MX2013000989A - Receptores de celulas t. - Google Patents
Receptores de celulas t.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de enlazarse al complejo de EVDPIGHLY HLA-Al y que comprende un TCR de tipo silvestre especificado el cual tiene mutaciones específicas en el dominio variable alfa de TCR y/o el dominio variable beta de TCR para incrementar la afinidad. Estos TCR son útiles para una terapia adoptiva.
Description
RECEPTORES DE CELULAS T
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a receptores de células T (TCR, por sus siglas en inglés) los cuales se enlazan al péptido EVDPIGHLY (derivado de la proteína MAGE-3) presentado como un complejo de péptido-HLA-Al , los TCR son mutados en relación con los dominios variables alfa y/o beta de TCR específico para MAGE-A3 nativo y tienen afinidades de enlace para, y/o vidas medias de enlace para, el complejo por lo menos al doble de aquellas de un TCR específico para MAGE-A3 de referencia.
Antecedentes de la Invención
El péptido EVDPIGHLY (SEC ID No: 1) corresponde a los números de residuos de aminoácidos 168-176 de la proteína MAGE-3 conocida. La proteína MAGE-3 es expresada en muchos tipos de tumores, que incluyen melanomas y otros tumores sólidos tales como Carcinoma de Células Escamosas de Cabeza y Cuello, pulmonar, de vejiga, gástrico y esofágico. El péptido de MAGE-3 EVDPIGHLY (SEC ID No : 1) es el epítopo de MAGE-3 mejor caracterizado. Es reconocido por las células T restringidas tanto a HLA-A1 como a HLA-B35. Es capaz de producir una actividad citotóxica contra células objetivo positivas para HLA-A1, pulsadas con péptidos y líneas de células de melanoma positivas HLA-A1 que expresan la MAGE-3.
Ref. 238411 Se ha mostrado que el péptido, utilizado como una vacuna, induce la regresión de tumores y produce respuestas de CTL en algunos de esos pacientes.
Por lo tanto, el complejo EVDPIGHLY HLA-A1 proporciona un marcador de cáncer que los TCR de la invención pueden fijar como objetivo. Por ejemplo, los TCR de la invención se pueden transformar en células T, volviéndolas capaces de destruir células tumorales que presentan ese complejo de HLA, para la administración a un paciente en el proceso de tratamiento conocido como terapia adoptiva. Para este propósito, sería deseable si los TCR tuvieran una afinidad más alta y/o una constante de disociación más lenta para el complejo de péptido-HLA que los TCR nativos específicos para ese complejo. Los incrementos dramáticos en la afinidad han sido asociados con una pérdida de especificidad de antígenos en las células T CD8 modificadas genéticamente con TCR, lo cual podría dar por resultado la activación no específica de estas de células T CD8 transíectadas con TCR, de modo que los TCR que tienen una afinidad algo más alta y/o una constante de disociación algo más lenta para el complejo de péptido-HLA que los TCR nativos específicos . para ese complejo, pero no una afinidad dramáticamente más alta y/o una constante de disociación dramáticamente más lenta para el complejo de péptido-HLA que los TCR nativos, se preferirían para una terapia adoptiva (véase Zhao y colaboradores, (2007) J Iwmunol . 179: 5845-54; Robbins y colaboradores, (2008) J Inmuno1. 180: 6116-31 y véase también el documento publicado WO 2008/038002) .
Los TCR se describen utilizando la nomenclatura de TCR de International Immunogenetics (IMGT) y los vínculos a la base de datos pública de IMGT de las secuencias de TCR. Los TCR heterodiméricos alfa-beta nativos tienen una cadena alfa y una cadena beta. En general, cada cadena comprende regiones variables, de unión y constantes y la cadena beta también contiene usualmente una región corta de diversidad entre las regiones variables y de unión, pero esta región de diversidad se considera frecuentemente como parte de la región de unión. Cada región variable comprende tres CDRs (Regiones Determinantes de Complementariedad) integradas en la secuencia de estructura, una es la región hipervariable llamada CDR3. Existen varios tipos ; de regiones variables de cadena alfa (Va) y varios tipos de regiones variables de cadena beta (?ß) distinguidas por jsu estructura, secuencias de CDR1 y CDR2 , y por una secuencia de CDR3 definida parcialmente. Los tipos Va son referidos en la nomenclatura de IMGT por un número de TRAV único,'. De esta manera, "TRAV21" define una región Va de TCR que tiene una estructura única y secuencias de CDR1 y CDR2 y una secuencia de CDR3 la cual es definida parcialmente por una secuencia de aminoácidos la cual se conserva de TCR a TCR pero la cual también incluye una secuencia de aminoácidos la cual varía de TCR a TCR. De la misma manera, "TRBV5-1" define una región ?ß de TCR que tiene una estructura única y secuencias de CDRl y CDR2, pero con solo una secuencia de CDR3 definida parcialmente.
Las regiones de unión del TCR son definidas similarmente por la nomenclatura de IMGT TRAJ y TRBJ única y las regiones constantes por la nomenclatura de IMGT TRAC y TRBC.
La región de diversidad de cadena beta es referida en la nomenclatura de IMGT por la abreviación TRBD y, como se mencionara, las regiones TRBD/TRBJ concatenadas se consideran frecuentemente juntas como la región de unión.
Se considera generalmente que las cadenas a y ß de los TCR aß tienen cada una dos "dominios" , específicamente dominios variable y constante. El dominio variable consiste de una concatenación de región variable y región de unión. En la presente descripción y reivindicaciones, el término "dominio variable alfa de TCR" se refiere por lo tanto a la concatenación de regiones TRAV y TRAJ y el término dominio constante alfa de TCR se refiere a la región TRAC extracelular o una secuencia de TRAC truncada C-terminal. Del mismo modo, el término "dominio variable beta de TCR" se refiere a la concatenación de TRBV y regiones TRBD/TRBJ y el término dominio constante beta de TCR se refiere a la región TRBC extracelular o a una secuencia de TRBC truncada C-terminal .
Las únicas secuencias definidas por la nomenclatura de IMGT son conocidas ampliamente y son accesibles para aquellas personas que trabajan en el campo de TCR. Por ejemplo, se pueden encontrar en la base de datos pública de IMGT. El documento "T cell Receptor Factsbook" , (2001) LeFranc y LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8 también da a conocer secuencias definidas1 por la nomenclatura de IMGT, pero debido a su fecha de publicación y retraso consecuente, la información en el mismo necesita ser confirmada algunas veces por referencia a la base de datos de IMGT .
Se ha confirmado que un TCR específico para MAGE-3 nativo (Clon EB81-103 del Doctor Pierre G. Coulie, Unidad de Genética Celular, Universidad de Lovain, Avenida Hippocrate 74, UCL 7459, B-1200 Bruselas, ' Bélgica; véase también Karanikas, y colaboradores (2003) "Monoclonal anti-MAGE-3 CTL responses in melanoma patients displaying tumor regression after vaccination with a recombiriant canarypox virus" . J\_ Immunol . 171(9): 4898-904)) tiene :el siguiente uso de genes V, J y C de cadena alfa y cadena béta:
Cadena alfa - TRAV21*01/TRAJ28/TRAC (la secuencia extracelular de la cadena alfa de TCR específico para MAGE-A3 nativo se proporciona en la SEC ID No: 2)
Cadena beta: - TRBV5-1*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2 (la secuencia extracelular de la cadena beta de TCR específico para MAGE-A3 nativo se proporciona en la SEC ID No: 3) . (Se debe observar que la secuencia de TRBV5-1 tiene 2 variantes alélicas, designadas en la nomenclatura de IMGT como TRBV5-l*0l y *02 respectivamente y el clon de TCR específico para MAGE-A3 nativo referido anteriormente tiene la variación *01. De la misma manera, la secuencia de TRBJ2-7 tiene dos variaciones conocidas y es la secuencia *01 la cual está presente en el clon de TCR referido anteriormente. También se debe observar que la ausencia de un calificador "*" significa que solo se conoce un alelo para la secuencia relevante) .
Los términos "TCR de tipo silvestre" , "TCR nativo" , "TCR específico para MAGE-A3 de tipo silvestre" y "TCR específico para MAGE-A3 nativo" se utilizan a manera de sinónimo en este documento para referirse a este TCR de origen natural que tiene las SEC ID Nos: 2 y 3 de cadena alfa y beta extracelular.
Breve Descripción de la Invención
De acuerdo con la invención, se proporciona un receptor de células T (TCR) que, tiene la propiedad de enlazarse al complejo de EVDPIGHLY (SEC ID No: 1) HLA-A1 y que comprende un dominio variable alfa de TCR y un dominio variable beta de TCR, caracterizado porque
el dominio variable alfa de TCR tiene la secuencia de aminoácidos desde Kl hasta P114 de la SEC ID No: 2 excepto que por lo menos una de las siguientes mutaciones está presente, específicamente
501 es mutado a 50V;
51Q es mutado a 5IR;
52S es mutado a 52P;
53S es mutado a 53Y; y/o
el dominio variable beta de TCR tiene la secuencia de aminoácidos desde Kl hasta T112 de la SEC ID No: 3 excepto que por lo menos una de las siguientes mutaciones está presente, específicamente
50F es mutado a 50T;
51S es mutado a 51D,
52E es mutado a 52M;
53T es mutado a 53L;
54Q es mutado a 54L.
Los TCR de la invención tienen preferiblemente una afinidad de enlace para, y/o una vida media de enlace para, el complejo de EVDPIGHLY-HLA-A1 por lo menos al doble de aquellas de un TCR específico para MAGE-A3 de referencia, el TCR específico para MAGE-A3 de referencia tiene la secuencia SEC ID No : 6 de cadena alfa extracelular y la secuencia SEC ID No: 7 de cadena beta extracelular.
