CN105377886A - 识别mage-a1的高亲和力结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的高亲和力抗原识别构建体，如抗体或T细胞受体，其特异性地结合黑色素瘤相关抗原(MAGE)A1。本发明的构建体特别用于诊断、预防或治疗特征为MAGE-A1抗原的特异性表达的肿瘤疾病。还提供编码、包含或呈现本发明的抗原识别构建体的核酸、载体和宿主细胞，如CD4或CD8阳性T细胞。因此本发明提供用于免疫疗法、特别是过继性T细胞疗法的新手段，用于治疗癌症。

Description

识别MAGE-A1的高亲和力结合分子
发明领域
本发明涉及新的高亲和力抗原识别构建体，如抗体或T细胞受体，其特异性地结合黑色素瘤相关抗原(MAGE)A1。本发明的构建体特别用于诊断、预防或治疗特征为MAGE-Al抗原的特异性表达的肿瘤疾病。还提供了编码、包含或呈现本发明的抗原识别构建体的核酸、载体和宿主细胞，如CD4或CD8阳性T细胞。因此本发明提供用于免疫疗法、特别是过继性T细胞疗法的新手段，用于治疗癌症。
发明背景
尽管对诊断有癌症的患者可用的诊断和治疗选择存在显著的技术进步，但预后仍然通常不良，并且很多患者不能被治愈。免疫疗法有希望对诊断有不同肿瘤的患者提供有效、靶向的治疗，具有不损害正常组织而根除恶性肿瘤细胞的潜力。理论上免疫体系的T细胞能够识别对肿瘤细胞特异性的蛋白质模式，并且通过多种效应机理介导它们的毁灭。过继式T细胞疗法试图利用并增强患者自身T细胞的根除肿瘤的能力，并且然后将这些效应物返回患者，在这样的状态下它们有效地清除残留的肿瘤，但不损害健康组织。尽管这种方法对肿瘤免疫领域来说不是新的，但过继性T细胞疗法的临床使用中仍然很多的缺陷削弱了该方法在癌症治疗中的充分使用。
TCR为免疫球蛋白超家族的异质二聚体细胞表面蛋白，其与参与调节信号转导的CD3复合物的无变异蛋白相关联。TCR存在αβ和γδ的形式，其结构上相似但是具有完全不同的解剖学定位和可能的功能。天然异质二聚体αβTCR的胞外部分由两条多肽组成，每条多肽均具有膜近侧恒定区和膜远侧可变区。每个恒定区和可变区均包括链内二硫键。可变区含有类似于抗体的互补决定区(CDR)的高度多态环。TCR基因疗法的使用克服了许多当前的障碍。它允许使患者自身的T细胞具有预期特异性，并且在短时间内产生足够量的T细胞，避免它们耗竭。TCR将被转导入中心记忆T细胞或具有干细胞特性的T细胞，根据转移其可确保更好的持续和功能。TCR被工程化的T细胞将被注入由于化疗或放射致使淋巴细胞减少的癌症患者中，其允许有效的移植但抑制了免疫抑制。表达人MHC分子和不同人TCR库的转基因小鼠被作为工具来快速地分析肽抗原是否为免疫原性，即，它们是否被有效地加工并通过MHC分子呈现，它们是否有效地诱导免疫后的T细胞应答(Lietal.2010NatMed)。由Lietal所公布的使用ABabDII小鼠的过继性T细胞疗法的概念在图1中显示。
简单地说，ABabDII小鼠中的CD8+T细胞具有人T细胞受体(TCR)，所述受体识别通过人MHCI型分子所呈现的抗原。与人相反，ABabDII小鼠对人肿瘤相关抗原(TAA)是不耐受的。因此，当接种人TAA时，ABabDII小鼠产生针对那些外来抗原有效的适应性免疫应答，包括高亲和力的抗原特异性T细胞的扩增(图1，右边)。用合适的人TAA免疫后，可以提取编码ABabDII小鼠的高亲和力TCR的遗传信息(图1，中间)。这些TCR可随后通过逆转录病毒转导重表达于来自肿瘤患者的T细胞中。那些重新-靶向的T细胞可被转回患者中对抗肿瘤(图1，左边)。
使用人TCR转基因小鼠，因此不由小鼠基因组编码的任何人肽序列适合用于免疫，并且将产生具有最佳亲和力的TCR。最佳亲和力意味着T细胞仅限于人自身-MHC分子，并且识别作为外来物的抗原肽，例如表现出不耐受库。通过使用肽/MHC多聚体，可以分选转基因小鼠的特异性T细胞，例如通过单细胞PCR分离人TCR，优化TCR用于有效表达而避免与内源性TCR错配，并用于通过病毒载体转导患者的T细胞(Uckertetal.2008Cancerimmunolimmunother；kammertoensTetal.2009EurJImmunol)。
发现黑色素瘤抗原基因(MAGE-A)在许多不同的组织学来源的肿瘤中表达。由MAGE基因所编码的蛋白质为肿瘤排斥抗原，其能诱导具有识别并且杀死癌细胞能力的特异性细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)。因此MAGE基因和蛋白质为用于发展新药以通过免疫疗法对抗癌症的优选目标。MAGE-A蛋白质构成癌-睾丸抗原的亚家族，其主要在生殖细胞系中表达，但不限于生殖细胞系。然而它们也在多种人癌症中表达，在这里它们与恶性肿瘤相关，并可能促进恶性肿瘤。MAGE抗原在肿瘤中而不在正常周围健康组织中的这种特异性表达使得该抗原家族用于定向的过继式T细胞转移十分引人注目。然而，由于缺乏靶向MAGE抗原的特异性高效抗体或T细胞受体，迄今为止已知没有满意的免疫疗法。
鉴于上述背景技术中的较大缺陷，本发明的目的是提供具有针对MAGE-A抗原的高亲和力和特异性的新的抗原识别构建体。而且，本发明意图提供允许产生这种构建体的新方法。更广泛的说，本发明设法提供用于免疫癌症疗法的新手段。
第一方面，通过抗原识别构建体解决上述问题，所述抗原识别构建体包含与选自SEQIDNo.1-6的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。SEQIDNo1-6对应于本申请的图4中所显示的CDR3区。意外地发现，与针对MAGE抗原的本领域现有的TCR相比，本发明的实施例中所提供的TCR是高效的。在本发明的一个优选的实施方案中，抗原识别构建体包含与选自SEQIDNo.1-6的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的互补决定区3(CDR3)。
