CN100523189C - 新型人免疫细胞抑制性受体klrl1的功能及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种免疫细胞抑制性受体。本发明提供编码此蛋白分子的多核苷酸和经重组技术产生这种蛋白分子的方法。本发明还公开了编码这种新型免疫细胞抑制性受体的多核苷酸的用途。本发明的蛋白质分子是一种免疫细胞抑制性受体,对于NK细胞和单核巨噬细胞的免疫调节功能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域,具体地说,本发明涉及新的编码人免疫细胞抑制性受体(C lectin-like molecule,简称为“KLRL1”)的多核苷酸,以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及人免疫细胞抑制性受体KLRL1单克隆抗体的制备及表型分析。KLRL1对于NK细胞和单核巨噬细胞的有免疫调节功能。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer,NK)无需抗原预先作用就可直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞,因为具备此功能特点,NK细胞在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用。NK细胞表面分布杀伤活化受体和杀伤抑制受体,通过两种受体的相互作用确保NK细胞既能杀伤病毒感染的细胞和突变肿瘤细胞,又能保护宿主自身正常细胞免遭破坏。NK细胞表面杀伤抑制受体与靶细胞表面组织相容性复合体I类分子(MHCI类分子)结合,可产生杀伤抑制信号,能阻断杀伤信号的传递。对于宿主自身组织细胞,因MHCI类分子表达正常使杀伤抑制受体介导的抑制作用占主导地位,表现为NK细胞失活;对于病毒感染的细胞和肿瘤细胞,由于MHCI类分子表达减少或缺失而影响杀伤抑制受体与相应配体的结合,从而使杀伤活化受体的作用占主导地位,表现为NK细胞活化并产生杀伤作用。NK细胞是机体天然免疫系统的重要组成部分,在机体抗病毒感染和抗肿瘤免疫中,NK细胞和CTL细胞作为最主要的效应细胞担负重要的作用。因此,对如何提高NK细胞杀伤靶细胞的效应和精确调控其靶向性的探索一直是研究抗病毒感染和抗肿瘤免疫治疗的热点,NK细胞作为免疫杀伤效应的第一道防线在机体肿瘤发生的早期承担最主要的抗肿瘤任务,也就是说,机体NK细胞的杀伤活性直接影响肿瘤的早期治疗和预后。随着一系列NK细胞表面抑制性受体和活化性受体的发现,通过精确调节NK细胞表面受体提高NK细胞杀伤效应和成为抗肿瘤免疫治疗的新策略。因此,NK细胞抑制性受体的结构与功能的深入研究必然为抗肿瘤免疫治疗研究开辟新的途径,同时,也为抗病毒感染的免疫治疗提供新的思路。
近年来研究表明,人类NK细胞表面抑制性受体可以分为三个家族:第一个家族为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer Ig-like Receptors KIR),在结构上为胞外段有二到三个免疫球蛋白样结构域的一型膜蛋白受体,配体为人类白细胞抗原I类分子(HLAI类分子);第二个家族为免疫球蛋白样转录产物(ILT);第三个家族为杀伤细胞凝集素样受体(Killer cell Lectin-like Receptors KLR),所有成员定位于人12号染色体的NK复合体(NKC),其中功能已明确为抑制性受体的分子是MAFA-L,CD94-NKG2A,Ly49a,Ly49c,Ly49e和Ly49g。免疫抑制性受体的结构特点为胞内段含有一个或多个免疫受体酪氨酸相关的抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs ITIM),ITIM是由6个氨基酸组成的保守序列(I/L/VXYXXL/V,X代表任一氨基酸)。当免疫抑制性受体与相应配体偶联时,ITIM发生酪氨酸磷酸化,然后与SHP1蛋白酪氨酸磷酸酶或/和SPIP肌醇磷酸酶的结合,产生细胞活化的负调节效应。
由于免疫抑制性受体在细胞活性调节中发挥重要作用,尤其近年来发现这一类分子在杀伤性T淋巴细胞和树突状细胞(Dendritic cells,DC)表面均有表达,使其具有重要的理论探索意义和广阔的临床应用前景,是当前免疫学、细胞与分子生物学和肿瘤学等领域的热门课题。
研究已表明,免疫过程与许多疾病相关,因此,本领域迫切需要开发与免疫有关的相关物质。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的人免疫细胞抑制性受体KLRL1蛋白以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面,提供新颖的分离出的KLRL1多肽,它包括:具有SEQ IDNO:2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地,该多肽选自下组:
(a)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽;
(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,且具有对于NK细胞和单核巨噬细胞的免疫调节功能的由(a)衍生的多肽;
(c)由(a)所述多肽、或其N端第1-95氨基酸构成的片段、或第132-265个氨基酸构成的片段与Fc片段或BGR构成的融合蛋白,该融合蛋白具有对于NK细胞和单核巨噬细胞的免疫调节功能。
更佳地,该多肽是具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面,提供编码分离的这些多肽的多核苷酸,该多核苷酸包含一核苷酸序列,该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70%相同性:(a)编码上述人KLRL1多肽的多核苷酸;和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地,该多核苷酸编码具有SEQ ID NO:2或3所示氨基酸序列的多肽。更佳地,该多核苷酸的序列是选自下组的一种:(a)具有SEQ ID NO:1中170-967位的序列;(b)具有SEQ ID NO:1中1-1566位的序列。
在本发明的第三方面,提供了含有上述多核苷酸的载体,以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面,提供了制备具有人KLRL1蛋白活性的多肽的方法,该方法包含:(a)在适合表达人KLRL1蛋白的条件下,培养上述被转化或转导的宿主细胞;(b)从培养物中分离出具有人KLRL1蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面,提供了与上述的人KLRL1多肽特异性结合的抗体。