Se debe observar que la SEC ID No: 6 es la secuencia ID No. 2 extracelular de cadena alfa nativa excepto que C162 ha sido sustituido por T162 (es decir T48 de TRAC) . Del mismo modo, la SEC ID No : 7 es la secuencia ID No. 3 extracelular de cadena beta nativa excepto que C169 ha sido sustituido por S169 (es decir S57 de TRBC2) , A187 ha sido sustituido por C187 y D201 ha sido sustituido por N201. Estas sustituciones de cisteína en relación con las secuencias extracelulares de cadena alfa y beta nativas hacen posible la formación de un enlace de disulfuro entre cadenas el cual estabiliza el TCR soluble, replegado, es decir el TCR formado al replegar cadenas alfa y beta extracelulares. El uso del TCR soluble unido a disulfuro estable como el TCR de referencia hace posible una evaluación más conveniente de la afinidad de enlace y la vida media de enlace. Las otras mutaciones en la SEC ID No. 6 de cadena alfa y la SEC ID No: 7 de cadena beta en relación con las SEC ID Nos: 2 y 3 de cadenas alfa y beta nativas son "silenciosas" en el sentido de que no afectan la afinidad de enlace o la vida media de enlace en relación con la secuencia nativa. Por lo tanto, si un TCR de la invención tiene una afinidad de enlace para, y/o una vida media de enlace para, el complejo EVDPIGHLY-HLA-A1 por lo menos al doble de aquellas del TCR específico para MAGE-A3 de referencia, también . satisface implícitamente aquellos criterios con respecto al clon de TCR específico para MAGE-A3 nativo referido anteriormente.
El "TCR específico para MAGE-A3 de referencia que tiene la secuencia de cadena alfa extracelular SEC ID No: 6 y la secuencia de cadena beta extracelular SEC ID No: 7" es referido a manera de sinónimo en ló sucesivo de ya sea "el TCR de referencia" o "el TCR específico para MAGE-A3 de referencia" .
La afinidad de enlace (inversamente proporcional a la constante de equilibrio KD) y la vida media de enlace (expresada como T1/2) se puede determinar por medio de cualquier método apropiado. Se apreciará que la duplicación de la afinidad de un TCR da por resultado la división por la mitad de la KD. T1/2 se calcula como In2 dividido por la constante de disociación (koff) . La duplicación de esta manera de T1/2 da por resultado una división por la mitad en la koft · Los valores de KD y- k0ff para los TCR se miden usualmente para formas solubles del TCR, es decir aquellas formas las cuales son truncadas para retirar los residuos de dominio transmembrana hidrófobos. Por lo tanto, se debe entender que un TCR determinado satisface el requerimiento que éste tiene una afinidad de enlace para, y/o una vida media de enlace para, el complejo de EVDPIGHLY-HLA-Al si una forma soluble de ese TCR satisface ese requerimiento. Preferiblemente, la afinidad de enlace o la vida media de enlace de un TCR determinado se mide varias veces, por ejemplo 3 o más veces, utilizando el mismo protocolo de ensayo, y se toma un promedio de los resultados. En una modalidad preferida, estas mediciones se hacen utilizando el método de Resonancia de Plasmón Superficial (BIAcore) del Ejemplo 3 en este documento. El TCR específico para MAGE-A3 de referencia tiene una KD de aproximadamente 250 µ? medida por medio de ese método y la koff fue aproximadamente 0.2 s"1 (es decir el T1/2 fue aproximadamente 3 s) .
Los TCR de la invención tienen una afinidad y/o vida media de enlace para el complejo de EVDPIGHLY HLA-Al por lo menos al doble de aquellas del TCR específico para MAGE-A3 de referencia, mientras que retienen una especificidad aceptable para el complejo de EVDPIGHLY HLA-Al, por ejemplo similar al TCR específico para AGE-A3 de referencia. Los TCR requeridos para la transfección de células T para la terapia adoptiva deben tener afinidades algo más altas y/o vidas medias de enlace más prolongadas para el complejo de EVDPIGHLY HLA-Al que el TCR específico para MAGE-A3 de referencia (aunque aún respectivamente por lo menos al doble de aquellas del TCR nativo) .
Por ejemplo, los TCR de ,1a invención pueden tener una KD para el complejo de aproximadamente 6 M a aproximadamente 70 µ? y/o pueden ' tener una vida media de enlace (T1/2) para el complejo de aproximadamente 1 a aproximadamente 11 s.
A efectos de la presente invención, un TCR es una porción que tiene por lo menos un dominio variable alfa de TCR y/o beta de TCR. Generalmente, comprenden tanto un dominio variable alfa de TCR como un dominio variable beta de TCR. Pueden ser heterodímeros aß o pueden estar en un formato de cadena individual. Para el uso en la terapia adoptiva, un TCR heterodimérico aß puede ser transíectado, por ejemplo, como cadenas de longitud completa que tienen dominios tanto citoplásmicos como transmembrana. Si se desea, un enlace de disulfuro introducido entre residuos de los dominios constantes respectivos puede estar presente (véase por ejemplo el documento WO 2006/000830) .
Cualquiera que sea el formato, los TCR de la invención son mutados en relación con el TCR específico para MAGE-A3 nativo que tiene las secuencias de cadena alfa y beta extracelulares SEC ID Nos: 2 y 3 en su dominio variable alfa (que se extiende desde Kl hasta P114 de la SEC ID No: 2) y/o dominio variable beta (que se extiende desde Kl hasta T112 de la SEC ID No: 3) . El TCR específico para MAGE-A3 nativo o el TCR específico para MAGE-A3 de referencia pueden utilizarse como una plantilla en la cual se pueden introducir las diversas mutaciones que causan una alta afinidad y/o una constante de disociación lenta para la interacción entre los TCR de la invención y el complejo de EVDPIGHLY HLA-A1. Las modalidades de la invención incluyen TCR los cuales son mutados en relación con el dominio' variable de cadena a que se extiende desde Kl hasta P114 de la SEC ID No : 2 y/o el dominio variable de cadena ß que se extiende desde Kl hasta T112 de la SEC ID No : 3 en por lo menos una región determinante de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) y/o una región de estructura de dominio variable de la misma.
Las mutaciones se pueden llevar a cabo utilizando cualquier método apropiado que incluye, pero no está limitado a, aquellos basados en la reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) , clonación basada en enzimas de restricción o procedimientos de clonación independiente de la ligadura (LIC, por sus siglas en inglés) . Estos métodos se detallan en muchos de los textos de biología molecular estándar. Para detalles adicionales con respecto a la mutagénesis de reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) y la clonación basada en enzimas de restricción véase Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd, Ed.) CSHL Press. Se puede encontrar información adicional sobre procedimientos de LIC en (Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6 (1) : 30-6) .
Un método para generar TCR específicos para MAGE-3 de alta afinidad de la invención se selecciona de una biblioteca diversa de partículas de fagos que exhiben estos TCR como se da a conocer en el docúmento WO 2004/044004.
Se debe observar que cualquier TCR aß que comprenda un uso de genes Va y ?ß y por lo tanto secuencias de aminoácidos de dominio variable similar a aquel del TCR específico para MAGE-A3 nativo o el TCR específico para MAGE-3 de referencia podría hacer un TCR plantilla conveniente. Entonces sería posible introducir en el ADN que codifica uno o ambos de los dominios variables del TCR aß plantilla los cambios requeridos para producir los TCR mutados de la invención. Como será obvio para aquellas personas expertas en el campo, las mutaciones necesarias podrían ser introducidas por una variedad de métodos, por ejemplo la mutagénesis dirigida a un sitio.
En algunas modalidades, los TCR de la invención tienen un dominio variable de cadena alfa que se extiende desde Kl hasta P114 de la SEC ID No: 2, excepto que los residuos de aminoácidos en una o más de las posiciones 501, 51Q, 52S y 53S son mutados y/o que tiene el dominio variable de cadena beta que se extiende desde Kl hasta T112 de la SEC ID No: 3, excepto que los residuos de aminoácidos en una o más de las posiciones 50F, 51S, 52E, 53T o 54Q son mutados. Por ejemplo, los TCR de la invención pueden tener uno o más de los residuos de aminoácidos de dominio variable de cadena alfa 50V, 51R, 52P o 53Y utilizando la numeración mostrada en la SEC ID No: 2 y/o uno o más de los residuos de aminoácidos de dominio variable de cadena beta 50T, 51D, 52M, 53L o 54L utilizando la numeración mostrada en la SEC ID No: 3.
Los TCR específicos de la invención incluyen aquellos que comprenden una de las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena alfa SEC ID Nos: 8 y 9 y/o una de las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena beta SEC ID Nos: 10 y 11. De esta manera, los TCR con la secuencia de dominio variable de la cadena alfa de tipo silvestre (de Kl a P114 de la SEC ID No: 2) se pueden asociar con una cadena beta que tiene una de las SEC ID Nos: 10 y 11. Alternativamente, una cadena alfa que tiene una de las SEC ID Nos: 8 y 9 se puede asociar con la secuencia de dominio variable de la cadena beta de tipo silvestre (de Kl a T112 de la SEC ID No: 3) . Alternativamente una cadena alfa que tiene una de las SEC ID Nos: 8 y 9 se puede asociar con una cadena beta que tiene una de las SEC ID Nos: 10 y 11.
Las variantes fenotípicamente silenciosas de los TCR planteados anteriormente también forman parte de esta invención. El término "variantes fenotípicamente silenciosas" se refiere a TCR los cuales son idénticos a un TCR de la invención en cuanto a la secuencia excepto que incorporan cambios en los dominios constantes y/o variables los cuales no alteran la afinidad y/o constante de disociación para la interacción con el complejo de péptido-HLA.. Un ejemplo de esta variante es proporcionado por TCR de la invención en los cuales el dominio constante alfa de TCR contiene un residuo de aminoácido de Fenilalanina (F) sustituido por el residuo de aminoácido 135 Serina (S) utilizando la numeración de la SEC ID O: 2.
