JP7038703B2 - Ｈｂｖ抗原特異的結合分子およびそのフラグメント - Google Patents

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Description

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原特異的結合分子、特にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲポリペプチドおよびそれらのフラグメントに関する。
宿主免疫系はＴ細胞を介して作用し、ウイルス感染を排除し、宿主の癌性増殖を抑制する。Ｂ型肝炎ウイルス感染において、特に、ＣＤ８＋ Ｔ細胞はウイルス感染を除去または制御する免疫系の重要な成分である。感染を消散する患者は、慢性的に感染した患者と比較すると定量的に強いＣＤ８＋免疫応答を有する。然るにウイルス特異的Ｔ細胞応答の欠如は、慢性ＨＢＶ感染の制御の障害と関連付けられている。骨髄移植またはウイルス特異的Ｔ細胞の養子移入のいずれかによるウイルス特異的免疫の再構築は、持続感染を抑制し、致命的感染に対して防御することができる。
外部病原体、例えばウイルスなどは、短鎖ペプチドにプロセシングされ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＨＬＡクラスＩ分子によって提示され得る。ＣＤ８＋ Ｔ細胞上で発現されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＡＰＣ上の特異的ＨＬＡクラスＩ分子によって提示されるペプチドと会合することができる。その後、ＴＣＲは、ＨＬＡ－ペプチド複合体を認識し、感染細胞を溶解するための一連の細胞における変化を開始することにより作用する。ウイルス特異的ＴＣＲを介してＴ細胞応答を操作する方策は、慢性感染症を処置するため、または長期感染によって発症するさらなる合併症に関連する死亡率を防止するための臨床的療法に結びつけることができる。特に、肝細胞がん（ＨＣＣ）細胞は、多くの場合、ＨＢＶ ＤＮＡ組込みを有しており、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞によって標的とされ得る。
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩによってコードされているＨＬＡクラスＩ分子は多型を示し、ＨＬＡ－Ａ、ＢまたはＣの異なる対立遺伝子形態は異なる個体において見出すことができる。通常、ＨＢＶ特異的エピトープを同定する試みは、西洋系集団において優勢である、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｄ、およびＦに対するＨＬＡ－Ａ２分子への偏りがある。対照的に、アジア系集団において優勢である、ＨＢＶ遺伝子型ＢおよびＣに対するＨＬＡ－ＢまたはＣ拘束性エピトープに関する情報はすべて限られていた。
この特定の適用において、本発明者らは、顕著なアジア系の対立遺伝子ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８によって拘束されるＨＢＶエンベロープタンパク質１７１～１８０に対するＴＣＲ配列を構築した。
本発明は、抗原結合分子、特にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。より詳細には、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのペプチドを認識することが可能な抗原結合分子および細胞に関する。
一態様において、本発明は、
アミノ酸配列：
ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
を有するＣＤＲ３ａを含むＴＣＲα鎖可変領域、または１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているその変異体；および、
アミノ酸配列：
ＣＤＲ３ｂ：ＳＡＶＤＲＤＥＰＦＨＳＮＱＰＱＨ（配列番号６）を有するＣＤＲ３ｂを有するＴＣＲβ鎖可変領域、または１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているその変異体
を含む、任意選択で単離された、ＴＣＲまたはそのフラグメントを提供する。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲまたはフラグメントは、
アミノ酸配列ｉ）～ｉｉｉ）：
ｉ）ＣＤＲ１ａ：ＤＸＳＳＴＹ（配列番号１）；
ｉｉ）ＣＤＲ２ａ：ＩＦＳＮＭＤＭ（配列番号２）；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
を有するＣＤＲを含むＴＣＲα鎖可変領域；および、
アミノ酸配列ｉｖ）～ｖｉ）：
ｉｖ）ＣＤＲ１ｂ：ＤＦＱＡＴＴ（配列番号４）；
ｖ）ＣＤＲ２ｂ：ＳＮＥＧＳＫＡ（配列番号５）；
ｖｉ）ＣＤＲ３ｂ：ＳＡＶＤＲＤＥＰＦＨＳＮＱＰＱＨ（配列番号６）
を有するＣＤＲを含むＴＣＲβ鎖可変領域；または、
１つもしくは複数の配列ｉ）～ｖｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているそれらの変異体
（式中、Ｘ＝ＳまたはＩである）
を含む。
別の態様において、本発明は、
アミノ酸配列ｉ）～ｉｉｉ）：
ｉ）ＣＤＲ１ａ：ＤＸＳＳＴＹ（配列番号１）；
ｉｉ）ＣＤＲ２ａ：ＩＦＳＮＭＤＭ（配列番号２）；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
を有するＣＤＲを含むＴＣＲα鎖可変領域；または、
１つもしくは複数の配列ｉ）～ｉｉｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているそれらの変異体
（式中、Ｘ＝ＳまたはＩである）
を含む、任意選択で単離された、ＴＣＲまたはそのフラグメントを提供する。
別の態様において、本発明は、
アミノ酸配列ｉｖ）～ｖｉ）：
ｉｖ）ＣＤＲ１ｂ：ＤＦＱＡＴＴ（配列番号４）；
ｖ）ＣＤＲ２ｂ：ＳＮＥＧＳＫＡ（配列番号５）；
ｖｉ）ＣＤＲ３ｂ：ＳＡＶＤＲＤＥＰＦＨＳＮＱＰＱＨ（配列番号６）
を有するＣＤＲを含むＴＣＲβ鎖可変領域；または、
１つもしくは複数の配列ｉｖ）～ｖｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているそれらの変異体
を含む、任意選択で単離された、ＴＣＲまたはそのフラグメントを提供する。
本発明の様々な態様による実施形態において、ＴＣＲまたはフラグメントは、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子によってコードされているＭＨＣクラスＩα鎖を含むＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）Ｅｎｖポリペプチドのペプチドに結合することができる。
一態様において、本発明は、α鎖可変領域およびβ鎖可変領域を含む、任意選択で単離されたＴＣＲまたはそのフラグメントであって、ＴＣＲまたはフラグメントが、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子によってコードされているＭＨＣクラスＩα鎖を含むＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるＨＢＶ Ｅｎｖポリペプチドのペプチドに結合することが可能である、ＴＣＲまたはそのフラグメントを提供する。
本発明の様々な態様による実施形態において、ＨＢＶ Ｅｎｖポリペプチドのペプチドは、ＨＢＶ Ｅｎｖポリペプチドの１７１～１８０位を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列ＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡ（配列番号１９）またはＬＬＧＰＬＬＶＬＱＡ（配列番号２０）を含むか、またはそれらからなる。
本発明の様々な態様による実施形態において、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子はＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子はＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１ではない。
別の態様において、本発明は、本発明によるＴＣＲまたはフラグメントをコードする単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、
（ａ）可変領域および定常領域を含むＴＣＲα鎖をコードする核酸配列；
（ｂ）可変領域および定常領域を含むＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列；ならびに、
（ｃ）切断可能なリンカーをコードする核酸配列
を含み；
ここで、配列（ｃ）は配列（ａ）と配列（ｂ）の間の単離された核酸内に配置されており、配列（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は同じリーディングフレーム内にある。いくつかの実施形態において、配列（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、５’から３’方向：５’－（ｂ）－（ｃ）－（ａ）－３’で提供される。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーはピコルナウイルス２Ａ（Ｐ２Ａ）リンカーである。いくつかの実施形態において、ＴＣＲα鎖の定常領域および／またはＴＣＲβ鎖の定常領域は、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖との間にジスルフィド結合を形成するための少なくとも１つの非天然システイン残基を付加的にコードする。
別の態様において、本発明は、本発明による単離された核酸を含むベクターであって、ベクターがプラスミド、バイナリーベクター、ＤＮＡベクター、ｍＲＮＡベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、トランスポゾン系ベクター、および人工染色体からなる群より選択される、ベクターを提供する。
別の態様において、本発明は、本発明による単離された核酸またはベクターによってコードされている単離されたポリペプチドを提供する。
別の態様において、本発明は、
アミノ酸配列ｉ）～ｉｉｉ）：
ｉ）ＣＤＲ１ａ：ＤＸＳＳＴＹ（配列番号１）；
ｉｉ）ＣＤＲ２ａ：ＩＦＳＮＭＤＭ（配列番号２）；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
を有するＣＤＲ；または、
１つもしくは複数の配列ｉ）～ｉｉｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸と置き換えられているそれらの変異体
（式中、Ｘ＝ＳまたはＩである）
を含む、単離されたＴＣＲα鎖可変領域ポリペプチドを提供する。
いくつかの実施形態において、単離されたＴＣＲα鎖可変領域ポリペプチドは、
アミノ酸配列ｉ）～ｉｉｉ）：
ｉ）ＣＤＲ１ａ：ＤＳＳＳＴＹ（配列番号２４）；
ｉｉ）ＣＤＲ２ａ：ＩＦＳＮＭＤＭ（配列番号２）；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
を有するＣＤＲ；または、
１つもしくは複数の配列ｉ）～ｉｉｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸と置き換えられているそれらの変異体
を含む。
いくつかの実施形態において、単離されたＴＣＲα鎖可変領域ポリペプチドは、
アミノ酸配列ｉ～ｉｉｉ）：
ｉ）ＣＤＲ１ａ：ＤＩＳＳＴＹ（配列番号２５）；
ｉｉ）ＣＤＲ２ａ：ＩＦＳＮＭＤＭ（配列番号２）；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
を有するＣＤＲ；または、
１つもしくは複数の配列ｉ）～ｉｉｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸と置き換えられているそれらの変異体
を含む。
別の態様において、本発明は、
アミノ酸配列ｉｖ）～ｖｉ）：
ｉｖ）ＣＤＲ１ｂ：ＤＦＱＡＴＴ（配列番号４）；
ｖ）ＣＤＲ２ｂ：ＳＮＥＧＳＫＡ（配列番号５）；
ｖｉ）ＣＤＲ３ｂ：ＳＡＶＤＲＤＥＰＦＨＳＮＱＰＱＨ（配列番号６）
有するＣＤＲ；または、
１つもしくは複数の配列ｉｖ）～ｖｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸と置き換えられているそれらの変異体
を含む、単離されたＴＣＲβ鎖可変領域ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本発明は、本発明によるＴＣＲまたはフラグメント、単離された核酸、ベクターまたは単離されたポリペプチドを含む、任意選択で単離された、細胞を提供する。
別の態様において、本発明は、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子によってコードされているＭＨＣクラスＩα鎖を含むＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるＨＢＶ Ｅｎｖポリペプチドのペプチドに反応性である外因性ＴＣＲを含む、任意選択で単離された、細胞を提供する。
本発明の態様による実施形態において、細胞は、以下の特性：
ａ）ＩＦＮγの発現；
ｂ）ＨＢＶに感染しているか、またはＨＢＶ Ｅｎｖペプチドもしくはポリペプチドを含むかもしくは発現する細胞に対する細胞毒性；
ｃ）ＨＢＶに感染しているか、またはＨＢＶ Ｅｎｖペプチドもしくはポリペプチドを含むかもしくは発現する細胞との接触に応答した、増殖、ＩＦＮγ発現の増加、ＩＬ－２発現の増加、ＴＮＦα発現の増加、パーフォリン発現の増加、グランザイム発現の増加、および／またはＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）発現の増加
のうちの１つまたは複数を示す。
別の態様において、本発明は、本発明による単離された核酸またはベクターを細胞に導入することを含む、ＨＢＶ反応性Ｔ細胞を産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、細胞による単離された核酸またはベクターの発現に適した条件下で、細胞を培養することをさらに含む。
関連する態様において、本発明は、本発明によるＨＢＶ反応性Ｔ細胞を産生する方法によって得られるかまたは得ることができる、任意選択で単離された、細胞を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明によるＴＣＲ、フラグメント、ポリペプチドまたは細胞と、ＨＢＶ Ｅｎｖペプチドまたはポリペプチドとを含み、任意選択でＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子によってコードされているＭＨＣクラスＩα鎖を含むＭＨＣクラスＩ分子をさらに含む、複合体、任意選択でｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明によるＴＣＲ、フラグメント、単離された核酸、ベクター、単離されたポリペプチドまたは細胞と、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、疾患または障害を処置または予防するための医薬の製造における、本発明によるＴＣＲまたはフラグメント、単離された核酸、ベクター、単離されたポリペプチド、細胞または医薬組成物の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、治療的または予防的有効量の本発明によるＴＣＲまたはフラグメント、単離された核酸、ベクター、単離されたポリペプチド、細胞または医薬組成物を対象に投与することを含む、疾患または障害を処置または予防する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、
