DE19540515C1 - Tumortherapie durch adoptiven Transfer CD44v-spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten - Google Patents
Tumortherapie durch adoptiven Transfer CD44v-spezifischer zytotoxischer T-LymphozytenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Therapie von Tumoren durch adoptiven Transfer zytotoxi
scher T-Lymphozyten, die Tumorzellen zerstören, die ein oder mehrere variante Epitope
des CD44-Gens auf ihrer Zelloberfläche exprimieren.
Die Bekämpfung multipler (metastatischer) solider Tumoren stellt gegenwärtig ein
kritisches Problem in der Krebstherapie dar. Viele Laboratorien und Kliniken richten ihre
Versuche darauf, die Immunabwehr gegen die Tumoren wiederzubeleben. Solche Versuche
gründen auf der Annahme, daß Reaktivität gegen Tumorantigene existiert, aber ineffektiv
geworden ist. Expansion und Reinjektion von tumorinfiltrierenden Lymphozyten, Verabrei
chung fehlender Komponenten wie Zytokine oder kostimulatorische Oberflächenmoleküle,
oder Verbesserung der Tumorantigenpräsentation sind experimentelle Ansätze, von denen
angenommen wird, daß sie zur Tumorzerstörung führen (1-6).
In einem alternativen Ansatz, anti-Tumor-Immunreaktionen zu mobilisieren, werden
Lymphozyten dazu gebracht, unabhängig von ihrer TCR-Spezifität (TCR = T-Zell-Rezeptor)
Tumorzellen zu zerstören. Als eine Möglichkeit, dies zu erreichen, wurden bispezifische
Antikörper erzeugt, die eine Affinität sowohl für Lymphozytenoberflächenmoleküle als auch
Tumorantigen haben, und von denen angenommen wird, daß sie Lymphozyten in Kontakt
mit Tumorzellen bringen (7, 8). Weil jedoch Antikörper nur schlecht in solide Tumoren ein
dringen können (9), wäre es als eine weitere Möglichkeit wünschenswert, die Tumorspezifi
tät auf Lymphozyten zu übertragen, die Zellen, die natürlicherweise in Gewebe eindringen
und antigenspezifische Zytolyse ausüben können. Fusionen von Strukturen, die Spezifität
determinieren, z. B. ein Antikörperminigen, mit Komponenten des TCR-Komplexes sind
deshalb vorgeschlagen worden (10). Die zentrale Rolle der ζ-Untereinheit des TCR-Komplexes
für die Signalübertragung wurde kürzlich erkannt, wobei chimäre Rezeptoren ver
wendet wurden, die aus der zytoplasmatischen Domäne der ζ-Kette und der extrazellulären
und transmembranen Domäne von anderen Proteinen bestanden (21-25).
Bevor man in der Lage ist, Lymphozyten eines Tumorpatienten zu reprogrammieren,
muß eine Fülle von Fragen geklärt werden. Zum Beispiel, auf welches Epitop sollen die
Lymphozyten gerichtet werden? Eine weitere Frage ist, welche Antikörperaffinität (des
Miniantikörpers in der TCR-Fusion) wird gebraucht oder ist ausreichend, um die Zerstö
rung von Tumorzellen zu bewirken? Weil ruhende Lymphozyten, zusätzlich zu der ge
wünschten Affinität für ein Tumorantigen, eine ausreichende Signalübertragung in den Kern
benötigen, um eine Expansion zu erreichen sowie, noch wichtiger, ihre Differenzierung in
CTLs, muß ferner geklärt werden, ob die genetisch erzeugten Fusionsproteine überhaupt
signalisieren oder Signale von genügender Stärke zur Verfügung stellen können, um primäre
periphere Lymphozyten ausreichend zu aktivieren.
Das Tumorantigen CD44 stellt eine Familie von Oberflächenmolekülen mit extremer
Variabilität dar, die durch alternatives Spleißen erzeugt wird (11-15). Metastatische Tumo
ren aus Tier und Mensch exprimieren oft bestimmte CD44-Isoformen. Insbesondere schei
nen Epitope, die durch das Exon v6 kodiert werden, mit Tumorprogression und schlechter
Prognose korreliert zu sein (11, 16-19). In der Ratte interferiert der Antikörper 1.1ASML,
der für ein v6-kodiertes Epitop spezifisch ist, mit der metastatischen Ausbreitung von Pan
kreaskarzinomen (20).
Die Aufgabe, deren Lösung der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, war die
Bereitstellung verbesserter Verfahren zur adoptiven Immuntherapie von Tumoren sowie
von Mitteln für solche Verfahren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Fusionsprotein, enthaltend einen ersten
Anteil, der eine spezifische Affinität für eine Aminosäuresequenz hat, die durch ein variantes
Exon des CD44-Gens kodiert wird, und einen zweiten Anteil, der die Aminosäuresequenz
einer Untereinheit des T-Zell-Rezeptorkomplexes oder eines Immunglobulinrezeptors oder
eines Teils dieser Untereinheit enthält. Bevorzugt enthält der erste Anteil eine variable
Domäne eines Antikörpers, der für variantes CD44 (CD44v) spezifisch ist. Eine solche
Domäne kann in Form eines einkettigen Antikörpermoleküls (scFv) bereitgestellt werden, in
dem die variable Region der leichten Kette (VL) und die variable Region der schweren
Kette (VH) des Antikörpers über eine flexible Verknüpfungsregion miteinander verknüpft
sind. Der CD44v-spezifische Anteil des Fusionsproteins kann auch vorteilhaft auf ein huma
nes oder humanisiertes Antikörpermolekül zurückgehen. Insbesondere sind Ausführungs
formen bevorzugt, bei denen der Antikörperanteil des Fusionsproteins eine spezifische
Affinität für eine Aminosäuresequenz hat, die vom variablen Exon v5 und/oder v6 kodiert
wird. Ganz besonders bevorzugt ist dabei eine spezifische Affinität für ein Epitop in der
Aminosäuresequenz KWFENEWQGKNPPT (Ratte) oder QWFGNRWHEGYRQT
(Mensch). Ein vorteilhafter Weg der Ausführung der Erfindung ist die Konstruktion eines
Fusionsproteins, dessen Antikörperanteil eine Aminosäuresequenz gemäß Abb. 1B
enthält. Besonders bevorzugt ist ferner ein Fusionsprotein, dessen erster Anteil von dem
Antikörper VFF-18 abgeleitet ist, der von einer Hybridomazellinie sezerniert wird, die am