Como se mencionara anteriormente, los TCR heterodiméricos aß de la invención pueden tener un enlace de disulfuro introducido entre sus dominios constantes. Los TCR preferidos de este tipo incluyen aquéllos los cuales tienen una secuencia de dominio constante de TRAC y una secuencia de dominio constante de TRBCl o TRBC2 excepto que Thr 48 de TRAC y Ser 57 de TRBCl o TRBC2 son reemplazados por residuos de cisteína, los residuos de cisteína forman un enlace de disulfuro entre la secuencia de dominio constante de TRAC y la secuencia de dominio constante de TRBCl o TRBC2 del TCR.
Con b sin el enlace introducido entre cadenas que se mencionó en el párrafo anterior, los TCR heterodiméricos aß de la invención pueden tener una secuencia de dominio constante de TRAC y una secuencia de dominio constante de TRBCl o TRBC2 y la secuencia de dominio constante de TRAC y la secuencia de dominio constante de TRBCl o TRBC2 del TCR se pueden unir por medio del enlace de disulfuro nativo ent Cys4 del exón 2 de TRAC y Cys2 del exón 2 de TRBCl o TRBC2.
Puesto que los TCR heterodiméricos aß de la invención tienen utilidad en la terapia adoptiva, la invención incluye una célula aislada, especialmente una célula T, que presenta un TCR de la invención. Existe una variedad de métodos que son adecuados para la transfección de células T con ADN o AR que codifica los TCR de la invención. (Véase por ejemplo Robbins y colaboradores, (2008, J. Iirimunol 180: 6116-6131)) . Las células T que expresan los TCR de la invención serán adecuadas para el uso en el tratamiento basado en la terapia adoptiva de cánceres de MAGE- 3+ HLA-A1+. Como será conocido para aquellas personas expertas en el campo, existe una variedad de métodos adecuados por medio de los cuales se puede llevar a cabo una terapia adoptiva. (Véase por ejemplo Rosenberg y colaboradores, (2008) Nat Rev Cáncer 8 (4) : 299-308) .
Para el uso en una terapia adoptiva, la invención también incluye células que albergan un vector de expresión de TCR el cual comprende ácido nucleico que codifica el TCR de la invención en un marco de lectura abierto individual o dos marcos de lectura abiertos distintos. También están incluidas en el alcance de la invención las células que albergan un primer vector de expresión el cual comprende ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un TCR de la invención y un segundo vector de expresión el cual comprende ácido nucleico que codifica la cadena beta de un TCR de la invención. ',
Los TCR de la invención proyectados para el uso en una terapia adoptiva son glicosiládos cuando son expresados por las células T transíectadas . : Como es bien sabido, el patrón de glicosilación de TCR ¦ transfectados puede ser modificado por mutaciones del gen transfectado .
Para la administración a pacientes, las células T transfectadas con TCR de la invención se pueden proporcionar en una composición farmacéutica junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Las células de acuerdo con la invención serán suministradas usualmente como parte de una composición farmacéutica, estéril la cual incluirá normalmente un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica puede estar en cualquier forma adecuada (dependiendo del método déseado de administración a un paciente) . Se puede proporcionar en una forma de dosificación unitaria, se proporcionará generalmente en un envase sellado y se puede proporcionar como parte de un kit. Este kit incluiría normalmente (aunque no necesariamente) instrucciones para el uso. Puede incluir una pluralidad de las formas de dosificación unitarias.
La composición farmacéutica se puede adaptar para la administración por la ruta intravenosa. Estas composiciones se pueden preparar por medio de cualquier método conocido en el campo de la farmacia, por ejemplo al mezclar el ingrediente activo con el (los) portador (es) o excipiente (s) bajo condiciones estériles.
Las dosificaciones de las sustancias de la presente invención pueden variar entre amplios límites, dependiendo de la enfermedad o trastorno que es tratado, la edad y condición del individuo que es tratado, etcétera y un médico determinará finalmente las dosificaciones apropiadas a utilizarse .
Breve Descripción de las Figuras
La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos en los cuales las siguientes Figuras se refieren a:
Las Figuras 1A y 2A muestran respectivamente las secuencias de aminoácidos extracelulares de la cadena alfa de TCR específico para MAGE-A3 nativo que tiene el uso de genes TRAV21*01/TRAJ28/TRAC y de la cadena beta de TCR específico para MAGE-A3 nativo que tiene el uso de genes TRBV5-1*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2 (SEC ID Nos : 2 y 3 respectivamente) (cuyos títulos son: Figura 1A: "Secuencia de aminoácidos de cadena alfa TRAV21*0l/TRAJ28/TRAC del TCR específico para MAGE-A3 de Tipo Silvestre (SEC ID No: 2)" y Figura 2A: "Secuencia de aminoácidos de cadena beta TRBV5-1*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2 del TCR; específico para AGE-A3 de Tipo Silvestre (SEC ID No: 3)")·
Las Figuras IB y 2B muestran respectivamente secuencias de ADN que codifican las cadenas alfa y beta de TCR específico para MAGE-A3 de tipo silvestre solubles también referidas como las cadenas alfa y beta de TCR específico para MAGE-A3 de referencia (cuyos títulos son: Figura IB: "Secuencia de ADN de cadena alfa del TCR de referencia (véase la Figura 1C) (SEC ID No: 4) (la cisteína introducida está en negrita) y Figura 2B : "Secuencia de ADN de cadena beta del TCR de referencia (véase la Figura 2C) (SEC ID No: 5) (la cisteína introducida está en negrita)"). Estas secuencias incluyen residuos de cisteína adicionales para formar un enlace de disulfuro no nativo. Los codones mutados que codifican los residuos de cisteína adicionales están en negrita. Las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción Ndel y HindIII están subrayadas.
Las Figuras 1C y 2C muestran respectivamente las secuencias de aminoácidos extracelulares de cadenas alfa y beta de TCR específico para MAGE-A3 de tipo silvestre o TCR específico para MAGE-A3 de referencia soluble (SEC ID Nos: 6 y 7 respectivamente) producidas a partir de las secuencias de ADN de las Figuras IB y 2B respectivamente, pero sin la metionina principal, introducida que es insertada para la expresión eficiente en bacterias (cuyos títulos son: Figura 1C: "Secuencia de aminoácidos de cadenas alfa del TCR de referencia - cadena alfa TRAV21*01/TRAJ28/TRAC del TCR específico para MAGE-A3 de Tipo Silvestre, pero con la cisteína (en negrita y subrayada) : sustituida por T162 (es decir T48 de la región constante de TRAC) (SEC ID No: 6)" y Figura 2C: "Secuencia de aminoácidos de cadena beta del TCR de referencia - cadena beta TRBV5-l*0l/TRBDl/TRBJ2-7*0l/TRBC2 del TCR específico para MAGE-A3 de ! Tipo Silvestre, pero con la cisteína (en negrita y subrayada) sustituida por S169 (es decir S57 de la región constante de TRBC2) y con A187 sustituido por C187 y D201 sustituido por N201 (SEC ID No: 7)"). Las cisteínas introducidas están en negrita y subrayadas .
Las Figuras 3A-3B muestran las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena alfa de las variantes de TCR específico para MAGE-A3 de acuerdo con la invención (cuyos títulos son: Figura 3A: "Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena alfa del TCR específico para MAGE-A3 de alta afinidad (SEC ID No: 8)" y Figura 3B: "Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena alfa del TCR específico para MAGE-A3 de alta afinidad (SEC ID No: 9)"). Los residuos mutados están en negrita y subrayados .
Las Figuras 4A-4B muestran las secuencias de aminoácidos de dominio variable dé cadena beta de variantes de TCR específico para MAGE-A3 de; acuerdo con la invención (cuyos títulos son: Figura 4A: "Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena beta del TCR específico para MAGE-A3 de alta afinidad (SEC ID No: 10)" y Figura 4B: "Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena beta del TCR específico para MAGE-A3 de alta afinidad (SEC ID No: 11)") .
Los residuos mutados están en negrita y subrayados.
La Figura 5A muestra la secuencia de ADN para el gen de TCR específico para MAGE-A3 de tipo silvestre (construcción de cadena alfa T-2A-cadena beta WT con la secuencia 2A de teschovirus-1 de Porcino en negrita y subrayada) para la transducción de células T (cuyo título es "Secuencia de ADN de cadena alfa WT-2A-cadena beta WT de TCR específico para MAGE de tipo silvestre con la secuencia 2A de teschovirus-1 de Porcino (en negrita y subrayada) (SEC ID No: 12) ") .
La Figura 5B muestra la secuencia de aminoácidos del TCR específico para MAGE-A3 de tipo silvestre para la transducción de células T producida a partir de la secuencia de ADN de las Figuras 5A-5B (cuyo título es "Secuencia de aminoácidos de cadena alfa WT-2A-cadena beta WT de TCR específico para MAGE de tipo silvestre con la secuencia 2A de teschovirus-1 de Porcino (en negrita y subrayada) (SEC ID No: 13)") ¦ La secuencia 2A de teschovirus-1 de Porcino está en negrita y subrayada.
La Figura 6 muestra la liberación de IFN-? de células T transducidas con TCR específico para MAGE-A3 en respuesta a un intervalo de células objetivo en un ensayo ELISPOT. Estas figuras muestran la activación específica incrementada de células T transducidas con TCR específicos para MAGE-A3 de afinidad más alta en comparación con células T transducidas con el TCR específico para MAGE-A3 nativo (cuyo título es: "Activación incrementada de células T transducidas con el TCR específico para MAGE-A3 de afinidad mejorada en respuesta a líneas de células tumorales") .