在本发明的第六方面,提供了模拟、促进、拮抗人KLRL1多肽活性的化合物,以及抑制人KLRL1多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地,该化合物是人KLRL1多肽的编码序列或其片段的反义序列。
在本发明的第七方面,提供了检测样品中是否存在KLRL1蛋白的方法,它包括:将样品与KLRL1蛋白的特异性抗体接触,观察是否形成抗体复合物,形成了抗体复合物就表示样品中存在KLRL1蛋白。
在本发明的第八方面,提供了一种检测与人KLRL1多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法,该方法包括:检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。
在本发明的第九方面,提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人KLRL1多肽活性的激动剂,或者筛选抑制人KLRL1多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人KLRL1蛋白的编码序列或其片段,可被作为引物用于PCR扩增反应,或者作为探针用于杂交反应,或者用于制造基因芯片或微阵列。
在本发明的第十方面,提供了一种药物组合物,它含有安全有效量的本发明的人KLRL1多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物在治疗肿瘤和病毒感染等病症方面可能有潜在的应用前景。本发明还提供了KLRL1多肽的用途,它被用于制备免疫调节NK细胞和单核巨噬细胞的药物。
在另一优选例中,所述的药物是选自下组的药物:
(a)抑制NK细胞的杀伤活性的药物;
(b)抑制单核巨噬细胞的功能的药物
本发明的其它方面由于本文的技术的公开,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案,而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1:人KLRL1对磷酸酶SHP-1和SHP-2的募集作用。其中:
A:为NK-92和U937细胞中人KLRL1对磷酸酶SHP-1和SHP-2的募集作用。
B:为NK-92和U937细胞中人KLRL1蛋白的表达。
图2:人KLRL1/BGR融合蛋白可结合酵母聚糖。
图3:人KLRL1/BGR融合蛋白对酵母聚糖内吞的下调作用。
图4:人KLRL1对小鼠单核/巨噬细胞Raw264.7细胞的酵母聚糖内吞和TNF-α分泌的下调作用。
图5:KLRL1-Fc融合蛋白的真核表达及纯化。
图6:人hKLRL1对NK细胞杀伤活性的抑制作用。
图7是本发明的人KLRL1的cDNA序列,其中非编码序列用小写字母表示,编码序列用大写字母表示。
图8是本发明的人KLRL1蛋白的全长氨基酸序列。
具体实施方式
在本发明中,术语“KLRL1蛋白”、“KLRL1多肽”、“KLRL1蛋白多肽”或“免疫细胞抑制性受体KLRL1”可互换使用,都指含有人免疫细胞抑制性受体KLRL1氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的免疫细胞抑制性受体KLRL1。
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
如本文所用,“分离的KLRL1蛋白或多肽”是指KLRL1多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化KLRL1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。KLRL1多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽,优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物,或是化学合成的产物,或使用重组技术从原核或真核宿主(例如,细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主,本发明的多肽可以是糖基化的,或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人KLRL1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人KLRL1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中,术语“人KLRL1多肽”指具有人KLRL1蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人KLRL1蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人KLRL1蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人KLRL1DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人KLRL1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽,如包含人KLRL1多肽或其片段的融合蛋白(例如与Fc或BGR形成融合蛋白)。除了几乎全长的多肽外,本发明还包括了人KLRL1多肽的可溶性片段。通常,该片段具有人KLRL1多肽序列的至少约10个连续氨基酸,通常至少约30个连续氨基酸,较佳地至少约50个连续氨基酸,更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人KLRL1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人KLRL1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的修饰形式上的差异,或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到,如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变,还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解,本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸,磷酸丝氨酸,磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中,“人KLRL1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比,有至多10个,较佳地至多8个,更佳地至多5个,最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lys |
