DE69231046T2 - Rekombinante DNS die für eine Kette des T-Zell Rezeptors kodiert, Verfahren zur Herstellung, Antikörper und Arzneimittel die diese enthalten - Google Patents
Rekombinante DNS die für eine Kette des T-Zell Rezeptors kodiert, Verfahren zur Herstellung, Antikörper und Arzneimittel die diese enthaltenInfo
- Publication number
- DE69231046T2 DE69231046T2 DE69231046T DE69231046T DE69231046T2 DE 69231046 T2 DE69231046 T2 DE 69231046T2 DE 69231046 T DE69231046 T DE 69231046T DE 69231046 T DE69231046 T DE 69231046T DE 69231046 T2 DE69231046 T2 DE 69231046T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- sequence
- chain
- recombinant dna
- murine
- restriction site
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 title claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 title claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 title description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims abstract description 46
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 claims abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 17
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 11
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 27
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 abstract description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 241001135910 Phage M13mp18 Species 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- 108010064134 2-deoxy-scyllo-inosose synthase Proteins 0.000 description 1
- DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 6-[3-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-3-oxopropyl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)C(CCC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1)=O DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 241001452028 Escherichia coli DH1 Species 0.000 description 1
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000009109 curative therapy Methods 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical compound [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft neue rekombinante DNS- Moleküle, die für eine Kette des Rezeptors für das T-Zell-Antigen codieren, ein Herstellungsverfahren, Antikörper und diese umfassende Medikamente.
- Es wäre interessant, leicht ein Antikörper-Panel zu entwickeln, das gegen die verschiedenen Ketten von Rezeptoren für das humane T-Zell-Antigen (nachstehend TCR) gerichtet ist, um beispielsweise eine Diskriminierung und eine genaue Zählung zwischen den verschiedenen Unterpopulationen humaner T-Zellen zu erhalten.
- Die Untersuchung des Ungleichgewichts zwischen Unterpopulationen würde eine Differentialdiagnostik von Erkrankungen, die eine T-Zellproliferation hervorrufen, ermöglichen. Sie könnte auch eine spezifische Immunantwort auf ein bestimmtes pathogenes Gewebe, wie beispielsweise einen Tumor, nachweisen. Insbesondere ist bekannt, daß Antikörper gegen CD&sub4;- und CD&sub8;-Antigene, die zwei T-Zellpopulationen unterscheiden, eine Serie von Immunkrankheiten, darunter AIDS, nachweisen. Diese Antikörper sollten leicht und in großer Menge hergestellt werden können.
- Die EP-0 340 793-A beschreibt chimäre rekombinante DNS, deren zwei rekombinante Segmente gegebenenfalls von zwei verschiedenen Arten stammen. Die aus diesen beiden Segmenten erhaltenen Chimären codieren jedoch für Immunglobulin-Domänen, für eine variable, die für ein Immunglobulin-Segment codiert, und eine konstante für ein TCR-Segment.
- CHOI Y. et al. beschrieben in Nature 346, S. 471-473 (1990), für TCR-Chimären codierende DNS, die ein humanes Vβ-Segment umfassen, das mit einem murinen Dβ-, Jβ-, Cβ2-Segment ligiert ist. Die so gebildete TCR-Chimäre, die mit einer α-Kette gekoppelt und mit CD3 assoziiert ist, wurde exprimiert. Es wird vorgeschlagen, daß das beschriebene Verfahren die Produktion von Mäuse-Antikörpern ermöglichen kann, die für Vβ- oder Vα-Segmente des humanen TCR spezifisch sind. Dieses beschriebene Verfahren ist jedoch für einen gegebenen Konstruktionstyp spezifisch, der nur den humanen Vβ-Teil enthält. Es wäre interessant, ein Cβ2- Segment murinen Ursprungs verwenden zu können, um die Herstellung einer großen Serie von Chimären zu ermöglichen, die verschiedene, insbesondere humane Teile V, J und D umfassen.
- Die Anmelderin hat neue rekombinante DNS gefunden, welche die Herstellung neuer Eukaryoten-Expressionsvektoren ermögli chen, die bemerkenswerte Mittel zur Transfektion von Eukaryoten- Zellen darstellen, wobei die transfektierten Zellen ausgezeichnete Immunogene sind, die zu insbesondere monoklonalen Antikörpern führen, welche gegen die verschiedenen Ketten humaner TCR gerichtet sind.
- Daher betrifft die vorliegende Anmeldung eine rekombinante DNS, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine chimäre Nucleotidsequenz umfaßt, die für eine Kette des Rezeptors für das T-Zell- Antigen codiert, wobei die Sequenz besteht aus:
- - einer Sequenz, die von einem anderen als murinen Säuger stammt und für die Gesamtheit des variablen (V), Diversitäts- (D) und Vereinigungsteils (J) codiert,
- - und einer Sequenz murinen Ursprungs, die für den konstanten komplementären Teil (C) codiert, der in der obigen Säugersequenz fehlt,
- wobei die beiden Sequenzen auf der Höhe einer natürlichen oder künstlich geschaffenen Restriktionsstelle verbunden sind.
- Im folgenden wird diese Stelle "selektierte Stelle" genannt.
- Rekombinante DNS bedeutet eine künstlich geschaffene Nucleotidsequenz.
- Chimäre bedeutet, daß die rekombinante DNS zumindest zwei Sequenzen unterschiedlichen Ursprungs umfaßt, beispielsweise 3, 4 oder 5 und vorzugsweise 2 Sequenzen mit zwei verschiedenen Ursprüngen.
- Diese Sequenzen stammen von zwei verschiedenen Arten, und der Ursprung einer von ihnen ist murin, wobei die andere (oder die anderen) insbesondere von einem Primaten und vorzugsweise vom Menschen stammt (oder stammen).
- Der T-Zell-Rezeptor ist ein heterodimeres Protein, das aus zwei Polypeptid-Ketten besteht, die durch eine Disulfid-Brücke verbunden sind. Der Rezeptor wird an der Oberfläche von T-Zellen in Assoziation mit dem CD3-Komplex exprimiert. Der Ort, der einer bestimmten TCR-Kette entspricht, umfaßt eine wichtige Selektion bestimmter Gensegmente, die zahlreiche verschiedene Segmente V, mehrere Segmente J und ein oder zwei konstante Segmente C einschließen. Diese Segmente können somatische Umordnungen während einer thymischen Reifung der T-Zellen eingehen, wobei so ein einzigartiges Gen produziert wird, das transkribiert wird und Segmente V, Segmente J, ein Segment C und gegebenenfalls ein Segment D zwischen den Segmenten V und J enthält.
- In der oben beschriebenen rekombinanten DNS-Chimäre kann die gesamte Sequenz, die für den Teil C codiert, von einem Murinen stammen, und in diesem Fall umfaßt die Sequenz des anderen Säugers kein dem Teil C entsprechendes Nucleotid. Vorzugsweise umfaßt die von einem anderen Säuger stammende Sequenz einen kurzen Teil C, vorzugsweise weniger als 100 Nucleotide und insbesondere etwa 60 Nucleotide; daher stammt nur ein großer Teil C der Chimäre vom Murinen (wobei dieser Teil der komplementäre Teil ist, der in der obigen Sequenz des anderen Säugers fehlt), und der Rest stammt vom Säuger. Die beiden Sequenzen verschiedenen Ursprungs sind auf der Höhe einer selektierten Restriktionsstelle im Leserahmen verbunden.
- Die Sequenz des anderen Säugers umfaßt notwendigerweise zusätzlich zu den Teilen V, J und gegebenenfalls D und einem Teil von C die Gesamtheit der Kopfsequenz.
- Die selektierte Restriktionsstelle kann natürlich auf jeder der beiden Sequenzen vorliegen oder natürlich auf einer einzigen der beiden Sequenzen vorliegen, wobei die Restriktionsstelle auf der anderen Sequenz künstlich geschaffen wird. Die obige Restriktionsstelle muß auf dem murinen Cβ-Segment einzigartig sein und vorzugsweise auf dem Segment des anderen Säugers einzigartig sein.