La Figura 7 muestra un ensayo de citotoxicidad donde se somete a prueba la eliminación de líneas de células tumorales por células T transducidas con MAGE-A3 (cuyo título es: "Citotoxicidad incrementada de células T transducidas con el TCR específico para MAGE-A3 de afinidad mejorada en respuesta a una línea de células tumorales que de tipo silvestre" ) .
Descripción Detallada de la Invención
Ejemplos
Ejemplo 1
Clonación de las secuencias de región variable de cadenas alfa y beta de TCR específico para MAGE-A3 de referencia en plásmidos de expresión basados en pGMT7
Los dominios variables alfa de TCR específico para
MAGE-A3 de referencia y los dominios variables beta de TCR se amplificaron por medio de PCR a partir de ADNc total aislado de un clon de células T MAGE-3 '(Clon EB81-103 de Pierre Coulie Universidad de Louvain, Bélgica) . En el caso de la cadena alfa, un oligonucleótido Al específico para la secuencia de región variable de cadena alfa (ggaattccatatgaaacaagaagttactcaaattcc SEC ID No: 14) el cual codifica el sitio de restricción Ndel y una metionina introducida para el inicio de expresión eficiente en bacterias y un oligonucleótido A2 específico para la secuencia de región constante de cadena alfa (ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg SEC ID No: 15) el cual codifica el sitio de restricción Salí se utilizan para amplificar la región variable de cadena alfa. En el caso de la cadena beta, un oligonucleótido Bl específico para la secuencia de región variable de cadena beta (gaattccatatgaaagctggagttactcaaactccaag SEC ID No: 16) el cual codifica el sitio de restricción Ndel y una metionina introducida para el inicio de : expresión eficiente en bacterias y un oligonucleótido B2 específico para la secuencia de región constante de cadena beta ( tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc SEC ID No: 17) el cual codifica el sitio de restricción Agel se utilizan para amplificar la región variable de cadena beta.
Las regiones variables alfa y beta se clonaron en plásmidos de expresión basados en pGMT7 que contenían ya sea C o c por medio de métodos estándar descritos en Molecular Cloning a Laboratory Manual Tercera edición de Sambrook y Russell. Los plásmidos se secuenciaron utilizando el Analizador de ADN Applied Biosystems 3730x1.
Las secuencias de ADN que codificaban la cadena alfa de TCR cortada con Ndel y Salí se ligaron en el vector pGMT7 + Ca, el cual se cortó con Ndel y Xhol. Las secuencias de ADN que codificaban la cadena beta de TCR cortada con Ndel y Agel se ligaron en un vector pGMT7 + c separado, el cual también se cortó con Ndel y Agel.
Ligadura
Los plásmidos ligados se transformaron en células competentes de la cepa XLl-blue de Escherichia coli y se colocaron en placas de LB/agar que contenían 100 µg/ml de ampicilina. Después de la incubación durante toda la noche a 37 °C, se eligieron colonias individuales y se desarrollaron en 10 mi de LB que contenía 100 µ<3/?t?1 de ampicilina durante toda la noche a 37 °C con agitación. Los plásmidos clonados se purificaron utilizando un kit Miniprep (Qiagen) y los plásmidos se secuenciaron utilizando un Analizador de ADN Applied Biosystems 3730x1.
Las Figuras 1C y 2C muestran respectivamente las secuencias de aminoácidos extracelulares de cadena a y ß de TCR específico para MAGE-A3 de referencia unidas a disulfuro soluble (SEC ID Nos: 6 y 7 respectivamente) producidas a partir de secuencias de ADN de las Figuras IB y 2B respectivamente, pero sin la metionina principal introducida que fue insertada para la expresión eficiente en bacterias. Se debe observar que las cisteínas fueron sustituidas en las regiones constantes de las cadenas alfa y beta para proporcionar un enlace de disulfuro entre cadenas artificial en el replegado para formar el TCR heterodimérico . Las cisteínas introducidas se muestran en negrita y subrayadas. Las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción en las secuencias de ADN de las Figuras IB y 2B están subrayadas .
Ejemplo 2
Expresión, replegado y purificación de TCR específico para MAGE-A3 de referencia soluble
Los plásmidos de expresión que contenían la cadena y la cadena ß de TCR respectivamente, preparados en el Ejemplo 1, se transformaron por separado en la cepa de E. coli Rosetta (DE3)pLysS y las colonias individuales resistentes a ampicilina se desarrollaron a 37 °C en un medio TYP (100 µg/ml de ampicilina) hasta una OD600 de ~0.6-0.8 antes de inducir la expresión de proteínas con IPTG 0.5 mM. Las células se recolectaron tres horas después de la inducción por medio de la centrifugación durante 30 minutos a 4000 rpm en un dispositivo Beckman J-6B. Las pelotillas de células se lisaron con 25 mi de Bug Buster" (Novagen) en presencia de MgCl2 y DNasel. Las pelotillas de cuerpos de inclusión se recuperaron por medio de la centrifugación durante 30 minutos a 13000 rpm en una centrífuga Beckman J2-21. Luego se llevaron a cabo tres lavados con detergente para retirar los restos de células y componentes de membrana. Cada vez, la pelotilla ,de cuerpos de inclusión se homogenizó en un amortiguador Tritón (Tris-HCl 50 mM pH 8.0, Tritón-X100 0.5%, NaCl 200 mM, NaEDTA 10 mM, ) antes de ser aglomerada por medio de la centrifugación durante 15 minutos a 4,000 rpm. El detergente y la sal luego se retiraron por medio de un lavado similar en el siguiente amortiguador: Tris-HCl 50 m pH 8.0, NaEDTA 1 mM, pH 8.0. Finalmente, los cuerpos de inclusión se dividieron en alícuotas de 30 mg y se congelaron a -70°C. El producto de proteínas de cuerpos de inclusión se cuantificó mediante la solubilización con Guanidina-HCl 6 M y se tomó una medición de OD en un Espectrofotómetro Hitachi U-2001^. La concentración de proteínas luego se calculó utilizando el coeficiente de extinción.
Aproximadamente 15 mg de cuerpos de inclusión solubilizados con la cadena ß de TCR y 15 mg de cuerpos de inclusión solubilizados con la cadena a de TCR se descongelaron de soluciones madre congeladas y se diluyeron en 10 mi de una solución de guanidina (clorhidrato de guanidina 6 M, Tris HCl 50 mM pH 8.1, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, DTT 10 mM) , para asegurar la desnaturalización completa de cadenas. La solución de guanidina que contenía cadenas de TCR completamente reducidas y desnaturalizadas luego se inyectó en 0.5 litros del siguiente amortiguador de replegado: Tris 100 mM pH 8.1, L-arginina 400 mM, EDTA 2 mM, urea 5 M. La pareja de redox (clorhidrato de cisteamina y diclorhidrato de cistamina) a concentraciones finales de 6.6 mM y 3.7 mM respectivamente, se agregó aproximadamente 5 minutos antes de la adición dé las cadenas de TCR desnaturalizadas. La solución se dejó durante ~30 minutos. El TCR replegado se dializó en una membrana de celulosa tubular de diálisis (Sigma-Aldrich; Producto No. D9402) contra 10 L de H20 a 5°C + 3°C durante 18-20 horas. Después de este tiempo, el amortiguador de diálisis se cambió dos veces a Tris 10 mM nuevo pH 8.1 (10 L) y la diálisis se continuó a 5°C ± 3°C durante otras ~8 horas.
El TCR soluble se separó de productos de degradación plegados incorrectamente e impurezas al cargar el replegado dializado en una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ y eluir la proteína enlazada con un gradiente de NaCl 0-500 mM en Tris 10 mM pH 8.1 sobre 6 volúmenes de columna utilizando un purificador AktaMR (GE Healthcare) . Las fracciones pico luego se almacenaron a 4°C y se analizaron por medio de SDS-PAGE teñido con Coomassie antes de ser reunidos y concentrados. Finalmente, el TCR soluble se purificó y se caracterizó utilizando una columna de filtración en gel GE Healthcare Superdex 75HRMR equilibrada previamente en amortiguador de PBS (Sigma) . La elución de picos a un peso molecular relativo : de aproximadamente 50 kDa se reunió y se concentró antes de la caracterización por medio del análisis de resonancia de plasmón superficial BIAcoreMR.
Ejemplo 3
Caracterización de enlace
Análisis BIAcoreMR
Un biosensor de resonancia de plasmón superficial (BIAcore 3000MR) se puede utilizar para analizar el enlace de un TCR soluble a su ligando de péptido-MHC. Esto se facilita al producir complejos de péptido-HLA ( "pHLA" ) biotinilados , solubles los cuales pueden ser inmovilizados en una superficie de enlace revestida con estreptavidina (chip de sensor) . Los chips de sensor comprenden cuatro celdas de flujo individuales las cuales hacen posible la medición simultánea del enlace de receptores de células T a cuatro diferentes complejos de pHLA. La inyección manual del complejo de pHLA permite que se manipule fácilmente el nivel preciso de moléculas clase I inmovilizadas.
Las moléculas HLA-A*01 clase I biotiniladas se replegaron in vitro de cuerpos de inclusión expresados de manera bacteriana que contienen las proteínas de subunidades constituyentes y péptido sintético, seguido por la purificación y la biotinilación enzimática in vitro (O'Callaghan y colaboradores (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15) . La cadena pesada de HLA-A*01 se expresó con una etiqueta de biotinilación C-terminal la cual reemplaza los dominios transmembrana y citoplásmicos de la proteína en una construcción apropiada. Se obtuvieron niveles de expresión de cuerpos de inclusión de -75 mg/litro de cultivo bacteriano. La cadena ligera de MHC o microglobulina-P2 ( 2m) también fue expresada como cuerpos de inclusión en E.coli de una construcción apropiada, a un nivel de ~500 mg/litro de cultivo bacteriano.
