的多样库中进行挑选。
需注意的是，包含与天然MAGE-A3 TCR或参比MAGE-3 TCR相似的Vα和Vβ基因用法并因而具有相似的可变结构域氨基酸序列的任何αβTCR可作为便捷的模板TCR。随后可以向编码模板αβTCR的一个或两个可变结构域的DNA中引入产生本发明的突变TCR所需的变化。对于本领域技术人员显而易见地，必要的突变可用多种方法引入，如定点诱变。
在一些实施方式中，本发明所述TCR具有SEQ ID No:2的K1到P114的α链可变结构域，但该序列中50I，51Q，52S或53S一个或多个位点的氨基酸残基发生突变，和/或具有SEQ ID No:3的K1到T112的β链可变结构域，但该序列中50F，51S，52E，53T或54Q一个或多个位点的氨基酸残基发生突变。例如，本发明所述TCR可能具有按SEQ ID No:2中所示编号的α链可变结构域氨基酸残基50V，51R，52P或53Y中的一个或多个，和/或按SEQ ID No:3中所示编号的β链可变结构域氨基酸残基50T，51D，52M，53L或54L中的一个或多个。
本发明的特定TCR包括含有α链可变结构域氨基酸序列SEQ ID No:8和9之一，和/或β链可变结构域氨基酸序列SEQ ID No:10和11之一的那些TCR。因此具有野生型α链的可变结构域序列(SEQ ID No:2的K1到P114)的TCR可能与具有SEQ ID No:10和11之一的β链关联。替代地，具有SEQ ID No:8和9之一的α链可能与野生型β链的可变结构域序列(SEQ ID No:3的K1到T112)关联。替代地，具有SEQ ID No:8和9之一的α链可能与具有SEQ ID No:10和11之一的β链关联。
如上所述的TCR的表型沉默变体也是本发明的一部分。术语“表型沉默变体”是指与本发明所述TCR序列一致但在恒定和/或可变结构域掺有不会改变与肽－HLA复合体相互作用的亲和力和/或解离速率的变化。此类变体的一种示例是本发明的TCR，所述TCR中TCRα恒定结构域中按SEQ ID No:2中所示编号的135丝氨酸(S)氨基酸残基替换成苯丙氨酸(F)氨基酸残基。
如上所述，本发明的αβ杂二聚体TCR可在其恒定结构域之间含有引入的二硫键。这种类型的优选TCR包括具有TRAC恒定结构域序列和TRBC1或TRBC2恒定结构域序列但TRAC的Thr48和TRBC1或TRBC2的Ser57被替换成半胱氨酸残基的TCR，所述半胱氨酸在TCR的TRAC恒定结构域序列和TRBC1或TRBC2恒定结构域序列之间形成二硫键。
无论有或没有上段中提到的引入的链间键，本发明的αβ杂二聚体TCR可具有TRAC恒定结构域序列和TRBC1或TRBC2恒定结构域序列，且TCR的TRAC恒定结构域序列和TRBC1或TRBC2恒定结构域序列可通过TRAC外显子2的Cys4和TRBC1或TRBC2外显子2的Cys2之间的天然二硫键连接。
本发明的αβ杂二聚体TCR可用于过继治疗，因此本发明包括呈递本发明所述TCR的分离细胞，特别是T细胞。许多方法适用于将编码本发明所述TCR的DNA或RNA转染入T细胞。(参见例如Robbins等,(2008)J.Immunol. 180:6116-6131)。表达本发明所述TCR的T细胞适用于基于过继治疗的MAGE-3+HLA-A1+癌症治疗。本领域技术人员已知过继治疗可得以进行的许多合适方法。(参见例如Rosenberg等,(2008)Nat Rev Cancer8(4):299-308)。
为了用于过继治疗，本发明还包括携带TCR表达载体的细胞，所述表达载体包含位于单一开放读码框内或两个不同开放读码框内的编码本发明所述TCR的核酸。本发明范围内还包括携带第一表达载体和第二表达载体的细胞，其第一表达载体包含编码本发明所述TCR的α链的核酸，其第二表达载体包含编码本发明所述TCR的β链的核酸。
欲用于过继治疗的本发明TCR由经转染的T细胞表达时是糖基化的。已熟知，转染的TCR的糖基化模式可以通过所转染基因的突变而改变。
为了施用于患者，本发明所述TCR转染的T细胞可以在药物组合物中与药学可接受载体一同提供。本发明所述的细胞通常作为无菌药物组合物的一部分进行供应，所述组合物一般包括药学可接受的载体。该药物组合物可为任何合适的形式(取决于将其施用于患者所需的方法)。其可按单位剂型提供，通常在密闭容器中提供，并可作为试剂盒的一部分来提供。此类试剂盒通常(但并非必须)包括使用说明。其可包括多种所述单位剂型。
所述药物组合物可适于通过静脉内途径来施用。此类组合物可通过制药领域任何已知方法制备，如将活性组分与载体或赋形剂在无菌状态下混合。
本发明所述物质的剂量可大范围变动，取决于所治疗的疾病或症状，待治疗个体的年龄和状况等，医师可最终决定适当的使用剂量。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明，其中涉及以下附图。
图1A和2A分别显示具有TRAV21*01/TRAJ28/TRAC基因的天然MAGE-A3 TCRα链，和具有TRBV5-1*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2基因的天然MAGE-A3 TCRβ链(分别为SEQ ID No:2和3)的胞外氨基酸序列。