本发明的上下文中所优选的抗原识别构建体进一步包含选自TRAV5、TRAV13-1、TRAV12-3、TRBV28、TRBV29-1、TRBV13、TRBV20、TRBV12的V元件和/或选自TRAJ41、TRAJ29、TRAJ31、TRAJ49、TRAJ34、TRBJ2-7、TRBJ2-2、TRBJ2-6、TRBJ7、TRBJ1-2的V元件；优选如表1中所描述地组合。
根据本发明的抗原识别构建体对黑色素瘤相关抗原MAGE家族的抗原是特异的和/或特异性地结合黑色素瘤相关抗原MAGE家族的抗原。已知多种蛋白质属于MAGE家族的一部分，所述MAGE家族也包括一些假基因。由全部MAGE家族成员所共享的一个同源区为一段约200个氨基酸的区域，其已被命名为MAGE保守结构域。MAGE保守结构域通常位于临近C端，尽管它也可以发现于一些蛋白质的更中心的位置。MAGE保守结构域通常呈现为单拷贝，但在一些蛋白质中是重复的。通过本发明的抗原识别构建体可检测的MAGE基因选自MAGE-B1、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-A2B、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-B1、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGE-B18、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-B6B、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E1、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-HI、MAGE-L2、NDN、NDNL2。本发明的上下文所优选的为选自以下的12个同源的MAGE蛋白：MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12。最优选的为对MAGE-A1具有特异性的抗原识别构建体。
本文所使用的术语“特异性”或“抗原特异性”或对指定抗原“特异”指抗原识别构建体能特异性地结合并且免疫地识别所述抗原，优选MAGE-A1，更优选具有高亲和力。例如，如果表达TCR的T细胞与用低浓度(例如，约10-11mo1/1、10-10mo1/1、10-9mo1/1、10-8mo1/1、10-7mo1/1、10-6mo1/1、10-5mo1/1)的MAGE肽(如MAGE-A1HLA-A02限制性MAGE-Al278-286肽)脉冲的靶细胞共培养分泌至少约200pg/ml或更多(例如，250pg/ml或更多、300pg/ml或更多、400pg/ml或更多、500pg/ml或更多、600pg/ml或更多、700pg/ml或更多、1000pg/ml或更多、2,000pg/ml或更多、2,500pg/ml或更多、5,000pg/ml或更多)的干扰素γ(IFN-γ)，那么该TCR可被认为对MAGE-A1具有“抗原特异性”。可选地或另外，如果表达TCR的T细胞与用低浓度的HLA-A02限制性MAGE-A1脉冲的靶细胞共培养分泌比未转导的IFN-γ的背景水平至少两倍多的IFN-γ，那么该TCR可被认为对MAGE-Al具有“抗原特异性”。如上所述的这样的“特异性”-例如-可用ELISA分析。
本发明的优选实施方案公开了抗原识别构建体，其为抗体的形式，或其衍生物或片段，或者T细胞受体(TCR)的形式，或其衍生物或片段。本文所公开的抗体或TCR的片段或衍生物优选地仍然分别具有如原始抗体或TCR的抗原特异性(对于抗原的结合功能)。
天然α-β异质二聚体TCR具有α链和β链。每条链包含可变区、连接区和恒定区，并且β链通常还含有在可变区和连接区之间的短的多变区，但是该多变区经常被认为是连接区的一部分。每个可变区包含在骨架序列中所嵌入的三个CDR(互补决定区)，其中一个为超变区被命名CDR3。存在通过它们的骨架，CDR1和CDR2序列，以及通过部分定义的CDR3序列所区别的一些α链可变(Vα)区的类型和一些β链可变(Vβ)区的类型。Vα型在IMGT命名法中通过独特的TRAV号提及。
因此，本发明进一步的实施方案涉及包含α链可变区的ARC，其中所述α链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，它们包含与Vα-型TRAV5(根据IMGT命名法)相应的CDR1和CDR2，以及CDR3：CAESIGSNSGYALNF；Vα-型TRAV13-1的CDR1和CDR2，以及CDR3:CAARPNSGNTPLVF；或Vα-型TRAV12-3的CDR1和CDR2，以及CAMSDTGNQFYF；的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或优选100％同一性的氨基酸序列。