（ａ）対象から少なくとも１つのＴ細胞を単離することと；
（ｂ）本発明による単離された核酸またはベクターを少なくとも１つのＴ細胞に導入し、それにより少なくとも１つのＴ細胞を改変することと；
（ｃ）改変された少なくとも１つのＴ細胞を対象に投与することと
を含む、対象における疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。
一態様において、本発明は、
（ａ）対象から少なくとも１つのＴ細胞を単離することと；
（ｂ）本発明によるＴＣＲ、フラグメント、核酸、ベクター、またはポリペプチドを発現するかまたは含むように少なくとも１つのＴ細胞を改変することと；
（ｃ）改変された少なくとも１つのＴ細胞を対象に投与することと
を含む、対象における疾患または障害を処置または予防する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞が単離される対象は、改変されたＴ細胞を投与された対象である。
本発明の様々な態様による実施形態において、疾患または障害は、ＨＢＶ感染によって発症もしくは悪化され、またはＨＢＶ感染が危険因子である疾患または障害である。いくつかの実施形態において、疾患は、Ｂ型肝炎、肝細胞癌腫または膵臓がんのうちの１つまたは複数である。いくつかの実施形態において、処置される対象は、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子を含むＨＬＡ－Ｃ遺伝子型を有する。いくつかの態様において、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子はＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１である。いくつかの態様において、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子はＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１ではない。いくつかの実施形態において、対象は、ＨＢＶに感染しているか、またはＨＢＶによる感染の危険性がある。いくつかの実施形態において、ＨＢＶは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩまたはＪから選択される。
一態様において、本発明は、本発明によるＴＣＲまたはフラグメント、単離された核酸、ベクター、または単離されたポリペプチドをＴ細胞に導入することを含む、改変されたＴ細胞を調製するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。特定の実施形態において、本方法は、本発明による単離された核酸またはベクターを導入することを含む。いくつかの実施形態において、本発明による単離された核酸またはベクターの導入は、形質導入を含む。いくつかの実施形態において、本発明による核酸またはベクターの導入は、エレクトロポレーションを含む。
別の態様において、本発明は、対象に対してＨＬＡ－Ｃ遺伝子型を判定することを含む、本発明によるＴＣＲまたはフラグメント、単離された核酸、ベクター、単離されたポリペプチド、細胞または医薬組成物を使用して、疾患または障害の治療的または予防的処置のために対象を識別する方法であって、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子を有すると判定された対象が治療的または予防的処置に適した対象であると同定される、方法を提供する。いくつかの態様において、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子はＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１である。いくつかの態様において、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子はＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１ではない。
別の態様において、本発明は、対象がＨＢＶに感染しているかどうかを判定すること、または対象がＨＢＶに感染する危険性があるかどうかを判定することを含む、本発明によるＴＣＲまたはフラグメント、単離された核酸、ベクター、単離されたポリペプチド、細胞または医薬組成物を使用して、疾患または障害の治療的または予防的処置のために対象を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＨＢＶは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩまたはＪから選択される。
別の態様において、本発明は、対象から得られた試料で、任意選択でｉｎ ｖｉｔｒｏで、本発明によるＴＣＲまたはフラグメント、複合体、単離された核酸、ベクター、単離されたポリペプチドまたは細胞を検出することを含む、対象におけるＨＢＶ感染を診断する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＨＢＶは、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩまたはＪから選択される。いくつかの実施形態において、対象はＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子を有する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子はＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子はＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１ではない。
別の態様において、本発明は、所定量の本発明によるＴＣＲまたはフラグメント、単離された核酸、ベクター、単離されたポリペプチド、細胞または医薬組成物を含むキットオブパーツを提供する。
説明
Ｔ細胞受容体
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、典型的にはα鎖およびβ鎖を含むヘテロ二量体の抗原結合性分子である。本質的に、α鎖およびβ鎖は、Ｔ細胞（αβＴ細胞）の細胞表面で、不変のＣＤ３鎖との複合体として発現される。γ鎖およびδ鎖を含む代替ＴＣＲは、Ｔ細胞のサブセット（γδＴ細胞）上で発現される。ＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される抗原ペプチドを認識する（結合する）。ＴＣＲ構造およびペプチド－ＭＨＣ複合体の認識は、例えば、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版 Ｊａｎｅｗａｙ ＣＡ Ｊｒ， Ｔｒａｖｅｒｓ Ｐ， Ｗａｌｐｏｒｔ Ｍら、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００１）、第３章および第６章に詳細に開示されており、これはその全体を参照により本明細書に組み入れる。
ＴＣＲα鎖およびβ鎖は、定常（Ｃ）領域および可変（Ｖ）領域を含む。α鎖およびβ鎖ポリペプチドの可変領域は、抗原－ＭＨＣ複合体に結合する。各ＴＣＲのα鎖およびβ鎖可変領域は、抗原－ＭＨＣ複合体に対する特異性を決定する、３つの相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＴＣＲのα鎖およびβ鎖のＣＤＲは、それぞれ、ＣＤＲ１－３ａおよびＣＤＲ１－３ｂと呼ばれる。したがって、本発明のいくつかの実施形態において、ＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドは、ＣＤＲ１ａ、ＣＤＲ２ａおよびＣＤＲ３ａ、ならびにＣＤＲ１ｂ、ＣＤＲ２ｂおよびＣＤＲ３ｂを言及することにより定義され得る。α鎖およびβ鎖の可変領域はまた、ＣＤＲ間にフレームワーク領域を含む。
したがって、本発明は、
アミノ酸配列ｉ）～ｉｉｉ）：
ｉ）ＣＤＲ１ａ：ＤＸＳＳＴＹ（配列番号１）；
ｉｉ）ＣＤＲ２ａ：ＩＦＳＮＭＤＭ（配列番号２）；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
を有するＣＤＲを含むＴＣＲα鎖可変領域；および、
アミノ酸配列ｉｖ）～ｖｉ）：
ｉｖ）ＣＤＲ１ｂ：ＤＦＱＡＴＴ（配列番号４）；
ｖ）ＣＤＲ２ｂ：ＳＮＥＧＳＫＡ（配列番号５）；
ｖｉ）ＣＤＲ３ｂ：ＳＡＶＤＲＤＥＰＦＨＳＮＱＰＱＨ（配列番号６）
を有するＣＤＲを含むＴＣＲβ鎖可変領域；または、
１つもしくは複数の配列ｉ）～ｖｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているそれらの変異体
（式中、Ｘ＝ＳまたはＩである）
を含む、ＴＣＲまたはフラグメントを提供する。
また、アミノ酸配列ｉ）～ｉｉｉ）：
ｉ）ＣＤＲ１ａ：ＤＳＳＳＴＹ（配列番号２４）；
ｉｉ）ＣＤＲ２ａ：ＩＦＳＮＭＤＭ（配列番号２）；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
を有するＣＤＲを含むＴＣＲα鎖可変領域；および、
アミノ酸配列ｉｖ）～ｖｉ）：
ｉｖ）ＣＤＲ１ｂ：ＤＦＱＡＴＴ（配列番号４）；
ｖ）ＣＤＲ２ｂ：ＳＮＥＧＳＫＡ（配列番号５）；
ｖｉ）ＣＤＲ３ｂ：ＳＡＶＤＲＤＥＰＦＨＳＮＱＰＱＨ（配列番号６）
を有するＣＤＲを含むＴＣＲβ鎖可変領域；または、
１つもしくは複数の配列ｉ）～ｖｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているそれらの変異体
を含む、ＴＣＲまたはフラグメントも提供される。
また、アミノ酸配列ｉ）～ｉｉｉ）：
ｉ）ＣＤＲ１ａ：ＤＩＳＳＴＹ（配列番号２５）；
ｉｉ）ＣＤＲ２ａ：ＩＦＳＮＭＤＭ（配列番号２）；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
を有するＣＤＲを含むＴＣＲα鎖可変領域；および、
アミノ酸配列ｉｖ）～ｖｉ）：
ｉｖ）ＣＤＲ１ｂ：ＤＦＱＡＴＴ（配列番号４）；
ｖ）ＣＤＲ２ｂ：ＳＮＥＧＳＫＡ（配列番号５）；
ｖｉ）ＣＤＲ３ｂ：ＳＡＶＤＲＤＥＰＦＨＳＮＱＰＱＨ（配列番号６）
を有するＣＤＲを含むＴＣＲβ鎖可変領域；または、
１つもしくは複数の配列ｉ）～ｖｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているそれらの変異体
を含む、ＴＣＲまたはフラグメントも提供される。
α鎖ポリペプチドおよびβ鎖ポリペプチドのＣＤＲ３は、抗原認識にとって最も重要なＣＤＲであると考えられる。したがって、本発明の実施形態において、ＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドは、ＣＤＲ３ａおよびＣＤＲ３ｂを言及することにより定義され得る。
したがって、本発明は、アミノ酸配列：
ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
を有するＣＤＲ３ａを含むＴＣＲα鎖可変領域、またはその１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているその変異体、および、アミノ酸配列：
ＣＤＲ３ｂ：ＳＡＶＤＲＤＥＰＦＨＳＮＱＰＱＨ（配列番号６）
を有するＣＤＲ３ｂを含むＴＣＲβ鎖可変領域、またはその１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているその変異体
を含む、任意選択で単離された、ＴＣＲまたはそのフラグメントを提供する。
本発明はまた、本明細書に記載のＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖もしくはそれらのフラグメントを単独で、または他の分子と組み合わせて使用することも意図する。例えば、本発明のＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖またはそのフラグメントは、他のＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖またはフラグメントと共に抗原結合分子、例えばＴＣＲを形成するのに有用であり得る。したがって、本発明の態様は、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖のうちの１つのＣＤＲを言及することにより定義されるＴＣＲまたはフラグメントを包含する。
したがって、本発明は、アミノ酸配列ｉ）～ｉｉｉ）：
ｉ）ＣＤＲ１ａ：ＤＸＳＳＴＹ（配列番号１）；
ｉｉ）ＣＤＲ２ａ：ＩＦＳＮＭＤＭ（配列番号２）；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
を有するＣＤＲを含むＴＣＲα鎖可変領域、または、
１つもしくは複数の配列ｉ）～ｉｉｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているそれらの変異体
（式中、Ｘ＝ＳまたはＩである）
を含む、任意選択で単離された、ＴＣＲまたはそのフラグメントを提供する。
また、アミノ酸配列ｉ）～ｉｉｉ）：
ｉ）ＣＤＲ１ａ：ＤＳＳＳＴＹ（配列番号２４）；
ｉｉ）ＣＤＲ２ａ：ＩＦＳＮＭＤＭ（配列番号２）；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
を有するＣＤＲを含むＴＣＲα鎖可変領域、または、
１つもしくは複数の配列ｉ）～ｉｉｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているそれらの変異体
を含む、任意選択で単離された、ＴＣＲまたはそのフラグメントを提供する。
また、アミノ酸配列ｉ）～ｉｉｉ）：
ｉ）ＣＤＲ１ａ：ＤＩＳＳＴＹ（配列番号２５）；
ｉｉ）ＣＤＲ２ａ：ＩＦＳＮＭＤＭ（配列番号２）；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
を有するＣＤＲを含むＴＣＲα鎖可変領域；または、
１つもしくは複数の配列ｉ）～ｉｉｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているそれらの変異体
を含む、任意選択で単離された、ＴＣＲまたはそのフラグメントを提供する。
また、アミノ酸配列ｉｖ）～ｖｉ）：
ｉｖ）ＣＤＲ１ｂ：ＤＦＱＡＴＴ（配列番号４）；
ｖ）ＣＤＲ２ｂ：ＳＮＥＧＳＫＡ（配列番号５）；
ｖｉ）ＣＤＲ３ｂ：ＳＡＶＤＲＤＥＰＦＨＳＮＱＰＱＨ（配列番号６）
を有するＣＤＲを含むＴＣＲβ鎖可変領域、または、
１つもしくは複数の配列ｉｖ）～ｖｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているそれらの変異体
を含む、任意選択で単離された、ＴＣＲまたはそのフラグメントを提供する。
同様に、本発明の態様は、単離されたＴＣＲα鎖ポリペプチドまたは単離されたＴＣＲβ鎖ポリペプチドを包含する。
したがって、本発明は、アミノ酸配列ｉ）～ｉｉｉ）：
ｉ）ＣＤＲ１ａ：ＤＸＳＳＴＹ（配列番号１）；