图1B和2B分别显示编码可溶性野生型MAGE-A3 TCRα和β链即参比MAGE-A3 TCRα和β链的DNA序列。这些序列包括形成非天然二硫键的附加半胱氨酸残基。编码附加半胱氨酸残基的经突变密码子为粗体。NdeI和HindIII限制性酶识别序列带下划线。
图1C和2C分别显示由图1B和2B的DNA序列分别生成的可溶性野生型MAGE-A3 TCR或参比MAGE-A3 TCR的α和β链胞外的氨基酸序列(分别为SEQ ID No:6和7)，不过不含用于细菌内有效表达而插入的前导甲硫氨酸。所引入的半胱氨酸为粗体并带下划线。
图3A-B显示本发明所述MAGE-A3 TCR变体的α链可变结构域氨基酸序列。突变的残基为粗体并带下划线。
图4A-B显示本发明所述MAGE-A3 TCR变体的β链可变结构域氨基酸序列。突变的残基为粗体并带下划线。
图5A显示用于转导T细胞的野生型MAGE-A3-特异性TCR基因的DNA序列(WTα链-2A-WTβ链构建体，猪捷申病毒-12A序列为粗体并带下划线)。
图5B显示由图5的DNA序列生成的用于T细胞转导的野生型MAGE-A3-特异性TCR的氨基酸序列。猪捷申病毒-12A序列为粗体并带下划线。
图6显示ELISPOT试验中酶联免疫斑点检测中MAGE-A3 TCR转导的T细胞响应一系列靶细胞的IFN-γ释放。这些图显示较高亲和力MAGE-A3 TCR转导的T细胞相比天然MAGE-A3 TCR转导的T细胞具有增强的特异性激活。
图7显示的细胞毒性试验检测由MAGE-A3 TCR转导的T细胞杀死肿瘤细胞系。
实施例1 克隆参比MAGE-A3TCRα和β链可变区序列至pGMT7表达质粒中
从提取自MAGE-3 T细胞克隆(来源于比利时鲁汶大学Pierre Coulie的克隆EB81-103)的总cDNA中PCR扩增得到参比MAGE-A3 TCR可变α和TCR可变β结构域。就α链而言，利用α链可变区序列特异性寡核苷酸A1(ggaattccatatgaaacaagaagttactcaaattcc SEQ ID No:14)，和α链恒定区序列特异性寡核苷酸A2(ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg SEQ ID No:15)扩增α链可变区，其中A1编码限制性位点NdeI和用于有效启动细菌内表达而引入的甲硫氨酸，而A2编码限制性位点SalI。就β链而言，利用β链可变区序列特异性寡核苷酸B1(gaattccatatgaaagctggagttactcaaactccaag SEQ ID No:16)，和β链恒定区序列特异性寡核苷酸B2(tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc SEQ ID No:17)扩增β链可变区，其中B1编码限制性位点NdeI和用于有效启动细菌内表达而引入的甲硫氨酸，而B2编码限制性位点AgeI。
采用Sambrook和Russell的Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆实验室手册》)第三版中描述的标准方法，将α和β可变区克隆到含有Cα或Cβ的pGMT7表达质粒中。利用应用生物系统公司(Applied Biosystems)的3730xl DNA分析仪对质粒进行测序。
将经NdeI和SalI酶切的编码TCRα链的DNA序列接入经NdeI和XhoI酶切的pGMT7+Cα载体中。将经NdeI和AgeI酶切的编码TCRβ链的DNA序列接入同样经NdeI和AgeI酶切的另一pGMT7+Cβ载体中。
连接
将已连接的质粒转入大肠杆菌(E.coli)XL1-蓝色细胞中，接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB/琼脂平板上。37°C培养过夜后，挑取单菌落并在含100μg/ml氨苄青霉素的10ml LB中37°C振荡生长过夜。利用Miniprep试剂盒(凯杰公司)纯化克隆质粒，并利用应用生物系统3730xl DNA分析仪对质粒进行测序。
图1C和2C分别显示由图1B和2B的DNA序列分别生成的可溶性二硫键连接的参比MAGE-A3 TCRα和β链胞外氨基酸序列(分别为SEQ ID No:6和7)，不过不含用于细菌内有效表达而插入的前导甲硫氨酸。注意，α和β链的恒定区中有半胱氨酸替换，以在重折叠形成杂二聚体TCR时提供人工链间二硫键。所引入的半胱氨酸为粗体并带下划线。图1B和2B的DNA序列中的限制性酶识别序列带下划线。
实施例2 表达、重折叠和纯化可溶性参比MAGE-A3 TCR