因此，本发明的另一实施方案涉及包含β链可变区的ARC，其中所述β链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，它们包含与Vβ-型TRBV28(根据IMGT命名法)的CDR1和CDR2，以及CDR3：CASRGLAGYEQYF；或Vβ-型TRBV29-1的CDR1和CDR2，以及CDR3：CSVEQDTNTGELFF；或Vβ-型TRBV13的CDR1和CDR2，以及CDR3：CASSFRGGGANVLTF；的各自氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或优选100％同一性的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，前述的ARC包含具有上述所提及的可变区的α链和β链，优选如下文表1中所显示的组合。
优选地，本发明的ARC包含至少一个，优选全部3个CDR序列CDR1、CDR2和CDR3。本发明的ARC可包含：
分别已知的Vα和Vβ类型的CDR1和CDR2区为根据IMGT数据库所示的：
TRAV5：CDR1:DSSSTY(SEQIDNO:40)，CDR2：IFSNMDM(SEQIDNO：41)
TRAV13-1CDR1：DSASNY(SEQIDNO:42)，CDR2：IRSNVGE(SEQIDNO：43)
TRAV12-3CDR1：NSAFQY(SEQIDNO：44)，CDR2：TYSSGN(SEQIDNO：45)
TRBV28：CDR1：MDHEN(SEQIDNO：46)，CDR2：SYDVKM(SEQIDNO：47)
TRBV29-1：CDR1：SQVTM(SEQIDNO：48)，CDR2：ANQGSEA(SEQIDNO：49)
TRBV13：CDR1：PRHDT(SEQIDNO：50)，CDR2：FYEKMQ(SEQIDNO：51)。
因此，在优选的实施方案中，本发明的ARC包含α链，其包含SEQIDNO：40、41和1；或SEQIDNO：42、43和2；或SEQIDNO：44，45和3；中所显示的CDR序列。可选地或另外，本发明的ARC包含β链，其具有SEQIDNO：46、47和4；或SEQIDNO：48、49和5；或SEQIDNO：50、51和6；中所显示的序列。
根据本发明优选为TCR或抗体，或它们分别的抗原结合片段，其具有
a.α链和β链，所述α链包含SEQIDNO：40、41和1中所显示的CDR序列，所述β链包含SEQIDNO：46、47和4中所显示的CDR序列；或
b.α链和β链，所述α链包含SEQIDNO：42、43和2中所显示的CDR序列，所述β链包含SEQIDNO：48、49和5中所显示的CDR序列；或
c.α链和β链，所述α链包含SEQIDNO：44、45和3中所显示的CDR序列，所述β链包含SEQIDNO：50、51和6中所显示的CDR序列。
在优选的实施方案中，ARC选自抗体或TCR，但是TCR是优选的。
为了本发明的目的，TCR为具有至少一个TCRα和/或TCRβ可变区的部分。通常它们包含TCRα可变区和TCRβ可变区。它们可为αβ异源二聚体或可为单链形式。为了在过继式疗法中使用，例如，αβ异质二聚体TCR可作为兼具细胞质和跨膜结构域的全长链被转染。如果需要，可存在各自的恒定结构域的残基之间引入的二硫键。
在本发明的第一个方面的一个优选实施方案中，抗原识别构建体为如上所述的TCR。TCR优选包含至少一个α和/或βTCR链，其中所述TCR链由至少一个核酸编码，所述核酸包含选自以下的核苷酸序列：(i)SEQIDNo.13-21中所包含的TCR链编码序列，或(ii)与SEQIDNo.13-21中所包含的TCR编码序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％99％或100％同一性的序列，或(iii)由于遗传密码的简并性而编码与SEQIDNo.13-21中所包含的任一项TCR编码序列相同的TCR，但具有不同序列的序列。
SEQIDNo.13-21描述了图8-16的载体图谱的核苷酸序列。这些载体的每一个均包含本发明的TCR的α和β链。在图中，β链位于α链序列的上游。如下所述，本发明示例性地描述了3种分别的TCR，其为通过鼠源化TCR链的恒定结构域的原始序列而不同程度的优化。载体标示中的缩写“hc”代表完全的人TCR的变体，“mc”代表TCR链中完全鼠源化的恒定结构域，而“mmc”描述TCR链的恒定结构域中最小鼠源化。载体图谱中(并且因此在相应的序列中)的α和β链的精确位置可从附图说明得到。
如之前所描述的可选的(i)的一个优选的实施方案中，TCR包含SEQIDNo.13-21的任一项中共同包含的α链和β链序列。
在本发明的第一方面的另一优选的实施方案中，抗原识别构建体为如上所述的TCR。TCR优选包含至少一个α和/或βTCR链，其中所述TCR链包含如SEQIDNo.22-39中所显示的任一项TCR链的氨基酸序列，或与SEQIDNo.22-39中所显示的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
scTCR可包含第一条TCR链(例如，α链)的可变区的多肽和全部(全长)第二条TCR链(例如，β链)的多肽，或反之亦然。而且，scTCR可任选地包含将两条或多条多肽连接在一起的一个或多个连接子。例如，如本文所述，连接子可为将两条单链连接在一起的肽。
也提供这样的本发明的scTCR，其融合于人细胞因子，如IL-2、IL-7或IL-15。
根据本发明的抗原识别构建体也可以以多聚体复合物的形式提供，其包含至少2个scTCR分子，其中所述scTCR分子各自融合到至少一个生物素的部分，并且其中所述scTCR通过生物素-链霉亲和素的相互作用而互相连接以允许形成所述多聚体复合物。也提供较高等级的多聚体复合物，其包含两个以上的本发明的scTCR。
