JPH0591881A - Ｔ細胞抗原レセプター鎖をコードする新規組換えｄｎａ分子、調製方法、抗体およびそれらを含む医薬 - Google Patents
Ｔ細胞抗原レセプター鎖をコードする新規組換えｄｎａ分子、調製方法、抗体およびそれらを含む医薬Info
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- JPH0591881A JPH0591881A JP4028264A JP2826492A JPH0591881A JP H0591881 A JPH0591881 A JP H0591881A JP 4028264 A JP4028264 A JP 4028264A JP 2826492 A JP2826492 A JP 2826492A JP H0591881 A JPH0591881 A JP H0591881A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、Ｔ細胞抗原レセプター鎖をコード
するキメラヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ、前記
ＤＮＡを使って得られる抗体、それらを含む医薬組成物
および診断薬、並びに調製方法に関する。 【構成】 前記配列は、可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）およ
び連結（Ｊ）領域の全部をコードする哺乳類由来の配
列、並びに上記哺乳類配列を欠く定常相補的（Ｃ）領域
をコードするマウス由来の配列により構成され、この２
配列は天然のまたは人工的に作製された制限部位のとこ
ろで連結されている。
するキメラヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ、前記
ＤＮＡを使って得られる抗体、それらを含む医薬組成物
および診断薬、並びに調製方法に関する。 【構成】 前記配列は、可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）およ
び連結（Ｊ）領域の全部をコードする哺乳類由来の配
列、並びに上記哺乳類配列を欠く定常相補的（Ｃ）領域
をコードするマウス由来の配列により構成され、この２
配列は天然のまたは人工的に作製された制限部位のとこ
ろで連結されている。
Description
【０００１】本発明は、Ｔ細胞抗原レセプター鎖をコー
ドする新規組換えＤＮＡ分子、調製方法、抗体およびそ
れらを含む医薬に関する。
ドする新規組換えＤＮＡ分子、調製方法、抗体およびそ
れらを含む医薬に関する。
【０００２】例えば異なるヒトＴ細胞亜集団間の迅速な
識別と統計を得るために、異なるヒトＴ細胞抗原レセプ
ター鎖（以後ＴＣＲ）に対して向けられた一群の抗体を
容易な方法で発生させることは有用であろう。亜集団間
のアンバランスの研究は、Ｔ細胞の増殖を引き起こす病
気の鑑別診断を可能にするだろう。それは特定の病原組
織、例えば腫瘍に対する特異的免疫応答の証拠でもあり
得る。特にＴ細胞の２集団を区別するCD4 およびCD8 抗
原に対する抗体が一連の免疫病（その１つはAIDSであ
る）の証拠であることは知られている。それらの抗体は
容易に且つ大量に生産することが可能であるべきであ
る。
識別と統計を得るために、異なるヒトＴ細胞抗原レセプ
ター鎖（以後ＴＣＲ）に対して向けられた一群の抗体を
容易な方法で発生させることは有用であろう。亜集団間
のアンバランスの研究は、Ｔ細胞の増殖を引き起こす病
気の鑑別診断を可能にするだろう。それは特定の病原組
織、例えば腫瘍に対する特異的免疫応答の証拠でもあり
得る。特にＴ細胞の２集団を区別するCD4 およびCD8 抗
原に対する抗体が一連の免疫病（その１つはAIDSであ
る）の証拠であることは知られている。それらの抗体は
容易に且つ大量に生産することが可能であるべきであ
る。
【０００３】CHOI,Yらは、Nature 346:471-473(1990)
において、マウスＤβ，Ｊβ，Ｃβセグメントと連結さ
れたヒトＶβセグメントを含むキメラTCR をコードする
ＤＮＡを記載している。こうして形成され、α鎖と結合
されそしてCD3 と組み合わされたキメラTCR が発現され
ている。記載の方法がヒトTCR のＶβまたはＶαセグメ
ントに特異的なマウス抗体の産生を可能にすることが提
案されている。しかしながら、この記載の方法は、ヒト
Ｖβ領域を含む与えられた構成物型にのみ特異的であ
る。マウス起源のＣβ２セグメントを使って種々のＶ，
ＪおよびＤ領域、特にヒト起源のものを含む広範囲のキ
メラ体の調製を可能にすることは有用であろう。本出願
人は、新規真核発現ベクターの調製を可能にする新規組
換えＤＮＡを開発した。これは注目に値する真核細胞の
トランスフェクション剤であり、トランスフェクトされ
た細胞は、異なるヒトTCR 鎖に対して向けられた抗体、
特にモノクローナル抗体、を誘導する優れた免疫原であ
った。
において、マウスＤβ，Ｊβ，Ｃβセグメントと連結さ
れたヒトＶβセグメントを含むキメラTCR をコードする
ＤＮＡを記載している。こうして形成され、α鎖と結合
されそしてCD3 と組み合わされたキメラTCR が発現され
ている。記載の方法がヒトTCR のＶβまたはＶαセグメ
ントに特異的なマウス抗体の産生を可能にすることが提
案されている。しかしながら、この記載の方法は、ヒト
Ｖβ領域を含む与えられた構成物型にのみ特異的であ
る。マウス起源のＣβ２セグメントを使って種々のＶ，
ＪおよびＤ領域、特にヒト起源のものを含む広範囲のキ
メラ体の調製を可能にすることは有用であろう。本出願
人は、新規真核発現ベクターの調製を可能にする新規組
換えＤＮＡを開発した。これは注目に値する真核細胞の
トランスフェクション剤であり、トランスフェクトされ
た細胞は、異なるヒトTCR 鎖に対して向けられた抗体、
特にモノクローナル抗体、を誘導する優れた免疫原であ
った。
【０００４】従って、本出願人の主題は、Ｔ細胞抗原レ
セプター鎖をコードするキメラヌクレオチド配列を含む
ことを特徴とする組換えＤＮＡであって、前記配列が ─可変領域（Ｖ）、多様性領域（Ｄ）および連結領域
（Ｊ）の全部をコードする哺乳類由来の配列、並びに ─上記哺乳類配列を欠いた定常相補的領域（Ｃ）をコー
ドするマウス由来の配列により構成され、この２つの配
列が天然のまたは人工的に作製された制限部位のところ
で連結されている組換えＤＮＡである。この部位を以後
「選ばれた部位」と呼ぶことにする。
セプター鎖をコードするキメラヌクレオチド配列を含む
ことを特徴とする組換えＤＮＡであって、前記配列が ─可変領域（Ｖ）、多様性領域（Ｄ）および連結領域
（Ｊ）の全部をコードする哺乳類由来の配列、並びに ─上記哺乳類配列を欠いた定常相補的領域（Ｃ）をコー
ドするマウス由来の配列により構成され、この２つの配
列が天然のまたは人工的に作製された制限部位のところ
で連結されている組換えＤＮＡである。この部位を以後
「選ばれた部位」と呼ぶことにする。
【０００５】組換えＤＮＡとは、人工的に作製されたヌ
クレオチド配列を意味する。キメラとは組換えＤＮＡが
異なる起源からの少なくとも２つの配列、例えば２つの
異なる起源の３，４または５つの配列、好ましくは２つ
の配列を含むことを意味する。
クレオチド配列を意味する。キメラとは組換えＤＮＡが
異なる起源からの少なくとも２つの配列、例えば２つの
異なる起源の３，４または５つの配列、好ましくは２つ
の配列を含むことを意味する。
【０００６】それらの配列は２つの異なる種に由来し、
そしてそれらのうちの１つの起源がマウスであり；もう
１つ（またはその他のもの）が特に霊長類、好ましくは
ヒトに由来する。Ｔ細胞レセプターはジスルフィド結合
により結合された２本のポリペプチド鎖から成るヘテロ
二量体タンパク質である。該レセプターはCD3 複合体と
会合してＴ細胞の表面上に発現される。特定のTCR 鎖に
相当する遺伝子座は、多数の異なるＶセグメント、数個
のＪセグメントおよび１つか２つの定常Ｃセグメントを
含む別個の遺伝子セグメントの大量選択を伴う。それら
のセグメントはＴ細胞の胸腺成熟中の体細胞再配列を受
け、転写されそしてＶセグメント、Ｊセグメント、Ｃセ
グメント、および適当ならばＶセグメントとＪセグメン
トの間にＤセグメントを含むユニークな遺伝子を生成す
ることができる。
そしてそれらのうちの１つの起源がマウスであり；もう
１つ（またはその他のもの）が特に霊長類、好ましくは
ヒトに由来する。Ｔ細胞レセプターはジスルフィド結合
により結合された２本のポリペプチド鎖から成るヘテロ
二量体タンパク質である。該レセプターはCD3 複合体と
会合してＴ細胞の表面上に発現される。特定のTCR 鎖に
相当する遺伝子座は、多数の異なるＶセグメント、数個
のＪセグメントおよび１つか２つの定常Ｃセグメントを
含む別個の遺伝子セグメントの大量選択を伴う。それら
のセグメントはＴ細胞の胸腺成熟中の体細胞再配列を受
け、転写されそしてＶセグメント、Ｊセグメント、Ｃセ
グメント、および適当ならばＶセグメントとＪセグメン
トの間にＤセグメントを含むユニークな遺伝子を生成す
ることができる。
【０００７】上記の組換えキメラＤＮＡでは、Ｃ領域の
コード配列の全部がマウスに由来することができ、そし
てこの場合、他方の哺乳類配列はＣ部分に相当するヌク
レオチドを含まない。好ましくは、他方の哺乳類由来の
配列は短いＣ領域、好ましくは100 未満、特に約60ヌク
レオチドを含む。このため、キメラ体の一方の大きいＣ
領域のみがマウス由来であり（この領域は上記の他の哺
乳類配列を欠く相補的領域である）、残りは哺乳類由来
である。異なる起源の２配列が選ばれた制限部位のとこ
ろで読み枠内で同位相連結される。他方の哺乳類配列は
Ｖ，Ｊ並びに場合によりＤ領域およびＣ領域に加えて、
ヘッド配列の全部を必ず含むだろう。
コード配列の全部がマウスに由来することができ、そし
てこの場合、他方の哺乳類配列はＣ部分に相当するヌク
レオチドを含まない。好ましくは、他方の哺乳類由来の
配列は短いＣ領域、好ましくは100 未満、特に約60ヌク
レオチドを含む。このため、キメラ体の一方の大きいＣ
領域のみがマウス由来であり（この領域は上記の他の哺
乳類配列を欠く相補的領域である）、残りは哺乳類由来
である。異なる起源の２配列が選ばれた制限部位のとこ
ろで読み枠内で同位相連結される。他方の哺乳類配列は
Ｖ，Ｊ並びに場合によりＤ領域およびＣ領域に加えて、
ヘッド配列の全部を必ず含むだろう。
【０００８】選ばれた制限部位は２つの配列の各々に天
然に存在するか、または２つの配列の一方のみに天然に
存在することができ、後者の場合他方の配列上に前記制
限部位が人工的に作製される。上記制限部位はＣβマウ
スセグメント上でユニークでなければならず、好ましく
は他方の哺乳類セグメント上でユニークでなければなら
ない。
然に存在するか、または２つの配列の一方のみに天然に
存在することができ、後者の場合他方の配列上に前記制
限部位が人工的に作製される。上記制限部位はＣβマウ
スセグメント上でユニークでなければならず、好ましく