ｉｉ）ＣＤＲ２ａ：ＩＦＳＮＭＤＭ（配列番号２）；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
を有するＣＤＲ；または、
１つもしくは複数の配列ｉ）～ｉｉｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているそれらの変異体
（式中、Ｘ＝ＳまたはＩである）
を含む、単離されたＴＣＲα鎖可変領域ポリペプチドを提供する。
また、アミノ酸配列ｉ）～ｉｉｉ）：
ｉ）ＣＤＲ１ａ：ＤＳＳＳＴＹ（配列番号２４）；
ｉｉ）ＣＤＲ２ａ：ＩＦＳＮＭＤＭ（配列番号２）；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
を有するＣＤＲ；または、
１つもしくは複数の配列ｉ）～ｉｉｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているそれらの変異体
を含む、単離されたＴＣＲα鎖可変領域ポリペプチドを提供する。
また、アミノ酸配列ｉ）～ｉｉｉ）：
ｉ）ＣＤＲ１ａ：ＤＩＳＳＴＹ（配列番号２５）；
ｉｉ）ＣＤＲ２ａ：ＩＦＳＮＭＤＭ（配列番号２）；
ｉｉｉ）ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
を有するＣＤＲ；または、
１つもしくは複数の配列ｉ）～ｉｉｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているそれらの変異体
を含む、単離されたＴＣＲα鎖可変領域ポリペプチドも提供する。
また、アミノ酸配列ｉｖ）～ｖｉ）：
ｉｖ）ＣＤＲ１ｂ：ＤＦＱＡＴＴ（配列番号４）；
ｖ）ＣＤＲ２ｂ：ＳＮＥＧＳＫＡ（配列番号５）；
ｖｉ）ＣＤＲ３ｂ：ＳＡＶＤＲＤＥＰＦＨＳＮＱＰＱＨ（配列番号６）
を有するＣＤＲ；または、
１つもしくは複数の配列ｉｖ）～ｖｉ）内の１個もしくは２個のアミノ酸が別のアミノ酸で置き換えられているそれらの変異体
を含む、単離されたＴＣＲβ鎖可変領域ポリペプチドも提供する。
本発明によるＴＣＲ、フラグメントおよびポリペプチドは、本明細書に記載のＣＤＲの変異体ＣＤＲである１つまたは複数のＣＤＲを含み得る。変異体は、ＣＤＲ配列中に１個もしくは２個のアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態において、変異体はＣＤＲ配列中に３個または４個のアミノ酸置換を有し得る。
本明細書に記載のＣＤＲは、いくつかの異なるフレームワーク領域と併せて有用であり得る。ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列は当分野では周知であり、例えば免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を参照して同定することができるか、またはそれから検索することができる。
ペプチドおよび提示
ＴＣＲは、ＭＨＣ分子によって提示される抗原ペプチドを認識する。抗原は抗原提示細胞（ＡＰＣ）の分子機構によってペプチドにプロセシングされ、次いでそれはＭＨＣ分子と会合し、細胞表面でペプチド－ＭＨＣ複合体として提示される。異なるＴＣＲは、異なるペプチド－ＭＨＣ複合体に結合する異なる能力、したがって異なるペプチド－ＭＨＣ複合体に異なる反応性を示す。ＭＨＣ上の抗原プロセシング、ローディングおよび提示は、例えば、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｊａｎｅｗａｙ ＣＡ Ｊｒ， Ｔｒａｖｅｒｓ Ｐ， Ｗａｌｐｏｒｔ Ｍら、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００１）、第５章に詳述されており、参照によりその全体を本明細書に組み入れる。
本発明は、特にＨＢＶに反応性のＴ細胞に関する。したがって、本発明の態様において、ＴＣＲ、フラグメント、ポリペプチドおよび細胞は、ＨＢＶポリペプチド由来のペプチドを提示するＭＨＣ分子に結合することが可能である。
本明細書で使用される場合の「ＨＢＶポリペプチド」とは、ＨＢＶビリオンに由来するポリペプチド、またはＨＢＶ由来の核酸によってコードされているポリペプチドを意味する。
本明細書で使用される場合の「ＨＢＶ」とは、任意のＨＢＶを意味する。いくつかの実施形態において、ＨＢＶは、血清型ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒまたはａｙｗのＨＢＶである。いくつかの実施形態において、ＨＢＶは、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩまたはＪのＨＢＶである（例えば、Ｓｕｎｂｕｌ、Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｅｒｏｌ （２０１４） ２０（１８）：５４２７～５４３４を参照されたい）。特定の実施形態において、ＨＢＶ遺伝子型はＢまたはＣである。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」とは、ペプチド結合によって連結されている２つ以上のアミノ酸モノマーの鎖を意味する。いくつかの実施形態において、ペプチドは５０アミノ酸以下の長さであってよい。本明細書で使用される場合の「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって連結されている２つ以上のペプチドの鎖を意味する。
いくつかの実施形態において、ＨＢＶポリペプチドは、「ｅｎｖ」として公知である、ウイルスエンベロープタンパク質をコードするＨＢＶの核酸領域によってコードされているポリペプチドであってよい。本明細書において、ｅｎｖ領域によってコードされているＨＢＶポリペプチドは、「Ｅｎｖポリペプチド」と呼ばれる。
当業者は、所定のペプチドまたはポリペプチドがＨＢＶビリオンに由来するか、ＨＢＶ由来の核酸によってコードされているか、および／またはＨＢＶのｅｎｖ領域によってコードされているかどうかを、例えば、ペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列のタンパク質ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＰ）分析によって容易に決定することができる。
いくつかの実施形態において、ＨＢＶポリペプチドは、（例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Ｔａｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ （２０１４） ８８（２）：１３３２～１３４１に記載されているような）ＨＢＶ Ｅｎｖポリペプチドの表面（Ｓ）領域をコードする核酸によってコードされているポリペプチドであり得る。本明細書では、ＥｎｖポリペプチドのＳ領域をコードする核酸によってコードされているＨＢＶポリペプチドは、「Ｓポリペプチド」と呼ばれる。
いくつかの実施形態において、本発明によるＴＣＲ、フラグメント、ポリペプチドまたは細胞によって認識されるペプチドは、Ｅｎｖポリペプチドおよび／またはＳポリペプチドのペプチドである。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＨＢＶ Ｅｎｖポリペプチドの１７１～１８０位のアミノ酸を含むアミノ酸の配列を含み、Ｅｎｖの残基はＨＢＶ遺伝子型ＢのＥｎｖを基準として番号が付与されている。
いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＨＢＶ Ｅｎｖポリペプチドの１７１～１８０位を含むアミノ酸の配列、ＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡ（配列番号１９）もしくはＬＬＧＰＬＬＶＬＱＡ（配列番号２０）、またはアミノ酸配列内に１、２または３個のアミノ酸置換を有するそれらの変異体を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列の一端または両端に１、２、３、４、５個のアミノ酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列の一端または両端に１～２、１～３、１～４、または１～５個のアミノ酸をさらに含む。
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列における置換は、配列番号１９または２０の１位にはない。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列における置換は、配列番号１９または２０の１０位にはない。
いくつかの実施形態において、ペプチドは、５～１５、５～１４、５～１３、５～１２、５～１１、５～１０、５～９または５～８アミノ酸長のうちの１つである。いくつかの実施形態において、ペプチドは、５～１５、６～１５、７～１５、８～１５、９～１５、１０～１５、１１～１５または１２～１５アミノ酸長のうちの１つである。いくつかの実施形態において、ペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸長のうちの１つである。
本発明の実施形態において、ペプチドは、ＭＨＣ分子によって提示される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ分子である。
ＭＨＣクラスＩ分子は、α鎖およびβ２－ミクログロブリンのヘテロ二量体である。α鎖は、α１、α２およびα３と称される３つのドメインを有する。α１ドメインおよびα２ドメインは、一緒になって、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるペプチドが結合する溝を形成し、ペプチド－ＭＨＣ複合体を形成する。ＭＨＣクラスＩのα鎖は多型であり、異なるα鎖は異なるペプチドに結合し、提示することが可能である。ヒトにおいて、ＭＨＣクラスＩα鎖は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子によってコードされている。
本発明による実施形態において、ＴＣＲ、フラグメント、ポリペプチドまたは細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるＨＢＶポリペプチドに由来するペプチドに結合することが可能である。
いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子座にコードされているα鎖を含む。いくつかの実施形態において、α鎖は、対立遺伝子群ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８のメンバーであるＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子によってコードされている。いくつかの実施形態において、α鎖は、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１によってコードされている。いくつかの態様において、α鎖はＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１によってコードされてはいない。
本発明によるＴＣＲ、フラグメント、ポリペプチドまたは細胞は、本明細書に記載のＭＨＣクラスＩ分子によって提示される本明細書に記載のＨＢＶペプチドに結合することが可能であることは理解されよう。特定の実施形態において、本発明は、以下のうちの１つまたは複数に結合することが可能なＴＣＲ、フラグメント、ポリペプチドまたは細胞に関する：
（ｉ）ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子によってコードされているα鎖を含むＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるＨＢＶポリペプチドに由来するペプチドであって、任意選択でＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子がＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１の１つであるか、またはＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子がＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１ではない、ペプチド。
（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるＨＢＶポリペプチドに由来するペプチドであって、ＨＢＶ Ｅｎｖポリペプチドの１７１～１８０位を含むアミノ酸の配列、ＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡ（配列番号１９）もしくはＬＬＧＰＬＬＶＬＱＡ（配列番号２０）、またはそのアミノ酸配列中に１もしくは２もしくは３個のアミノ酸置換を有するそれらの変異体を含むか、またはそれらからなるペプチド。
（ｉｉｉ）ＨＢＶ Ｅｎｖポリペプチドの１７１～１８０位を含むアミノ酸の配列、ＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡ（配列番号１９）もしくはＬＬＧＰＬＬＶＬＱＡ（配列番号２０）、またはＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子によってコードされているα鎖を含むＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるそのアミノ酸配列中に１もしくは２もしくは３個のアミノ酸置換を有するそれらの変異体を含むか、またはそれらからなるペプチドであって、任意選択でＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子がＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１の１つであるか、またはＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子がＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１ではない、ペプチド。
本発明はまた、本発明によるＴＣＲ、フラグメント、ポリペプチドまたは細胞および本明細書に記載のＨＢＶペプチドを含む複合体、任意選択でｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体を提供する。いくつかの実施形態において、複合体は、本明細書に記載のＭＨＣクラスＩ分子を含む。
組換えＴＣＲ、フラグメント、ポリペプチドおよび細胞
様々な態様において、本発明は天然に存在しない生成物を提供する。そのような生成物は、組換え生成物、人工生成物、非天然生成物、または合成生成物と様々に呼ばれ得る。
一態様において、本発明は、外因性ＴＣＲ、フラグメント、ポリペプチド、核酸および細胞を提供する。本発明による外因性ＴＣＲ、フラグメント、ポリペプチド、核酸または細胞は、本明細書に記載の構造を有する。
本明細書で使用される「外因性」は、一般に、内因性ではないことを意味する。細胞に関する文脈において、本発明による外因性ＴＣＲ、フラグメント、またはポリペプチドは、例えば、細胞に外因性ＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドをコードする核酸を導入する前の、その細胞の核酸によってコードされていないＴＣＲ、フラグメント、またはポリペプチドを意味し得る。外因性核酸は、例えば、細胞に核酸を導入する前の、その細胞に存在しない核酸を意味する。