Las células de E. coli se lisaron y los cuerpos de inclusión se purificaron a aproximadamente 80% de pureza. El péptido sintético (MAGE-A3 EVDPIGHLY) se disolvió en DMSO a una concentración final de 4 mg/ml . Los cuerpos de inclusión de ß2p? y la cadena pesada se desnaturalizaron por separado en guanidina-HCl 6 mM, Tris 50 mM pH 8.1, NaCl 100 mM, DTT 10 mM, EDTA 10 mM. Se preparó un amortiguador de replegado que contenía L-Arginina 0.4 M, Tris 100 mM pH 8.1, diclorhidrato de cistamina 3.7 mM, clorhidrato de cisteamina 6.6 mM y se enfrió rápidamente a <5°C. Preferiblemente, el péptido se agregó primero al amortiguador de replegado, seguido por la adición de ß2?? desnaturalizado luego la adición de una cadena pesada desnaturalizada. El péptido EVDPIGHLY de MAGE-A3 se agregó al amortiguador de replegado a 4 mg/litro (concentración final) . Luego se agregaron 30 mg/litro de ß2?? seguido por 30 mg/litro de cadena pesada (concentraciones finales) . Se permitió que el 1 replegado alcanzara la consumación a 4°C durante por lo menos 1 hora.
El amortiguador se intercambió mediante la diálisis en 10 volúmenes de Tris 10 mM pH 8.1. Fueron necesarios dos cambios de amortiguador para reducir suficientemente la fuerza iónica de la solución. La solución de proteínas luego se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa 1.5 µ?? y se cargó en una columna de intercambio aniónico POROS 50HQ (8 mi de volumen de lecho) . La proteína se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0-500 mM en Tris 10 mM pH 8.1 utilizando un purificador AktaMR (GE Healthcare) . El complejo de HLA-A*01-péptido se eluyó en NaCl aproximadamente 250 mM y las fracciones pico se recolectaron, un cóctel de inhibidores de proteasa (Calbiochem) se agregó y las fracciones se enfriaron rápidamente sobre hielo.
A las moléculas de pHLA etiquetadas con biotinilación se les intercambió el amortiguador en Tris 10 mM pH 8.1, NaCl 5 mM utilizando uná columna de desalinización rápida GE HealthcareMR equilibrada i en el mismo amortiguador. Inmediatamente con la elución, las fracciones que contenían proteína se enfriaron rápidamente sobre hielo y se agregó un cóctel de inhibidor de proteasa (Calbiochem) . Luego se agregaron reactivos de biotinilación: biotina 1 mM, ATP 5 mM (amortiguado a pH 8), MgCl2 7.5 mM ¡y 5 µg/ml de enzima BirAMR (purificada de acuerdo con O'Callaghan y colaboradores (1999) Anal. Biochem 266: 9-15). Luego se 'permitió que la mezcla se incubara a temperatura ambiente durante toda la noche .
Las moléculas de pHLA-A*01 biotiniladas se purificaron utilizando la cromatografía de filtración en gel. Una columna GE Healthcare Superdex 75 HR 10/30MR se equilibró previamente con PBS filtrado y 1 mi de mezcla de reacción de biotinilación se cargó y la columna se desarrolló con PBS a 0.5 ml/minuto utilizando un purificador AktaR (GE Healthcare) . Las moléculas de pHLA-A*01 biotiniladas se eluyeron como un pico individual a aproximadamente 15 mi. Las fracciones que contenían proteína se reunieron, se enfriaron rápidamente sobre hielo y se agregó un cóctel de inhibidor de proteasa. La concentración de proteína se determinó utilizando un ensayo de enlace de Coomassie (PerBio) y las alícuotas de moléculas de pHLA-A*01 biotiniladas se almacenaron congeladas a -20 °C.
Estos complejos inmovilizados son capaces de enlazar tanto receptores de células T como el correceptor CD8a , los cuales se pueden inyectar ambos en la fase soluble . Se observa que las propiedades de enlace a pHLA de los TCR solubles son cualitativa y cuantitativamente similares si el TCR se utiliza ya sea en la fase soluble o inmovilizada. Este es un control importante para la actividad parcial de especies solubles y también sugiere que los complejos de pHLA biotinilados son biológicamente tan activos como los complejos no biotinilados.
El biosensor de resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) BIAcore 3000MR mide los cambios en el índice refractivo expresados en unidades de respuesta (RU, por sus siglas en inglés) cerca de una superficie de sensor dentro de una celda de flujo pequeña, un principio que se puede utilizar para detectar interacciones de receptor-ligando y para analizar su afinidad y parámetros cinéticos. Los experimentos BIAcore se realizaron a una temperatura de 25 °C, utilizando amortiguador de PBS (Sigma, pH 7.1-7.5) como el amortiguador de corrida y en la preparación de diluciones de muestras de proteína. La estreptavidina se inmovilizó en las celdas de flujo por medio de métodos de acoplamiento de amina estándar. Los complejos de pHLA se inmovilizaron por vía de la etiqueta de biotina.
El ensayo luego se realizó al pasar TCR soluble sobre las superficies de las diferentes celdas de flujo a un caudal constante, midiendo la respuesta de SPR al hacerlo de esta manera .
Constante de enlace de equilibrio
Los métodos de análisis BIAcore anteriores se usaron para determinar las constantes de enlace de equilibrio. Las diluciones en serie de la forma heterodimérica, soluble, unida a disulfuro del TCR específico para AGE-A3 de referencia se prepararon y se inyectaron a un caudal constante de 5 µ? min"1 sobre dos diferentes celdas de flujo; una revestida con ~1000 RU de complejo de EVDPIGHLY HLA-A*01 específico, la segunda revestida con -1000 RU de complejo de HLA-A2 -péptido (KIFGSLAFL (SEC ID No : 18)) no específico. La respuesta se normalizó para cada concentración utilizando la medición de la celda de control. La respuesta de datos normalizada se representó gráficamente contra la concentración de una muestra de TCR y se ajustó a un modelo de ajuste de curva no lineal con el propósito de calcular la constante de enlace de equilibrio, KD. (Price & Dwek, Principies and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (2a Edición) 1979, Clarendon Press, Oxford) . La forma soluble unida a disulfuro del TCR específico para MAGE-A3 , de referencia (Ejemplo 2) demostró una KD de aproximadamente 250 µ?. De los mismos datos de BIAcore, el T1/2 fue aproximadamente 3 s.
Parámetros Cinéticos
Los métodos de análisis BIAcore anteriores también se utilizaron para determinar las constantes de enlace de equilibrio y constantes de disociación.
Para los TCR (véase el Ejemplo 4 posterior) la KD se determinó al medir experimentalmente la constante de velocidad de disociación, koff, y la constante de velocidad de asociación, kon- La constante de equilibrio KD se calculó como koff/kon.
El TCR se inyectó en dos células diferentes, una revestida con -300 RU de complejo de EVDPIGHLY HLA-A*01 específico, la segunda revestida con ~300 RU de complejo de HLA-Al-péptido no específico. El caudal se estableció a 50 µ?/minuto. Típicamente 250 µ? de TCR a una concentración equivalente a -10 veces la KD se inyectaron. El amortiguador luego se extendió hasta que la respuesta había regresado a la línea de referencia o habían transcurrido >2 horas . Los parámetros cinéticos se calcularon utilizando el software BIAevaluationMR. La fase de disociación se ajustó a una ecuación individual de decaimiento exponencial que hace posible el cálculo de la vida media.
Ejemplo 4
Generación de variantes del TCR específico para MAGE-A3 de referencia
La expresión en fagos es un medio por el cual las bibliotecas de variantes de TCR específico para MAGE-A3 se pueden generar con el propósito de identificar mutantes de afinidad más alta. La expresión en fagos de TCR y las métodos de selección descritos en (Li y colaboradores (2005) Nature Biotech 23 (3) : 349-354) se aplicaron al TCR específico para MAGE-A3 del Ejemplo 2.
Se identificaron los TCR con afinidades y/o vidas medias de enlace por lo menos al doble de aquellas del TCR específico para MAGE-A3 de referencia (y por lo tanto implícitamente por lo menos al doble de aquellas del TCR nativo) , que tenían uno o más de lós residuos de aminoácidos de dominio variable de cadena alfa 50V, 51R, 52P o 53Y utilizando la numeración mostrada en la SEC ID No: 2 y/o uno o más de los residuos de aminoácidos de dominio variable de cadena beta 50T, 51D, 52M, 53L o 54L utilizando la numeración mostrada en la SEC ID No: 3.
Los ejemplos específicos de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas alfa (SEC ID Nos: 8 y 9) y cadenas beta ; (SEC ID Nos: 10 y 11) de TCR de afinidad más alta se muestran en las figuras 3A-3B y 4A-4B respectivamente. Estas cadenas alfa son mutadas en la CDR2 y las cadenas beta son mutadas en la CDR2.
Los heterodímeros de TCR se replegaron utilizando el método del Ejemplo 2 anterior (incluyendo las cisteínas introducidas en las regiones constantes para proporcionar el enlace de disulfuro entre cadenas, artificial) . De esta manera se prepararon los TCR, que consistían de (a) la cadena beta de TCR de referencia, junto con cadenas alfa las cuales incluyen los dominios variables SÉC ID Nos: 8 y 9; (b) la cadena alfa de TCR de referencia, junto con cadenas beta las cuales incluyen los dominios variables de cadena beta SEC ID Nos: 10 y 11; y (c) varias combinaciones de cadenas beta y alfa que incluyen los dominios variables, mutantes .