は他方の哺乳類セグメント上でユニークでなければなら
ない。
【０００９】選ばれた制限部位が人工的に作製される場
合、それは例えばヌクレオチドの削除もしくは付加によ
り、または好ましくは既知の方法に従った突然変異によ
り、特に部位特異的突然変異誘発により、製造すること
ができる。こうしてＤＮＡ中に製造された変異は、通常
は存在しない制限部位の導入を可能にする。特に、ヒト
Ｃβ１およびＣβ２領域をコードするＤＮＡには天然に
存在するが、マウスTCR 鎖をコードする遺伝子には欠け
ているBglII 部位を、部位特異的突然変異誘発により、
または場合によってはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
による突然変異誘発により、マウスのＣβ２遺伝子中に
導入することができる。この変異は１または複数の出発
配列との最大相同性を保持することができる。こうして
作製された制限部位は、前記酵素を使ってマウス配列と
哺乳類配列の両方を切断し、読み枠内での同位相連結に
より所望のキメラ体を作製することができるように、好
ましくは該制限部位が哺乳類、特にヒトに天然に存在す
るレベルの部位と同様な部位のレベルに置かれるだろ
う。上記のことから、特定の制限酵素が選択されたなら
ば、対応する単一制限部位がせいぜいマウスＣβセグメ
ント上に存在しなければならず、好ましくは他方の哺乳
類セグメント上にユニークであり、更に、Ｃ領域のコー
ド配列のレベルで、特にTCR 鎖をコードするＤＮＡの同
位相転写を可能にする位置に存在しなければならない。
この特に有用な場合には、TCR の多数の異なるＶ領域
（特にヒトの）と連結されたマウスTCR のＣ領域をコー
ドする遺伝子の全系列を製造することができる。
合、それは例えばヌクレオチドの削除もしくは付加によ
り、または好ましくは既知の方法に従った突然変異によ
り、特に部位特異的突然変異誘発により、製造すること
ができる。こうしてＤＮＡ中に製造された変異は、通常
は存在しない制限部位の導入を可能にする。特に、ヒト
Ｃβ１およびＣβ２領域をコードするＤＮＡには天然に
存在するが、マウスTCR 鎖をコードする遺伝子には欠け
ているBglII 部位を、部位特異的突然変異誘発により、
または場合によってはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
による突然変異誘発により、マウスのＣβ２遺伝子中に
導入することができる。この変異は１または複数の出発
配列との最大相同性を保持することができる。こうして
作製された制限部位は、前記酵素を使ってマウス配列と
哺乳類配列の両方を切断し、読み枠内での同位相連結に
より所望のキメラ体を作製することができるように、好
ましくは該制限部位が哺乳類、特にヒトに天然に存在す
るレベルの部位と同様な部位のレベルに置かれるだろ
う。上記のことから、特定の制限酵素が選択されたなら
ば、対応する単一制限部位がせいぜいマウスＣβセグメ
ント上に存在しなければならず、好ましくは他方の哺乳
類セグメント上にユニークであり、更に、Ｃ領域のコー
ド配列のレベルで、特にTCR 鎖をコードするＤＮＡの同
位相転写を可能にする位置に存在しなければならない。
この特に有用な場合には、TCR の多数の異なるＶ領域
（特にヒトの）と連結されたマウスTCR のＣ領域をコー
ドする遺伝子の全系列を製造することができる。
【００１０】本発明の好ましい組換えＤＮＡは、該制限
部位が哺乳類のＣ領域をコードする配列上に天然に存在
することを特徴とする。本発明の特に好ましいキメラ体
は、哺乳類由来のその配列がヒトＶβ，Ｄβ，Ｊβセグ
メント、並びにＣβ１およびＣβ２のユニークBglII 部
位までの短いＣβ１またはＣβ２部分をコードする配列
であることを特徴とする哺乳類領域を有する。本発明の
キメラ体のマウス領域は、制限部位、特にBglII がマウ
ス起源の鎖の上に人工的に作製されることを特徴とす
る。
部位が哺乳類のＣ領域をコードする配列上に天然に存在
することを特徴とする。本発明の特に好ましいキメラ体
は、哺乳類由来のその配列がヒトＶβ，Ｄβ，Ｊβセグ
メント、並びにＣβ１およびＣβ２のユニークBglII 部
位までの短いＣβ１またはＣβ２部分をコードする配列
であることを特徴とする哺乳類領域を有する。本発明の
キメラ体のマウス領域は、制限部位、特にBglII がマウ
ス起源の鎖の上に人工的に作製されることを特徴とす
る。
【００１１】本発明の組換えＤＮＡは、上記のＶ，Ｄ，
ＪおよびＣ領域に限定された一本鎖ヌクレオチド配列の
形で、または他のヌクレオチド、例えば特にヘッド配列
（リーダー配列）を構成するものを含む一本鎖ヌクレオ
チド配列の形で提供することができる。上記配列は特に
発現ベクター中に組み込むことができ、この場合、真核
発現ベクターが好ましい。上記配列はそれの複製を考慮
して別のベクター、例えばプラスミド、例えばBLUESCRI
PT中に組み込むこともできる。真核発現ベクターとして
は、特にpHβPr1-Neo を挙げることができる。pHβPr1g
ptも挙げることができ、一般にはcDNAの発現を可能にす
るプロモーター調節シグナルおよびポリアデニル化シグ
ナルを含む任意の真核発現ベクターを挙げることができ
る。ベクター−宿主の組合せの選択は明らかに当業者の
能力の範囲内である。
ＪおよびＣ領域に限定された一本鎖ヌクレオチド配列の
形で、または他のヌクレオチド、例えば特にヘッド配列
（リーダー配列）を構成するものを含む一本鎖ヌクレオ
チド配列の形で提供することができる。上記配列は特に
発現ベクター中に組み込むことができ、この場合、真核
発現ベクターが好ましい。上記配列はそれの複製を考慮
して別のベクター、例えばプラスミド、例えばBLUESCRI
PT中に組み込むこともできる。真核発現ベクターとして
は、特にpHβPr1-Neo を挙げることができる。pHβPr1g
ptも挙げることができ、一般にはcDNAの発現を可能にす
るプロモーター調節シグナルおよびポリアデニル化シグ
ナルを含む任意の真核発現ベクターを挙げることができ
る。ベクター−宿主の組合せの選択は明らかに当業者の
能力の範囲内である。
【００１２】特に好ましい本発明の組換えＤＮＡは、そ
れらが好ましくはpHβPr1-Neo 由来である真核発現ベク
ターの形で提供されることを特徴とする。特に真核発現
ベクターの形の上記組換えＤＮＡは、適当な宿主中にTC
R コード配列をトランスフェクトせしめるのに用いるこ
とができる。こうしてトランスフェクトされ、所望によ
り、例えばより良好な発現を獲得するために予めCD3 Ze
ta鎖でトランスフェクトされている宿主細胞は、好まし
くはマウスにおいて免疫原として使用することができ
る。こうして標準手順により、抗体特にモノクローナル
抗体を調製することができ、この場合、使用したマウス
の脾細胞とミエローマ細胞とから得られたハイブリドー
マのスクリーニングは、出発系の非認識に対するトラン
スフェクト系の認識によって行うことができる。
れらが好ましくはpHβPr1-Neo 由来である真核発現ベク
ターの形で提供されることを特徴とする。特に真核発現
ベクターの形の上記組換えＤＮＡは、適当な宿主中にTC
R コード配列をトランスフェクトせしめるのに用いるこ
とができる。こうしてトランスフェクトされ、所望によ
り、例えばより良好な発現を獲得するために予めCD3 Ze
ta鎖でトランスフェクトされている宿主細胞は、好まし
くはマウスにおいて免疫原として使用することができ
る。こうして標準手順により、抗体特にモノクローナル
抗体を調製することができ、この場合、使用したマウス
の脾細胞とミエローマ細胞とから得られたハイブリドー
マのスクリーニングは、出発系の非認識に対するトラン
スフェクト系の認識によって行うことができる。
【００１３】従って、本出願の主題は、上述の組換えＤ
ＮＡを使って調製されることを特徴とする抗体、特にモ
ノクローナル抗体でもある。この抗体は、それらがTCR
鎖に関して、特にTCR 鎖の可変Ｖ領域に関してだけでな
く、与えられたTCR についてのそれらの典型的再配列中
のＤおよびＪ領域に関しても完全に特徴づけられている
ので、注目すべき特性を有する。従って、それらの抗体
はヒトＴ細胞の集団を識別することができ、よって特に
例えば特定の病気または欠損症を認識することができ
る。前記抗体では、ヒトまたは動物における自己免疫疾
患の診断および治療的または予防的療法の両者に対して
顕著な特性を有する抗可変領域抗体、特にＶβ，Ｄおよ
びＪ領域抗体が好ましい。
ＮＡを使って調製されることを特徴とする抗体、特にモ
ノクローナル抗体でもある。この抗体は、それらがTCR
鎖に関して、特にTCR 鎖の可変Ｖ領域に関してだけでな
く、与えられたTCR についてのそれらの典型的再配列中
のＤおよびＪ領域に関しても完全に特徴づけられている
ので、注目すべき特性を有する。従って、それらの抗体
はヒトＴ細胞の集団を識別することができ、よって特に
例えば特定の病気または欠損症を認識することができ
る。前記抗体では、ヒトまたは動物における自己免疫疾
患の診断および治療的または予防的療法の両者に対して
顕著な特性を有する抗可変領域抗体、特にＶβ，Ｄおよ
びＪ領域抗体が好ましい。
【００１４】従って、本発明の主題は、少なくとも１つ
の前記抗体を含有することを特徴とする医薬組成物でも
ある。該医薬組成物は、特にヒト医薬において常用され
る非経口形態、特に注射可能な形態、例えば、皮下、筋
内または静内注射用の形態で提供することができる。前
記抗体は、前記抗体の注入により、免疫病またはＴ細胞
の増殖および白血病Ｔ細胞を引き起こす病気を治療する
のに利用することができる。このためには、抗体は既知
の方法に従って毒素または放射性物質と組み合わせるこ
とができる。本発明の抗体は、特に免疫病、例えば関節
リウマチ、糖尿病、シェーグレン病または紅斑性狼瘡の
治療に用いることができる。使用する生成物、治療する
患者および問題となる病気に従って変化する有効量は、
例えば、細胞毒としてリシンＡと組み合わせて、一日あ
たりおよびヒトの体重１kgあたり本発明のモノクローナ
ル抗体0.001 〜25 mg、好ましくは0.05〜0.2 mg/kg/日
である。
の前記抗体を含有することを特徴とする医薬組成物でも
ある。該医薬組成物は、特にヒト医薬において常用され
る非経口形態、特に注射可能な形態、例えば、皮下、筋
内または静内注射用の形態で提供することができる。前
記抗体は、前記抗体の注入により、免疫病またはＴ細胞
の増殖および白血病Ｔ細胞を引き起こす病気を治療する
のに利用することができる。このためには、抗体は既知
の方法に従って毒素または放射性物質と組み合わせるこ
とができる。本発明の抗体は、特に免疫病、例えば関節
リウマチ、糖尿病、シェーグレン病または紅斑性狼瘡の
治療に用いることができる。使用する生成物、治療する
患者および問題となる病気に従って変化する有効量は、
例えば、細胞毒としてリシンＡと組み合わせて、一日あ
たりおよびヒトの体重１kgあたり本発明のモノクローナ
ル抗体0.001 〜25 mg、好ましくは0.05〜0.2 mg/kg/日
である。