在一个实施方案中，根据本发明的抗原识别构建体为抗体，或其片段。本文中使用的以其多种语法形式存在的术语“抗体”涉及免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有抗体结合部位或互补位的分子。这样的分子也被称为免疫球蛋白分子的“抗原结合片段”。本发明进一步提供了抗体，或其抗原结合部分，其特异性地结合本文所描述的抗原。抗体可为本领域已知的任何种类的免疫球蛋白，例如，抗体可为任何同种型，例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等等。抗体可为单克隆的或多克隆的。抗体可为天然存在的抗体，例如，从哺乳动物(例如，小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等等)分离和/或纯化的抗体。或者，抗体可为遗传工程化的抗体，例如，人源化抗体或嵌合抗体。抗体可为单体或多聚体的形式。
本发明也提供本文所描述的任何抗体的抗原结合部分。抗原结合部分可为具有至少一个抗原结合位点的任何部分，如Fab、F(ab')2、dsFv、sFv、双链抗体和三链抗体。单链可变区片段(sFv)抗体片段，其由包含经合成肽与抗体重链的可变区(V)连接的抗体轻链的V区的平头Fab片段组成，可使用常规DNA重组技术产生。同样地，可通过DNA重组技术制备二硫键稳定的可变区片段(dsFv)，然而，本发明的抗体片段不限于这些示例性的抗体片段的类型。另外，抗体，或其抗原结合部分可被修饰为包含可检测的标签，如，放射性同位素、荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化酶)和元素颗粒(例如，金颗粒)。
在本发明的实施方案中，抗原识别构建体结合人白细胞抗原(HLA)呈现，优选通过HLA-A02呈现，的MAGE肽。在优选的实施方案中，抗原识别构建体特异性地结合人MAGE-Al278-286表位。
在优选的实施方案中，抗原识别构建体为人TCR，或其片段或衍生物。人TCR或者其片段或衍生物为包含超过50％的对应的人TCR序列的TCR。优选地，只有小部分的TCR序列为人工来源的或来源于其他的物种。然而，已知，例如在恒定区具有鼠序列的人来源的嵌合TCR是有优势的。因此特别优选根据本发明的TCR，其在它们恒定区的胞外部分中含有鼠序列。
因此，还优选本发明的抗原识别构建体能够识别其以人白细胞抗原(HLA)依赖方式的抗原，优选以HLA-A02依赖方式的抗原。本发明的上下文中的术语“HLA依赖方式”指抗原识别构建体结合仅通过HLA呈现的抗原肽事件中的抗原。
在一个实施方案中，根据本发明的抗原识别构建体优选诱导免疫应答，优选地，其中所述免疫应答通过干扰素(IFN)γ水平的增加表征。
本发明的优选的实施方案涉及为T细胞受体的抗原识别构建体，并且在它的α链其包含与选自SEQIDNo.1-3的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3，和/或在它的β链上包含与选自SEQIDNo.4-6的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3。进一步优选的TCR，其中α链包含与SEQIDNo.1具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3，和β链包含与SEQIDNo.4具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3；或其中α链包含与SEQIDNo.2具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3，和β链包含与SEQIDNo.5具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3；或其中α链包含与SEQIDNo.3具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3，和β链包含与SEQIDNo.6具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3。优选地，CDR3区与任何图中所描述的CDJ元件结合，特别是如图4所显示的组合。
而且，优选的本发明的抗原识别构建体，其为T细胞受体，包含与SEQIDNo.22-39中所显示的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。特别优选的TCR与选自TCR1367hc、TCR1367mc、TCR1367mmc、TCR1405hc、TCR1405mc、TCR1405mmc、TCR1705hc、TCR1705mc或TCR1705mmc的TCR具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％和100％序列同一性。最优选的TCR选自TCR1367hc、TCR1367mc、TCR1367mmc、TCR1405hc、TCR1405mc、TCR1405mmc、TCR1705hc、TCR1705mc和TCR1705mmc。本发明的上述提及的TCR的氨基酸序列在SEQIDNo.22-39中描述。
根据本发明的抗原识别构建体为高亲和力TCR。
另一个方面，通过提供编码根据本发明的抗原识别构建体的核酸来解决本发明的问题。核酸优选地(a)具有编码根据本发明的抗原识别构建体的链；(b)具有与(a)中的链互补的链；或(c)具有在严格条件下与(a)或(b)中所描述的分子杂交的链。严格条件是本领域技术人员已知的，具体来自Sambrooketal,“MolecularCloning(分子克隆)”。除此之外，核酸任选地具有用于表达对应于所述蛋白的核酸序列所必需的另外的序列，特别是用于在哺乳动物/人细胞中表达。所使用的核酸可被包含在适合用于允许对应于所述肽的核酸序列在细胞中表达的载体中。然而，核酸也可被用于转化递呈细胞，其不应被限制于典型的抗原递呈细胞如树状细胞，在这样的方式下它们本身在它们的细胞表面上产生相应的蛋白质。