La interacción entre estos TCR específicos para
MAGE-A3 unidos a disulfuro, solubles y el complejo de EVDPIGHLY HLA-A*01 se analizó utilizando el método BIAcore descrito anteriormente y los datos' de enlace se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1
Ejemplo 5
Transfección de células T con variantes del TCR específico para MAGE-A3 nativo
(a) Preparación de vector lentiviral mediante la transfección transitoria mediada por Express-InMR de células 293T
Un sistema de empaque lentiviral de 3a generación se utiliza para empacar vectores lentivirales que contienen el gen que codifica el TCR deseádo. Las células 293T son transíectadas con 4 plásmidos (un vector lentiviral que contiene el gen ORF individual de cadena alfa de TCR-P2A-cadena beta de TCR descrito en el Ejemplo 5c y 3 plásmidos que contienen los otros componentes necesarios para construir partículas lentivirales infecciosas pero no replicativas) utilizando la transfección mediada por Express-InMR (Open Biosystems) . Para la transfección se toma un matraz T150 de células 293T en fase de crecimiento exponencial, con células distribuidas uniformemente sobre la placa y ligeramente más de 50% confluentes. Las alícuotas de Express-lnMR se llevan a la temperatura ambiente. 3 mi de Medio Libre de Suero (RPMI 1640 + HEPES 10 mM) se colocan en un tubo cónico, estéril de 15 mi. 174 µ? de Reactivo Express-InMR se agregan directamente en el Medio Libre de Suero (esto proporciona una relación en peso 3.6:1 del Reactivo ,con respecto al ADN) . Se mezcla completamente al invertir los tubos 3-4 veces y se incuba a temperatura ambiente durante 5-20 minutos.
En un microtubo separado de 1.5 mi, se agregan 15 g de ADN plasmídico a alícuotas de mezcla de empaquetamiento combinadas previamente (que contienen 18 µg de pRSV.REV (plásmido de expresión Rev) , 18 µ¾ de pMDLg/p . RRE (plásmido de expresión Gag/Pol) , 7 µg de pVSV-G (plásmido de expresión de glicoproteína VSV) , usualmente ~22 µ? y se pipetea ascendentemente y descendentemente para asegurar la homogeneidad de la mezcla de ADN. Se agrega gota a gota ~1 mi de Express-Jn^/Medio Libre de Suero a la mezcla de ADN, luego se pipetea ascendentemente y descendentemente con suavidad antes de la transferencia nuevamente al resto del Express -InMR/Medio Libre de Suero. El tubo se invierte 3-4 veces y se incuba a temperatura ambiente durante 15-30 minutos .
El medio de cultivo antiguo se retira del matraz de células. El complejo de Express- ????/medio/ADN (3 mi) se agrega al matraz directamente en fondo de un matraz vertical de células 293T. El matraz se coloca lentamente en posición horizontal para cubrir células y el matraz se balancea muy suavemente para asegurar una distribución uniforme. Después de 1 minuto, se agregan 22 mi de medio de cultivo nuevo (Ri0 + HEPES : RPMI 1640, FBS inactivado térmicamente al 10%, Pen al 1%/Strep/L-glutamina, HEPES 10 mM) y se regresa cuidadosamente a la incubadora. Se incuba durante toda la noche a 37°C/C02 al 5%. Después de 24 horas, se procede a recolectar el medio que contiene vectores lentivirales empacados.
Para recolectar los vectores lentivirales empacados, el sobrenadante de cultivo de células se filtra a través de un filtro de jeringa de nilón de 0.45 micrómetros, el medio de cultivo se centrifuga a 10,000 g durante 18 horas (o 112.000 g durante 2 horas), se , retira la mayor parte del sobrenadante (teniendo cuidado de no alterar la pelotilla) y la pelotilla se suspende de nuevo en algunos mi restantes de sobrenadante (a menudo aproximadamente 2 mi de un volumen de partida de 31 mi por tubo) . Se congelan instantáneamente sobre hielo seco en alícuotas de 1 mi y se almacena a -80°C. (b) Transducción de células T con vectores lentivirales empacados que contienen el gen de interés
Antes de la transducción con los vectores lentivirales empacados, las células T humanas (CD8 o CD4 o ambas dependiendo de los requerimientos) se aislan de la sangre de voluntarios saludables. Estas células se cuentan y se incuban durante toda la noche en; R10 que contiene 50 U/ml de IL-2 en lxlO6 células por mi (0.5 ml/pocillo) en placas de 48 pocilios con microperlas revestidas con anticuerpo anti-CD3/CD28 lavadas previamente (expansor de células T DynalR, Invitrogen) en una relación de 3 perlas por célula.
Después de la estimulación durante toda la noche, 0.5 mi de vector lentiviral, empacado, puro se agregan a las células deseadas. Se incuban a 37°C/C02 al 5% durante 3 días. 3 días después de la transducción se cuentan las células y se diluyen a 0.5xl06 células/ml. Se agrega medio nuevo que contiene IL-2 como se requiera. Se retiran las perlas 5-7 días después de la transducción. Se cuentan las células y se reemplaza o se agrega medio nuevo que contiene IL-2 en intervalos de 2 días. Se mantienen, las células entre 0.5xl06 y lxlO6 células/ml. Las células se pueden analizar por medio de la citometría de flujo desde el día 3 y se pueden utilizar para ensayos funcionales (por ejemplo ELISpot para la liberación de IFNy) desde el día 5. Desde el día 10, o cuando las células están disminuyendo la velocidad de división y se reducen respecto al tamaño, se congelan las células en alícuotas de por lo menos 4xl06 células/frasquito (a lxlO7 células/ml en 90% de FBS/10% de DMSC¡) para el almacenamiento. (c) Gen de TCR de tipo silvestre (wt) para la transfección de células T por medio de los métodos (a) y (b) anteriores
La Figura 5A es una secuencia de ADN (SEC ID No: 12) que codifica el TCR específico para MAGE-A3 nativo (optimizado con codones para la expresión máxima en células humanas) . Es una construcción de marco de lectura abierto individual de cadena alfa de longitud completa (TRAV21) -teschovirus-1 porcino 2A-cadena beta de longitud completa (TRBV5-1) . La secuencia 2A está subrayada y está precedida por nucleótidos que codifican un sitio de escisión de furina para ayudar en la remoción proteolítica de la secuencia 2A
(planteada adicionalmente más adelante en relación con la Figura 5B (SEC ID No: 13) . Pasar por alto enlaces peptídicos durante la traducción de proteínas del ARNm en el extremo 3' de la secuencia 2A produce dos proteínas: 1) fusión de cadena alfa de TCR-2A, 2) cadena beta de TCR. La SEC ID No : 12 incluye los sitios de restricción de Nhel y Salí
(subrayados) .
La Figura 5B es la secuencia de aminoácidos (SEC ID
No : 13) que corresponde a la Figura 5A
En la Figura 5B:
M1-S19 es una secuencia líder la cual se retira con la maduración del TCR de cadena alfa de tipo silvestre;
K20-S227 corresponde a la secuencia de cadena alfa de tipo silvestre SEC ID No: 2;
K20-R254 corresponde al dominio extracelular de cadena alfa de tipo silvestre;
I255-L271 es la región transmembrana de cadena alfa del
TCR maduro;
W272-S274 es la región intracelular de cadena alfa del
TCR maduro;
R277-R280 es el sitio de escisión de furina para ayudar en la remoción proteolítica, eri el aparato de Golgi, de la secuencia P2A A285-P303;
G275, S276, S281 a G284, R304 son conectores flexibles que permiten la función completa de la escisión de furina y secuencias P2A;
M305-V323 es una secuencia líder la cual se retira con la maduración del TCR de cadena beta de tipo silvestre;
K324-D565 corresponde a la secuencia de cadena beta de tipo silvestre SEC ID No: 3;
K324-E585 corresponde al dominio extracelular de cadena beta de tipo silvestre;
I586-V607 es la región transmembrana de cadena beta del
TCR maduro;
K608-G614 es la región intracelular de cadena beta del TCR maduro.
(d) Células T transfectadas con TCR específicos para MAGE de tipo silvestre y de alta afinidad
Siguiendo los procedimientos descritos en los puntos (a) y (b) anteriores, el gen', de TCR alfa wt_2A_beta wt específico para MAGE-A3 (SEC ID ;No: 12 (Figura 5A) ) se insertó en el vector de lentivirus pELNSxv utilizando los sitios de restricción de Nhel y SalJ únicos para ambas construcciones de ADN y se crearon células T transfectadas.
Similarmente, las células T se pueden crear por medio de la transfección con genes idénticos a la SEC ID No: 12 (Figura 5A) excepto que codifican (a) TCR con la secuencia de dominio variable (de Kl a P114) de la cadena alfa de tipo silvestre SEC ID No : 2, asociada con un dominio variable de cadena beta que tiene una de las SEC ID Nos: 10 u 11; o (b) un dominio variable de cadena alfa que tiene una de las SEC ID Nos: 8 o 9 asociadas con la secuencia de dominio variable (de Kl a T112) de la cadena beta de tipo silvestre SEC ID No: 3; o (c) un dominio variable de cadena alfa que tiene una de las SEC ID Nos: 8 o 9 asociadas con un dominio variable de cadena beta que tiene una de las SEC ID Nos: 10 u 11.
Ejemplo 6
Activación incrementada de células T transducidas con TCR de afinidad mejorada hacia MAGE-A3 en comparación con la afinidad de tipo silvestre en respuesta a líneas de células tumorales
Protocolo Elispot
El siguiente ensayo se llevó a cabo para demostrar la activación de linfocitos T citotóxicos transducidos con TCR (CTLs) en respuesta a líneas [ de células tumorales. La producción de IFN-?, medida utilizando. el ensayo ELISPOT, se utilizó como una lectura para la activación de linfocitos T citotóxicos (CTL) .
