PT499555E - Moleculas de adn recombinado que codifica uma cadeia do receptor do antigene de celulas t processo de preparacao anticorpos e medicamentos englobando-os - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

MOLÉCULAS DE ADN RECOMBINADO QUE CODIFICA UMA CADEIA DO RECEPTOR DO ANTIGENE DE CÉLULAS T, PROCESSO DE PREPARAÇÃO, ANTICORPOS E MEDICAMENTOS ENGLOBANDO-OS A presente invenção está relacionada com novas moléculas de ADN recombinado que codificam uma cadeia do receptor do antigene de células T, com o seu processo de preparação, com anticorpos e com medicamentos que os compreendem.

Seria interessante desenvolver de uma forma fácil um painel de anticorpos dirigido contra as diferentes cadeias de receptores do antigene de células T humanas (a seguir designados TCR), a fim de se obter, por exemplo, uma discriminação e uma enumeração precisa das diferentes subpopulações de células T humanas. O estudo do desequilíbrio entre as subpopulações permitiria o diagnóstico diferencial das doenças que provocam uma proliferação das células T. Ela poderia também ser o sinal de uma resposta imunitária específica contra um tecido particular patogénico como, por exemplo, um tumor. Em particular, sabe-se que anticorpos contra os antigenes CD4 e CD8i que distinguem entre duas populações de células T, são sinais de uma série de doenças imunitárias como a SIDA. Estes anticorpos deveriam poder ser obtidos facilmente e em grande quantidade. A Patente EP-A-0 340 793 descreve ADNs recombinados quiméricos cujos dois segmentos recombinados provêm ou não de duas espécies diferentes. Contudo, as quimeras obtidas a partir destes dois segmentos codificam domínios imunoglobulinas: um variável que codifica um segmento de imunoglobulina, o outro, constante, que codifica um segmento de TCR.

Choi, Y. et al. descreveram em Nature 346. páginas 471-473 (1990) ADNs que codificam TCR quiméricos compreendendo um segmento Vp humano ligado a um segmento Dp, Jp, Cp2 murino. O TCR quimérico assim formado, acoplado a uma cadeia α e associado ao CD3, foi expresso. Sugere-se que o processo descrito pode permitir a produção de anticorpos de rato específicos para os segmentos Vp ou Va do TCR humano. Todavia, o 1 processo descrito é específico para um dado tipo de construção contendo unicamente a porção \/β humana. Seria interessante poder utilizar um segmento 0β2 de origem murina para permitir a preparação de uma larga série de quimeras compreendendo diferentes porções V, J e D, particularmente humanas. O requerente descobriu novos ADNs recombinados que permitem a preparação de novos vectores de expressão eucariota, os quais são importantes agentes de transfecção de células eucariotas, sendo estas células transfectadas excelentes imunogenes que conduzem a anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais, dirigidos contra as diferentes cadeias de TCR humanos. É por isso que o presente pedido tem como objecto um ADN recombinado, caracterizado por compreender uma sequência nucleotídica quimérica que codifica uma cadeia do receptor do antigene de células T, sendo a referida sequência constituída por: - uma sequência proveniente de um mamífero que não murino, que codifica a totalidade da porção variável (V), diversidade (D) e de junção (J), - e uma sequência de origem murina, que codifica a porção complementar constante (C) ausente da sequência de mamífero acima referida, estando as duas sequências ligadas ao nível de um local de restrição natural ou criado artificialmente. Na descrição que se segue, designar-se-á este local por “local seleccionado”.

Por ADN recombinado entende-se uma sequência de nucleótidos criada artificialmente.

Por quimera entende-se que o ADN recombinado compreende pelo menos duas sequências de origens diferentes; por exemplo, 3, 4 ou 5 e, de preferência, 2 sequências de duas origens diferentes.

Estas sequências provêm de duas espécies diferentes, e a origem de uma delas é murina; a outra (ou as outras) derivará particularmente de um primata e, de preferência, do homem. 2 O receptor das células T é uma proteína heterodimérica composta por duas cadeias polipeptídicas ligadas através de uma ponte de dissulfureto. O receptor é expresso na superfície das células T em associação com o complexo CD3. O locus correspondente a uma cadeia particular do TCR compreende uma importante selecção de segmentos génicos distintos, incluindo numerosos segmentos V diferentes, vários segmentos J e um ou dois segmentos constantes C. Estes segmentos podem sofrer rearranjos somáticos durante a maturação tímica das células T, produzindo, assim, um gene único, que é transcrito e que contém segmentos V, segmentos J, um segmento C e, eventualmente, um segmento D entre os segmentos V e J.

No ADN recombinado quimérico acima descrito, a totalidade da sequência que codifica a porção C pode provir de um mamífero murino, e, neste caso, a sequência do outro mamífero não compreende qualquer nucleótido correspondente à porção C. De preferência, a sequência proveniente de um outro mamífero compreende uma pequena porção C, preferencialmente, inferior a 100 nucleótidos e, especialmente, cerca de 60 nucleótidos; devido a isto, só uma grande porção C da quimera provém do mamífero murino (sendo esta porção a porção complementar ausente da sequência do outro mamífero acima referida) e o resto provém do outro mamífero. As duas sequências de origens diferentes estão ligadas ao nível de um local de restrição seleccionado, em fase na grelha de leitura. A sequência do outro mamífero compreenderá necessariamente, além das porções V, J, eventualmente, D e uma porção de C, a totalidade da sequência principal. O local de restrição seleccionado pode estar naturalmente presente em cada uma das duas sequências ou naturalmente presente só numa delas, sendo o referido local de restrição criado artificialmente na outra sequência. O local de restrição acima referido deve ser único no segmento Cp murino e, de preferência, único no segmento do outro mamífero.