本文所使用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常指DNA或RNA的聚合物，其可为单链的或双链的，合成的或从天然来源获得的(例如，分离的和/或纯化的)，其可含有天然的、非天然的或改变的核苷酸，以及其可含有天然的、非天然的或改变的核苷酸间键，如氨基磷酸盐键或硫代磷酸盐键，代替未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间存在的磷酸二酯。
优选地，本发明的核酸为重组体。如本文所用的，术语“重组体”涉及(i)通过将天然的或合成的核酸片段与能在活细胞中复制的核酸分子连接而在活细胞外构建的分子，或(ii)复制上述(i)中所描述的分子得到的分子。用于本文的目的，复制可为体外复制或体内复制。核酸可包含编码任何本文所描述的TCR、多肽、或蛋白质、或其功能部分或功能变体的任何核苷酸序列。
而且，本发明提供包含如上所述的根据本发明的核酸的载体。预期的，载体为表达载体或重组表达载体。在本发明的上下文中，术语“重组表达载体”指允许在合适的宿主细胞中表达mRNA、蛋白质或多肽的核酸构建体。本发明的重组表达载体可为任何合适的重组表达载体，并且可被用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括用于增殖和扩增，或用于表达，或用于两者所设计的载体，如质粒和病毒。动物表达载体的实施例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo。优选地，重组表达载体为病毒载体，例如，逆转录病毒载体。重组表达载体包含调控序列，如转录和翻译起始和终止密码子，其对载体将被引入的宿主细胞(例如，细菌、真菌、植物或动物)的种类是特异性的，并且在所述宿主中应该能进行本发明的核酸的表达。而且，本发明的载体可包括一个或多个标记基因，其允许用于筛选转化或转染的宿主。重组表达载体可包含天然的或标准的启动子，其可操作性地连接到编码本发明的构建体的核苷酸序列，或连接到与编码本发明的构建体的核苷酸序列互补的核苷酸序列上，或连接到与编码本发明的构建体的核苷酸序列杂交的核苷酸序列上。例如，选择的启动子包括强的、弱的、可诱导的、组织特异性的和发育特异性的启动子。启动子可为非病毒启动子或病毒启动子。本发明的重组表达载体可被设计用于瞬时表达、用于稳定表达或用于两者。另外，重组表达载体可被设计用于组成型表达或用于诱导型表达。
本发明也涉及包含根据本发明的抗原识别构建体的宿主细胞。具体地，本发明的宿主细胞包含本文上述的核酸或载体。宿主细胞可为真核细胞，例如，植物、动物、真菌或藻类，或可为原核细胞，例如，细菌或原生动物。宿主细胞可为培养的细胞或原代细胞，即，直接从有机体(例如，人)分离的细胞。宿主细胞可为粘附细胞或悬浮细胞，即，悬浮着生长的细胞。用于产生重组TCR、多肽或蛋白质的目的，宿主细胞优选哺乳动物细胞。最优选地，宿主细胞为人细胞。虽然宿主细胞可为任何细胞类型，可来源于任何组织类型，并且可为任何发育阶段的细胞，但宿主细胞优选外周血白细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。更优选地，宿主细胞为T细胞。T细胞可为任何T细胞，如培养的T细胞，例如，原代T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupTl等，或从哺乳动物获得的T细胞，优选来自人患者的T细胞或T细胞前体。如果从哺乳动物获得，T细胞可从多种来源获得，包括但不限于血、骨髓、淋巴结、胸腺或其他的组织或液体。T细胞也可被富集或用于纯化。优选地，T细胞为人T细胞。更优选地，T细胞为分离自人的T细胞。T细胞可为任何T细胞的类型，并且可为任何发育阶段的T细胞，包括但不限于CD4阳性和/或CD8阳性、CD4阳性辅助T细胞，例如，Thl和Th2细胞、CD8阳性T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞(TIL)、记忆T细胞、初始T细胞等等。优选地，T细胞为CD8阳性T细胞或CD4阳性T细胞。
优选地，本发明的宿主细胞为淋巴细胞，优选T淋巴细胞，如CD4或CD8阳性T-细胞。而且，宿主细胞优选对表达MAGE-A1的肿瘤细胞特异性的肿瘤反应T细胞。
本发明的又一方面涉及本文所公开的抗原识别构建体、核酸、载体和/或宿主细胞用于在医学中使用。在一个优选的实施方案中，在医学中使用包括在诊断、预防和/或治疗增殖性疾病，如恶性或良性肿瘤疾病中使用。
因此通过本发明也提供用于治疗患有肿瘤或肿瘤疾病的个体的方法，其包括施用由本发明所公开的抗原识别构建体、核酸、载体和/或宿主细胞。优选的个体为需要这样治疗的个体。优选的实施方案中的个体为哺乳动物个体，优选患有肿瘤或肿瘤疾病的人患者。
在本发明的一个优选的方面中，肿瘤或肿瘤疾病是特征为本文上文所述的MAGE抗原的表达的疾病。最优选地，肿瘤或肿瘤疾病表达MAGE-Al抗原，甚至更优选地，其中肿瘤或肿瘤疾病经HLA呈现MAGE-Al278-286表位。进一步优选地，肿瘤或肿瘤疾病的特征为MAGE-Al抗原与健康组织的差异表达。MAGE-Al抗原可在正常的(非癌的)细胞中低程度的表达，而所述抗原在肿瘤细胞中显著更强的表达。