Asn(N) | Gln;His;Lys;Arg | Gln |
Asp(D) | Glu | Glu |
Cys(C) | Ser | Ser |
Gln(Q) | Asn | Asn |
Glu(E) | Asp | Asp |
Gly(G) | Pro;Ala | Ala |
His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe | Leu |
Leu(L) | Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Leu |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala | Leu |
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质,但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用,“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸,较好是至少30个核苷酸,更好是至少50个核苷酸,最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码KLRL1蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供,更佳地被纯化至均质。
本发明的人KLRL1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985;230:1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时,可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法),用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择,并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或KLRL1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science,1984;224:1431),可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的KLRL1多肽。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明的编码人KLRL1多肽的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中,人KLRL1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于:在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg,et al.Gene,1987,56:125);在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之,只要能在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人KLRL1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有:大肠杆菌的lac或trp启动子;λ噬菌体PL启动子;真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母;植物细胞;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时,如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子,通常大约有10到300个碱基对,作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的人KLRL1蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于):直接做为药物治疗KLRL1蛋白功能低下或丧失所致的疾病,和用于筛选促进或对抗KLRL1蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人KLRL1蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人KLRL1蛋白功能的多肽分子。
另一方面,本发明还包括对人KLRL1DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,尤其是单克隆抗体。这里,“特异性”是指抗体能结合于人KLRL1基因产物或片段。较佳地,指那些能与人KLRL1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人KLRL1蛋白的分子,也包括那些并不影响人KLRL1蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人KLRL1基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体,而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab′或(Fab)2片段;抗体重链;抗体轻链;遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人,美国专利No.4,946,778);或嵌合抗体,如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如,纯化的人KLRL1基因产物或者其具有抗原性的片段,可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的,表达人KLRL1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人KLRL1蛋白功能的抗体以及不影响人KLRL1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人KLRL1基因产物的片段或功能区,通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人KLRL1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生;与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽),可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人KLRL1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中,检测活检标本中的人KLRL1蛋白。