PT499555E

PT499555E - RECOMBINATED DNA MOLECULES THAT ENCODES A CHAIN OF THE T-CELL ANTIGEN RECEIVER PREPARATION PROCESS ANTIBODIES AND MEDICINES BY BROUGHTING IT

Info

Publication number: PT499555E
Application number: PT92430003T
Authority: PT
Inventors: Francois Romagne; Andre Van Agthoven; Bernard Malissen
Original assignee: Immunotech Sa
Priority date: 1991-02-15
Filing date: 1992-02-12
Publication date: 2000-10-31
Also published as: DE69231046T2; ES2147725T3; CA2061266A1; FR2672901B1; EP0499555A1; DK0499555T3; DE69231046D1; EP0499555B1; FR2672901A1; ATE193058T1; JPH0591881A; GR3034176T3

Abstract

Recombinant DNA containing a chimeric nucleotide sequence encoding a T cell antigen receptor chain, the said sequence consisting of: - a sequence of mammalian origin encoding the entire variable (V), diversity (D) and junction (J) regions, - and a sequence of murine origin encoding the constant complementary region (C) which is absent from the above mammalian sequence, the two sequences being joined at a natural or artificially created restriction site, antibodies obtained using the said DNAs, pharmaceutical composition and diagnostic products containing them and a process for preparing them.

Description

k 33· 555k 33 · 555

DESCRIÇÃODESCRIPTION

MOLÉCULAS DE ADN RECOMBINADO QUE CODIFICA UMA CADEIA DO RECEPTOR DO ANTIGENE DE CÉLULAS T, PROCESSO DE PREPARAÇÃO, ANTICORPOS E MEDICAMENTOS ENGLOBANDO-OS A presente invenção está relacionada com novas moléculas de ADN recombinado que codificam uma cadeia do receptor do antigene de células T, com o seu processo de preparação, com anticorpos e com medicamentos que os compreendem.RECOMBINATED DNA MOLECULES THAT ENCODES A CHAIN OF THE T-CELL ANTIGEN RECEPTOR, PREPARATION PROCESS, ANTIBODIES AND MEDICINES ENGAGING THEM The present invention relates to novel recombinant DNA molecules encoding a T cell antigen receptor chain, their preparation process, with antibodies and with medicaments comprising them.

Seria interessante desenvolver de uma forma fácil um painel de anticorpos dirigido contra as diferentes cadeias de receptores do antigene de células T humanas (a seguir designados TCR), a fim de se obter, por exemplo, uma discriminação e uma enumeração precisa das diferentes subpopulações de células T humanas. O estudo do desequilíbrio entre as subpopulações permitiria o diagnóstico diferencial das doenças que provocam uma proliferação das células T. Ela poderia também ser o sinal de uma resposta imunitária específica contra um tecido particular patogénico como, por exemplo, um tumor. Em particular, sabe-se que anticorpos contra os antigenes CD4 e CD8i que distinguem entre duas populações de células T, são sinais de uma série de doenças imunitárias como a SIDA. Estes anticorpos deveriam poder ser obtidos facilmente e em grande quantidade. A Patente EP-A-0 340 793 descreve ADNs recombinados quiméricos cujos dois segmentos recombinados provêm ou não de duas espécies diferentes. Contudo, as quimeras obtidas a partir destes dois segmentos codificam domínios imunoglobulinas: um variável que codifica um segmento de imunoglobulina, o outro, constante, que codifica um segmento de TCR.It would be interesting to develop in an easy way an antibody panel directed against the different chains of human T cell antigen receptors (hereinafter TCRs) in order to obtain, for example, discrimination and precise enumeration of the different subpopulations of human T cells. Studying the imbalance between the subpopulations would allow differential diagnosis of the diseases that provoke a proliferation of T cells. It could also be the signal of a specific immune response against a particular pathogenic tissue such as a tumor. In particular, antibodies against CD4 and CD8i antigens distinguishing between two T cell populations are known to be signals of a number of immune diseases such as AIDS. These antibodies should be readily and readily available. EP-A-0 340 793 discloses chimeric recombinant DNAs whose two recombined segments come from two different species or not. However, the chimeras obtained from these two segments encode immunoglobulin domains: one variable encoding one immunoglobulin segment, the other constant, encoding a TCR segment.

Choi, Y. et al. descreveram em Nature 346. páginas 471-473 (1990) ADNs que codificam TCR quiméricos compreendendo um segmento Vp humano ligado a um segmento Dp, Jp, Cp2 murino. O TCR quimérico assim formado, acoplado a uma cadeia α e associado ao CD3, foi expresso. Sugere-se que o processo descrito pode permitir a produção de anticorpos de rato específicos para os segmentos Vp ou Va do TCR humano. Todavia, o 1 processo descrito é específico para um dado tipo de construção contendo unicamente a porção \/β humana. Seria interessante poder utilizar um segmento 0β2 de origem murina para permitir a preparação de uma larga série de quimeras compreendendo diferentes porções V, J e D, particularmente humanas. O requerente descobriu novos ADNs recombinados que permitem a preparação de novos vectores de expressão eucariota, os quais são importantes agentes de transfecção de células eucariotas, sendo estas células transfectadas excelentes imunogenes que conduzem a anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais, dirigidos contra as diferentes cadeias de TCR humanos. É por isso que o presente pedido tem como objecto um ADN recombinado, caracterizado por compreender uma sequência nucleotídica quimérica que codifica uma cadeia do receptor do antigene de células T, sendo a referida sequência constituída por: - uma sequência proveniente de um mamífero que não murino, que codifica a totalidade da porção variável (V), diversidade (D) e de junção (J), - e uma sequência de origem murina, que codifica a porção complementar constante (C) ausente da sequência de mamífero acima referida, estando as duas sequências ligadas ao nível de um local de restrição natural ou criado artificialmente. Na descrição que se segue, designar-se-á este local por “local seleccionado”.Choi, Y. et al. have described in Nature 346. pages 471-473 (1990) chimeric TCR-encoding DNAs comprising a human Vβ segment linked to a murine Dp, Jp, Cp2 segment. The chimeric TCR thus formed, coupled to an α chain and associated with CD3, was expressed. It is suggested that the described process may allow the production of mouse antibodies specific for Vp or Va segments of human TCR. However, the described process is specific for a given type of construct containing the human portion only. It would be interesting to be able to use a 0β2 segment of murine origin to allow the preparation of a large series of chimeras comprising different V, J and D portions, particularly human. The inventors have discovered novel recombinant DNAs which allow the preparation of novel eukaryotic expression vectors which are important eukaryotic cell transfection agents, these transfected cells being excellent immunogens leading to antibodies, especially monoclonal antibodies, directed against the different TCR chains humans. It is for this reason that the present application relates to a recombinant DNA, characterized in that it comprises a chimeric nucleotide sequence encoding a T cell antigen receptor chain, said sequence consisting of: a sequence originating from a non-murine mammal , which encodes the entire variable portion (V), (D) and junction (J) diversity, - and a murine origin sequence encoding the constant complementary portion (C) absent from the above mammalian sequence, the two sequences linked to the level of a naturally occurring or artificially created restriction site. In the following description, this location will be designated by "selected site".

Por ADN recombinado entende-se uma sequência de nucleótidos criada artificialmente.By recombinant DNA is meant an artificially created nucleotide sequence.

Por quimera entende-se que o ADN recombinado compreende pelo menos duas sequências de origens diferentes; por exemplo, 3, 4 ou 5 e, de preferência, 2 sequências de duas origens diferentes.By chimera is meant that the recombinant DNA comprises at least two sequences of different origins; for example, 3, 4 or 5, and preferably 2 sequences from two different sources.

Estas sequências provêm de duas espécies diferentes, e a origem de uma delas é murina; a outra (ou as outras) derivará particularmente de um primata e, de preferência, do homem. 2 O receptor das células T é uma proteína heterodimérica composta por duas cadeias polipeptídicas ligadas através de uma ponte de dissulfureto. O receptor é expresso na superfície das células T em associação com o complexo CD3. O locus correspondente a uma cadeia particular do TCR compreende uma importante selecção de segmentos génicos distintos, incluindo numerosos segmentos V diferentes, vários segmentos J e um ou dois segmentos constantes C. Estes segmentos podem sofrer rearranjos somáticos durante a maturação tímica das células T, produzindo, assim, um gene único, que é transcrito e que contém segmentos V, segmentos J, um segmento C e, eventualmente, um segmento D entre os segmentos V e J.These sequences come from two different species, and the origin of one of them is murine; the other (or others) will derive particularly from a primate, and preferably from man. The T cell receptor is a heterodimeric protein composed of two polypeptide chains linked through a disulfide bridge. The receptor is expressed on the surface of T cells in association with the CD3 complex. The locus corresponding to a particular TCR chain comprises an important selection of distinct gene segments including numerous different V segments, several J segments and one or two constant C segments. These segments may undergo somatic rearrangements during the thymic maturation of T cells, producing , thus a unique gene which is transcribed and which contains V segments, J segments, a C segment and, optionally, a D segment between the V and J. segments.

No ADN recombinado quimérico acima descrito, a totalidade da sequência que codifica a porção C pode provir de um mamífero murino, e, neste caso, a sequência do outro mamífero não compreende qualquer nucleótido correspondente à porção C. De preferência, a sequência proveniente de um outro mamífero compreende uma pequena porção C, preferencialmente, inferior a 100 nucleótidos e, especialmente, cerca de 60 nucleótidos; devido a isto, só uma grande porção C da quimera provém do mamífero murino (sendo esta porção a porção complementar ausente da sequência do outro mamífero acima referida) e o resto provém do outro mamífero. As duas sequências de origens diferentes estão ligadas ao nível de um local de restrição seleccionado, em fase na grelha de leitura. A sequência do outro mamífero compreenderá necessariamente, além das porções V, J, eventualmente, D e uma porção de C, a totalidade da sequência principal. O local de restrição seleccionado pode estar naturalmente presente em cada uma das duas sequências ou naturalmente presente só numa delas, sendo o referido local de restrição criado artificialmente na outra sequência. O local de restrição acima referido deve ser único no segmento Cp murino e, de preferência, único no segmento do outro mamífero.In the chimeric recombinant DNA described above, the entire sequence encoding the C moiety may be derived from a murine mammal, and in this case the sequence of the other mammal does not comprise any nucleotide corresponding to the C moiety. Preferably, the sequence from a another mammal comprises a small portion C, preferably less than 100 nucleotides and especially about 60 nucleotides; because of this, only a large portion C of the chimera comes from the murine mammal (this portion being the complementary portion absent from the sequence of the other mammal referred to above) and the remainder from the other mammal. The two sequences of different origins are linked to the level of a selected restriction site, in phase in the reading frame. The sequence of the other mammal will necessarily comprise, in addition to the portions V, J, optionally D and a portion of C, the entire principal sequence. The selected restriction site may be naturally present in each of the two sequences or naturally present in only one of them, said restriction site being artificially created in the other sequence. The above restriction site should be unique in the murine Cp segment and preferably unique in the segment of the other mammal.