另外，在本发明的一个优选的方面，通过在先的药物治疗，例如，用5-氮杂-2-脱氧胞嘧啶核苷(5-aza-2-deoxycitabine)，诱导或增强MAGE-Al在肿瘤中的表达。
本发明的上下文中的术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”表示选自以下的疾病：黑色素瘤，肝细胞癌，肝内和肝外的肝小胆管癌，鳞状细胞癌，腺癌以及头，颈，肺或食道的未分化癌，结肠癌，软骨肉瘤，骨肉瘤，成神经管细胞瘤，成神经细胞瘤，头或颈的非鳞状细胞癌，卵巢肿瘤，淋巴瘤，急性和慢性淋巴细胞白血病，急性和慢性粒细胞白血病，膀胱癌，前列腺癌，胰腺癌，乳腺癌和胃癌。通过本发明的产物和/或方法优选治疗的疾病包括黑色素瘤，非小细胞肺癌，胰腺癌和肝小胆管癌。
本发明的一个优选的医学用途涉及免疫疗法，优选过继性T细胞疗法。本发明的产物和方法特别用于过继性T细胞疗法方面。例如，本发明的化合物的施用可涉及将本发明的T细胞注入所述患者。优选地，这样的T细胞为患者的自体T细胞，其在体外转导有本发明的核酸或抗原识别构建体。
又一方面，本发明公开了用于制备表达MAGE-A1特异性抗原识别构建体(ARC)的细胞系的方法，其包括：
a.提供合适的宿主细胞，
b.提供编码ARC的遗传构建体，其中所述ARC包含CDR3，其具有与选自SEQIDNo.1-6的氨基酸序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
c.将所述遗传构建体引入所述合适的宿主细胞，
d.通过所述合适的宿主细胞表达所述遗传构建体。
在一个优选的实施方案中，上述方法还包括所述ARC的细胞表面呈现的步骤。
当然，也优选本发明该方面的内容，所述ARC为根据本文如上所述的发明方面的ARC。在这方面，另外或可选择的，也优选所述ARC为哺乳动物来源的ARC，优选人来源的ARC。
用于在本发明的方法中使用的优选的合适的宿主细胞为哺乳动物，特别为人细胞，如人T-细胞。用于在本发明使用的T细胞在本文的上文中有详细描述。
在一个实施方案中，根据本发明的方法所产生的ARC为TCR。例如也包括具有另外(功能)结构域的TCR或提供有可选择的结构域的TCR，例如提供有外来跨膜结构域作为膜锚着点的TCR。例如，根据本发明所产生的TCR为α/βTCR、γ/δTCR或单链TCR(scTCR)。另外，由本发明包括的TCR形式通常为本领域已知的任何TCR，特别是本文所述的那些TCR。
预期地，用于在根据本发明的方法中使用的转染体系为逆转录病毒载体体系。这样的体系为本领域技术人员所熟知。
在一个实施方案中，本发明也包含从细胞中纯化ARC，任选地，重构T细胞中翻译的ARC-片段的额外的方法步骤。
在本发明的可选的方面中，通过用于生产T细胞受体(TCR)的方法获得或可获得T细胞，其对肿瘤细胞是特异性的并且具有本文上述的高亲和力。这样的T细胞取决于本发明的方法中所用的宿主细胞，例如人或非-人T细胞，优选人TCR。
因此也提供药物组合物，其包含任何本文所述的本发明的产物，具体为任何蛋白质，核酸或宿主细胞。在优选的实施方案中，所述药物组合物用于免疫疗法。
用于本发明的药学上可接受的载体或稀释剂的实例包括稳定剂，如SPGA、碳水化合物(例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)、蛋白质，如白蛋白或酪蛋白、含有蛋白质的制剂如牛血清或脱脂奶和缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)。
将在以下的实施例中结合附图和序列进一步描述本发明，然而，并非限于此。为了本发明的目的，本文所引用的全部参考文献通过引用的方式以其整体并入本文。在图和序列中：
附图简述
图1：显示过继性T细胞疗法的概念
图2：显示MAGE-A1和它的表位定位
图3：显示ABabDII小鼠中针对MAGE-A1的免疫应答
图4：显示TCR载体的示意图
图5：显示TCR转导的Jurkat76细胞的FACS结果
图6：显示MAGE-Al特异性T细胞的功能亲和力
图7：显示通过转导有本发明的MAGE-A1特异性TCR的T细胞的肿瘤细胞识别MAGE-Al
图8：pMP71-TCR1367hc的载体图。TCR编码序列位于SEQIDNo.13的核苷酸1041和2864之间。TCRβ链位于核苷酸1041和1970之间，α链在2037和2864之间。
图9：pMP71-TCR1367mc的载体图。TCR编码序列位于SEQIDNo.14的核苷酸1041和2834之间。TCRβ链位于核苷酸1041和1952之间，α链在2019和2834之间。
图10：pMP71-TCR1367mmc的载体图。TCR编码序列位于SEQIDNo.15的核苷酸1041和2864之间。TCRβ链位于核苷酸1041和1970之间，α链在2037和2864之间。
图11：pMP71-TCR1405hc的载体图。TCR编码序列位于SEQIDNo.16的核苷酸1041和2855之间。TCRβ链位于核苷酸1041和1967之间，α链在2034和2855之间。
图12：pMP71-TCR1405mc的载体图。TCR编码序列位于SEQIDNo.17的核苷酸1041和2825之间。TCRβ链位于核苷酸1041和1949之间，α链在2016和2825之间。
图13：pMP71-TCR1405mmc的载体图。TCR编码序列位于SEQIDNo.18的核苷酸1041和2854之间。TCRβ链位于核苷酸1041和1967之间，α链在2034和2854之间。
图14：pMP71-TCR1705hc的载体图。TCR编码序列位于SEQIDNo.19的核苷酸1041和2894之间。TCRβ链位于核苷酸1041和2006之间，α链在2073和2894之间。