Quando o local de restrição seleccionado é criado artificialmente, ele pode ser produzido, por exemplo, por eliminação ou adição de nucleótidos ou, de preferência, por mutação de acordo com métodos conhecidos, especialmente por mutagénese dirigida. A alteração do ADN efectuada desta forma permite a introdução de um local de restrição normalmente ausente. Em particular, por mutagénese dirigida pode introduzir-se um local Bgl II, 3 naturalmente presente no ADN que codifica as regiões Cpi e Cp2 humanas, mas ausente do gene que codifica a cadeia do TCR do rato, no gene Οβ2 do rato, eventualmente por mutagénese através de polimerização em cadeia (PCR). A mutação permite conservar o máximo de homologia com a(s) sequência(s) de partida. O local de restrição assim criado será, de preferência, colocado ao nível de um local homólogo do local ao nível do qual o local de restrição está naturalmente presente no mamífero considerado, particularmente o homem, de forma a permitir a clivagem, com a ajuda da referida enzima, tanto da sequência murina, como da sequência do mamífero, para, em seguida, por ligação em fase na grelha de leitura, criar a quimera desejada. Pelo que foi dito anteriormente, compreende-se que, ao escolher uma dada enzima de restrição, deve estar presente, no máximo, um único local de restrição correspondente no segmento Cp murino e, de preferência, um único local no segmento do outro mamífero, além de que, ao nível da sequência que codifica a porção C, conduz a um local que permite a transcrição em fase de um ADN que codifica especialmente a cadeia do TCR. Num caso particularmente interessante, pode produzir-se todo um conjunto de genes que codificam uma porção C de um TCR murino ligada a numerosas porções V diferentes de TCR, particularmente humano.

Os ADNs recombinados preferidos, de acordo com a invenção, são caracterizados pelo local de restrição ser natural na sequência que codifica a porção C do mamífero.

As quimeras mais particularmente preferidas, de acordo com a invenção, possuem uma porção de mamífero, caracterizada pela sua sequência proveniente de um mamífero ser a sequência que codifica os segmentos Vp, Dp, ϋβ humanos, e uma curta porção Cp1 ou Cp2 até ao local único Bgl II de Cpi e Cp2. A porção murina das quimeras importantes, de acordo com a invenção, é caracterizada pelo local de restrição, especialmente Bgl II, ser artificialmente criado na cadeia de origem murina. O ADN recombinado, de acordo com a invenção, pode apresentar-se sob a forma de uma sequência nucleotídica de cadeia simples limitada às porções V, D, J e C acima referidas ou comportando outros nucleótidos, por exemplo, e particularmente, aqueles que constituem a sequência principal. 4 É desta forma que a sequência acima referida pode, em particular, ser incluída num vector de expressão e, neste caso, de preferência, num vector de expressão eucariota. A sequência acima referida pode igualmente ser incluída, tendo em vista a sua replicação, num outro vector, por exemplo, num plasmídeo, como e.g. BLUESCRIP. Como vector de expressão eucariota pode citar-se, muito particularmente, pHpPr1-Néo. Pode igualmente citar-se pHpPr1gpt e, de uma forma geral, qualquer vector de expressão eucariota que possua os sinais de regulação promotor e um sinal de poliadenilação que permita a expressão do ADNc. Evidentemente, a escolha do par vector-hospedeiro é da competência do perito.

Os ADNs recombinados mais particularmente preferidos, de acordo com a invenção, são caracterizados por se apresentarem sob a forma de um vector de expressão eucariota, o qual é, de preferência, derivado de ρΗβΡΓΐ-Néo. O ADN recombinado acima referido, particularmente sob a forma de vector de expressão eucariota, pode ser utilizado para transfectar a sequência que codifica o TCR num hospedeiro apropriado. As células hospedeiras assim transfectadas, eventualmente tratadas - por exemplo, previamente transfectadas com a cadeia CD3 Zeta para se obter uma melhor expressão - podem ser utilizadas como imunogene, de preferência, no rato.

Podem assim preparar-se anticorpos de uma forma clássica, especialmente anticorpos monoclonais, podendo fazer-se a triagem dos hibridomas, os quais foram obtidos a partir de células de mieloma e de células do baço dos ratos utilizados, através do reconhecimento da linha transfectada versus o não reconhecimento da linha de partida. É por isso que o presente pedido tem igualmente como objecto anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais, caracterizados por serem preparados por utilização de um ADN recombinado, como descrito acima.

Os anticorpos acima referidos apresentam propriedades notáveis, pois estão perfeitamente caracterizados no que diz respeito às cadeias de TCR e, particularmente, no que diz respeito às regiões variáveis V das cadeias de TCR, mas também relativamente às regiões D e J no seu rearranjo típico para um dado TCR. 5

Estes anticorpos são, por conseguinte, capazes de distinguir a população de células T humanas e, desta forma, reconhecer especificamente, por exemplo, uma dada doença ou deficiência.

Entre os anticorpos acima descritos preferem-se os anticorpos anti-porção variável, especialmente \/β, D e J, que apresentam propriedades notáveis para o diagnóstico e, ao mesmo tempo, para a terapia curativa ou preventiva de doenças auto-imunes, no homem ou no animal. É por isso que a presente invenção tem também como objecto as composições farmacêuticas caracterizadas por englobaram pelo menos um dos anticorpos, tal como definidos acima.

As composições farmacêuticas podem apresentar-se particularmente sob as formas parenterais, especialmente injectáveis, correntemente utilizadas em medicina humana; por exemplo, pela via subcutânea, intramuscular ou intravenosa.

Os anticorpos acima referidos podem igualmente ser utilizados para tratar as doenças imunes ou que provocam uma proliferação das células T, assim como as leucemias das células T, por injecção destes anticorpos.

Para este fim, os anticorpos podem ser acoplados a toxinas ou a produtos radioactivos, de acordo com métodos conhecidos.

Os anticorpos de acordo com a invenção encontram aplicação especialmente no tratamento de doenças imunes, tais como a artrite reumatóide, a diabetes, a doença de Sjõgren ou o lúpus eritematoso. A dose habitual no homem, variável de acordo com o produto utilizado, com o sujeito tratado e com a afecção em causa, pode ser, por exemplo, de 0,001 a 25 mg por dia e por kg de peso corporal de um anticorpo monoclonal, de acordo com a invenção, acoplado a ricina A como citotóxico e, de preferência, de 0,05 a 0,2 mg/kg/dia.

Dado que os anticorpos acima referidos, especialmente os anticorpos monoclonais, encontram também utilizações com fins diagnósticos, para a detecção, a identificação ou 6 a dosagem dos TCR ou de porções de TCR, a presente invenção tem igualmente como objecto a utilização dos referidos anticorpos, assim como as composições diagnósticas destinadas à detecção, à identificação ou à dosagem dos antigenes acima referidos.