Quando o local de restrição seleccionado é criado artificialmente, ele pode ser produzido, por exemplo, por eliminação ou adição de nucleótidos ou, de preferência, por mutação de acordo com métodos conhecidos, especialmente por mutagénese dirigida. A alteração do ADN efectuada desta forma permite a introdução de um local de restrição normalmente ausente. Em particular, por mutagénese dirigida pode introduzir-se um local Bgl II, 3 naturalmente presente no ADN que codifica as regiões Cpi e Cp2 humanas, mas ausente do gene que codifica a cadeia do TCR do rato, no gene Οβ2 do rato, eventualmente por mutagénese através de polimerização em cadeia (PCR). A mutação permite conservar o máximo de homologia com a(s) sequência(s) de partida. O local de restrição assim criado será, de preferência, colocado ao nível de um local homólogo do local ao nível do qual o local de restrição está naturalmente presente no mamífero considerado, particularmente o homem, de forma a permitir a clivagem, com a ajuda da referida enzima, tanto da sequência murina, como da sequência do mamífero, para, em seguida, por ligação em fase na grelha de leitura, criar a quimera desejada. Pelo que foi dito anteriormente, compreende-se que, ao escolher uma dada enzima de restrição, deve estar presente, no máximo, um único local de restrição correspondente no segmento Cp murino e, de preferência, um único local no segmento do outro mamífero, além de que, ao nível da sequência que codifica a porção C, conduz a um local que permite a transcrição em fase de um ADN que codifica especialmente a cadeia do TCR. Num caso particularmente interessante, pode produzir-se todo um conjunto de genes que codificam uma porção C de um TCR murino ligada a numerosas porções V diferentes de TCR, particularmente humano.When the selected restriction site is artificially created, it may be produced, for example, by elimination or addition of nucleotides or, preferably, by mutation according to known methods, especially by site-directed mutagenesis. Altering the DNA done in this way allows the introduction of a normally absent restriction site. In particular, by site-directed mutagenesis a BglII, 3 site naturally present in the DNA encoding the human Cp and Cp2 regions, but absent from the gene encoding the mouse TCR chain, into the mouse Οβ2 gene, possibly mutagenesis by polymerase chain reaction (PCR). The mutation allows to maintain the maximum homology with the starting sequence (s). The restriction site thus created will preferably be placed at the level of a site homologous to the site at the level of which the restriction site is naturally present in the mammal in question, particularly man, so as to allow cleavage with the aid of said enzyme, from both the murine sequence and the mammalian sequence, and then by phase-linking the reading frame to create the desired chimera. From what has been said above, it will be understood that, in choosing a given restriction enzyme, at most a single restriction site should be present corresponding in the murine Cp segment and preferably a single site in the segment of the other mammal, and at the level of the sequence encoding the C moiety leads to a site which allows the in-phase transcription of a DNA encoding the TCR chain in particular. In a particularly interesting case, a whole set of genes encoding a C portion of a murine TCR attached to numerous different V portions of TCR, particularly human, may be produced.

Os ADNs recombinados preferidos, de acordo com a invenção, são caracterizados pelo local de restrição ser natural na sequência que codifica a porção C do mamífero.Preferred recombinant DNAs according to the invention are characterized in that the restriction site is native to the sequence encoding the mammalian portion C.

As quimeras mais particularmente preferidas, de acordo com a invenção, possuem uma porção de mamífero, caracterizada pela sua sequência proveniente de um mamífero ser a sequência que codifica os segmentos Vp, Dp, ϋβ humanos, e uma curta porção Cp1 ou Cp2 até ao local único Bgl II de Cpi e Cp2. A porção murina das quimeras importantes, de acordo com a invenção, é caracterizada pelo local de restrição, especialmente Bgl II, ser artificialmente criado na cadeia de origem murina. O ADN recombinado, de acordo com a invenção, pode apresentar-se sob a forma de uma sequência nucleotídica de cadeia simples limitada às porções V, D, J e C acima referidas ou comportando outros nucleótidos, por exemplo, e particularmente, aqueles que constituem a sequência principal. 4 É desta forma que a sequência acima referida pode, em particular, ser incluída num vector de expressão e, neste caso, de preferência, num vector de expressão eucariota. A sequência acima referida pode igualmente ser incluída, tendo em vista a sua replicação, num outro vector, por exemplo, num plasmídeo, como e.g. BLUESCRIP. Como vector de expressão eucariota pode citar-se, muito particularmente, pHpPr1-Néo. Pode igualmente citar-se pHpPr1gpt e, de uma forma geral, qualquer vector de expressão eucariota que possua os sinais de regulação promotor e um sinal de poliadenilação que permita a expressão do ADNc. Evidentemente, a escolha do par vector-hospedeiro é da competência do perito.More particularly preferred chimeras according to the invention have a mammalian portion, characterized in that their sequence from a mammal is the sequence encoding the human Vp, Dp, ϋβ segments, and a short Cp1 or Cp2 portion to the site single Bgl II of Cpi and Cp2. The murine portion of the important chimeras according to the invention is characterized by the restriction site, especially Bgl II, being artificially created in the murine chain of origin. The recombinant DNA according to the invention may be in the form of a single-stranded nucleotide sequence limited to the abovementioned portions V, D, J and C or carrying other nucleotides, for example, and particularly those constituting the main sequence. It is in this way that the above sequence can in particular be included in an expression vector and, in this case, preferably in a eukaryotic expression vector. The above sequence may also be included, with a view to its replication, in another vector, for example in a plasmid, such as e.g. BLUESCRIP. As a eukaryotic expression vector, there can be mentioned, in particular, pHpPr1-N0o. There may also be mentioned pHpPr1gpt and, in general, any eukaryotic expression vector having the promoter regulatory signals and a polyadenylation signal that allows expression of the cDNA. Of course, the choice of the vector-host pair is within the skill of the expert.

Os ADNs recombinados mais particularmente preferidos, de acordo com a invenção, são caracterizados por se apresentarem sob a forma de um vector de expressão eucariota, o qual é, de preferência, derivado de ρΗβΡΓΐ-Néo. O ADN recombinado acima referido, particularmente sob a forma de vector de expressão eucariota, pode ser utilizado para transfectar a sequência que codifica o TCR num hospedeiro apropriado. As células hospedeiras assim transfectadas, eventualmente tratadas - por exemplo, previamente transfectadas com a cadeia CD3 Zeta para se obter uma melhor expressão - podem ser utilizadas como imunogene, de preferência, no rato.More particularly preferred recombinant DNAs according to the invention are characterized in that they are in the form of a eukaryotic expression vector, which is preferably derived from ρββ-N0. The above recombined DNA, particularly in the form of a eukaryotic expression vector, may be used to transfect the TCR-encoding sequence in an appropriate host. The thus-transfected host cells, if appropriate treated - for example, previously transfected with the CD3 Zeta chain to obtain better expression - may be used as an immunogen, preferably in the mouse.

Podem assim preparar-se anticorpos de uma forma clássica, especialmente anticorpos monoclonais, podendo fazer-se a triagem dos hibridomas, os quais foram obtidos a partir de células de mieloma e de células do baço dos ratos utilizados, através do reconhecimento da linha transfectada versus o não reconhecimento da linha de partida. É por isso que o presente pedido tem igualmente como objecto anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais, caracterizados por serem preparados por utilização de um ADN recombinado, como descrito acima.Antibodies of a classical form, especially monoclonal antibodies, can thus be prepared, and hybridomas can be screened, which were obtained from myeloma cells and spleen cells of the mice used, by recognition of the transfected line versus non-recognition of the starting line. It is for this reason that the subject of the present application is also antibodies, especially monoclonal antibodies, characterized in that they are prepared by use of a recombinant DNA, as described above.

Os anticorpos acima referidos apresentam propriedades notáveis, pois estão perfeitamente caracterizados no que diz respeito às cadeias de TCR e, particularmente, no que diz respeito às regiões variáveis V das cadeias de TCR, mas também relativamente às regiões D e J no seu rearranjo típico para um dado TCR. 5The above antibodies have remarkable properties as they are perfectly characterized with respect to the TCR chains and particularly with respect to the V variable regions of the TCR chains but also with respect to the D and J regions in their typical rearrangement for a given TCR. 5

Estes anticorpos são, por conseguinte, capazes de distinguir a população de células T humanas e, desta forma, reconhecer especificamente, por exemplo, uma dada doença ou deficiência.These antibodies are therefore capable of distinguishing the population of human T cells and, in this way, specifically recognizing, for example, a given disease or deficiency.

Entre os anticorpos acima descritos preferem-se os anticorpos anti-porção variável, especialmente \/β, D e J, que apresentam propriedades notáveis para o diagnóstico e, ao mesmo tempo, para a terapia curativa ou preventiva de doenças auto-imunes, no homem ou no animal. É por isso que a presente invenção tem também como objecto as composições farmacêuticas caracterizadas por englobaram pelo menos um dos anticorpos, tal como definidos acima.Among the antibodies described above, variable anti-variable antibodies, especially β / β, D and J, which exhibit remarkable properties for diagnosis and at the same time for curative or preventive therapy of autoimmune diseases, are preferred. man or animal. It is for this reason that the present invention also relates to pharmaceutical compositions characterized in that they comprise at least one of the antibodies, as defined above.

As composições farmacêuticas podem apresentar-se particularmente sob as formas parenterais, especialmente injectáveis, correntemente utilizadas em medicina humana; por exemplo, pela via subcutânea, intramuscular ou intravenosa.The pharmaceutical compositions may be in particular in parenteral forms, especially injectables, commonly used in human medicine; for example, by the subcutaneous, intramuscular or intravenous route.

Os anticorpos acima referidos podem igualmente ser utilizados para tratar as doenças imunes ou que provocam uma proliferação das células T, assim como as leucemias das células T, por injecção destes anticorpos.The above antibodies can also be used to treat immune diseases or which cause T cell proliferation as well as T cell leukemias by injection of these antibodies.