【００１５】前記抗体、特にモノクローナル抗体が、診
断目的、TCR またはTCR 部分の検出、同定または測定に
使用できるとすれば、本発明の主題は前記抗体の用途、
並びに前記抗原の検出、同定または測定用の診断組成物
でもある。前記抗体はTCR 鎖に相当する抗原部分を含む
生成物の精製に使用することもできる。前記抗体は診断
目的でサイトフルオリメトリーに使用することができ、
このためには既知の方法によりFITCや藻紅素といった蛍
光標識物質と接合することができる。
断目的、TCR またはTCR 部分の検出、同定または測定に
使用できるとすれば、本発明の主題は前記抗体の用途、
並びに前記抗原の検出、同定または測定用の診断組成物
でもある。前記抗体はTCR 鎖に相当する抗原部分を含む
生成物の精製に使用することもできる。前記抗体は診断
目的でサイトフルオリメトリーに使用することができ、
このためには既知の方法によりFITCや藻紅素といった蛍
光標識物質と接合することができる。
【００１６】例えば、Ｔ細胞集団の存在は、例えば感
染、癌または自己免疫疾患にかかっている組織において
特異的可変セグメントを検出することにより、およびそ
の存在を既知の方法に従って検出することにより、検出
することができる。前記抗体は酵素を使って標識するこ
ともできる。酵素としては、例えば、グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルコリンエステラー
ゼ、グルコースオキシダーゼまたはβ−ガラクトシダー
ゼを挙げることができる。前記抗体は、人体の疾患部分
において、特異的可変領域を含むＴ細胞集団の画像診断
における使用のために、インジウム111 といった放射能
標識と接合することができる。
染、癌または自己免疫疾患にかかっている組織において
特異的可変セグメントを検出することにより、およびそ
の存在を既知の方法に従って検出することにより、検出
することができる。前記抗体は酵素を使って標識するこ
ともできる。酵素としては、例えば、グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ、アセチルコリンエステラー
ゼ、グルコースオキシダーゼまたはβ−ガラクトシダー
ゼを挙げることができる。前記抗体は、人体の疾患部分
において、特異的可変領域を含むＴ細胞集団の画像診断
における使用のために、インジウム111 といった放射能
標識と接合することができる。
【００１７】本発明の主題は、上記組換えＤＮＡの調製
方法であって、 ─少なくとも制限部位のところまでの哺乳類のＴ細胞抗
原レセプター鎖のＶ，ＤおよびＪ領域をコードする配列
全部により構成されるヌクレオチド配列を、 ─上記と同じ制限部位で出発する上記哺乳類鎖配列のＣ
領域を欠く相補的領域を含むマウス由来のヌクレオチド
配列 と連結せしめ、ここで前記制限部位は所望のキメラ体を
得るために前記２つの配列の一方、他方または両方に人
工的に作製され、次いで所望であれば、前記Ｖ，Ｄ，Ｊ
およびＣ領域の全部を含む配列を真核発現ベクターと連
結せしめ、次いで所望であれば、得られた新規キメラ体
を単離することを特徴とする方法である。
方法であって、 ─少なくとも制限部位のところまでの哺乳類のＴ細胞抗
原レセプター鎖のＶ，ＤおよびＪ領域をコードする配列
全部により構成されるヌクレオチド配列を、 ─上記と同じ制限部位で出発する上記哺乳類鎖配列のＣ
領域を欠く相補的領域を含むマウス由来のヌクレオチド
配列 と連結せしめ、ここで前記制限部位は所望のキメラ体を
得るために前記２つの配列の一方、他方または両方に人
工的に作製され、次いで所望であれば、前記Ｖ，Ｄ，Ｊ
およびＣ領域の全部を含む配列を真核発現ベクターと連
結せしめ、次いで所望であれば、得られた新規キメラ体
を単離することを特徴とする方法である。
【００１８】好ましい態様では、上記方法は、更に、コ
ード鎖に類似した鎖を除きＴ細胞抗原レセプターの合成
を可能にする全ての要素を含む真核細胞を前記キメラ配
列によりトランスフェクトせしめ、こうしてトランスフ
ェクトされた細胞を対応するマウス株において抗原とし
て使用し、該抗原を投与したマウスから取り出した脾細
胞をミエローマ細胞と融合し、既知の方法に従って哺乳
類可変配列の生産物に対して向けられた抗体を調製する
ことを特徴とする。
ード鎖に類似した鎖を除きＴ細胞抗原レセプターの合成
を可能にする全ての要素を含む真核細胞を前記キメラ配
列によりトランスフェクトせしめ、こうしてトランスフ
ェクトされた細胞を対応するマウス株において抗原とし
て使用し、該抗原を投与したマウスから取り出した脾細
胞をミエローマ細胞と融合し、既知の方法に従って哺乳
類可変配列の生産物に対して向けられた抗体を調製する
ことを特徴とする。
【００１９】上記方法は特に次のようにして実施するこ
とができる。まず、前記配列を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ
を使って出発し、２つの異なる制限酵素、即ちＣ領域の
ところの選択した制限部位に相当する酵素、例えばBglI
I 、およびヘッド遺伝子の後方で反対側の配列を切断す
るもう１つの酵素、例えば前記配列を含む直鎖状二本鎖
ＤＮＡで始まるEcoRI で切断することにより、哺乳類TC
R 鎖のＶ，ＤおよびＪ領域をコードするヌクレオチド配
列、特に哺乳類TCR 鎖のＶ，Ｊ，場合によりＤ領域およ
びＣ領域をコードする配列、並びにそれのヘッド遺伝子
を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡを得る。こうして得られたＤ
ＮＡを、同じ２つの制限酵素により処理されたベクター
と連結せしめる。このベクターはTCR 鎖のＣセグメント
をコードする配列、および上記と同じ制限部位、例えば
BglII とEcoRI を含む。こうして所望のキメラ遺伝子が
得られる。しかしながら、このキメラ遺伝子はそれだけ
では発現できない。このため、他方で、該キメラ体を含
むベクターを、TCR キメラ体をコードするキメラ遺伝子
の両方の領域を切断する２つの制限酵素により処理し、
他方で、真核発現ベクターを同じ２つの制限酵素で処理
する。上記で得られたTCR キメラ鎖をコードする遺伝子
を前記真核発現ベクターと連結せしめることにより、新
規キメラ真核発現ベクターを得る。この真核発現ベクタ
ーは、TCR をコードするキメラ遺伝子の正しい転写を保
証するのに必要な要素を含まなければならない。この理
由のため、ベクターとして例えばpHβPr-1-Neoを挙げる
ことができる。これはBamHI およびSalIにより切断する
ことができ、そして特に選択マーカーとして利用される
ネオマイシン耐性遺伝子、SV40真核プロモーター遺伝
子、およびBamHI 部位の近くにポリアデニル化マーカー
を含む。得られた新規キメラベクターは、真核細胞、好
ましくはマウスのＴ細胞、特にキメラベクターにより供
給される遺伝子を除きTCR の発現のための全ての要素を
含む細胞系からのもの、をトランスフェクトせしめるの
に有利に使用される。例としてはマウス細胞系DOIS 19
またはDS 23,27,4と称するものを挙げることができる。
そのような細胞は、細胞の表面上にTCR を発現すること
ができるものだけであるトランスフェクト細胞を容易に
選択することが可能である。
とができる。まず、前記配列を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡ
を使って出発し、２つの異なる制限酵素、即ちＣ領域の
ところの選択した制限部位に相当する酵素、例えばBglI
I 、およびヘッド遺伝子の後方で反対側の配列を切断す
るもう１つの酵素、例えば前記配列を含む直鎖状二本鎖
ＤＮＡで始まるEcoRI で切断することにより、哺乳類TC
R 鎖のＶ，ＤおよびＪ領域をコードするヌクレオチド配
列、特に哺乳類TCR 鎖のＶ，Ｊ，場合によりＤ領域およ
びＣ領域をコードする配列、並びにそれのヘッド遺伝子
を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡを得る。こうして得られたＤ
ＮＡを、同じ２つの制限酵素により処理されたベクター
と連結せしめる。このベクターはTCR 鎖のＣセグメント
をコードする配列、および上記と同じ制限部位、例えば
BglII とEcoRI を含む。こうして所望のキメラ遺伝子が
得られる。しかしながら、このキメラ遺伝子はそれだけ
では発現できない。このため、他方で、該キメラ体を含
むベクターを、TCR キメラ体をコードするキメラ遺伝子
の両方の領域を切断する２つの制限酵素により処理し、
他方で、真核発現ベクターを同じ２つの制限酵素で処理
する。上記で得られたTCR キメラ鎖をコードする遺伝子
を前記真核発現ベクターと連結せしめることにより、新
規キメラ真核発現ベクターを得る。この真核発現ベクタ
ーは、TCR をコードするキメラ遺伝子の正しい転写を保
証するのに必要な要素を含まなければならない。この理
由のため、ベクターとして例えばpHβPr-1-Neoを挙げる
ことができる。これはBamHI およびSalIにより切断する
ことができ、そして特に選択マーカーとして利用される
ネオマイシン耐性遺伝子、SV40真核プロモーター遺伝
子、およびBamHI 部位の近くにポリアデニル化マーカー
を含む。得られた新規キメラベクターは、真核細胞、好
ましくはマウスのＴ細胞、特にキメラベクターにより供
給される遺伝子を除きTCR の発現のための全ての要素を
含む細胞系からのもの、をトランスフェクトせしめるの
に有利に使用される。例としてはマウス細胞系DOIS 19
またはDS 23,27,4と称するものを挙げることができる。
そのような細胞は、細胞の表面上にTCR を発現すること
ができるものだけであるトランスフェクト細胞を容易に
選択することが可能である。
【００２０】もちろん、各々の融合（上記および下記
の）の後、適当な宿主のトランスフェクションおよび所
望のキメラ体を含む細胞の選択を行うことができる。ト
ランスフェクト細胞は、例えば腹腔内注射により、抗原
として好ましくはマウスに投与することができる。こう
して処理されたマウスの脾細胞（この細胞は所望の抗体
を分泌することができる）を取り出して不死細胞系、例
えばミエローマと融合させる。所望の抗体を産生する選
択されたハイブリドーマは、選択された哺乳類、特にヒ
トのTCR の特異的Ｖ鎖に対して向けられた抗体、特にモ
ノクローナル抗体の調製を可能にする。
の）の後、適当な宿主のトランスフェクションおよび所
望のキメラ体を含む細胞の選択を行うことができる。ト
ランスフェクト細胞は、例えば腹腔内注射により、抗原
として好ましくはマウスに投与することができる。こう
して処理されたマウスの脾細胞（この細胞は所望の抗体
を分泌することができる）を取り出して不死細胞系、例
えばミエローマと融合させる。所望の抗体を産生する選
択されたハイブリドーマは、選択された哺乳類、特にヒ
トのTCR の特異的Ｖ鎖に対して向けられた抗体、特にモ
ノクローナル抗体の調製を可能にする。
【００２１】哺乳類Ｔ細胞抗原のレセプター鎖をコード