07.06.1994 unter dem Aktenzeichen DSM ACC2174 bei der DSM-Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig,
Deutschland, hinterlegt wurde. Dieser Antikörper ist für ein Epitop innerhalb der Aminosäu
resequenz QWFGNRWHEGYRQT spezifisch.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Fusionsprotein,
bei dem der erste Anteil, der eine spezifische Affinität für eine Aminosäuresequenz hat, die
durch ein variantes Exon des CD44-Gens kodiert wird, mit der ζ-Untereinheit des T-Zell-Rezeptors
oder einem Teil bzw. Fragment dieser Untereinheit verknüpft ist. Vorteilhaft
kann der Teil bzw. das Fragment der ζ-Untereinheit die zytoplasmatische Domäne und/oder
die Transmembrandomäne der ζ-Untereinheit enthalten. Statt der extrazellulären Domäne
der ζ-Untereinheit kann das Fusionsprotein in einer solchen Ausführungsform dann den er
sten Anteil, der eine spezifische Affinität für eine Aminosäuresequenz hat, die durch ein
oder mehrere variable(s) Exon(s) des CD44-Gens kodiert wird, enthalten. In einer weiteren
Ausführungsform können der erste und der zweite Anteil über eine Scharnierregion (hinge)
miteinander verknüpft sein, z. B. die Scharnierregion von CD8α.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Nukleinsäuremolekül, das
für ein Fusionsprotein, wie es oben beschrieben wurde, kodiert. Vorteilhaft kann ein solches
Nukleinsäuremolekül ein Expressionsvektor sein, der die kodierende Information für ein
solches Fusionsprotein enthält. Typischerweise ist in einem solchen Expressionsvektor die
für das Fusionsprotein kodierende Sequenz so angeordnet, daß sie in funktionellem Zusam
menhang mit einer oder mehreren regulatorischen Sequenzen steht, so daß mit Hilfe dieses
Expressionsvektors das Fusionsprotein in einer geeigneten Wirtszelle, z. B. einer eukaryoti
schen Kulturzelle, oder aber auch, besonders bevorzugt, in einem Lymphozyten exprimiert
werden kann.
Entsprechend ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung eine Wirtszelle, die ein Nu
kleinsäuremolekül oder einen Expressionsvektor, wie sie im vorhergehenden Absatz be
schrieben wurden, enthält.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein T-Lymphozyt, der ein
Fusionsprotein, wie es oben beschrieben wird, exprimiert. Vorzugsweise wird dabei das
Fusionsprotein in die Zellmembran dieses T-Lymphozyten inseriert und dabei der Anteil mit
der spezifischen CD44v-Affinität nach außen exponiert. Ein weiterer Gegenstand der Erfin
dung ist die Verwendung eines solchen T-Lymphozyten
zur Behandlung von Krebs- bzw. zur Behandlung und/oder Pro
phylaxe metastatischer Erkrankungen. Besonders vorteilhaft ist eine solche Verwendung,
wenn es sich bei der Erkrankung um ein Mamma-, Kolon-, Magen- oder Pankreaskarzinom
handelt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls oder Expres
sionsvektors, wie er zuvor beschrieben wurde,
zur Behandlung von Krebs- bzw. zur Behandlung und/oder
Prophylaxe metastatischer Erkrankungen. Besonders vorteilhaft ist eine solche Verwen
dung, wenn es sich bei der Erkrankung um ein Mamma-, Kolon-, Magen-, Zervix- oder
Pankreaskarzinom oder um ein malignes Lymphom handelt.
Die vorliegende Erfindung kann wie in den Beispielen beschrieben oder, in Kenntnis
der technischen Lehre dieser Beschreibung, mit Hilfe an sich bekannter Methoden ausge
führt werden. Die Herstellung von Antikörpermolekülen, die für variante Epitope von CD44
spezifisch sind, ist im Stand der Technik beschrieben. Neben den bereits genannten Litera
turstellen sei hier noch auf die WO 91/17248, WO 95/00851, WO 95/04547 und
PCT/EP9502126 verwiesen, auf die hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird. Insbeson
dere die WO 95/00851 beschreibt die Herstellung v5- und v6-spezifischer Antikörper sowie
von Antikörpern, die für ein Übergangsepitop spezifisch sind, das von den Exons v7 und v8
gemeinsam kodiert wird. Verfahren zur Klonierung der variablen Regionen solcher Anti
körper und zur Herstellung abgeleiteter Antikörpermoleküle, z. B. chimärer, humanisierter
oder einkettiger Antikörpermoleküle, sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt. Hier
seien zusätzlich zu den bereits genannten Referenzen die EP 0239400, EP 0519596, EP
0368684, EP 0438310, WO 92/07075 und die WO 92/22653 genannt. Für die Anwendung
der erfindungsgemäßen Lehre in der Therapie und Prophylaxe menschlicher Krebserkran
kungen wird der erste Anteil des Fusionsproteins bevorzugt ein humanisiertes Antikörper
molekül oder von einem humanisierten Antikörpermolekül abgeleitet sein.
Der zweite Anteil des Fusionsproteins wird bei der Anwendung der erfindungsgemä
ßen Lehre in der Therapie und Prophylaxe menschlicher Erkrankungen bevorzugt eine Ami
nosäuresequenz einer Untereinheit des humanen T-Zell-Rezeptorkomplexes oder eines
humanen Immunglobulinrezeptors oder eines Teils dieser Untereinheit enthalten. Insbeson
dere kann dies die Sequenz oder eine Teilsequenz der ζ-Untereinheit des humanen T-Zell-Rezeptors
sein (51).
Fusionsproteine mit v5-spezifischer Affinität im Sinne der vorliegenden Erfindung
bzw. Nukleinsäuren, die dafür kodieren, sind deshalb vorteilhaft, weil das Exon v5 in einer
Reihe von Krebserkrankungen bereits in einem sehr frühen Stadium exprimiert wird. V6-spezifische
Fusionsproteine bzw. Nukleinsäuren, die dafür kodieren, können beispielsweise
zur Behandlung von Kolon-, Magen-, Pankreas- oder Mammakarzinomen eingesetzt wer
den. Fusionsproteine mit Spezifität für das Übergangsepitop v7/v8 bzw. Nukleinsäuren, die
dafür kodieren, sind insbesondere zur Behandlung von Zervixkarzinomen von Vorteil.