Para este fim, os anticorpos podem ser acoplados a toxinas ou a produtos radioactivos, de acordo com métodos conhecidos.To this end, the antibodies may be coupled to toxins or radioactive products, according to known methods.

Os anticorpos de acordo com a invenção encontram aplicação especialmente no tratamento de doenças imunes, tais como a artrite reumatóide, a diabetes, a doença de Sjõgren ou o lúpus eritematoso. A dose habitual no homem, variável de acordo com o produto utilizado, com o sujeito tratado e com a afecção em causa, pode ser, por exemplo, de 0,001 a 25 mg por dia e por kg de peso corporal de um anticorpo monoclonal, de acordo com a invenção, acoplado a ricina A como citotóxico e, de preferência, de 0,05 a 0,2 mg/kg/dia.Antibodies according to the invention find application especially in the treatment of immune diseases, such as rheumatoid arthritis, diabetes, Sjogren's disease or lupus erythematosus. The usual dose in man, variable according to the product used, with the subject and the condition concerned, may be, for example, from 0.001 to 25 mg per day and per kg of body weight of a monoclonal antibody of according to the invention, coupled to ricin A as cytotoxic, and preferably 0.05 to 0.2 mg / kg / day.

Dado que os anticorpos acima referidos, especialmente os anticorpos monoclonais, encontram também utilizações com fins diagnósticos, para a detecção, a identificação ou 6 a dosagem dos TCR ou de porções de TCR, a presente invenção tem igualmente como objecto a utilização dos referidos anticorpos, assim como as composições diagnósticas destinadas à detecção, à identificação ou à dosagem dos antigenes acima referidos.As the above antibodies, especially monoclonal antibodies, also find diagnostic uses for the detection, identification or dosage of TCRs or TCR portions, the present invention also relates to the use of said antibodies, as well as diagnostic compositions for the detection, identification or dosage of the abovementioned antigens.

Os anticorpos acima referidos encontram igualmente aplicação na purificação de produtos que englobam a porção antigénica correspondente às cadeias de TCR.The above antibodies also find application in the purification of products encompassing the antigenic portion corresponding to the TCR chains.

Os anticorpos acima referidos podem ser utilizados em citofluorimetria com fins diagnósticos e, com este objectivo, podem ser acoplados, através de métodos conhecidos, a marcadores fluorescentes, como o FITC ou a ficoeritrina.The above antibodies may be used in cytofluorimetry for diagnostic purposes and for this purpose may be coupled by known methods to fluorescent labels such as FITC or phycoerythrin.

Pode, por exemplo, detectar-se a presença de uma população de células T, descobrindo um segmento variável específico ao nível de tecidos que sofrem, por exemplo, de uma infecção, de um cancro ou de uma doença auto-imune e detectando a sua presença através de métodos conhecidos.For example, the presence of a T cell population can be detected by finding a specific variable segment at the level of tissues suffering, for example, from an infection, cancer or autoimmune disease and detecting its presence by known methods.

Podem igualmente marcar-se os anticorpos acima descritos com a ajuda de enzimas. Pode citar-se, por exemplo, a glucose-6-fosfato desidrogenase, a acetilcolinesterase, a glucose oxidase ou a beta-galactosidase.The antibodies described above can also be labeled with the aid of enzymes. Mention may be made, for example, of glucose-6-phosphate dehydrogenase, acetylcholinesterase, glucose oxidase or beta-galactosidase.

Os anticorpos totais acima referidos podem igualmente ser acoplados a um marcador radioactivo, tal como o índio 111, para uso na obtenção de imagens das populações de células T que comportam uma região variável específica, ao nível das porções doentes do corpo humano. A presente invenção tem igualmente como objecto um processo de preparação dos ADNs recombinados acima descritos, caracterizado por se ligar: - uma sequência nucleotídica constituída pelo menos pela totalidade da sequência que codifica as porções V, D e J de uma cadeia do receptor do antigene de células T de um mamífero que não murino, até ao nível de um local de restrição, a - uma sequência nucleotídica de origem murina que compreende a porção complementar da porção C ausente da sequência da cadeia de mamífero acima referida, a partir do mesmo local de restrição que acima, 7 sendo o referido local de restrição criado artificialmente numa, na outra ou nas duas sequências, para se obter a quimera esperada; em seguida, se desejado, ligar uma sequência que compreende a totalidade das porções V, D, J e C acima referidas a um vector de expressão eucariota; depois, se desejado, isolar a nova quimera obtida.The above total antibodies may also be coupled to a radioactive label, such as indium 111, for use in obtaining images of T cell populations bearing a specific variable region, at the level of the diseased portions of the human body. The present invention also provides a process for preparing the above-described recombinant DNAs, characterized in that: a nucleotide sequence consisting of at least the entire sequence encoding the V, D and J portions of an antigen receptor chain of T cells from a non-murine mammal, to the level of a restriction site, a - a nucleotide sequence of murine origin comprising the portion of the C-portion missing from the above-mentioned mammalian chain sequence, from the same mammalian said restriction site being artificially created in one or the other or both sequences to provide the expected chimera; then, if desired, linking a sequence comprising all of the above-mentioned portions V, D, J and C to a eukaryotic expression vector; then, if desired, isolate the novel chimera obtained.

Em condições preferenciais, o processo acima descrito é caracterizado, além disso, por se transfectar uma célula eucariota que comporta todos os elementos que permitem a síntese do receptor do antigene de células T, à excepção da cadeia homóloga da cadeia codificada pela sequência quimérica acima referida, se utilizarem estas células transfectadas como antigene na estirpe murina correspondente, se fundirem células do baço, pré-recolhidas em mamíferos murinos aos quais foi administrado o antigene, com células de mieloma para preparar, de acordo com métodos conhecidos, anticorpos dirigidos contra o produto da sequência variável do mamífero. O processo acima descrito pode ser particularmente efectuado como se segue: A sequência nucleotídica que codifica as porções V, D e J de uma cadeia do TCR de mamífero e, especialmente, um ADN linear de cadeia dupla comportando a sequência que codifica as porções V, J, eventualmente, D e, eventualmente, em parte C de uma cadeia de TCR de mamífero, além do seu gene principal, é obtida por clivagem com a ajuda de duas enzimas de restrição diferentes: a enzima correspondente ao local de restrição seleccionado ao nível da porção C, por exemplo, Bgl II, e uma outra enzima que corta a sequência do lado oposto, após o gene principal - por exemplo, Eco RI - a partir de uma sequência de ADN linear de cadeia dupla que comporta a referida sequência. O ADN obtido desta forma é ligado a um vector tratado com as mesmas duas enzimas de restrição, vector este que comporta a sequência que codifica o segmento C da cadeia de TCR e os mesmos locais de restrição que acima, por exemplo, Bgl II e Eco RI. Obtém-se, assim, o gene quimérico esperado. Este não pode, contudo, ser expresso tal qual. É por isso que, por um lado, o vector que comporta a quimera é tratado com duas enzimas de restrição que cortam dos dois lados do gene quimérico que codifica o TCR quimérico; e, por outro lado, se trata um vector de expressão eucariota com as mesmas duas enzimas de restrição. Por ligação do gene obtido acima, que codifica o TCR quimérico, ao referido vector de expressão eucariota, obtém-se um novo vector quimérico de expressão eucariota. O referido vector de expressão eucariota deve comportar os elementos 8 necessários para assegurar a transcrição correcta do gene quimérico que codifica o TCR. A este respeito, pode citar-se, por exemplo, o vector pHpPr1-Néo, que pode ser cortado com Bam Hl e Sal I e compreende o gene de resistência à neomicina, que é utilizado como marca de selecção, um gene promotor eucariota SV40 e um sinal de poliadenilação nas proximidades do local Bam Hl. O novo vector quimérico obtido é utilizado, de forma vantajosa, para transfectar células eucariotas, de preferência, células T de rato, especialmente linhas celulares que comportam todos os elementos para a expressão do TCR, à excepção do gene transportado pelo vector quimérico. Pode citar-se, por exemplo, a linha de rato DOIS 19 ou aquela de nome DS 23.27.4. Tais células permitem uma selecção fácil das células transfectadas que por si só são capazes de expressar o TCR na superfície da célula.Under preferable conditions, the above described process is further characterized by transfecting a eukaryotic cell bearing all the elements that allow the synthesis of the T cell antigen receptor, except for the homologous strand of the strand encoded by the above chimeric sequence , if these cells transfected as antigen are used in the corresponding murine strain, spleen cells, pre-harvested in murine mammals to which the antigen was administered, are fused with myeloma cells to prepare, according to known methods, antibodies directed against the product of the mammalian variable sequence. The nucleotide sequence encoding the V, D and J portions of a mammalian TCR chain and especially a double-stranded linear DNA carrying the sequence encoding the V, J, optionally D and possibly part C of a mammalian TCR chain, in addition to its main gene, is obtained by cleaving with the help of two different restriction enzymes: the enzyme corresponding to the restriction site selected at the level of the C-moiety, for example, Bgl II, and another enzyme which cleaves the sequence on the opposite side after the major gene - for example, Eco RI - from a double-stranded linear DNA sequence bearing said sequence. The DNA thus obtained is ligated to a vector treated with the same two restriction enzymes, which vector comprises the sequence encoding the C-segment of the TCR chain and the same restriction sites as above, for example Bgl II and Eco RI. The expected chimeric gene is thus obtained. This can not, however, be expressed as such. That is why, on the one hand, the chimera-bearing vector is treated with two restriction enzymes that cut on both sides of the chimeric gene encoding the chimeric TCR; and, on the other hand, a eukaryotic expression vector is treated with the same two restriction enzymes. Binding of the above gene encoding the chimeric TCR to said eukaryotic expression vector gives a novel chimeric eukaryotic expression vector. Said eukaryotic expression vector must contain the elements necessary to ensure correct transcription of the chimeric gene encoding the TCR. In this regard, mention may be made, for example, of the vector pHpPr1-N0o, which can be cut with Bam HI and Sal I and comprises the neomycin resistance gene, which is used as a selection marker, a SV40 eukaryotic promoter gene and a polyadenylation signal in the vicinity of the Bam HI site. The novel chimeric vector obtained is advantageously used to transfect eukaryotic cells, preferably mouse T cells, especially cell lines bearing all elements for TCR expression, with the exception of the gene carried by the chimeric vector. Mention may be made, for example, of the mouse line TWO 19 or that of the name DS 23.27.4. Such cells allow easy selection of the transfected cells which alone are capable of expressing the TCR on the cell surface.