Os anticorpos acima referidos encontram igualmente aplicação na purificação de produtos que englobam a porção antigénica correspondente às cadeias de TCR.

Os anticorpos acima referidos podem ser utilizados em citofluorimetria com fins diagnósticos e, com este objectivo, podem ser acoplados, através de métodos conhecidos, a marcadores fluorescentes, como o FITC ou a ficoeritrina.

Pode, por exemplo, detectar-se a presença de uma população de células T, descobrindo um segmento variável específico ao nível de tecidos que sofrem, por exemplo, de uma infecção, de um cancro ou de uma doença auto-imune e detectando a sua presença através de métodos conhecidos.

Podem igualmente marcar-se os anticorpos acima descritos com a ajuda de enzimas. Pode citar-se, por exemplo, a glucose-6-fosfato desidrogenase, a acetilcolinesterase, a glucose oxidase ou a beta-galactosidase.

Os anticorpos totais acima referidos podem igualmente ser acoplados a um marcador radioactivo, tal como o índio 111, para uso na obtenção de imagens das populações de células T que comportam uma região variável específica, ao nível das porções doentes do corpo humano. A presente invenção tem igualmente como objecto um processo de preparação dos ADNs recombinados acima descritos, caracterizado por se ligar: - uma sequência nucleotídica constituída pelo menos pela totalidade da sequência que codifica as porções V, D e J de uma cadeia do receptor do antigene de células T de um mamífero que não murino, até ao nível de um local de restrição, a - uma sequência nucleotídica de origem murina que compreende a porção complementar da porção C ausente da sequência da cadeia de mamífero acima referida, a partir do mesmo local de restrição que acima, 7 sendo o referido local de restrição criado artificialmente numa, na outra ou nas duas sequências, para se obter a quimera esperada; em seguida, se desejado, ligar uma sequência que compreende a totalidade das porções V, D, J e C acima referidas a um vector de expressão eucariota; depois, se desejado, isolar a nova quimera obtida.

Em condições preferenciais, o processo acima descrito é caracterizado, além disso, por se transfectar uma célula eucariota que comporta todos os elementos que permitem a síntese do receptor do antigene de células T, à excepção da cadeia homóloga da cadeia codificada pela sequência quimérica acima referida, se utilizarem estas células transfectadas como antigene na estirpe murina correspondente, se fundirem células do baço, pré-recolhidas em mamíferos murinos aos quais foi administrado o antigene, com células de mieloma para preparar, de acordo com métodos conhecidos, anticorpos dirigidos contra o produto da sequência variável do mamífero. O processo acima descrito pode ser particularmente efectuado como se segue: A sequência nucleotídica que codifica as porções V, D e J de uma cadeia do TCR de mamífero e, especialmente, um ADN linear de cadeia dupla comportando a sequência que codifica as porções V, J, eventualmente, D e, eventualmente, em parte C de uma cadeia de TCR de mamífero, além do seu gene principal, é obtida por clivagem com a ajuda de duas enzimas de restrição diferentes: a enzima correspondente ao local de restrição seleccionado ao nível da porção C, por exemplo, Bgl II, e uma outra enzima que corta a sequência do lado oposto, após o gene principal - por exemplo, Eco RI - a partir de uma sequência de ADN linear de cadeia dupla que comporta a referida sequência. O ADN obtido desta forma é ligado a um vector tratado com as mesmas duas enzimas de restrição, vector este que comporta a sequência que codifica o segmento C da cadeia de TCR e os mesmos locais de restrição que acima, por exemplo, Bgl II e Eco RI. Obtém-se, assim, o gene quimérico esperado. Este não pode, contudo, ser expresso tal qual. É por isso que, por um lado, o vector que comporta a quimera é tratado com duas enzimas de restrição que cortam dos dois lados do gene quimérico que codifica o TCR quimérico; e, por outro lado, se trata um vector de expressão eucariota com as mesmas duas enzimas de restrição. Por ligação do gene obtido acima, que codifica o TCR quimérico, ao referido vector de expressão eucariota, obtém-se um novo vector quimérico de expressão eucariota. O referido vector de expressão eucariota deve comportar os elementos 8 necessários para assegurar a transcrição correcta do gene quimérico que codifica o TCR. A este respeito, pode citar-se, por exemplo, o vector pHpPr1-Néo, que pode ser cortado com Bam Hl e Sal I e compreende o gene de resistência à neomicina, que é utilizado como marca de selecção, um gene promotor eucariota SV40 e um sinal de poliadenilação nas proximidades do local Bam Hl. O novo vector quimérico obtido é utilizado, de forma vantajosa, para transfectar células eucariotas, de preferência, células T de rato, especialmente linhas celulares que comportam todos os elementos para a expressão do TCR, à excepção do gene transportado pelo vector quimérico. Pode citar-se, por exemplo, a linha de rato DOIS 19 ou aquela de nome DS 23.27.4. Tais células permitem uma selecção fácil das células transfectadas que por si só são capazes de expressar o TCR na superfície da célula.

Claro que cada ligação (acima e abaixo referida) é seguida pela transfecção de um hospedeiro apropriado e pela selecção das células que contêm a quimera desejada.