将实施例1中制备的分别含TCRα链和β链的表达质粒各自转入大肠杆菌菌株Rosetta(DE3)pLysS中，氨苄青霉素抗性的单菌落于TYP(氨苄青霉素100μg/ml)培养基中37°C生长至OD600约为0.6-0.8后用0.5mM IPTG诱导蛋白表达。诱导3小时后于贝克曼（Beckman）J-6B中4000rpm离心30分钟收集细胞。在MgCl2和DNA酶I存在下用25ml Bug Buster(诺瓦基公司(NovaGen))裂解细胞团块。在贝克曼J2-21离心机中13000rpm离心30分钟回收包涵体团块。然后进行三次洗涤剂洗涤以去除细胞碎片和膜组分。每次将包涵体团块于曲通(Triton)缓冲液(50mM Tris-HCI pH8.0,0.5%曲通-X100,200mM NaCl,10mM NaEDTA)中匀浆后，4000rpm离心15分钟得团块。用如下缓冲液：50mMTris-HCl pH8.0,1mM NaEDTA，pH8.0，通过类似的洗涤除去洗涤剂和盐。最后，将包涵体分成30mg等份并-70°C冷冻。用6M盐酸胍溶解并在日立（Hitachi）U-2001分光光度计上测定OD来定量包涵体蛋白质得率。由消光系数计算得到蛋白浓度。
从冻存备料解冻出约15mg TCRβ链和15mg TCRα链的已溶解包涵体，稀释至10ml胍溶液(6M盐酸胍,50mM Tris HCl pH8.1,100mM NaCl,10mMEDTA,10mM二硫苏糖醇)稀释以确保链完全变性。接着将含完全还原和变性的TCR链的胍溶液注射到0.5L如下重折叠缓冲液中：100mM Tris pH8.1,400mM L-精氨酸,2mM EDTA,5M尿素。先加入氧化还原对(半胱胺盐酸盐和胱胺二盐酸盐)至终浓度分别为6.6mM和3.7mM，约5分钟后加入变性的TCR链。溶液静置约30分钟。将重折叠TCR用纤维素膜透析管(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，产品号D9402)在10L水中于5°C±3°C透析18-20小时。随后将透析缓冲液两次换成新鲜的10mM Tris pH8.1(10L)并于5°C±3°C继续透析约8小时。
将经透析的重折叠液上载到POROS 50HQ阴离子交换柱上，利用Akta纯化仪(GE医疗集团(GE Healthcare))用10mM Tris pH8.1以跨6倍柱体积的0-500mM NaCl梯度洗脱结合的蛋白，从而将可溶性TCR与错误折叠物、降解产物和杂质分离。将峰组分于4°C保存并用考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析后，汇集并浓缩。最后，利用经PBS缓冲液(西格玛公司)预平衡的GE医疗集团Superdex 75HR凝胶过滤柱纯化和鉴定可溶性TCR。汇集和浓缩相对分子量约为50kDa处洗脱的峰，然后采用BIAcore表面等离子体共振分析进行鉴定。
实施例3 结合特征
BIAcore分析
表面等离子体共振生物感应器(BIAcore 3000TM)可用于分析可溶性TCR与其肽-MHC配体的结合。这受益于可溶性生物素化的肽-HLA(“pHLA”)复合体的生成，该复合体可固定化到包被有链霉亲和素的结合表面(感应器芯片)。所述感应器芯片包括四个独立的流动池，可以同时测量T细胞受体与四个不同pHLA复合体的结合。手动注射pHLA复合体使得固定化I类分子的精密水平易于操控。
通过含有组成亚基蛋白和合成肽的细菌表达的包涵体的体外重折叠，再经过纯化和体外酶促生物素化得到生物素化I类HLA-A*01分子(O’Callaghan等(1999)Anal.Biochem.266:9-15)。HLA-A*01重链表达时带有C端生物素化标签，该标签以适当构建体中替代该蛋白的跨膜和胞质结构域。所得包涵体表达水平约为75mg/L细菌培养物。在大肠杆菌中也由适当构建体将MHC轻链或β2-微球蛋白(β2m)表达为包涵体，表达水平约为500mg/L细菌培养物。
裂解大肠杆菌细胞并纯化包涵体至约80%纯度。将合成肽(MAGE-A3EVDPIGHLY)溶解于DMSO中至终浓度4mg/ml。β2m和重链的包涵体分别于6M盐酸胍，50mM Tris pH8.1，100mM NaCl，10mM二硫苏糖醇，10mMEDTA中变性。制备的重折叠缓冲液含有0.4M L-精氨酸，100mM Tris pH8.1，3.7mM胱胺二盐酸盐，6.6mM半胱胺盐酸盐，并冷藏至低于5°C。优选先将所述肽加入重折叠缓冲液中，然后加入变性的β2m，再加入变性的重链。将MAGE-A3 EVDPIGHLY肽加入重折叠缓冲液中至4mg/L(终浓度)。然后加入30mg/Lβ2m，再是30mg/L重链(终浓度)。4°C重折叠至少1小时使其进行完全。
用10倍体积的10mM Tris pH8.1透析以置换缓冲液。需要换两次缓冲液以充分降低溶液的离子强度。此后，蛋白溶液经1.5μm醋酸纤维素滤器过滤后上载到POROS 50HQ阴离子交换柱(8ml柱床体积)。利用Akta纯化仪(GE医疗集团)用含Tris pH8.1以线性的0-500mM NaCl梯度洗脱蛋白。HLA-A*01-肽复合体约在250mM NaCl处洗脱，收集峰组分，加入蛋白酶抑制剂混合物(卡巴开公司(Calbiochem))，并将组分于冰上冷却。
将生物素标记的pHLA分子经缓冲液置换入10mM Tris pH8.1,5mMNaCl，所述置换利用平衡于同一缓冲液的GE医疗集团快速脱盐柱。洗脱后立即将含蛋白的部分于冰上冷却并加入蛋白酶抑制剂混合物(卡巴开公司)。然后加入生物素化试剂：1mM生物素，5mM ATP(缓冲至pH8)，7.5mM MgCl2和5μg/ml BirA酶(按O’Callaghan等(1999)Anal.Biochem.266:9-15所述进行纯化)。然后将混合液于室温孵育过夜。