- Wenn die selektierte Restriktionsstelle künstlich geschaffen wird, kann sie beispielsweise durch Deletion oder Addition von Nucleotiden oder vorzugsweise durch Mutation gemäß an sich bekannten Verfahren hergestellt werden, insbesondere durch ortsspezifische Mutagenese. Die so bewirkte Veränderung der DNS ermöglicht die Einführung einer normalerweise fehlenden Restriktionsstelle. Insbesondere kann eine BglII-Stelle, die natürlich auf der Höhe der für die Regionen Cβ1 und Cβ2 codierenden humanen DNS vorliegt, jedoch im für die TCR-Kette codierenden Mäuse- Gen fehlt, in das Mäuse-Gen Cβ2 durch ortsspezifische Mutagenese eingeführt werden, jedoch gegebenenfalls durch eine Kettenpolymerisationsmutagenese (PCR). Die Mutation ermöglicht die Beibehaltung einer maximalen Homologie mit der oder den Ausgangssequenzen. Die so geschaffene Restriktionsstelle ist vorzugsweise auf der Höhe einer Stelle angeordnet, die zu der Stelle homolog ist, auf deren Höhe die Restriktionsstelle bei dem betreffenden Säuger, insbesondere beim Menschen, natürlich vorliegt, um ein Schneiden sowohl der murinen Sequenz als auch der Sequenz des Säugers mit Hilfe des genannten Enzyms zu ermöglichen, wobei anschließend durch Ligation im Leserahmen die gewünschte Chimäre geschaffen wird. Aus dem vorhergehenden ist ersichtlich, daß, wenn ein gegebenes Restriktionsenzym gewählt wird, höchstens eine einzige entsprechende Restriktionsstelle auf dem murinen Segment Cβ vorliegen darf, die vorzugsweise auf dem Segment des anderen Säugers einzigartig ist, und außerdem auf der Höhe der für den Teil C codierenden Sequenz an einem Ort vorliegt, der die Transkription im Rahmen einer insbesondere für die TCR-Kette codierenden DNS ermöglicht. In einem besonders interessanten Fall kann eine ganze Serie von Genen produziert werden, die für einen Teil C eines murinen TCR codieren, und die mit zahlreichen von TCR verschiedenen Teilen V, insbesondere humanen, ligiert sind.
- Die gemäß der Erfindung bevorzugten DNS sind dadurch gekennzeichnet, daß die Restriktionsstelle natürlich auf der für den Teil C des Säugers codierenden Sequenz ist.
- Gemäß der Erfindung besonders bevorzugte Chimären haben einen Säuger-Teil, dadurch gekennzeichnet, daß seine von einem Säuger stammende Sequenz die für die humanen Segmente Vβ, Dβ, Jβ codierende Sequenz ist, und einen kurzen Teil Cβ1 und Cβ2 bis zur einzigartigen BglII-Stelle von Cβ1 und Cβ2.
- Der murine Teil der bemerkenswerten Chimären gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Restriktionsstelle, insbesondere BglII, künstlich auf der Kette murinen Ursprungs geschaffen wird.
- Die rekombinante DNS gemäß der Erfindung kann in Form einer mono- oder einzelsträngigen Nucleotidsequenz vorliegen, die auf die obigen Teile V, D, J und C begrenzt ist, oder andere Nucleotide umfassen, beispielsweise und insbesondere jene, welche die Kopfsequenz bilden.
- Daher kann die obige Sequenz insbesondere in einen Expressionsvektor eingeschlossen werden, und in diesem bevorzugten Fall in einen Eukaryoten-Expressionsvektor.
- Die obige Sequenz kann auch für ihre Replikation in einen anderen Vektor eingeschlossen werden, beispielsweise in ein Plasmid, wie beispielsweise BLUESCRIPT. Als Eukaryoten-Expressionsvektor kann insbesondere pHβPrl-Neo angegeben werden. Ebenso kann pHβPrlgpt und allgemein jeder Eukaryoten-Expressionsvektor angegeben werden, der Promotor-Regulationssignale und ein Polyadenylierungssignal aufweist, welche die Expression der cDNS ermöglichen. Es ist klar, daß die Wahl des Paares Vektor- Wirt Fachleuten bekannt ist.
- Die gemäß der Erfindung besonders bevorzugten DNS sind dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form eines Eukaryoten-Expressionsvektors vorliegen, der vorzugsweise von pHβPrl-Neo abgeleitet ist.
- Die obige rekombinante DNS, insbesondere in Form des Eukaryoten-Expressionsvektors, kann zur Transfektion der für den TCR codierenden Sequenz in einen geeigneten Wirt verwendet werden. So transfektierte Wirtszellen, die gegebenenfalls behandelt wurden, beispielsweise vorher mit der CD3 Zeta-Kette transfektiert wurden, um eine bessere Expression zu erhalten, können als Immunogen vorzugsweise bei Mäusen verwendet werden.
- Insbesondere monoklonale Antikörper können auch klassisch hergestellt werden, wobei das Screening der erhaltenen Hybridomen aus Myelom-Zellen und Milzzellen des verwendeten Murinen durch die Erkennung der transfektierten Linie gegenüber der Nicht-Erkennung der Ausgangslinie durchgeführt werden kann.
- Daher betrifft die vorliegende Anmeldung auch insbesondere monoklonale Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie unter Verwendung einer oben beschriebenen rekombinanten DNS hergestellt werden.
- Die obigen Antikörperweisen bemerkenswerte Eigenschaften auf, da sie gegenüber TCR-Ketten und insbesondere gegenüber variablen Regionen V von TCR-Ketten, jedoch auch gegenüber Regionen D und J in ihrer typischen Umordnung für einen gegebenen TCR perfekt charakterisiert sind.
- Diese Antikörper sind daher fähig, die Population humaner T-Zellen zu unterscheiden und so beispielsweise eine Krankheit oder einen gegebenen Mangel spezifisch zu erkennen.
- Unter den oben beschriebenen Antikörpern werden die Antikörper gegen den variablen Teil, insbesondere Vβ, D und J, bevorzugt, die bemerkenswerte Eigenschaften sowohl für die Diagnostik als auch die kurative und präventive Therapie von Autoimmunkrankheiten bei Menschen oder Tieren aufweisen.
- Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch pharmazeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest einen der wie oben definierten Antikörper umfassen.
- Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können insbesondere in parenteralen Formen vorliegen, die insbesondere injizierbar sind und derzeit in der Humanmedizin verwendet werden, beispielsweise auf subkutanem, intramuskulärem oder intravenösem Weg.
- Die obigen Antikörper können auch zur Behandlung von Immunkrankheiten oder Krankheiten, die eine T-Zellproliferation hervorrufen, sowie T-Zell-Leukämien durch Injektion der obigen Antikörper verwendet werden.
- Zu diesem Zweck können die Antikörper mit Toxinen oder mit radioaktiven Produkten gemäß an sich bekannten Verfahren gekoppelt werden.
- Die erfindungsgemäßen Antikörper finden insbesondere bei der Behandlung von Immunkrankheiten, wie rheumatoider Arthritis, Diabetes, Sjögren-Krankheit oder Lupus erythematosus, Verwendung.
- Die übliche Dosis, die gemäß dem verwendeten Produkt, dem behandelten Patienten und der betreffenden Affektion variabel ist, kann beispielsweise 0,001 bis 25 mg, pro Tag und pro kg Körpergewicht bei Menschen, monoklonaler Antikörper gemäß der Erfindung gekoppelt mit Ricin A als Cytotoxin, und vorzugsweise 0,05 bis 0,2 mg/kg/Tag betragen.
- Da die obigen, insbesondere monoklonalen Antikörper auch für Diagnosezwecke, für die Detektion, Identifikation oder Messung von TCR oder Teilen von TCR Verwendung finden, betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung dieser Antikörper sowie die diagnostischen Zusammensetzungen zur Detektion, Identifikation oder Messung der obigen Antigene.