As células transfectadas podem ser administradas como antigene, de preferência, a ratos, por exemplo, por injecção íntraperitoneal. Podem, assim, recolher-se células do baço de mamíferos murinos tratados desta forma - células capazes de segregar os anticorpos pesquisados - para as fundir com células imortais, como o mieloma. Os hibridomas seleccionados que produzem os anticorpos procurados permitem então a preparação de anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais, dirigidos contra uma cadeia V particular do TCR do mamífero seleccionado, especialmente o homem. O ADN de cadeia dupla que codifica a cadeia do receptor do antigene de células T de mamífero pode, por exemplo, ser preparado como se segue: O estudo da sequência de genes que codificam uma dada cadeia permite seleccionar um local de restrição já existente numa porção constante C ou criar esse local na referida sequência. O conhecimento destas sequências, por exemplo no que diz respeito às cadeias para as famílias Vp1, νβ2, Vp3, νβ4, Vp5, νβ6, νβ7, Vp8, νβ10, νβ11, νβ12, νβ15, \/β17, νβ18, permite a síntese de novos oligonucleótidos que podem ser utilizados para sintetizar o ADN complementar a partir do ARN mensageiro. A partir de linfócitos T de mamífero (por exemplo, seres humanos), purifica-se o ARNm que codifica uma dada cadeia de TCR. Sintetiza-se o ADN correspondente com a ajuda 9 de um oligonucleótido ΟΗΟβ específico para um dado gene de mamífero e contendo, eventualmente, o local de restrição único seleccionado; sintetiza-se a segunda cadeia do ADN a partir de um oligonucleótido específico para a cadeia e com a ajuda da transcriptase inversa e amplifica-se o gene obtido por reacções de polimerização em cadeia (PCR) efectuando, por exemplo, cerca de trinta ciclos.

Obtém-se, assim, uma grande quantidade de ADN linear codificante de cadeia dupla. Podem então cortar-se com as enzimas apropriadas, por exemplo, Bgl II e Eco RI, os fragmentos produzidos por PCR, de forma a eliminar toda ou parte da sequência que codifica a porção C, a partir do local seleccionado e de maneira a conservar as sequências V, D e J, assim como a totalidade do gene principal. A sequência nucleotídica de origem murina que compreende a porção complementar da porção C ausente da sequência da cadeia de mamífero acima referida, no caso em que aquela se encontra sob a forma de um vector que comporta a referida sequência, pode ser preparada como se segue: A partir de um banco de ADNc proveniente de uma linha celular murina, por exemplo, KB5C20, isola-se um ADNc completo contendo toda a porção codificante da cadeia do TCR escolhido com a ajuda de uma sonda conhecida; efectua-se a clonagem deste ADNc num plasmídeo apropriado, por exemplo pUC19, e depois transfecta-se o plasmídeo resultante, denominado neste caso pUCmCp2, num hospedeiro, por exemplo a estirpe bacteriana DH1 de E. coli.

Poderá, em seguida, clonar-se o fragmento interessante de ADN murino num fago. Para isso, pode digerir-se o pUCmCp2 com enzimas de restrição apropriadas, por exemplo Eco RI e Hind III, de forma a obter, no caso acima referido, três fragmentos. Purifica-se o fragmento que contém toda a sequência codificante da cadeia C murina desejada (no caso das enzimas previamente citadas, Eco RI corta na porção V da sequência). Obtém-se, desta forma, uma sequência que codifica uma parte da porção V, assim como a totalidade das porções D, J e C. Liga-se, em seguida, a referida sequência a um fago apropriado, por exemplo M13mp18, com as mesmas enzimas de restrição. Neste caso, o ADN fágico existe sob duas formas: cadeia simples para o fago encapsulado e cadeia dupla para a sua forma replicativa. Hibrida-se um oligonucleótido complementar da região a mutar, à excepção da mutação desejada, com a forma em cadeia simples do fago. A 10 cadeia complementar é sintetizada in vitro através de uma ADN polimerase, utilizando o mesmo oligonucleótido para iniciar a reacção. Fecha-se a nova cadeia sobre si mesma, com a ajuda de uma ligase. A cadeia dupla completamente homóloga é então transfectada, por exemplo, em E. coli, especialmente JM101. As colónias mutantes são seleccionadas, por exemplo, por hibridação com um oligonucleótido marcado radioactivamente.

Para os detalhes relativamente à mutagénese dirigida, consultar Maniatis et al. (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press).

Purifica-se o ADN de cadeia dupla de um subclone que comporta a mutação desejada e no qual o resto da sequência que codifica a porção C permaneceu íntegra, e corta-se com enzimas apropriadas, por exemplo, Eco RI e Eco RV, para isolar o fragmento que transporta o gene desejado. Liga-se então este fragmento a um plasmídeo adaptado, que seja possível de sequenciar, comporte locais de restrição que permitam extrair facilmente a sequência inserida para a introduzir num vector de expressão e que tenha sido previamente aberto através de enzimas compatíveis presentes no seu local de restrição múltiplo, por exemplo Eco RI e Sma I. Como de costume, o produto de ligação pode então ser transfectado num hospedeiro apropriado, por exemplo, uma estirpe bacteriana E. coli DH1. Efectuando a análise, por exemplo, através de corte com dois pares de enzimas, tal como Eco Rl-Xba I e Eco Rl-Bgl II, pode seleccionar-se um clone que forneça as bandas esperadas por meio de electroforese. O plasmídeo purificado compreende a sequência nucleotídica de origem murina esperada, complementar da porção C ausente da sequência da cadeia de mamífero acima referida, a partir do mesmo local de restrição, de forma a permitir a ligação em fase na grelha de leitura.

Do que precede entende-se que o processo da presente invenção permite uma preparação fácil de painéis de anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais, específicos para diferentes estruturas da porção V das cadeias do TCR, a partir de um número muito limitado de segmentos de origem murina. 11

Com efeito, o referido segmento murino que codifica a porção C compreende, por modificação, um local de restrição que está presente na quase totalidade das cadeias constantes de origem humana, por exemplo, Bgl II para as cadeias humanas Cpi e Cp2.

As diferentes técnicas utilizadas acima são bem conhecidas dos peritos e foram objecto de numerosas publicações que fazem parte do estado da técnica.

Os exemplos que se seguem ilustram a presente invenção sem, contudo, a limitar. A Figura 1 representa comparações dos ADNc de cadeias Cp2 de rato e de cadeias Cp1 humanas de TCR. A Figura 2 representa um oligonucleótido complementar do ADNc que codifica a cadeia Cp2 do TCR murino, excepto ao nível das duas bases necessárias para introduzir o local Bgl II. A Figura 3 representa oligonucleótidos específicos para as cadeias Cpi e Cp2 de TCR humanos. A Figura 4 representa os perfis de citometria de fluxo de transfectantes de DOIS 19 (perfis negros) obtidos com dois ADNs quiméricos contendo Vp8 humanos (quadros superiores: à esquerda FRN8.1.2, à direita MZ3 DC8) e Vp2 humanos (quadros inferiores: à esquerda FRN2.7.3, à direita FRN2.7.6), relativamente à linha de partida DOIS 19 (perfis brancos); as células são marcadas com um anticorpo anti-CD3 de rato. A Figura 5 mostra a análise da linha Jurkatt com um anticorpo distinto, o sobrenadante de E83C11.20 e o anticorpo monoclonal anti-CD3 humano da Immunotech.