Die vorliegende Erfindung kann beispielsweise ausgeführt werden, indem ein Expres
sionsvektor konstruiert wird, der die Expression eines Fusionsproteins in humanen T-Lym
phozyten erlaubt, wobei der erste Anteil dieses Fusionsproteins ein einkettiges Antikörper
konstrukt ist, das sich vom CD44v6-spezifischen Antikörper VFF-18 ableitet, und der zwei
te Teil des Fusionsproteins die zytoplasmatische Domäne und die Transmembrandomäne
der ζ-Untereinheit des humanen TCR enthält, wobei die beiden Anteile über eine Scharnier
region verknüpft sind. Ein solcher Expressionsvektor kann dann in Lymphozyten einge
bracht werden, die aus dem Blut eines Tumorpatienten gewonnen wurden, und die so ver
änderten Lymphozyten zurück in den Patienten injiziert werden.
Der in den Beispielen beschriebene retrovirale Transfer des scFv:α:ζ-Fusionstruktes
führte zur Oberflächenexpression des Proteins. Auf der Oberfläche der T-Zellen
zeigte das Fusionsprotein die korrekte Antigenspezifität. Die reprogrammierte CTL-Linie
zeigt eine veränderte Zielzellspezifität. Während sie zytotoxische Aktivität gegenüber dem
P815-Mastozytom, gegen welches sie erzeugt wurde, beibehält, zerstört sie nun zusätzlich
v6-Epitop exprimierende Tumorzellen in vitro. Die Affinität und möglicherweise die Sig
nalübertragung über die ζ-Kette reicht für das Zerstörungsereignis in vitro aus. Dies ist in
Übereinstimmung mit vergleichbaren Versuchen, bei denen andere Antigene und entweder
die ζ-Kette oder die homologe y-Kette des hochaffinen FcεRI als Fusionspartner für die
scFv Fragmente verwendet wurde (10, 41, 42, 47-49). In der Maus führen die reprogram
mierten CTLs zu einer signifikanten Verzögerung des Tumorwachstums von Xenotrans
plantaten.
In Kenntnis der nachstehenden Beispiele ist es möglich, antigenselektive CTLs mit
anderen Spezifitäten zu erzeugen, insbesondere für CD44-Epitope, die von humanen Zer
vixkarzinomen oder von Mamma- oder kolorektalen Karzinomen gebildet werden (16-18,
44, 50). Neue Spezifitäten können durch scFv-Austausch in den retroviralen Konstrukten
erzeugt werden.
(A) Amino
säuresequenzen, die das Epitop des monoklonalen Antikörpers (mAk) 1.1ASML enthalten.
Das Epitop ist in den Aminosäuren 318-331 der CD44v4-v7-Isoform der Ratte enthalten
(Klon pMeta-1; Sequenzdaten siehe Ref. 11). Die ungefähre Ausdehnung des Epitops wur
de durch Kompetitionsanalyse mit synthetischen Peptiden bestimmt. (B) Nukleotid- und
abgeleitete Aminosäuresequenz des scFv(1.1ASML)-Gens. Die Sequenz zeigt das cDNA-Fragment
(bp 1-357), das die VH-Domäne kodiert, den synthetischen Linker (bp 358-402),
und das cDNA-Fragment (bp 403-735), das die Vκ-Domäne kodiert. Die CDRs in
der abgeleiteten Aminosäuresequenz der 1.1ASML VH- und Vκ-Domänen und des syntheti
schen Linkerpeptides sind unterstrichen. Die Sequenzpositionen bp 736-746 werden durch
das Plasmid pWW152 beigetragen. (C) Schematische Darstellung des scFv(1.1ASML):α:ζ-Expressionsplasmides
pL[scFv(1.1ASML):α:ζ]. Das Plasmid enthält das Gen für den
chimären scFv(1.1ASML):α:ζ-Oberflächenrezeptor, der in den retroviralen Vektor pLXSN
inseriert ist. Die Leadersequenz der schweren Immunglobulinkette (SP), das PCR-amplifizierte
cDNA-Fragment VH des mAk 1.1ASML, eine Sequenz, die den 15 Aminosäure-Linker kodiert (LINKER), das PCR-amplifizierte cDNA-Fragment Vκ von 1.1ASML, eine Se
quenz, die für die immunglobulinähnliche Scharnierregion der CD8α-Kette kodiert
(HINGE), und die cDNA für die Transmembran- und zytoplasmatische Domäne der ζ-Kette
des T-Zell-Antigenrezeptors (ζ) sind als Kästen angezeigt. Die Expression des Fusionsgens
wird durch den Moloney-Murine-Leukemia-Virus-5′-LTR-Promotor transkriptionell
reguliert. Das neor-Gen, das die G418-Resistenz vermittelt, wird von dem gleichen Plasmid
kodiert. Die Pfeile zeigen die Transkriptionsstartpunkte an. Ψ+/gag bezieht sich auf
Sequenzen des Moloney-Murine-Sarcoma-Virus- und des MoMuLV-Genoms, die für die
Verpackung erforderlich sind.