対象の文脈において、外因性ＴＣＲ、フラグメント、またはポリペプチドとは、ＴＣＲ、フラグメント、ポリペプチド、または外因性ＴＣＲ、フラグメントもしくはポリペプチドをコードする核酸を対象に導入する前に、対象に存在しないか、または対象の核酸、例えばゲノムの核酸によってコードされているＴＣＲ、フラグメント、またはポリペプチドを意味し得る。外因性核酸とは、例えば核酸を対象に導入する前に、その対象に存在しない核酸を意味する。外因性細胞とは、例えば、細胞および／または核酸を対象に導入する前に、その対象に存在しない細胞を意味する。
一態様において、本発明は、本発明によるＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドをコードする核酸を提供する。いくつかの態様において、核酸は、例えば、他の核酸または天然の生物学的材料から精製または単離される。
いくつかの実施形態において、本発明による核酸は、配列番号７～１８（図１１）のうちの１つもしくは複数、または遺伝子コードの結果として縮重しているコード配列を含んでいてもよく、あるいはそれらに対して少なくとも７０％の同一性、任意選択で７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの１つの同一性を有するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、核酸は、（ａ）可変領域および定常領域を含むＴＣＲα鎖をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、（ｂ）可変領域および定常領域を含むＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列を含む。いくつかの態様において、核酸は、（ａ）可変領域および定常領域を含むＴＣＲα鎖をコードする核酸配列、ならびに（ｂ）可変領域および定常領域を含むＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質として本発明によるＴＣＲα鎖およびβ鎖を発現させることが望ましい場合がある。これは、例えば、各鎖について同様のレベルのタンパク質発現を達成するために望ましい場合がある。したがって、いくつかの態様において、核酸は、（ｃ）リンカー配列をコードする核酸配列をさらに含む。本明細書で使用される場合の「リンカー配列」とは、発現されるペプチド配列またはポリペプチド配列を連結するためのアミノ酸の配列を意味する。本発明において、リンカー配列は、ＴＣＲα鎖およびβ鎖を連結するためのものである。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質として発現されるＴＣＲα鎖およびβ鎖を分離させることが望ましい場合がある。いくつかの実施形態において、これは、ＴＣＲα鎖とβ鎖との間の融合タンパク質の切断を提供することによって達成することができる。
したがって、いくつかの実施形態においては、リンカー配列は切断可能なリンカーであり得る。すなわち、リンカー配列は、切断可能なアミノ酸の配列を含み得る。例えば、リンカー配列は、ペプチド結合を切断することが可能な酵素のための基質、すなわち切断部位として作用することが可能な配列を含み得る。多くのそのような切断部位は、分子生物学の当業者には公知であり、使用することができる。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、自己切断部位を含み得る。自己切断部位は、酵素による処理を必要とすることなく自動的に切断される。自己切断部位の例は、「Ｇ／Ｐ」で切断されるピコルナウイルス「ＮＰＧＰ」由来の２Ａ配列である。この自己切断配列は、本明細書では、「ピコルナウイルス２Ａ（Ｐ２Ａ）」と呼ばれる。Ｐ２Ａを含むリンカー配列は、本明細書では、Ｐ２Ａリンカーと呼ばれる。
ＴＣＲα鎖およびβ鎖がリンカー配列によって連結されている単一ポリペプチドとして発現されることが望ましい場合、ＴＣＲα鎖およびβ鎖ならびにリンカーをコードする核酸配列が同一リーディングフレーム内に提供されなければならないことは理解されよう。
本発明による核酸は、核酸内の特定の方向で、配列（ａ）および配列（ｂ）と、任意選択で配列（ｃ）を含み得る。すなわち、配列は、特定の順序で提供され得る。配列（ａ）および（ｂ）、ならびに任意選択で（ｃ）の特定の５’から３’への順序は、例えば、転写、転写後のプロセシング、翻訳、翻訳後のプロセシング、折畳、会合、安定、分解、輸送、および／または核酸／発現生成物の機能特性に影響を及ぼし得る。
本発明による核酸のいくつかの実施形態において、配列（ａ）および配列（ｂ）は、５’から３’への方向：５’－（ｂ）－（ａ）－３’で提供される。いくつかの実施形態において、配列（ａ）および配列（ｂ）は、５’から３’への方向：５’－（ａ）－（ｂ）－３’で提供される。いくつかの実施形態において、配列（ａ）、配列（ｂ）および配列（ｃ）は、５’から３’への方向：５’－（ｂ）－（ｃ）－（ａ）－３’で提供される。いくつかの実施形態において、配列（ａ）、配列（ｂ）および配列（ｃ）は、５’から３’への方向：５’－（ａ）－（ｃ）－（ｂ）－３’で提供される。
いくつかの実施形態において、核酸は、発現されたＴＣＲα鎖とβ鎖との間の会合を増大および／または安定化させるための１つまたは複数の構造的特徴をコードする。いくつかの実施形態において、その特徴は、特定のアミノ酸またはアミノ酸の配列であり得る。いくつかの実施形態において、核酸は、ＴＣＲα鎖とβ鎖との間に１つまたは複数のジスルフィド結合を形成するための１つまたは複数の非天然システイン残基をコードし得る。いくつかの実施形態において、核酸は、ＴＣＲα鎖および／またはβ鎖の定常領域内の１つまたは複数の非天然システイン残基をコードし得る。
本発明の一態様は、本発明による核酸を含むベクターを提供する。
本明細書で使用される場合の「ベクター」は、外因性核酸を細胞に移入するためのビヒクルとして使用される核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。ベクターは、細胞内で核酸を発現させるための発現ベクターであり得る。そのようなベクターは、発現されるべき配列をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター配列を含んでいてもよい。ベクターはまた、終止コドンおよび発現エンハンサーを含んでいてもよい。当分野において公知である任意の適切なベクター、プロモーター、エンハンサーおよび終止コドンを使用し、本発明によるベクターからポリペプチドを発現させることができる。適切なベクターとしては、例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる、Ｍａｕｓら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１４）３２：１８９～２２５に記載されているような、プラスミド、バイナリーベクター、ＤＮＡベクター、ｍＲＮＡベクター、ウイルスベクター（例えば、ガンマレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター）、トランスポゾン系ベクター、および人工染色体（例えば、酵母人工染色体）が挙げられる。
本発明によるいくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、または単純ヘルペスウイルスベクターであってもよい。
本明細書において、用語「作動可能に連結された」は、選択された核酸配列および制御核酸配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）が、制御配列の影響または調節下でヌクレオチド配列の発現をする（それにより発現カセットを形成する）ように共有結合される状況を含み得る。したがって、制御配列が核酸配列の転写をもたらし得る場合、制御配列は選択された核酸配列に作動可能に連結されている。適切な場合、次いで、得られた転写物は所望のポリペプチドに翻訳され得る。
本発明はまた、本発明によるベクターを細胞に導入することと、細胞によるベクターの発現に適した条件下で細胞を培養することとを含む、本発明によるＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドを産生するための方法を提供する。
ポリペプチドの発現に適した任意の細胞は、本発明によるＴＣＲ、フラグメントおよびポリペプチドの産生に使用することができる。細胞は、原核生物または真核生物であってもよい。適切な原核細胞としては、大腸菌が挙げられる。真核細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。いくつかの場合において、いくつかの原核細胞は真核生物と同じ翻訳後改変が可能ではないので、細胞は原核細胞ではない。さらに、真核生物においては非常に高い発現レベルが可能であり、タンパク質は、適切なタグを使用して真核生物からより容易に精製することできる。ＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドの培地への分泌を増強する特定のプラスミドもまた利用することができる。
本発明によるＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドを産生する方法は、ＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドを発現するように改変された細胞の培養または発酵を包含し得る。培養または発酵は、栄養源、空気／酸素および／または増殖因子の適切な供給が提供されるバイオリアクター中で実施することができる。タンパク質を細胞、培地または発酵ブロスから抽出し、本発明によるＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドを単離することができる。培養、発酵および分離の技術は、当業者には周知である。
バイオリアクターは、細胞を培養することができる１つまたは複数の容器を含む。バイオリアクターでの培養は、リアクターへの反応物の連続的な流れ、およびリアクターからの培養細胞の連続的な流れによって連続的に起こり得る。あるいは、培養はバッチ内で起こり得る。バイオリアクターは、最適条件が培養される細胞に提供されるように、環境条件、例えば、容器内のｐＨ、酸素、容器内外への流速、および攪拌などを監視および調節する。
ＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドを発現する細胞を培養した後、ＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドを単離するのが好ましい。当分野において公知である細胞培養物からポリペプチドを分離するための任意の適切な方法を使用することができる。培養物からＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドを単離するために、まずＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドを含む培地から培養細胞を分離することが必要であり得る。目的のＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドが細胞から分泌される場合は、細胞は遠心分離によって分泌されたポリペプチド／タンパク質を含む培地から分離することができる。ＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドが細胞内に収集される場合、遠心分離の前に、例えば超音波処理、急速凍結融解または浸透圧溶解を使用して細胞を破砕することが必要である。遠心分離によって、培養細胞を含有するペレット、または培養細胞の細胞デブリ、ならびに培地および目的のポリペプチド／タンパク質を含有する上清が得られる。
次いで、ＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドを、他のタンパク質成分および非タンパク質成分を含み得る上清または培地から単離することが望ましい場合がある。上清または培地からポリペプチド成分を分離するための一般的な手法は、沈澱によるものである。異なる溶解度のポリペプチドは、異なる濃度の沈澱剤、例えば硫酸アンモニウムなどで沈澱する。例えば、低濃度の沈澱剤では、水溶性タンパク質が抽出される。したがって、漸増濃度の沈澱剤を添加することにより、異なる溶解度のタンパク質を区別することができる。続いて透析を使用し、分離したタンパク質から硫酸アンモニウムを除去することができる。
異なるポリペプチドを区別する他の方法が当分野において公知であり、例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズクロマトグラフィーである。これらは沈澱の代替として使用することができるか、または沈澱後に実施することができる。
ＴＣＲ、フラグメントまたはポリペプチドが培養物から単離されたら、タンパク質を濃縮することが必要な場合がある。目的のタンパク質を濃縮する多くの方法、例えば、限外濾過または凍結乾燥などが当分野において公知である。
また、本発明による核酸またはベクターを細胞に導入することを含む、細胞を産生する方法も本発明によって提供される。いくつかの実施形態において、この方法は、細胞による核酸またはベクターの発現に適した条件下で細胞を培養することをさらに含む。いくつかの態様において、この方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ法である。
いくつかの実施形態において、本発明による単離された核酸またはベクターを導入することは、形質導入、例えばレトロウイルス形質導入を含む。したがって、いくつかの実施形態において、単離された核酸もしくはベクターはウイルスベクターに含まれるか、またはベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、この方法は、例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる、Ｋｏｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ － Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１３）２、ｅ１１４に記載されているように、本発明による核酸またはベクターをエレクトロポレーションによって導入することを含む。
いくつかの実施形態において、方法は改変免疫細胞を産生するための方法であって、免疫細胞がＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、またはマクロファージであってもよく、任意選択で免疫細胞がＴ細胞である、方法である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ３＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ３＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞である。したがって、いくつかの実施形態において、この方法は、本発明による核酸またはベクターをＣＤ３＋細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、本発明による核酸またはベクターをＣＤ３＋、ＣＤ８＋細胞に導入することを含む。
本発明はまた、本発明による細胞を産生するための方法によって得られるか、または得ることができる細胞を提供する。