PARTE EXPERIMENTAL EXEMPLO 1

Tira-se partido da existência de um local Bgl II no gene que codifica as cadeias p1 e P2 do TCR na sua região C, nas proximidades da região J, e da existência de um local idêntico, à excepção de duas bases, na porção homóloga do rato (ver Figura 1). 12 A) Preparação da sequência nucleotídica de origem murina que compreende a porção complementar da porção C ausente da sequência humana de uma cadeia β2, sob a forma de um vector que comporta a referida sequência. 1. Cadeia CB2 murina A sequência da cadeia Οβ2 murina está descrita em detalhe em Malissen, M. et al. (1984) Cell 37: 1101-1110. Obteve-se um ADNc completo contendo toda a porção codificante de Cp2, a partir de um banco de ADNc da linha celular murina KB5C20 (descrita em Albert et al. (1982) Immunogenetics 16: 533-549). Este ADNc foi clonado no plasmídeo pUC19. O plasmídeo resultante pUCmCp2 foi transfectado na estirpe bacteriana DH1. A bactéria recombinante foi depositada junto da Colecção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em Paris, em 12 de Fevereiro de 1991, sob o número 1-1032, e está disponível sem restrições. 2. Mutagénese dirigida do ADNc codificante da cadeia CB2 murina

Princípio: O procedimento de mutagénese dirigida escolhido utiliza o fago filamentoso M13mp18 da BIORAD. Este bacteriófago está descrito com precisão em Norrander et al. (1983) Gene 26: 101-106. Ele está disponível comercialmente através de vários fabricantes, particularmente através da BIORAD. O princípio da manipulação é o seguinte:

Clona-se o fragmento de ADN a modificar no local de restrição múltiplo do fago. Este vector fágico existe sob duas formas durante o seu ciclo de vida. A forma replicativa, na bactéria, é essencialmente de cadeia dupla; a forma encapsulada é de cadeia simples. O ADN das duas formas é purificável. Um oligonucleótido complementar da região a mutar, à excepção da mutação desejada, é hibridado com a forma em cadeia simples do fago. A cadeia complementar é, em seguida, sintetizada in vitro por meio de uma ADN polimerase, utilizando o oligonucleótido que comporta a mutação desejada para iniciar a reacção. Usa-se uma ligase para fechar a nova cadeia sobre si mesma, na extremidade 5’ do oligonucleótido. A cadeia dupla completamente homóloga, à excepção da mutação desejada, é transfectada em E. coli, resultando em duas classes de colónias mutantes e não mutantes. As colónias mutantes são, em seguida, seleccionadas. 13

Para introduzir o local Bgl II no ADNc da cadeia Cp2 de rato, clona-se este ADNc no fago M13mp18. Utiliza-se o oligonucleótido da figura 2 para efectuar a mutagénese. Este oligonucleótido é complementar do ADNc que codifica o gene Cp2 murino, à excepção das duas bases necessárias para introduzir o local Bgl II. Estas duas bases estão sublinhadas na figura 2.

Os procedimentos de clonagem, transfecção, distribuição, análises das colónias e purificação das formas em cadeia simples e dupla do fago M13mp18 são descritas, de forma precisa, por Maniatis et al. (já citado). O hospedeiro bacteriano utilizado é a estirpe JM101 d eE.coli.

Experimentação: a) Clonagem de CB2 murino em M13mp18.

Digere-se o plasmídeo pUCmCp2 com Eco RI e Hind III. Esta digestão fornece 3 fragmentos que se distinguem por meio de electroforese em gel de agarose. Purifica-se o fragmento intermediário com cerca de 1000 pares de bases (pb) que contém toda a sequência codificante de Οβ2 murino. Este fragmento é ligado ao ADN de cadeia dupla do fago M13mp18 previamente aberto com Eco RI e Hind III, os quais são locais presentes no local de restrição múltipla deste vector. Transfectam-se então colónias de E. coli JM101.

Da análise das colónias isoladas, retém-se o clone Μ13ΕΗΟβ7 e, em seguida, purifica-se a forma em cadeia simples de Μ13ΕΗΟβ7. b) Mutagénese de CB2 de rato O procedimento utilizado está descrito, de forma precisa, em Maniatis et al.. Devem, no entanto, ressalvar-se os seguintes pontos: O oligonucleótido da figura 2 é sintetizado no aparelho Applied Biosystems 380B e, em seguida, purificado em coluna sep Pak C18. 14

Hibridam-se 0,2 μg da cadeia simples de Μ13ΕΗΟβ7 com 3 pmole de OhCp cinase. Não se utiliza qualquer outro oligonucleótido. A temperatura inicial da reacção de hibridação é de 70°C. A polimerase utilizada é a T4 ADN polimerase (1 unidade por reacção) para completar em cadeia dupla. A transfecção é efectuada na estirpe E coli JM101. A selecção das colónias mutantes faz-se por hibridaçao com o oligonucleótido da figura 2 marcado radioactivamente. A temperatura de hibridação é de 42°C. Duas lavagens de 10 min, a 4°C, foram suficientes para discriminar as colónias mutantes por auto-radiografia. O ADN de um subclone de uma colónia identitificada por hibridação radioactiva, denominado muCp215, foi digerido com Bgl II e, em seguida, sequenciado pelo método de Sanger para confirmação da mutação desejada e integridade do resto da sequência Cp2 murina. O ADN em cadeia dupla deste subclone foi purificado e utilizado no resto das experiências. 3 Subclonagem da cadeia mutada em p Bluescript SK* p Bluescript SK+ é um plasmídeo totalmente caracterizado e disponível comercialmente através da companhia STRATAGENE. O ADN de cadeia dupla de muCp215 é cortado com Eco RI e Eco RV, e o mais pequeno dos dois fragmentos é purificado em gel de agarose. Este fragmento é ligado ao p Bluescript previamente aberto com Eco RI e Sma I, dois locais presentes no “polylinker” deste plasmídeo, e transfectado na estirpe de E. coli DH1, que serve de hospedeiro à quimera. As colónias isoladas são analisadas por corte com dois pares de enzimas: Eco Rl-Xba I e Eco Rl-Bgl II. Um clone denominado pBSmuCp215 fornece as bandas esperadas (cerca de 1,2 kb e 0,5 kb, respectivamente) por meio de electroforese. Este plasmídeo foi purificado e utilizado no resto das experiências.