利用凝胶过滤层析纯化所述生物素化pHLA-A*01分子。将GE医疗集团的Superdex75 HR10/30柱用经过滤PBS预平衡，上载1ml生物素化的反应混合液，并将柱用Akta纯化仪(GE医疗集团)用PBS以0.5ml/min展开。生物素化pHLA-A*01分子在约15ml时以单一峰洗脱。汇集含蛋白的部分，冰上冷却并加入蛋白酶抑制剂混合物。利用考马斯结合试验(PerBio)测定蛋白浓度，将等份的生物素化pHLA-A*01分子于-20°C冷冻保藏。
这样固定化的复合体能结合T细胞受体和共受体CD8αα，两者均可注入可溶相。可溶性TCR在可溶或固定相中使用时，所观察到的pHLA结合特性在定性和定量上均相似。这是对可溶物的部分活性的重要对照，也暗示了生物素化pHLA复合体与非生物素化复合体生物活性一样。
BIAcore3000TM表面等离子体共振(SPR)生物感应器测量小流动池内感应器表面附近的折射率的变化，以响应单位(RU)表示，此原理可用于检测受体配体相互作用和用于分析它们的亲和力和动力学参数。BIAcore实验于25°C下进行，使用PBS缓冲液(西格玛公司，pH7.1-7.5)作为电泳缓冲液和用于制备蛋白样品的稀释液。采用标准胺类偶合法将链霉亲和素固定于流动池。pHLA复合体经生物素标签固定。然后通过将可溶性TCR以恒定流速通过不同流动池的表面进行试验，从而测量SPR响应。
平衡结合常数
上述BIAcore分析方法用于确定平衡结合常数。制备二硫键连接的可溶性杂二聚体形式的参比MAGE-A3TCR的连续稀释液，以5微升/分钟恒定流速注射流过两个不同的流动池；一个包被有约1000RU的特异性EVDPIGHLYHLA-A*01复合体，第二个包被有约1000RU的非特异性HLA-A2-肽(KIFGSLAFL(SEQ ID No:18))复合体。用对照池的测量来标准化每个浓度的响应。将标准化的数据响应对TCR样品浓度作图，拟合至非线性曲线拟合模型，用以计算平衡结合常数KD。(Price和Dwek,Principles and Problems inPhysical Chemistry for Biochemists(《针对生物化学家的物理化学原理和方法》，第二版)1979，Clarendon出版社，牛津)。二硫键连接的可溶形式的参比MAGE-A3TCR(实施例2)的KD约为250μM。相同BIAcore数据得到T1/2约为3s。
动力学参数
上述BIAcore分析方法还用于确定平衡结合常数和解离速率。
通过实验测量解离速率常数koff和结合速率常数kon确定TCR(见下述实施例4)的KD。平衡常数KD计算为koff/kon。
TCR注射流过两个不同的池，一个包被有约300RU的特异性EVDPIGHLY HLA-A*01复合体，第二个包被有约300RU的非特异性HLA-A1-肽复合体。流速设定为50μl/min。通常注射250μl浓度相当于约10倍KD的TCR。然后，缓冲液流过直至响应回到基线或耗时大于2小时为止。利用BIAevaluation软件计算动力学参数。将解离相拟合成可计算半衰期的一次指数衰减方程。
实施例4 产生参比MAGE-A3 TCR的变体
噬菌体展示是一种手段，藉此产生MAGE-A3 TCR变体库用以鉴定亲和力较高的突变体。可对实施例2的MAGE-A3 TCR施用(Li等(2005)Nature Biotech23(3):349-354)中描述的TCR噬菌体展示和筛选方法。
鉴定出亲和力和/或亲和半衰期至少两倍于参比MAGE-A3 TCR(因此意味着至少两倍于天然TCR)的TCR，它们含有按SEQ ID No:2中所示编号的α链可变结构域氨基酸残基50V，51R，52P或53Y中的一个或多个，和/或按SEQID No:3中所示编号的β链可变结构域氨基酸残基50T，51D，52M，53L或54L中的一个或多个。
图3A-B和4A-B分别显示较高亲和力TCR的α链(SEQ ID No:8和9)和β链(SEQ ID No:10和11)的可变区氨基酸序列的特定示例。这些α链在CDR2中突变，β链在CDR2中突变。
利用上文实施例2的方法重折叠TCR杂二聚体(包括在恒定区引入半胱氨酸以提供人工的链间二硫键)。按该方式制备包括TCR，其组成为：(a)参比TCRβ链与含有可变结构域SEQ ID No:8和9的α链；(b)参比TCRα链与含有可变结构域SEQ ID No:10和11的β链；以及(c)含有突变可变结构域的β和α链的多种组合。
利用上述BIAcore方法分析这些可溶性二硫键连接的MAGE-A3 TCR与EVDPIGHLY HLA-A*01复合体之间的相互作用，结合数据如表1所示。
表1
实施例5 以天然MAGE-A3 TCR的变体转染T细胞
(a)表达(Express-In)介导瞬态转染293T细胞制备慢病毒载体