Claro que cada ligação (acima e abaixo referida) é seguida pela transfecção de um hospedeiro apropriado e pela selecção das células que contêm a quimera desejada.Of course, each binding (above and below) is followed by transfection of an appropriate host and selection of the cells containing the desired chimera.

As células transfectadas podem ser administradas como antigene, de preferência, a ratos, por exemplo, por injecção íntraperitoneal. Podem, assim, recolher-se células do baço de mamíferos murinos tratados desta forma - células capazes de segregar os anticorpos pesquisados - para as fundir com células imortais, como o mieloma. Os hibridomas seleccionados que produzem os anticorpos procurados permitem então a preparação de anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais, dirigidos contra uma cadeia V particular do TCR do mamífero seleccionado, especialmente o homem. O ADN de cadeia dupla que codifica a cadeia do receptor do antigene de células T de mamífero pode, por exemplo, ser preparado como se segue: O estudo da sequência de genes que codificam uma dada cadeia permite seleccionar um local de restrição já existente numa porção constante C ou criar esse local na referida sequência. O conhecimento destas sequências, por exemplo no que diz respeito às cadeias para as famílias Vp1, νβ2, Vp3, νβ4, Vp5, νβ6, νβ7, Vp8, νβ10, νβ11, νβ12, νβ15, \/β17, νβ18, permite a síntese de novos oligonucleótidos que podem ser utilizados para sintetizar o ADN complementar a partir do ARN mensageiro. A partir de linfócitos T de mamífero (por exemplo, seres humanos), purifica-se o ARNm que codifica uma dada cadeia de TCR. Sintetiza-se o ADN correspondente com a ajuda 9 de um oligonucleótido ΟΗΟβ específico para um dado gene de mamífero e contendo, eventualmente, o local de restrição único seleccionado; sintetiza-se a segunda cadeia do ADN a partir de um oligonucleótido específico para a cadeia e com a ajuda da transcriptase inversa e amplifica-se o gene obtido por reacções de polimerização em cadeia (PCR) efectuando, por exemplo, cerca de trinta ciclos.Transfected cells may be administered as antigen, preferably to rats, for example, by intraperitoneal injection. Spleen cells from murine mammals treated in this way - cells capable of secreting the screened antibodies - can thus be harvested to fuse them with immortal cells, such as myeloma. Selected hybridomas that produce the desired antibodies then allow the preparation of antibodies, particularly monoclonal antibodies, directed against a particular TCR V chain of the mammal selected, especially man. The double stranded DNA encoding the mammalian T cell antigen receptor chain can, for example, be prepared as follows: Examination of the gene sequence encoding a given strand allows one to select a restriction site already present in a portion constant C or create that location in said sequence. The knowledge of these sequences, for example with respect to the families chains Vp1, νβ2, Vp3, νβ4, Vp5, νβ6, νβ7, Vp8, νβ10, νβ11, νβ12, νβ15, ßβ17, νβ18, allows the synthesis of novel oligonucleotides that can be used to synthesize the complementary DNA from the messenger RNA. From mammalian T lymphocytes (e.g., humans), the mRNA encoding a given TCR chain is purified. The corresponding DNA is synthesized with the aid of a ΟΗΟβ oligonucleotide specific for a given mammalian gene and optionally containing the single restriction site selected; the second strand of the DNA is synthesized from a chain-specific oligonucleotide and with the aid of reverse transcriptase and the gene obtained is amplified by polymerase chain reaction (PCR) for example by performing about thirty cycles.

Obtém-se, assim, uma grande quantidade de ADN linear codificante de cadeia dupla. Podem então cortar-se com as enzimas apropriadas, por exemplo, Bgl II e Eco RI, os fragmentos produzidos por PCR, de forma a eliminar toda ou parte da sequência que codifica a porção C, a partir do local seleccionado e de maneira a conservar as sequências V, D e J, assim como a totalidade do gene principal. A sequência nucleotídica de origem murina que compreende a porção complementar da porção C ausente da sequência da cadeia de mamífero acima referida, no caso em que aquela se encontra sob a forma de um vector que comporta a referida sequência, pode ser preparada como se segue: A partir de um banco de ADNc proveniente de uma linha celular murina, por exemplo, KB5C20, isola-se um ADNc completo contendo toda a porção codificante da cadeia do TCR escolhido com a ajuda de uma sonda conhecida; efectua-se a clonagem deste ADNc num plasmídeo apropriado, por exemplo pUC19, e depois transfecta-se o plasmídeo resultante, denominado neste caso pUCmCp2, num hospedeiro, por exemplo a estirpe bacteriana DH1 de E. coli.A large amount of linear double stranded DNA is thus obtained. The fragments produced by PCR can then be cut with the appropriate enzymes, for example Bgl II and Eco RI, so as to eliminate all or part of the sequence coding for the C moiety from the selected site and in order to preserve the V, D and J sequences, as well as the entire major gene. The nucleotide sequence of murine origin which comprises the complementary portion of the C moiety absent from the above-mentioned mammalian chain sequence, in the case where it is in the form of a vector carrying said sequence, can be prepared as follows: From a cDNA library from a murine cell line, for example KB5C20, a complete cDNA containing the entire coding portion of the chosen TCR chain is isolated with the aid of a known probe; the cDNA is cloned into an appropriate plasmid, for example pUC19, and then the resulting plasmid, referred to herein as pUCmCp2, is transfected into a host, for example the E.coli bacterial strain DH1.

Poderá, em seguida, clonar-se o fragmento interessante de ADN murino num fago. Para isso, pode digerir-se o pUCmCp2 com enzimas de restrição apropriadas, por exemplo Eco RI e Hind III, de forma a obter, no caso acima referido, três fragmentos. Purifica-se o fragmento que contém toda a sequência codificante da cadeia C murina desejada (no caso das enzimas previamente citadas, Eco RI corta na porção V da sequência). Obtém-se, desta forma, uma sequência que codifica uma parte da porção V, assim como a totalidade das porções D, J e C. Liga-se, em seguida, a referida sequência a um fago apropriado, por exemplo M13mp18, com as mesmas enzimas de restrição. Neste caso, o ADN fágico existe sob duas formas: cadeia simples para o fago encapsulado e cadeia dupla para a sua forma replicativa. Hibrida-se um oligonucleótido complementar da região a mutar, à excepção da mutação desejada, com a forma em cadeia simples do fago. A 10 cadeia complementar é sintetizada in vitro através de uma ADN polimerase, utilizando o mesmo oligonucleótido para iniciar a reacção. Fecha-se a nova cadeia sobre si mesma, com a ajuda de uma ligase. A cadeia dupla completamente homóloga é então transfectada, por exemplo, em E. coli, especialmente JM101. As colónias mutantes são seleccionadas, por exemplo, por hibridação com um oligonucleótido marcado radioactivamente.The interesting fragment of murine DNA can then be cloned into a phage. For this, pUCmCp2 can be digested with appropriate restriction enzymes, for example Eco RI and Hind III, in order to obtain, in the aforementioned case, three fragments. The fragment containing the entire coding sequence of the desired murine C-chain is purified (in the case of the aforementioned enzymes, Eco RI cuts into the V portion of the sequence). There is thus obtained a sequence encoding a portion of portion V, as well as all portions D, J and C. The sequence is then attached to a suitable phage, for example M13mp18, with the restriction enzymes. In this case, phage DNA exists in two forms: single strand for the encapsulated phage and double strand for its replicative form. An oligonucleotide complementary to the mutated region is hybridized, with the exception of the desired mutation, to the single stranded form of the phage. The complementary strand is synthesized in vitro through a DNA polymerase, using the same oligonucleotide to initiate the reaction. The new chain is closed on itself, with the help of a ligase. The fully homologous double strand is then transfected, for example, into E. coli, especially JM101. The mutant colonies are selected, for example, by hybridization with a radiolabeled oligonucleotide.

Para os detalhes relativamente à mutagénese dirigida, consultar Maniatis et al. (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press).For details regarding targeted mutagenesis, see Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Purifica-se o ADN de cadeia dupla de um subclone que comporta a mutação desejada e no qual o resto da sequência que codifica a porção C permaneceu íntegra, e corta-se com enzimas apropriadas, por exemplo, Eco RI e Eco RV, para isolar o fragmento que transporta o gene desejado. Liga-se então este fragmento a um plasmídeo adaptado, que seja possível de sequenciar, comporte locais de restrição que permitam extrair facilmente a sequência inserida para a introduzir num vector de expressão e que tenha sido previamente aberto através de enzimas compatíveis presentes no seu local de restrição múltiplo, por exemplo Eco RI e Sma I. Como de costume, o produto de ligação pode então ser transfectado num hospedeiro apropriado, por exemplo, uma estirpe bacteriana E. coli DH1. Efectuando a análise, por exemplo, através de corte com dois pares de enzimas, tal como Eco Rl-Xba I e Eco Rl-Bgl II, pode seleccionar-se um clone que forneça as bandas esperadas por meio de electroforese. O plasmídeo purificado compreende a sequência nucleotídica de origem murina esperada, complementar da porção C ausente da sequência da cadeia de mamífero acima referida, a partir do mesmo local de restrição, de forma a permitir a ligação em fase na grelha de leitura.The double stranded DNA of a subclone bearing the desired mutation is purified and in which the remainder of the sequence coding for the C moiety has remained intact, and is cut with appropriate enzymes, for example Eco RI and Eco RV, to isolate the fragment that carries the desired gene. This fragment is then ligated into a suitable plasmid, which is capable of sequencing, containing restriction sites that allow the inserted sequence to be easily extracted to introduce it into an expression vector and which has been previously opened through compatible enzymes present at its locus of multiple restriction, for example Eco RI and Sma I. As usual, the binding product can then be transfected into an appropriate host, for example, a bacterial strain E. coli DH1. Performing the analysis, for example, by cutting with two pairs of enzymes, such as Eco RI-Xba I and Eco RI-Bgl II, a clone can be selected which provides the expected bands by means of electrophoresis. The purified plasmid comprises the nucleotide sequence of expected murine origin, complementary to portion C absent from the above mammalian chain sequence, from the same restriction site, so as to allow in-phase attachment to the reading frame.