する二本鎖ＤＮＡは、例えば、次のようにして調製する
ことができる。特定の鎖の遺伝子コード配列の研究は、
定常Ｃ領域上に既に存在する制限部位を選択することを
可能にする。即ち、それは前記配列上へのそのような部
位の造成をもたらす。例えば下記群：Ｖβ１，Ｖβ２，
Ｖβ３，Ｖβ４，Ｖβ５，Ｖβ６，Ｖβ７，Ｖβ８，Ｖ
β10，Ｖβ11，Ｖβ12，Ｖβ15，Ｖβ17，Ｖβ18の鎖に
関するそれらの配列の認識は、メッセンジャーＲＮＡか
ら相補的ＤＮＡを合成するのに用いることができる新規
オリゴヌクレオチドの合成を可能にする。与えられたTC
R 鎖をコードするmRNAを哺乳類（例えばヒト）Ｔリンパ
球から精製する。適当ならば選ばれたユニーク制限部位
を含む与えられた哺乳類遺伝子の特異的 OhCβオリゴヌ
クレオチドを使って、対応するＤＮＡを合成し、その鎖
の特異的オリゴヌクレオチドと逆転写酵素を使って第二
鎖を合成し、そして得られた遺伝子をポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を例えば約30サイクル行うことにより増
幅する。
する二本鎖ＤＮＡは、例えば、次のようにして調製する
ことができる。特定の鎖の遺伝子コード配列の研究は、
定常Ｃ領域上に既に存在する制限部位を選択することを
可能にする。即ち、それは前記配列上へのそのような部
位の造成をもたらす。例えば下記群：Ｖβ１，Ｖβ２，
Ｖβ３，Ｖβ４，Ｖβ５，Ｖβ６，Ｖβ７，Ｖβ８，Ｖ
β10，Ｖβ11，Ｖβ12，Ｖβ15，Ｖβ17，Ｖβ18の鎖に
関するそれらの配列の認識は、メッセンジャーＲＮＡか
ら相補的ＤＮＡを合成するのに用いることができる新規
オリゴヌクレオチドの合成を可能にする。与えられたTC
R 鎖をコードするmRNAを哺乳類（例えばヒト）Ｔリンパ
球から精製する。適当ならば選ばれたユニーク制限部位
を含む与えられた哺乳類遺伝子の特異的 OhCβオリゴヌ
クレオチドを使って、対応するＤＮＡを合成し、その鎖
の特異的オリゴヌクレオチドと逆転写酵素を使って第二
鎖を合成し、そして得られた遺伝子をポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を例えば約30サイクル行うことにより増
幅する。
【００２２】こうして多量の直鎖状二本鎖コードＤＮＡ
が得られる。次いでPCR により製造された断片を、選ば
れた部位からＣ領域の全部または一部分を削除しそして
配列Ｖ，ＤおよびＪ並びにヘッド遺伝子を保持するため
に、適当な酵素、例えばBglII およびEcoRI により切断
する。前記哺乳類鎖配列を欠くＣ領域の相補的部分を含
むマウス起源のヌクレオチド配列は、これが前記配列を
含むベクターの形で見つかる場合、次のようにして調製
することができる。マウス細胞系、例えばKB5C20由来の
cDNAバンクから選択されたTCR 鎖のコード領域の全部を
含む完全なcDNAを、既知のプローブを使って単離する。
このcDNAを適当なプラスミド、例えばpUC19 中でクロー
ニングし、次いで得られたプラスミド（この場合 pUCmC
β2 と称する）を宿主、例えば大腸菌（E. coli ）株DH
1 中にトランスフェクトせしめる。
が得られる。次いでPCR により製造された断片を、選ば
れた部位からＣ領域の全部または一部分を削除しそして
配列Ｖ，ＤおよびＪ並びにヘッド遺伝子を保持するため
に、適当な酵素、例えばBglII およびEcoRI により切断
する。前記哺乳類鎖配列を欠くＣ領域の相補的部分を含
むマウス起源のヌクレオチド配列は、これが前記配列を
含むベクターの形で見つかる場合、次のようにして調製
することができる。マウス細胞系、例えばKB5C20由来の
cDNAバンクから選択されたTCR 鎖のコード領域の全部を
含む完全なcDNAを、既知のプローブを使って単離する。
このcDNAを適当なプラスミド、例えばpUC19 中でクロー
ニングし、次いで得られたプラスミド（この場合 pUCmC
β2 と称する）を宿主、例えば大腸菌（E. coli ）株DH
1 中にトランスフェクトせしめる。
【００２３】次いでマウスＤＮＡの有用な断片をファー
ジ中でクローニングすることができる。このためには、
pUCmCβ2 を適当な制限酵素、例えばEcoRI とHindIII
により消化し、上記場合３つの断片を得ることができ
る。所望のマウスＣ鎖のコード配列の全部を含む断片を
精製する（上述した酵素の場合、EcoRI は該配列のＶ領
域中を切断する）。こうして、Ｖ領域の一部、並びに
Ｄ，ＪおよびＣ領域の全部をコードする配列が得られ
る。次いでこの配列を上記と同じ制限酵素を使って適当
なファージ、例えばM13mp18 と連結せしめる。この場
合、ファージＤＮＡは２つの形態、即ち組み込み形ファ
ージの一本鎖、そして複製形態の二本鎖で存在する。所
望の変異を除く変異しようとする領域の相補的オリゴヌ
クレオチドを、該ファージの一本鎖形態とハイブリダイ
ズせしめる。この相補鎖は、反応を開始させるのに同じ
オリゴヌクレオチドを使ってＤＮＡポリメラーゼにより
試験管内で合成する。リガーゼを使って新規鎖を自己閉
環させる。完全に相同の二本鎖を例えば大腸菌、特にJM
101 中にトランスフェクトせしめる。例えば放射能標識
オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによ
り、変異体コロニーを選択する。部位特異的突然変異誘
発の詳細については、MANIATISら(Molecular Cloning;A
Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Labor
atory Press) を参照のこと。
ジ中でクローニングすることができる。このためには、
pUCmCβ2 を適当な制限酵素、例えばEcoRI とHindIII
により消化し、上記場合３つの断片を得ることができ
る。所望のマウスＣ鎖のコード配列の全部を含む断片を
精製する（上述した酵素の場合、EcoRI は該配列のＶ領
域中を切断する）。こうして、Ｖ領域の一部、並びに
Ｄ，ＪおよびＣ領域の全部をコードする配列が得られ
る。次いでこの配列を上記と同じ制限酵素を使って適当
なファージ、例えばM13mp18 と連結せしめる。この場
合、ファージＤＮＡは２つの形態、即ち組み込み形ファ
ージの一本鎖、そして複製形態の二本鎖で存在する。所
望の変異を除く変異しようとする領域の相補的オリゴヌ
クレオチドを、該ファージの一本鎖形態とハイブリダイ
ズせしめる。この相補鎖は、反応を開始させるのに同じ
オリゴヌクレオチドを使ってＤＮＡポリメラーゼにより
試験管内で合成する。リガーゼを使って新規鎖を自己閉
環させる。完全に相同の二本鎖を例えば大腸菌、特にJM
101 中にトランスフェクトせしめる。例えば放射能標識
オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによ
り、変異体コロニーを選択する。部位特異的突然変異誘
発の詳細については、MANIATISら(Molecular Cloning;A
Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Labor
atory Press) を参照のこと。
【００２４】所望の変異を含むがＣ領域のコード配列の
残りは正しく保持されているサブクローンの二本鎖ＤＮ
Ａを精製し、そして適当な酵素、例えばEcoRI とEcoRV
により切断し、所望の遺伝子を含む断片を単離する。次
いでこの断片を適当なプラスミド中に連結せしめる。該
プラスミドは配列決定することが可能であり、そして挿
入された配列を発現ベクター中に導入するために容易に
抽出しそしてその多重結合部位中に存在する対応する酵
素、例えばEcoRI とSmaIにより予め開環することが可能
である制限部位を含む。通常通り、連結生成物を適当な
宿主、例えば大腸菌DH1 中にトランスフェクトせしめる
ことができる。例えば、EcoRI-XbaIおよびEcoRI-BglII
といった２組の酵素ペアで切断することにより分析し、
電気泳動時に所望のバンドを提供するクローンを選択す
ることができる。
残りは正しく保持されているサブクローンの二本鎖ＤＮ
Ａを精製し、そして適当な酵素、例えばEcoRI とEcoRV
により切断し、所望の遺伝子を含む断片を単離する。次
いでこの断片を適当なプラスミド中に連結せしめる。該
プラスミドは配列決定することが可能であり、そして挿
入された配列を発現ベクター中に導入するために容易に
抽出しそしてその多重結合部位中に存在する対応する酵
素、例えばEcoRI とSmaIにより予め開環することが可能
である制限部位を含む。通常通り、連結生成物を適当な
宿主、例えば大腸菌DH1 中にトランスフェクトせしめる
ことができる。例えば、EcoRI-XbaIおよびEcoRI-BglII
といった２組の酵素ペアで切断することにより分析し、
電気泳動時に所望のバンドを提供するクローンを選択す
ることができる。
【００２５】精製されたプラスミドは、読み枠内での同
位相連結を可能にするように、同じ制限部位から上記哺
乳類鎖配列を欠いたＣ領域に相補的なマウス起源の所望
のヌクレオチド配列を含む。上記のことから、本発明の
方法は、ごく限定された数のマウス起源のセグメントか
らの、TCR 鎖のＶ領域の異なる構造の特異的抗体群、特
にモノクローナル抗体の調製を可能にする。実際に、Ｃ
領域をコードする前記マウスセグメントは、変異によ
り、ヒト起源の定常鎖のほとんど全部に存在する制限部
位、例えばヒト鎖Ｃβ１とＣβ２についてはBglII を含
む。上記で使用する種々の技術は当業者にとって周知で
あり、技術の現状の一部である多数の刊行物の主題であ
る。下記の実施例は、本発明を限定することなく本発明
を説明する。
位相連結を可能にするように、同じ制限部位から上記哺
乳類鎖配列を欠いたＣ領域に相補的なマウス起源の所望
のヌクレオチド配列を含む。上記のことから、本発明の
方法は、ごく限定された数のマウス起源のセグメントか
らの、TCR 鎖のＶ領域の異なる構造の特異的抗体群、特
にモノクローナル抗体の調製を可能にする。実際に、Ｃ
領域をコードする前記マウスセグメントは、変異によ
り、ヒト起源の定常鎖のほとんど全部に存在する制限部
位、例えばヒト鎖Ｃβ１とＣβ２についてはBglII を含
む。上記で使用する種々の技術は当業者にとって周知で
あり、技術の現状の一部である多数の刊行物の主題であ
る。下記の実施例は、本発明を限定することなく本発明
を説明する。
【００２６】実施例１ Ｊ領域の近くのＣ領域内のTCR β１およびβ２鎖をコー
ドする遺伝子上のBglII 部位の存在と、マウスの対応領
域中の２塩基を除く同一部位の存在を利用する（図１参
照）。 Ａ）β２鎖のヒト配列を欠くＣ領域の相補的部分を含む
マウス起源のヌクレオチド配列を含んで成るベクターの
調製 １．マウスＣβ２鎖 マウスＣβ２鎖の配列はMalissen M. ら(1984), Cell 3
7:1101-1110 に詳細に記載されている。Ｃβ２のコード
部分の全部を含む完全cDNAをKB5C20マウス細胞系のcDNA