图15：pMP71-TCR1705mc的载体图。TCR编码序列位于SEQIDNo.20的核苷酸1041和2864之间。TCRβ链位于核苷酸1041和1988之间，α链在2055和2864之间。
图16：pMP71-TCR1705mmc的载体图。TCR编码序列位于SEQIDNo.21的核苷酸1041和2894之间。TCRβ链位于核苷酸1041和2006之间，α链在2073和2894之间。
图17：T2细胞与浓度渐增的MAGE-A1278孵育并且与已转染有如所示的不同TCR的人T细胞共培养。12小时后，通过测定培养物中的IFNγ来评价功能应答。
图18：T2细胞负载10-5mol/1MAGE-A1278或与MAGE-A1278仅有2个氨基酸不同的在人蛋白组学上两个最相似的表位(MAGE-B16和MAGE-B5)，并且与TCR修饰的T细胞共培养。基于IFNγ的产生评价功能应答。
图19：T2细胞负载114种不同的HLA-A2限制性自体肽的其中一种(浓度10-5mol/1)，并且与来自两个不同供体的转导有TCR1367的T细胞共培养。供体1的结果用黑色圆点表示，供体2的结果通过白色圆点表示。
SEQIDNo1-6：显示本发明的TCR的α和βCDR3序列。
SEQIDNo7-10：显示健康人体的α和β链CDR3序列。
SEQIDNo11-12：显示人(11)和小鼠(12)MAGE-Al的表位序列。
SEQIDNo13-21：显示图8-16的载体核苷酸序列。
SEQIDNo22-39：显示本发明的TCR的α和β链的完整的氨基酸序列
SEQIDNo40-51：显示Vα和Vβ基因的α和βCDR1和CDR2序列
实施例
实施例1：使用ABabDII小鼠产生具有MAGE表位的T细胞
图2显示HLA-A2限制性表位MAGE-Al278-286的位置在有关全长MAGE-A1蛋白质中的定位(顶端)。人MAGE-A1278-286表位与它的小鼠同源物显著不同以放置ABabDII小鼠中人MAGE-Al278-286的耐受性(底部)。
MAGE-A1在多种人肿瘤中表达，而它在正常人组织中的表达据信限于睾丸。因此，特异性靶向表达MAGE-A1的细胞应该将毒性限于最小。
ABabDII小鼠用不完全弗氏佐剂中的包含九聚物MAGE-Al278-286加CpG的30肽免疫。用不完全弗氏佐剂中的九聚物MAGE-Al278-286加CpG进行加强。在分析的那天，取血并用MAGE-A1/HLA-A2特异性四聚体和用于某个TRBV链的抗体(IMGT命名法)染色。数次加强后，MAGE-A1特异性T细胞的单克隆群体在ABabDII小鼠的血液中是可检测的。图3显示被免疫动物的免疫应答和免疫方案。用四聚体染色观察到被免疫的细胞的FACS分析中的明显转移，其表明产生了MAGE特异性T细胞。
实施例2：T细胞受体的分离和鉴定
来自实施例1中所产生的MAGE-A1特异性T细胞克隆的cDNA通过5'-RACE扩增并测序。
表1显示来自ABabDII小鼠的三种不同的TCR和从健康人中获得的两种TCR的α和β链的互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列(Ottaviani,S.,Zhang,Y.BoonT.,&VanderBruggen,P.(2005).AMAGE-1antigenicpeptiderecognizedbyhumancytolyticTlymphocytesonHLA-A2tumorcells.CancerImmunology,Immunotherapy:CII,54(12),1214-1220.)。
表1：三种不同MAGE-A1特异性TCR的CDR3区的氨基酸序列
*人库参见：Ottavianietal.(2005).CancerImmunology,Immunotherapy,54(12),1214–1220
然后克隆包含上述CDR3序列的分离的TCR。逆转录病毒载体MP71用于转导原代人外周血淋巴细胞(hPBL)。每个TCR的α和β基因用P2A元件连接确保两条链的等摩尔表达(图4)，所述P2A元件在转导TCR的翻译期间被细胞蛋白酶切除。
全部基因为用于优化表达的优化密码子。为了在hPBL中进一步优化表达，额外的修饰被引入野生型TCR的恒定区。TCR链的恒定区的完全(A)和最小(B)鼠源化导致在hPBL中的表达水平比在未修饰的人恒定区(C)高。
然后用来源于ABabDII小鼠和人志愿者的不同TCR转导hCD8+Jurkat76细胞。被转导的细胞对于CD3染色阳性。所有被转导的细胞特异性地结合MAGE-A1/HLA-A2四聚体(图5)。
意外地，与本领域现有的TCR相比，本发明的TCR提供不同寻常的高亲和力。用不同MAGE-A1特异性TCR转导hPBL。然后将被转导的PBL与T2细胞孵育，所述T2细胞已被不同浓度的MAGE-Al278-286肽脉冲。整夜的孵育后，通过ELISA测定IFNγ的产生。
对肽脉冲的T2细胞的刺激应答中，来自ABabDII小鼠的TCR(图6，实心)显示比来源于耐受人体系的TCR(图6，空心)在较低肽浓度下应答并且产生较高的IFNγ-生成量。
通过使用本发明的TCR测试肿瘤细胞识别进一步确认该结果(图7)。被转导的hBL与不同的肿瘤细胞系孵育。整夜的孵育后，通过ELISA测定IFNγ的产生。被转导的hPBL特异性地识别HLA-A2限制性呈现范围中的MAGE-Al。当与表达MAGE-Al的肿瘤细胞系孵育时，转导有来自ABabDII小鼠的PBL(实心条)产生比转导有来自人库的TCR(阴影条)更高的IFNγ量。
实施例3：本发明的TCR的灵敏性和特异性