Do que precede entende-se que o processo da presente invenção permite uma preparação fácil de painéis de anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais, específicos para diferentes estruturas da porção V das cadeias do TCR, a partir de um número muito limitado de segmentos de origem murina. 11From the above, it is understood that the process of the present invention enables easy preparation of antibody panels, especially monoclonal antibodies, specific for different structures of the V portion of the TCR chains, from a very limited number of murine origin segments. 11

Com efeito, o referido segmento murino que codifica a porção C compreende, por modificação, um local de restrição que está presente na quase totalidade das cadeias constantes de origem humana, por exemplo, Bgl II para as cadeias humanas Cpi e Cp2.Indeed, said murine segment encoding the C moiety comprises, by modification, a restriction site which is present in almost all of the constant chains of human origin, for example, Bgl II for the human Cpi and Cp2 chains.

As diferentes técnicas utilizadas acima são bem conhecidas dos peritos e foram objecto de numerosas publicações que fazem parte do estado da técnica.The different techniques used above are well known to those skilled in the art and have been the subject of numerous publications which are part of the prior art.

Os exemplos que se seguem ilustram a presente invenção sem, contudo, a limitar. A Figura 1 representa comparações dos ADNc de cadeias Cp2 de rato e de cadeias Cp1 humanas de TCR. A Figura 2 representa um oligonucleótido complementar do ADNc que codifica a cadeia Cp2 do TCR murino, excepto ao nível das duas bases necessárias para introduzir o local Bgl II. A Figura 3 representa oligonucleótidos específicos para as cadeias Cpi e Cp2 de TCR humanos. A Figura 4 representa os perfis de citometria de fluxo de transfectantes de DOIS 19 (perfis negros) obtidos com dois ADNs quiméricos contendo Vp8 humanos (quadros superiores: à esquerda FRN8.1.2, à direita MZ3 DC8) e Vp2 humanos (quadros inferiores: à esquerda FRN2.7.3, à direita FRN2.7.6), relativamente à linha de partida DOIS 19 (perfis brancos); as células são marcadas com um anticorpo anti-CD3 de rato. A Figura 5 mostra a análise da linha Jurkatt com um anticorpo distinto, o sobrenadante de E83C11.20 e o anticorpo monoclonal anti-CD3 humano da Immunotech.The following examples illustrate the present invention without, however, limiting it. Figure 1 depicts comparisons of the mouse Cp2 chains cDNAs and human TCR Cp1 chains. Figure 2 depicts an oligonucleotide complementary to the cDNA encoding the Cp2 chain of the murine TCR except at the level of the two bases required to introduce the Bgl II site. Figure 3 depicts oligonucleotides specific for the human TCR Cpi and Cp2 chains. Figure 4 depicts flow cytometric profiles of DOIS 19 transfectants (black profiles) obtained with two chimeric Vp8-containing chimeric DNAs (top frames: left FRN8.1.2, right MZ3 DC8) and human Vp2 (bottom frames: α left FRN2.7.3, FRN2.7.6 right, relative to the starting line TWO 19 (white profiles); the cells are labeled with a rat anti-CD3 antibody. Figure 5 shows the analysis of the Jurkatt line with a distinct antibody, the supernatant of E83C11.20 and the human anti-CD3 monoclonal antibody from Immunotech.

PARTE EXPERIMENTAL EXEMPLO 1EXPERIMENTAL PART EXAMPLE 1

Tira-se partido da existência de um local Bgl II no gene que codifica as cadeias p1 e P2 do TCR na sua região C, nas proximidades da região J, e da existência de um local idêntico, à excepção de duas bases, na porção homóloga do rato (ver Figura 1). 12 A) Preparação da sequência nucleotídica de origem murina que compreende a porção complementar da porção C ausente da sequência humana de uma cadeia β2, sob a forma de um vector que comporta a referida sequência. 1. Cadeia CB2 murina A sequência da cadeia Οβ2 murina está descrita em detalhe em Malissen, M. et al. (1984) Cell 37: 1101-1110. Obteve-se um ADNc completo contendo toda a porção codificante de Cp2, a partir de um banco de ADNc da linha celular murina KB5C20 (descrita em Albert et al. (1982) Immunogenetics 16: 533-549). Este ADNc foi clonado no plasmídeo pUC19. O plasmídeo resultante pUCmCp2 foi transfectado na estirpe bacteriana DH1. A bactéria recombinante foi depositada junto da Colecção Nacional de Culturas de Microrganismos (CNCM) em Paris, em 12 de Fevereiro de 1991, sob o número 1-1032, e está disponível sem restrições. 2. Mutagénese dirigida do ADNc codificante da cadeia CB2 murinaWe take advantage of the existence of a Bgl II site in the gene encoding the TCR p1 and P2 chains in its C region, near the J region, and the existence of an identical site, with the exception of two bases, in the homologous portion of the mouse (see Figure 1). A) Preparation of the nucleotide sequence of murine origin comprising the complementary portion of the C moiety absent from the human sequence of a β2 chain, in the form of a vector carrying said sequence. 1. murine CB2 chain The murine Οβ2 chain sequence is described in detail in Malissen, M. et al. (1984) Cell 37: 1101-1110. A complete cDNA containing the entire coding portion of Cp2 was obtained from a cDNA library of the murine cell line KB5C20 (described in Albert et al. (1982) Immunogenetics 16: 533-549). This cDNA was cloned into plasmid pUC19. The resulting plasmid pUCmCp2 was transfected into the bacterial strain DH1. The recombinant bacterium was deposited with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM) in Paris on February 12, 1991, under the number 1-1032, and is available without restriction. 2. Directed mutagenesis of the cDNA encoding the murine CB2 chain

Princípio: O procedimento de mutagénese dirigida escolhido utiliza o fago filamentoso M13mp18 da BIORAD. Este bacteriófago está descrito com precisão em Norrander et al. (1983) Gene 26: 101-106. Ele está disponível comercialmente através de vários fabricantes, particularmente através da BIORAD. O princípio da manipulação é o seguinte:Principle: The chosen mutagenesis procedure uses the filamentous phage M13mp18 from BIORAD. This bacteriophage is described with precision in Norrander et al. (1983) Gene 26: 101-106. It is available commercially through various manufacturers, particularly through BIORAD. The principle of manipulation is as follows:

Clona-se o fragmento de ADN a modificar no local de restrição múltiplo do fago. Este vector fágico existe sob duas formas durante o seu ciclo de vida. A forma replicativa, na bactéria, é essencialmente de cadeia dupla; a forma encapsulada é de cadeia simples. O ADN das duas formas é purificável. Um oligonucleótido complementar da região a mutar, à excepção da mutação desejada, é hibridado com a forma em cadeia simples do fago. A cadeia complementar é, em seguida, sintetizada in vitro por meio de uma ADN polimerase, utilizando o oligonucleótido que comporta a mutação desejada para iniciar a reacção. Usa-se uma ligase para fechar a nova cadeia sobre si mesma, na extremidade 5’ do oligonucleótido. A cadeia dupla completamente homóloga, à excepção da mutação desejada, é transfectada em E. coli, resultando em duas classes de colónias mutantes e não mutantes. As colónias mutantes são, em seguida, seleccionadas. 13The DNA fragment to be modified is cloned into the multiple restriction site of the phage. This phage vector exists in two forms during its life cycle. The replicative form, in the bacterium, is essentially double-stranded; the encapsulated form is single-stranded. The DNA of the two forms is purifiable. An oligonucleotide complementary to the mutated region, with the exception of the desired mutation, is hybridized to the single stranded form of the phage. The complementary strand is then synthesized in vitro by means of a DNA polymerase using the oligonucleotide which carries the desired mutation to initiate the reaction. A ligase is used to close the new strand on itself at the 5 'end of the oligonucleotide. The fully homologous double strand, with the exception of the desired mutation, is transfected into E. coli, resulting in two classes of mutant and non-mutant colonies. The mutant colonies are then selected. 13

Para introduzir o local Bgl II no ADNc da cadeia Cp2 de rato, clona-se este ADNc no fago M13mp18. Utiliza-se o oligonucleótido da figura 2 para efectuar a mutagénese. Este oligonucleótido é complementar do ADNc que codifica o gene Cp2 murino, à excepção das duas bases necessárias para introduzir o local Bgl II. Estas duas bases estão sublinhadas na figura 2.To introduce the Bgl II site into the mouse Cp2 chain cDNA, this cDNA is cloned into the M13mp18 phage. The oligonucleotide of Figure 2 is used to effect mutagenesis. This oligonucleotide is complementary to the cDNA encoding the murine Cp2 gene, except for the two bases required to introduce the Bgl II site. These two bases are underlined in figure 2.

Os procedimentos de clonagem, transfecção, distribuição, análises das colónias e purificação das formas em cadeia simples e dupla do fago M13mp18 são descritas, de forma precisa, por Maniatis et al. (já citado). O hospedeiro bacteriano utilizado é a estirpe JM101 d eE.coli.Methods of cloning, transfection, distribution, colony analysis and purification of the single and double stranded forms of the M13mp18 phage are described in detail by Maniatis et al. (cited above). The bacterial host used is strain JM101 dEE.coli.

Experimentação: a) Clonagem de CB2 murino em M13mp18.Experimentation: a) Cloning of murine CB2 in M13mp18.

Digere-se o plasmídeo pUCmCp2 com Eco RI e Hind III. Esta digestão fornece 3 fragmentos que se distinguem por meio de electroforese em gel de agarose. Purifica-se o fragmento intermediário com cerca de 1000 pares de bases (pb) que contém toda a sequência codificante de Οβ2 murino. Este fragmento é ligado ao ADN de cadeia dupla do fago M13mp18 previamente aberto com Eco RI e Hind III, os quais são locais presentes no local de restrição múltipla deste vector. Transfectam-se então colónias de E. coli JM101.The plasmid pUCmCp2 is digested with Eco RI and Hind III. This digestion provides 3 fragments which are distinguished by agarose gel electrophoresis. The 1000 bp (bp) intermediate fragment containing the entire murine Î²2 coding sequence is purified. This fragment is ligated to the double stranded DNA of the phage M13mp18 previously opened with Eco RI and Hind III, which are sites present at the multiple restriction site of this vector. Colonies of E. coli JM101 are then transfected.