いくつかの実施形態において、本方法は、ＨＢＶ反応性Ｔ細胞を産生するための方法である。本明細書の実施形態において、「ＨＢＶ反応性」Ｔ細胞は、ＨＢＶに感染している細胞、またはＨＢＶペプチドを含むかもしくは発現する細胞に応答してＴ細胞の特定の機能特性を示す細胞である。いくつかの実施形態において、特性は、エフェクターＴ細胞に関連する機能特性、例えば細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＨＢＶ反応性Ｔ細胞は、以下の性質のうちの１つまたは複数を示し得る：ＨＢＶに感染している細胞、またはＨＢＶペプチドを含むかもしくは発現する細胞に対する細胞毒性；ＨＢＶに感染している細胞、またはＨＢＶペプチドを含むかもしくは発現する細胞との接触に応答した増殖、ＩＦＮγ発現の増加、ＣＤ１０７α発現の増加、ＩＬ－２発現の増加、ＴＮＦα発現の増加、パーフォリン発現の増加、グランザイム発現の増加、および／またはＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）発現の増加。
抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、両方ともその全体を参照により本明細書に組み入れる、例えば、Ｂｅｔｔｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００３ ２８１ （１－２）：６５～７８に述べられており、Ｚａｒｉｔｓｋａｙａら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ （２０１１）、９（６）：６０１～６１６で論じられているような、脱顆粒に関するフローサイトメトリーアッセイによって同定することができる。
いくつかの実施形態において、ＨＢＶに感染した細胞は、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩまたはＪのＨＢＶに感染し得る。特定の実施形態において、ＨＢＶ遺伝子型は、ＢまたはＣである。いくつかの実施形態において、細胞は、本明細書に記載のＨＢＶペプチドのいずれかの実施形態によるＨＢＶペプチドを含むか、または発現する。
いくつかの実施形態において、ＨＢＶに感染している細胞、またはＨＢＶペプチドを含むかもしくは発現する細胞は、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子によってコードされているＭＨＣクラスＩα鎖を含むＭＨＣクラスＩ分子であって、任意選択で、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が対立遺伝子群ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８のメンバーであるか、任意選択でα鎖がＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１によってコードされているか、またはα鎖がＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１によってコードされない、ＭＨＣクラスＩ分子を含み得る。いくつかの実施形態において、ＨＢＶに感染している細胞、またはＨＢＶペプチドを含むかもしくは発現する細胞は、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子をコードする核酸であって、任意選択で、ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子が対立遺伝子群ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８のメンバーであるか、任意選択でＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子がＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１であるか、またはＬＡ－Ｃ対立遺伝子がＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１ではない、核酸を含み得る。
細胞傷害性および／または発現を調査するための方法は、例えば、本明細書の実施例６に記載されているように、ＨＢＶペプチドでパルスされたＨＬＡ適合抗原提示細胞の使用を包含し得る。
本明細書で使用される場合、「細胞傷害性」とは細胞死滅を意味する。所定の標的細胞（すなわち、ＨＢＶに感染している細胞、またはＨＢＶペプチドを含むかもしくは発現する細胞）に対するＴ細胞の細胞傷害性は、例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる、Ｚａｒｉｔｓｋａｙａら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ （２０１１）、９（６）：６０１～６１６に概説された方法のいずれかを使用して調査され得る。標的細胞に対するＴ細胞の細胞毒性に関するアッセイの一例は、５１Ｃｒ放出アッセイであって、そのアッセイでは、標的細胞が、それらが内在化する５１Ｃｒで処理される。Ｔ細胞による標的細胞の溶解によって、放射性５１Ｃｒの細胞培養上清中への放出が起こり、それが検出され得る。
本明細書では、ＩＦＮγ、ＣＤ１０７ａ、ＩＬ－２、ＴＮＦα、パーフォリン、グランザイムおよび／またはＦＡＳＬの「発現」は、遺伝子発現またはタンパク質発現を意味し得る。遺伝子発現は、当業者に公知の各種手段によって、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって、またはレポーターに基づく方法によってｍＲＮＡのレベルを測定することにより測定することができる。同様に、タンパク質発現は、当分野において周知の各種方法によって、例えば、ウエスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、またはレポーターに基づく方法による抗体に基づく方法によって測定することができる。
「発現の増加」とは、ＨＢＶに感染している細胞、またはＨＢＶペプチドを含むかもしくは発現する細胞と接触していないＴ細胞による遺伝子／タンパク質の発現レベル、あるいは、ＨＢＶに感染していない細胞、または本明細書に記載のＨＢＶペプチドを含まないかもしくは発現しない細胞との接触に応答したＴ細胞による発現のレベルより高い発現レベルを意味する。いくつかの実施形態において、遺伝子またはタンパク質発現の増加は、ＨＢＶに感染している細胞、またはＨＢＶペプチドを含むかもしくは発現する細胞と接触していないＴ細胞による発現レベル、あるいは、ＨＢＶに感染していない細胞、または本明細書に記載のＨＢＶペプチドを含まないかもしくは発現しない細胞との接触に応答したＴ細胞による発現のレベルの１倍超、１．１倍超、１．２倍超、１．３倍超、１．４倍超、１．５倍超、１．６倍超、１．７倍超、１．８倍超、１．９倍超、２倍超、２．１倍超、２．２倍超、２．３倍超、２．４倍超、２．５倍超、２．６倍超、２．７倍超、２．８倍超、２．９倍超、３倍超、３．１倍超、３．２倍超、３．３倍超、３．４倍超、３．５倍超、３．６倍超、３．７倍超、３．８倍超、３．９倍超、４倍超、４．１倍超、４．２倍超、４．３倍超、４．４倍超、４．５倍超、４．６倍超、４．７倍超、４．８倍超、４．９倍超、または５倍超のうちの１つであってよい。
医学上の使用と処置および予防する方法
本発明によるＴＣＲ、フラグメント、核酸、ベクター、ポリペプチドまたは細胞は、治療的方法および予防的方法における使用が見出される。
したがって、一態様において、本発明は、疾患または障害を処置または予防する方法において使用するための本発明によるＴＣＲ、フラグメント、核酸、ベクター、ポリペプチド、細胞または医薬組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、疾患または障害を処置または予防するための医薬の製造における本発明によるＴＣＲ、フラグメント、核酸、ベクター、ポリペプチド、細胞または医薬組成物の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、治療上有効な量または予防上有効な量の本発明によるＴＣＲ、フラグメント、核酸、ベクター、ポリペプチド、細胞または医薬組成物を対象に投与することを含む、疾患または障害を処置または予防する方法を提供する。
特に、本発明によるＴＣＲ、フラグメント、核酸、ベクター、ポリペプチド、細胞または医薬組成物は、ＨＢＶ感染によって発症もしくは悪化する疾患、またはＨＢＶ感染が危険因子である疾患または障害を予防または処置するための使用が見出される。
ＨＢＶ感染によって発症／悪化する疾患および障害は、Ｌｉａｎｇ， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ （２００９）， ４９（補遺５）：Ｓ１３～Ｓ２１に記載されており、急性肝炎（劇症肝不全を含む）、慢性肝炎、肝硬変、肝臓がん、例えば肝細胞がん（ＨＣＣ）、または膵臓がんが挙げられる。ＨＢＶ感染が危険因子である疾患および障害としては、壊死性血管炎および腎症、例えば膜性糸球体腎炎（ＭＧＮ）が挙げられる。
本発明によるＴＣＲ、フラグメント、核酸、ベクター、ポリペプチドまたは細胞の投与は、好ましくは、対象に有益性を示すのに十分である、「治療上有効」または「予防上有効」な量である。実際の投与量、ならびに投与の速度および時間経過は、疾患または障害の性質および重篤度に依存する。処置の処方、例えば、投与量の決定などは、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、処置されるべき疾患／障害、個別の対象の状態、送達の部位、投与方法、および開業医に知られている他の要因を考慮する。上述の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、２０００、ｐｕｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓで確認することができる。
本発明の実施形態において、処置または予防の方法は、Ｔ細胞の養子移入を含み得る。Ｔ細胞養子移入は、一般に、Ｔ細胞が対象から得られるプロセス、典型的にはＴ細胞が単離される血液サンプルを採取することによって得られるプロセスを意味する。Ｔ細胞は、次いで典型的には、何らかの方法で、同じ対象もしくは異なる対象のいずれかに対して処置または改変される。処置は、典型的には、ある特定の所望する特徴を有するＴ細胞集団を対象に提供すること、またはその対象においてそのような特徴を有するＴ細胞の頻度を増加させることを目的とする。ウイルス特異的Ｔ細胞の養子移入は、例えば、Ｃｏｂｂｏｌｄら、（２００５） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２０２：３７９～３８６、およびＲｏｏｎｅｙら、（１９９８）、Ｂｌｏｏｄ ９２：１５４９～１５５５に記載されており、これらはその全体を参照により本明細書に組み入れる。
本発明において、養子移入は、対象にＨＢＶ反応性Ｔ細胞、特にＨＢＶ反応性ＣＤ８＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞を導入するか、またはその頻度を高めることを目的として実施される。
したがって、一態様において、本発明は、
（ａ）対象から少なくとも１つのＴ細胞を単離することと；
（ｂ）本発明によるＴＣＲ、フラグメント、核酸、ベクター、またはポリペプチドを発現するまたは含むように少なくとも１つのＴ細胞を改変することと；
（ｃ）改変された少なくとも１つのＴ細胞を対象に投与することと
を含む、対象における疾患または障害を処置または予防する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞が単離される対象は、改変されたＴ細胞が投与された対象である。
本発明によって改変された少なくとも１つのＴ細胞は、当業者に周知の方法に従って改変することができる。改変は、導入された核酸の永久的発現または一過性発現のための核酸導入を含み得る。
任意の適切な遺伝子工学プラットフォームを使用して、本発明によるＴ細胞を改変することができる。Ｔ細胞を改変するための適切な方法としては、例えば、参照により本明細書に組み入れる、Ｍａｕｓら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ （２０１４） ３２：１８９～２２５に述べられていたように、遺伝子工学プラットフォームの使用、例えば、ガンマレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＤＮＡトランスフェクション、トランスポゾンに基づく遺伝子送達、およびＲＮＡトランスフェクションなどが挙げられる。
いくつかの実施形態において、本方法は、以下のステップ：対象から血液試料を採取するステップ；血液試料から少なくとも１つのＴ細胞を単離するステップ；ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ細胞培養において少なくとも１つのＴ細胞を培養するステップ；少なくとも１つのＴ細胞に、本発明によるＴＣＲ、フラグメント、核酸、ベクター、またはポリペプチドを導入し、それによって少なくとも１つのＴ細胞を改変するステップ；少なくとも１つのＴ細胞を回収するステップ；改変されたＴ細胞をアジュバント、希釈剤、または担体と混合するステップ；改変Ｔ細胞を対象に投与するステップのうちの１つまたは複数を含み得る。
当業者は、例えば、その全体を参照により組み入れる、Ｑａｓｉｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ （２０１５） ６２：４８６～４９１を参照することによって、本発明によるＨＢＶ反応性Ｔ細胞を養子移入するための適切な試薬および手順を決定することができる。
関連する態様において、本発明は、本発明によるＴＣＲ、フラグメント、核酸、ベクター、またはポリペプチドをＴ細胞に導入し、それによって少なくとも１つのＴ細胞を改変することを含む、改変されたＴ細胞を調製する方法を提供する。本方法は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで実施される。
一態様において、本発明は、
（ａ）対象から少なくとも１つのＴ細胞を単離することと；
（ｂ）本発明による単離された核酸またはベクターを少なくとも１つのＴ細胞に導入し、それによって少なくとも１つのＴ細胞を改変することと；
（ｃ）改変された少なくとも１つのＴ細胞を対象に投与することと
を含む、対象における疾患または障害を処置または予防する方法を提供する。
本発明による実施形態において、対象は、好ましくはヒト被験者である。いくつかの実施形態において、本明細書の本発明の治療的または予防的方法によって処置される対象は、ＨＬＡ遺伝子型に基づいて選択される。いくつかの実施形態において、対象は、ＭＨＣクラスＩ分子の文脈で本明細書に記載のＨＢＶペプチドを提示することが可能なＭＨＣクラスＩα鎖をコードするＨＬＡ対立遺伝子を有する。いくつかの実施形態において、対象は、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子を含むＨＬＡ－Ｃ遺伝子型を有する。いくつかの態様において、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子はＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子はＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１ではない。いくつかの実施形態において、対象はアジア民族である。いくつかの実施形態では、患者は東南アジア民族である。