此外,与人KLRL1蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记,注入体内可跟踪其位置和分布。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与人KLRL1蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人KLRL1蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人KLRL1蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素,蓖麻蛋白,红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP,攻击抗体的氨基,通过二硫键的交换,将毒素结合于抗体上,这种杂交抗体可用于杀灭人KLRL1蛋白阳性的细胞(例如淋巴结细胞等)。
多克隆抗体的生产可用人KLRL1蛋白或多肽免疫动物,如家兔,小鼠,大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应,包括但不限于弗氏佐剂等。
利用本发明蛋白,通过各种常规筛选方法,可筛选出与KLRL1蛋白发生相互作用的物质,如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等,当在治疗上进行施用(给药)时,可提供不同的效果。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的多肽可直接用于疾病治疗,例如,用于抑制NK细胞的杀伤活性、抑制单核巨噬细胞的功能。在使用本发明KLRL1蛋白时,还可同时使用其他治疗剂。
本发明还提供了一种药物组合物,它含有安全有效量的本发明KLRL1多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物,可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时,是将安全有效量的KLRL1蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
人KLRL1蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于KLRL1蛋白的无表达或异常/无活性的KLRL1蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的KLRL1蛋白,以抑制内源性的KLRL1蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将KLRL1基因转移至细胞内。构建携带KLRL1基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook,et al.)。另外重组人KLRL1基因可包装到脂质体中,然后再转移至细胞内。
抑制人KLRL1mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子,其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得,如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性,可用多种方法对其进行修饰,如增加两侧的序列长度,核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括:将多聚核苷酸直接注入到体内组织中;或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中,再将细胞移植到体内等。
能与人KLRL1蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时,必须对人KLRL1蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测人KLRL1蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的,且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人KLRL1蛋白水平,可以用作解释人KLRL1蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断KLRL1蛋白起作用的疾病。
一种检测检测样品中是否存在KLRL1蛋白的方法是利用KLRL1蛋白的特异性抗体进行检测,它包括:将样品与KLRL1蛋白特异性抗体接触;观察是否形成抗体复合物,形成了抗体复合物就表示样品中存在KLRL1蛋白。
KLRL1蛋白的多聚核苷酸可用于KLRL1蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面,KLRL1蛋白的多聚核苷酸可用于检测KLRL1蛋白的表达与否或在疾病状态下KLRL1蛋白的异常表达。如KLRL1DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断KLRL1蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法,Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术,相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上,用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用KLRL1蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测KLRL1蛋白的转录产物。
检测KLRL1基因的突变也可用于诊断KLRL1蛋白相关的疾病。KLRL1蛋白突变的形式包括与正常野生型KLRL1 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外,突变有可能影响蛋白的表达,因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之,根据本发明KLRL1蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp),可以将序列定位于染色体上。然后,将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