Da análise das colónias isoladas, retém-se o clone Μ13ΕΗΟβ7 e, em seguida, purifica-se a forma em cadeia simples de Μ13ΕΗΟβ7. b) Mutagénese de CB2 de rato O procedimento utilizado está descrito, de forma precisa, em Maniatis et al.. Devem, no entanto, ressalvar-se os seguintes pontos: O oligonucleótido da figura 2 é sintetizado no aparelho Applied Biosystems 380B e, em seguida, purificado em coluna sep Pak C18. 14From the analysis of the isolated colonies, clone Μ13ΕΗΟβ7 is retained, and then the single-stranded form of Μ13ΕΗΟβ7 is purified. b) Mutagenesis of rat CB2 The procedure used is described accurately in Maniatis et al. The following points should, however, be noted: The oligonucleotide of Figure 2 is synthesized in the Applied Biosystems 380B apparatus, and in then purified on Sep C18 column. 14

Hibridam-se 0,2 μg da cadeia simples de Μ13ΕΗΟβ7 com 3 pmole de OhCp cinase. Não se utiliza qualquer outro oligonucleótido. A temperatura inicial da reacção de hibridação é de 70°C. A polimerase utilizada é a T4 ADN polimerase (1 unidade por reacção) para completar em cadeia dupla. A transfecção é efectuada na estirpe E coli JM101. A selecção das colónias mutantes faz-se por hibridaçao com o oligonucleótido da figura 2 marcado radioactivamente. A temperatura de hibridação é de 42°C. Duas lavagens de 10 min, a 4°C, foram suficientes para discriminar as colónias mutantes por auto-radiografia. O ADN de um subclone de uma colónia identitificada por hibridação radioactiva, denominado muCp215, foi digerido com Bgl II e, em seguida, sequenciado pelo método de Sanger para confirmação da mutação desejada e integridade do resto da sequência Cp2 murina. O ADN em cadeia dupla deste subclone foi purificado e utilizado no resto das experiências. 3 Subclonagem da cadeia mutada em p Bluescript SK* p Bluescript SK+ é um plasmídeo totalmente caracterizado e disponível comercialmente através da companhia STRATAGENE. O ADN de cadeia dupla de muCp215 é cortado com Eco RI e Eco RV, e o mais pequeno dos dois fragmentos é purificado em gel de agarose. Este fragmento é ligado ao p Bluescript previamente aberto com Eco RI e Sma I, dois locais presentes no “polylinker” deste plasmídeo, e transfectado na estirpe de E. coli DH1, que serve de hospedeiro à quimera. As colónias isoladas são analisadas por corte com dois pares de enzimas: Eco Rl-Xba I e Eco Rl-Bgl II. Um clone denominado pBSmuCp215 fornece as bandas esperadas (cerca de 1,2 kb e 0,5 kb, respectivamente) por meio de electroforese. Este plasmídeo foi purificado e utilizado no resto das experiências.0.2 μg of Μ13Εββ single strand is hybridized with 3 μmol OhCp kinase. No other oligonucleotide is used. The initial temperature of the hybridization reaction is 70 ° C. The polymerase used is T4 DNA polymerase (1 unit per reaction) to complete double stranded. The transfection is performed on E. coli strain JM101. Selection of the mutant colonies is done by hybridization with the oligonucleotide of Figure 2 radiolabelled. The hybridization temperature is 42øC. Two 10 min washes at 4 ° C were sufficient to discriminate the mutant colonies by autoradiography. DNA from a subclone of a colony identified by radioactive hybridization, termed muCp215, was digested with Bgl II and then sequenced by the Sanger method for confirmation of the desired mutation and integrity of the remainder of the murine Cp2 sequence. The double stranded DNA of this subclone was purified and used in the remainder of the experiments. 3 Subcloning of the mutated strand in p Bluescript SK * p Bluescript SK + is a fully characterized plasmid and commercially available from STRATAGENE. The muCp215 double stranded DNA is cut with Eco RI and Eco RV, and the smallest of the two fragments is purified on agarose gel. This fragment is ligated into the previously opened Bluescript p with Eco RI and Sma I, two sites present on the polylinker of this plasmid, and transfected into E. coli DH1 strain, which serves as host to the chimera. The isolated colonies are analyzed by cutting with two enzyme pairs: Eco RI-Xba I and Eco RI-Bgl II. A clone termed pBSmuCp215 provides the expected bands (about 1.2 kb and 0.5 kb, respectively) by means of electrophoresis. This plasmid was purified and used in the rest of the experiments.

B) Obtenção de ADNc humano codificando a cadeia do TCR 15 A técnica de polimerização em cadeia (PCR) é escolhida pelas razões citadas a seguir: - estão publicados muitos genes que codificam a cadeia do TCR, incluindo diferentes regiões V, - rapidez de obtenção de ADNc por esta técnica, - certeza de ter genes completos na extremidade 5’, compreendendo o codão ATG de iniciação, - facilidade de integrar locais de restrição na extremidade 5’ do gene para facilitar a clonagem.B) Production of human cDNA encoding the TCR chain The polymerase chain reaction (PCR) technique is chosen for the following reasons: - many genes encoding the TCR chain, including different V regions, are published, - rapidity of production cDNA by this technique, - certainty to have complete genes at the 5 'end, comprising the initiation ATG codon, - ease of integrating restriction sites at the 5' end of the gene to facilitate cloning.

No exemplo preferido, e para mostrar a polivalência permitida pela invenção, isolaram-se vários ADNc humanos contendo diferentes segmentos variáveis e acoplaram-se à cadeia mutada Cp2 de rato. - Obtenção de ARNm de células T humanasIn the preferred example, and to show the polyvalency allowed by the invention, several human cDNAs containing different variable segments were isolated and coupled to the rat Cp2 mutated chain. - Obtaining human T-cell mRNA

Utiliza-se uma mistura de linfócitos periféricos de indivíduos caucasianos, obtidos junto do Centro de Transfusão Sanguínea de Marselha. Após Ficoll, os linfócitos são ajustados a 1 milhão de células por mililitro em meio RPMI, 10% soro fetal de vitelo, 20 mM glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 500 IU penicilina, e estimulados com fitohemaglutinina A (10 μg/mililitro de concentração final), durante 3 dias. Utilizam-se 200 milhões de células para purificação do seu ARN total. O protocolo utilizado está descrito, de forma exacta, em Maniatis et al.. Obtêm-se cerca de 50 μ9 de ARN por este método.A mixture of peripheral lymphocytes from Caucasian individuals obtained from the Center for Blood Transfusion in Marseille is used. After Ficoll, lymphocytes are adjusted to 1 million cells per milliliter in RPMI medium, 10% fetal calf serum, 20 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate, 500 IU penicillin, and stimulated with phytohemagglutinin A (10 μg / milliliter of final concentration) for 3 days. 200 million cells are used for purification of their total RNA. The protocol used is described accurately in Maniatis et al. About 50 μ of RNA is obtained by this method.

- Reaccão de PCR- PCR Reaction

Um oligonucleótido OhCp, que é específico para as duas cadeias humanas Οβ2 e Cpi e contém o local único Bgl II presente nos segmentos génicos ΰβ1 e Cp2, é sintetizado de forma análoga a OmCfrAn OhCp oligonucleotide, which is specific for the two Οβ2 and Cpi human chains and contains the unique Bgl II site present in the ΰβ1 and Cp2 gene segments, is synthesized analogously to OmCfr

Sintetizam-se igualmente cinco oligonucleótidos - OL1, OL2, OL3, OL8, OL12 -específicos para as sequências principais Ν/β1.2, νβ2.1, νβ3.1, νβ8.1, νβ12.3, 16 respectivamente, segundo a definição das subfamílias νβ de Toyonaga et al. (1987) EurJ ImmunolW: 375-383.Five oligonucleotides - OL1, OL2, OL3, OL8, OL12 - specific for the major sequences Ν / β1.2, νβ2.1, νβ3.1, νβ8.1, νβ12.3, 16 respectively are also synthesized according to the definition of the νβ subfamilies of Toyonaga et al. (1987) EurJ Immunol W: 375-383.

Estes oligonucleótidos possuem na extremidade 5' as 8 bases TAGAATTC que não hibridam com as sequências principais das regiões variáveis. Estas 8 bases contêm o local Eco RI para facilitar a clonagem dos produtos de amplificação.These oligonucleotides have at the 5 'end the 8 TAGAATTC bases which do not hybridize to the major sequences of the variable regions. These 8 bases contain the Eco RI site to facilitate the cloning of the amplification products.

Estes oligonucleótidos estão representados na figura 3.These oligonucleotides are shown in Figure 3.

Foram efectuadas cinco reacções independentes de PCR, utilizando os pares de oligonucleótidos OhCp-OLi, onde i é um elemento de (1, 2, 3, 8, 12). Nós começámos com o par OhCp*OL8. O procedimento experimental está descrito em detalhe em Kawasaki et al. (1989) PCR Technology, Principies and Applications for DNA Amplification, Stockton Press, Henry A. Ehrlich Edition, pp 89 e seguintes. Os pormenores que se seguem são úteis: A quantidade de ARN de partida é de 1 μg para a síntese da cadeia complementar de ADNc.Five independent PCR reactions were performed using the oligonucleotide pairs OhCp-OLi, where i is an element of (1, 2, 3, 8, 12). We started with the pair OhCp * OL8. The experimental procedure is described in detail in Kawasaki et al. (1989) PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, Stockton Press, Henry A. Ehrlich Edition, pp. 89 et seq. The following details are useful: The amount of starting RNA is 1 μg for synthesis of the complementary cDNA strand.

Para a reacção de PCR propriamente dita, utilizam-se 10 pmole de cada oligonucleótido OL8 e OhCp. O ciclo de PCR é: -1 min de desnaturação a 95°C, -1 min de hibridação a 52°C,For the PCR reaction itself, 10 Âμmole of each OL8 and OhCp oligonucleotide is used. The PCR cycle is: -1 min of denaturation at 95 ° C, -1 min of hybridization at 52 ° C,

-1 mn de extensão a 72°C e efectuam-se 30 ciclos no DNA Thermalcycler, Version 2.2 da Perkin Elmer. O produto da reacção é depositado em gel de agarose a 1,4% para electroforese. Após coloração com brometo de etídeo, corta-se uma banda distinta com cerca de 500 pb e o ADN é electroeluído. Obtêm-se cerca de 30 ng de ADN.-1 nm extension at 72 ° C and run 30 cycles on Perkin Elmer's Thermalcycler DNA, Version 2.2. The reaction product is deposited on 1.4% agarose gel for electrophoresis. After staining with ethidium bromide, a distinct band of about 500 bp is cut and the DNA is electroeluted. About 30 ng of DNA is obtained.