本発明による実施形態において、対象は、ＨＢＶ感染によって発症もしくは悪化する疾患もしくは障害、またはＨＢＶ感染がそのような疾患／障害、例えばＨＢＶ感染の特定のマーカーの特徴付けに基づいた危険因子である疾患もしくは障害の処置のために選択され得る。対象は、処置を必要とする疾患もしくは障害と診断されたか、またはそのような疾患もしくは障害を有することが疑われる可能性がある。
本発明による実施形態において、対象は、ＨＢＶ感染によって発症もしくは悪化する疾患もしくは障害、またはＨＢＶ感染がＨＢＶ感染症の特定の危険因子に関するその特徴付けに基づく危険因子である疾患もしくは障害を予防するための本明細書における予防方法について選択され得る。
本発明の様々な態様による実施形態において、本発明による疾患または障害を処置または予防することには併用療法が含まれ得る。そのような実施形態において、本発明によるＴＣＲ、フラグメント、核酸、ベクター、ポリペプチド、細胞または医薬組成物は、さらなる介入を含む過程の一部として投与することができる。
いくつかの実施形態において、本方法は、ＨＢＶ感染、またはＨＢＶ感染症によって発症もしくは悪化する疾患もしくは障害の予防または処置のための、－例えば、適切な薬剤の投与による－介入を含み得る。予防的介入は、例えば、Ｗｅｅｋｌｙ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｃｏｒｄ ４０（８４）： ４０５～４２０ （２００９）に記載されているＢ型肝炎ワクチンを用いるワクチン接種を含み得る。適切な治療薬としては、Ｂ型慢性肝炎感染者の予防、ケアおよび治療のためのＷＨＯガイドライン、２０１５年３月、ＩＳＢＮ ９７８９２４１５４９０５９、ならびにＡｌｂｅｒｔｉおよびＣａｐｏｒａｓｏ、Ｄｉｇ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ、２０１１ ４３ 補遺１：Ｓ５７～６３（これらは両方ともその全体を参照により本明細書に組み入れる）に記載されているような薬剤が挙げられる。特に、本発明は、抗ウイルス剤、例えば、ラミブジン（Ｅｐｉｖｉｒ）、アデフォビル（Ｈｅｐｓｅｒａ）、テノホビル（Ｖｉｒｅａｄ）、テルビブジン（Ｔｙｚｅｋａ）およびエンテカビル（Ｂａrａｃｌｕｄｅ）、およびそれらの併用、ならびにまたインターフェロンアルファ－２ａおよびＰＥＧ化インターフェロンアルファ－２ａの使用を考慮する。
いくつかの実施形態において、本方法は、がん、例えば肝臓がん、例えば肝細胞がんを処置または予防するための治療的または予防的介入を含む。
患者の選択
本発明はまた、本発明による治療的または予防的処置のための対象を同定する方法を提供する。
一態様において、治療的または予防的処置のための対象を同定する方法は、対象についてのＨＬＡ型を決定することを包含する。特定の実施形態において、本方法は、対象についてＨＬＡ－Ｃ遺伝子型を決定することを含む。
ＨＬＡタイピングは、当業者に周知の様々な方法によって、例えば、１つまたは複数のＨＬＡ遺伝子を型別に配列決定すること、およびＤＮＡ配列を公知のＨＬＡ対立遺伝子に関する配列と比較することにより実施することができる。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子を有すると決定された対象は、本発明による治療的または予防的処置に適した対象であると同定される。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子はＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１である。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子はＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１ではない。
一態様において、治療的または予防的処置のための対象を同定する方法は、対象がＨＢＶ、例えばＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩまたはＪに感染しているか、またはＨＢＶに感染する危険があるかどうかを決定することを含む。特定の実施形態において、ＨＢＶ遺伝子型はＢまたはＣである。
ＨＢＶ感染は、例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる、Ａｓｐｉｎａｌｌら、Ｏｃｃｕｐ Ｍｅｄ（Ｌｏｎｄ）（２０１１）６１（８）：５３１～５４０に概説されている、当業者に周知の様々な方法によって決定することができる。ＨＢＶ感染の診断においてしばしば使用される診断試験は、血液中の１つまたは複数のＢ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎表面抗体、およびＢ型肝炎コア抗体の存在に関する試験を包含する。他の方法は、臨床試料中のＨＢＶ ＤＮＡの存在に関する試験を包含する。
診断方法
さらなる態様において、本発明は、本発明によるＴＣＲ、フラグメント、ポリペプチド、核酸、ベクター、複合体または細胞の存在を検出することを含む、対象におけるＨＢＶ感染を診断する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、検出は試料、例えば、血液または組織の試料においてである。いくつかの実施形態において、試料は、一定量の血液；フィブリン塊および血球を除去した後に得られる血液の液体部分を含み得る対象血液由来の一定量の血清；組織試料もしくは生検；または対象から単離された細胞を含み得るか、またはそれらに由来するものであり得る。
いくつかの実施形態において、試料は対象から得られた。いくつかの実施形態において、この方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
いくつかの実施形態において、本方法は、対象から試料を採取するステップと、その試料を分析して本発明によるＴＣＲ、フラグメント、ポリペプチド、核酸、ベクター、複合体または細胞の存在を検出するステップとを含む。
特定の実施形態において、本方法は、ヒトまたは動物の身体では実施されない。
組成物
本発明はまた、本発明によるＴＣＲ、フラグメント、核酸、ベクター、ポリペプチドまたは細胞を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本組成物は医薬組成物である。いくつかの実施形態において、本組成物は、研究、治療、予防および／または診断における使用に適した組成物である。
いくつかの実施形態において、本発明によるＴＣＲ、フラグメント、核酸、ベクター、ポリペプチドまたは細胞は、好ましくは、限定するものではないが、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝剤、保存剤、抗酸化剤、滑沢剤、安定剤、可溶化剤、界面活性剤（例えば湿潤剤）、マスキング剤、着色剤、香味剤、および甘味剤を含む、当業者に周知の１つまたは複数の他の薬学的に許容される成分と共に、医薬または薬剤として製剤化される。本明細書で使用される場合の「薬学的に許容される」という用語は、適切な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なく、適切な有益性／危険性比に見合った、当該の対象（例えばヒト）の組織との接触において使用するのに適した化合物、成分、材料、組成物、剤形などに関する。それぞれの担体、アジュバント、賦形剤などはまた、製剤の他の成分と適合性であるという意味において「許容される」はずである。適切な担体、アジュバント、賦形剤などは、標準的な製薬のテキスト、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．、１９９０；および、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第２版、１９９４で確認することができる。
製剤は、薬学の分野において周知の任意の方法によって調製することができる。そのような方法は、活性化合物を１つまたは複数の副成分を構成する担体と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、活性化合物を均一かつ密接に担体（例えば、液体担体、微細化固体担体など）と会合させ、次いで必要に応じて、生成物を成形することによって調製される。
製剤は、複数の経路による投与用に調製することができる。医薬および組成物は、液体または固体（粉末を含む）の剤形で製剤化することができる。投与経路は、局所投与、非経口投与、全身投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、髄腔内投与、眼内投与、皮下投与、経口投与、または経皮投与であってよい。いくつかの実施形態において、投与は注射を含み得る。注射用製剤は、選択した薬剤を滅菌媒体または等張性媒体中に含むことができる。
本発明の一態様では、キットオブパーツが提供される。キットオブパーツは、本発明による所定量のＴＣＲ、フラグメント、核酸、ベクター、ポリペプチド、細胞または医薬組成物を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の方法においてＴＣＲ、フラグメント、核酸、ベクター、ポリペプチド、細胞または医薬組成物を使用するための説明書を含んでいてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、本キットは、ＨＢＶ感染によって発症もしくは悪化する疾患もしくは障害、またはＨＢＶ感染が危険因子である疾患もしくは障害を処置または予防するために、ＴＣＲ、フラグメント、核酸、ベクター、ポリペプチド、細胞もしくは医薬組成物を患者に投与するための説明書を含んでいてもよい。
本発明は、そのような組み合わせが明白に許容されないか、または明らかに回避される場合を除き、記載されている態様および好ましい特徴の組み合わせを包含する。
本明細書で使用されている項目の見出しは系統立てる目的のためだけであり、記載されている主題を限定するように解釈されるものではない。
本発明の態様および実施形態を、ここで添付の図面を参照しながら例として説明する。さらなる態様および実施形態は、当業者には明白であろう。本明細書で言及されているすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書全体を通して、以下の特許請求の範囲を含めて、文脈上他の解釈を要する場合を除き、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形体は、記載した整数もしくはステップ、または整数もしくはステップの群の包含を意味するが、いかなる他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の除外を意味するものでないと理解されよう。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されている場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他の解釈を要する場合を除き、複数の指示の語を包含することに留意されたい。範囲は、本明細書では、「約」のある特定の値から、および／または「約」の別の特定の値までとして表現され得る。そのような範囲が表現される場合、他の実施形態は、ある特定の値から、および／または他の特定の値までを包含する。同様に、値が近似値として表現される場合は、先行詞「約」を使用することにより、特定の値が別の実施形態を形成することは理解されよう。
本発明の原理を説明する実施形態および実施例を、ここで、添付の図面を参照しながら説明する。
ＨＢＶペプチドによる刺激への応答におけるＴ細胞によるＩＦＮγ産生に関するＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果を示す写真である。 ＨＢＶ遺伝子型ＢおよびＣのＨＢＶペプチドＥ３４、Ｅ３５およびＥ３６の概略図である。 未刺激の対照と比較した、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖後のＥ３５刺激Ｔ細胞によるＣＤ８＋およびＣＤ１０７ａ＋の発現を示すグラフである。 未刺激の対照と比較した、再刺激後のＴ細胞によるＣＤ８＋、ＣＤ１０７ａ＋およびＩＦＮγの発現を示すグラフである。 未刺激の対照と比較した、異なるＨＢＶ Ｅｎｖペプチドによる刺激後のＴ細胞によるＣＤ１０７ａ＋およびＩＦＮγの発現を示すグラフである。 ＨＢＶペプチドおよびＴ細胞応答をまとめた表であり、ＨＢＶペプチド配列およびＨＢＶ Ｅｎｖ内の位置を示す表である。 ＨＢＶペプチドおよびＴ細胞応答をまとめた表であり、示したペプチドで刺激した後のリンパ球の総数に対する百分率としてのＣＤ８＋およびＣＤ１０７ａ＋、ならびにＣＤ８＋およびＩＦＮγ＋リンパ球の百分率を示す表である。 異なる濃度の異なるＨＢＶペプチドで刺激したＴ細胞によるＩＦＮγ産生を示すグラフである。 ＨＬＡ型に対するドナーの分析を示す表およびグラフである。 Ｔ細胞からのｃＤＮＡの調製の概略図である。 細菌の形質転換および配列分析に関するＳＭＡＲＴｅｒ ｃＤＮＡのＴＯＰＯクローニングの概略図である。 ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列および核酸配列を示す図である。配列分析およびその後のコドン最適化によって決定された核酸配列を示す。 ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖ＭＰ７１レトロウイルスベクター構築物の概略図である。 レトロウイルス調製およびＴ細胞の形質導入の概略図である。 形質導入されていない対照と比較した、ＴＣＲα構築物およびＴＣＲβ構築物を形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞によるＶｂ発現およびＥ３４五量体結合を示すグラフである。 ペプチドパルスしたＥＢＶＢ細胞とインキュベーションした後の、形質導入されていない対照と比較した、ＴＣＲα構築物およびＴＣＲβ構築物で形質導入されたＣＤ８ ＋Ｔ細胞によるＣＤ１０７ａおよびＩＦＮγの発現を示すグラフである。 Ｖα－Ｐ２Ａ－Ｖβの概略図とＶβ－Ｐ２Ａ－Ｖα構築物の概略図である。 Ｖα－Ｐ２Ａ－Ｖβ構築物およびＶβ－Ｐ２Ａ－Ｖα構築物で形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞によるＶｂ発現を示すグラフである。 Ｖα－Ｐ２Ａ－Ｖβ構築物およびＶβ－Ｐ２Ａ－Ｖα構築物で形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞によるＥ３４五量体結合を示すグラフである。 ペプチドパルスしたＥＢＶＢ細胞とインキュベートした後の、Ｖα－Ｐ２Ａ－Ｖβ構築物およびＶβ－Ｐ２Ａ－Ｖα構築物で形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞によるＣＤ１０７ａの発現を示すグラフである。 ペプチドパルスしたＥＢＶＢ細胞とインキュベートした後の、Ｖα－Ｐ２Ａ－Ｖβ構築物およびＶβ－Ｐ２Ａ－Ｖα構築物で形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγの発現を示すグラフである。
本発明者らは、以下の実施例において、ＴＣＲが結合するエピトープの分析、ＭＨＣクラスＩによるＨＢＶペプチドの提示、ＴＣＲのクローニングおよび配列決定、ＴＣＲ構築物の産生および最適化、ＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞の生成、ならびにＴＣＲを発現するＴ細胞の機能的特徴付けを含む、ＨＢＶ反応性Ｔ細胞クローンの同定および特徴付けを記載する。