一旦序列被定位到准确的染色体位置,此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如,V.Mckusick,Mendelian Inheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析,确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
在本发明的一个实例中,提供了一种分离的多核苷酸,它编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从人树突状细胞cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO:1所示,它包含的多核苷酸序列全长为1566个碱基,其开放读框位于170-967位,编码全长为265个氨基酸的人KLRL1蛋白(SEQ ID NO:2)。该KLRL1蛋白具有抑制NK细胞的杀伤活性、抑制单核巨噬细胞的功能,是一种新型免疫细胞抑制性受体。因此在抗病毒感染和抗肿瘤免疫等多个领域的免疫诊断和免疫治疗方面具有潜在的重要开发和应用价值。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:人KLRL1cDNA的克隆
用Trizol(Gibco公司)提取人树突状细胞总RNA。然后,从总RNA中分离poly(A)mRNA。将poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA后,用SuperScriptII克隆试剂盒(购自Gibco)将cDNA片段定向插入到载体的多克隆位点上,转化DH5α细菌形成cDNA质粒文库。用双脱氧法测定随机挑选克隆的5′末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库进行比较,结果发现有一个cDNA克隆的DNA序列为新的全长cDNA。通过合成一系列引物对新克隆所含的DNA序列进行双向测定。计算机分析表明,克隆所含的全长cDNA是一个新的cDNA序列(如SEQ ID NO:1和图7所示),编码一个新的蛋白质(如SEQ ID NO:2和图8所示)。此蛋白质被命名为人免疫细胞抑制性受体KLRL1,其编码基因命名为人免疫细胞抑制性受体KLRL1基因。
序列SEQ ID NO:1全长为1566bp,包括169bp的5′端非编码区和599bp的3′端非编码区,编码含265个氨基酸的多肽。理论上计算未糖基化的成熟分子的分子量为31.8kD。
实施例2:用RT-PCR方法克隆人KLRL1蛋白的编码序列
用Trizol(Gibco公司)提取处于对数生长期人树突状细胞总RNA,取6μg细胞总RNA与0.5μg Oligo-dT12-18混合,进行反转录。反转录体系为20μl,反应结束后加80μl ddH2O进行稀释。PCR扩增所用的引物如下:有义引物5′GGGTGATTGGTACAGTAGGTTTATAAACAG(SEQ ID NO:3),反义引物5′GCCTTTTCGTTTTTGTTTATTGGCTTTTAC(SEQ ID NO:4)。PCR反应体积为50μl,其中含反转录模板10μl、0.4μM引物、0.2μM dNTP和1U ExTaq DNA聚合酶(Takara Inc.),扩增参数为94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 45秒,25个循环后PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳初步确认。DNA序列分析结果表明,该PCR产物的DNA编码序列与SEQ ID NO:1所示的编码区(170-967)完全相同。
实施例3KLRL1蛋白的Northern印迹分析
按如下常规方法进行Northern印迹:待检滤膜置于10ml经68℃预热的杂交液,在杂交炉(Bellco)中于68℃预杂交30分钟;将标记好的cDNA探针于95~100℃变性2~5分钟,置冰上迅速冷却后加入杂交液(cDNA探针终浓度为2~10ng/ml或1~2×106cpm/ml),充分混匀,于68℃杂交2小时。杂交结束后,滤膜用2×SSC、0.05%SDS室温淋洗数次,继振荡冲洗30~40分钟,其间更换洗液数次。随后用0.1×SSC、0.1%SDS于50℃振荡冲洗20~40分钟。最后滤膜用塑料保鲜膜包裹,于-70℃曝光X线胶片24~48小时。
Northern印迹杂交显示:KLRL1在肝、脾和外周血细胞中高表达。
实施例4人KLRL1蛋白重组表达
在该实施例中,以实施例2中的PCR扩增产物为模板,用序列如下的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增,获得人KLRL1DNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′端寡核苷酸引物序列为:
5′端引物:5′-cg gga tcc ATC AGT GAA GAG CTC CAG AGA A-3′(SEQ IDNO:5),
3′端引物:5′-cG gaa ttc TCA TGC CTC CCT AAA ATA TGT A-3′(SEQ IDNO:6)。
PCR产物纯化后经BamHI/EcoRI酶切再与质粒pUC18按常规方法重组并转化至感受态DH5α,挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪,BigDye Terminator试剂盒,PE公司)。将正确序列的KLRL1蛋白cDNA酶切片段克隆至表达载体pGEX-2T并转化至DH5α。酶切产物行2%琼脂糖凝胶电泳分析。经测序证实,已插入了完整的KLRL1编码序列。
挑表达KLRL1的阳性DH5α克隆接种于100ml 2×YTA培养基中,37℃300rpm振荡培养12-15hr,1:10稀释于预热的2×YTA培养基继续振荡培养1.5hr,加100mM IPTG至0.1mM后30℃诱导2-6hr,5,000g 4℃离心10min去上清,置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl,2.7mM KCl,10.1mM Na2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.3)重悬,超声(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20% Triton X-100至1%轻摇30min,然后12,000g 4℃离心10min,上清用0.8μm滤膜过滤后,过1ml 50%谷胱甘肽Sepharose 4B层析柱,1×PBS充分洗涤后,加入500ul谷胱甘肽洗脱缓冲液(10mM谷胱甘肽,50mM Tris-HCl,pH 8.0)室温静置30分钟后收集洗脱液,重复洗脱2-3次,得到人KLRL1蛋白。