- Die obigen Antikörper finden auch Verwendung bei der Reinigung von Produkten, die den Antigen-Teil enthalten, der den TCR-Ketten entspricht.
- Die obigen Antikörper können für Diagnosezwecke in der Cytofluorimetrie verwendet werden und können dafür durch an sich bekannte Verfahren mit fluoreszierenden Markern, wie FITC oder Phycoerythrin, gekoppelt werden.
- Beispielsweise kann das Vorliegen einer T-Zellpopulation durch die Detektion eines spezifischen variablen Segments auf der Höhe von beispielsweise an einer Infektion, an Krebs oder einer Autoimmunkrankheit leidenden Geweben und durch die Detektion seines Vorliegens gemäß an sich bekannten Verfahren detektiert werden.
- Die oben beschriebenen Antikörper können auch mit Hilfe von Enzymen markiert werden. Beispielsweise können Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Acetylcholinesterase, Glucoseoxidase oder Betagalactosidase angegeben werden.
- Die gesamten obigen Antikörper können auch mit einem radioaktiven Marker, wie Indium III, zur Verwendung bei der Abbildung von T-Zellpopulationen, die eine spezifische variable Region umfassen, auf der Höhe erkrankter menschlicher Körperteile gekoppelt werden.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen rekombinanten DNS, dadurch gekennzeichnet, daß ligiert wird:
- - eine Nucleotidsequenz, die aus zumindest der Gesamtheit der für die Teile V, D und J codierenden Sequenz einer Kette des Rezeptors des T-Zell-Antigens eines anderen als murinen Säugers bis zur Höhe einer Restriktionsstelle besteht, mit
- - einer Nucleotidsequenz murinen Ursprungs, die den komplementären Teil des Teils C, der in der Sequenz der obigen Säugerkette fehlt, aus derselben Restriktionsstelle wie oben umfaßt,
- wobei die Restriktionsstelle künstlich auf einer, der anderen oder den beiden Sequenzen geschaffen wird, um die erwartete Chimäre zu erhalten, dann, wenn gewünscht, eine Sequenz, welche die Gesamtheit der obigen Teile V, D, J und C umfaßt, mit einem Eukaryoten-Expressionsvektor ligiert wird, und anschließend, wenn gewünscht, die neue erhaltene Chimäre isoliert wird.
- Unter diesen bevorzugten Bedingungen ist das oben beschriebene Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß außerdem eine Eukaryotenzelle transfektiert wird, die alle Elemente umfaßt, welche die Synthese des Rezeptors des T-Zell-Antigens ermöglichen, mit Ausnahme der Kette, die zu der Kette homolog ist, für welche die obigen chimäre Sequenz codiert, die so transfektierten Zellen in der entsprechenden murinen Rasse als Antigen verwendet werden, die Milzzellen, die den Murinen entnommen wurden, denen das Antigen für die Myelom-Zellen verabreicht wurde, fusioniert werden, um gemäß an sich bekannten Verfahren Antikörper herzustellen, die gegen das Produkt der variablen Säugersequenz gerichtet sind.
- Das oben beschriebene Verfahren kann insbesondere wie folgt durchgeführt werden:
- Die für die Teile V, D und J einer Säuger-TCR-Kette codie rende Nucleotidsequenz und insbesondere eine lineare doppelsträngige DNS, welche die für die Teile V, J, gegebenenfalls D und gegebenenfalls teilweise C codierende Sequenz enthält, einer Säuger-TCR-Kette ebenso wie ihr Kopfgen wird durch Schneiden mit Hilfe von zwei verschiedenen Restriktionsenzymen erhalten: das Enzym, das der selektierten Restriktionsstelle auf der Höhe des Teils C entspricht, beispielsweise BglII, und ein anderes Enzym, das die Sequenz der gegenüberliegenden Seite nach dem Kopfgen spaltet, beispielsweise EcoRI, aus einer linearen doppelsträngigen DNS-Sequenz, die diese Sequenz umfaßt. Die so erhaltene DNS wird mit einem Vektor ligiert, der mit denselben zwei Restriktionsenzymen behandelt wird, wobei dieser Vektor die für das Segment C der TCR-Kette codierende Sequenz und dieselben Restriktionstellen wie oben, beispielsweise BglII und EcoRI, umfaßt. So wird das erwartete chimäre Gen erhalten. Dieses ist nicht immer als solches exprimierbar. Daher wird einerseits der die Chimäre umfassende Vektor mit zwei Restriktionsenzymen behandelt, die das für die TCR-Chimäre codierende chimäre Gen gemeinsam schneiden; andererseits wird ein Eukaryoten-Expressionsvektor mit denselben beiden Restriktionsenzymen behandelt. Durch Ligation des oben erhaltenen Gens, das für die TCR-Chimäre codiert, mit dem Eukaryoten-Expressionsvektor wird ein neuer chimärer Eukaryoten-Expressionsvektor erhalten. Dieser Eukaryoten- Expressionsvektor muß die Elemente umfassen, die für die Sicherstellung der korrekten Transkription des für den TCR codierenden chimären Gens notwendig sind. In dieser Hinsicht kann beispielsweise als Vektor pHβPrl-Neo angegeben werden, der durch BamHI und SalI gespalten werden kann und insbesondere das Neomycin-Resistenzgen, das als Selektionsmarker verwendet wird, ein Eukaryoten-SV40-Promotorgen, sowie ein Polyadenylierungssignal in der Nähe der BamHI-Stelle umfaßt. Der erhaltene neue chimäre Vektor wird vorteilhaft zur Transfektion von Eukaryoten-Zellen, vorzugsweise Mäuse-T-Zellen, verwendet, insbesondere von Zellinien, die alle Elemente für die Expression des TCR mit Ausnahme des durch den chimären Vektor gelieferten Gens umfassen. Beispielsweise kann die Mäuse-Linie DOIS 19 oder jene mit der Bezeichnung DS 23.27.4 angegeben werden. Derartige Zellen ermöglichen eine leichte Selektion transfektierter Zellen, die allein den TCR an der Oberfläche der Zelle exprimieren können.
- Es ist klar, daß jede Ligation (im vorstehenden und nach stehenden) von der Transfektion eines geeigneten Wirts und der Selektion von die gewünschte Chimäre enthaltenden Zellen gefolgt wird.
- Die transfektierten Zellen können als Antigen vorzugsweise Mäusen, beispielsweise durch intraperitoneale Injektion, verabreicht werden. Auf diese Weise können Milzzellen von so behandelten Murinen entnommen werden, Zellen, welche die gesuchten Antikörper sezernieren können, um sie mit unsterblichen Zellen, wie dem Myelom, zu fusionieren. Die selektierten Hybridomen, welche die gesuchten Antikörper produzieren, ermöglichen so die Herstellung insbesondere monoklonaler Antikörper, die gegen eine bestimmte Kette V des TCR des gewählten Säugers, insbesondere des Menschen, gerichtet sind.
- Die doppelsträngige DNS, die für die Kette des Rezeptors des Säuger-T-Zell-Antigens codiert, kann beispielsweise wie folgt hergestellt werden:
- Die Untersuchung der Sequenz von Genen, die für eine gegebene Kette codieren, ermöglicht die Selektion einer bereits auf einem konstanten Teil C vorliegenden Restriktionsstelle, d. h. führt zur Schaffung einer derartigen Stelle auf der Sequenz. Die Kenntnis dieser Sequenzen, beispielsweise hinsichtlich der Ketten für die Familien Vβ1, Vβ2, Vβ3, Vβ4, Vβ5, Vβ6, Vβ7, Vβ8, Vβ10, Vβ11, Vβ12, Vβ15, Vβ17 Vβ18, ermöglicht die Synthese neuer Oligonucleotide, die zur Synthese der komplementären DNS aus mRNS verwendbar sind.