采用第三代慢病毒包装系统包装含所需TCR的编码基因的慢病毒载体。利用Express-In介导转染(开放生物系统公司(Open Biosystems))将4个质粒(含有如实施例5c所述的TCRα链-P2A-TCRβ链单一开放读码框基因的1个慢病毒载体，和含有构建传染性但非复制性慢病毒颗粒所需其它组分的3个质粒)转染入293T细胞。
为了转染，取处于指数生长期的293T细胞的一个T150培养瓶，其中细胞均匀分布于平板上，略超过50%汇合。将Express-In等份试样置于室温。取3ml无血清培养基(RPMI1640+10mM HEPES)置于15ml无菌锥形管中。将174μlExpress-In试剂直接加到无血清培养基中(试剂与DNA重量比为3.6:1)。翻转试管3-4次以充分混匀，室温孵育5-20分钟。
在单独的1.5ml微管中，将15μg质粒DNA加入预混匀的封装等份混匀液中(含18μg pRSV.REV(Rev表达质粒)，18μg pMDLg/p.RRE(Gag/Pol表达质粒)，7μg pVSV-G(VSV糖蛋白表达质粒))，通常约22μl，并上下抽吸以确保DNA混合液均匀。将约1ml Express-In/无血清培养基滴加到DNA混合液中，轻柔上下抽吸后，移回至剩下的Express-In/无血清培养基中。翻转该管3-4次，室温孵育15-30分钟。
除去细胞培养瓶中的旧培养基。将Express-In/培养基/DNA(3ml)复合体直接加入竖直的293T细胞培养瓶的底部。缓慢放平培养瓶以盖住细胞，温和振动培养瓶确保分散均匀。1分钟后加入22ml新鲜培养基(R10+HEPES:RPMI1640，10%热失活的FBS，1%青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺，10mM HEPES)，小心放回培养箱中。于37°C/5%CO2培养过夜。24小时后，收集含已包装慢病毒载体的培养基。
为了收集已包装的慢病毒载体，将细胞培养上清液滤过0.45微米的尼龙注射过滤器，培养基于10,000g离心18小时(或112,000g离心2小时)，除去大部分上清液(小心不要搅动团块)，然后将团块重悬浮在剩余的几毫升上清液(通常每管31ml初始体积剩余约2ml)重新悬浮沉淀。以1ml等份于干冰上快速冷冻，-80°C保藏。
(b)用含感兴趣基因的已包装慢病毒载体转导T细胞
在用已包装慢病毒载体转导前，从健康志愿者的血液中分离出人体T细胞(CD8或CD4或两者，取决于需求)。对这些细胞计数，并在48孔平板上以每毫升1×106细胞(0.5ml/孔)于含50U/ml IL-2的R10中与经预洗涤的抗CD3/CD28抗体包被微珠(Dynal T细胞扩增子，英俊公司(Invitrogen))一起以每个细胞3粒微珠的比例孵育过夜。
刺激过夜后，将0.5ml纯的已包装慢病毒载体加入所需细胞中。于37°C/5%CO2培养3天。转导3天后对细胞计数并稀释至0.5×106个细胞/毫升。按需要加入含IL-2的新鲜培养基。转导5-7天后除去微珠。对细胞计数，每两天替换或加入含IL-2的新鲜培养基。使细胞保持在0.5×106到1×106个细胞/毫升之间。第三天起用流式细胞仪分析细胞，第五天起进行细胞功能试验(如酶联免疫斑点(ELISpot)分析IFNγ释放)。第十天起或者当细胞减缓分裂且尺寸缩小时，按至少4×106个细胞/瓶(90%FBS/10%DMSO中1×107个细胞/毫升)等份冷冻细胞用于保藏。
(c)用于上述方法(a)和(b)中T细胞转染的野生型(wt)TCR基因
图5A为编码天然MAGE-A3 TCR的DNA序列(SEQ ID No:12)(密码子优化以实现最高的人细胞表达)。它是全长α链(TRAV21)-猪捷申病毒-12A-全长β链(TRBV5-1)单一开放读码框构建体。2A序列带下划线，前面为编码弗林蛋白酶切割位点的核苷酸以协助蛋白水解去除2A序列(下面就图5B(SEQ IDNo:13)作进一步讨论)。mRNA的蛋白翻译时在2A序列的3’端肽键跳读，生成两个蛋白：1)αTCR链-2A融合蛋白；2)βTCR链。SEQ ID No:12包括NheI和SalI限制性位点(带下划线)。
图5B为对应于图5A的氨基酸序列(SEQ ID No:13)。
图5B中：
M1-S19为野生型α链TCR成熟时除去的前导序列；
K20-S227对应于野生型α链序列SEQ ID No:2；
K20-R254对应于野生型α链胞外结构域；
I255-L271为成熟TCR的α链跨膜区；
W272-S274为成熟TCR的α链胞内区；
R277-R280为协助高尔基体中蛋白水解去除P2A序列A285-P303的弗林蛋白酶切割位点；
G275,S276,S281至G284,R304为柔性接头，使弗林蛋白酶切割和P2A序列的功能得以充分发挥；
M305-V323为野生型β链TCR成熟时除去的前导序列；
K324-D565对应于野生型β链序列SEQ ID No:3；
K324-E585对应于野生型β链胞外结构域；
I586-V607为成熟TCR的β链跨膜区；
K608-G614为成熟TCR的β链胞内区。
(d)野生型和高亲和力MAGE TCR转染T细胞
按上面(a)和(b)所述步骤，利用两种DNA构建体独有的NheI和SalI限制性位点将MAGE-A3 α wt2A_β wt TCR基因(SEQ ID No:12(图5A))插入到pELNSxv慢病毒载体中，然后产生经转染的T细胞。