(A) Expression von scFv(1.1ASML):α:ζ in zytotoxischen T-Lymphozyten. Zellysate (NP-40-Lysepuffer:
1% NP-40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM PMSF, 10 mM
Iodacetamid, 80 µg/ml Aprotinin, 50 µg/ml Leupeptin, 4 µg/ml Pepstatin) wurden aus Eltern-cI96
oder CAYZ.007 hergestellt. Protein-Aliquots (cI96: Spur 1; CAYZ.007: Spur 2)
wurden in einer 10%-SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt und einer
Standard-Immunoblotanalyse unterworfen. Einer Inkubation mit mAk H146-968 (anti-ζ)
folgte eine Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Zweitreagenz (P260, DAKO,
Hamburg, Deutschland), das mit H146-968 reagierte. (B) Zelloberflächenlokalisation
von scFv(1.1ASML):α:ζ in infizierten zytotoxischen T-Zellen. 2 × 10⁷ lebensfähige CTLs
(CAYZ.007: Spuren 1 und 2; cI96: Spur 3) wurden mit Sulfo-NHS-Biotin (Pierce, Rock
ford, IL, USA) markiert, in 1 ml NP-40-Lysepuffer lysiert und der Immunpräzipitation mit
dem anti-ζ mAk H146-968 (Spuren 1 und 3) oder einem Kontroll-mAk (Spur 2) unterwor
fen. Immunkomplexe wurden durch Behandlung mit Protein-G-Agarose präzipitiert, in einer
10% SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt und auf eine PVDF-
(Polyvinyliden-Difluorid)-Membran
(Millipore Bedford, MA, USA) transferiert. Biotinylier
te Proteine wurden mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Streptavidin visualisiert. (C)
Spezifische Bindung von scFv(1.1ASML):α:ζ an Ratten-CD44-Spleißvarianten, die v6-Epitop
tragen. 5 × 10⁷ CAYZ.007-Zellen wurden in NP-40-Lysepuffer lysiert. Zellkernfreie
Überstände wurden mit Glutathion-Agarose vorgeklärt und anschließend mit
GST#CD44v4-v7 inkubiert (Spur 2). GST#CD44v4-v7 ist ein bakteriell exprimiertes Fu
sionsprotein, das aus der Glutathion S-Transferase aus S. japonicum und Sequenzen, die
durch die varianten Exons v4-v7 von Ratten-CD44 spezifiziert werden, besteht. Immun
komplexe wurden durch Behandlung mit Glutathion-Agarose präzipitiert und unter redu
zierenden Bedingungen in einer 10% SDS-PAGE aufgetrennt. In einer Standard-Immuno
blotanalyse wurden die ζ-Proteine durch Reaktion mit anti-ζ mAk H146-968 nachgewiesen
(siehe Abb. 2A). Inkubationen mit GST (anstatt GST#CD44v4-v7, Spur 3) oder mit
Glutathion-Agarose allein (Spur 1) dienten als Kontrollen. Positionen und Molekularge
wichte von Standardproteinen sind angezeigt. Pfeile zeigen die endogene ζ-Kette oder die ζ-Chimäre
an.
(A) CAYZ.007 und Eltern-cI96-Zellen wurden auf ihre zytolytische Aktivität
gegenüber verschiedenen Zielzellen in einem 6-stündigen LDH-Freisetzungstest untersucht.
BSp73 AS14 ist eine transfizierte Rattenpankreaskarzinomzellinie, die die CD44v4-v7-Isoform
der Ratte in großer Menge exprimiert; NIH3T3#CD44v4-v7 sind infizierte murine Fi
broblasten, die Ratten-CD44v4-v7 exprimieren. Die spezifische LDH-Freisetzung (in Pro
zenten) ist gegen das E/T-Verhältnis (Effektor/Zielzell-Verhältnis) aufgetragen. (B) Kom
petitive Suppression der BSp73AS 14-Lyse durch mAk 1.1ASML. BSp73AS 14-Zellen wur
den mit CAYZ.007-CTLs bei einem konstanten Effektor/Zielzellen-Verhältnis von 4 : 1 in
der Gegenwart von steigenden Mengen des mAk 1.1ASML inkubiert. Ein Zytotoxizitäts
test, der in der Gegenwart eines isotypgleichen Antikörpers irrelevanter Spezifität (anti-Gallium-Chelat;
siehe Ref 12) durchgeführt wurde, diente als Kontrolle. Die prozentspezi
fische LDH-Freisetzung ist gegen die Konzentration des Kompetitors aufgetragen.
Athymische BALB/c-Nacktmäuse, die palpierbare s.c. BSp73AS14-Xenotransplantate
(pankreatisches Karzinom der Ratte) in einer Größe von 20-50 mm³ trugen, erhielten tägli
che intravenöse Injektionen von entweder 3 × 10⁷ cI96 (graue Säulen; mittleres Tumorvo
lumen bei Start der Behandlung: 30 mm³, n=7), 3 × 10⁷ CAYZ.007 (schwarze Säulen;
mittleres Tumorvolumen bei Start der Behandlung: 34 mm³, n=10), oder PBS (PBS =
phosphate buffered saline = isotonischer Kochsalzpuffer) (weiße Säulen; mittleres
Tumorvolumen bei Start der Behandlung: 28 mm³, n=7). Die Tumorgröße wurde zu den
angegebenen Zeiten bestimmt. Das durchschnittliche Tumorvolumen ist gegen die Zeit (in
Tagen) aufgetragen. Die Behandlung wurde nach 7 Tagen Injektion beendet. Werte sind
Mittelwerte SD. Die Unterschiede im Tumorvolumen, die beobachtet wurden, waren
statistisch signifikant (Student′s t Test, p <0.025).
Athymische BALB/c-Nacktmäuse, die palpierbare s.c. BSp73AS14-Xenotransplantate
(pankreatisches Karzinom der Ratte) in einer Größe von 20-50 mm³ trugen, erhielten ent
weder tägliche i.v. Injektionen von PBS (weiße Säulen; mittleres Tumorvolumen zum Be
ginn der Behandlung: 32 mm³, n=9), tägliche i.p. Injektionen von 10⁴ U humanem rIL-2
(graue Säulen; mittleres Tumorvolumen beim Beginn der Behandlung: 34 mm³, n=5) oder
tägliche i.v. Injektionen von 3 × 10⁷ CAYZ.007 in Kombination mit i.p. Injektionen von 10⁴
U humanem rIL-2 (schwarze Säulen; mittleres Tumorvolumen beim Start der Behandlung:
29 mm³, n=6). Die Tumorgröße wurde zu den angegebenen Zeiten bestimmt. Das durch
schnittliche Tumorvolumen ist gegen die Zeit (in Tagen) aufgetragen. Werte sind Mittel
werte ± SD. Die Behandlung wurde nach 7 Tagen der Injektion beendet.
Die BSp73-Variante ASpSVMeta 1-14 (BSp73AS14) und die den mAk 1.1ASML
(gamma 1/kappa) produzierende Hybridomazellinie (11) wurde in RPMI 1640 Medium
(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) kultiviert, das mit 10% fötalem Kälberserum
supplementiert war (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA). Klon 96 (cI96) ist eine
C57BL/6 (H-2b)-abgeleitete permanente zytotoxische T-Zellinie mit H-2 Kd-restringierter
Spezifität für P815 (H-2d) Mastozytomzellen (26, 27). CI96 und seine Infektanden (z. B.