- Aus Säuger-T-Lymphocyten (beispielsweise humanen) wird mRNS gereinigt, die für eine gegebene TCR-Kette codiert. Die entsprechende DNS wird mit Hilfe eines Oligonucleotids OHCβ synthetisiert, das für ein gegebenes Säuger-Gen spezifisch ist und gegebenenfalls die einzigartige selektierte Restriktionsstelle enthält, der zweite Strang wird aus einem für die Kette spezifischen Oligonucleotid mit Hilfe von reverser Transkriptase synthetisiert, und das erhaltene Gen wird durch Kettenpolymerisationsreaktionen (PCR) amplifiziert, wobei beispielsweise etwa 30 Zyklen durchgeführt werden.
- So wird eine große Menge an codierender linearer doppelsträngiger DNS erhalten. Dann können mit den geeigneten Enzymen, beispielsweise BglII und EcoRI, die durch die PCR produzierten Fragmente geschnitten werden, um die gesamte oder einen Teil der für den Teil C codierenden Sequenz aus der selektierten Stelle zu eliminieren, wobei die Sequenzen V, D und J sowie die Gesamtheit des Kopfgens konserviert werden.
- - Die Nucleotidsequenz murinen Ursprungs, die den komplementären Teil des Teils C enthält, der in der obigen Sequenz der Säuger-Kette fehlt, kann in dem Fall, wo sie in Form eines diese Sequenz umfassenden Vektors vorliegt, wie folgt hergestellt werden:
- Vollständige cDNS, die den gesamten für die TCR-Kette codierenden Teil enthält, und die aus einer cDNS-Bank ausgewählt wird, welche von einer murinen Zellinie stammt, beispielsweise KB5C20, wird mit Hilfe einer bekannten Sonde isoliert; diese cDNS wird in ein geeignetes Plasmid, beispielsweise PUC10, kloniert, dann wird das erhaltene Plasmid, in diesem Fall pUCmCβ2 genannt, in einen Wirt, beispielsweise den Bakterienstamm DH1 von E. coli, transfektiert.
- Anschließend kann das interessante murine DNS-Fragment in einen Phagen kloniert werden. Zu diesem Zweck wird pUCmCβ2 mit den geeigneten Restriktionsenzymen, beispielsweise EcoRI und HindIII, verdaut, um im obigen Fall drei Fragmente zu erhalten. Das Fragment, das die gesamte für die gewünschte murine Kette C codierende Sequenz enthält, wird gereinigt (im Fall der obigen Enzyme schneidet EcoRI im Teil V der Sequenz). So wird eine Sequenz erhalten, die für einen Teil des Teils V codiert, sowie für die Gesamtheit der Teile D, J und C. Dann wird diese Sequenz mit einem geeigneten Phagen, beispielsweise M13mp18, mit denselben Restriktionsenzymen ligiert. In diesem Fall existiert Phagen-DNS in zwei Formen: einzelsträngig für das Phagen-Capsid und doppelsträngig für seine replikative Form. Ein komplementäres Oligonucleotid der zu mutierenden Region, mit Ausnahme der gewünschten Mutation, wird mit der einzelsträngigen Form des Phagen hybridisiert. Der komplementäre Strang wird in vitro mit DNS-Polymerase synthetisiert, wobei dasselbe Oligonucleotid zur Initiation der Reaktion verwendet wird. Der neue Strang wird mit Hilfe einer Ligase in sich selbst geschlossen. Der völlig homologe Doppelstrang wird dann beispielsweise in E. coli, insbesondere JM101, transfektiert. Die mutanten Kolonien werden selektiert, beispielsweise durch Hybridisierung mit einem radioaktiv markierten Oligonucleotid.
- Einzelheiten zur ortsspezifischen Mutagenese siehe MANIATIS et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press).
- Die doppelsträngige DNS wird aus einem Subklon gereinigt, der die gewünschte Mutation enthält, und in den der Rest der für den Teil C codierenden Sequenz integriert ist, und sie wird mit geeigneten Enzymen, beispielsweise EcoRI und EcoRV, zur Isolierung des das gewünschte Gen enthaltenden Fragments geschnitten. Dann wird dieses Fragment in ein geeignetes Plasmid ligiert, das sequenziert werden kann und Restriktionsstellen aufweist, die eine leichte Extraktion der Sequenz ermöglichen, welche insertiert wurde, um sie in einen Expressionsvektor einzuführen, und das vorher durch kompatible Enzyme geöffnet wurde, die in seiner multiplen Bindungsstelle vorliegen, beispielsweise EcoRI und SmaI. Wie gewohnt, kann dann das Produkt der Ligation in einen geeigneten Wirt transfektiert werden, beispielsweise einen E. coli-Bakterienstamm DH1. Mittels einer Analyse beispielsweise durch Schneiden mit zwei Enzympaaren, wie EcoRI-XBaI und EcoRI- BglII, kann ein Klon selektiert werden, der in einer Elektrophorese die erwarteten Banden liefert.
- Das gereinigte Plasmid umfaßt die erwartete komplementäre Nucleotidsequenz murinen Ursprungs des Teils C, der in der Sequenz der obigen Säuger-Kette fehlt, ausgehend von derselben Restriktionsstelle, um die Ligation im Leserahmen zu ermöglichen.
- Aus dem vorhergehenden ist ersichtlich, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung die leichte Herstellung insbesondere monoklonaler Antikörper-Panels, die für verschiedene Strukturen des Teils V von TCR-Ketten spezifisch sind, aus einer sehr begrenzten Anzahl von Segmenten murinen Ursprungs ermöglicht.
- Tatsächlich umfaßt das für den Teil C codierende murine Segment durch Modifikation eine Restriktionsstelle, die nahezu auf der Gesamtheit konstanter Ketten humanen Ursprungs vorliegt, beispielsweise BglII für die humanen Ketten Cβ1 und Cβ2.
- Die obigen verschiedenen verwendeten Techniken sind Fachleuten wohlbekannt und Teil zahlreicher Publikationen im Stand der Technik.
- Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne sie jedoch einzuschränken.
- Fig. 1 zeigt Vergleiche der cDNS von Mäuse-Ketten Cβ2 und humanen TCR-Ketten Cβ1.
- Fig. 2 zeigt ein komplementäres cDNS-Oligonucleotid, das für die murine TCR-Kette Cβ2 codiert, ausgenommen die Höhe der bei den Basen, die für die Einführung der BglII-Stelle notwendig sind.
- Fig. 3 zeigt für humane TCR-Ketten Cβ1 und Cβ2 spezifische Oligonucleotide.
- Fig. 4 zeigt Flußcytometrieprofile von Transfektanten von DOIS19 (schwarze Profile), die mit zwei chimären DNS erhalten wurden, welche humanes Vβ8 enthalten (Rahmen oben: links FRNS.1.2, rechts MZ3 DC8), und humanes Vβ2 (Rahmen unten: links FRN2.7.3, rechts FRN2.7.6); im Vergleich zur Ausgangslinie DOIS19 (weiße Profile); die Zellen sind mit einem anti-CD3- Mäuse-Antikörper markiert.
- Fig. 5 zeigt die Analyse der Jurkatt-Linie durch einen bestimmten Antikörper, den Überstand von E83C11.20 und den monoklonalen humanen anti-CD3 von Immunotech.
- Es wird das Vorliegen einer BglII-Stelle auf dem für die Ketten β1 und β2 des TCR codierenden Gen in ihrer Region C in der Nähe der Region J und jenes einer identischen Stelle mit Ausnahme von zwei Basen im homologen Teil bei der Maus verwendet (siehe Fig. 1).
- A) Herstellung der Nucleotidsequenz murinen Ursprungs, die den komplementären Teil des Teils C umfaßt, der in der humanen Sequenz einer Kette β2 fehlt, in Form eines diese Sequenz umfassenden Vektors
- Die Sequenz der murinen Kette Cβ2 ist detailliert in Malissen M. et al. (1984), Cell 37: 1101-1110, beschrieben. Eine vollständige cDNS, die den gesamten codierenden Teil von Cβ2 enthält, wurde aus einer cDNS-Bank der murinen Zellinie KB5C20 erhalten (beschrieben in Albert et al. (1982), Immunogenetics 16: 533-549). Diese cDNS wurde in das Plasmid pUC19 kloniert. Das erhaltene Plasmid pUC m Cβ2 wurde in den Bakterienstamm DH1 transfektiert. Das rekombinante Bakterium wurde bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) in Paris am 12. Februar 1991 unter der Nr. I-1032 hinterlegt und ist ohne Einschränkung erhältlich.