经凝血酶(thrombin)(Sigma公司)酶切去除GST后得到KLRL1蛋白,分子量约为31.8kD。
用Edams水解法进行N-端氨基酸序列分析,证实了其N端序列与SEQ ID NO:2所示的N端序列相符。
实施例5:抗人KLRL1蛋白的多克隆抗体的产生
将实施例4中获得的重组蛋白KLRL1蛋白用来免疫动物以产生抗体,具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离,将电泳条带从凝胶中切下,并用等体积的完全Freund′s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白,对小鼠进行腹膜内注射。14天后,用非完全Freund′s佐剂乳化的同样抗原,对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫,至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人KLRL1蛋白基因翻译产物的能力加以评估。结果发现,抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。
实施例6:人KLRL1单克隆抗体的制备及表型分析
用Trizol试剂提取处于对数生长期相应细胞系、人外周血单核细胞及经LPS刺激不同时间的人外周血单核细胞来源的树突状细胞总RNA,取5μg细胞总RNA与1μg Oligo-dT12-18混合,进行反转录。反转录体系为20μl,反应结束后加80μlddH20进行稀释。PCR扩增人KLRL1全长开放阅读框的引物如下:
有义引物5’-AAAGAATTCATGTCTGAAGAAGTTACTT-3’(SEQ ID NO:7),该引物含有EcoR I限制性内切酶的酶切位点,在该酶切位点之后是翻译起始子和人KLRL1的部分编码序列;
反义引物5’-AAAGGATCCTCATGCCTCCCATTT-3’(SEQ ID NO:8),该引物含有BamH I限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人KLRL1的部分编码序列。
PCR反应体积为50μl,其中含反转录模板10μl、0.5mM引物、0.2mM dNTP和1U rTaq DNA聚合酶(Takara),扩增参数为95℃ 15秒、57℃ 30秒、72℃ 90秒,32个循环后PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳初步确认。DNA序列分析结果表明该PCR产物的编码DNA序列与人KLRL1开放阅读框架的1-798位完全相同。
将获得的PCR产物纯化后经EcoR I-BamH I酶切再与质粒pcDNA3.1/myc-his(-)B(Invitrogen公司)按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌BL21,挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪,BigDye Terminator试剂盒,PE公司)。经测序证实,已插入了所设计的KLRL1编码序列。正确序列的克隆形成载体pcDNA-KLRL1。
以瞬时转染pcDNA-KLRL1的NIH3T3细胞小鼠成纤维细胞为抗原经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,初次免疫3-4周后加强免疫3次,每次间隔2周。末次免疫取等量细胞经尾静脉加强免疫,3天后取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0做细胞融合。取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0,1000rpm离心5分钟,弃上清,用不完全培养液混悬细胞后计数,取所需的细胞数,用不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液,用不完全培养液洗涤2次。将骨髓瘤细胞与脾细胞按110或15的比例混合在一起,在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次,1200rpm,8分钟。弃上清,用滴管吸净残留液体,以免影响PEG的浓度。轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略加松动。在室温下融合:30秒内加入预热的1ml45%PEG(Merek,分子量4000)含5%DMSO,边加边搅拌;作用90秒钟,若冬天室温较低时可延长至120秒钟;加预热的不完全培养液,终止PEG作用,每隔2分钟分别加入1ml,2ml,3ml,4ml,5ml和10ml;离心,800rpm,6分钟;弃上清,先用6ml左右20%小牛血清RPMI1640轻轻混悬。根据所用96孔培养板的数量,补加完全培养液,10ml一块96孔板。将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板,100μl/孔,37、5%CO2孵箱培养。应用HAT选择培养液筛选融合细胞,ELISA检测阳性克隆,采用有限稀释法反复克隆化3-4次,得到有稳定分泌抗体能力的杂交瘤细胞株。腹腔注射0.5ml液体石腊于BaLb/c小鼠,1~2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞,接种细胞7~10天后可收集腹水,经Affi-Gel protein A-agarose亲和柱(Bio-Rad Laboratories)纯化得到单克隆抗体。用标准抗Ig类与亚类血清系统作夹心ELISA来分析所得到单克隆抗体的表型。
结果显示获得小鼠抗人KLRL1单克隆抗体HK-13,表型为IgG1,kappa。
实施例7:免疫共沉淀和Western印迹检测
收集培养细胞,在含1mM PMSF的PBS中洗两次后,重悬于T-PER组织蛋白抽提试剂(Pierce公司)中,混匀,放冰上20min,以10,000g 4℃离心10分钟,收集上清。蛋白样品定量采用BCA法。
收集用于免疫共沉淀的细胞,在含1mM PMSF的PBS中洗两次后,加入0.5mlPBS置于37℃预处理5分钟;加入终浓度为100μM的Na3VO4和0.03% H2O2置于37℃孵育5分钟;随后在冰上加入2×1%毛地黄皂苷裂解液(25mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH 7.5,1%毛地黄皂苷,1mM NaF,1mM PMSF,1mM Na3VO4,10μg/mlleupeptin,and 10μg/ml aprotinin)裂解30分钟,16,000g 4℃离心15分钟,收集细胞裂解上清,加入正常BALB/c小鼠血清和蛋白A beads 4℃震荡孵育预封闭1小时,2,300g 4℃离心2分钟收集上清,加入单克隆抗体HK-13和蛋白A beads4℃震荡孵育8小时。2,300g 4℃离心2分钟收集anti-Flag M2-agarose beads,用0.5%毛地黄皂苷裂解液洗3次,即为免疫沉淀物。