类似地，可通过转染与SEQ ID No:12(图5A)相同的基因产生T细胞，但所用基因编码(a)具有野生型α链SEQ ID No:2的可变结构域序列(K1到P114)关联含SEQ ID No:10或11之一的β链可变结构域的TCR；或(b)含SEQ ID No:8或9之一的α链可变结构域，其关联野生型β链SEQ ID No:3的可变结构域序列(K1到T112)；或(c)含SEQ ID No:8或9之一的α链可变结构域，其关联含SEQ ID No:10或11之一的β链可变结构域。
实施例6 对肿瘤细胞系的响应中MAGE-A3改良亲和力TCR所转导T细胞相比野生型亲和力的激活增强
酶联免疫斑点法原理
为了证实TCR转导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在肿瘤细胞系响应中的激活，进行以下试验。利用酶联免疫斑点法测量IFN-γ的生成，用作细胞毒性T淋巴细胞(CTL)激活的读数。
试剂
试验介质：10%胎牛血清(吉布可公司(Gibco)，目录号2011-09)，88%RPMI1640(吉布可公司，目录号42401)，1%谷氨酰胺(吉布可公司，目录号25030)和1%青霉素/链霉素(吉布可公司，目录号15070-063)。
洗涤缓冲液：0.01M PBS/0.05%吐温20
PBS(吉布可公司，目录号10010)
人IFNγELISPOT PVDF-酶促试剂盒(法国戴克隆公司(Diaclone)，目录号856.051.020)含有所有其他所需试剂。(捕获和检测抗体，脱脂奶粉，牛血清白蛋白，链霉亲和素碱性磷酸酶和BCIP/NBT溶液以及人IFN-γPVDF ELISPOT96孔板)。
方法
靶细胞制备
本方法中使用的靶细胞为天然的表位呈递细胞：HCT-116结肠癌和NCI-H1975非小细胞肺癌均为HLA-A1+MAGE+。HLA-A1+MAGE－型N3正常人表皮黑色素细胞用作阴性对照。通过在Megafuge1.0(贺利氏公司(Heraeus))中1200rpm离心10分钟，将足量靶细胞(50,000个细胞/孔)洗涤3次。然后将细胞按106个细胞/ml重悬浮于试验介质中。
效应细胞制备
本方法中使用的效应细胞(T细胞)为1:1混合的CD4+和CD8+T细胞(通过阴性挑选(利用CD4和CD8阴性分离试剂盒，Dynal)获得)。将细胞用抗CD3/CD28包被的小球(T细胞扩增子，英俊公司)激发，用携带编码感兴趣全长αβTCR(基于实施例5所述和图5B所示的构建体)基因的慢病毒转导，并在含50U/ml IL-2的试验介质中扩增至转导后10到13天。将这些细胞置于试验介质中然后在Megafuge1.0(贺利氏公司)中1200rpm离心10分钟进行洗涤。然后将细胞重悬浮于试验介质中至4×所需终浓度。
酶联免疫斑点试验(ELISPOT）
按如下方式准备平板：每个平板取100μl抗IFN-γ捕获抗体稀释于10ml无菌PBS中。将100μl稀释的捕获抗体等份加入每个孔内。将平板于4°C孵育过夜。孵育后洗涤平板(程序1，板型2，Ultrawash Plus96-孔洗板机，丹尼克斯公司(Dynex))以移除捕获抗体。每个孔中加入100μl含2%脱脂牛奶的无菌PBS以封闭平板，将平板于室温孵育两小时。然后洗去平板上的脱脂牛奶(程序1，板型2，Ultrawash Plus96-孔洗板机，丹尼克斯公司)，将ELISPOT平板于纸巾上轻拂轻拍以除去残留的洗涤缓冲液。
然后按如下顺序将试验成分加到ELISPOT平板中：
50μl106个细胞/ml的靶细胞(共给出50,000个靶细胞/孔)。
使每孔终体积为200μl的足量介质(试验介质)。
50μl效应细胞(5,000个混合的经转导CD4/8+细胞/孔)。
平板孵育过夜(37°C/5%CO2)。第二天将平板用洗涤缓冲液洗涤三次(程序1，板型2，Ultrawash Plus96-孔洗板机，丹尼克斯公司)，于纸巾上轻拍以除去多余的洗涤缓冲液。然后向每个孔中加入100μl初级检测抗体。向戴克隆公司试剂盒中提供的一瓶检测抗体中加入550μl蒸馏水来制备所述初级检测抗体。取100μl该溶液稀释于10ml PBS/1%牛血清白蛋白中(单块平板所需体积)。平板室温孵育至少两小时后，用洗涤缓冲液洗涤三次(程序1，板型2，UltrawashPlus96-孔洗板机，丹尼克斯公司)，于纸巾上轻拍以除去多余的洗涤缓冲液。
通过向每个孔中加入100μl稀释的链霉亲和素碱性磷酸酶然后将平板室温孵育1小时来进行第二次检测。将10μl链霉亲和素碱性磷酸酶加到10mlPBS/1%牛血清白蛋白(单块平板所需体积)中来制得所用链霉亲和素碱性磷酸酶。然后将平板用洗涤缓冲液洗涤三次(程序1，板型2，Ultrawash Plus96-孔洗板机，丹尼克斯公司)，于纸巾上轻拍以除去多余的洗涤缓冲液。然后向每个孔中加入100μl戴克隆公司试剂盒中所提供的BCIP/NBT溶液。反应过程中用箔片覆盖平板，静置5-15分钟。在此期间定期检查平板斑点确定终止反应的最佳时间。将平板在盛满自来水的水槽中洗涤以终止反应，振干后拆卸成三个组成部件。将平板置于50°C干燥1小时后用免疫斑点读板机(CTL；细胞技术有限公司)计数膜上生成的斑点。