- Prinzip: Das gewählte Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese verwendet den Filamentphagen M12mp18 BIORAD. Dieser Bakteriophage ist genau in Norrander et al. (1983), Gene 26: 101- 106, beschrieben. Er ist im Handel von mehreren Herstellern, insbesondere BIORAD, erhältlich. Das Manipulationsprinzip ist wie folgt:
- Das zu modifizierende DNS-Fragment wird in die multiple Bindungsstelle des Phagen kloniert. Dieser Phagenvektor existiert während seines Lebenszyklus in zwei Formen. Die replikative Form im Bakterium ist im wesentlichen doppelsträngig, die Capsid-Form ist einzelsträngig. Die DNS der beiden Formen kann gereinigt werden. Ein komplementäres Oligonucleotid der zu mutierenden Region, ausgenommen die gewünschte Mutation, wird mit der einzelsträngigen Form des Phagen hybridisiert. Dann wird der komplementäre Strang in vitro durch eine DNS-Polymerase synthetisiert, wobei das die gewünschte Mutation umfassende Oligonucleotid zur Initiation der Reaktion verwendet wird. Eine Ligase wird zum Verschließen des neuen Strangs in sich selbst am 5'-Ende des Oligonucleotids verwendet. Das homologe doppelsträngige Komplement, ausgenommen die beabsichtigte Mutation, wird in E. coli transfektiert, wobei zwei Klassen mutanter und nicht mutanter Kolonien erhalten werden. Die mutanten Kolonien werden anschließend selektiert.
- Zur Einführung der BglII-Stelle in die cDNS der Kette Cβ2 von Mäusen wird diese cDNS in den Phagen M13mp18 kloniert. Das Oligonucleotid von Fig. 2 wird zur Durchführung der Mutagenese verwendet. Dieses Oligonucleotid ist zur für das murine Gen Cβ2 codierenden cDNS komplementär, ausgenommen die beiden zur Einführung der BgIII-Stelle notwendigen Basen. Diese beiden Basen sind in Fig. 2 unterstrichen.
- Die Verfahren der Klonierung, Transfektion, Darstellung, Kolonienanalyse, Reinigung einzel- und doppelsträngigen Formen für den Phagen M13mp18 sind genau von Maniatis et al. beschrieben (bereits zitiert). Der verwendete Bakterienwirt ist der Stamm JM101 von E. coli.
- pUCmCβ2 wird mit EcoRI und HindIII verdaut. Dieser Verdau ergibt 3 durch Agarose-Elektrophorese unterscheidbare Fragmente. Das Zwischenfragment mit etwa 1000 Basenpaaren (bp), das die gesamte für das murine Cβ2 codierende Sequenz enthält, wird gereinigt. Dieses Fragment wird in die doppelsträngige DNS des Phagen M13mp18 kloniert, die vorher durch EcoRI und HindIII geöffnet wurde; Stellen, die in der multiplen Bindungsstelle dieses Vektors vorliegen. Dann wird in Kolonien von E. coli JM101 transfektiert.
- Aus der Analyse der isolierten Kolonien wird der Klon M13 EH Cβ7 in der Folge behalten, die einzelsträngige Form von M13EHCβ7 wird gereinigt.
- Das verwendete Verfahren ist in Maniatis et al. genau beschrieben. Dennoch sind die folgenden Punkte klarzustellen:
- Das Oligonucleotid von Fig. 2 wird auf einer Applied Biosystems 380B-Vorrichtung synthetisiert, dann auf einer sep Pak C18-Säule gereinigt.
- 0,2 ug des Einzelstrangs von M13EHCβ7 werden mit 3 pmol OhCβ-Kinase hybridisiert. Es wird kein anderes Oligonucleotid verwendet. Die Ausgangstemperatur der Hybridisierungsreaktion beträgt 70ºC.
- Die verwendete Polymerase ist T4-DNS-Polymerase (1 Einheit pro Reaktion) zur Vervollständigung zum Doppelstrang.
- Die Transfektion wird im E. coli-Stamm JM101 durchgeführt. Die Selektion der mutanten Kolonien erfolgt durch Hybridisierung mit dem radioaktiv markierten Oligonucleotid von Fig. 2. Die Hybridisierungstemperatur beträgt 42ºC. Zwei Wäschen mit 10 min bei 4ºC waren ausreichend, um die mutanten Kolonien durch Autoradiographie zu diskriminieren.
- Die DNS eines als muCβ215 bezeichneten Subklons einer durch radioaktive Hybridisierung erzeugten Kolonie wurde mit BglII verdaut, dann durch das Sanger-Verfahren zur Bestätigung der gewünschten Mutation und Integrität des Rests der murinen Sequenz Cβ2 sequenziert. Die doppelsträngige DNS dieses Subklons wird gereinigt und in den weiteren Versuchen verwendet.
- p Bluescript SK&spplus; ist ein Plasmid, das zur Gänze charakte risiert und im Handel bei der Firma STRATAGENE erhältlich ist. Die doppelsträngige DNS von muCβ215 wird mit EcoRI und EcoRV geschnitten und das kleinere der beiden Fragmente auf Agarose-Gel gereinigt. Dieses Fragment wird in p Bluescript ligiert, das vorher durch EcoRI und SmaI geöffnet wurde, zwei Stellen, die im Polylinker dieses Plasmids vorliegen, und in den E. coli-Stamm DH1 transfektiert, der als Wirt für die Chimäre dient. Isolierte Kolonien werden durch Schneiden mit zwei Enzympaaren EcoRI-XbaI und EcoRI-BglII analysiert. Ein als pBS mu Cβ215 bezeichneter Klon liefert die erwarteten Banden (etwa 1, 2 kb bzw. 0,5 kb) in einer Elektrophorese. Dieses Plasmid wird gereinigt und in den folgenden Versuchen verwendet.
- Die Kettenpolymerisationstechnik (PCR) wird aus den nachstehend angegebenen Gründen gewählt:
- - es sind viele Gene publiziert, die für die verschiedene Regionen V enthaltende TCR-Kette codieren,
- - Schnelligkeit beim Erhalten von cDNS durch diese Technik,
- - Sicherheit, komplette 5'-Gene zu haben, die das ATG-Initiationscodon umfassen,
- - Einfachheit der Integration von 5'-Restriktionsstellen des Gens zur Erleichterung der Klonierung.
- Im bevorzugten Beispiel, und um die durch die Erfindung ermöglichte Polyvalenz zu zeigen, wurden mehrere humane cDNS, die verschiedene variable Segmente enthalten, isoliert und mit der mutierten Mäuse-Kette Cβ2 gekoppelt.
- Es wird eine Mischung peripherer Lymphocyten von Kaukasiern verwendet, die vom Centre de Transfusion Sanguine de Marseille erhalten wurde. Nach Ficoll werden die Lymphocyten auf 1 Million Zellen pro ml in RPMI-Medium, 10% fötalem Kälberserum, 20 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 500 IE Penicillin eingestellt und mit Phytohämagglutinin A (10 ug/ml Endkonzentration) 3 Tage lang stimuliert. 200 Millionen Zellen werden zur Reinigung ihrer gesamten RNS verwendet.
- Das verwendete Protokoll ist genau in Maniatis et al. beschrieben. Durch dieses Verfahren werden etwa 50 ug RNS erhalten.
- Ein Oligonucleotid OhCβ, das für die beiden humanen Ketten Cβ2 und Cβ1 spezifisch ist und die einzigartige BglII-Stelle enthält, die auf den Gensegmenten Cβ1 und Cβ2 vorliegt, wird auf eine Weise analog zu OmCβ synthetisiert.