実施例１：ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた細胞のスクリーニング
血液は、急性Ｂ型肝炎感染から回復した健康なドナーから採取した。ドナーからのＰＢＭＣをフィコール－ハイパック密度勾配遠心分離（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）によって単離し、２％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ－Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）に再懸濁した。
１０アミノ酸残基によりオーバーラッピングされており、全ＨＢＶプロテオーム配列をカバーする短鎖ペプチドのライブラリーを調製した。特に、エンベロープタンパク質は９ペプチド／プールを含有する９×９マトリックスにプールし、ポリメラーゼタンパク質は１２または１４ペプチド／プールを含有する１４×１２マトリックスを形成した。
ＰＢＭＣをプレートにアリコートし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで上述の合成ペプチドを用いて１０日間増殖させた。
次いで、ペプチドプールを使用して特異的Ｔ細胞クローンを刺激し、スクリーニングした。ＰＢＭＣを３７℃で１時間インキュベートし、次いで洗浄し、２％ヒトＡＢ血清および２０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を含むＡＩＭ－Ｖ培地（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、英国）でさらに４倍のＰＢＭＣと共培養した。ＨＢＶ－特異的Ｔ細胞応答は、Ｔａｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ（２０１４）、８８（２）：１３３２～１３４１に記載されているように、増殖後にＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析し、陽性応答を有するウェルを同定した（図１）。
Ｔ細胞クローンは、ＨＢＶ遺伝子型Ｃのペプチド３５（本明細書ではＥ３５ Ｇｅｎ Ｃと称する）に特異的な高ＩＦＮγ産生を有すると同定された。Ｅ３５ ＨＢＶ遺伝子型Ｃペプチドは、アミノ酸配列ＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡ（配列番号１９）を有し、Ｅ３５ ＨＢＶ遺伝子型Ｂペプチドは、アミノ酸配列ＬＬＧＰＬＬＶＬＱＡ（配列番号２０）を有する（図２を参照されたい）。
実施例２：ＥＬＩＳＰＯＴ応答を確認するための特異性試験
同定されたＥ３５特異的Ｔ細胞は、Ｅ３５ Ｇｅｎ Ｃペプチド（すなわち、ＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡ；Ｅ３５ Ｇｅｎ Ｃ）５時間刺激し、細胞傷害性脱顆粒アッセイにより特異性を確認した。細胞を、ＣＤ１０７ａおよびブレフェルジンＡの存在下で、２μｇ／ｍｌのＥ３５ Ｇｅｎ Ｃペプチドで再刺激した。増殖細胞を、氷上で１５分間、Ｃｙ－クロム－結合抗ＣＤ８＋およびＣＤ１０７ａ－ＰＥ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）で標識した。次いで、細胞を洗浄し、固定し、製造業者の指示に従ってＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理することにより透過処理した。次いで、細胞を抗ＩＦＮγ ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて３０分間染色し、洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した後、ＦＡＣＳによって取得し、ＦＡＣｓ Ｄｉｖａソフトウェアを使用して分析した。図３は、未刺激の対照ＰＢＭＣによる発現と比較した、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖後のＥ３５ ＧｅｎＣ刺激Ｔ細胞によるＣＤ８＋およびＣＤ１０７ａ＋の発現を示す。図４は、未刺激の対照ＰＢＭＣによる発現と比較した、ペプチドによる再刺激後のＣＤ８＋およびＣＤ１０７ａ＋、ならびにＩＦＮγの発現を示す。脱顆粒活性の明らかな増加が、ＣＤ８＋ ＣＤ１０７＋ Ｔ細胞集団の頻度の増加によって証明されているように検出された。
ＨＢＶ遺伝子型ＢおよびＣによる感染が特にアジアで蔓延しているため、ペプチドＥ３５の領域およびその近傍の遺伝子型ＢおよびＣに対応する配列を有するオーバーラッピングペプチドによる刺激に対するＴ細胞クローンの応答を調べた（図２を参照されたい）。
Ｅ３４ ＨＢＶ遺伝子型Ｃペプチドは、配列ＳＴＴＳＧＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡ（配列番号２１）を有する。Ｅ３４ ＨＢＶ遺伝子型Ｂペプチドは、配列ＳＴＴＳＧＬＬＧＰＬＬＶＬＱＡ（配列番号２２）を有する。Ｅ３６は、ＨＢＶ遺伝子型ＢおよびＣに対応し、配列ＶＬＱＡＧＦＦＬＬＴＲＩＬＴ（配列番号２３）を有する。
２μｇ／ｍｌのペプチドを、ＣＤ１０７ａおよびブレフェルジンＡと共に添加した。５時間インキュベーションした後、細胞を表面ＣＤ８ ＰＥ－Ｃｙ７－Ａ、ＣＤ１０７ａ ＦＩＴＣ－ＡおよびＩＦＮ－ｇ ＰＥ－Ａについて染色した後、ＦＡＣＳによって取得した。結果を図５に示す。Ｔ細胞クローンは、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ Ｅ３４ペプチド（ＳＴＴＳＧＦＬＧＰＬＬＶＬＱ）による刺激に応答して最も高いＩＦＮγ産生を示し、ＨＢＶ遺伝子型ＣペプチドＥ３５（ＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡＧＦＦＬＬ）およびＨＢＶ遺伝子型Ｂ Ｅ３４ペプチド（ＬＬＧＰＬＬＶＬＱＡＧＦＦＬＬ）での刺激に応答して観察された、より低いが依然として有意な応答を示す。
エピトープ認識の詳しい特異性をさらに調べるため、Ｅ３４およびＥ３５のオーバーラッピング領域に特異的な９～１１量体のパネル（図６Ａ）を設計し、上述と同じプロトコルに従って、２回目の再刺激を行った後にＴ細胞クローンを試験した。
結果を図６Ｂに示す。ＣＤ８＋細胞およびＩＦＮγ＋細胞の頻度は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ（ＬＬＧＰＬＬＶＬＱＡ）およびＨＢＶ遺伝子型Ｃ（ＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡ）の両方によって発現されるＨＢＶ Ｅｎｖエピトープ１７１～１８０に関して最も高く、類似している。これは、遺伝子型ＢおよびＣの両方に対するＴ細胞クローンの保存された特異性を示している。
実施例３：ＨＢＶ遺伝子型ＢペプチドおよびＣペプチドに対する用量応答
エプスタイン－バールウイルス形質転換Ｂ細胞（ＥＢＶＢ細胞）を、各種濃度（１μｇ／ｍｌ～１ｐｇ／ｍｌ）の同定されたＨＢＶエンベロープエピトープ（両遺伝子型ＢおよびＣ：Ｆ／ＬＬＧＰＬＬＶＬＱ）でパルスした後、５時間ＢＦＡの存在下で、短期増殖させたＴ細胞株とインキュベートした。
結果を図７に示す。両遺伝子型ＢペプチドおよびＣペプチドは、同レベルのＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を誘発した。
実施例４：ＨＬＡ拘束の決定
対象のＨＬＡ型は、ＤＮＡシークエンシングによって４桁解像度まで決定した。既知のＨＬＡクラスＩ適合ＥＢＶＢ細胞のパネルをＥ３５ペプチドでパルスした後、短期増殖させたＴ細胞株を添加し、５時間培養し、次いで、ＩＦＮγおよびＣＤ１０７ａ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーにより定量した。増殖させたＴ細胞クローンがＣｗ０８０１によって拘束されたことが決定された（図８を参照されたい；ＣＦ０５１５およびＷＧＰ２２は不死化ＥＢＶ Ｂ細胞株である）。
実施例５：クローン性およびＴＣＲクローニング
ＨＢＶ Ｅｎｖ １７１～１８０特異的、Ｃｗ０８０１拘束性Ｔ細胞クローンのクローン性を、Ｔ細胞受容体Ｖｂモノクローナル抗体のパネルを使用して調べた。ＴＣＲ可変ベータ鎖染色パネルＩＯ Ｔｅｓｔ Ｂｅｔａ Ｍａｒｋ ＴＣＲ Ｖキット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用し、ペプチド刺激後のＣＤ１０７ａ＋細胞に対する免疫優性Ｖβを決定した。
Ｔ細胞クローンを、抗ＣＤ１０７ａ－ＡＰＣの存在下で２時間１μｇ／ｍｌのペプチドで刺激し、１回洗浄した後、ＩＯＴｅｓｔ（登録商標）Ｂｅｔａ Ｍａｒｋ ＴＣＲ Ｖ ｂｅｔａ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅキット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州）を使用して優性Ｖｂについて染色した。この手順によってすべての既知のＶｂ鎖ファミリーメンバーでＴ細胞を染色した。Ｅ３４－特異的Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、ＣＤ１０７ａ＋Ｖβ＋細胞をゲートすることによって選別した。染色によって特定のＶｂ鎖ＴＲＢＶ２０．１が陽性染色されたが、このことはクローンが相同であることを示唆している。
全ＲＮＡは、Ａｒｃｔｕｒｕｓ ＰｉｃｏＰｕｒｅ ＲＮＡ単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、製造業者の指示に従って、選別されたＴ細胞クローンから単離した。簡単に説明すると、全細胞抽出物を精製カラムに加え、エタノールで溶出した。ｃＤＮＡは、ＳＭＡＲＴＥＲ（商標） ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増殖キットを使用して合成した（図９）。ＳＭＡＲＴｅｒ ＩＩ Ａオリゴヌクレオチドおよびオリゴ（ｄＴ）プライマーを、ｍＲＮＡ合成用のＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（ＲＴ）と共に使用した。ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ ＲＴは、ｍＲＮＡ鋳型の末端に達した場合に、いくつかの非鋳型残基を付加する。ｍＲＮＡ鋳型の非鋳型尾部は、第二鎖合成用の伸長されたプライミング領域として作用する。２回のＰＣＲ反応の後、平滑化ＰＣＲ産物を細菌形質転換用のｐＣＲ（商標）４ｂｌｕｎｔ－ＴＯＰＯベクターに連結させた（図１０）。免疫遺伝学Ｖ－クエストアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｓｈａｒｅ／ｔｅｘｔｅｓ／）を使用する配列分析により、Ｖａ鎖中の相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＣＤＲ１ａ：ｇａｃａｇｃｔｃｃｔｃｃａｃｃｔａｃ（配列番号７）、ＣＤＲ２ａ：ａｔｔｔｔｔｔｃａａａｔａｔｇｇａｃａｔｇ（配列番号８）、ＣＤＲ３ａ：ｇｃａｇａｇａｃｃｔｔｇｇａｔａａｃｔａｔｇｇｔｃａｇａａｔｔｔｔｇｔｃ（配列番号９）、およびＶｂ鎖のＣＤＲ（ＣＤＲ１ｂ：ｇａｃｔｔｔｃａｇｇｃｃａｃａａｃｔ（配列番号１０）、ＣＤＲ２ｂ：ｔｃｃａａｔｇａｇｇｇｃｔｃｃａａｇｇｃｃ（配列番号１１）、ＣＤＲ３ｂ：ａｇｔｇｃｔｇｔａｇａｃａｇｇｇａｔｇａａｃｃｔｔｔｃｃａｔａｇｃａａｔｃａｇｃｃｃｃａｇｃａｔ（配列番号１２））を明らかにした－図１１を参照されたい。
アミノ酸配列ＤＩＳＳＴＹ（配列番号２５）を有するＣＤＲ１ａをコードする変異体クローンも同定された。
実施例６：レトロウイルス性形質導入されたＴ細胞の機能分析
ＴＣＲα鎖およびβ鎖ＣＤＲ配列を決定した後、ＴＣＲ遺伝子をＭＰ７１レトロウイルスベクターに個別にクローニングし、発現および機能を分析した。
簡単に説明すると、ウイルスパッケージング細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳ）をＩＭＤＭ、１０％ＦＢＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰｌａｓｍｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と共に、トランスフェクションの１日前に２×１０６細胞／皿で播種した。０日目に、細胞を、ＣａＣｌ２法を使用して、アンホトロピックエンベロープと共にＭＰ７１レトロウイルスベクターで一過的に同時トランスフェクトした（図１２および図１３）。細胞をＡｉｍ－Ｖ ２％ヒトＡＢ血清中でさらに１日インキュベートした後、ウイルス上清を回収し、５×１０５個の活性化Ｔ細胞と６日間、５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ－３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）および６００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２と共に混合した。
７日目に、形質導入されたＴＣＲの発現効率は、Ｖｂおよび五量体について個別に染色し、ＦＡＣｓにより分析することによって決定した。抗Ｖｂｅｔａ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびＰＥ標識ＨＬＡ五量体（Ｐrｏｌｍｍｕｎｅ）を使用した。細胞をＥ３４五量体で１０分間、室温で染色した、次いで、氷上で３０分間ＶｂおよびＣＤ８に対して染色した後、ＦＡＣｓにより取得した。
形質導入Ｔ細胞は、偽形質導入細胞と比較して、Ｖｂ発現および五量体結合の増加を示した（図１４）。
１０日目に、活性化ＥＢＶＢ細胞を使用し、形質導入Ｔ細胞の機能性を脱顆粒アッセイによって確認した。
簡単に説明すると、ＥＢＶＢ細胞株ＣＦ０５１５（ＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１をコードするもの）を１０μｇ／ｍＬのペプチドで１時間、室温でパルスした。次いで、ペプチドパルスした細胞を、ＣＤ１０７ａおよびＢＦＡの存在下で、ＴＣＲ形質導入細胞または偽形質導入細胞と共培養し、一晩３７℃でインキュベートした。
ＨＢｓ１７１－１８０ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞および偽形質導入Ｔ細胞をＣＤ８およびＣＤ１０７ａ抗体で標識し、ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍにより透過処理し、抗ＩＦＮγ ＰＥについて染色し、洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。
結果を図１５に示す。ＣＤ８＋ ＣＤ１０７ａ＋ Ｔ細胞集団およびＩＦＮγ分泌性ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度の明らかな増加が確認された。
実施例７：コドン最適化およびベクター構築
ＴＣＲ遺伝子をさらに最適化し、単一のカセットへと構築した。２つのアミノ酸変化をＴＣＲのα鎖定常領域と１つのβ鎖定常領域に組み込み、対合および発現を増加させた。
Ｖα－Ｐ２Ａ－ＶβおよびＶβ－Ｐ２Ａ－Ｖαの方向からなる遺伝子カセットをＭＰ７１にクローニングし、異なる方向中にＴＣＲα鎖およびβ鎖を有する２つの異なるＰ２Ａ－結合単一カセット、コドン最適化システイン改変遺伝子構築物（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を得た（図１６を参照されたい）。