结果
采用酶联免疫斑点试验(如上所述)测定对多种MAGE-A3-阳性和对照肿瘤细胞系响应中已激活的经TCR转导T细胞的IFNγ释放。用Prism(Graph Pad公司)对每个孔内观察到的酶联免疫斑点数作图。
将表达a)TCR No:1，b)TCR No:2，c)TCR No:3，d)TCR No:4或e)TCRNo:5(如下表所述)的CD4+，CD8+或混合CD4+/CD8+T细胞与MAGE-A3+HLA:A1+肿瘤细胞系HCT-116或NCI-H1975或者与MAGE-A3-HLA:A1+N3黑色素细胞一起孵育。未转导的T细胞(Nt)也用作阴性对照。
| TCR编号 | TCRα可变结构域SEQ ID NO: | TCRβ可变结构域SEQ ID NO: |
| 1 | SEQ ID No:2的K1到P114 | SEQ ID No:3的K1到T112 |
| 2 | 9 | SEQ ID No:3的K1到T112 |
| 3 | 8 | SEQ ID No:3的K1到T112 |
| 4 | SEQ ID No:2的K1到P114 | 10 |
| 5 | SEQ ID No:2的K1到P114 | 11 |
图6证实TCR No:1转导的T细胞在肿瘤细胞系响应中不释放IFNγ。TCRNo:2转导的T细胞只响应HCT-116结肠癌细胞而释放IFNγ。
亲和力增强的MAGE-A3 TCRNo:3,4和5转导的T细胞对HCT-116细胞有较高响应值，但对NCI-H1975细胞也有响应。
实施例7 MAGE-A3改良亲和力TCR转导的T细胞在肿瘤细胞系响应中的细胞毒性高于野生型
本试验是对51Cr释放放射性细胞毒性试验的比色替代并定量测量细胞裂解所释放的酶：乳酸脱氢酶(LDH)。利用30分钟的酶偶联试验来测量培养上清液中释放的LDH，该酶使四唑盐(INT)转化成红色甲
产物。产生的颜色深度与裂解的细胞数成正比。采用标准96孔读板机采集490nm处的吸光值。
材料
-培养基：10%胎牛血清(热失活的，吉布可公司，目录号10108-165)，含酚红的88%RPMI1640(英俊公司，目录号42401042)，1%谷氨酰胺，200mM(英俊公司，目录号25030024)，1%青霉素/链霉素(英俊公司，目录号15070063)
-试验介质：10%胎牛血清(热失活的，吉布可公司，目录号10108-165)，不含酚红的88%RPMI 1640(英俊公司，目录号32404014)，1%谷氨酰胺，200mM(英俊公司，目录号25030024)，1%青霉素/链霉素(英俊公司，目录号15070063)-Nunc微孔圆底96孔组织培养板(能肯（Nunc）公司，目录号163320)
-Nunc-免疫Maxisorb板(能肯公司，目录号442404)
方法
靶细胞制备
本试验中使用的靶细胞(T)为用或未用shRNA敲减MAGE-A3/6蛋白表达(敲减操作如下所述)的HCT-116结肠癌细胞系(HLA-A1+MAGE-A3+)。于试验介质中制备靶细胞：靶细胞浓度调成2×105个细胞/ml，使50μl给出1×104细胞/孔。
siRNA敲减MAGE-A3/6
按生产商的说明，用编码MAGE-A3/6 shRNA(圣克鲁斯（Santi Cruz）生物技术公司，目录号sc-45284-V)的慢病毒颗粒转导HCT-116细胞。简略地，96孔平底组织培养平板的每个孔中接种入4×104个细胞(100μl/孔)，孵育过夜使其贴壁。目标为约50%汇合。第二天将10μl培养基换成10μl100μg/ml聚凝胺(稀释于培养基中；圣克鲁斯生物技术公司，目录号sc-134220)，使每个孔中终浓度为5μg/ml。室温缓慢解冻含shRNA慢病毒颗粒的上清液并轻柔混匀。然后向每个孔中加入60μl含shRNA慢病毒颗粒的上清液和40μl培养基，使每个孔中总体积为200μl，然后将细胞培养过夜。18小时后轻柔除去培养基，用200μl不含聚凝胺的新鲜培养基替换。次日将细胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA(英俊公司，目录号25200)脱离并植入6孔平板内，用以在含5μg/ml盐酸嘌呤霉素(圣克鲁斯生物技术公司，目录号sc-108071)的新鲜培养基中扩增，以挑选表达shRNA的细胞。几轮扩增后将细胞冷冻。利用蛋白质印迹法评估MAGE-A3/6蛋白表达的敲减。
效应细胞制备
本试验中使用的效应细胞(E)为按前述方法(实施例7)受激、转导并扩增的混合CD8+和CD4+T细胞(1:1)。效应细胞和靶细胞比例为1.25:1。在试验介质中制备效应细胞；细胞浓度调成2.5×105个细胞/ml，使50μl含1.25×104个细胞。
试验准备
按如下顺序将试验成份加到平板中：
-试验介质(每孔共150μl)
-每孔50μl靶细胞(如前述制备)
-每孔50μl效应细胞(如前述制备)
如下所述准备几个对照：
-效应自发释放：单独50μl效应细胞。
-靶细胞自发释放：单独50μl靶细胞。
-靶细胞最大释放：单独50μl靶细胞＋10μl地高辛(600μg/ml，使终浓度40μg/ml)。