CAYZ.007) wurden in DMEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA), das mit 10%
fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 100 mM Hepes, 50 mM 2-ME und 100 U/ml
Mäuse-rIL-2 versetzt war, kultiviert. X63Ag8-653-Transfektanten, die IL-2 sezernierten
(28), die retroviralen Verpackungszellinien ΩE und PA317 (29, 30), deren Transfektanden
und Infektanden und die murine Fibroblastenzellinie NH3T3 und deren Infektanden wurden
in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 100 mM Hepes und 50 mM
2-ME kultiviert. BALB/c nu/nu (H-2b)-Mäuse wurden von Charles River, Sulzfeld,
Deutschland, bezogen, in Filter-top Käfigen gehalten, und für Experimente bei einem Alter
von 8-10 Wochen verwendet.
H146-968 ist ein Hamster-IgG, das gegen das C-terminale Peptid (Aminosäuren 151-164;
Numerierung gemäß Referenz 31) der Maus ζ-Kette gerichtet ist (32). Humanes rIL-2
(1,8 × 10⁷ U/mg) wurde von Chiron GmbH, Ratingen, Deutschland bezogen.
Die vorliegende Erfindung, mit der metastasierende Tumoren zerstört werden können,
beeinhaltet die Reprogrammierung von zytotoxischen Lymphozyten. Um einer CTL-Linie
Tumorzellspezifität zu vermitteln, wurde ein einkettiger Miniantikörper an die TCR-ζ-Kette
fusioniert und ein entsprechendes Konstrukt in der CTL-Linie exprimiert. Das Fusionsprote
in behielt dabei die antigenbindende Spezifität des Antikörpers. Das System, das hier exem
plarisch verwendet wurde, enthält den monoklonalen Antikörper 1.1ASML, der ein Epitop
erkennt, das von dem varianten Exon v6 des CD44-Gens der Ratte kodiert wird (Die Se
quenz, die das Epitop enthält, ist in Abb. 1A gezeigt), und ein hochmetastatisches Rattenpankreas-Adenokarzinom,
das dieses Epitop exprimiert (11). cDNA-Fragmente, die die VH-
und Vκ-Domänen von 1.1ASML kodieren, wurden durch reverse Transkription von Hybridoma-mRNA,
gefolgt von cDNA-Amplifizierung unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion
(33) isoliert. Die amplifizierten cDNA-Sequenzen wurden in das Plasmid
pWW152 (34) inseriert, wobei die 1.1ASML VH- und Vκ-cDNAs so angeordnet sind, daß
sie sich in einem offenen Leserahmen befinden, aber durch eine Sequenz, die für ein künstli
ches Linkerpeptid von 15 Aminosäuren kodiert (GGGGS)₃, voneinander getrennt sind. Fünf
unabhängige Klone jeweils von VH- und Vκ-cDNAs wurden sequenziert. Alle VH- und alle
Vκ-Sequenzen zeigten identische Antikörperdomänen der variablen Regionen (37; Abb.
1B). Das 5′-VH-linker-Vκ-3′-Design, das hier verwendet wurde, um die Antigen-determinierende
Struktur eines einkettigen Peptides zusammenzusetzen, wurde früher schon erfolg
reich in bakterieller Expression angewendet (34, 38-40). Es zeigte sich, daß ein bakteriell
exprimierter scFv(1.1ASML) in der Tat in der Lage ist, das v6-Epitop zu erkennen. Das 3′-Ende
des scFv(1.1ASML)-Gens, das die minimale Antigenerkennungsstelle kodiert, wurde
an eine trunkierte Maus-κ-Ketten-cDNA fusioniert (31). Es zeigte sich, daß das ζ-Ketten-Protein
des T-Zell-Antigen-Rezeptorkomplexes die Signalübertragung übermitteln konnte,
wenn Antigenbindung durch das scFv-Fragment vermittelt wurde. Kodierende Sequenzen,
die am äußeren 5′-Ende des Fusionsgens lokalisiert sind, spezifizieren ein Signalpeptid der
schweren Immunglobulinketten , wodurch ein effizienter Transport des rekombinanten
Rezeptors an die Zelloberfläche gewährleistet wird. Das Fusionsprotein wird in die Plasma
membran durch die Transmembranregion der ζ-Kette integriert. Moritz und Mitarbeiter (41,
42) haben das Erfordernis eines Spacers zwischen der scFv-Domäne und der ζ-Kette
festgestellt, um die Zugänglichkeit des scFv-Fragments zu gewährleisten, wenn es auf der
T-Zelloberfläche exprimiert wird. Entsprechend wurde die cDNA für die Scharnierregion
der CD8α-Kette (35) zwischen die scFv-Domäne und die ζ-Ketten-cDNA inseriert. Das
komplette chimäre Gen wurde in das retrovirale Expressionsplasmid pLXSN (36) inseriert.
Die Expression von scFv(1.1ASML):α:ζ wird durch den Moloney Murine Leukemia Virus
(MoMuLV)-5′-LTR-Promotor transkriptionell reguliert. Eine schematische Darstellung des
Plasmids pL[scFv(1.1ASML):α:ζ] ist in Abb. 1C gezeigt.
Im einzelnen wurde wie folgt vorgegangen. Gesamt-RNA wurde aus 1.1ASML-Hybridomazellen
hergestellt. Dann wurde die Erststrang-cDNA-Synthese der variablen Domä
ne der schweren Kette (VH) und der variable Domäne der leichten kappa-Kette (Vκ) ausge
führt, wobei die Oligonukleotide 5′-AGATCCACGGCCCAGTGGATAGA-3′ (CHFOR),
spezifisch für die Ig-gamma-1-konstante Region der Maus, und 5′-GGATACAGTTGCGGCCGCATCAGC-3′
(CκFOR), spezifisch für die kappa-konstante Region der Maus, einge
setzt wurden. CDNAs der variablen Domäne wurden mit PCR amplifiziert, wobei die Pri
mer 5′-ATTATAAGCTTCAGGT G/C A/C A /IG CTGCAG G/C AGTC A/T GG-3′
(VHBACK) sowie 5′-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3′ (VH1-FOR;
33) für VH und 5′-GACATTCAGCTGACCCAG T/A CT C/G C/A A/C/T-3′ (Vκ
BACK) sowie 5′-GTTAGATCTCCA G/A C/T TT G/T GT G/C C G/C-3′ (VκFOR) für Vκ
benutzt wurden. Die Primer enthalten passende Restriktionsschnittstellen an ihren Enden,
um eine Klonierung der PCR-Produkte in den modifizierten pBluescript KS⁺-Vektor
pWW152 (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA; Modifikationen beschrieben in
der Referenz 34) zu gestatten, der einen 15-Aminosäure-Linker kodiert (GGGGS)3. Die
cDNA, die den CD44v6-spezifischen scFv(1.1.ASML) kodiert, wurde 3′ einer für ein Leader-Peptid
einer schwere Kette eines Immunglobulins kodierenden Sequenz plaziert und
anschließend an die cDNA ligiert, die für die CD8α-Scharnierregion (Aminosäuren 105-163;
Numerierung gemäß Referenz 35) kodiert, gefolgt von der ζ-Ketten-cDNA (beginnend
mit den Nukleotiden, die für Aminosäure 28 kodieren; Numerierung entsprechend Referenz
31). Das komplette Konstrukt, bezeichnet mit scFv(1.1.ASML):α:ζ, wurde in den retrovira
len Vektor pLXSN (36) subkloniert, der einen selektierbaren Marker für G418-Resistenz
enthält.
Um retrovirale Partikel aus dem retroviralen Expressionsvektor pL[scFv(1.1ASML):α:ζ]
zu produzieren, wurde das Plasmid in die amphotrope Verpackungslinie PA317 (30)
eingeführt. Infizierte Klone wurden in der Gegenwart von G418 selektioniert und die Ex
pression der chimären ζ-Kette durch Western-Blot-Analyse identifiziert. Der retrovirale
Überstand eines Klones, der einen hohen Titer produzierte, wurde benutzt, um die murine
zytotoxische T-Lymphozytenlinie cI96 (26, 27) zu infizieren. Stabile Infektanten
(bezeichnet mit CAYZ.001 bis 103) wurden in der Gegenwart von G418 selektiert. Immu
noblotanalysen von aus repräsentativen Klonen hergestellten Lysaten, bei denen der anti-ζ
mAk H146-968 benutzt wurde, ergaben Banden mit scheinbaren Molekulargewichten von
50-70 kD (Beispiel gezeigt in Abb. 2A, Spur 2), die in Lysaten, die aus der Elternzellinie
cI96 hergestellt wurden, nicht detektierbar sind (Spur 1). Die 50-kD-Bande korrespondiert
in der Größe mit dem unmodifizierten chimären Oberflächenrezeptor. Die Identität der lang
samer wandernden Banden wurde nicht untersucht. Sie könnten N-glykosylierte Produkte
repräsentieren (41). Ein N-Glykosylierungs-Konsensus-Motiv (NST) befindet sich in der
CD8α Scharnierregion. Die endogene ζ-Kette wird als eine Bande von 16 kD scheinbarem
Molekulargewicht in Lysaten sowohl von infizierten als auch von Eltern-CTLs detektiert
(Abb. 2A, Spur 1 und 2). Vergleichbare Resultate wurden mit verschiedenen infizierten Zel
linien erhalten. Klon CAYZ.007 wurde für weitere Studien verwendet. Die korrekte Mem
braninsertion von scFv(1.1ASML):α:ζ im Klon CAYZ.007 CTLs wurde durch Oberflä
chenbiotinylierung, gefolgt von Immunpräzipitation, bestätigt (Abb. 2B). Banden von 50 kD
und 70 kD scheinbarem Molekulargewicht werden nur nach Biotinylierung von infizierten
Zellen (Spur 1), nicht aber von Elternzellen (Spur 3) beobachtet.
Im einzelnen wurde wie folgt vorgegangen. Das Vektorkonstrukt pL[scFv(1.1ASML):α:ζ]SN
wurde durch Standard-Kalziumphosphat-Transfektion der helfervirusfreien
ektopischen Verpackungszellinie ΩE (29) in den korrespondierenden Retrovirus konver
tiert. Transfektanten wurden auf stabile Integration proviraler DNA in der Gegenwart des
Neomycinanalogs G418-Sulfat (G418, Geniticin, Life Technologies, Gaithersburg) MD,
USA) in einer Konzentration von 1 mg/ml selektiert. Retrovirale Überstände von Pools
stabil transfizierter Produzenten wurden mit PolybrenTM (1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecame
thylen-polymethobromid bzw. Hexadimethrinbromid, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) bei
einer Endkonzentration von 8 µg/ml supplementiert und dazu verwendet, die helfervirus
freie Verpackungszellinie PA317 (30) zu infizieren. Infizierte Klone wurden in G418-haltigem
Medium (1 mg/ml) selektiert. Retrovirale Titer von Zellkulturüberständen dieser Ver
packungszellinien (in der Größenordnung von 10⁵ CFU/ml) wurden durch Infektion von
NIH3T3-Zellen und Auszählen der G418-resistenten Klone bestimmt. Überstände dieser
Produzentenlinien wurden dazu benutzt, die murine CTL-Zellinie cI96 (26, 27) in der
Gegenwart von Polybren (8 µg/ml) zu infizieren. Infizierte CTL-Klone (CAYZ.#) wurden
durch Wachstum in Kulturmedium, das 1 mg/ml G418 enthielt, selektiert.
Die Affinität von scFv(1.1ASML):α:ζ für das CD44 Epitop der Ratte, das von Exon
v6 kodiert wird, wurde durch Inkubation von Zellysaten mit bakteriell exprimiertem
Glutathion-(S)-Tranferase (GST)-Fusionsprotein, das das v6-Epitop enthält (GST#CD44-v4-v7),
gefolgt von Präzipitation der Immunkomplexe mit Glutathion-Agarose. GST#-CD44v4-v7
wird durch Insertion von Exon v4-v7-Sequenzen von Ratten-CD44
(Nukleotidpositionen 753-1246; Numerierung gemäß Referenz 11) in die singuläre Sinal-Stelle
des bakteriellen Expressionvektors pGEX2T (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)
produziert. Western blot Analyse von GST#CD44v4-v7-Präzipitaten unter reduzierenden
Bedingungen, wobei der ζ-Ketten spezifische mAk H146-968 benutzt wurde, ergab Banden
von 50-70 kD scheinbarem Molekulargewicht (Abb. 2C, Spur 2), die in Größe dem chimä
ren Rezeptor und seinem posttranslationalen Modifikationsprodukt entsprechen. Diese Ban
den treten in Immunpräzipitationen, die mit GST (Spur 1) oder Glutathion- Agarose allein
(Spur 3) durchgeführt wurden, nicht auf. Die Affinität für bakteriell exprimiertes v6-Epitop
konnte auch mit einem ELISA demonstriert werden.
Um die Spezifität der infizierten CTLs zu untersuchen, Tumorzellen zu erkennen und
zu zerstören, die das v6-Epitop auf ihrer Oberfläche exprimieren, wurden pankreatische
Karzinomzellen der Ratte (BSp73AS14) mit CTLs gemischt und die Zellyse in einem Standard-LDH-Freisetzungstest
bestimmt (Abb. 3A). CTLs, die das chimäre scFv:α:ζ-Protein
exprimierten, lysierten effizient BSp73AS14-Zielzellen. Bei einem angemessenen E/T Ver
hältnis wurden bis zu 100% der BSP73AS14-Zellen eliminiert. Eltern-cI96-CTLs zeigten
keine zytolytische Aktivität gegenüber BSP73AS14-Zellen. Diese Spezifität der Lyse durch
retroviral infizierte CTLs wurde auch mit NIH3T3-Fibroblasten, die mit Ratten-CD44v4-v7
durch retroviralen Gentransfer transfiziert worden waren, beobachtet. N1H3T3#CD44v4-v7
Zellen exprimieren das v6-Epitop auf ihrer Zelloberfläche und werden von CAYZ.007-Infektanten
effektiv zerstört (Abb. 3A). Keine Zellyse wurde detektiert, wenn die Eltern-NH3T3-Fibroblasten
als Zielzellen für CAYZ.007-CTLs verwendet wurden, oder wenn
N1H3T3#CD44v4-v7-Zellen mit den Eltern-cI96-CTLs inkubiert wurden. Um die Spezifität
der Zielzellyse durch die infizierten CTLs weiter zu bestätigen, wurden Zytotoxizitätstests
in Gegenwart von variierenden Mengen spezifischer Kompetitoren durchgeführt. Bei einem
konstanten E/T-Verhältnis von 4 zu 1 nahm die spezifische LDH-Freisetzung von
BSP73AS14-Zellen mit der Zugabe von steigenden Mengen des mAk 1.1ASML (Abb. 3B)
oder bakteriell exprimiertem löslichem Antigen (GST#CD44v4-v7) ab. Die Zugabe entwe
der eines Kontrollantikörpers von gleichem Isotyp, aber irrelevanter Spezifität (mAk 3-9;
siehe Ref 12), oder bakteriell exprimiertem GST allein beeinflußt die LDH Freisetzung
nicht.
Der Zytotoxizitätstest wurde im einzelnen wie folgt durchgeführt. Die Zytotoxizität
von CTLs gegen verschiedene Zielzellen wurde mit einem nichtradioaktiven Zytotoxizitäts
test (CytoTox96TM, Promega, Madison, WI, USA) gemäß der Herstellervorschrift gemes
sen. Der Test basiert auf der kolorimetrischen Quantifizierung von stabilem zytosolischen
Laktat-Dehydrogenase-Enzym (LDH), das nach T-Zellyse in das Kulturmedium freigesetzt
wird. Verschiedene Mengen von Effektorlymphozyten wurden zu 10⁴ Zielzellen in 0.1 ml
Phenolrot-freiem Medium in 96-Loch-Mikrotiterplatten mit U-Boden zugegeben und 6
Stunden in einer wassergesättigten Atmosphäre bei 5% CO₂ inkubiert. Der LDH-Gehalt
wurde in 50-µl-Aliquots von zellfreiem Kulturüberstand (EXP) bestimmt. Spontane LDH-Freisetzung
von Zielzellen (TSR) und maximale LDH-Freisetzung von Zielzellen (TMR)
nach Lyse mit 0.8% Triton X-100 (100% LDH-Freisetzung) wurden bestimmt. Die spon
tane LDH-Freisetzung von jeder Effektor-CTL-Konzentration, die in dem Test verwendet
wurde, wurde ebenfalls gemessen (ECSR). Die Absorptionswerte entsprechen 3fach-Bestimmungen
und wurden um die LDH-Aktivität, die durch das Serum im Kulturmedium
beigetragen wird, korrigiert. Die korrigierten Werte wurden dazu benutzt, die spezifische
Lyse zu berechnen, wobei die folgende Gleichung verwendet wurde: % spezifische Lyse =
(EXP-ECSR-TSR) × (TMR-TSR)-1. TSR betrug 20% von TMR oder weniger.
Die reprogrammierten CTLs zerstören Zieltumorzellen nicht nur in vitro, sondern
wirken auch in vivo. Die Interferenz mit dem Tumorwachstum in vivo wurde untersucht,
indem Ratten-BSp73AS14-Tumorzellen athymischen nackten BALB/c-Mäusen subkutan
injiziert wurden, und die Tumoren bis zu einer Größe von 20-50 mm³ wachsen gelassen
wurden. Dann wurde täglich entweder PBS, parenterale cI96 CTLs oder genetisch verän
derte CTLs (über einen Zeitraum von 7 Tagen bei 3 × 10⁷ Zellen pro Tier und Tag) intra
venös injiziert. In den Kontrolltieren, die PBS-Injektionen erhielten, verdoppelte sich das
Tumorvolumen alle 2.5 Tage (Abb. 4). I.v.-Injektionen von parentalen cI96 CTLs beein
flußte das Tumorwachstum nicht (Abb. 4). Die tägliche i.v.-Injektion von CTLs, die das
scFv:α:ζ-Fusionsprotein exprimierten, verzögerte signifikant das Tumorwachstum (Abb. 4).
Am Tag 13 wurde das Experiment abgebrochen. Die durchschnittliche Größe der Tumoren
am Tag 13 in CAYZ.007-behandelten Tieren betrug nur 50% derjenigen in allen Kontroll
gruppen. Keines der Tiere entwickelte Lymphknoten oder Lungenmetastasen zu diesem
frühen Zeitpunkt der Beobachtung. Alle Behandlungen wurden von den Tieren gut toleriert,
und Gewichtsverlust oder andere Zeichen systemischer Toxizität wurden nicht beobachtet.
Die Unterschiede in der Tumorgröße an allen Tagen waren statistisch signifikant (Student′s
T Test, p <0.025).
Interleukin-2 (IL-2) ist der wichtigste Wachstumsfaktor für zytotoxische T-Lymphozyten.
CI96 und seine Infektanten überleben und proliferieren in Zellkultur nur in der Anwe
senheit von IL-2. Wir untersuchten deshalb, ob die systemische Verabreichung von IL-2 den
Antitumoreffekt von CAYZ.007 verstärken würde. Nacktmäuse, die BSP73AS14-Tumoren
mit einer Größe von 20-50 mm³ trugen, erhielten tägliche i.v.-Injektionen von 3 × 10⁷
CAYZ.007 in Kombination mit i.p.-Injektionen von 10⁴ U menschlichem rIL-2. (CAYZ.007
poliferieren in Zellkultur in der Anwesenheit von humanem rIL-2). Kontrolltiere erhielten
entweder i.v.-Injektionen von PBS oder lediglich i.p.-Injektionen von 10⁴ U humanem rIL-2.
Die Tiere wurden wieder für 7 Tage behandelt und das Tumorwachstum wurde durch
Greifzirkelmessungen verfolgt. Die Daten, die in Abb. 5 gezeigt werden, zeigen deutlich die
verstärkte Suppression des Tumorwachstums durch scFv(1.1ASML):α:ζ exprimierende
CTLs in der Anwesenheit von IL-2. Während das durchschnittliche Tumorvolumen in bei
den Kontrollgruppen in einer Woche um mehr als das 25fache zunahm, nahmen die Tumo
ren in den CAYZ.007-behandelten Tieren in der gleichen Zeit kaum um das doppelte zu.
Die systemische Verabreichung von IL-2 selbst hat keinen wachstumssuppressiven Effekt
auf BSP73AS14-Tumoren.
Bei den Tierexperimenten wurde im einzelnen wie folgt vorgegangen. Das Wachstum
von Tumoren in athymischen BALB/c-nu/nu-Mäusen wurde durch s.c. Inokulation von
Tumorzellen (5 × 10⁵ Zellen) in die mitteldorsale Region induziert. Tiere, die Tumoren in
einer Größe von 20-50 mm³ trugen, wurden verschiedenen Behandlungen, wie in den Ab
bildungslegenden 4 und 5 beschrieben, unterworfen. Die Tumorlast wurde täglich durch
Greifzirkelmessungen bestimmt. Das Tumorvolumen wurde berechnet, wobei die folgende
Gleichung verwendet wurde: Tumorvolumen = 4/3 × π × r³. Um unnötiges Leid zu ver
meiden, wurden die Tiere getötet, wenn die Tumoren 1.5 cm³ Größe erreicht hatten. Alle
Tiere wurden auf Metastasen in Lymphknoten und Lungen untersucht.
Statistische Signifikanz der Unterschiede in der Tumorgröße zwischen CAYZ.007-behandelten
Tieren und Kontrollgruppen wurde gemessen, wobei der Student′s t Test nach
logarithmischer Transformation der Rohdaten verwendet wurde.
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Claims (20)
1. Fusionsprotein, enthaltend einen ersten Anteil, der eine spezifische Affinität für
eine Aminosäuresequenz hat, die durch ein variantes Exon des CD44-Gens kodiert wird,
und einen zweiten Anteil, der die Aminosäuresequenz einer Untereinheit des T-Zell-Rezeptorkomplexes
oder eines Immunglobulinrezeptors oder eines Teils dieser Untereinheit ent
hält.
2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Anteil
wenigstens eine variable Domäne eines Antikörpers enthält, der für variantes CD44 spezi
fisch ist.
3. Fusionsprotein nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die variable Region
der leichten Kette (VL) und die variable Region der schweren Kette (VH) des Antikörpers in
diesem Fusionsprotein über eine flexible Verknüpfungsregion miteinander verknüpft sind.
4. Fusionsprotein nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikör
per human oder humanisiert ist.
5. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es
eine spezifische Affinität für eine Aminosäuresequenz hat, die vom variablen Exon v5
und/oder v6 kodiert wird.
6. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es
eine spezifische Affinität für ein Epitop in der Aminosäuresequenz KWFENEWQGKNPPT
oder QWFGNRWHEGYRQT hat.
7. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es
eine Aminosäuresequenz gemäß Abb. 1B enthält, wobei Abb. 1B Bestandteil
dieses Anspruchs ist.
8. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die
Untereinheit des T-Zell-Rezeptors die ζ-Untereinheit ist.
9. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß
der Teil der ζ-Untereinheit die zytoplasmatische Domäne und/oder die Transmembrando
mäne enthält.
10. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß
der erste und der zweite Anteil über eine Scharnierregion miteinander verknüpft sind.
11. Fusionsprotein nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Scharnierre
gion die Scharnierregion von CD8α ist.
12. Nukleinsäuremolekül, das für ein Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 1
bis 11 kodiert.
13. Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 12 enthält.
14. Wirtszelle, die ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 12 oder einen Expres
sionsvektor gemäß Anspruch 13 enthält.
15. Wirtszelle nach Anspruch 14, wobei diese Wirtszelle ein T-Lymphozyt ist, der ein
Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 exprimiert.
16. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß Anspruch 12 oder Expressions
vektors gemäß Anspruch 13 zur Behandlung von Krebs.
17. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß Anspruch 12 oder eines Ex
pressionsvektors gemäß Anspruch 13 zur Behandlung und/oder Prophylaxe metastatischer
Erkrankungen.
18. Verwendung eines T-Lymphozyten gemäß Anspruch 15 zur Behandlung von
Krebs.
19. Verwendung eines T-Lymphozyten gemäß Anspruch 15 zur Behandlung meta
statischer Erkrankungen.
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei der Erkrankung um ein Mamma-, Kolon-, Magen- oder Pankreaskarzinom
handelt.
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