バンクから得た〔Albertら(1982), Immunogenetics 16:
533-549 に記載〕。このcDNAをpUC19 プラスミド中でク
ローニングした。得られたプラスミド pUCmCβ2 を菌株
DH1 中にトランスフェクトせしめた。組換え菌は、1991
年 2月12日にパリのCNCM (Collection Nationale de Cu
ltures de Microorganismes)にI-1032のもとに寄託され
ており、制限なく自由に入手可能である。
ドする遺伝子上のBglII 部位の存在と、マウスの対応領
域中の２塩基を除く同一部位の存在を利用する（図１参
照）。 Ａ）β２鎖のヒト配列を欠くＣ領域の相補的部分を含む
マウス起源のヌクレオチド配列を含んで成るベクターの
調製 １．マウスＣβ２鎖 マウスＣβ２鎖の配列はMalissen M. ら(1984), Cell 3
7:1101-1110 に詳細に記載されている。Ｃβ２のコード
部分の全部を含む完全cDNAをKB5C20マウス細胞系のcDNA
バンクから得た〔Albertら(1982), Immunogenetics 16:
533-549 に記載〕。このcDNAをpUC19 プラスミド中でク
ローニングした。得られたプラスミド pUCmCβ2 を菌株
DH1 中にトランスフェクトせしめた。組換え菌は、1991
年 2月12日にパリのCNCM (Collection Nationale de Cu
ltures de Microorganismes)にI-1032のもとに寄託され
ており、制限なく自由に入手可能である。
【００２７】２．マウスＣβ２鎖をコードするcDNAの部
位特異的突然変異誘発 原理 ：選んだ部位特異的突然変異誘発法は、繊維状ファ
ージM13mp18 BIORADを使用する。このバクテリオファー
ジはNorrander ら(1983) Gene 26:101-106に明確に記載
されている。それは幾つかの製造業者、特にBIORADから
市販されている。操作原理は次のようである。まず、変
異しようとするＤＮＡ断片を該ファージの多重結合部位
上でクローニングする。このファージベクターは生活環
の間２つの形態で存在する。細菌中での複製形態は本質
的に二本鎖であり、組み込み形態は一本鎖である。両形
態のＤＮＡが精製可能である。所望の変異を除き変異し
ようとする領域に相補的なオリゴヌクレオチドをファー
ジの一本鎖形とハイブリダイズせしめる。次いで反応を
開始させるのに所望の変異を含むオリゴヌクレオチドを
使ってＤＮＡポリメラーゼを用いて試験管内で相補鎖を
合成する。リガーゼを使って該オリゴヌクレオチドの
５′末端のところで新規鎖を自己閉環せしめる。所望の
変異以外は完全に相同の二本鎖を大腸菌（E. coli ）中
にトランスフェクトせしめ、変異体コロニーと非変異体
コロニーの２組を生ぜしめる。変異体コロニーを選択す
る。
位特異的突然変異誘発 原理 ：選んだ部位特異的突然変異誘発法は、繊維状ファ
ージM13mp18 BIORADを使用する。このバクテリオファー
ジはNorrander ら(1983) Gene 26:101-106に明確に記載
されている。それは幾つかの製造業者、特にBIORADから
市販されている。操作原理は次のようである。まず、変
異しようとするＤＮＡ断片を該ファージの多重結合部位
上でクローニングする。このファージベクターは生活環
の間２つの形態で存在する。細菌中での複製形態は本質
的に二本鎖であり、組み込み形態は一本鎖である。両形
態のＤＮＡが精製可能である。所望の変異を除き変異し
ようとする領域に相補的なオリゴヌクレオチドをファー
ジの一本鎖形とハイブリダイズせしめる。次いで反応を
開始させるのに所望の変異を含むオリゴヌクレオチドを
使ってＤＮＡポリメラーゼを用いて試験管内で相補鎖を
合成する。リガーゼを使って該オリゴヌクレオチドの
５′末端のところで新規鎖を自己閉環せしめる。所望の
変異以外は完全に相同の二本鎖を大腸菌（E. coli ）中
にトランスフェクトせしめ、変異体コロニーと非変異体
コロニーの２組を生ぜしめる。変異体コロニーを選択す
る。
【００２８】マウスＣβ２鎖のcDNA中にBglII 部位を導
入するために、このcDNAをファージM13mp18 中でクロー
ニングする。図２のオリゴヌクレオチドを突然変異誘発
に使用する。このオリゴヌクレオチドは、BglII 部位を
導入するのに必要な２塩基を除きマウスＣβ２遺伝子を
コードするcDNAと相補的である。それらの２塩基は図２
において下線が引かれている。クローニング、トランス
フェクション、ストレッチング、コロニーの分析、一本
鎖および二本鎖形のファージM13mp18 の精製の方法はMa
niatisら（前掲）により詳細に記載されている。使用す
る細菌宿主は大腸菌（E. coli ）JM101 株である。
入するために、このcDNAをファージM13mp18 中でクロー
ニングする。図２のオリゴヌクレオチドを突然変異誘発
に使用する。このオリゴヌクレオチドは、BglII 部位を
導入するのに必要な２塩基を除きマウスＣβ２遺伝子を
コードするcDNAと相補的である。それらの２塩基は図２
において下線が引かれている。クローニング、トランス
フェクション、ストレッチング、コロニーの分析、一本
鎖および二本鎖形のファージM13mp18 の精製の方法はMa
niatisら（前掲）により詳細に記載されている。使用す
る細菌宿主は大腸菌（E. coli ）JM101 株である。
【００２９】実験： ａ）M13mp18 中でのマウスＣβ２のクローニング pUCmCβ2 をEcoRI とHindIII で消化する。この消化
は、アガロースゲル電気泳動により区別可能な３断片を
提供する。マウスＣβ２のコード配列の全部を含む約10
0 塩基対(bp)の中間断片を精製する。この断片を、ファ
ージM13mp18 ベクターのEcoRI とHindIII （この２つの
制限部位はベクターの多重結合部位中に存在する）で予
め開環されたM13mp18 ファージの二本鎖ＤＮＡ中に連結
せしめ、次いで大腸菌JM101 コロニーをトランスフェク
トせしめる。単離したコロニーの分析から、クローンM1
3EHCβ7を更なる実験のため保持し、一本鎖形のM13EHC
β7を精製する。
は、アガロースゲル電気泳動により区別可能な３断片を
提供する。マウスＣβ２のコード配列の全部を含む約10
0 塩基対(bp)の中間断片を精製する。この断片を、ファ
ージM13mp18 ベクターのEcoRI とHindIII （この２つの
制限部位はベクターの多重結合部位中に存在する）で予
め開環されたM13mp18 ファージの二本鎖ＤＮＡ中に連結
せしめ、次いで大腸菌JM101 コロニーをトランスフェク
トせしめる。単離したコロニーの分析から、クローンM1
3EHCβ7を更なる実験のため保持し、一本鎖形のM13EHC
β7を精製する。
【００３０】ｂ）マウスＣβ２の突然変異誘発 使用する方法はManiatisらにより詳細に記載されてい
る。しかしながら、次の点を明確にしなければならな
い。 ・図２のオリゴヌクレオチドはApplied Biosystems 380
B 装置で合成し、次いでSep Pak C18 カラム上で精製す
る。 ・0.2 μg の一本鎖M13EHCβ7 を３ピコモルの OhCβキ
ナーゼとハイブリダイズさせる。他のオリゴヌクレオチ
ドは全く使用しない。ハイブリダイゼーション反応の開
始温度は70℃である。 ・使用するポリメラーゼは、二本鎖を完全にするT4 DNA
ポリメラーゼ（反応あたり１単位）である。
る。しかしながら、次の点を明確にしなければならな
い。 ・図２のオリゴヌクレオチドはApplied Biosystems 380
B 装置で合成し、次いでSep Pak C18 カラム上で精製す
る。 ・0.2 μg の一本鎖M13EHCβ7 を３ピコモルの OhCβキ
ナーゼとハイブリダイズさせる。他のオリゴヌクレオチ
ドは全く使用しない。ハイブリダイゼーション反応の開
始温度は70℃である。 ・使用するポリメラーゼは、二本鎖を完全にするT4 DNA
ポリメラーゼ（反応あたり１単位）である。
【００３１】・トランスフェクションは大腸菌JM101 株
中で行う。 ・変異体コロニーの選択は、図２の放射能標識オリゴヌ
クレオチドとのハイブリダイゼーションによって行う。
ハイブリダイゼーション温度は42℃である。オートラジ
オグラフィーにより変異体コロニーを識別するのに４℃
での２回の２分間洗浄が十分であった。 放射性ハイブリダイゼーションにより位置づけられたコ
ロニーの muCβ215 と称するサブクローンのＤＮＡをBg
lII で消化し、次いで所望の変異およびマウスＣβ２配
列の残部の完全性の確認のため、サンガー法により配列
決定した。
中で行う。 ・変異体コロニーの選択は、図２の放射能標識オリゴヌ
クレオチドとのハイブリダイゼーションによって行う。
ハイブリダイゼーション温度は42℃である。オートラジ
オグラフィーにより変異体コロニーを識別するのに４℃
での２回の２分間洗浄が十分であった。 放射性ハイブリダイゼーションにより位置づけられたコ
ロニーの muCβ215 と称するサブクローンのＤＮＡをBg
lII で消化し、次いで所望の変異およびマウスＣβ２配
列の残部の完全性の確認のため、サンガー法により配列
決定した。
【００３２】３．pBluescript SK+ 中での変異鎖のサブ
クローニング pBluescript SK+ は、完全に特徴づけられておりそして
STRATAGENE社から市販されているプラスミドである。mu
Cβ215 の二本鎖ＤＮＡをEcoRI とEcoRV で切断し、２
断片のうちの小さい方をアガロースゲル上で精製する。
この断片をEcoRI とSmaIで予め開環しておいたpBluescr
ipt 中に連結せしめ（EcoRI とSmaIの２部位はこのプラ
スミドのポリリンカー中に存在する）、そして該キメラ
体の宿主として働く大腸菌DH1 中にトランスフェクトせ
しめる。単離したコロニーを２組の酵素ペアEcoRI-XbaI
およびEcoRI-BglII での切断により分析する。pBsmuCβ
215 と命名した１つのクローンは電気泳動時に所望のバ
ンド（それぞれ約1.2 kbおよび0.5 kb）を提供する。こ
のプラスミドを精製し、次の実験に使用する。
クローニング pBluescript SK+ は、完全に特徴づけられておりそして
STRATAGENE社から市販されているプラスミドである。mu
Cβ215 の二本鎖ＤＮＡをEcoRI とEcoRV で切断し、２
断片のうちの小さい方をアガロースゲル上で精製する。
この断片をEcoRI とSmaIで予め開環しておいたpBluescr
ipt 中に連結せしめ（EcoRI とSmaIの２部位はこのプラ
スミドのポリリンカー中に存在する）、そして該キメラ
体の宿主として働く大腸菌DH1 中にトランスフェクトせ
しめる。単離したコロニーを２組の酵素ペアEcoRI-XbaI
およびEcoRI-BglII での切断により分析する。pBsmuCβ
215 と命名した１つのクローンは電気泳動時に所望のバ