Amplifica-se uma segunda vez 1 ng deste ADN por PCR. Purifica-se a banda específica da mesma forma que anteriormente e obtêm-se 300 ng de ADN. 171 ng of this DNA is amplified a second time by PCR. The specific band is purified in the same manner as above and 300 ng DNA is obtained. 17

As reacções de PCR com os pares OL1, OL2, OL3, OL12 associados, respectivamente, a OhCp foram efectuadas da mesma forma, exceptuando no caso de OL12 e OL3 onde a segunda amplificação não foi necessária (obtiveram-se mais de 100 ng na primeira amplificação). C) Construção dos genes quiméricos Princípio:PCR reactions with the OL1, OL2, OL3, OL12 pairs associated with OhCp were performed in the same manner, except for OL12 and OL3 where the second amplification was not necessary (more than 100 ng were obtained in the first amplification). C) Construction of chimeric genes Principle:

Constroem-se os genes quiméricos clonando cada fragmento produzido por PCR e cortado com Eco RI e Bgl II no fragmento extenso obtido com a digestão de pBSmuCp215.The chimeric genes are assembled by cloning each fragment produced by PCR and cut with Eco RI and Bgl II on the extended fragment obtained with the digestion of pBSmuCp215.

Corta-se o pBSmuCp215 com Eco RI e Bgl II, e o fragmento extenso denominado FpBSmuCp215 é purificado em gel de agarose e electroeluído.PBSmuCp215 is cleaved with Eco RI and Bgl II, and the extended fragment termed FpBSmuCp215 is purified on agarose gel and electroeluted.

Com Eco RI e Bgl II, cortam-se 100 ng do produto de amplificação obtido com os oligonucleótidos OL8 -OhCp.With Eco RI and Bgl II, 100 ng of the amplification product obtained is cut with oligonucleotides OL8 -OhCp.

Ligam-se estes dois fragmentos e o produto de ligação é transfectado em DH1. A análise de colónias isoladas BSGp8.1, BSGP8.2 ... BSGp8.5, por corte com Bgl ll-Eco RI, fornece o fragmento esperado com cerca de 500 pb. BSGP8.1 é sequenciado entre o local Eco RI e o local Bgl II. A análise da sequência mostra uma semelhança total com a sequência publicada para Vp8.1 de Yoshikai, Y. et ai (1984) Nature 312: 521-524.These two fragments are ligated and the ligation product is transfected into DH1. Analysis of isolated colonies BSGp8.1, BSGP8.2 ... BSGp8.5, by cleavage with BglII-Eco RI, provides the expected fragment with about 500 bp. BSGP8.1 is sequenced between the Eco RI site and the Bgl II site. Sequence analysis shows a complete similarity to the published sequence for Vp8.1 of Yoshikai, Y. et al (1984) Nature 312: 521-524.

Do mesmo modo, efectua-se a clonagem dos produtos de PCR obtidos com os pares de oligonucleótidos contendo OL1, OL2, OL3, OL12 em FpBSCp215.Likewise, the PCR products obtained with the oligonucleotide pairs containing OL1, OL2, OL3, OL12 in FpBSCp215 are cloned.

Obtém-se, relativamente à definição das diferentes subfamílias Vp de Toyonaga et al. (1987) Eur. J. Immunol. 17: 375-383: . com OL1, os clones BSGpi .2 e BSGpi.3 cuja sequência para a região V é idêntica a Vp1.2. 18 . com OL2, os clones BSGP2.5 cuja sequência para a região V corresponde a νβ2.2, e Βδθβ2.7 e Β8Θβ2.11 que possuem o gene νβ2.3. . com OL12, os clones ΒδΘβ12.1 e ΒδΟβ12.4 que possuem o gene \/β12.3. EXEMPLO 2: Expressão dos genes quiméricosWe obtain, in relation to the definition of the different Vp subfamilies of Toyonaga et al. (1987) Eur. J. Immunol. 17: 375-383. with OL1, clones BSGpi .2 and BSGpi.3 whose sequence for the V region is identical to Vp1.2. 18. with OL2, the BSGP2.5 clones whose sequence for the V region corresponds to νβ2.2, and Βδθβ2.7 and Β8Θβ2.11 that have the νβ2.3 gene. . with OL12, clones ΒδΘβ12.1 and ΒδΟβ12.4 that have the gene β / β12.3. EXAMPLE 2: Expression of chimeric genes

Princípio: A cadeia do TCR é uma proteína membranar que é expressa na superfície se, e unicamente se, as outras cadeias do complexo do TCR que lhe estão associadas (isto é, a cadeia α e o complexo CD3) estiverem presentes.Principle: The TCR chain is a membrane protein that is expressed on the surface if, and only if, the other chains of the associated TCR complex (ie the α chain and the CD3 complex) are present.

Para se obter a expressão dos genes quiméricos anteriormente construídos, utiliza-se a linha celular murina DOIS 19 desenvolvida por Letourneur, F. et al. (1989) Eur. J. Immunol. 19: 2269-2274. DOIS 19 é um mutante de um hibridoma T de rato que possui todos os componentes do TCR, excepto a cadeia β. Esta linha não exprime pois TCR na sua superfície. A transfecção de uma cadeia exógena induz a expressão de um receptor funcional nas células transfectadas. Dois genes quiméricos da invenção, contidos em ΒδΘβδ.Ι e ΒδΘβ2.7, foram transfectados nesta célula, seguindo os protocolos descritos a seguir: 1) Subclonaqem dos genes quiméricos num vector de expressão eucariota Princípio: O vector de expressão escolhido é o plasmídeo ρΗβΡΜ-néo. Ele está descrito de forma precisa em Gunning, P. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 4831-4835. O gene a expressar é subclonado a jusante do promotor β actina e a montante de um local de poliadenilação presente neste plasmídeo. Estes dois sinais asseguram a síntese de um ARN mensageiro funcional do gene inserido. Por outro lado, este plasmídeo possui o gene de resistência à neomicina que confere resistência a uma série de antibióticos - no caso do exemplo preferido, o antibiótico G418 - às células que integraram o plasmídeo. 19To obtain the expression of the chimeric genes previously constructed, the murine cell line TWO 19 developed by Letourneur, F. et al. (1989) Eur. J. Immunol. 19: 2269-2274. TWO is a mutant of a mouse T hybridoma that has all components of the TCR except the β chain. This line does not therefore express TCR on its surface. Transfection of an exogenous chain induces the expression of a functional receptor in the transfected cells. Two chimeric genes of the invention, contained in δδβδδ and δδββ2, were transfected into this cell following the protocols described below: 1) Subcloneqem of chimeric genes into a eukaryotic expression vector Principle: The expression vector chosen is the plasmid ρΗβΡΜ -néo. It is described accurately in Gunning, P. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Know. USA 84: 4831-4835. The gene to be expressed is subcloned downstream of the β-actin promoter and upstream of a polyadenylation site present in this plasmid. These two signals ensure the synthesis of a functional messenger RNA of the inserted gene. On the other hand, this plasmid has the neomycin resistance gene which confers resistance to a number of antibiotics - in the case of the preferred example, the antibiotic G418 - to the cells that integrated the plasmid. 19

Por outro lado, estão igualmente presentes uma origem de replicação e um gene de resistência à ampicilina, que permitem a selecção e a replicação em E. coli. A estirpe de E. coli aqui utilizada é MC 1061.On the other hand, an origin of replication and an ampicillin resistance gene, which allow selection and replication in E. coli, are also present. The E. coli strain used herein is MC 1061.

Experimentação:Experimentation:

Corta-se o plasmídeo BSGP8.1 com as enzimas Bam Hl e Sal I e purifica-se o menor dos dois fragmentos (1,2 kb) em gel de agarose. Este fragmento que comporta a totalidade da sequência codificante do gene quimérico é ligado ao plasmídeo ρΗβΡΜ-ηέο, previamente aberto com Bam Hl e Sal I. O produto de ligação é transfectado em E. coli MC 1061 e, da análise de colónias isoladas por corte com Bam Hl e Sal I, conserva-se o clone denominado néo-Gp8.1, que fornece o fragmento esperado com 1,2 kb por meio de electroforese em gel de agarose.The plasmid BSGP8.1 is cut with the enzymes Bam HI and Sal I and the smaller of the two fragments (1.2 kb) is purified on agarose gel. This fragment bearing the entire coding sequence of the chimeric gene is ligated to the plasmid ρΗβΡΜ-ηέο, previously opened with Bam HI and Sal I. The ligation product is transfected into E. coli MC 1061 and from analysis of isolated colonies by cut with Bam HI and Sal I, the clone designated neo-Gp8.1, which provides the expected 1.2 kb fragment, is maintained by agarose gel electrophoresis.

Da mesma forma, o gene quimérico contido em pBSGp2.7 é subclonado em pHpPr1-néo, conservando-se o clone denominado néo-Gp2.7. Néo- Gp8.1 foi depositado na CNCM em 12 de Fevereiro de 1991, sob o n.° 1-1033. 2. Transfeccão dos genes quiméricos em DOIS 19 O procedimento de transfecção escolhido é a fusão de protoplastos.Likewise, the chimeric gene contained in pBSGp2.7 is subcloned into pHpPr1-n0, and the clone designated as neo-Gp2.7 is conserved. Neo-Gp8.1 was deposited with the CNCM on 12 February 1991 under No. 1-1033. 2. Transfection of chimeric genes into TWO The preferred transfection procedure is the fusion of protoplasts.