コロニーをスクリーニングし、構築物を初代ヒトＴ細胞に形質導入し、発現および機能性を調べた。
発現効率を、形質導入後のＶｂ染色および五量体染色により試験し、結果を図１７－１および図１７－２に示す。抗Ｖｂｅｔａ抗体およびＰＥ標識ＨＬＡ五量体を使用し、上述のようにして形質導入ＴＣＲの発現をモニターした。
β鎖のコード配列がα鎖のコード配列の５’側の発現カセットに位置する場合、Ｖｂ染色において２倍の増加が見られ、一方五量体染色においては、正確に対合されたＴＣＲを示す、顕著な７倍の増加が観察された。
ウイルス特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を、脱顆粒およびＩＦＮγ産生の分析により決定し、その結果を図１８－１および図１８－２に示す。機能性ＴＣＲの発現の増加は、機能的に４倍以上増加して翻訳された。

Claims (35)

  1. α鎖可変領域およびβ鎖可変領域を含む、任意選択で単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそのフラグメントであって、ＴＣＲまたはフラグメントが、ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子によってコードされているＭＨＣクラスＩα鎖を含むＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）Ｅｎｖポリペプチドのペプチドに結合することが可能であり、
    前記α鎖可変領域が、アミノ酸配列ｉ）～ｉｉｉ）：
    ｉ）ＣＤＲ１ａ：ＤＸＳＳＴＹ（配列番号１）；
    ｉｉ）ＣＤＲ２ａ：ＩＦＳＮＭＤＭ（配列番号２）；
    ｉｉｉ）ＣＤＲ３ａ：ＡＥＴＬＤＮＹＧＱＮＦＶ（配列番号３）
    を有するＣＤＲ３ａ（式中、Ｘ＝ＳまたはＩである）を含み、および、
    前記β鎖可変領域が、アミノ酸配列ｉｖ）～ｖｉ）：
    ｉｖ）ＣＤＲ１ｂ：ＤＦＱＡＴＴ（配列番号４）；
    ｖ）ＣＤＲ２ｂ：ＳＮＥＧＳＫＡ（配列番号５）；
    ｖｉ）ＣＤＲ３ｂ：ＳＡＶＤＲＤＥＰＦＨＳＮＱＰＱＨ（配列番号６）
    を有するＣＤＲ３ｂを含む、
    任意選択で単離された、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそのフラグメント。
  2. 前記Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＥｎｖポリペプチドがＨＢＶビリオンに由来するポリペプチド、またはＨＢＶ由来の核酸によってコードされているポリペプチドである、請求項１に記載のＴＣＲまたはフラグメント。
  3. 前記Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）が、血清型ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒまたはａｙｗのＨＢＶである、請求項１又は２に記載のＴＣＲまたはそのフラグメント。
  4. ペプチドがＨＢＶ Ｅｎｖポリペプチドの１７１～１８０位を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＴＣＲまたはフラグメント。
  5. ペプチドがアミノ酸配列ＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡ（配列番号１９）またはＬＬＧＰＬＬＶＬＱＡ（配列番号２０）を含むか、またはそれらからなる、請求項１から４のいずれか一項に記載のＴＣＲまたはフラグメント。
  6. ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子がＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１である、請求項１から５のいずれか一項に記載のＴＣＲまたはフラグメント。
  7. ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子がＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１ではない、請求項１から５のいずれか一項に記載のＴＣＲまたはフラグメント。
  8. 請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＣＲまたはフラグメントをコードする単離された核酸。
  9. 核酸が
    （ａ）前記α鎖可変領域および定常領域を含むＴＣＲα鎖をコードする核酸配列；
    （ｂ）前記β鎖可変領域および定常領域を含むＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列；ならびに、
    （ｃ）切断可能なリンカーをコードする核酸配列
    を含み；
    ここで、配列（ｃ）は配列（ａ）と配列（ｂ）の間の単離された核酸内に配置されており、配列（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は同じリーディングフレーム内にある、
    請求項８に記載の単離された核酸。
  10. 配列（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が５’から３’方向：５’－（ｂ）－（ｃ）－（ａ）－３’で提供される、請求項９に記載の単離された核酸。
  11. 切断可能なリンカーがピコルナウイルス２Ａ（Ｐ２Ａ）リンカーである、請求項９又は１０に記載の単離された核酸。
  12. ＴＣＲα鎖の定常領域および／またはＴＣＲβ鎖の定常領域が、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖との間にジスルフィド結合を形成するための少なくとも１つの非天然システイン残基を付加的にコードする、請求項９から１１のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  13. ベクターがプラスミド、バイナリーベクター、ＤＮＡベクター、ｍＲＮＡベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、トランスポゾン系ベクター、および人工染色体からなる群より選択される、請求項８から１２のいずれか一項に記載の単離された核酸を含むベクター。
  14. 請求項８から１２のいずれか一項に記載の単離された核酸または請求項１３に記載のベクターによってコードされている単離されたポリペプチド。
  15. 請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＣＲまたはフラグメント、請求項８から１２のいずれか一項に記載の単離された核酸、請求項１３に記載のベクター、または請求項１４に記載の単離されたポリペプチドを含む、任意選択で単離された、細胞。
  16. ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子によってコードされているＭＨＣクラスＩα鎖を含むＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）Ｅｎｖポリペプチドのペプチドに反応性である外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、任意選択で単離された、請求項１５に記載の細胞。
  17. 以下の特性：
    ａ）ＩＦＮγの発現；
    ｂ）ＨＢＶに感染しているか、またはＨＢＶ Ｅｎｖペプチドもしくはポリペプチドを含むかもしくは発現する細胞に対する細胞毒性；
    ｃ）ＨＢＶに感染しているか、またはＨＢＶ Ｅｎｖペプチドもしくはポリペプチドを含むかもしくは発現する細胞との接触に応答した、増殖、ＩＦＮγ発現の増加、ＩＬ－２発現の増加、ＴＮＦα発現の増加、パーフォリン発現の増加、グランザイム発現の増加、および／またはＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）発現の増加
    のうちの１つまたは複数を示す、請求項１５又は１６に記載の細胞。
  18. 請求項８から１２のいずれか一項に記載の単離された核酸、または請求項１３に記載のベクターを細胞に導入することを含む、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）反応性Ｔ細胞を産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
  19. 細胞による単離された核酸またはベクターの発現に適した条件下で、細胞を培養することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 細胞が請求項１８又は１９の方法によって得られるかまたは得ることができる、任意選択で単離された、細胞。
  21. 請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＣＲもしくはフラグメント、請求項１４に記載のポリペプチド、または請求項１５から１７及び２０のいずれか一項に記載の細胞と、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ） Ｅｎｖペプチドまたはポリペプチドとを含み、任意選択でＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子によってコードされているＭＨＣクラスＩα鎖を含むＭＨＣクラスＩ分子をさらに含む複合体であって、任意選択でｉｎ ｖｉｔｒｏである複合体。
  22. 請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＣＲもしくはフラグメント、請求項８から１２のいずれか一項に記載の単離された核酸、請求項１３に記載のベクター、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド、または請求項１５から１７及び２０のいずれか一項に記載の細胞と、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、または希釈剤とを含む医薬組成物。
  23. 疾患または障害を処置または予防する方法において使用するための、請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＣＲもしくはフラグメント、請求項８から１２のいずれか一項に記載の単離された核酸、請求項１３に記載のベクター、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド、請求項１５から１７及び２０のいずれか一項に記載の細胞、または請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. 疾患または障害を処置または予防するための医薬の製造における、請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＣＲもしくはフラグメント、請求項８から１２のいずれか一項に記載の単離された核酸、請求項１３に記載のベクター、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド、請求項１５から１７及び２０のいずれか一項に記載の細胞、または請求項２２に記載の医薬組成物の使用。
  25. 対象に投与することにより疾患または障害を処置または予防するための医薬であって、
    請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＣＲもしくはフラグメント、請求項８から１２のいずれか一項に記載の単離された核酸、請求項１３に記載のベクター、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド、請求項１５から１７及び２０のいずれか一項に記載の細胞、および請求項２２に記載の医薬組成物から選ばれる医薬。
  26. 対象における疾患または障害を処置または予防すべき前記対象に投与するための改変Ｔ細胞であって、
    対象から単離された少なくとも１つのＴ細胞に、請求項８から１２のいずれか一項に記載の単離された核酸、または請求項１３に記載のベクターが導入されている少なくとも１つの改変Ｔ細胞。
  27. 対象における疾患または障害を処置または予防すべき前記対象に投与するための改変Ｔ細胞であって、
    対象から単離された少なくとも１つのＴ細胞に、請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＣＲもしくはフラグメント、請求項８から１２のいずれか一項に記載の単離された核酸、請求項１３に記載のベクター、または請求項１４に記載の単離されたポリペプチドを発現するかまたは含む少なくとも１つの改変Ｔ細胞。
  28. Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染によって発症もしくは悪化されるのを治療または予防し、もしくはＨＢＶ感染が危険因子である疾患または障害を治療または予防するための医薬であって、
    請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＣＲもしくはフラグメント、請求項８から１２のいずれか一項に記載の単離された核酸、請求項１３に記載のベクター、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド、請求項１５から１７及び２０のいずれか一項に記載の細胞および請求項２２に記載の医薬組成物から選ばれるいずれかからなる医薬。
  29. 前記疾患がＢ型肝炎、肝細胞癌腫または膵臓がんのうちの１つまたは複数である、請求項２５又は２８に記載の医薬。
  30. ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子を含むＨＬＡ－Ｃ遺伝子型を有する対象に処置するためのものである、請求項２５、２８及び２９のいずれか一項に記載の医薬。
  31. 前記ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子がＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１である、請求項３０に記載の医薬。
  32. 前記ＨＬＡ－Ｃｗ＊０８対立遺伝子がＨＬＡ－Ｃｗ＊０８０１ではない、請求項３０に記載の医薬。
  33. Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染しているか、または対象がＨＢＶによる感染の危険性がある対象に投与するためのものである、請求項２５及び２８から３２のいずれか一項に記載の医薬。
  34. 前記ＨＢＶがＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩまたはＪから選択される、請求項３３に記載の医薬。
  35. 請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＣＲもしくはフラグメント、請求項８から１２のいずれか一項に記載の単離された核酸、請求項１３に記載のベクター、または請求項１４に記載の単離されたポリペプチドをＴ細胞に導入することを含む、改変されたＴ細胞を調製するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
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