ンド（それぞれ約1.2 kbおよび0.5 kb）を提供する。こ
のプラスミドを精製し、次の実験に使用する。
【００３３】Ｂ）TCR 鎖をコードするヒトcDNAの調製 下記の理由でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技術を
選んだ。 ──異なるＶ領域を含むTCR 鎖をコードする多数の遺伝
子が発表されていること； ──この技術を使ってcDNAの迅速な調製が可能なこと； ──開始ＡＴＧコドンを含む５′位に完全な遺伝子を有
する確実性； ──クローニングを促進するために遺伝子の５′位に制
限部位を組み込むことができること。 好ましい例では、本発明により許容される多価性を示す
ために、異なる可変セグメントを含む幾つかのヒトcDNA
を単離し、そして変異マウスＣβ２鎖に結合させた。
選んだ。 ──異なるＶ領域を含むTCR 鎖をコードする多数の遺伝
子が発表されていること； ──この技術を使ってcDNAの迅速な調製が可能なこと； ──開始ＡＴＧコドンを含む５′位に完全な遺伝子を有
する確実性； ──クローニングを促進するために遺伝子の５′位に制
限部位を組み込むことができること。 好ましい例では、本発明により許容される多価性を示す
ために、異なる可変セグメントを含む幾つかのヒトcDNA
を単離し、そして変異マウスＣβ２鎖に結合させた。
【００３４】ヒトＴ細胞からのmRNAの調製 コーカサス人からの末梢リンパ球の混合物（マルセイユ
のCentre de Transfusion Sanguineから入手）を使用す
る。フィコール処理後、リンパ球をRPMI培地、10％ウシ
胎児血清、20mMグルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウ
ム、500IU ペニシリン中１mlあたり106 細胞に調整し、
フィトヘマグルチニンＡ（10μg/mlの最終濃度）で３日
間刺激する。200 ×106 細胞を全RNA の精製に使用す
る。使用したプロトコールはManiatisらにより詳細に記
載されている。この方法により約50μg のRNA が得られ
る。
のCentre de Transfusion Sanguineから入手）を使用す
る。フィコール処理後、リンパ球をRPMI培地、10％ウシ
胎児血清、20mMグルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウ
ム、500IU ペニシリン中１mlあたり106 細胞に調整し、
フィトヘマグルチニンＡ（10μg/mlの最終濃度）で３日
間刺激する。200 ×106 細胞を全RNA の精製に使用す
る。使用したプロトコールはManiatisらにより詳細に記
載されている。この方法により約50μg のRNA が得られ
る。
【００３５】ＰＣＲ反応 ２つのヒトＣβ２およびＣβ１鎖に特異的であり、そし
て遺伝子断片Ｃβ１およびＣβ２上に存在するユニーク
BglII 部位を含む OhCβオリゴヌクレオチドをOmCβと
同様にして合成する。Toyonagaら(1987), Eur. J. Immu
nol. 17:375-383 のＶβサブファミリーの定義によれば
Ｖβ1.2,Ｖβ2.1,Ｖβ3.1,Ｖβ8.1,Ｖβ12.3のヘッド配
列にそれぞれ特異的な５つのオリゴヌクレオチドOL1, O
L2, OL3, OL8,OL12も合成する。それらのオリゴヌクレ
オチドは可変領域のヘッド配列上にハイブリダイズしな
い８塩基TAGAATTCを５′位に有する。それらの８塩基は
増幅生成物のクローニングを促進するためのEcoRI 部位
を含む。それらのオリゴヌクレオチドを図３に示す。
て遺伝子断片Ｃβ１およびＣβ２上に存在するユニーク
BglII 部位を含む OhCβオリゴヌクレオチドをOmCβと
同様にして合成する。Toyonagaら(1987), Eur. J. Immu
nol. 17:375-383 のＶβサブファミリーの定義によれば
Ｖβ1.2,Ｖβ2.1,Ｖβ3.1,Ｖβ8.1,Ｖβ12.3のヘッド配
列にそれぞれ特異的な５つのオリゴヌクレオチドOL1, O
L2, OL3, OL8,OL12も合成する。それらのオリゴヌクレ
オチドは可変領域のヘッド配列上にハイブリダイズしな
い８塩基TAGAATTCを５′位に有する。それらの８塩基は
増幅生成物のクローニングを促進するためのEcoRI 部位
を含む。それらのオリゴヌクレオチドを図３に示す。
【００３６】オリゴヌクレオチドペア OhCβ−OLi （こ
こでｉは1, 2, 3, 8, 12の要素である）を使って５つの
独立したPCR 反応を行った。まずペア OhCβ−OL8 を使
って出発した。実験手順はKawasakiら(1989), PCR Tech
nology, Principles and Applications for DNA Amplif
ication ; Stockton Press, Henry A. Ehrlich編, p89
に詳細に記載されている。下記の情報が有用である。cD
NAの相補的鎖の合成のための開始時のRNA の量は１μｇ
である。PCR 反応自体にはオリゴヌクレオチドOL8 と O
hCβ各々10ピコモルを使う。PCR サイクルは、 ─95℃で１分間の変性、 ─52℃で１分間のハイブリダイゼーション、 ─72℃で１分間の伸長 であり、DNA Thermalcycler Version 2.2 (Perkin Elme
r)上で30サイクルを行う。
こでｉは1, 2, 3, 8, 12の要素である）を使って５つの
独立したPCR 反応を行った。まずペア OhCβ−OL8 を使
って出発した。実験手順はKawasakiら(1989), PCR Tech
nology, Principles and Applications for DNA Amplif
ication ; Stockton Press, Henry A. Ehrlich編, p89
に詳細に記載されている。下記の情報が有用である。cD
NAの相補的鎖の合成のための開始時のRNA の量は１μｇ
である。PCR 反応自体にはオリゴヌクレオチドOL8 と O
hCβ各々10ピコモルを使う。PCR サイクルは、 ─95℃で１分間の変性、 ─52℃で１分間のハイブリダイゼーション、 ─72℃で１分間の伸長 であり、DNA Thermalcycler Version 2.2 (Perkin Elme
r)上で30サイクルを行う。
【００３７】反応生成物を電気泳動のため1.4 ％アガロ
ースゲル上に負荷する。臭化エチジウムでの着色後、約
500 bpの明瞭なバンドを切り取り、ＤＮＡを電気溶出せ
しめる。約30 ng のＤＮＡが得られる。このＤＮＡの１
ngを２回目のPCR により増幅させる。特定のバンドを上
記と同様にして精製し、約300 ngのＤＮＡを得る。同様
にして、 OhCβと組み合わせたOL1, OL2, OL3, OL12 ペ
アをそれぞれ使ってPCR 反応を行った。ただし、OL12と
OL3 の場合には２回目のPCR 反応は不要であった（１回
目の増幅で100 ng以上が得られた）。
ースゲル上に負荷する。臭化エチジウムでの着色後、約
500 bpの明瞭なバンドを切り取り、ＤＮＡを電気溶出せ
しめる。約30 ng のＤＮＡが得られる。このＤＮＡの１
ngを２回目のPCR により増幅させる。特定のバンドを上
記と同様にして精製し、約300 ngのＤＮＡを得る。同様
にして、 OhCβと組み合わせたOL1, OL2, OL3, OL12 ペ
アをそれぞれ使ってPCR 反応を行った。ただし、OL12と
OL3 の場合には２回目のPCR 反応は不要であった（１回
目の増幅で100 ng以上が得られた）。
【００３８】Ｃ）キメラ遺伝子の作製 原理 ：pBSmuCβ215 の消化から得られた大断片中にEcoR
I とBglII で切断された各PCR 生成物断片をクローニン
グすることにより、キメラ遺伝子を作製する。pBSmuCβ
215 をEcoRI とBglII で切断し、 FpBSmuCβ215 と命名
した大断片をアガロースゲル上で精製し、電気溶出させ
る。OL8− OhCβオリゴヌクレオチドペアを使って得ら
れた増幅生成物100 ngをEcoRI とBglII で切断する。そ
れらの２断片を連結せしめ、連結生成物をDH1 中にトラ
ンスフェクトせしめる。
I とBglII で切断された各PCR 生成物断片をクローニン
グすることにより、キメラ遺伝子を作製する。pBSmuCβ
215 をEcoRI とBglII で切断し、 FpBSmuCβ215 と命名
した大断片をアガロースゲル上で精製し、電気溶出させ
る。OL8− OhCβオリゴヌクレオチドペアを使って得ら
れた増幅生成物100 ngをEcoRI とBglII で切断する。そ
れらの２断片を連結せしめ、連結生成物をDH1 中にトラ
ンスフェクトせしめる。
【００３９】単離したコロニー BSGβ8.1, BSGβ8.2 …
BSGβ8.5 のBglII-EcoRI 消化による分析は、約500 bp
の所望の断片を提供する。 BSGβ8.1 のEcoRI 部位とBg
lII部位の間を配列決定する。該配列の分析は、Yoshika
i Y. ら(1984) Nature312:521-524 によりＶβ8.1 につ
いて発表された配列との完全な類似を示す。同様に、OL
1, OL2, OL3, OL12 を含むオリゴヌクレオチドペアを使
って得られたPCR 生成物を FpBSCβ215 中にクローニン
グする。Toyonagaら(1987) Eur. J.Immunol. 17:375-38
3による種々のＶβサブファミリーの定義に関して次の
クローンが得られる。 ・OL1 の場合、Ｖ領域の配列がＶβ1.2 と同じであるク
ローン BSGβ1.2 と BSGβ1.3 。 ・OL2 の場合、Ｖ領域の配列がＶβ2.2 と一致するクロ
ーンBSGβ2.5 並びにＶβ2.3 遺伝子を有するクローン
BSGβ2.7 および BSGβ2.11。 ・OL12の場合、Ｖβ12.3遺伝子を有するクローン BSGβ
12.1および BSGβ12.4。
BSGβ8.5 のBglII-EcoRI 消化による分析は、約500 bp
の所望の断片を提供する。 BSGβ8.1 のEcoRI 部位とBg
lII部位の間を配列決定する。該配列の分析は、Yoshika
i Y. ら(1984) Nature312:521-524 によりＶβ8.1 につ
いて発表された配列との完全な類似を示す。同様に、OL
1, OL2, OL3, OL12 を含むオリゴヌクレオチドペアを使
って得られたPCR 生成物を FpBSCβ215 中にクローニン
グする。Toyonagaら(1987) Eur. J.Immunol. 17:375-38
3による種々のＶβサブファミリーの定義に関して次の
クローンが得られる。 ・OL1 の場合、Ｖ領域の配列がＶβ1.2 と同じであるク
ローン BSGβ1.2 と BSGβ1.3 。 ・OL2 の場合、Ｖ領域の配列がＶβ2.2 と一致するクロ
ーンBSGβ2.5 並びにＶβ2.3 遺伝子を有するクローン