将蛋白样品或免疫沉淀物行SDS-PAGE,随后以100V恒电压于4℃转至硝酸纤维素膜上,丽春红染色并标记大小和方向。室温阻断2小时(5%脱脂奶粉的TBST溶液),以阻断液稀释一抗,室温孵育1小时。TBST(0.05% Tween 20的TBS溶液)洗15分钟、3次,以阻断液稀释二抗,室温孵育2小时。TBST洗15分钟、3次,TBS(10mM Tris-HCl,pH8.0,150mM NaCl)洗15分钟,然后加入化学发光底物作用1min,并迅速封膜和自显影。
用于Western印迹检测KLRL1蛋白表达的一抗为小鼠抗KLRL1单克隆抗体HK-13,二抗为HRP标记抗鼠IgG(Santa Cruz公司);用于免疫共沉淀后Western印迹检测SHP-1、SHP-2和SHIP1的一抗分别为兔抗SH-PTP1(SHP-1)多抗、兔抗SH-PTP2多抗和兔抗SHIP1多抗(Santa Cruz公司),二抗为HRP标记抗兔IgG(Santa Cruz公司)。
结果提示,在NK细胞系NK-92以及髓系/单核细胞系U937中,人KLRL1分子均能够在酪氨酸磷酸化的情况下募集酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2,推测KLRL1能够发挥潜在的免疫抑制性受体作用,对NK细胞和单核巨噬细胞的免疫学功能起一定的调控作用(图1)。
实施例8:KLRL1/BGR融合蛋白的真核表达载体构建及稳定转染
以包含KLRL1全长cDNA序列的重组质粒pcDNA-KLRL1为模板,用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行overlap extension PCR扩增,获得人KLRL1胞内段、跨膜区及部分柄部区域(N端95个氨基酸)和小鼠β-葡聚糖受体(BGR)胞外段融合DNA作为插入片段的真核表达载体。
上游引物为:
5’-CTACAACTGATGAGTAACTTCCTATCAAGAAATAAAG-3’(SEQ ID NO:9)
下游引物为:
5’-TTTATTTCTTGATAGGAAGTTACTCATCAGTTGTAG-3’(SEQ ID NO:10)
经测序证实得到包含KLRL1N端95个氨基酸和小鼠β-葡聚糖受体胞外段融合蛋白的真核表达载体pKLRL1/BGR。
根据《分子克隆》中所述的标准方法,利用基因突变将KLRL1胞内段(1-39aa)删除后加入起始密码子(AUG),将KLRL1胞内段的ITIM序列(VTYADL;5-10aa)突变为VTFADL,分别得到胞内段缺失的载体ptruncKLRL1/BGR和ITIM突变的载体pITIM KLRL1/BGR。然后将上述融合蛋白的编码序列克隆至逆转录病毒载体pFBneo(Stratagene公司),瞬时转染293细胞,病毒包装,分别转染NIH3T3细胞和小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7细胞经3μg/ml嘌呤霉素筛选得到稳定表达上述融合蛋白的细胞株。
实施例9:单核巨噬细胞功能检测实验
酵母聚糖为β-葡聚糖受体(BGR)的配体。用以下方法进行酵母聚糖结合实验:稳定转染的NIH3T3细胞按2 x 105cells/well铺24孔板,加100μg/ml海带多糖(Sigma公司)37℃预处理20分钟,加入FITC标记的酵母聚糖(25particles/cell)(Molecular Probes公司)37℃ 5% CO2孵育1小时,PBS洗三次,3% Triton X-100裂解细胞,用Titretek Fluoroskan II(Labsystems公司)检测酵母聚糖结合率。
酵母聚糖内吞实验:稳定转染的NIH3T3细胞按2 x 105cells/well铺24孔板,加cytochalasin D(1μM)(Sigma公司)预处理40分钟,且在实验过程中维持使用,加入FITC标记的酵母聚糖(5 particles/cell)37℃ 5% CO2孵育30分钟,PBS洗三次,37℃ 5% CO2孵育90分钟,加兔抗酵母聚糖抗体(MolecularProbes公司),用含1% BSA和5%灭活羊血清的PBS封闭,异藻蓝蛋白(APC)标记的羊抗兔抗体孵育,经1%多聚甲醛固定后进行FACS检测。
TNF-α分泌实验:稳定转染的小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7细胞按2 x 105cells/well铺24孔板,4℃预冷20分钟,加100μg/ml葡聚糖磷酸酶(GluP)(Sigma公司)4℃预处理20分钟,加入100μg/ml酵母聚糖37℃ 5% CO2孵育30分钟,PBS洗三次,37℃ 5% CO2孵育3小时后用ELISA检测上清中TNF-α的分泌情况。
结果显示KLRL1的胞内段可以阻断NIH3T3细胞的内吞功能,并且能够抑制酵母聚糖介导的RAW264.7细胞TNF-α分泌功能,从而证实KLRL1作为抑制性受体是单核巨噬细胞生物活性的负性调节因子(图2、图3和图4)。
实施例10:KLRL1-Fc融合蛋白真核表达载体构建、真核细胞基因转染及蛋白纯化
以包含KLRL1全长cDNA序列的重组质粒pcDNA-KLRL1为模板,利用如下序列的hKLRL1的特异性引物从中克隆得到hKLRL1的胞外段(132-265aa)。克隆至常规的p2SB/Myc-His载体(一种多克隆位点上游带有人IL-2分泌信号肽编码序列的哺乳动物细胞表达载体)。
上游引物为5’-ACGGATCCTTGCCAAGGAGATGGATT-3’(SEQ ID NO:11,5′端含BamH I位点);
下游引物为5’-TCAAGCTTGCCTCCCTAAAATATGTAG-3’(SEQ ID NO:12,5′端含Hind III位点,不含终止密码子)。
反应参数:95℃ 45秒,55℃ 30秒,72℃ 30秒,28循环后72℃延伸10分钟,产物预期大小为402bp。PCR产物纯化后经Bamh I和Hind III双酶切,与p2SB/Myc-His载体按常规方法重组并转化至感受态细菌BL21(氯化钙法),挑取克隆进行鉴定、纯化并测序(ABI377全自动DNA测序仪,Perkin-Elmer公司;测序引物为T7和BGH)。序列正确的重组质粒用XhoI和Hind III双酶切,酶切片段包括人IL-2分泌信号肽和hKLRL1胞外段,经纯化后克隆至表达载体pFcA(多克隆位点下游带有人IgG Fc段编码序列的哺乳动物细胞表达载体,为本所自行构建)。经Xho I和Hind III酶切鉴定阳性克隆后,重组载体记为phexKLRL1-Fc。