B) Obtenção de ADNc humano codificando a cadeia do TCR 15 A técnica de polimerização em cadeia (PCR) é escolhida pelas razões citadas a seguir: - estão publicados muitos genes que codificam a cadeia do TCR, incluindo diferentes regiões V, - rapidez de obtenção de ADNc por esta técnica, - certeza de ter genes completos na extremidade 5’, compreendendo o codão ATG de iniciação, - facilidade de integrar locais de restrição na extremidade 5’ do gene para facilitar a clonagem.

No exemplo preferido, e para mostrar a polivalência permitida pela invenção, isolaram-se vários ADNc humanos contendo diferentes segmentos variáveis e acoplaram-se à cadeia mutada Cp2 de rato. - Obtenção de ARNm de células T humanas

Utiliza-se uma mistura de linfócitos periféricos de indivíduos caucasianos, obtidos junto do Centro de Transfusão Sanguínea de Marselha. Após Ficoll, os linfócitos são ajustados a 1 milhão de células por mililitro em meio RPMI, 10% soro fetal de vitelo, 20 mM glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 500 IU penicilina, e estimulados com fitohemaglutinina A (10 μg/mililitro de concentração final), durante 3 dias. Utilizam-se 200 milhões de células para purificação do seu ARN total. O protocolo utilizado está descrito, de forma exacta, em Maniatis et al.. Obtêm-se cerca de 50 μ9 de ARN por este método.

- Reaccão de PCR

Um oligonucleótido OhCp, que é específico para as duas cadeias humanas Οβ2 e Cpi e contém o local único Bgl II presente nos segmentos génicos ΰβ1 e Cp2, é sintetizado de forma análoga a OmCfr

Sintetizam-se igualmente cinco oligonucleótidos - OL1, OL2, OL3, OL8, OL12 -específicos para as sequências principais Ν/β1.2, νβ2.1, νβ3.1, νβ8.1, νβ12.3, 16 respectivamente, segundo a definição das subfamílias νβ de Toyonaga et al. (1987) EurJ ImmunolW: 375-383.

Estes oligonucleótidos possuem na extremidade 5' as 8 bases TAGAATTC que não hibridam com as sequências principais das regiões variáveis. Estas 8 bases contêm o local Eco RI para facilitar a clonagem dos produtos de amplificação.

Estes oligonucleótidos estão representados na figura 3.

Foram efectuadas cinco reacções independentes de PCR, utilizando os pares de oligonucleótidos OhCp-OLi, onde i é um elemento de (1, 2, 3, 8, 12). Nós começámos com o par OhCp*OL8. O procedimento experimental está descrito em detalhe em Kawasaki et al. (1989) PCR Technology, Principies and Applications for DNA Amplification, Stockton Press, Henry A. Ehrlich Edition, pp 89 e seguintes. Os pormenores que se seguem são úteis: A quantidade de ARN de partida é de 1 μg para a síntese da cadeia complementar de ADNc.

Para a reacção de PCR propriamente dita, utilizam-se 10 pmole de cada oligonucleótido OL8 e OhCp. O ciclo de PCR é: -1 min de desnaturação a 95°C, -1 min de hibridação a 52°C,

-1 mn de extensão a 72°C e efectuam-se 30 ciclos no DNA Thermalcycler, Version 2.2 da Perkin Elmer. O produto da reacção é depositado em gel de agarose a 1,4% para electroforese. Após coloração com brometo de etídeo, corta-se uma banda distinta com cerca de 500 pb e o ADN é electroeluído. Obtêm-se cerca de 30 ng de ADN.

Amplifica-se uma segunda vez 1 ng deste ADN por PCR. Purifica-se a banda específica da mesma forma que anteriormente e obtêm-se 300 ng de ADN. 17

As reacções de PCR com os pares OL1, OL2, OL3, OL12 associados, respectivamente, a OhCp foram efectuadas da mesma forma, exceptuando no caso de OL12 e OL3 onde a segunda amplificação não foi necessária (obtiveram-se mais de 100 ng na primeira amplificação). C) Construção dos genes quiméricos Princípio:

Constroem-se os genes quiméricos clonando cada fragmento produzido por PCR e cortado com Eco RI e Bgl II no fragmento extenso obtido com a digestão de pBSmuCp215.

Corta-se o pBSmuCp215 com Eco RI e Bgl II, e o fragmento extenso denominado FpBSmuCp215 é purificado em gel de agarose e electroeluído.

Com Eco RI e Bgl II, cortam-se 100 ng do produto de amplificação obtido com os oligonucleótidos OL8 -OhCp.

Ligam-se estes dois fragmentos e o produto de ligação é transfectado em DH1. A análise de colónias isoladas BSGp8.1, BSGP8.2 ... BSGp8.5, por corte com Bgl ll-Eco RI, fornece o fragmento esperado com cerca de 500 pb. BSGP8.1 é sequenciado entre o local Eco RI e o local Bgl II. A análise da sequência mostra uma semelhança total com a sequência publicada para Vp8.1 de Yoshikai, Y. et ai (1984) Nature 312: 521-524.

Do mesmo modo, efectua-se a clonagem dos produtos de PCR obtidos com os pares de oligonucleótidos contendo OL1, OL2, OL3, OL12 em FpBSCp215.