BSGβ2.7 および BSGβ2.11。 ・OL12の場合、Ｖβ12.3遺伝子を有するクローン BSGβ
12.1および BSGβ12.4。
【００４０】実施例２：キメラ遺伝子の発現 原理 ：TCR 鎖は、TCR 鎖と関連づけられるTCR 複合体
（即ちα鎖とCD3 の複合体）の別の鎖が存在する場合に
のみ表面上に発現される膜タンパク質である。予め作製
されたキメラ遺伝子の発現を得るために、Letourneur F
ら(1989) Eur. J. Immunol. 19:2269-2274により開発さ
れたマウス細胞系DOIS 19 を使用する。DOIS 19 は、β
鎖を除くTCR の全成分を有するマウスＴハイブリドーマ
の変異体である。従ってこの系は、その表面上にTCR を
発現しない。外来鎖のトランスフェクションは、トラン
スフェクト細胞において機能的なレセプターの発現を誘
導する。 BSGβ8.1 と BSGβ2.7 中に含まれる本発明の
２つのキメラ遺伝子を、下記に記載のプロトコールに従
ってこの細胞中にトランスフェクトせしめた。
（即ちα鎖とCD3 の複合体）の別の鎖が存在する場合に
のみ表面上に発現される膜タンパク質である。予め作製
されたキメラ遺伝子の発現を得るために、Letourneur F
ら(1989) Eur. J. Immunol. 19:2269-2274により開発さ
れたマウス細胞系DOIS 19 を使用する。DOIS 19 は、β
鎖を除くTCR の全成分を有するマウスＴハイブリドーマ
の変異体である。従ってこの系は、その表面上にTCR を
発現しない。外来鎖のトランスフェクションは、トラン
スフェクト細胞において機能的なレセプターの発現を誘
導する。 BSGβ8.1 と BSGβ2.7 中に含まれる本発明の
２つのキメラ遺伝子を、下記に記載のプロトコールに従
ってこの細胞中にトランスフェクトせしめた。
【００４１】１）真核発現ベクター中でのキメラ遺伝子
のサブクローニング 原理 ：選んだ発現ベクターはプラスミドpHβPr1-neo で
ある。それはGunning P.ら(1987) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 84:4831-4835中に詳細に記載されている。発現
しようとする遺伝子をこのプラスミド上に存在するβア
クチンプロモーターの下流で且つポリアデニル化部位の
上流にサブクローニングする。それらの２つのシグナル
は、挿入された遺伝子の機能的mRNAの合成を保証する。
更に、このプラスミドは、プラスミドが導入された細胞
に抗生物質、好ましい例としてはG418抗生物質に対する
耐性を付与するネオマイシン耐性遺伝子を有する。更
に、大腸菌中での選択および複製を可能にする複製開始
点とアンピシリン耐性遺伝子も存在する。ここで使用す
る大腸菌株はMC1061である。
のサブクローニング 原理 ：選んだ発現ベクターはプラスミドpHβPr1-neo で
ある。それはGunning P.ら(1987) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 84:4831-4835中に詳細に記載されている。発現
しようとする遺伝子をこのプラスミド上に存在するβア
クチンプロモーターの下流で且つポリアデニル化部位の
上流にサブクローニングする。それらの２つのシグナル
は、挿入された遺伝子の機能的mRNAの合成を保証する。
更に、このプラスミドは、プラスミドが導入された細胞
に抗生物質、好ましい例としてはG418抗生物質に対する
耐性を付与するネオマイシン耐性遺伝子を有する。更
に、大腸菌中での選択および複製を可能にする複製開始
点とアンピシリン耐性遺伝子も存在する。ここで使用す
る大腸菌株はMC1061である。
【００４２】実験：プラスミド BSGβ8.1 をBamHIとSal
I酵素で切断し、２断片のうちの小さい方（1.2 kb）を
アガロースゲル上で精製する。キメラ遺伝子のコード配
列全部を含むこの断片を、BamHI とSalIで予め開環され
たプラスミドpHβPr1-neo と連結せしめる。この連結混
合物を大腸菌MC1061中にトランスフェクトせしめ、単離
したコロニーのBamHI とSalIでの消化による分析から、
アガロースゲル電気泳動において所望の1.2 kb断片を与
えるneoGβ8.1 と称するクローンを保持する。同様に、
pBSGβ2.7 中に含まれるキメラ遺伝子をpHβPr1-neo 中
にサブクローニングし、neoGβ2.7 と称するクローンを
維持する。neoGβ8.1 を1991年 2月12日にI-1033のもと
にCNCMに寄託した。
I酵素で切断し、２断片のうちの小さい方（1.2 kb）を
アガロースゲル上で精製する。キメラ遺伝子のコード配
列全部を含むこの断片を、BamHI とSalIで予め開環され
たプラスミドpHβPr1-neo と連結せしめる。この連結混
合物を大腸菌MC1061中にトランスフェクトせしめ、単離
したコロニーのBamHI とSalIでの消化による分析から、
アガロースゲル電気泳動において所望の1.2 kb断片を与
えるneoGβ8.1 と称するクローンを保持する。同様に、
pBSGβ2.7 中に含まれるキメラ遺伝子をpHβPr1-neo 中
にサブクローニングし、neoGβ2.7 と称するクローンを
維持する。neoGβ8.1 を1991年 2月12日にI-1033のもと
にCNCMに寄託した。
【００４３】２．DOIS 19 中へのキメラ遺伝子のトラン
スフェクション 選択したトランスフェクション法はプロトプラスト融合
である。MALISSENらにより記載されたプロトコール("Te
chnique de transfert de genes dans les cullules eu
karyotes", 1990, INSERM 編, Paris, 25-31) の順に従
う。ただし、選択培地中のG418の濃度は、クローンneoG
β8.1 とneoGβ2.7 の場合は3 mg/ml である。
スフェクション 選択したトランスフェクション法はプロトプラスト融合
である。MALISSENらにより記載されたプロトコール("Te
chnique de transfert de genes dans les cullules eu
karyotes", 1990, INSERM 編, Paris, 25-31) の順に従
う。ただし、選択培地中のG418の濃度は、クローンneoG
β8.1 とneoGβ2.7 の場合は3 mg/ml である。
【００４４】３．トランスフェクタントの分析 neoGβ8.1 については、FRN8.1.1……FRN8.1.24 と命名
したネオマイシン耐性コロニーをフラックスサイトメト
リーにより分析する。各クローンにつき、4 ％ウシ胎児
血清(FCS) 、0.02％アジ化ナトリウムおよび15μg/mlの
マウス抗CD3 抗体〔LEO ら(1987) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 84:1374 に記載された抗体2C11〕を含むダルベ
ッコ改良イーグル培地(DMEM)の溶液中で 105個の細胞を
攪拌下4℃で45分間インキュベートする。DMEM, 4% FCS,
0.02% アジ化ナトリウムで３回洗浄した後、細胞をDME
M, 4% FCS, 0.02% アジ化ナトリウム中15μg/mlのFITC
標識ヒツジ抗ラット免疫グロブリンポリクローナル抗体
（Immunotech試薬）と共に攪拌下で4 ℃にて30分間イン
キュベートする。DMEM, 4% FCS, 0.02%アジ化ナトリウ
ムで３回洗浄した後、細胞を１％ホルムアルデヒド含有
ＰＢＳ中で固定し、そしてBecton DickinsonからのFACS
CAN フラックスサイトメトリー装置上で分析する。同様
にして105 個のDOIS 19 細胞を処理し、負の対照として
使う。クローンFRN8.1.2について得られたプロフィール
をDOIS 19 のプロフィールと比較して図４に示す。同じ
手順をプラスミドneoGβ2.7 にも使い、FACSCAN 上で得
られたクローンFRN2.7.3のプロフィールをDOIS 19 のも
のと比較して図４に示す。この２つの細胞系をBalb/cマ
ウスの免疫処置のために維持する。
したネオマイシン耐性コロニーをフラックスサイトメト
リーにより分析する。各クローンにつき、4 ％ウシ胎児
血清(FCS) 、0.02％アジ化ナトリウムおよび15μg/mlの
マウス抗CD3 抗体〔LEO ら(1987) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 84:1374 に記載された抗体2C11〕を含むダルベ
ッコ改良イーグル培地(DMEM)の溶液中で 105個の細胞を
攪拌下4℃で45分間インキュベートする。DMEM, 4% FCS,
0.02% アジ化ナトリウムで３回洗浄した後、細胞をDME
M, 4% FCS, 0.02% アジ化ナトリウム中15μg/mlのFITC
標識ヒツジ抗ラット免疫グロブリンポリクローナル抗体
（Immunotech試薬）と共に攪拌下で4 ℃にて30分間イン
キュベートする。DMEM, 4% FCS, 0.02%アジ化ナトリウ
ムで３回洗浄した後、細胞を１％ホルムアルデヒド含有
ＰＢＳ中で固定し、そしてBecton DickinsonからのFACS
CAN フラックスサイトメトリー装置上で分析する。同様
にして105 個のDOIS 19 細胞を処理し、負の対照として
使う。クローンFRN8.1.2について得られたプロフィール
をDOIS 19 のプロフィールと比較して図４に示す。同じ
手順をプラスミドneoGβ2.7 にも使い、FACSCAN 上で得
られたクローンFRN2.7.3のプロフィールをDOIS 19 のも
のと比較して図４に示す。この２つの細胞系をBalb/cマ
ウスの免疫処置のために維持する。
【００４５】４．Balb/cマウスの免疫処置 ３匹のBalb/cマウスをFRN8.1.2で免疫処置する。免疫処
置プロトコールは次の通りである： ─第０日：10×106 個のFRN8.1.2細胞を腹腔内経路によ
り注入。 ─第20日：10×106 個のFRN8.1.2細胞を腹腔内経路によ
り注入。 ─第40日： 5×106 個の細胞を静内経路により注入。 ─第43日：融合のための脾臓の切除。
置プロトコールは次の通りである： ─第０日：10×106 個のFRN8.1.2細胞を腹腔内経路によ
り注入。 ─第20日：10×106 個のFRN8.1.2細胞を腹腔内経路によ
り注入。 ─第40日： 5×106 個の細胞を静内経路により注入。 ─第43日：融合のための脾臓の切除。
【００４６】５．リンパ球ハイブリダイゼーションによ
る融合 KohlerおよびMilstein (1975) Nature 256:495-497によ
り記載されたプロトコールに従って、２匹の免疫処置マ
ウスの脾細胞をミエローマX63Ag258と融合させる。DOIS
19 に対するFRN8.1.2に関するフラックスサイトメトリ
ーにより、融合から得られたクローンの上清の分析を行