Segue-se passo a passo o protocolo descrito por Malissen et ai. (ref. “Technique de transfert de gènes dans les cellules eucaryotes”, 1990, Editions INSERM, Paris, 25-31), exceptuando pelo facto da concentração de G418 no meio selectivo ser de 3 mg/ml com os clones néo-Gp8.1 e néo-Gp2.7. 4. Análise dos transfectantesThe protocol described by Malissen et al. Is followed step by step. (ref. Technique de transfert de gènes dans les cellules eucaryotes, 1990, Editions INSERM, Paris, 25-31), except that the concentration of G418 in the selective medium is 3 mg / ml with the non-Gp8 clones. 1 and neo-Gp2.7. 4. Analysis of transfectants

Para néo-Gp8.1, as colónias resistentes à neomicina, denominadas FRN8.1.1 .... FRN8.1.24, são analisadas por citometria de fluxo. Para cada clone, colocam-se 105 células numa solução de Dubelco Modified Eagle Médium (DMEM) com 4% de soro fetal de vitelo (SFV), 0,02% azida de sódio e 15 μg/ml anticorpos anti-CD3 de rato (anticorpos 2C11 descritos em Leo et ai. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 1374) sob agitação 20 durante 45 min, a 4°C. Após três lavagens com DMEM, 4% SFV, 0,02% azida de sódio, incubam-se as células com um anticorpo policlonal de cabra anti-imunoglobulina do baço marcado com FITC (reagente da Immunotech) numa concentração de 15 pg/ml em DMEM, 4% SFV, 0,02% azida durante 30 min, a 4°C, sob agitação. Após três lavagens com DMEM, 4% SFV, 0,02% azida de sódio, as células são fixas em PBS com 1% de formaldeído e analisadas no aparelho de citometria de fluxo FACSCAN de Becton Dickinson. Tratam-se 105 células DOIS 19 da mesma forma, que servem de controlo negativo. O perfil obtido para o clone FRN8.1.2 está apresentado na figura 4 em comparação com o perfil de DOIS 19.For neo-Gp8.1, neomycin resistant colonies, designated FRN8.1.1 .... FRN8.1.24, are analyzed by flow cytometry. For each clone, 105 cells were loaded into a solution of Dubelco Modified Eagle Medium (DMEM) with 4% fetal calf serum (SFV), 0.02% sodium azide and 15 μg / ml rat anti-CD3 antibodies ( 2C11 antibodies described in Leo et al (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84: 1374) under stirring for 45 min at 4 ° C. After three washes with DMEM, 4% SFV, 0.02% sodium azide, the cells are incubated with a FITC-labeled goat anti-immunoglobulin goat polyclonal antibody (Immunotech reagent) at a concentration of 15æg / ml in DMEM, 4% SFV, 0.02% azide for 30 min at 4 ° C under stirring. After three washes with DMEM, 4% SFV, 0.02% sodium azide, the cells are fixed in 1% formaldehyde PBS and analyzed on the Becton Dickinson FACSCAN flow cytometry apparatus. 105 cells are treated in the same manner, serving as a negative control. The profile obtained for clone FRN8.1.2 is shown in figure 4 compared to the profile of DOIS 19.

Procede-se da mesma forma com o plasmídeo néo-Gp2.7, e o perfil obtido no FACSCAN do clone FRN2.7.3 está apresentado na figura 4 em comparação com o de DOIS 19. As duas linhas celulares são guardadas para a imunização de ratos Balb/c. 5. Imunização de ratos Balb/cThe plasmid is also the same as plasmid neo-Gp2.7, and the profile obtained in the FACSCAN of clone FRN2.7.3 is shown in figure 4 compared to that of TWO 19. The two cell lines are stored for the immunization of mice Balb / c. 5. Immunization of Balb / c mice

Três ratos Balb/c são imunizados com FRN8.1.2. O protocolo de imunização é o seguinte: - Dia 0: 10 milhões de células FRN8.1.2 injectados por via intraperitoneal. - Dia 20: 10 milhões de células FRN8.1.2 injectados por via intraperitoneal. - Dia 40: 5 milhões de células injectados por via intravenosa. - Dia 43: Recolha dos baços para fusão. 6. Fusão por hibridacão linfocitáriaThree Balb / c mice are immunized with FRN8.1.2. The immunization protocol is as follows: - Day 0: 10 million FRN8.1.2 cells injected intraperitoneally. - Day 20: 10 million FRN8.1.2 cells injected intraperitoneally. - Day 40: 5 million cells injected intravenously. - Day 43: Collection of spleens for fusion. 6. Lymphocyte hybridization

Fundem-se os esplenócitos de dois ratos imunizados com o mieloma X63Ag258, seguindo o protocolo descrito por Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495-497. A análise dos sobrenadantes dos clones resultantes da fusão faz-se por citometria de fluxo de FRN8.1.2 versus DOIS 19. Recolhem-se 100 μΙ do sobrenadante de cada clone: 50 μΙ são incubados com 50 μΙ de DMEM, 4% SFV, 0,02% azida contendo 10* células FRN8.1.2, e os restantes 50 μΙ são incubados com 50 μΙ do mesmo meio, mas contendo 21 105 células DOIS 19. O protocolo é o mesmo que aquele utilizado para a análise dos transfectantes.Splenocytes from two mice immunized with the myeloma X63Ag258 are fused following the protocol described by Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495-497. Supernatant analysis of the clones resulting from the fusion is done by flow cytometry of FRN8.1.2 versus TWO 19. 100 μl of the supernatant from each clone is collected: 50 μl are incubated with 50 μl of DMEM, 4% SFV, , 02% azide containing 10 * FRN8.1.2 cells, and the remaining 50 μl are incubated with 50 μ of the same medium, but containing 21 105 cells of the TWO 19. The protocol is the same as that used for the analysis of the transfectants.

Dos 400 sobrenadantes testados, dois sobrenadantes assinalam FRN8.1.2 e não assinalam DOIS 19. Os dois monoclonais correspondentes reagem pois com uma cadeia do complexo quimérico do TCR contendo a cadeia humana νβ8.1. O clone E83C11.20 não assinala a linha FRN2.7.3, assegurando que este monoclonal não reconhece os componentes de rato do TCR quimérico. O clone E93C11.20, em compensação, assinala a linha humana Jurkatt que expressa a cadeia νβ8.1 (Yoshikai et al. (1984) Nature 312: 521-524). A figura 5 mostra a análise da linha Jurkatt com um anticorpo diferente, o sobrenadante de E83C11.20 e o monoclonal anti-CD3 humano da Immunotech.Of the 400 supernatants tested, two supernatants signal FRN8.1.2 and do not signal TWO 19. The two corresponding monoclonals then react with a chimeric TCR complex chain containing the νβ8.1 human chain. Clone E83C11.20 does not signal the FRN2.7.3 line, ensuring that this monoclonal does not recognize the mouse components of the chimeric TCR. Clone E93C11.20, in contrast, signals the Jurkatt human line expressing the νβ8.1 chain (Yoshikai et al. (1984) Nature 312: 521-524). Figure 5 shows the analysis of the Jurkatt line with a different antibody, the E83C11.20 supernatant and Immunotech's human anti-CD3 monoclonal.

Destas análises conclui-se que o monoclonal E83C11.20 é específico para uma cadeia humana νβ8.1. EXEMPLO 3From these analyzes it is concluded that the monoclonal E83C11.20 is specific for a νβ8.1 human chain. EXAMPLE 3

Preparou-se uma preparação injectável compreendendo: - Anticorpos monoclonais do exemplo 2 - Água para preparações injectáveis 5 mg 1 mlAn injectable preparation was prepared comprising: - Monoclonal antibodies of example 2 - Water for injections 5 mg 1 ml

Lisboa, '31JUL. 2000 Por IMMUNOTECH S.A.Lisbon, 31JUL. 2000 By IMMUNOTECH S.A.

Agente Oficial da Propriedade Industriai ArcodaCenceigão» 3e K-1100 LISBOA 22Official Property Agent Industriai ArcodaCenceigão »3e K-1100 LISBON 22

Claims

Recombinant DNA comprising a chimeric nucleotide sequence encoding a T-cell antigen receptor chain, said sequence comprising: a non-murine mammalian sequence encoding the entire variable portion (V ), (D) and (J) diversity, - and a murine origin sequence encoding the constant complementary portion (C) absent from the above mammalian sequence, the two sequences being bound to the level of a natural restriction site or artificially created.

Recombinant DNA according to claim 1, wherein the restriction site is native to the sequence encoding portion C.

Recombinant DNA according to claim 1 or 2, characterized in that the sequence from a mammal is the sequence encoding a Vp chain of human origin and the restriction site is Bgl II.

Recombinant DNA according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the restriction site is artificially created in the murine origin chain.

Recombinant DNA according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it is a eukaryotic expression vector.

Recombinant DNA according to claim 5, characterized in that the eukaryotic expression vector is a plasmid derived from PhpPr1-N0o.

Recombinant DNA according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the variable portion (V) is of human origin and is selected from Vp1, Vp2, Vp3, Vp4, Vp5, Vp6, Vp8, Vp8, Vp10, Vp11, Vp12, Vpi5, Vp17 and Vp18. 1

Recombinant DNA according to claim 7, characterized in that the variable portion (V) is Ν / β2.

Recombinant DNA according to claim 7, wherein the variable moiety is νβ17.

An antibody preparation process comprising the expression of hybridomas prepared by lymphocyte fusion from mice spleen cells immunized with the aid of an antigen containing a protein, characterized in that said protein is encoded by a recombinant DNA as defined in any one of claims 1 to 9.

Pharmaceutical compositions characterized in that they comprise antibodies prepared according to the process of claim 10.

Diagnostic products characterized in that they comprise antibodies prepared according to the process of claim 10.

A process for the preparation of a recombinant DNA as defined in claim 1, characterized in that: a nucleotide sequence consisting of at least the entire sequence encoding the V, D and J portions of an antigen receptor chain of T cells from a non-murine mammal, to the level of a restriction site, a - a nucleotide sequence of murine origin comprising the complementary portion of the C moiety absent from the above mammalian chain sequence, from the same restriction site above, said restriction site being artificially created in one or the other or both sequences to provide the expected chimera; then, if desired, linking a sequence comprising all of the above-mentioned portions V, D, J and C to a eukaryotic expression vector; and then, if desired, isolate the novel chimera obtained. 2

The method of preparing antibodies according to claim 10 comprising a step of preparing the recombinant DNA defined in claim 5, further characterized in that a eukaryotic cell bearing all the elements which allow the synthesis of the receptor of the T cell antigen, other than the homologous strand of the strand encoded by the abovementioned chimeric DNA sequence; if these transfected cells are used as antigen in the corresponding murine race; spleen cells collected in murine mammals to which the antigen was administered are fused with myeloma cells to prepare, according to known methods, antibodies directed against the mammalian variable sequence product.

15. Human T-cell receptor Vp2 anti-chain antibodies.

16. Human T-cell receptor Vp17 anti-chain antibodies. Lisbon, 31 JUL 2000 By IMMUNOTECH S.A.

Official Proprietor of the Industrial Property of the Company 3A-1100 USBQA 3

SUMMARY RECOMBINANT DNA MOLECULES THAT ENCODES A CHAIN OF THE T-CELL ANTIGEN RECEPTOR, PREPARATION PROCESS, ANTIBODIES AND MEDICATIONS BY ENGAGING THEM RECOMBINED DNA comprising a chimeric nucleotide sequence encoding a T-cell antigen receptor chain, said sequence consisting of: a sequence from a mammal encoding the entire variable portion (V), (D) and junction (J) diversity, and a murine origin sequence encoding the constant complementary portion (C) absent from said mammalian sequence, the two sequences being linked to the level of a naturally occurring or artificially created restriction site; antibodies obtained by use of said DNAs, pharmaceutical compositions and diagnostic products encompassing them and their preparation process.