Reactivos
Medios de ensayo: FCS al 10% (Gibco, # de Catálogo 2011-09) , RPMI 1640 al 88% (Gibco, # de Catálogo 42401) , glutamina al 1% (Gibco # de Catálogo 25030) y penicilina/estreptomicina al 1% (Gibco # de Catálogo 15070-063) .
Amortiguador de lavado: PBS 0.01 M/Tween 20 al
0.05%
PBS (Gibco # de Catálogo 10010)
El kit Enzimático PVDF con IFNy Humano para ELISPOT
(Diaclone, Francia; # de Catálogo 856.051.020) contiene todos los otros reactivos requeridos. (Anticuerpos de captura y detección, leche descremada en polvo, BSA, estreptavidina-fosfatasa alcalina y solución de BCIP/NBT así como también las placas de 96 pocilios con IFN-? Humano PVDF para ELISPOT) Método
Preparación de células objetivo
Las células objetivo utilizadas en este método fueron células que presentaban epítopos naturales: carcinoma colorrectal HCT-116 y carcinoma pulmonar de células no pequeñas NCI-H1975 las cuales son¡ ambas HLA-A1+ MAGE+ . Los melanocitos epidérmicos, humanos, nórmales N3 , los cuales son HLA-A1+ MAGE" se utilizaron como control negativo. Suficientes células objetivo (50 000 células/pocilio) se lavaron tres veces por medio de la centrifugación a 1200 rpm, 10 minutos en un dispositivo Megafuge 1.0MR (Heraeus) . Las células luego se suspendieron de nuevo en medios de ensayo a 106 células/ml.
Preparación de Células Efectoras
Las células efectoras (células T) utilizadas en este método fueron una mezcla 1:1 de células T CD4+ y CD8+ (obtenidas por medio de la selección negativa (utilizando los Kits de Aislamiento Negativo de CD4 y CD8, DynalMR) de PBL) . Las células se estimularon con perlas revestidas con anticuerpo anti-CD3/CD28 (expansor de células T, Invitrogen) , se transdujeron con lentivirus que llevaban el gen que codificaba el TCR aß completo de interés (con base en la construcción descrita en el Ejemplo 5 y mostrada en la Figura 5A y se expandieron en medios de ensayo que contenían 50U/ml de IL-2 hasta entre 10 y 13 días después de la transducción. Estas células luego se colocaron en medios de ensayo antes del lavado por medio de la centrifugación a 1200 rpm, 10 minutos en un dispositivo Megafuge 1.0MR (Heraeus) . Las células luego se suspendieron de nuevo en medios de ensayo a 4X la concentración requerida,, final.
ELISPOTs
Las placas se prepararon de la siguiente manera: 100 µ? de anticuerpo de captura anti-IFN-? se diluyeron en 10 mi de PBS estéril por placa. 100 µ? del anticuerpo de captura diluido luego se prorratearon en cada pocilio. Las placas luego se incubaron durante toda la noche a 4°C. Después de la incubación, las placas se lavaron (programa 1, tipo de placa 2, lavador de placas de 96 pocilios, Ultrawash PlusMR; Dynex) para retirar el anticuerpo de captura. Las placas luego se bloquearon al agregar 100 µ? de leche descremada al 2% en PBS estéril a cada pocilio e incubar las placas a temperatura ambiente durante dos horas. La leche descremada luego se lavó de las placas (programa 1, tipo de placa 2, lavador de placas de 96 pocilios Ultrawash PlusMR, Dynex) y cualquier amortiguador de lavado restante se retiró al sacudir y golpear suavemente las placas de ELISPOT sobre una toalla de papel .
Los constituyentes del ensayo luego se agregaron a la placa de ELISPOT en el siguiente orden:
50 µ? de células objetivo 106 células/ml
(proporcionando un total de 50,000 células objetivo/pocilio).
Suficientes medios para proporcionar un volumen final de 200 ul por pocilio (medios de ensayo) .
50 µ? de células efectoras (5,000 células CD4/8+ transducidas , mezcladas/pocilio) .
Las placas luego se incubaron durante toda la noche (37°C/C02 al 5%). Al siguiente día, las placas se lavaron tres veces (programa 1, tipo de placa 2, lavador de placas de 96 pocilios Ultrawash PlusMR, Dyhex) con amortiguador de lavado y se golpearon suavemente sobre una toalla de papel para retirar el exceso de amortiguador de lavado. 100 µ? de anticuerpo de detección primario luego se agregaron a cada pocilio. El anticuerpo de detección primario se preparó al agregar 550 µ? de agua destilada a un frasquito de anticuerpo de detección suministrado con el kit DiacloneMR. 100 µ? de esta solución luego se diluyeron en 10 mi de PBS/BSA al 1% (el volumen requerido para una placa individual) . Las placas luego se incubaron a temperatura ambiente durante por lo menos 2 horas antes de ser lavadas tres veces (programa 1, tipo de placa 2, lavador de placas de 96 pocilios Ultrawash PlusMR, Dynex) con amortiguador de lavado, el exceso de amortiguador de lavado se retiró al golpear suavemente la placa sobre una toalla de papel.
La detección secundaria se realizó al agregar 100 µ? de estreptavidina- fosfatasa alcalina diluida a cada pocilio e incubar la placa a temperatura ambiente durante 1 hora. La estreptavidina- fosf tasa alcalina se preparó al agregar 10 µ? de estreptavidina- fosfatasa alcalina a 10 mi de PBS/BSA al 1% (el volumen requerido para una placa individual) . Las placas luego se lavaron tres veces (programa 1, tipo de placa 2, lavador de placas de 96 pocilios Ultrawash PlusMR, Dynex) con amortiguador de lavado y se golpearon suavemente sobre una toalla de papel para retirar el exceso de amortiguador de lavado. 100 µ? de solución de BCIP/NBT, como se suministró con el kit DiacloneMR, luego se agregaron a cada pocilio. Durante el desarrollo, las placas se cubrieron en una hoja delgada de metal y se dejaron durante 5-15 , minutos. Las placas en desarrollo se verificaron regularmente por las manchas durante este período para determinar el tiempo óptimo para terminar la reacción. Las placas se lavaron en un fregadero lleno de agua de la llave para terminar la reacción de desarrollo y se agitaron en seco antes de su desensamble en sus tres partes constituyentes. Las placas luego se secaron a 50 °C durante 1 hora antes del conteo de las manchas que se habían formado en la membrana utilizando un lector de placas ImmunospotMR (CTL; Cellular Technology Limited) .
RESULTADOS
La liberación de IFNy por células T transducidas con TCR activado en respuesta a una variedad de líneas de células tumorales MAGE-A3 -positivas y de control se sometió a prueba por medio de un ensayo de ELISPOT (descrito anteriormente) . El número de manchas de ELISPOT observadas en cada pocilio se representó gráficamente utilizando PrismMR (Graph Pad) .
Las células T CD4+, CD8+ o CD4+/CD8+ mezcladas que expresaban a) TCR No: 1, b) TCR No 2, c) TCR No: 3, d) TCR No : 4 o e) TCR No: 5 (como se describe en la siguiente tabla) se incubaron con líneas de células tumorales MAGE-A3+ HLA: Al+ HCT-116 o NCI-H1975 o con melanocitos N3 MAGE-A3" HLA:Al+ . Las células T no transducidas (Nt) también se utilizaron como un control negativo.
La Figura 6 demuestra que las células T transducidas con TCR No: 1 no liberaron IFNy en respuesta a líneas de células tumorales . Las células T transducidas con TCR No: 2 liberaron IFNy únicamente en respuesta a células de carcinoma colorrectal HCT-116. Las células T transducidas con TCR específico para MAGE-A3 de afinidad mejorada No: 3, 4 y 5 respondieron en mayor número a las células HCT-116 pero también respondieron a las células NCI-H1975.
Ejemplo 7
Citotoxicidad incrementada de células T transducidas con TCR de afinidad mejorada específico para MAGE-A3 en respuesta a una línea de células tumorales de tipo silvestre
Este ensayo es una alternativa colorimétrica a los ensayos de citotoxicidad radioactivos de liberación de 51Cr y mide cuantitativamente la lactato deshidrogenasa (LDH) la cual es una enzima que es liberada con la lisis de células.
La LDH liberada en sobrenadantes dé cultivos se mide con un ensayo enzimático acoplado durante 30 minutos, el cual da por resultado la conversión de una sal de tetrazolio (INT) en un producto de formazan rojo. La cantidad de color formado es proporcional al número de células Usadas. Los datos de absorbancia se recolectan utilizando un lector de placas de 96 pocilios estándar a 490 nm.
Materiales
El Ensayo de Citotoxicidad no Radioactivo CytoTox96MR (Promega) (G1780) contiene una Mezcla de Substratos, Amortiguador de Ensayo, Solución de Lisis y Solución de Detención
- Medios de cultivo: FCS al 10% (inactivado térmicamente, Gibco, # de catálogo 10108-165) , RPMI 1640 al 88% con rojo de fenol (Invitrogen, # de catálogo 42401042) , glutamina al 1%, 200 mM (Invitrogen, # de catálogo 25030024) , penicilina/estreptomicina al 1% (Invitrogen, # de catálogo 15070063) i
- Medios de ensayo: FCS al 10% '(inactivado térmicamente, Gibco, # de catálogo 10108-165) , RPMI 1640 al 88% sin rojo de fenol (Invitrogen, # de catálogo 32,404014) , glutamina al 1%, 200 mM (Invitrogen, # de; catálogo 25030024) , penicilina/estreptomicina al 1% (Invitrogen, # de catálogo 15070063)
- Placa de cultivo de tejido de 96 pocilios de fondo redondo Nunc microwellMR (Nunc, # de catálogo 163320)
- Inmunoplacas Nunc MaxisorbMR (Nunc, # de catálogo 442404) Método
Preparación de células objetivo
Las células objetivo (T) utilizadas en este ensayo fueron la línea de células de carcinoma colorrectal HCT-116 (HLA-A1+ MAGE-A3+) con o sin supresión de la expresión de proteína MAGE-A3/6 por medio de ARNsh (supresión realizada como se describe posteriormente) . Las células objetivo se prepararon en medio de ensayo: la concentración de células objetivo se ajustó a 2 x 105 células/ml para proporcionar lxlO4 células/pocilio en 50 µ? .