-试验介质对照：单独150μl介质。
-裂解液的试验介质体积对照：150μl介质＋10μl地高辛。
所有孔都准备三个平行，终体积150μl。
将平板于250×g离心4分钟，然后37°C孵育24小时。将平板250×g离心4分钟。从试验平板的每个孔中移取50μl上清液至平底96孔Nunc Maxisorb板的相应孔中。用试验缓冲液(12ml)重溶底物混合物。板的每个孔中加入50μl重溶的底物混合物。用铝箔覆盖平板并室温孵育30分钟。板的每个孔中加入50μl终止溶液以终止反应。加入终止溶液后的1小时内用ELISA读板机记录490nm处的吸光度。
结果计算
实验的、靶细胞自发释放的和效应细胞自发释放的所有吸光值中减去培养基本底的吸光值平均值。
靶细胞最大释放对照所得的吸光值中减去体积校正对照的吸光值平均值。
在如下方程中利用前两步所得的校正值计算细胞毒性百分比：
%细胞毒性＝100×(实验值-效应自发值-靶自发值)/(靶最大值-靶自发值)
结果
图7显示经转导以表达TCR No:1、TCR No:2或TCR No:3(如下表所述)的T细胞特异性杀死结肠癌细胞。TCR No:2转导的T细胞和TCR No:3转导的T细胞杀死表达MAGE-A3的HCT-116结肠癌细胞，其细胞毒性比野生型TCR No:1转导的T细胞高。利用shRNA敲减HCT-116细胞的MAGE-A3/6蛋白表达(T(M-))时这种杀死减弱。
| TCR编号 | TCRα可变结构域SEQ ID NO: | TCRβ可变结构域SEQ ID NO: |
| 1 | SEQ ID No:2的K1到P114 | SEQ ID No:3的K1到T112 |
| 2 | 8 | SEQ ID No:3的K1到T112 |
| 3 | SEQ ID No:2的K1到P114 | 10 |
Claims (13)
1.一种T细胞受体(TCR)，其具有结合EVDPIGHLY(SEQ ID No:1)HLA-A1复合体的特性且包括TCRα可变结构域和TCRβ可变结构域，其特征在于：
所述TCRα可变结构域具有SEQ ID No:2从K1到P114的氨基酸序列，但存在至少一种以下突变：
50I突变为50V；
51Q突变为51R；
52S突变为52P；
53S突变为53Y；和/或
所述TCRβ可变结构域具有SEQ ID No:3从K1到T112的氨基酸序列，但存在至少一种以下突变：
50F突变为50T；
51S突变为51D；
52E突变为52M；
53T突变为53L；
54Q突变为54L。
2.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR包含α链可变结构域氨基酸序列SEQ ID No:8和9中的一个。
3.如权利要求1或2所述的TCR，其特征在于，所述TCR包含β链可变结构域氨基酸序列SEQ ID No:10和11中的一个。
3、如前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR还具有α链TRAC恒定结构域和β链TRBC1或TRBC2恒定结构域，或具有经截短或替换修饰的α链TRAC和β链TRBC1或TRBC2恒定结构域，所述修饰用以去除TRAC外显子2的Cys4和TRBC1或TRBC2外显子2的Cys2之间的天然二硫键。
4.如前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述TCR为αβ杂二聚体TCR，且具有α和β链恒定结构域序列，其中TRAC的Thr48和TRBC1或TRBC2的Ser57被替换成半胱氨酸残基，所述半胱氨酸在TCR的α和β恒定结构域之间形成二硫键。
5.编码前述权利要求中任一项所述的TCR的核酸。
6.携带TCR表达载体的细胞，所述载体包含位于单一开放读码框或两个不同开放读码框中的如权利要求5所述的核酸。
7.携带第一表达载体和第二表达载体的细胞，所述第一表达载体包含编码权利要求1至4中任一项所述的TCR的α链的核酸，所述第二表达载体包含编码权利要求1至4中任一项所述的TCR的β链的核酸。
8.一种细胞，所述细胞在其表面展示权利要求1至4中任一项所述的TCR。
11.如权利要求8所述的细胞，所述细胞呈递具有SEQ ID No:8所示α链可变结构域和SEQ ID No:3所示β链的TCR。
12.如权利要求8所述的细胞，所述细胞呈递具有SEQ ID No:9所示α链可变结构域和SEQ ID No:3所示β链的TCR。
13.如权利要求8所述的细胞，所述细胞呈递具有SEQ ID No:2所示α链和SEQ ID No:10所示β链可变结构域的TCR。
14.如权利要求8所述的细胞，所述细胞呈递具有SEQ ID No:2所示α链和SEQ ID No:11所示β链可变结构域的TCR。
15.一种药物组合物，其包括多种如权利要求6至14中任一项所述的细胞和一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。
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