Obtém-se, relativamente à definição das diferentes subfamílias Vp de Toyonaga et al. (1987) Eur. J. Immunol. 17: 375-383: . com OL1, os clones BSGpi .2 e BSGpi.3 cuja sequência para a região V é idêntica a Vp1.2. 18 . com OL2, os clones BSGP2.5 cuja sequência para a região V corresponde a νβ2.2, e Βδθβ2.7 e Β8Θβ2.11 que possuem o gene νβ2.3. . com OL12, os clones ΒδΘβ12.1 e ΒδΟβ12.4 que possuem o gene \/β12.3. EXEMPLO 2: Expressão dos genes quiméricos

Princípio: A cadeia do TCR é uma proteína membranar que é expressa na superfície se, e unicamente se, as outras cadeias do complexo do TCR que lhe estão associadas (isto é, a cadeia α e o complexo CD3) estiverem presentes.

Para se obter a expressão dos genes quiméricos anteriormente construídos, utiliza-se a linha celular murina DOIS 19 desenvolvida por Letourneur, F. et al. (1989) Eur. J. Immunol. 19: 2269-2274. DOIS 19 é um mutante de um hibridoma T de rato que possui todos os componentes do TCR, excepto a cadeia β. Esta linha não exprime pois TCR na sua superfície. A transfecção de uma cadeia exógena induz a expressão de um receptor funcional nas células transfectadas. Dois genes quiméricos da invenção, contidos em ΒδΘβδ.Ι e ΒδΘβ2.7, foram transfectados nesta célula, seguindo os protocolos descritos a seguir: 1) Subclonaqem dos genes quiméricos num vector de expressão eucariota Princípio: O vector de expressão escolhido é o plasmídeo ρΗβΡΜ-néo. Ele está descrito de forma precisa em Gunning, P. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 4831-4835. O gene a expressar é subclonado a jusante do promotor β actina e a montante de um local de poliadenilação presente neste plasmídeo. Estes dois sinais asseguram a síntese de um ARN mensageiro funcional do gene inserido. Por outro lado, este plasmídeo possui o gene de resistência à neomicina que confere resistência a uma série de antibióticos - no caso do exemplo preferido, o antibiótico G418 - às células que integraram o plasmídeo. 19

Por outro lado, estão igualmente presentes uma origem de replicação e um gene de resistência à ampicilina, que permitem a selecção e a replicação em E. coli. A estirpe de E. coli aqui utilizada é MC 1061.

Experimentação:

Corta-se o plasmídeo BSGP8.1 com as enzimas Bam Hl e Sal I e purifica-se o menor dos dois fragmentos (1,2 kb) em gel de agarose. Este fragmento que comporta a totalidade da sequência codificante do gene quimérico é ligado ao plasmídeo ρΗβΡΜ-ηέο, previamente aberto com Bam Hl e Sal I. O produto de ligação é transfectado em E. coli MC 1061 e, da análise de colónias isoladas por corte com Bam Hl e Sal I, conserva-se o clone denominado néo-Gp8.1, que fornece o fragmento esperado com 1,2 kb por meio de electroforese em gel de agarose.

Da mesma forma, o gene quimérico contido em pBSGp2.7 é subclonado em pHpPr1-néo, conservando-se o clone denominado néo-Gp2.7. Néo- Gp8.1 foi depositado na CNCM em 12 de Fevereiro de 1991, sob o n.° 1-1033. 2. Transfeccão dos genes quiméricos em DOIS 19 O procedimento de transfecção escolhido é a fusão de protoplastos.

Segue-se passo a passo o protocolo descrito por Malissen et ai. (ref. “Technique de transfert de gènes dans les cellules eucaryotes”, 1990, Editions INSERM, Paris, 25-31), exceptuando pelo facto da concentração de G418 no meio selectivo ser de 3 mg/ml com os clones néo-Gp8.1 e néo-Gp2.7. 4. Análise dos transfectantes

Para néo-Gp8.1, as colónias resistentes à neomicina, denominadas FRN8.1.1 .... FRN8.1.24, são analisadas por citometria de fluxo. Para cada clone, colocam-se 105 células numa solução de Dubelco Modified Eagle Médium (DMEM) com 4% de soro fetal de vitelo (SFV), 0,02% azida de sódio e 15 μg/ml anticorpos anti-CD3 de rato (anticorpos 2C11 descritos em Leo et ai. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 1374) sob agitação 20 durante 45 min, a 4°C. Após três lavagens com DMEM, 4% SFV, 0,02% azida de sódio, incubam-se as células com um anticorpo policlonal de cabra anti-imunoglobulina do baço marcado com FITC (reagente da Immunotech) numa concentração de 15 pg/ml em DMEM, 4% SFV, 0,02% azida durante 30 min, a 4°C, sob agitação. Após três lavagens com DMEM, 4% SFV, 0,02% azida de sódio, as células são fixas em PBS com 1% de formaldeído e analisadas no aparelho de citometria de fluxo FACSCAN de Becton Dickinson. Tratam-se 105 células DOIS 19 da mesma forma, que servem de controlo negativo. O perfil obtido para o clone FRN8.1.2 está apresentado na figura 4 em comparação com o perfil de DOIS 19.

Procede-se da mesma forma com o plasmídeo néo-Gp2.7, e o perfil obtido no FACSCAN do clone FRN2.7.3 está apresentado na figura 4 em comparação com o de DOIS 19. As duas linhas celulares são guardadas para a imunização de ratos Balb/c. 5. Imunização de ratos Balb/c

Três ratos Balb/c são imunizados com FRN8.1.2. O protocolo de imunização é o seguinte: - Dia 0: 10 milhões de células FRN8.1.2 injectados por via intraperitoneal. - Dia 20: 10 milhões de células FRN8.1.2 injectados por via intraperitoneal. - Dia 40: 5 milhões de células injectados por via intravenosa. - Dia 43: Recolha dos baços para fusão. 6. Fusão por hibridacão linfocitária

Fundem-se os esplenócitos de dois ratos imunizados com o mieloma X63Ag258, seguindo o protocolo descrito por Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495-497. A análise dos sobrenadantes dos clones resultantes da fusão faz-se por citometria de fluxo de FRN8.1.2 versus DOIS 19. Recolhem-se 100 μΙ do sobrenadante de cada clone: 50 μΙ são incubados com 50 μΙ de DMEM, 4% SFV, 0,02% azida contendo 10* células FRN8.1.2, e os restantes 50 μΙ são incubados com 50 μΙ do mesmo meio, mas contendo 21 105 células DOIS 19. O protocolo é o mesmo que aquele utilizado para a análise dos transfectantes.