利用低浓度DEAE-葡聚糖法进行真核细胞的基因转染。主要步骤为:处70-80%汇合(confluent)生长的非洲绿猴肾细胞COS-7细胞,用含10mmol/L HEPES无NaHCO3的DMEM无血清培养基(HEPES-DMEM,Invitrogen公司)洗两遍;phexKLRL1-Fc质粒DNA与DEAE-葡聚糖、HEPES-DMEM无血清培养基按一定比例混合,DEAE-葡聚糖的终浓度为0.25mg/L,然后加入终浓度为0.1mM的二盐酸氯喹;将上述混合物加入待转染细胞,置37℃ 5% CO2培养5小时;弃去全部上清,用HEPES-DMEM无血清培养基洗两遍,再用含NaHCO3的DMEM有血清培养基洗一遍,加入含10%血清的正常培养基,继续培养12小时后更换为含1%血清的新鲜培养基培养5-6天,收集细胞培养上清约1000ml,经Western印迹分析,结果证实,转染了phexKLRL1-Fc的非洲绿猴肾细胞COS-7细胞培养上清中。结果检测到hKLRL1胞外段与Fc段的融合蛋白存在,蛋白表观分子量大小约37KD(图5)。将该融合蛋白记为hexKL-Fc。
收集的细胞培养上清约1000ml通过超滤浓缩至60ml;浓缩液过Affi-Gelprotein A-agarose亲和柱(Bio-Rad公司),用0.1M甘氨酸(pH 3.0)洗脱上清中表达的hexKL-Fc融合蛋白,用BCA法蛋白定量后调节pH值至7.0,滤过除菌后-20℃保存。
实施例11:NK细胞杀伤活性检测和Fc融合蛋白竞争性阻断实验
运用LDH释放法检测NK细胞杀伤活性检测,基本原理如下:乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)是胞浆中的酶,细胞死亡后释放到上清中;在硫辛酰胺脱氢酶和氧化型辅酶I的共同作用下,乳酸脱氢酶可以将-p-碘苯酯-3-p-氯化硝基苯四唑(INT)转化为红色formazan;通过吸光检测可以间接检测细胞死亡率。检测试剂盒是CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega公司),基本方法如下:收集对数生长期的靶细胞,计数;在96孔圆底板中加入靶细胞,每孔50μl,细胞数为1×103;收集对数生长期的效应细胞,计数倍比稀释;向每孔加入效应细胞50μl,效应细胞和靶细胞分别为50:1、25:1和12.5:1,250g离心5分钟后置37℃ 5% CO2孵育4小时;250g离心5分钟,每孔吸出50μl上清对应加入另一96孔酶联检测板,依次加入50μl反应液,室温避光放置30分钟,在酶联检测仪上检各孔吸光度(OD值),检测波长490nm。
Fc融合蛋白竞争性阻断实验:收集对数生长期的靶细胞,用纯化的hexKL-Fc融合蛋白37℃ 5% CO2孵育8小时,融合蛋白的终浓度为20μg/ml,对照组用与之浓度相同的IgG,然后用RPMI 1640无血清培养基洗两遍,记数铺板,以下步骤与上述相同。
杀伤活性(%)=[(OD实验组-OD总自然释放)/(OD最大释放组-OD总自然释放)]×100
结果显示,hexKL-Fc融合蛋白预处理的A549,HeLa和MCF-7细胞不管对新鲜分离的NK细胞还是对NK-92细胞株,其敏感性都得到了相应的提高,表现为NK效应细胞杀伤效率的明显增强,而对于K562细胞处理前后无显著差异(图6)。这一结果既证明了hKLRL1作为一种免疫抑制性受体可以抑制NK细胞的杀伤活性,又从侧面提示A549,HeLa和MCF-7细胞表面存在hKLRL1分子的可能配体。
实施例12:药物组合物的制备
按常规的混合法,将1mg实施例4制备的KLRL1与200ml注射用生理盐水配制成注射液,分装于10ml的小瓶中。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国人民解放军第二军医大学
<120>新型人免疫细胞抑制性受体KLRL1的功能及用途
<130>044722
<160>12
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1566
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
<210>2
<211>265
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
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<220>
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<223>引物
<400>12
Claims (8)
1.一种分离的多肽,其特征在于,该多肽是:
由氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽的N端第1-95个氨基酸构成的片段、或第132-265个氨基酸构成的片段与Fc片段或小鼠β-葡聚糖受体胞外段构成的融合蛋白,该融合蛋白具有对于NK细胞和单核巨噬细胞的免疫调节功能。
2.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,该多肽是SEQ ID NO:2中第132-265个氨基酸构成的片段与Fc片段构成的融合蛋白。
3.一种分离的多核苷酸,其特征在于,它选自下组:
(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸;
(b)与多核苷酸(a)完全互补的多核苷酸。
4.一种载体,其特征在于,它含有权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种遗传工程化的宿主细胞,其特征在于,它含有权利要求4所述的载体。
6.一种多肽的制备方法,其特征在于,该方法包含:
(a)在适合表达的条件下,培养权利要求6所述的宿主细胞;
(b)从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。
7.一种药物组合物,其特征在于,它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。
8.如权利要求1所述的多肽的用途,其特征在于,用于制备免疫调节NK细胞和单核巨噬细胞的药物。
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NCBI登录号:AAL95693. ,NCBI. 2002 |
NCBI登录号:AAL95693. ,NCBI. 2002 * |
利用育苗池大规模培养新月菱形藻的方法. 关春江.水产养殖,第1期. 1998 |
利用育苗池大规模培养新月菱形藻的方法. 关春江.水产养殖,第1期. 1998 * |
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