う。各クローンの上清100 μl を取り、その50μl を10
5 個のFRN8.1.2細胞を含むDMEM, 4% FCS, 0.02%アジ化
ナトリウム50μl と共にインキュベートし、残りの50μ
l を105 個のDOIS 19 細胞を含む同一培地50μl と共に
インキュベートする。その先のプロトコールはトランス
フェクタントの分析に使用したものと同じである。
る融合 KohlerおよびMilstein (1975) Nature 256:495-497によ
り記載されたプロトコールに従って、２匹の免疫処置マ
ウスの脾細胞をミエローマX63Ag258と融合させる。DOIS
19 に対するFRN8.1.2に関するフラックスサイトメトリ
ーにより、融合から得られたクローンの上清の分析を行
う。各クローンの上清100 μl を取り、その50μl を10
5 個のFRN8.1.2細胞を含むDMEM, 4% FCS, 0.02%アジ化
ナトリウム50μl と共にインキュベートし、残りの50μ
l を105 個のDOIS 19 細胞を含む同一培地50μl と共に
インキュベートする。その先のプロトコールはトランス
フェクタントの分析に使用したものと同じである。
【００４７】テストした400 の上清のうち、２つの上清
がFRN8.1.2を標識しDOIS 19 を標識しない。従って、２
つの対応するモノクローナルはヒトＶβ8.1 鎖を含むTC
R のキメラ複合体鎖と反応する。クローンE83C11.20 は
FRN2.7.3を標識せず、これはこのモノクローナルがキメ
ラTCR のマウス成分を認識しないことを保証する。他
方、クローンE83C11.20 はＶβ8.1 鎖を発現するヒトJu
rkat系〔Yoshikaiら(1984) Nature 312:521-524 〕を標
識する。図５は、別個の抗体であるImmunotechからの抗
CD3 ヒトモノクローナル抗体とE83C11.20 の上清による
Jurkat系の分析を示す。それらの分析から、モノクロー
ナルE83C11.20 がヒトＶβ8.1 鎖に特異的であると結論
づけられる。
がFRN8.1.2を標識しDOIS 19 を標識しない。従って、２
つの対応するモノクローナルはヒトＶβ8.1 鎖を含むTC
R のキメラ複合体鎖と反応する。クローンE83C11.20 は
FRN2.7.3を標識せず、これはこのモノクローナルがキメ
ラTCR のマウス成分を認識しないことを保証する。他
方、クローンE83C11.20 はＶβ8.1 鎖を発現するヒトJu
rkat系〔Yoshikaiら(1984) Nature 312:521-524 〕を標
識する。図５は、別個の抗体であるImmunotechからの抗
CD3 ヒトモノクローナル抗体とE83C11.20 の上清による
Jurkat系の分析を示す。それらの分析から、モノクロー
ナルE83C11.20 がヒトＶβ8.1 鎖に特異的であると結論
づけられる。
【００４８】実施例３ 次のものを含有する注射用製剤を調製した。 ─実施例２のモノクローナル抗体 ５mg ─注射剤用蒸留水 １ml
【図１】図１は、マウスＣβ２鎖とヒトＣβ１鎖のcDNA
の比較を表す。
の比較を表す。
【図２】図２は、BglII 部位を導入するのに必要な２塩
基のところを除きマウスTCR のＣβ２鎖をコードするcD
NAの相補的オリゴヌクレオチドを表す。
基のところを除きマウスTCR のＣβ２鎖をコードするcD
NAの相補的オリゴヌクレオチドを表す。
【図３】図３は、ヒトTCR Ｃβ１鎖とＣβ２鎖の特異的
オリゴヌクレオチドを表す。
オリゴヌクレオチドを表す。
【図４】図４は、出発の系DOIS 19 （白い外形）と比較
した、ヒトＶβ８（上の枠：左側FRN8.1.2、右側MZ3DC
8）およびヒトＶβ２（下の枠：左側FRN2.7.3、右側FRN
2.7.6）を含む２つのキメラＤＮＡを使って得られたDOI
S 19 のトランスフェクタント（黒い外形）のフラック
スサイトメトリーを表す。ここで細胞はマウス抗CD3 抗
体で標識されている。
した、ヒトＶβ８（上の枠：左側FRN8.1.2、右側MZ3DC
8）およびヒトＶβ２（下の枠：左側FRN2.7.3、右側FRN
2.7.6）を含む２つのキメラＤＮＡを使って得られたDOI
S 19 のトランスフェクタント（黒い外形）のフラック
スサイトメトリーを表す。ここで細胞はマウス抗CD3 抗
体で標識されている。
【図５】図５は、別個の抗体、即ちE83C11.20 の上清と
Immunotechのヒト抗CD3 モノクローナル抗体によるJurk
at系の分析を示す。
Immunotechのヒト抗CD3 モノクローナル抗体によるJurk
at系の分析を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/20 15/10 15/79 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ 8310−2Ｊ (72)発明者 ベルナール マリーセ フランス国，13009 マルセーユ，アブニ ユ ドウ ラ ピネード，11
Claims (11)
- 【請求項１】 Ｔ細胞抗原レセプター鎖をコードするキ
メラヌクレオチド配列を含むことを特徴とする組換えＤ
ＮＡであって、前記配列が ─可変領域（Ｖ）、多様性領域（Ｄ）および連結領域
（Ｊ）の全部をコードする哺乳類由来の配列、並びに ─上記哺乳類配列を欠いた定常相補的領域（Ｃ）をコー
ドするマウス由来の配列により構成され、この２つの配
列が天然のまたは人工的に作製された制限部位のところ
で連結されている組換えＤＮＡ。 - 【請求項２】 前記制限部位がＣ領域のコード配列に関
して天然であることを特徴とする、請求項１に記載の組
換えＤＮＡ。 - 【請求項３】 前記哺乳類由来の配列がヒト起源のＶβ
鎖をコードする配列であり、そして前記制限部位がBglI
I であることを特徴とする、請求項１または２に記載の
組換えＤＮＡ。 - 【請求項４】 前記制限部位がマウス起源の鎖上に人工
的に作製されることを特徴とする、請求項１〜３のいず
れか一項に記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項５】 真核発現ベクターであることを特徴とす
る、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えＤＮ
Ａ。 - 【請求項６】 前記真核発現ベクターがPhβ-PR1-Neo由
来のプラスミドであることを特徴とする、請求項５に記
載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか一項に記載の組
換えＤＮＡが介在する段階の連続により得られることを
特徴とする抗体。 - 【請求項８】 請求項７に記載の抗体を含有することを
特徴とする医薬組成物。 - 【請求項９】 請求項７に記載の抗体を含有することを
特徴とする診断薬。 - 【請求項１０】 請求項１に記載の組換えＤＮＡの調製
方法であって、制限部位のところまでの少なくともＴ細
胞抗原レセプター鎖のＶ，ＤおよびＪ領域をコードする
配列全部により構成されるヌクレオチド配列を、上記と
同じ制限部位から出発して上記哺乳類鎖配列を欠くＣ領
域の相補的部分を含むマウス由来のヌクレオチド配列と
連結せしめ、ここで所望するキメラ体を得るために前記
２つのヌクレオチド配列の一方、他方または両方の上に
前記制限部位が人工的に作製されており、次いで所望で
あれば、前記Ｖ，Ｄ，ＪおよびＣ領域全部を含む配列を
真核発現ベクターと連結せしめ、次いで所望であれば、
得られた新規キメラ体を単離することを特徴とする方
法。 - 【請求項１１】 請求項７に記載の抗体の調製方法であ
って、請求項５に記載の組換えＤＮＡのための請求項１
０に記載の調製方法を含んで成り、更に、前記キメラＤ
ＮＡ配列によりコードされる鎖に相同な鎖を除いてＴ細
胞抗原レセプターの合成を可能にする全ての要素を含む
真核細胞をトランスフェクトし、こうしてトランスフェ
クトされた細胞を対応するマウス株に対する抗原として
使用し、該抗原を投与したマウスから取り出した脾細胞
を、既知の方法に従ってミエローマ細胞と融合せしめ、
そして哺乳類の可変配列の生産物に対して向けられた抗
体を調製することを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR919102189A FR2672901B1 (fr) | 1991-02-15 | 1991-02-15 | Nouvelles molecules de dna recombinants codant pour une chaine du recepteur pour l'antigene des cellules t, procede de preparation, anticorps et medicaments les renfermant. |
| FR9102189 | 1991-02-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0591881A true JPH0591881A (ja) | 1993-04-16 |
Family
ID=9410030
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP4028264A Pending JPH0591881A (ja) | 1991-02-15 | 1992-02-14 | Ｔ細胞抗原レセプター鎖をコードする新規組換えｄｎａ分子、調製方法、抗体およびそれらを含む医薬 |
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| JP (1) | JPH0591881A (ja) |
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| DE (1) | DE69231046T2 (ja) |
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| GR (1) | GR3034176T3 (ja) |
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| CA2018248A1 (en) * | 1989-06-07 | 1990-12-07 | Clyde W. Shearman | Monoclonal antibodies against the human alpha/beta t-cell receptor, their production and use |
-
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-
2000
- 2000-08-10 GR GR20000401871T patent/GR3034176T3/el not_active IP Right Cessation
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