Supresión de MAGE-A3/6 por medio de ARNsi
Las células HCT-116 se transdujeron con partículas lentivirales que codificaban ARNsh de MAGE-A3/6 (Santi Cruz Biotech, # de catálogo sc-45284-V) como se describe en las instrucciones del fabricante. En resumen, 4xl04 células se colocaron por pocilio de una placa de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocilios (100 µ?/pocillo) y se incubaron durante toda la noche hasta adherirse. Se intentó conseguir aproximadamente 50% de confluencia. Al siguiente día, 10 µ? de medio se reemplazaron por 10 µ? de 100 µ9/p\1 de polibreneMR (diluido en medio de cultivo; Santa Cruz Biotech, # de catálogo sc-134220) para proporcionar una concentración final de 5 µg/ml por pocilio. El .sobrenadante que contenía partículas lentivirales de ARNsh se descongeló lentamente a temperatura ambiente y se mezcló suavemente. 60 µ? de sobrenadante que contenía partículas lentivirales entonces se agregaron por pocilio con 40 µ? adicionales de medio de cultivo para proporcionar un volumen total de 200 µ? por pocilio y las células se incubaron durante toda la noche. Después de 18 horas, el medio se retiró suavemente y se reemplazó por 200 µ? de medio de cultivo nuevo sin polibreneMR. Al siguiente día, las células se separaron con tripsina al 0.25%-EDTA (Invitrogen # de catálogo 25200) y se sembraron en placas de 6 pocilios para la expansión en medio nuevo que contenía 5 µg/ml de clorhidrato de puromicina (Santa Cruz Biotech, # de catálogo sc-108071) para la selección de células que expresaban el ARNsh. Las células se congelaron después de varias corridas de expansión. La supresión de la expresión de la proteína MAGE-A3/6 se evaluó por medio de la inmunotransferencia Western.
Preparación de células efectoras
Las células efectoras (E) , utilizadas en este ensayo fueron las célula T CD8+ y CD4+ mezcladas (1:1) estimuladas, transducidas y expandidas como se describiera previamente (Ejemplo 7) . La relación de células; efectoras con respecto a células objetivo fue 1.25:1. La's células efectoras se prepararon en medio de ensayo,- la concentración de células se ajustó a 2.5xl05/ml para proporcionar 1.25xl05 en 50 µ? .
Preparación del ensayo
Los constituyentes del ensayo se agregaron a la
o
placa en el siguiente orden:
Medio de ensayo (para proporcionar 150 µ? total por pocilio)
- 50 µ? de células objetivo (preparadas como se explicara previamente) a cada pocilio
- 50 µ? de células efectoras (preparadas como se explicara previamente) a cada pocilio
Varios controles se prepararon como se explica a continuación:
- Liberación espontánea de células efectoras: 50 µ? de células efectoras solas.
- Liberación espontánea de células obj etivo : 50 µ? de células objetivo solas.
Liberación máxima de células objetivo: 50 µ? de células objetivo solas + 10 µ? de digitonina (600 µg/ml para proporcionar 40 µg/ml final)
Control de medio de ensayo: 150 µ? de medio solo.
Control de volumen de medio de ensayo para solución de lisis: 150 µ? de medio + 10 µ? de digitonina.
Todos los pocilios se prepararon por triplicado en un volumen final de 150 µ? . La placa se centrifugó a 250 x g durante 4 minutos, luego se incubó a 37°C durante 24 horas. La placa se centrifugó a 250 x g durante 4 minutos. 50 µ? del sobrenadante de cada pocilio de la placa de ensayo se transfirieron al pocilio correspondiente de una placa de 96 pocilios de fondo plano Nunc Maxisorb . La Mezcla de Substratos se reconstituyó utilizando Amortiguador de Ensayo (12 mi) . 50 µ? de la Mezcla de Substratos reconstituida entonces se agregaron a cada pocilio de la placa. La placa se cubrió con una hoja delgada de aluminio y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. 50 µ? de Solución de Detención se agregaron a cada pocilio de la placa para detener la reacción. La absorbancia a 490 nm se registró en un lector de placas de ELISA dentro de una hora después de la adición de la Solución de Detención.
Cálculo de Resultados
El promedio de los valores de absorbancia del Fondo de Medio de Cultivo se sustrajo de todos los valores de absorbancia de Liberación Espontánea de Células Objetivo, Experimental y Liberación Espontánea de Células Efectoras. El promedio de los valores de absorbancia del Control de Corrección de Volumen se sustrajo de los valores de absorbancia obtenidos para el Contrpl de Liberación Máxima de Células Objetivo.
Los valores corregidos obtenidos en los primeros dos pasos se utilizaron en la siguiente fórmula para calcular el porcentaje de citotoxicidad :
% de citotoxicidad = 100 x (Experimental - Espontánea Efectora - Espontáneo Objetivo) / (Máxima Objetivo - Espontánea Objetivo) Resultados
La gráfica en la figura 7 muestra la eliminación específica de células de carcinoma colorrectal por parte de células T transducidas para expresar el TCR No: 1, TCR No: 2 o TCR No: 3 (como se describe en la siguiente tabla) . Las células T transducidas con TCR No: 2 y las células T transducidas con TCR No: 3 eliminan las células de carcinoma colorrectal HCT-116 que expresan MAGE-A3, con una citotoxicidad incrementada en comparación con las células T transducidas con TCR No: 1 de tipo silvestre. Esta eliminación se reduce por medio de la supresión de ARNsh de la expresión de proteínas MAGE-A3/6 en las células HCT-116.
(T(M-) ) .
Se hace constar que con relación a esta fecha, mejor método conocido por la solicitante para llevar a práctica la citada invención, es el que resulta claro de presente descripción de la invención.
Claims (14)
1. Un receptor de células T (TCR) que tiene la propiedad de enlazarse al complejo de EVDPIGHLY (SEC ID No : 1) HLA-Al y que comprende un dominio variable alfa de TCR y un dominio variable beta de TCR, caracterizado porque: el dominio variable alfa de TCR tiene la secuencia de aminoácidos desde Kl hasta P114 de la SEC ID No: 2 excepto que está presente por lo menos una de las siguientes mutaciones, específicamente 501 es mutado a 50V; 51Q es mutado a 51R 52S es mutado a 52P 53S es mutado a 53Y; y/o : el dominio variable beta 1 de TCR tiene la secuencia de aminoácidos desde Kl hasta T112 de la SEC ID No: 3 excepto que está presente por lo menos una de las siguientes mutaciones, específicamente 50F es mutado a 50T; 51S es mutado a 51D¡ 52E es mutado a 52M 53T es mutado a 53L 54Q es mutado a 54L.
2. Un TCR de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende na de las secuencias de aminoácidos de dominio variable dé cadena alfa SEC ID Nos: 8 y 9.
3. Un TCR de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque comprende una de las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena beta SEC ID Nos: 10 Y 11.
4. Un TCR de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque también tiene un dominio constante de TRAC de cadena alfa y un dominio constante de TRBCl o TRBC2 de cadena beta o que tiene dominios constantes de TRAC de cadena alfa y TRBCl o TRBC2 de cadena beta modificados mediante el truncamiento o sustitución para suprimir el enlacé de disulfuro nativo entre Cys4 del exón 2 de TRAC y Cys2 del ;exón 2 de TRBCl o TRBC2.
5. Un TCR de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque es un TCR heterodimérico aß y el cual tiene secuencias de dominio constante de cadena alfa y beta en 'las cuales los residuos de cisteína son sustituidos por Thr 48, de TRAC y Ser 57 de TRBCl o TRBC2, las cisteínas forman un enlace de disulfuro entre los dominios constantes alfa y beta del TCR.
6. Un ácido nucleico, caracterizado porque codifica un TCR de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
7. Una célula que alberga un vector de expresión de TCR, caracterizada porque comprende ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7 en un marco de lectura abierto individual o dos marcos de lectura abiertos distintos .
8. Una célula, caracterizada porque alberga un primer vector de expresión el cuál comprende ácido nucleico que codifica la cadena alfa de un TCR de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un segundo vector de expresión el cual comprende ácido nucleico que codifica la cadena beta de un TCR de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
9. Una célula, caracterizada porque exhibe sobre su superficie un TCR de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
10. Una célula de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque presenta un TCR que tiene un dominio variable de cadena alfa de la SEC ID No: 8 y una cadena beta de la SEC ID No: 3.;
11. Una célula de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque presenta un TCR que tiene un dominio variable de cadena alfa de la SEC ID No : 9 y una cadena beta de la SEC ID No: 3.
12. Una célula de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque presenta un TCR que tiene una cadena alfa de la SEC ID No: 2 y un dominio variable de cadena beta de la SEC ID No: 10.
13. Una célula de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque presenta un TCR que tiene una cadena alfa de la SEC ID No: 2 y un dominio variable de cadena beta de la SEC ID No: 11.
14. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una pluralidad de células de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, junto con uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.
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