Dos 400 sobrenadantes testados, dois sobrenadantes assinalam FRN8.1.2 e não assinalam DOIS 19. Os dois monoclonais correspondentes reagem pois com uma cadeia do complexo quimérico do TCR contendo a cadeia humana νβ8.1. O clone E83C11.20 não assinala a linha FRN2.7.3, assegurando que este monoclonal não reconhece os componentes de rato do TCR quimérico. O clone E93C11.20, em compensação, assinala a linha humana Jurkatt que expressa a cadeia νβ8.1 (Yoshikai et al. (1984) Nature 312: 521-524). A figura 5 mostra a análise da linha Jurkatt com um anticorpo diferente, o sobrenadante de E83C11.20 e o monoclonal anti-CD3 humano da Immunotech.

Destas análises conclui-se que o monoclonal E83C11.20 é específico para uma cadeia humana νβ8.1. EXEMPLO 3

Preparou-se uma preparação injectável compreendendo: - Anticorpos monoclonais do exemplo 2 - Água para preparações injectáveis 5 mg 1 ml

Lisboa, '31JUL. 2000 Por IMMUNOTECH S.A.

Agente Oficial da Propriedade Industriai ArcodaCenceigão» 3e K-1100 LISBOA 22

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1. ADN recombinado caracterizado por compreender uma sequência nucleotídica quimérica que codifica uma cadeia do receptor do antigene de células T, sendo a referida sequência constituída por: - uma sequência proveniente de um mamífero que não murino que codifica a totalidade da porção variável (V), diversidade (D) e de junção (J), - e uma sequência de origem murina que codifica a porção complementar constante (C) ausente da sequência de mamífero acima, estando as duas sequências ligadas ao nível de um local de restrição natural ou criado artificialmente.
2. 2. ADN recombinado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo local de restrição ser natural na sequência que codifica a porção C.
3. 3. ADN recombinado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pela sequência proveniente de um mamífero ser a sequência que codifica uma cadeia Vp de origem humana e pelo local de restrição ser Bgl II.
4. 4. ADN recombinado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo local de restrição ser artificialmente criado na cadeia de origem murina.
5. 5. ADN recombinado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se tratar de um vector de expressão eucariota.
6. 6. ADN recombinado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo vector de expressão eucariota ser um plasmídeo que deriva de PhpPr1-Néo.
7. 7. ADN recombinado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela porção variável (V) ser de origem humana e ser escolhida entre Vp1, Vp2, Vp3, Vp4, Vp5, Vp6, Υβ7, Vp8, Vp10, Vp11, Vp12, Vpi5, Vp17 e Vp18. 1
8. 8. ADN recombinado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela porção variável (V) ser Ν/β2.
9. 9. ADN recombinado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela porção variável ser νβ17.
10. 10. Processo de preparação de anticorpos que compreende a expressão de hibridomas preparados por fusão linfocitária a partir de células do baços de ratos imunizados com a ajuda de um antigene contendo uma proteína, caracterizado pela referida proteína ser codificada por um ADN recombinado, tal como definido em qualquer uma das reivindicação 1 a 9.
11. 11. Composições farmacêuticas caracterizadas por englobarem anticorpos preparados de acordo com o processo da reivindicação 10.
12. 12. Produtos de diagnóstico caracterizados por englobarem anticorpos preparados de acordo com o processo da reivindicação 10.
13. 13. Processo de preparação de um ADN recombinado, tal como definido na reivindicação 1, caracterizado por se ligar: - uma sequência nucleotídica constituída pelo menos pela totalidade da sequência que codifica as porções V, D e J de uma cadeia do receptor do antigene de células T de um mamífero que não murino, até ao nível de um local de restrição, a - uma sequência nucleotídica de origem murina que compreende a porção complementar da porção C ausente da sequência da cadeia de mamífero acima, a partir do mesmo local de restrição que acima, sendo o referido local de restrição artificialmente criado numa, na outra ou nas duas sequências, para se obter a quimera esperada; em seguida, se desejado, ligar uma sequência compreendendo a totalidade das porções V, D, J e C acima referidas a um vector de expressão eucariota; e depois, se desejado, isolar a nova quimera obtida. 2
14. 14. Processo de preparação de anticorpos de acordo com a reivindicação 10 que comporta uma etapa de preparação do ADN recombinado definido na reivindicação 5, caracterizado por, além disso, se transfectar uma célula eucariota que comporta todos os elementos que permitem a síntese do receptor do antigene de células T, à excepção da cadeia homóloga da cadeia codificada pela sequência de ADN quimérico acima referida; se utilizarem estas células transfectadas como antigene na raça murina correspondente; se fundirem células do baço, recolhidas em mamíferos murinos aos quais foi administrado o antigene, com células de mieloma para preparar, de acordo com métodos conhecidos, anticorpos dirigidos contra o produto da sequência variável do mamífero.
15. 15. Anticorpos anti-cadeia Vp2 do receptor de células T humanas.
16. 16. Anticorpos anti-cadeia Vp17 do receptor de células T humanas. Lisboa, 31 JUL 2000 Por IMMUNOTECH S.A.

    Agente Oficial da Propriedade Industriai ÁfeodaSeireeififiOi 3« 1S -1100 USBQA 3

    RESUMO MOLÉCULAS DE ADN RECOMBINADO QUE CODIFICA UMA CADEIA DO RECEPTOR DO ANTIGENE DE CÉLULAS T, PROCESSO DE PREPARAÇÃO, ANTICORPOS E MEDICAMENTOS ENGLOBANDO-OS ADN recombinado compreendendo uma sequência nucleotídica quimérica que codifica uma cadeia do receptor do antigene de células T, sendo a referida sequência constituída por: - uma sequência proveniente de um mamífero que codifica a totalidade da porção variável (V), diversidade (D) e de junção (J), - e uma sequência de origem murina que codifica a porção complementar constante (C) ausente da sequência de mamífero acima referida, estando as duas sequências ligadas ao nível de um local de restrição natural ou criado artificialmente; anticorpos obtidos por utilização dos referidos ADNs, composições farmacêuticas e produtos de diagnóstico englobando-os e seu processo de preparação.