- Fünf Oligonucleotide OL1, OL2, OL3, OL8, OL12, die jeweils für die Kopfsequenz von Vβ1.2, Vβ2.1, Vβ3.1, Vβ8.l, Vβ12.3 gemäß der Definition der Subfamilien Vβ von Toyonaga et al. (1987), Eur. J. Immunol. 17: 375-383, spezifisch sind, werden ebenfalls synthetisiert.
- Diese Oligonucleotide haben am 5'-Ende die 8 Basen TAGAATTC, die nicht an die Kopfsequenzen der variablen Regionen hybridisieren. Diese 8 Basen enthalten die EcoRI-Stelle zur Erleichterung der Klonierung von Amplifikationsprodukten.
- Diese Oligonucleotide sind in Fig. 3 gezeigt.
- Fünf unabhängige PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung der Oligonucleotid-Paare OhCβ-OL1 durchgeführt, wobei i ein Element von (1, 2, 3, 8, 12) ist.
- Wir haben mit dem Paar OhCβ, OL8 begonnen. Das Versuchsverfahren ist detailliert in Kawasaki et al. (1989) PCR Technology, Principles and Applications for ADN Amplification; Stockton Press, Henry A. Ehrlich Hrg. S. 89 ff., beschrieben. Die folgenden Ausführungen sind nützlich:
- Die Ausgangs-RNS-Menge beträgt 1 ug für die Synthese des komplementären cDNS-Strangs.
- Zur eigentlichen PCR-Reaktion werden 10 umol jedes Oligonucleotids OL8 und OhCβ verwendet.
- Der PCR-Zyklus ist:
- - 1 mn Denaturierung bei 95ºC,
- - 1 mn Hybridisierung bei 52ºC,
- - 1 mn Extension bei 72ºC,
- und es werden 30 Zyklen auf einem DNS-Thermocycler, Version 2.2, von Perkin Elmer durchgeführt.
- Das Reaktionsprodukt wird auf 1,4% Agarose-Gel für eine Elektrophorese aufgebracht. Nach Anfärbung mit Ethidiumbromid wird eine deutliche Bande mit ungefähr 500 bp abgetrennt, und die DNS wird elektroeluiert. Es werden etwa 30 nm DNS erhalten.
- 1 ng dieser DNS wird ein zweites Mal durch PCR amplifiziert. Die spezifische Bande wird auf die gleiche Weise wie oben gereinigt, und es werden 300 ng DNS erhalten.
- Die PCR-Reaktionen mit den Paaren OL1, OL2, OL3, OL12, jeweils mit OhCβ assoziiert, werden auf die gleiche Weise durchgeführt, außer daß im Fall von OL12 und OL3 die zweite Amplifikation nicht notwendig war (es wurden mehr als 100 ng bei der ersten Amplifikation erhalten).
- Die chimären Gene werden konstruiert, indem jedes durch PCR produzierte Fragment, das durch EcoRI und BglII geschnitten wird, in das aus dem Verdau von pBSmuCβ215 erhaltene große Fragment kloniert wird.
- pBSmuCβ215 wird mit EcoRI und BglII geschnitten, und das als FpBSmuCβ215 bezeichnete große Fragment wird auf Agarose-Gel gereinigt und elektroeluiert.
- 100 ng des mit den Oligonucleotiden OL8, OhCβ erhaltenen Amplifikationsprodukts werden mit EcoRI und BglII geschnitten.
- Diese beiden Fragment werden ligiert, und das Ligationsprodukt wird in DH1 transfektiert.
- Die Analyse der durch Schneiden mit BglII-EcoRI isolierten Kolonien BSGβ8.1, BSGβ8.2, ..., BSGβ8.5 ergibt das erwartete Fragment mit etwa 500 bp. BSGβ8.1 wird zwischen der EcoRI-Stelle und der BglII-Stelle sequenziert. Die Analyse der Seguenz zeigt eine völlige Ähnlichkeit mit der für Vβ8.1 von Yoshikai Y. et al. (1984), Nature 312: S. 521-524, veröffentlichten Sequenz.
- Ebenso werden die PCR-Produkte, die mit den OL1, OL2, OL3, OL12 enthaltenden Oligonucleotid-Paaren erhalten werden, in FpBSCβ215 kloniert.
- In bezug auf die Definition der verschiedenen Subfamilien Vβ von Toyonga et al. (1987), Eur. J. Immunol. 17: 375-383, werden erhalten:
- - mit OL1 die Klone BSGβ1.2 und BSGβ1.3, dessen Sequenz für die Region V identisch ist mit Vβ1.2;
- - mit OL2 die Klone BSGβ2.5, dessen Sequenz für die Region V Vβ2.2 entspricht, und BSGβ2.7 und BSGβ2.11 mit dem Gen Vβ2.3; mit OL12 die Klone BSGβ12.1 und BSGβ12.4 mit dem Gen Vβ12.3.
- Die TCR-Kette ist ein Membranprotein, das an der Oberfläche exprimiert wird, wenn und nur wenn die anderen Ketten des TCR- Komplexes, die mit dieser assoziiert sind (die Kette α und der Komplex CD3), vorhanden sind.
- Um die Expression vorher konstruierter chimärer Gene zu erhalten, wird die murine Zellinie DOIS19 verwendet, die von Letourneur F. et al. (1989), Eur. J. Immunol. 19: 2269-2274, entwickelt wurde. DOIS19 ist ein Mutant eines Mäuse-T-Hybridoms, der alle TCR-Bestandteile mit Ausnahme der Kette β aufweist. Diese Linie exprimiert daher TCR nicht an ihrer Oberfläche. Die Transfektion einer exogenen Kette induziert die Expression eines funktionellen Rezeptors in den transfektierten Zellen. Zwei chimäre Gene der Erfindung, die in BSGβ8.1 und BSGβ2.7 enthalten sind, wurden in diese Zelle gemäß den nachstehend beschriebenen Protokollen transfektiert:
- Der gewählte Expressionsvektor ist das Plasmid pHβPrl-neo. Es ist genau in Gunning P. et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 4831-4835, beschrieben. Das zu exprimierende Gen wird stromabwärts vom Promotor β-Aktin und stromaufwärts von einer Polyadenylierungsstelle subkloniert, die auf diesem Plasmid vorliegen. Diese beiden Signale stellen die Synthese einer funktionellen mRNS des insertierten Gens sicher. Außerdem weist dieses Plasmid das Neomycin-Resistenzgen auf, das Zellen, in die das Plasmid integriert ist, eine Resistenz gegen eine Serie von Antibiotika, im bevorzugten Beispiel das Antibiotikum G418, verleiht.
- Ferner sind auch ein Replikationsursprung und ein Ampicillin-Resistenzgen vorhanden, welche die Selektion und Replikation in E. coli ermöglichen.
- Der hier verwendete E. coli-Stamm ist MC1061.
- Das Plasmid BSGβ8.1 wird durch die Enzyme BamHI und SalI geschnitten, und das kleinere der beiden Fragmente (1,2 kb) wird auf Agarose-Gel gereinigt. Dieses Fragment, das die Gesamtheit der codierenden Seguenz des chimären Gens umfaßt, wird mit dem Plasmid pHβ Prl-neo Tigiert, das vorher durch BamHI und SalI geöffnet wurde. Das Ligationsprodukt wird in E. coli MC1061 trans fektiert, und aus der Analyse der durch das Schneiden mit BamHI und SalI isolierten Kolonien wird der als neo Gβ8.1 bezeichnete Klon behalten, der gemäß Agarose-Elektrophorese das erwartete 1,2 kb Fragment liefert. Auf die gleiche Weise wird das in pBSGβ2.7 enthaltene chimäre Gen in pHβ Prl-neo subkloniert, und der als neo Gβ2.7 bezeichnete Klon wird konserviert. Neo Gβ8.1 wurde bei der CNCM am 12. Februar 1991 unter der Nr. I-1033 hinterlegt.
- Das gewählte Transfektionsverfahren ist die Fusion von Protoplasten.