MAGE-A1278抗原在T2细胞中呈现。呈现抗原的T2细胞与表达本发明的TCR或对照TCR(CTL27)的T细胞共培养。如图17中所显示的，用来自ABabDII小鼠的本发明TCR修饰的T细胞(实线)与用人TCR(点划线)修饰的T细胞相比，对较少抗原量有应答(显示三个独立试验中的一个代表性的实例)。这些结果表明与本领域现有TCR相比，本发明的TCR的敏感性的意外提高(提高至少一个数量级)。
为了测试本发明的TCR对紧密相关的MAGE抗原表位的特异性，使TCR与MAGE抗原KVLEFVΑKV(MAGE-B16)和KVLEYLAKV(MAGE-B5)接触。抗原由T2细胞呈现，所述T2细胞随后与表达本发明的TCR的T细胞和对照共培养。测量干扰素-γ的释放。从图18可看到，本发明的TCR显著地识别MAGE-A1278抗原而不识别表位的变体。与对照TCR相比，特异性更好。
本发明的TCR的高特异性在测试144种人HLA-A2限制性自体抗原的实验中被确认。图19显示转染有TCR1367的供体T细胞特异性地检测MAGE-Al而不检测任何其他被试验的自体抗原，表明本发明的TCR惊人的高度特异性。
而且，将106个表达MAGE-Al的鼠纤维肉瘤细胞注入免疫缺陷小鼠并且长至约500mm3肿瘤体积的临床相对大小。为了治疗肿瘤，注射106个MAGE-Al特异性T细胞，其携带来自ABabDII小鼠的2个TCR(1367，1405)的其中之一或人TCR(CTL27)。在对照组中，注射106个携带不相干TCR的T细胞。
T细胞注射后14天基于肿瘤体积评价处理应答。结果在下面表2中提供。在用ABabDIITCR处理的组中，100％和67％动物对处理有应答。相比之下，用转导有人TCR或不相干TCR的T细胞处理的动物没有一个有应答。
表2:

Claims (15)

1.抗原识别构建体，其包含与选自SEQIDNo.1-6的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的互补决定区3(CDR3)。
2.如权利要求1所述的抗原识别构建体，其中所述构建体特异性地结合MAGE-A1抗原，优选地，其特异性地结合人MAGE-Al278-286表位。
3.如权利要求1或2所述的抗原识别构建体，其中所述抗原识别构建体为抗体，或其衍生物或片段，或者T细胞受体(TCR)，或其衍生物或片段。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗原识别构建体，其为TCR，所述TCR包含至少一条α和/或βTCR链，
a.其中所述TCR链由至少一个核酸编码，所述核酸包含选自以下的核苷酸序列：(i)SEQIDNo.13-21中所包含的TCR链编码序列，或(ii)与SEQIDNo.13-21中所包含的TCR编码序列具有至少80％同一性的序列，或(iii)由于遗传密码的简并性而编码与SEQIDNo.13-21中所包含的任一项TCR编码序列相同的TCR，但具有不同序列的序列；或
b.其中所述TCR链包含SEQIDNo.22-39中所示的任一项TCR链的氨基酸序列，或与SEQIDNo.22-39中所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述抗原识别构建体诱导免疫应答，优选地，其中所述免疫应答通过干扰素(IFN)γ水平的增加表征。
6.如权利要求3所述的T细胞受体(TCR)，或其衍生物或片段，其具有
a.α链和β链，所述α链包含SEQIDNO：40、41和1中所显示的CDR序列，所述β链包含SEQIDNO：46、47和4中所显示的CDR序列；或
b.α链和β链，所述α链包含SEQIDNO：42、43和2中所显示的CDR序列，所述β链包含SEQIDNO：48、49和5中所显示的CDR序列；或
c.α链和β链，所述α链包含SEQIDNO：44、45和3中所显示的CDR序列，所述β链包含SEQIDNO：50、51和6中所显示的CDR序列。
7.核酸，其编码权利要求1-6中任一项所述的抗原识别构建体。
8.载体，其包含权利要求7所述的核酸。
9.宿主细胞，其包含权利要求1-6中任一项所述的抗原识别构建体，或权利要求7所述的核酸，或权利要求8所述的载体。
10.如权利要求9所述的宿主细胞，其为淋巴细胞，优选为T淋巴细胞，如CD4或CD8阳性T-细胞。
11.如权利要求1-6中任一项所述的抗原识别构建体，或如权利要求7所述的核酸，或如权利要求8所述的载体，或如权利要求9或10所述的宿主细胞，用于在医学中使用。
12.如权利要求11所述的抗原识别构建体，或核酸，或载体，或宿主细胞，用于在诊断、预防和/或治疗增殖性疾病中使用，如恶性或良性肿瘤疾病，优选地，其中所述肿瘤疾病是特征为MAGE-A1抗原的差异表达的疾病。
13.如权利要求11或12所述的抗原识别构建体，或核酸，或载体，或宿主细胞，其中所述在医学中使用为在免疫疗法中使用，优选在过继性T细胞疗法中使用。
14.用于制备表达MAGE-A1特异性抗原识别构建体(ARC)的细胞系的方法，其包括
a.提供合适的宿主细胞，
b.提供编码ARC的遗传构建体，其中所述ARC包含CDR3，所述CDR3具有与选自SEQIDNo.1-6的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，或其中所述ARC为权利要求1-6中任一项所述的ARC，
c.将所述遗传构建体引入到所述合适的宿主细胞，
d.通过所述合适的宿主细胞表达所述遗传构建体。
15.如权利要求14所述的方法，其还包括从所述细胞纯化ARC，和，任选地，翻译的ARC-片段在T-细胞中的重建。
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