- Schrittweise wird das von MALISSEN et al. (siehe Technique des transfert de genes dans les cellules eucaroytes 1990, Editions INSERM, Paris, 25-31) beschriebene Protokoll befolgt, außer daß die Konzentration von G418 im selektiven Medium 3 mg/ml mit den Klonen neo Gβ8.1 und neo Gβ2.7 beträgt.
- Für neo Gβ8.1 werden die gegen Neomycin resistenten Kolonien FRN8.1.1 ... FRN8.1.24 durch Flußcytometrie analysiert. Für jeden Klon 10&sup5; Zellen in einer Lösung von Dulbeco Modified Eagle Medium (DMEM) bei 4% fötalem Kälberserum (FCS), 0,02% Natriumazid und 15 ug/ml Mäuse-anti-CD3-Antikörper (Antikörper C2C11, beschrieben in LEO et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 1374) 45 min lang bei 4ºC unter Rühren. Nach drei Wäschen mit DMEM, 4% FCS, 0,02% Natriumazid werden die Zellen mit einem mit FITC (Reagenz Immunotech) markierten, polyklonalen Ziegen-anti-Milzimmunglobulin-Antikörper bei 15 ug/ml in DMEM, 4%- FCS, 0,02% Natriumazid 30 min lang bei 4ºC unter Rühren inkubiert. Nach drei Wäschen mit DMEM, 4% FCS, 0,02% Azid werden die Zellen in PBS bei 1% Formaldehyd fixiert und auf einer Flußcytometrie-Vorrichtung FACSCAN von Becton Dickinson analysiert. 10&sup5; DOIS19-Zellen werden auf die gleiche Weise behandelt und dienen als negative Kontrolle. Das für den Klon FRN8.1.2 erhaltene Profil ist in Fig. 4 im Vergleich mit dem Profil von DOIS19 gezeigt.
- Auf die gleiche Weise wird mit dem Plasmid neo Gβ2.7 vorgegangen, und das auf dem FACSCAN erhaltene Profil des Klons FRN2.7.3 ist in Fig. 4 im Vergleich mit DOIS19 gezeigt. Die beiden Zellinien werden durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen erhalten.
- Drei Balb/c-Mäuse werden mit FRN8.1.2 immunisiert. Das Immunisierungsprotokoll ist wie folgt:
- - Tag 0: 10 Millionen Zellen FRN8.1.2, injiziert auf intraperitonealem Weg.
- - Tag 20: 10 Millionen Zellen FRN8.1.2, injiziert auf intraperitonealem Weg.
- - Tag 40: 5 Millionen Zellen, injiziert auf intravenösem Weg.
- - Tag 43: Entnahme der Milz zur Fusion.
- Splenocyten von zwei Mäusen werden fusioniert, die mit dem Myelom X63 Ag 258 gemäß dem von Kohler et Milstein (1975), Nature 256: 495-497, beschriebenen Protokoll immunisiert wurden. Die Analyse der Überstände von aus der Fusion erhaltenen Klonen erfolgt durch Flußcytometrie an FRN8.1.2 gegenüber DOIS19. 100 ul Überstand jedes Klons werden entnommen, 50 ul werden mit 50 ul DMEM, 4% FCS, 0,02% Azid, enthaltend 10&sup5; Zellen FRN8.1.2, inkubiert, die restlichen 50 ul werden mit 50 ul desselben Mediums, das jedoch 10&sup5; Zellen DOIS19 enthält, inkubiert. Das Protokoll ist ansonsten dasselbe wie das zur Analyse der Transfektanten verwendete.
- Von 400 getesteten Überständen markieren zwei Überstände FRN8.1.2 und markieren nicht DOIS19. Die beiden entsprechenden monoklonalen Antikörper reagieren daher mit einer Kette des chimären Komplexes von TCR, der die humane Kette Vβ8.1 enthält.
- Der Klon E83C11.20 markiert nicht die Linie FRN2.7.3, wodurch sichergestellt wird, daß dieser monoklonale Antikörper die Mäuse-Bestandteile von chimärem TCR nicht erkennt.
- Der Klon E93C11.20 markiert hingegen die humane Jurkatt-Linie, welche die Kette Vβ8.1 exprimiert (Yoshikai et al. (1984), Nature 312: 521-524). Fig. 5 zeigt die Analyse der Jurkatt-Linie für einen bestimmten Antikörper, den Überstand von E83C11.20 und den monoklonalen humanen anti-CD3-Antikörper von Immunotech.
- Aus diesen Analysen geht hervor, daß der monoklonale Antikörper E83C11.20 für eine humane Kette Vβ8.1 spezifisch ist.
- Eine injizierbare Zubereitung wurde hergestellt, die enthält:
- - monoklonaler Antikörper von Beispiel 2 5 mg
- - Wasser für injizierbare Zubereitungen 1 ml
Claims (16)
1. Rekombinante DNS, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine
chimäre Nucleotidsequenz umfaßt, die für eine Kette des Rezeptors
für das T-Zell-Antigen codiert, wobei die Sequenz besteht aus:
- einer Sequenz, die von einem anderen als murinen Säuger
stammt und für die Gesamtheit des variablen (V), Diversitäts-
(D) und Vereinigungsteils (J) codiert,
- und einer Sequenz murinen Ursprungs, die für den
konstanten komplementären Teil (C) codiert, der in der obigen
Säugersequenz fehlt,
wobei die beiden Sequenzen auf der Höhe einer natürlichen
oder künstlich geschaffenen Restriktionsstelle verbunden sind.
2. Rekombinante DNS nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Restriktionsstelle natürlich auf der für den Teil C
codierenden Sequenz ist.
3. Rekombinante DNS nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die von einem Säuger stammende Sequenz die für
eine Vβ-Kette menschlichen Ursprungs codierende Sequenz ist, und
daß die Restriktionsstelle BglII ist.
4. Rekombinante DNS nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß die Restriktionsstelle auf der Kette murinen
Ursprungs künstlich geschaffen wird.
5. Rekombinante DNS nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich um einen
Eukaryoten-Expressionsvektor handelt.
6. Rekombinante DNS nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß der Eukaryoten-Expressionsvektor ein von Phβ-Prl-Neo
abgeleitetes Plasmid ist.
7. Rekombinante DNS nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß der variable Teil (V) menschlichen Ursprungs
ist und aus Vβ1, Vβ2, Vβ3, Vβ4, Vβ5, Vβ6, Vβ7, Vβ8, Vβ10, Vβ11,
Vβ12, Vβ15, Vβ17 und Vβ18 ausgewählt wird.
8. Rekombinante DNS nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß der variable Teil (V) Vβ2 ist.
9. Rekombinante DNS nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
daß der variable Teil (V) Vβ17 ist.
10. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, welches die
Expression von Hybridomen umfaßt, die durch Lymphocytenfusion
aus Milzzellen von Mäusen hergestellt werden, welche mit Hilfe
eines Antigens immunisiert wurden, das ein Protein enthält,
da
durch gekennzeichnet, daß eine rekombinante DNS wie in einem der
Ansprüche 1 bis 9 definiert für das Protein codiert.
11. Pharmazeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet,
daß sie gemäß dem Verfahren von Anspruch 10 hergestellte
Antikörper enthalten.
12. Diagnoseprodukte, dadurch gekennzeichnet, daß sie gemäß dem
Verfahren von Anspruch 10 hergestellte Antikörper enthalten.
13. Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten DNS wie in
Anspruch 1 definiert, dadurch gekennzeichnet, daß ligiert wird:
- eine Nucleotidsequenz, die aus zumindest der Gesamtheit
der für die Teile V, D und J codierenden Sequenz einer Kette des
Rezeptors des T-Zell-Antigens eines anderen als murinen Säugers
bis zur Höhe einer Restriktionsstelle besteht, mit
- einer Nucleotidsequenz murinen Ursprungs, die den
komplementären Teil des Teils C, der in der Sequenz der obigen
Säugerkette fehlt, aus derselben Restriktionsstelle wie oben umfaßt,
wobei die Restriktionsstelle künstlich auf einer, der
anderen oder den beiden Sequenzen geschaffen wird, um die erwartete
Chimäre zu erhalten, dann, wenn gewünscht, eine Sequenz, welche
die Gesamtheit der obigen Teile V, D, J und C umfaßt, mit einem
Eukaryoten-Expressionsvektor ligiert wird, und anschließend,
wenn gewünscht, die neue erhaltene Chimäre isoliert wird.
14. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers nach Anspruch
10, welches einen Schritt der Herstellung von wie in Anspruch 5
definierter rekombinanter DNS umfaßt, dadurch gekennzeichnet,
daß außerdem eine Eukaryotenzelle transfektiert wird, die alle
Elemente umfaßt, welche die Synthese des Rezeptors des T-Zell-
Antigens ermöglichen, mit Ausnahme der Kette, die zu der Kette
homolog ist, für welche die obigen chimäre DNS-Sequenz codiert,
die so in die entsprechende murine Rasse transfektierten Zellen
als Antigen verwendet werden, die Milzzellen, die den Murinen
entnommen wurden, denen das Antigen für die Myelom-Zellen
verabreicht wurde, fusioniert werden, um gemäß an sich bekannten
Verfahren Antikörper herzustellen, die gegen das Produkt der
variablen Säugersequenz gerichtet sind.
15. Antikörper gegen die Vβ2-Kette des humanen
T-Zell-Rezeptors.
16. Antikörper gegen die Vβ17-Kette des humanen
T-Zell-Rezeptors.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR919102189A FR2672901B1 (fr) | 1991-02-15 | 1991-02-15 | Nouvelles molecules de dna recombinants codant pour une chaine du recepteur pour l'antigene des cellules t, procede de preparation, anticorps et medicaments les renfermant. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69231046D1 DE69231046D1 (de) | 2000-06-21 |
| DE69231046T2 true DE69231046T2 (de) | 2001-01-11 |
Family
ID=9410030
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69231046T Expired - Fee Related DE69231046T2 (de) | 1991-02-15 | 1992-02-12 | Rekombinante DNS die für eine Kette des T-Zell Rezeptors kodiert, Verfahren zur Herstellung, Antikörper und Arzneimittel die diese enthalten |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0499555B1 (de) |
| JP (1) | JPH0591881A (de) |
| AT (1) | ATE193058T1 (de) |
| CA (1) | CA2061266A1 (de) |
| DE (1) | DE69231046T2 (de) |
| DK (1) | DK0499555T3 (de) |
| ES (1) | ES2147725T3 (de) |
| FR (1) | FR2672901B1 (de) |
| GR (1) | GR3034176T3 (de) |
| PT (1) | PT499555E (de) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0758394B1 (de) | 1994-05-02 | 2002-11-20 | Bernd Groner | Bifunktionelles protein, herstellung und verwendung |
| US7994298B2 (en) | 2004-09-24 | 2011-08-09 | Trustees Of Dartmouth College | Chimeric NK receptor and methods for treating cancer |
| US9181527B2 (en) | 2009-10-29 | 2015-11-10 | The Trustees Of Dartmouth College | T cell receptor-deficient T cell compositions |
| US9273283B2 (en) | 2009-10-29 | 2016-03-01 | The Trustees Of Dartmouth College | Method of producing T cell receptor-deficient T cells expressing a chimeric receptor |
| WO2013033626A2 (en) | 2011-08-31 | 2013-03-07 | Trustees Of Dartmouth College | Nkp30 receptor targeted therapeutics |
| CN110511278B (zh) | 2012-05-07 | 2024-08-09 | 达特茅斯大学理事会 | 抗b7-h6抗体、融合蛋白及其使用方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL86278A (en) * | 1988-05-04 | 2003-06-24 | Yeda Res & Dev | Endowing cells with antibody specificity using chimeric t cell receptor |
| CA2018248A1 (en) * | 1989-06-07 | 1990-12-07 | Clyde W. Shearman | Monoclonal antibodies against the human alpha/beta t-cell receptor, their production and use |
-
1991
- 1991-02-15 FR FR919102189A patent/FR2672901B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-02-12 DE DE69231046T patent/DE69231046T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-02-12 EP EP92430003A patent/EP0499555B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-12 DK DK92430003T patent/DK0499555T3/da active
- 1992-02-12 ES ES92430003T patent/ES2147725T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-12 AT AT92430003T patent/ATE193058T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-02-12 PT PT92430003T patent/PT499555E/pt unknown
- 1992-02-14 CA CA002061266A patent/CA2061266A1/fr not_active Abandoned
- 1992-02-14 JP JP4028264A patent/JPH0591881A/ja active Pending
-
2000
- 2000-08-10 GR GR20000401871T patent/GR3034176T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2672901B1 (fr) | 1994-09-30 |
| EP0499555B1 (de) | 2000-05-17 |
| GR3034176T3 (en) | 2000-11-30 |
| PT499555E (pt) | 2000-10-31 |
| ATE193058T1 (de) | 2000-06-15 |
| FR2672901A1 (fr) | 1992-08-21 |
| JPH0591881A (ja) | 1993-04-16 |
| DE69231046D1 (de) | 2000-06-21 |
| DK0499555T3 (da) | 2000-10-09 |
| CA2061266A1 (fr) | 1992-08-16 |
| ES2147725T3 (es) | 2000-10-01 |
| EP0499555A1 (de) | 1992-08-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69100768T2 (de) | CD25-bindende Moleküle. | |
| DE3689123T2 (de) | Modulare einheit von antikörpergenen, daraus hergestellte antikörper und verwendung. | |
| DE68913771T2 (de) | Für IG-CD4 Fusionsproteine kodierende, klonierte Gene und deren Verwendung. | |
| DE69000338T2 (de) | Expressionssystem zur herstellung von chimaeren monoklonalen antikoerpern. | |
| DE3751004T2 (de) | Chimärer Antikörper mit Spezifität für menschliches Tumor-Antigen. | |
| DE69936927T2 (de) | Polyspezifische bindemoleküle und deren verwendung | |
| DE69233153T2 (de) | Humanisierte monoklonale antikörper | |
| DE68913658T3 (de) | Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen | |
| DE69534589T2 (de) | Gezielte zell-lyse von hiv-infizierten zellen mit chimären cd4 rezeptortragenden zellen | |
| DE69528894T2 (de) | Bifunktionelles protein, herstellung und verwendung | |
| DE69533675T2 (de) | Monoklonaler antikörper gegen rhesus d (d7c2) | |
| DE69233482T2 (de) | Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen | |
| DE60217839T2 (de) | Mittel zur suppression von transplantat-abstossung | |
| DE69129896T2 (de) | Gegen cd3 gerichtete antikörper | |
| DE69031591T2 (de) | Cd4-spezifischer rekombinanter antikörper | |
| US5506126A (en) | Rapid immunoselection cloning method | |
| EP0352761B1 (de) | Antigenkonstrukte von "Major Histocompatibility Complex" Klasse I Antigenen mit spezifischen Trägermolekülen, ihre Herstellung und Verwendung | |
| DE69429095T2 (de) | Humanisierte antikoerper | |
| AU658370B2 (en) | CD53 cell surface antigen and use thereof | |
| DE69233480T2 (de) | CD4-gamma2- und CD4-IgG2-Chimären | |
| DE4118120A1 (de) | Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung | |
| DE19821060A1 (de) | Ko-stimulierendes Polypeptid von T-Zellen, monoklonale Antikörper sowie die Herstellung und deren Verwendung | |
| DE69320336T2 (de) | Isolierung, Charakterisierung und Verwendung der menschlichen Beta-Einheit des Immunglobulin E-Hochaffinitätsrezeptors | |
| DE3752158T2 (de) | Molekulare Klonierung und Expression von menschlichem IL-3 | |
| DE69635639T2 (de) | Interleukin-12-beta-Rezeptoren mit niedriger Bindungsaffinität |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |