DE69635639T2

DE69635639T2 - Interleukin-12-beta-Rezeptoren mit niedriger Bindungsaffinität

Info

Publication number: DE69635639T2
Application number: DE69635639T
Authority: DE
Inventors: Ulrich Andreas Gubler; David Howard Presky
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1995-08-01
Filing date: 1996-07-23
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2016-07-24
Also published as: EP1243597B1; US5840530A; DE69637599D1; EP1243597A2; ATE314468T1; ES2305024T3; US5919903A; ES2255067T3; US5852176A; PT1243597E; DE69635639D1; EP0759466A2; JPH09132598A; EP0759466B1; ATE400586T1; JP2948150B2; DK1243597T3; EP0759466A3; EP1950226A2; DK0759466T3

Description

Diese Erfindung betrifft allgemein Interleukin-12-Rezeptoren, insbesondere menschliche Interleukin-12-Rezeptoren.
Interleukin-12 (IL-12), früher bekannt als cytotoxischer Lymphocyten-Reifungsfaktor oder natürliche Killerzellen stimulierender Faktor, ist ein 75 kDa großes, heterodimeres Cytokin, bestehend aus 40 kDa (p40) und 35 kDa (p35) großen Untereinheiten, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind, welches mehrere biologische Aktivitäten hat, einschließlich der Stimulierung der Proliferation aktivierter T- und NK-Zellen (Gately M.K. et al., J. Immunol. 147 (1991), 874) (Kobayashi M. et al., J. Exp. Med. 170 (1989), 827), der Erhöhung der lytischen Aktivität von NK/LAK-Zellen (Kobayashi M. et al., J. Exp. Med. 170 (1989), 827; Stern A.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 6808), der Verstärkung von cytolytischen T-Zell-Antworten (Gately M.K. et al., Cell. Immunology 143 (1992), 127), der Induktion von Interferon-gamma durch ruhende und aktivierte T- und NK-Zellen (Kobayashi M. et al., J. Exp. Med. 170 (1989), 827; Chan S.H. et al., J. Exp. Med. 173 (1991), 869) und der Förderung von T_h1-Typ-Helferzellantworten (Manetti R. et al., J. Exp. Med. 177 (1993), 1199; Hsieh C.-S. et al., Science 260 (1993), 547).
Die biologische Aktivität von IL-12 wird durch die Bindung der IL-12-Moleküle an Zelloberflächen- oder Plasmamembran-Rezeptoren auf aktivierten T- und NK-Zellen vermittelt; jedoch ist der Beitrag der einzelnen Untereinheiten p35 und p40 zur Rezeptorbindung und Signalübertragung weiterhin unbekannt. Studien mit einem markierten IL-12 haben gezeigt, daß diese Bindung in einer spezifischen und sättigbaren Weise erfolgt. IL-12 überträgt ein Signal an Zielzellen über einen Rezeptor, der zuerst auf Phytohämagglutinin (PHA)-aktivierten CD4⁺- CD8⁺-T-Zellen und auf IL-2-aktivierten CD56⁺-NK-Zellen charakterisiert wurde (Chizzonite R. et al., J. Immunol. 148 (1992), 3117; Desai B. et al., J. Immunol. 148 (1992), 3125).
Bei einer Untersuchung von über 20 menschlichen Zelllinien, die den T-, B-, NK- und Myelomonocyten-Abstammungslinien angehören, wurde nur eine einzige IL-2-abhängige, menschliche CD4⁺-T-Zelllinie (Kit 225/K6) identifiziert, welche den IL-12-Rezeptor konstitutiv exprimiert und auf IL-12 anspricht (Desai B. et al., J. Immunol. 148 (1992), 3125; Desai B. et al., J. Immunol. 150 (1993), 207A). Frisch präparierte, PHA-aktivierte, periphere einkernige Blutzellen (PBMCs) und die Kit 225/K6-Zelllinie stellen folglich zwei geeignete Zellquellen für eine Untersuchung der Biochemie des funktionellen IL-12-Rezeptors dar, wobei es möglicherweise noch andere gibt.
Durch Gleichgewichtsbindungsexperimente mit einem ¹²⁵I-markierten IL-12 wurden drei Stellen mit einer Bindungsaffinität für menschliches IL-12 von 5–20 pM, 50–200 pM bzw. 2–6 nM auf T-Zellen, welche auf IL-12 ansprechen, identifiziert (Chizzonite R. et al., Cytokine 6(5) (1994), A82a).
Es wurde bereits eine cDNA cloniert, die einen IL-12-Rezeptor mit geringer Bindungsaffinität codiert (Chua A. et al., J. Immunology 153 (1994), 128; Europäische Patentanmeldung Nr. 0,638,644). Unter Zugrundelegung einer bereits vorgeschlagenen Nomenklatur (Stahl und Yancopoulos, Cell 74 (1993), 587) wird die zuerst isolierte Kette des menschlichen IL-12-Rezeptors als die beta1-Kette bezeichnet.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: DNA-Sequenz der menschlichen IL-12-Rezeptor-beta2-cDNA (Startcodon = Nucleotid 641; Stoppcodon = Nucleotid 3226) (SEQ ID NO: 1).
2: Aminosäuresequenz des menschlichen IL-12-Rezeptor-beta2-Proteins (einfach unterstrichene Aminosäurereste in der N-terminalen Sequenz = Signalpeptid; Aminosäuren Nrn. 623–646 = Transmembranbereich, gekennzeichnet durch eine doppelte Unterstreichung; neun potentielle N-gebundene Glycosylierungsstellen in dem extrazellulären Teil sind durch fett gedruckte Kursivbuchstaben gekennzeichnet und ebenfalls unterstrichen; die konservierten Box 1 und 2-Motive in der cytoplasmatischen Domäne sind schraffiert [Aminosäurereste Nrn. 667–669, 699–704, 786–798] (SEQ ID NO: 2).
3: DNA-Sequenz der menschlichen IL-12-Rezeptor-beta1-cDNA (Startcodon = Nucleotid 65; Stoppcodon = Nucleotid 2050) (SEQ ID NO: 3).
4: Aminosäuresequenz des menschlichen IL-12-Rezeptor-beta1-Proteins (unterstrichene Aminosäurereste der N-terminalen Sequenz = Signalpeptidsequenz; Aminosäurereste Nrn. 541 bis 571 = Transmembranbereich, markiert durch
sechs potentielle N-gebundene Glycosylierungsstellen in dem extrazellulären Teil sind gekennzeichnet durch --------; die konservierten Box 1 und 2-Motive in der cytoplasmatischen Domäne sind gekennzeichnet durch
[Aminosäurereste Nrn. 577 bis 584 und 618 bis 629] (SEQ ID NO: 4).
5A: Scatchard-Analyse der Bindung eines rekombinanten menschlichen IL-12 an transfizierte COS-Zellen, die das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein exprimieren.
5B: Scatchard-Analyse der Bindung eines rekombinanten menschlichen IL-12 an transfizierte COS-Zellen, die das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein exprimieren.
5C: Scatchard-Analyse der Bindung eines rekombinanten menschlichen IL-12 an transfizierte COS-Zellen, die das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein und das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein coexprimieren.
6: Analyse der Proliferation von Ba/F3-Zellen, die mit der cDNA für das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein (-- ⧫ --), mit der cDNA für das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein (-- O --) oder mit der cDNA für sowohl das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein als auch das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein (-- • --) stabil, transfiziert sind, in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen des menschlichen IL-12 durch das Messen des Einbaus von tritiummarkiertem Thymidin.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Interleukin-12-(IL-12)-beta2-Rezeptorprotein mit geringer Bindungsaffinität oder ein Fragment davon, welches

(a) eine Bindungsaffinität für IL-12 von etwa 1 bis etwa 10 nM aufweist, und
(b) wenn es mit einem IL-12-beta1-Rezeptorprotein komplexiert ist, einen Komplex mit einer Bindungsaffinität zu IL-12 von etwa 5 bis etwa 100 pM ausbildet,

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nucleinsäure, welche das IL-12-beta2-Rezeptorprotein codiert, durch eine Nucleinsäuresequenz codiert, die unter stringenten Bedingungen an die Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO: 1 hybridisiert, oder die eine Sequenzhomologie von mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens etwa 90% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95% zu dem Polypeptid mit der SEQ ID NO: 1 aufweist. Insbesondere betrifft die Erfindung das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein, welches zum Beispiel die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, oder allelische Formen oder Varianten davon.
Die Erfindung betrifft außerdem einen Komplex, der befähigt ist, mit hoher Affinität an IL-12 zu binden, umfassend ein Interleukin-12-(IL-12)-beta2-Rezeptorprotein oder ein Fragment davon, wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 4, komplexiert mit einem IL-12-beta1-Rezeptorprotein, wie definiert in Anspruch 1, oder einem Fragment davon, welches

(a) eine Bindungsaffinität für IL-12 von etwa 1 bis etwa 10 nM aufweist, und
(b) wenn es mit einem IL-12-beta2-Rezeptorprotein komplexiert ist, einen Komplex mit einer Bindungsaffinität zu IL-12 von etwa 5 bis etwa 100 pM ausbildet.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der vorstehende Komplex ein IL-12-beta1-Rezeptorprotein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen homolog zu SEQ ID NO: 4 ist, oder das durch eine Nucleinsäure codiert wird, welche im Wesentlichen homolog zu SEQ ID NO: 3 ist. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird die Nucleinsäure, welche das IL-12-beta1-Rezeptorprotein codiert, durch eine Nucleinsäuresequenz codiert, die unter stringenten Bedingungen an die Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO: 3 hybridisiert, oder die eine Sequenzhomologie von mindestens 80%, stärker bevorzugt mindestens etwa 90% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95% zu dem Polypeptid mit der SEQ ID NO: 3 zeigt. Insbesondere betrifft die Erfindung das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein, welches zum Beispiel die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 aufweist, oder allelische Formen oder Varianten davon.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehenden Proteine oder Komplexe, welche löslich sind.
Ein Aspekt der vorliegende Erfindung ist ein Protein oder Komplex, das (der) durch eine Nucleinsäure codiert wird, die zwei Untersequenzen umfaßt, wobei eine der Untersequenzen ein lösliches Protein codiert, wie vorstehend definiert, und die andere der Untersequenzen alle Domänen der konstanten Region der schweren Kette eines menschlichen Ig außer der ersten Domäne der konstanten Region codiert. Die Erfindung schließt auch Proteine ein, welche durch eine erste und eine zweite Nucleinsäure codiert werden, wobei die erste Nucleinsäure zwei Untersequenzen umfaßt, wobei eine der Untersequenzen ein lösliches Fragment, wie oben erwähnt, eines IL-12-beta2-Rezeptorproteins codiert, und die andere der Untersequenzen alle Domänen der konstanten Region der schweren Kette eines menschlichen Ig außer der ersten Domäne der konstanten Region codiert, und wobei die zweite Nucleinsäure zwei Untersequenzen umfaßt, wobei eine der Untersequenzen ein lösliches Fragment eines IL-12-beta1-Rezeptorproteins codiert, und die andere der Untersequenzen alle Domänen der konstanten Region der schweren Kette eines menschlichen Ig außer der ersten Domäne der konstanten Region codiert.
Der Begriff "menschliches IL-12-beta2-Rezeptorprotein" verweist (1) auf das Protein von SEQ ID NO: 2, oder (2) auf ein Protein oder Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen homolog zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 ist, und das die folgenden Eigenschaften besitzt:

1) das Protein oder Polypeptid weist eine geringe Bindungsaffinität für menschliches IL-12 auf; und
2) das Protein oder Polypeptid, wenn es mit einem menschlichen beta1-Rezeptorprotein komplexiert ist, bildet einen Komplex mit einer hohen Bindungsaffinität für menschliches IL-12 aus.

Der Begriff "menschliches IL-12-beta1-Rezeptorprotein" verweist (1) auf das Protein von SEQ ID NO: 4, oder (2) auf ein Protein oder Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die im Wesentlichen homolog zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 ist, und das die folgenden Eigenschaften besitzt:

1) das daran bindende Protein oder Polypeptid weist eine geringe Bindungsaffinität für menschliches IL-12 auf; und
2) das Protein oder Polypeptid, wenn es mit einem menschlichen beta2-Rezeptorprotein komplexiert ist, bildet einen Komplex mit einer hohen Bindungsaffinität für menschliches IL-12 aus.

So wie hierin verwendet, schließen die Begriffe "IL-12-beta2-Rezeptorprotein" und "IL-12-beta1-Rezeptorprotein" auch absichtlich modifizierte, wie zum Beispiel durch ortsspezifische Mutagenese, oder zufällig durch Mutationen veränderte Proteine ein. Die Begriffe schließen auch Varianten ein, welche aus den funktionellen Gruppen, die als Seitenketten an den Resten vorkommen, oder den N- oder C-terminalen Gruppen durch auf dem Fachgebiet bekannte Mittel abgeleitet werden können und in der Erfindung eingeschlossen sind, solange sie pharmazeutisch verträglich bleiben, d.h. die Aktivität des Proteins nicht aufheben und keine toxischen Eigenschaften auf die sie enthaltenden Zusammensetzungen übertragen. Diese Varianten können zum Beispiel Polyethylenglykol-Seitenketten einschließen, welche antigene Stellen maskieren und die Verweildauer der Proteine in Körperflüssigkeiten verlängern können. Andere Varianten schließen aliphatische Ester der Carboxylgruppen; Amide der Carboxylgruppen durch die Umsetzung mit Ammoniak oder mit primären oder sekundären Aminen; N-Acylderivate von freien Aminogruppen der Aminosäurereste, welche mit Acyleinheiten (z.B. Alkanoyl- oder carbocyclischen Aroylresten) ausgebildet werden, oder O-Acylderivate von freien Hydroxylgruppen (zum Beispiel solchen von Seryl- oder Threonylgruppen), welche mit Acyleinheiten ausgebildet werden, ein.
"Im Wesentlichen homolog", welches sich sowohl auf Nucleinsäure- als auch auf Aminosäuresequenzen beziehen kann, bedeutet, daß sich eine bestimmte Zielsequenz, zum Beispiel eine durch Mutation veränderte Sequenz, von der Referenzsequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen oder Additionen unterscheidet, wobei deren Nettowirkung keine unerwünschte funktionelle Ungleichheit zwischen der Referenz- und der Zielsequenz zur Folge hat. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Sequenzen, welche eine Homologie von mehr als 80%, stärker bevorzugt mehr als 90% und noch stärker bevorzugt mehr als 95%, äquivalente biologische Eigenschaften und äquivalente Expressionseigenschaften zeigen, als im Wesentlichen homolog angesehen. Bei der Bestimmung der Homologie sollte eine Verkürzung der reifen Sequenz unbeachtet bleiben. Sequenzen mit einem geringeren Homologiegrad, einer vergleichbaren Bioaktivität und äquivalenten Expressionseigenschaften werden als wesentliche Äquivalente angesehen. Im Allgemeinen können homologe DNA-Sequenzen durch eine Kreuzhybridisierung unter hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen identifiziert werden.
"Ein Fragment des IL-12-beta2-Rezeptorproteins" bedeutet ein Protein oder Polypeptid, das die Aminosäuresequenz eines Teils oder Fragments eines IL-12-beta2-Rezeptorproteins aufweist, und das (a) eine geringe Bindungsaffinität für IL-12 aufweist, und (b) wenn es mit einem IL-12-beta1-Rezeptorprotein komplexiert ist, einen Komplex mit einer hohen Bindungsaffinität für IL-12 ausbildet.
"Ein Fragment des IL-12-beta1-Rezeptorproteins" bedeutet ein Protein oder Polypeptid, das die Aminosäuresequenz eines Teils oder Fragments eines IL-12-beta1-Rezeptorproteins aufweist, und welches, wenn es mit einem IL-12-beta2-Rezeptorprotein komplexiert ist, einen Komplex mit einer hohen Bindungsaffinität für IL-12 ausbildet.
Ein "lösliches Fragment" verweist auf ein Fragment eines IL-12-Rezeptorproteins, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche der gesamten oder einem Teil der extrazellulären Region des Proteins entspricht, und das die IL-12-Bindungsaktivität des intakten IL-12-Rezeptorproteins beibehält. Beispielsweise ist ein lösliches Fragment eines IL-12-beta2-Rezeptorproteins ein Fragment eines IL-12-beta2-Rezeptorproteins, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche der gesamten oder einem Teil der extrazellulären Region eines menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorproteins entspricht.
Gemäß der Erfindung kann ein "Komplex", umfassend ein IL-12-beta2-Rezeptorprotein oder ein Fragment davon, komplexiert mit einem IL-12-beta1-Rezeptorprotein oder einem Fragment davon, auf der Zelloberfläche der Wirtszelle exprimiert werden. Wenn der Komplex auf der Zelloberfläche der Wirtszelle exprimiert wird, weist er eine hohe Bindungsaffinität für IL-12 auf, während das IL-12-beta1-Rezeptorprotein und das IL-12-beta2-Rezeptorprotein allein jeweils eine geringe Bindungsaffinität für IL-12 aufweisen.
Gemäß dieser Erfindung kann das IL-12-beta2-Rezeptorprotein auf der Oberfläche einer Wirtszelle exprimiert werden.
Gemäß dieser Erfindung können nicht nur das IL-12-beta2-Rezeptorprotein, sondern auch Fragmente eines IL-12-beta2-Rezeptorproteins, die (1) eine geringe Bindungsaffinität für IL-12 aufweisen, und die (2), wenn sie mit einem IL-12-beta1-Rezeptorprotein komplexiert sind, einen Komplex mit einer hohen Bindungsaffinität ausbilden, erhalten werden. Die Fragmente eines IL-12-beta2-Rezeptorproteins können durch herkömmliche Mittel wie (1) einen proteolytischen Abbau des menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorproteins, (ii) eine chemische Synthese mittels Methoden, die auf dem Fachgebiet zur Routine gehören, oder (iii) herkömmliche Rekombinationstechniken erhalten werden.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein menschliches IL-12-Rezeptorprotein, das eine hohe Bindungsaffinität für menschliches IL-12 aufweist, ein Protein, welches mit einer Bindungsaffinität von etwa 5 bis etwa 100 pM an menschliches IL-12 bindet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein menschliches IL-12-Rezeptorprotein, das eine geringe Bindungsaffinität für menschliches IL-12 aufweist, ein Protein, welches mit einer Bindungsaffinität von etwa 1 bis etwa 10 nM an menschliches IL-12 bindet. Die Bindungsaffinität eines Proteins für IL-12 kann durch herkömmliche Mittel, wie solche, welche bei Chizzonite R. et al., J. Immunol. 148 (1992), 3117, beschrieben und in Beispiel 5 angegeben sind, bestimmt werden.
Die Fragmente eines IL-12-beta2-Rezeptorproteins können ebenfalls durch herkömmliche Mittel, wie solche, welche bei Chizzonite R. et al., J. Immunol. 148 (1992), 3117, beschrieben und in Beispiel 5 angegeben sind, auf eine Bindungsaffinität für IL-12 untersucht werden. Die Fragmente eines IL-12-beta2-Rezeptorproteins können entweder allein oder komplexiert mit einem IL-12-beta1-Rezeptorprotein oder einem Fragment eines IL-12-beta1-Rezeptorproteins, welches, wenn es mit einem IL-12-beta2-Rezeptorprotein komplexiert ist, einen Komplex mit einer hohen Bindungsaffinität ausbildet, auf eine Bindungsaffinität für IL-12 untersucht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nucleinsäuren, z.B. DNA, cDNA, RNA, mRNA, etc., welche die vorstehenden Proteine codieren, zum Beispiel einen Komplex, der befähigt ist, an menschliches IL-12 mit hoher Affinität zu binden, wobei der Komplex das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein oder ein Fragment davon und das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein oder ein Fragment davon umfaßt. Vorzugsweise codieren diese Nucleinsäuren das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein, wie eine Nucleinsäure mit der SEQ ID NO: 1, und/oder das IL-12-beta1-Rezeptorprotein, wie eine Nucleinsäure mit der SEQ ID NO: 3. Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Vektoren, umfassend eine vorstehende Nucleinsäure, sowie Expressionsvektoren und insbesondere Expressionsvektoren, worin die vorstehende Nucleinsäure funktionell mit Kontrollsequenzen verbunden ist, die durch eine Wirtszelle erkannt werden. Die Erfindung schließt eukaryontische und pro karyontische Wirtszellen, die mit einem oder mehreren der vorstehenden Vektoren transformiert sind, und insbesondere Wirtszellen, bei denen die Proteine oder Komplexe auf der Oberfläche der Wirtszellen exprimiert werden, sowie Wirtszellen, bei denen sich diese Zellen in Gegenwart von IL-12 stark vermehren, ein. Die vorstehenden Wirtszellen können mit einem ersten Vektor, umfassend eine Nucleinsäure, die das IL-12-beta2-Rezeptorprotein codiert, wie vorstehend definiert, und einem zweiten Vektor, umfassend eine Nucleinsäure, die das IL-12-beta1-Rezeptorprotein codiert, wie vorstehend definiert, oder mit einem einzigen Vektor, umfassend eine Nucleinsäure, welche ein IL-12-beta2-Rezeptorprotein codiert, und eine Nucleinsäure, welche ein IL-12-beta1-Rezeptorprotein codiert, transformiert sein.
So wie hierin verwendet, verweist "Nucleinsäure" auf ein Nucleinsäurepolymer in der Form eines separaten Fragments oder als eine Komponente eines größeren Nucleinsäurekonstrukts, das von einer Nucleinsäure abgeleitet worden ist, die mindestens einmal in einer im Wesentlichen reinen Form, d.h. frei von kontaminierenden endogenen Materialien, und in einer Menge oder Konzentration, welche die Identifizierung, Manipulation und Gewinnung der Sequenz und deren einzelnen Nucleotidsequenzen durch herkömmliche biochemische Methoden, zum Beispiel unter Verwendung eines Clonierungsvektors, ermöglicht, isoliert wurde. Solche Sequenzen werden vorzugsweise in der Form einer DNA oder einer cDNA mit einem offenen Leseraster, welches nicht von internen, nichttranslatierten Sequenzen oder Introns, die typischerweise in eukaryontischen Genen vorhanden sind, unterbrochen ist, bereitgestellt. Jedoch ist offensichtlich, daß auch eine genomische DNA, welche die relevanten Sequenzen enthält, verwendet werden könnte. Nichttranslatierte DNA-Sequenzen können 5' oder 3' von dem offenen Leseraster vorliegen, wo sie die Manipulation oder Expression der codierenden Regionen nicht stören.
Ein "Expressionsvektor" ist ein genetisches Element, das befähigt ist, sich unter seiner eigenen Kontrolle zu replizieren, wie ein Plasmid, Phage oder Cosmid, an das ein anderes Nucleinsäuresegment gebunden sein kann, um die Replikation des gebundenen Segments herbeizuführen. Er umfaßt eine Transkriptionseinheit, umfassend eine Zusammenstellung aus: (1) einem oder mehreren genetischen Elementen mit einer regulatorischen Funktion bei der Genexpression, zum Beispiel Promotoren und Enhancer, (2) eine strukturelle oder codierende Sequenz, die in eine mRNA transkribiert und in ein Protein translatiert wird, und (3) geeignete Transkriptionsinitiations- und -terminationssequenzen.
Ein "Clon" ist eine Gruppe von identischen DNA-Molekülen, die von einer DNA-Sequenz mit der ursprünglichen Länge abgeleitet sind, und unter Anwendung gentechnischer Methoden, häufig unter Beteiligung von Plasmiden, durch ein Bakterium oder ein Virus hergestellt werden.
Zusätzlich verweist die Erfindung auf ein gereinigtes rekombinantes Protein, umfassend zwei verschiedene Polypeptidketten (ein heterodimeres Protein), welches durch bekannte Methoden hergestellt werden kann. Die zwei verschiedenen Polypeptidketten werden jeweils durch ein anderes chimäres Polynucleotid codiert, das aus zwei Nucleinsäureuntersequenzen besteht, die im Leseraster miteinander verbunden sind. Die am 5'-Ende des ersten chimären Polynucleotids angeordnete erste Nucleinsäureuntersequenz ist eine isolierte Nucleinsäuresequenz, die ein lösliches Fragment eines IL-12-beta2-Rezeptorproteins codiert. Die am 3'-Ende des ersten chimären Polynucleotids angeordnete zweite Nucleinsäureuntersequenz ist eine isolierte Nucleinsäuresequenz, die alle Domänen der schweren Kette eines menschlichen Ig (vorzugsweise IgG) außer der ersten Domäne der konstanten Region codiert. Die am 5'-Ende des zweiten chimären Polynucleotids angeordnete erste Nucleinsäureuntersequenz ist eine isolierte Nucleinsäuresequenz, die ein lösliches Fragment eines IL-12-beta1-Rezeptorproteins codiert. Die am 3'-Ende des zweiten chimären Polynucleotids angeordnete zweite Nucleinsäureuntersequenz ist eine isolierte Nucleinsäuresequenz, die alle Domänen der schweren Kette eines menschlichen Ig (vorzugsweise IgG) außer der ersten Domäne der konstanten Region codiert.
Die Ausgangsmaterialien für die gereinigten rekombinanten Proteine der Erfindung können durch auf dem Fachgebiet bekannte Methoden erhalten werden. Insbesondere können unter Zugrundelegung der in 1 beschriebenen DNA-Sequenz, welche ein menschliches IL-12-beta2-Rezeptorproteins codiert, und der bereits bekannten Nucleinsäuresequenzen für bestimmte Rezeptoren solche partiellen Nucleinsäuresequenzen, die ein lösliches Fragment eines IL-12-beta2-Rezeptorproteins codieren, bestimmt und aus der in 1 beschriebenen DNA-Sequenz, welche ein menschliches IL-12-beta2-Rezeptorprötein codiert, unter Anwendung bekannter Methoden, vgl. Sambrook et al., "Molecular Cloning", 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), konstruiert werden. In ähnlicher Weise können unter Zugrundelegung der in 3 beschriebenen DNA-Sequenz, welche ein menschliches IL-12-beta1-Rezeptorprotein codiert, und der bereits bekannten DNA-Sequenzen für bestimmte Rezeptoren solche partiellen DNA-Sequenzen, die ein lösliches Fragment eines menschlichen IL-12-beta1-Rezeptorproteins codieren, bestimmt und aus der in 3 beschriebenen DNA-Sequenz, welche ein menschliches IL-12-beta1-Rezeptorprotein codiert, unter Anwendung bekannte Methoden, vgl. Sambrook et al., "Molecular Cloning", 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), konstruiert werden. Quellen für isolierte DNA-Sequenzen, die konstante Domänen menschlicher Immunglobuline codieren, sind auf dem Fachgebiet bekannt und zum Beispiel durch Ellison et al., Nucl. Acids Res. 10 (1982), 4071–4079, für IgG oder durch Huck et al., Nucl. Acids Res. 14 (1986), 1779–1789, für IgG₃ offenbart.
Die isolierte DNA-Sequenz, die das lösliche Fragment eines menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorproteins codiert, kann durch bekannte Methoden [Sambrook et al., "Molecular Cloning", 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] mit der isolierten DNA-Sequenz, die alle Domänen der schweren Kette eines menschlichen Ig (vorzugsweise IgG) außer der ersten Domäne der konstanten Region codiert, im Leseraster miteinander verbunden werden. Das erhaltene chimäre Polynucleotid enthält an seinem 5'-Ende die isolierte DNA-Sequenz, welche das lösliche Fragment eines menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorproteins codiert, und an seinem 3'-Ende die isolierte DNA-Sequenz, welche alle Domänen der schweren Kette eines menschlichen Ig außer der ersten Domäne der konstanten Region codiert.
In ähnlicher Weise kann die isolierte DNA-Sequenz, welche das lösliche Fragment eines menschlichen IL-12-beta1-Rezeptorproteins codiert, durch bekannte Methoden [Sambrook et al., "Molecular Cloning", 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] mit der isolierten DNA-Sequenz, welche alle Domänen der schweren Kette eines menschlichen Ig (vorzugsweise IgG) außer der ersten Domäne der konstanten Region codiert, im Leseraster miteinander verbunden werden. Das erhaltene chimäre Polynucleotid enthält an seinem 5'-Ende die isolierte DNA-Sequenz, welche das lösliche Fragment eines menschlichen IL-12-beta1-Rezeptorproteins codiert, und an seinem 3'-Ende die isolierte DNA-Sequenz, welche alle Domänen der schweren Kette eines menschlichen Ig außer der ersten Domäne der konstanten Region codiert.
Die chimären Polynucleotide können dann unter Anwendung bekannter Methoden [Sambrook et al., "Molecular Cloning", 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] in geeignete Expressionsvektoren für die Expression in einer nicht-menschlichen Säugerzelle wie einer CHO-Zelle integriert werden. Für die Herstellung des erfindungsgemäßen homodimeren Proteins wird das chimäre Polynucleotid, das an seinem 5'-Ende die isolierte DNA-Sequenz enthält, welche das lösliche Fragment eines menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorproteins codiert, in einen geeigneten Expressionsvektor integriert. Für die Herstellung des erfindungsgemäßen heterodimeren Proteins werden das chimäre Polynucleotid, das an seinem 5'-Ende die isolierte DNA-Sequenz enthält, welche das lösliche Fragment eines menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorproteins codiert, und das chimäre Polynucleotid, das an seinem 5'-Ende die isolierte DNA-Sequenz enthält, welche das lösliche Fragment eines menschlichen IL-12-beta1-Rezeptorproteins codiert, in einen einzigen geeigneten Expressionsvektor oder zwei getrennte, geeignete Expressionsvektoren integriert.
Vorzugsweise wird (werden) das (die) chimäre(n) Polynucleotid(e) zusammen mit einem selektierbaren Marker, zum Beispiel Neomycin, Hygromycin, Dihydrofolatreduktase (dhfr) oder Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (hgpt), unter Anwendung der auf dem Fachgebiet bekannten Methoden cotransfiziert. Die stabil in das Chromosom eingebaute DNA-Sequenz kann anschließend amplifiziert werden. Ein geeigneter Selektionsmarker hierfür ist zum Beispiel dhfr. Säugerzellen, zum Beispiel CHO-Zellen, die kein intaktes dhfr-Gen enthalten, werden hierbei nach Durchführung der Transfektion mit ansteigenden Mengen von Methotrexat inkubiert. Auf diese Weise können Zelllinien erhalten werden, welche eine größere Anzahl der gewünschten DNA-Sequenz verglichen mit den nicht amplifizierten Zellen enthalten.
Das Baculovirus-Expressionssystem kann auch für die Expression von rekombinanten Proteinen in Insektenzellen verwendet werden. Posttranslationale Modifikationen, welche durch Insektenzellen durchgeführt werden, sind solchen sehr ähnlich, die in Säugerzellen vorkommen. Für die Herstellung eines rekombinanten Baculovirus, welches das gewünschte Protein exprimiert, wird ein Transfervektor verwendet. Ein Transfervektor ist ein Plasmid, welche das (die) chimäre(n) Poly nucleotid(e) unter der Kontrolle eines starken Promotors, zum Beispiel demjenigen des Polyhedron-Gens, umgeben von Virussequenzen auf beiden Seiten, enthält. Der Transfervektor wird dann zusammen mit der DNA-Sequenz des Wildtyp-Baculovirus in die Insektenzellen eingeschleust. Die rekombinanten Viren, welche in den Zellen durch homologe Rekombination erhalten werden, können dann gemäß bekannten Methoden identifiziert und isoliert werden. Wenn das Baculovirus-Expressionssystem verwendet wird, müssen DNA-Sequenzen, die den Immunglobulinanteil codieren, in Form einer cDNA vorliegen.
Das exprimierte rekombinante Protein kann zum Beispiel durch bekannte Methoden gereinigt werden. Beispielsweise kann eine Protein G-Affinitätschromatographie für die Reinigung des erfindungsgemäßen homodimeren Proteins angewendet werden. Eine Säulenchromatographie oder irgendeine andere Methode, die eine Unterscheidung zwischen homodimeren Proteinen und heterodimeren Proteinen erlaubt, kann für die Reinigung des erfindungsgemäßen heterodimeren Proteins angewendet werden.
Expression eines menschlichen IL-12-Rezeptorproteins mit einer hohen Bindungsaffinität für menschliches IL-12:
Die cDNA von Zellen, worin der IL-12-Rezeptor bekanntermaßen vorkommt, wird durch herkömmliche Methoden in einen Bakterienwirt eingebracht, um eine cDNA-Bank zu etablieren. PHA-aktivierte PBMCs und Zellen der Kit 225/K6-Zelllinie sind Beispiele für Zellquellen für die cDNA. Die RNA der Zellen wird extrahiert, charakterisiert und durch herkömmliche Methoden in eine einzelsträngige cDNA transkribiert. Die einzelsträngige cDNA wird durch herkömmliche Methoden in eine doppelsträngige cDNA umgewandelt. Die doppelsträngige cDNA wird durch herkömmliche Techniken in einen Expressionsvektor wie pEF-BOS eingebaut. Die Plasmid-DNA aus dem Expressionsvektor wird dann durch herkömmliche Methoden in einen Bakterienwirt eingebracht, um eine Bank von Rekombinanten zu begründen.
Die cDNA-Bank wird durch herkömmliche Expressionsdurchmusterungsmethoden, wie durch Hara und Mijayima, EMBO 11 (1992), 1875, beschrieben, auf cDNAs durchmustert, welche, wenn sie zusammen mit cDNAs für das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein exprimiert werden, einen menschlichen IL-12-Rezeptor mit hoher Affinität ergeben. Eine kleine Anzahl von Clonen aus der Bank wird in Pools vermehrt. Die DNA wird durch herkömmliche Methoden aus den Pools von Clonen extrahiert. Die aus einem Pool von Clonen extrahierte DNA wird dann durch herkömmliche Methoden zusammen mit einer kleinen Menge einer DNA aus einem Plasmid, welches die cDNA enthält, die das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein codiert, in nicht-menschliche Wirtszellen eingeschleust. Die nicht-menschlichen Wirtszellen sind vorzugsweise Säugerzellen wie COS-Zellen. Anschließend wird ein markiertes, rekombinantes, menschliches IL-12 zu den nicht-menschlichen Wirtszellen zugegeben, die vorher transfiziert wurden, wie vorstehend beschrieben ist, und das Bindungssignal des Pools wird bestimmt. Dieser Vorgang wird für jeden Pool wiederholt. Die ein positives Bindungssignal für IL-12 zeigenden Pools können dann anschließend in kleinere Pools aufgeteilt und in der vorstehenden Weise noch einmal untersucht werden, bis ein einzelner Clon selektiert wird, der ein positives Bindungssignal zeigt.
Die Plasmid-DNA aus dem selektierten Clon wird mittels herkömmlicher Methoden, wie einem automatischen ABI-DNA-Sequenzanalysengerät in Verbindung mit einer thermostabilen DNA-Polymerase und farbstoffmarkierten Didesoxynucleotiden als Terminatoren, auf beiden Strängen sequenziert. Aminosäuresequenz-Abgleichungen können, wie durch Dayhoff M.O. et al., Methods Enzymology 91 (1983), 524, beschrieben, mit der Mutationsdatenmatrix, einem Lückenabzug von 6 und 100 Zufallsläufen durchgeführt werden.
Die DNA aus dem selektierten Clon wird dann durch herkömmliche Methoden zusammen mit einer DNA aus einem Plasmid, das die cDNA enthält, welche das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein codiert, in eine nicht-menschliche Wirtszelle, vorzugsweise eine nicht-menschliche Säugerzelle wie eine COS-Zelle oder eine Ba/F3-Zelle, cotransfiziert.
Alternativ kann durch herkömmliche Rekombinationstechniken ein Plasmid konstruiert werden, das Transkriptionseinheiten (einen Promotor, eine cDNA und Poly-A-Regionen) für sowohl das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein als auch das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein enthält. Die Plasmid-DNA wird durch herkömmliche Methoden in eine nicht-menschliche Wirtszelle, vorzugsweise eine nicht-menschliche Säugerzelle wie eine COS-Zelle oder eine Ba/F3-Zelle, eingeschleust.
Gemäß dieser Erfindung kann eine DNA isoliert werden, die ein menschliches IL-12-beta2-Rezeptorprotein oder ein Fragment davon codiert, wobei das Fragment (1) eine geringe Bindungsaffinität für menschliches IL-12 aufweist, und (2) wenn es mit einem menschlichen IL-12-beta1-Rezeptorprotein komplexiert ist, einen Komplex mit einer hohen Bindungsaffinität für menschliches IL-12 ausbildet.
Eine isolierte Nucleinsäuresequenz verweist auf ein Nucleinsäurepolymer in der Form eines separaten Fragments oder als eine Komponente eines größeren Nucleinsäurekonstrukts, das von einer Nucleinsäure abgeleitet worden ist, die mindestens einmal in einer im Wesentlichen reinen Form, d.h. frei von kontaminierenden endogenen Materialien, und in einer Menge oder Konzentration, welche die Identifizierung, Manipulation und Gewinnung der Sequenz und deren einzelnen Nucleotidsequenzen durch herkömmliche biochemische Methoden, zum Beispiel unter Verwendung eines Clonierungsvektors ermöglicht, isoliert wurde. Solche Sequenzen, z.B. eine DNA, werden vorzugsweise in Form eines offenen Leserasters, welches nicht von internen, nichttranslatierten Sequenzen oder Introns, die typischerweise in eukaryontischen Genen vorhanden sind, unterbrochen ist, bereitgestellt. Eine die relevanten Sequenzen enthaltende genomische DNA könnte ebenfalls als eine Quelle für codierende Sequenzen verwendet werden. Nichttranslatierte DNA-Sequenzen können 5' oder 3' von dem offenen Leseraster vorliegen, wo sie die Manipulation oder Expression der codierenden Regionen nicht stören.
Gemäß dieser Erfindung ist eine Säugerzelle, die das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein oder den Komplex auf ihrer Oberfläche exprimiert hat und die sich in Antwort auf menschliches IL-12 vermehrt, für die Bestimmung einer IL-12-Bioaktivität nützlich. Beispielsweise sind solche Zellen nützlich, um festzustellen, ob eine bestimmte Verbindung die biologische Aktivität von menschlichem IL-12 hemmt oder ein IL-12-Agonist ist.
Anhand der Fähigkeit zur Expression des menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorproteins auf der Oberfläche einer nicht-menschlichen Säugerzelle ist es den Erfindern außerdem möglich, auch Fragmente des menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorproteins zu exprimieren und zu bestimmen, ob diese Fragmente, wenn sie mit der beta1-Untereinheit oder einem aktiven Fragment davon komplexiert sind, dieselben Eigenschaften und eine hohe Bindungsaffinität für IL-12 wie der intakte Komplex aufweisen.
Eine isolierte DNA, welche das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein codiert, kann verwendet werden, um ein gereinigtes rekombinantes Protein herzustellen, das löslich ist und das mit derselben Affinität wie das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein an IL-12 bindet. Die isolierte DNA, welche das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein codiert, kann auch verwendet werden, um ein gereinigtes rekombinantes Protein herzustellen, das löslich ist und das mit derselben Affinität wie der rekombinante menschliche IL-12-Rezeptorkomplex aus dem beta2-Rezeptorprotein und dem beta2-Rezeptorprotein an IL-12 bindet [vgl. zum Beispiel Charnow S.M. et al., Trends in Biotechnology, Bd. 14 (1996), 52–60].
Solche gereinigten rekombinanten Proteine, die an menschliches IL-12 binden, sind nützlich zur Verhinderung oder Behandlung von pathologischen Zuständen, welche durch eine übermäßige oder unzureichende Aktivität von IL-12-Rezeptoren aufweisenden Zellen verursacht werden, indem sie die Bindung von IL-12 an solche Zellen hemmen. Pathologische Zustände, welche durch eine übermäßige Aktivität von IL-12-Rezeptoren aufweisenden Zellen verursacht werden, schließen Autoimmundefekte wie, ohne Einschränkung, rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankung und Multiple Sklerose ein.
Ein gereinigtes rekombinantes Protein, das löslich ist und das mit derselben Affinität wie das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein an IL-12 bindet, ist das Fusionsprodukt aus einem löslichen Fragment eines menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorproteins und der schweren Kette eines menschlichen Ig (wie IgG, IgM oder IgE, vorzugsweise IgG) mit allen Domänen außer der ersten Domäne der konstanten Region. Dieses rekombinante Protein, das ein Homodimer ist, wird durch ein chimäres Polynucleotid codiert, welches zwei DNA-Untersequenzen aufweist, die im Leseraster miteinander verbunden sind. Die erste DNA-Untersequenz am 5'-Ende des chimären Polynucleotids ist eine isolierte DNA-Sequenz, die ein lösliches Fragment eines menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorproteins codiert. Die zweite DNA-Untersequenz am 3'-Ende des chimären Polynucleotids ist eine isolierte DNA-Sequenz, die alle Domänen der schweren Kette eines menschlichen Ig (vorzugsweise IgG) außer der ersten Domäne der konstanten Region codiert. Das gewünschte rekombinante Protein kann durch Transfektion des chimären Polynucleotids in eine nicht-menschliche Säugerzelle wie eine Ovarzelle des Chinesischen Hamsters (CHO-Zelle) hergestellt werden. Das exprimierte rekombinante Protein kann zum Beispiel durch eine Protein G-Affinitätschromatographie gereinigt werden.
Ein gereinigtes rekombinantes Protein, das löslich ist und das mit derselben Affinität wie der rekombinante menschliche IL-12-Rezeptorkomplex aus dem beta1-Rezeptor und dem beta2-Rezeptor an IL-12 bindet, wird durch zwei chimäre Polynucleotide codiert, welche jeweils zwei DNA-Untersequenzen aufweisen, die im Leseraster miteinander verbunden sind. Die erste DNA-Untersequenz des ersten chimären Polynucleotids am 5'-Ende davon ist eine isolierte DNA-Sequenz, die ein lösliches Fragment eines menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorproteins codiert. Die zweite DNA-Untersequenz des ersten chimären Polynucleotids am 3'-Ende davon ist eine isolierte DNA-Sequenz, die alle Domänen der schweren Kette eines menschlichen Ig (zum Beispiel IgG, IgM oder IgE, vorzugsweise IgG) außer der ersten Domäne der konstanten Region codiert. Die erste DNA-Untersequenz des zweiten chimären Polynucleotids am 5'-Ende davon ist eine isolierte DNA-Sequenz, die ein lösliches Fragment eines menschlichen IL-12-beta1-Rezeptorproteins codiert. Die zweite DNA-Untersequenz des zweiten chimären Polynucleotids am 3'-Ende davon ist eine isolierte DNA-Sequenz, die alle Domänen der schweren Kette eines menschlichen Ig (zum Beispiel IgG, IgM oder IgE, vorzugsweise IgG) außer der ersten Domäne der konstanten Region codiert. Das gewünschte rekombinante Protein kann durch Cotransfektion der zwei chimären Polynucleotide in eine nicht-menschliche Säugerzelle wie eine CHO-Zelle hergestellt werden. Das exprimierte Protein kann zum Beispiel durch eine Methode, die eine Unterscheidung homodimerer Proteine von heterodimeren Proteinen ermöglicht, wie zum Beispiel eine Säulenchromatographie, aufgereinigt werden.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines oben erwähnten Proteins, das die Expression einer oben erwähnten Nucleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle umfaßt.
Gereinigte rekombinante Proteine sind nützlich zur Verhinderung oder Behandlung von pathologischen Zuständen, welche durch eine übermäßige oder unzureichende Aktivität von IL-12-Rezeptoren aufweisenden Zellen verursacht werden, indem sie die Bindung von IL-12 an solche Zellen hemmen.
"Gereinigt", so wie hierin verwendet, um die Reinheit eines rekombinanten Proteins, das durch die kombinierten, vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen codiert wird, oder von Proteinzusammensetzungen daraus zu definieren, bedeutet, daß das Protein oder die Proteinzusammensetzung im Wesentlichen frei von anderen Proteinen von natürlicher oder endogener Herkunft sind und weniger als etwa 1%, bezogen auf die Masse, an Proteinverunreinigungen enthalten, die aus den Herstellungsprozessen stammen. Solche Zusammensetzungen können jedoch andere Proteine enthalten, die als Stabilisatoren, Kardierungsmittel, Exzipienten oder Cotherapeutika zugegeben werden. Ein Protein ist aufgereinigt, wenn es zum Beispiel durch eine Silberfärbung als eine einzelne Proteinbande in einem Polyacrylamidgel nachweisbar ist.
Gereinigte rekombinante Proteine, wie vorstehend beschrieben, können bei der klinischen Behandlung von Autoimmundefekten, wie ohne Einschränkung rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankung und Multiple Sklerose verwendet werden.
Die vorstehend beschriebenen, gereinigten rekombinanten Proteine können in Kombination mit anderen Cytokin-Antagonisten, wie Antikörper gegen den IL-12-Rezeptor, dem löslichem TNF (Tumornekrosefaktor)-Rezeptor, dem IL-1-Antagonisten und dergleichen verwendet werden, um die vorstehenden Störungen oder Zustände zu behandeln oder zu verhindern.
Die Erfindung betrifft außerdem Arzneimittel, welche ein oben erwähntes Protein und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Die Arzneimittel können eine therapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer Cytokin-Antagonisten umfassen.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines oben erwähnten Proteins für die Herstellung eines Medikaments. Diese Verbindungen sind besonders zur Behandlung eines Autoimmundefektes nützlich.
Die Dosisbereiche für die Verabreichung der vorstehend beschriebenen, gereinigten rekombinanten Proteine kann durch Fachleute ohne übermäßiges Experimentieren ermittelt werden. Im Allgemeinen sind geeignete Dosierungen solche Dosierungen, welche ausreichend hoch sind, um die gewünschte Wirkung, zum Beispiel die Blockierung der Bindung eines endogenen IL-12 an seinen natürlichen Rezeptor, hervorzurufen. Die Dosierung sollte nicht so hoch sein, daß sie ungünstige Nebenwirkungen wie unerwünschte Kreuzreaktionen, anaphylaktische Reaktionen und dergleichen hervorruft. Im Allgemeinen variiert die Dosierung mit dem Alter, Zustand, Geschlecht und dem Ausmaß der Krankheit bei dem Patienten, den Gegenindikationen, wenn überhaupt, der Immuntoleranz und anderen solchen Variablen, die durch den einzelnen Arzt angepaßt werden müssen. Die vorstehend beschriebenen, gereinigten rekombinanten Proteine können parenteral durch Injektion oder durch graduelle Perfusion mit der Zeit verabreicht werden. Sie können intravenös, intraperitoneal, intramuskulär oder subkutan verabreicht werden.
Die Dosisbereiche für die Verabreichung der IL-12-Rezeptorproteine und der Fragmente davon können durch Fachleute ohne übermäßiges Experimentieren ermittelt werden. Im Allgemeinen sind geeignete Dosierungen solche Dosierungen, die ausreichend hoch sind, um die gewünschte Wirkung, zum Beispiel die Blockierung der Bindung eines endogenen IL-12 an seinen natürlichen Rezeptor, hervorzurufen. Die Dosierung sollte nicht so hoch sein, daß sie ungünstige Nebenwirkungen wie unerwünschte Kreuzreaktionen, anaphylaktische Reaktionen und dergleichen hervorruft. Im Allgemeinen variiert die Dosierung mit dem Alter, Zustand, Geschlecht und dem Ausmaß der Krankheit bei dem Patienten, den Gegenindikationen, wenn überhaupt, der Immuntoleranz und anderen solchen Variablen, welche durch den einzelnen Arzt angepaßt werden müssen. Der erwartete Dosisbereich beträgt etwa 1 ng/kg/Tag bis etwa 10 mg/kg/Tag. Die IL-12-Rezeptorproteine und die Fragmente davon können parenteral durch Injektion oder durch graduelle Perfusion mit der Zeit verabreicht werden. Sie können intravenös, intraperitoneal, intramuskulär oder subkutan verabreicht werden.
Zubereitungen für die parenterale Verabreichung schließen sterile, wäßrige oder nichtwäßrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen ein. Beispiele für nichtwäßrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Wäßrige Träger schließen Wasser, Alkohol/wäßrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Kochsalzlösung und gepufferte Medien, ein. Parenterale Vehikel schließen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextroselösung, Dextrose und Natriumchlorid, lactathaltige Ringerlösung oder nicht-flüchtige Öle ein. Intravenöse Vehikel schließen Flüssigkeits- und Nährstoffergänzungen, Elektrolytergänzungen, wie solche auf der Basis von Ringer-Dextroselösung, und dergleichen ein. Konservierungsmittel und andere Zusätze, wie zum Beispiel antimikrobielle Mittel, Antioxidationsmittel, Komplexbildner, inerte Gase und dergleichen, können ebenfalls vorhanden sein. Vgl. allgemein Remington's Pharmaceutical Science, 16. Auflage, Mack, Hrsg., 1980.
Tests zur Bestimmung, ob eine bestimmte Verbindung die IL-12-Aktivität blockiert:
Ein Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von entweder dem menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorprotein oder dem Komplex dieser Erfindung als ein Durchmusterungsmittel für Pharmazeutika. Gemäß dieser Erfindung ist es den Erfindern möglich, zu bestimmen, ob eine bestimmte Verbindung die menschliche IL-12-Aktivität blockiert oder als ein Agonist von IL-12 wirksam ist.
Die biologische Aktivität von menschlichem IL-12 bewirkt eine Stimulierung der Proliferation von aktivierten T- und NK-Zellen. Die Proliferation von aktivierten T-Zellen ruft Alloantigen-induzierte Immunantworten wie eine Allotransplantatabstoßung (wie Haut-, Nieren- und Herztransplantate) und eine Transplanat-Wirt-Reaktion in Patienten, welche Knochenmarktransplantate erhalten haben, hervor. Diese biologische Aktivität von menschlichem IL-12 wird durch die Bindung der menschlichen IL-12-Moleküle an Zelloberflächenrezeptoren auf den aktivierten T-Zellen vermittelt.
Eine Verbindung, welche die menschliche IL-12-Aktivität blockiert, würde daher die Proliferation von aktivierten T-Zellen hemmen und wäre zur Behandlung oder Verhinderung von Alloantigen-induzierten Immunantworten nützlich.
Um zu bestimmen, ob eine Verbindung die menschliche IL-12-Aktivität blockiert, wird zuerst eine Vielzahl von Zellen, welche entweder das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein oder ein Fragment davon oder den Komplex der Erfindung auf ihrer Oberfläche exprimiert haben, wobei sich die Zellen in Gegenwart von menschlichem IL-12 stark vermehren, bereitgestellt. Das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein oder ein Fragment davon bindet mit einer geringen Bindungsaffinität an menschliches IL-12, wenn es aber mit einem menschlichen beta1-Rezeptorprotein komplexiert ist, bildet es einen Komplex mit einer hohen Bindungsaffinität für menschliches IL-12 aus. Der erfindungsgemäße Komplex bindet mit einer hohen Bindungsaffinität an menschliches IL-12 und umfaßt einen Komplex aus (1) einem menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorprotein oder einem Fragment davon, welches, wenn es mit einem menschlichen IL-12-beta1-Rezeptorprotein komplexiert ist, einen Komplex mit einer hohen Bindungsaffinität für menschliches IL-12 ausbildet, und (2) einem menschlichen IL-12-beta1-Rezeptorprotein oder einem Fragment davon, welches, wenn es mit einem menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorprotein komplexiert ist, einen Komplex mit einer hohen Bindungsaffinität für menschliches IL-12 ausbildet. Zweitens werden die Zellen mit menschlichem IL-12 und der bestimmten Verbindung in Kontakt gebracht. Drittens wird bestimmt, ob die Anwesenheit der bestimmten Verbindung die Proliferation der Zellen hemmt.
Um zu bestimmen, ob eine Verbindung ein Agonist von menschlichem IL-12 ist, wird eine Vielzahl von Zellen, welche entweder das IL-12-beta2-Rezeptorprotein oder ein Fragment davon oder den Komplex der Erfindung auf ihrer Oberfläche exprimiert haben, wobei sich die Zellen in Gegenwart von menschlichem IL-12 stark vermehren, bereitgestellt. Das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein oder ein Fragment davon bindet mit einer geringen Bindungsaffinität an menschliches IL-12, wenn es aber mit einem menschlichen beta1-Rezeptorprotein komplexiert ist, bildet es einen Komplex mit einer hohen Bindungsaffinität für menschliches IL-12 aus. Der erfindungsgemäße Komplex bindet mit einer hohen Bindungsaffinität an menschliches IL-12 und umfaßt einen Komplex aus (1) einem menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorprotein oder einem Fragment davon, welches, wenn es mit einem menschlichen IL-12-beta1-Rezeptorprotein komplexiert ist, einen Komplex mit einer hohen Bindungsaffinität für menschliches IL-12 ausbildet, und (2) einem menschlichen IL-12-beta1-Rezeptorprotein oder einem Fragment davon, welches, wenn es mit einem menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorprotein komplexiert ist, einen Komplex mit einer hohen Bindungsaffinität für menschliches IL-12 ausbildet. Zweitens werden die Zellen mit menschlichem IL-12 oder der bestimmten Verbindung in Kontakt gebracht. Drittens wird bestimmt, ob die Anwesenheit der bestimmten Verbindung die Proliferation der Zellen stimuliert.
Beispiele für Zellen, welche befähigt sind, den Komplex auf ihrer Oberfläche zu exprimieren, wobei sich die Zellen in Gegenwart von menschlichem IL-12 stark vermehren, schließen ohne Einschränkung PHA-aktivierte PBMCs, Kit 225/K6-Zellen und Ba/F3-Zellen, transfiziert mit einer cDNA für sowohl das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein als auch das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein, ein. Beispiele für Zellen, welche befähigt sind, das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein oder ein Fragment davon auf ihrer Oberfläche zu exprimieren, wobei sich die Zellen in Gegenwart von menschlichem IL-12 stark vermehren, schließen ohne Einschränkung Ba/F3-Zellen ein, die mit einer cDNA für das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein transfiziert sind.
Um zu bestimmen, ob die Anwesenheit der bestimmten Verbindung die Proliferation der Zellen hemmt, kann das folgende Verfahren durchgeführt werden. Die auf menschliches IL-12 ansprechenden Zellen, welche das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein oder ein Fragment davon oder den menschlichen IL-12-Rezeptorkomplex der Erfindung auf ihrer Oberfläche exprimiert haben, werden in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte plattiert. Anschließend wird menschliches IL-12 zu einigen Vertiefungen der Mikrotiterplatte (Standardvertiefungen) zugegeben und mit den Zellen reagieren gelassen. Die zu testende Verbindung wird entweder vor oder gleichzeitig mit dem menschlichen IL-12 zu unterschiedlichen Vertiefungen der Mikrotiterplatte (Probenvertiefungen) zugegeben und mit den Zellen reagieren gelassen. Falls ein Lösungsmittel verwendet wird, darf es für die Zellen nicht toxisch sein. Anschließend wird die Proliferation der Zellen durch bekannte Methoden, zum Beispiel durch Markieren der Zellen nach dem Kontakt mit dem menschlichen IL-12 und der Verbindung (wie durch Einbau eines tritiummarkierten Thymidins in die replizierende DNA), durch Messen der Anreicherung von Zellstoffwechselprodukten (wie Milchsäure) und dergleichen, gemessen. Die Proliferation der Zellen in den Standardvertiefungen wird mit der Proliferation der Zellen in den Probenvertiefungen verglichen. Falls sich die Zellen in den Probenvertiefungen wesentlich weniger vermehren als die Zellen in den Standardvertiefungen, blockiert die Verbindung die IL-12-Aktivität.
Um zu bestimmen, ob die Anwesenheit der bestimmten Verbindung die Proliferation der Zellen stimuliert, kann das folgende Verfahren durchgeführt werden. Die auf menschliches IL-12 ansprechenden Zellen, welche das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein oder ein Fragment davon oder den menschlichen IL-12-Rezeptorkomplex der Erfindung auf ihrer Oberfläche exprimiert haben, werden in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte plattiert. Anschließend wird menschliches IL-12 zu einigen Vertiefungen der Mikrotiterplatte (Standardvertiefungen) zugegeben und mit den Zellen reagieren gelassen. Die zu testende Verbindung wird zu unterschiedlichen Vertiefungen der Mikrotiterplatte (Probenvertiefungen) zugegeben und mit den Zellen reagieren gelassen. Falls ein Lösungsmittel verwendet wird, darf es für die Zellen nicht toxisch sein. Anschließend wird die Proliferation der Zellen durch bekannte Methoden, zum Beispiel durch Markieren der Zellen nach dem Kontakt mit der Verbindung (wie durch Einbau eines tritiummarkierten Thymidins in die replizierende DNA), durch Messen der Anreicherung von Zellstoffwechselprodukten (wie Milchsäure) und dergleichen, gemessen. Die Proliferation der Zellen in den Standardvertiefungen wird mit der Proliferation der Zellen in den Probenvertiefungen verglichen. Falls sich die Zellen in den Probenvertiefungen wesentlich stärker vermehren als Zellen, welche dem menschlichen IL-12 nicht ausgesetzt waren, ist die Verbindung ein Agonist von menschlichem IL-12.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Durchmusterung von Verbindungen, welche zur Hemmung der IL-12-Aktivität nützlich sind, oder von Verbindungen, welche als Agonisten der IL-12-Aktivität nützlich sind, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen einer Verbindung, von der erwartet wird, daß sie die IL-12-Aktivität hemmt oder ein Agonist der IL-12-Aktivität ist, mit einem oben erwähnten Protein, gefolgt von dem Nachweis des biologischen Effekts, umfaßt.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht als eine Begrenzung angegeben.
Beispiele
Materialien und Methoden
1. Proteine, Plasmide und Stämme
Rekombinantes menschliches IL-12 (Gubler U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 4143) wurde wie hierin beschrieben erhalten.
Rekombinantes menschliches IL-2 (Lahm H.W. et al., J. Chromatog. 326 (1985), 357) wurde wie hierin beschrieben erhalten.
Das Plasmid pEF-BOS basiert auf einem pUC119-Grundgerüst und enthält den Promotor von Verlängerungsfaktor-1-alpha, um die Expression von Genen zu regulieren, welche in die BstXI-Stelle inseriert werden (Mizushima S. und Nagata S., Nucl. Acids Res. 18 (1990), 5322).
Die menschliche IL-12-beta1-Rezeptor-cDNA in dem Plasmid pEF-BOS wurde erhalten, wie bei Chua A. et al., J. Immunology 153 (1994), 128, und in der Europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 0638644 beschrieben ist.
Elektrokompetente E. coli DH-10B-Zellen (Grant S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 4645) wurden vom Bethesda Research Laboratory (Bethesda, Maryland) bezogen.
2. Markierung von menschlichem IL-12 mit ¹²⁵I
Rekombinantes menschliches IL-12 wurde wie folgt mit ¹²⁵I markiert. Iodogen wurde in Chloroform gelöst. 0,05 mg-Aliquots von Iodogen wurden in 12 × 150 mm großen Borsilicat-Glasröhrchen getrocknet. Für die Radiomarkierung wurden 1,0 mCi Na[¹²⁵I] zu dem mit Iodogen beschichteten Borsilicat-Glasröhrchen, welches auch 0,05 ml Tris-Iodierungspuffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,4 M NaCl; und 1 mM EDTA) enthielt, zugegeben, um eine ¹²⁵I-Lösung herzustellen. Die ¹²⁵I-Lösung wurde durch Inkubieren für 6 Minuten bei Raumtemperatur aktiviert. Die aktivierte ¹²⁵I-Lösung wurde in ein Röhrchen überführt, welches 0,05 bis 1 ml rekombinantes menschliches IL-12 (31,5 mg) in Tris-Iodierungspuffer enthielt. Das erhaltene Gemisch aus der aktivierten ¹²⁵I-Lösung und dem rekombinanten menschlichen IL-12 wurde für 6 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden 0,05 ml Iodogen-Stopppuffer (10 mg/ml Tyrosin, 10% Glycerin in Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,40) zugegeben und während 3 Minuten einwirken gelassen. Das erhaltene Gemisch wurde dann mit 1,0 ml Tris-Iodierungspuffer, enthaltend 0,25% Rinderserumalbumin (BSA), verdünnt und auf eine Bio-Gel P10DG-Entsalzungssäule für eine Chromatographie aufgetragen. Die Säule wurde mit Tris-Iodierungspuffer, enthaltend 0,25% BSA, eluiert. 1 ml-Fraktionen, enthaltend die eluierten Höchstmengen des markierten, rekombinanten menschlichen IL-12, wurden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden mit 1% BSA in Tris-Iodierungspuffer auf 1 × 10⁸ CpM/ml verdünnt. Der Einbau von ¹²⁵I in das rekombinante menschliche IL-12 wurde durch eine Fällung mit Trichloressigsäure (TCA) überwacht. Die durch TCA ausfällbare Radioaktivität (Endkonzentration = 10% TCA) betrug typischerweise mehr als 95% der Gesamtradioaktivität. Die radiospezifische Aktivität des markierten, rekombinanten menschlichen IL-12 betrug typischerweise 1000 bis 2000 CpM/fmol.
Beispiel 1
Präparation von menschlichen PHA-aktivierten Lymphoblasten
Menschliche periphere einkernige Blutzellen (PBMCs) wurden aus Blut isoliert, das von gesunden Spendern erhalten wurde, wie durch Gately et al., J. Natl. Cancer Inst. 69 (1982), 1245, beschrieben wurde. Das Blut wurde in heparinisierten Spritzen gesammelt, mit einem gleichen Volumen von Hank's balancierter Salzlösung verdünnt und über ein Lymphocyten-Trennmedium (LSM^®, bezogen von Organon Teknika Corporation, Durham, North Carolina) in Röhrchen geschichtet. Die Röhrchen wurden bei 2000 UpM für 20 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die PBMCs an der Grenzfläche der wäßrigen Blutlösung und des Lymphocyten-Trennmediums wurden gesammelt. Die gesammelten PBMCs wurden bei 1500 UpM für 10 Minuten durch ein 15 ml-Kissen von 20% Saccharose in Hank's balancierter Salzlösung pelletiert. Die pelletierten PBMCs wurden in Gewebekulturmedium (1:1-Gemisch aus RPMI-1640 und Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium, supplementiert mit 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren, 60 mg/ml Arginin-HCl, 10 mM HEPES-Puffer, 2 mM L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, 0,05 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mg/ml Dextrose) (TCM) plus 5% menschliches Serum resuspendiert und zweimal in TCM gewaschen.
Die PBMCs wurden dann aktiviert, um Lymphoblasten zu bilden. Insbesondere wurden 0,5 bis 1 × 10⁶ Zellen/ml in TCM plus 5% menschliches Serum plus 0,1 % (Vol./Vol.) PHA-P (Difco, Detroit, MI) während 3 Tagen bei 37°C in einer 5%igen CO₂-Atmosphäre gezüchtet.
Nach drei Tagen wurden die Zellkulturen in TCM plus 5% menschliches Serum und 50 E/ml rekombinantes menschliches IL-12 bezogen auf das Volumen 1:1 aufgeteilt, wobei > 95% T-Zellen erhalten wurden. Diese Zellen wurden für die Herstellung einer cDNA-Bank verwendet.
Beispiel 2
Extraktion und Charakterisierung von RNA
PBMCs, welche wie in Beispiel 1 isoliert und während 2–3 Tagen mit PHA aktiviert worden waren, wurden geerntet, und die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von Guanidin-Isothiocyanat/Phenol extrahiert, wie durch Chomczynski P. und Sacchi N., Anal. Biochem. 162 (1987), 156, beschrieben wurde. Poly-A⁺-RNA wurde durch Batch-Adsorption an Oligo-dT-Latexkügelchen aus der Gesamt-RNA isoliert, wie es beschrieben wurde (Kuribayashi K. et al., Nucl. Acids Res. Symposium Series 19 (1988), 61). Die Massenausbeute dieser Aufreinigung betrug etwa 4% Poly-A⁺-RNA.
Beispiel 3
cDNA-Bank
Aus der vorstehenden Poly-A⁺-RNA wurde wie folgt eine cDNA-Bank in dem Säugerexpressionsvektor pEF-BOS etabliert.
3 mg Poly-A⁺-RNA wurden unter Verwendung der reversen Transkriptase RNaseH-Minus in Gegenwart eines ³²P-dCTP's in einzelsträngige cDNAs revers transkribiert. Die erhaltenen einzelsträngigen cDNAs wurden, wie bei Gubler U. und Chua A., Essential Molecular Biology, Band II, Brown T.A., Herausgeber, S. 39–56, IRL Press 1991, beschrieben, in doppelsträngige cDNAs mit glatten Enden überführt. Anschließend wurden BstXI-Linker (Aruffo A. und Seed B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 8573) an die erhaltenen doppelsträngigen cDNAs ligiert.
cDNA-Moleküle mit einer Größe von mehr als 800 Basenpaaren (bp) wurden durch eine Größenausschlußchromatographie wie folgt selektiert. Eine Sephacryl SF 500-Säule (0,8 × 29 cm) wurde mit Hilfe der Schwerkraft in 10 mM Tris-HCl, pH 7,8 – 1 mM EDTA – 100 mM Na-Acetat gepackt. Die radioaktive cDNA mit den angehängten BstXI-Linkern wurde auf die Säule geladen, und 0,5 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die Größenverteilung der radioaktiven cDNA wurde mittels Durchführen einer Elektrophorese mit einem kleinen Aliquot jeder Fraktion auf einem 1%igen Agarosegel, Trocknen des Gels und Sichtbarmachen der Größe bestimmt, wobei das Gel einem Röntgenfilm ausgesetzt wurde. Auf diese Weise wurden cDNA-Moleküle von mehr als 800 bp der Größe nach selektiert.
Die selektierten cDNA-Moleküle wurden vereinigt und durch eine Ethanolfällung konzentriert. Die vereinigten und konzentrierten, selektierten cDNA-Moleküle wurden anschließend mit dem Plasmid pEF-BOS wie folgt ligiert. Das Plasmid war mit BstXI gespalten und über zwei aufeinanderfolgende 1%ige Agarosegele gereinigt worden. 300 ng der gespaltenen und gereinigten Plasmid-DNA wurden mit 30 ng der nach Größe selektierten cDNA in 60 ml Ligationspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8 – 10 mM MgCl₂ – 10 mM DTT – 1 mM rATP – 25 mg/ml BSA) bei 15°C über Nacht ligiert.
Am nächsten Tag wurde das mit der nach Größe selektierten cDNA ligierte Plasmid mit Phenol extrahiert. 6 mg Muschel-Glykogen wurden zu dem erhaltenen Extrakt zugegeben, und die Nucleinsäuren wurden durch Ethanol ausgefällt. Das erhaltene Präzipitat wurde in Wasser gelöst, und die Nucleinsäuren wurden abermals mit Ethanol gefällt, gefolgt von einem Waschschritt mit 80%igem Ethanol. Die gefällten und gewaschenen Nucleinsäuren bildeten ein Pellet. Das Pellet wurde in 6 ml Wasser gelöst. 1 ml-Aliquots des gelösten Pellets wurden anschließend mittels Elektroporation in den E. coli-Stamm DH-10B eingeschleust. Nach der Elektroporation von fünf parallelen Aliquots wurde eine Bank von etwa 10 Millionen Rekombinanten erzeugt.
Beispiel 4
Expressionsdurchmusterung auf cDNAs, die IL-12-Rezeptoren mit einer hohen Affinität codieren
Die Bank wurde gemäß der durch Hara und Miyajima, EMBO 11 (1992, 1875, beschriebenen allgemeinen Expressionsdurchmusterungsmethode durchmustert.
Pools von etwa 100 E. coli-Clonen aus der vorstehenden Bank wurden vermehrt, und die Plasmid-DNA wurde durch herkömmliche Methoden aus den Pools extrahiert. 2 × 10⁵ COS-Zellen wurden pro 35 mm-Kulturvertiefung plattiert. Die COS-Zellen wurden mittels der in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2. Auflage, Sambrook J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ("Molecular Cloning") beschriebenen herkömmlichen DEAE-Dextran-Technik mit einem Transfektionscocktail transfiziert. Der Transfektionscocktail enthielt (1) 1 mg Plasmid-DNA, extrahiert aus den aus der vorstehenden Bank erhaltenen E. coli-Clon-Pools, und (2) 0,1 mg pEF-BOS-Plasmid-DNA, enthaltend die menschliche IL-12-Rezeptor-beta1-cDNA.
Drei Tage nach der Transfektion wurden die Vertiefungen der COS-Zellen mit 10 pM eines markierten, menschlichen, rekombinanten IL-12 (spezifische Aktivität = 1000–2000 CpM/fmol) für 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das markierte, menschliche, rekombinante IL-12 wurde entfernt, und die einlagige Schicht von COS-Zellen wurde dreimal für eine Stunde mit Bindepuffer (RPMI-1640, 5% fötales Rinderserum (FBS), 25 mM HEPES, pH 7) gewaschen, um ferner auf COS-Zellen zu selektieren, die ausschließlich IL-12-Rezeptoren mit einer hohen Affinität exprimieren (die Bindung des IL-12-Liganden an die Stellen mit geringer Affinität wurde weiter verringert, da die Stellen mit geringer Affinität eine höhere Dissoziationsrate aufweisen). Anschließend wurden die einlagigen Zellschichten lysiert und in einem Gammazähler gezählt. Nach der Durchmusterung von 440 Pools (welche etwa 44.000 Clone repräsentieren) zeigte ein Pool übereinstimmend ein positives Bindungssignal (300 CpM gegenüber einem Hintergrund von 100 CpM). Aus diesem Pool wurde anschließend durch eine "sib-Selektion" ein einzelner Clon isoliert. Dieser einzelne Clon (B5-10) enthielt eine cDNA-Insertion von etwa 3 kb, die vollständig sequenziert wurde.
Die cDNA-Insertion von Clon B5-10 war im Hinblick auf die proteincodierende Region unvollständig, das sie kein Stoppcodon im Leseraster enthielt. Die cDNA-Bank von Beispiel 3 wurde noch einmal durch herkömmliche DNA-Hybridisierungstechniken, wie in "Molecular Cloning" und bei Grunstein und Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975), 3961, beschrieben, mit der cDNA-Insertion aus Clon B5-10 durchmustert. Auf diese Weise wurden weitere Clone isoliert und anschließend teilweise sequenziert. Für die Nucleotidsequenz eines Clons (Nr. 3) wurde festgestellt, daß sie (i) mit dem 3'-Ende der Nucleotidsequenz von Clon B5-10 überlappt, (ii) über die Nucleotidsequenz von Clon B5-10 hinaus verlängert ist, und (iii) ein Stoppcodon im Leseraster enthält.
Diese zusammengesetzte DNA-Sequenz ist in 1 gezeigt (SEQ ID NO: 1). Die abgeleitete Aminosäuresequenz für das codierte Rezeptorprotein ist in 2 gezeigt. Unter Zugrundelegung der bereits vorgeschlagenen Nomenklatur von Stahl und Yancopolous, Cell 74 (1993), 587, bezeichneten die Erfinder diese neu isolierte, menschliche IL-12-Rezeptorkette als die beta2-Kette.
Beispiel 5
Bindungstests
COS-Zellen (4–5 × 10⁷) wurden mittels Elektroporation unter Verwendung einer BioRad Gene Pulser-Vorrichtung (250 mF, 250 Volt) mit entweder (1) 25 mg der B5-10-Plasmid-DNA, die das rekombinante menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein exprimiert, (2) 25 mg der pEF-BOS-Plasmid-DNA, die das rekombinante menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein exprimiert, oder (3) einem Gemisch aus 12,5 mg der B5-10-Plasmid-DNA, die das rekombinante menschliche IL-12-beta2- Rezeptorprotein exprimiert, und 12,5 mg der pEF-BOS-Plasmid-DNA, die das rekombinante menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein exprimiert, transfiziert. Die elektroporierten Zellen wurden in eine 600 cm²-Kulturplatte plattiert, nach 72 Stunden durch Abschaben geerntet, gewaschen und in Bindepuffer resuspendiert.
Die Zellen wurden getestet, um die Affinität der exprimierten IL-12-Rezeptoren für menschliches IL-12 zu bestimmen. Insbesondere wurde die Gleichgewichtsbindung eines markierten, rekombinanten, menschlichen IL-12 an die Zellen durchgeführt und analysiert, wie bei Chizzonite R. et al., J. Immunol. 148 (1992), 3117, beschrieben wurde. Die elektroporierten Zellen (8 × 10⁴) wurden mit ansteigenden Konzentrationen des ¹²⁵I-markierten, rekombinanten, menschlichen IL-12 bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Die Inkubationen wurden in doppelter oder dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
Die zellgebundene Radioaktivität wurde von dem freien, markierten ¹²⁵I-IL-12 durch Zentrifugation des Gemisches von elektroporierten Zellen und dem ¹²⁵I-markierten, rekombinanten, menschlichen IL-12 durch 0,1 ml eines Ölgemisches (1:2-Gemisch aus Thomas Siliconfluid 6428-R15 [A.H. Thomas] und Siliconöl AR 200 [Gallard-Schlessinger]) bei 4°C für 90 Sekunden bei 10.000 × g unter Bildung eines Zellpellets in einem Röhrchen getrennt. Das Zellpellet wurde aus der Spitze des Röhrchens, worin es gebildet wurde, ausgeschnitten, und die zellgebundene Radioaktivität wurde in einem Gammazähler bestimmt.
Die Rezeptorbindungsdaten wurden analysiert, und die Affinitäten wurden gemäß Scatchard unter Anwendung der Methode, welche durch McPherson J., Pharmacol. Methods 14 (1985), 213, beschrieben wurde, berechnet.
Beispiel 6
Erzeugung einer auf IL-12 ansprechenden Zelllinie
Wildtyp-Ba/F3-Zellen, eine IL-3-abhängige Maus-Pro-B-Zelle (Palacios R. et al., Cell 41 (1985), 727) und Ba/F3-Zellen, die das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein exprimieren (Chua A. et al., J. Immunology 153 (1994), 128), wurden mit (1) 80 mg der pEF-BOS-Plasmid-DNA, die das rekombinante menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein exprimiert, und (2) 8 mg eines Plasmid, das ein Hygromycin-Resistenzgen exprimiert (Giordano T.J. et al., Gene 88 (1990), 285), mittels Elektro poration unter Verwendung einer BioRad Gene Pulser-Vorrichtung (960 mF, 400 Volt) cotransfiziert.
Alle Zellen wurden in einer Dichte von 2 × 10⁵ lebensfähigen Zellen/ml in einem Wachstumsmedium aus RPMI-1640, 10% FBS, Glutamin (2 mM), Penicillin G (100 E/ml), Streptomycin (100 mg/ml) und 10% eines konditionierten Mediums von der WEHI-3-Zelllinie (ATCC Nr. TIB 68, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) resuspendiert. Die WEHI-3-Zelllinie ist eine Quelle für IL-3. Die resuspendierten Zellen wurden dann bei 37°C unter 5% CO₂ für 120 Stunden inkubiert.
Die Zellen wurde anhand ihrer Fähigkeit selektiert, (1) in dem vorstehenden Wachstumsmedium in Gegenwart von 1 mg/ml Hygromycin oder (2) einem IL-12 enthaltenden Wachstumsmedium aus RPMI-1640, 10% FBS, Glutamin (2 mM), Penicillin G (100 E/ml), Streptomycin (100 mg/ml) und verschiedenen Konzentrationen (10, 50 oder 250 ng/ml) des menschlichen IL-12 zu wachsen.
Ba/F3-Zellen, die das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein exprimieren und welche mit der pEF-BOS-Plasmid-DNA transfiziert wurden, die das rekombinante menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein exprimiert, wuchsen in dem IL-12 enthaltenden Wachstumsmedium, was zeigt, daß die Coexpression des menschlichen IL-12-beta1-Rezeptorproteins und des menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorproteins eine Reaktionsfähigkeit auf menschliches IL-12 auf die Ba/F3-Zellen übertragen hat.
Außerdem wachsen Ba/F3-Zellen, die das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein exprimieren, in dem IL-12 enthaltenden Wachstumsmedium, was zeigt, daß die Expression des menschlichen IL-12-beta2-Rezeptorproteins eine Reaktionsfähigkeit auf menschliches IL-12 auf die Ba/F3-Zellen übertragen hat.
Beispiel 7
Wirkung von menschlichem IL-12 auf transfizierte Ba/F3-Zelllinien
Ba/F3-Zellen, die (1) das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein exprimieren, (2) das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein exprimieren, oder (3) das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein und das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein coexprimieren, wurden in RPMI-1640-Medium, supplementiert mit 10% FBS, 100 E/ml Penicillin G, 100 mg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin, bei 2 × 10⁴ Zellen/Vertiefung in Costar 3596-Mikroplatten mit flachem Boden für 24 Stunden gezüchtet. Anschließend wurden verschiedene Verdünnungen eines menschlichen IL-12, wie in 6 gezeigt, zu den Mikroplatten zugegeben, und die Zellen wurden für 42 Stunden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft inkubiert. 50 ml ³H-Thymidin, 10 mCi/ml in dem Kulturmedium, wurden dann zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Kulturen wurden für weitere 6 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Kulturinhalte mit Hilfe eines Zellerntegerätes auf Glasfaserfiltern geerntet. Der ³H-Thymidin-Einbau wurde unter Verwendung eines Flüssigkeitsszintillationszählers gemessen. Alle Proben wurden in vierfacher Ausfertigung untersucht.
Beispiel 8
Sequenzanalyse von IL-12-Rezeptor-cDNA-Clonen und des hierdurch codierten IL-12-Rezeptorproteins
Das IL-12-beta2-Rezeptorprotein, welches aus 862 Aminosäuren bestand und ein berechnetes Molekulargewicht von 97231 aufwies, besaß die folgenden Merkmale: ein N-terminales Signalpeptid, eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne und einen cytoplasmatischen Schwanz. Für ein klassisches N-terminales Signalpeptid wird eine Länge von 23 Aminosäuren vorhergesagt. Die Signalpeptidspaltung erfolgt überwiegend nach den Aminosäuren Ala, Ser, Gly, Cys, Thr und Gln (von Heijne G., Nucl. Acids Research 14 (1986), 4683). Für den IL-12-Rezeptor könnte die Spaltung folglich nach Ala23 in der in 2 gezeigten Sequenz erfolgen, wobei basierend auf der Spaltung bei Ala23 ein reifes Protein von 839 Aminosäuren zurückbleibt. Für die extrazelluläre Domäne des Rezeptors wird vorhergesagt, daß sie die Region von dem C-Terminus des Signalpeptids bis zu Aminosäure Nr. 622 in der in 2 gezeigten Sequenz umfaßt. Eine Hydrophobizitätsanalyse zeigt, daß der Bereich von Aminosäure Nr. 623 bis 646 hydrophob ist, wie für eine Transmembranankerregion zu erwarten wäre. Geladene Reste für den Transferstopp können sowohl am N- als auch am C-Terminus dieses vorhergesagten Transmembranbereiches identifiziert werden. Die extrazelluläre Domäne des Rezeptors weist folglich eine Länge von 599 Aminosäuren auf und enthält neun vorhergesagte H-gebundene Glycosylierungsstellen. Der cytoplasmatische Anteil weist eine Länge von 215 Aminosäuren auf (Aminosäurereste Nrn. 647 bis 862).
Eine weitere Analyse der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz ergibt, daß das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein aufgrund der Sequenzmotive [Cys132 --- Cys143TW] und [W305SKWS] ein Mitglied der Cytokinrezeptor-Superfamilie ist. Ein Vergleich der in 2 gezeigten Sequenz mit allen Mitgliedern der Superfamilie durch Starten des ALIGN-Programms ergibt, daß das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein gegenüber dem menschlichen gp130 die größte Homologie zeigt. Die cytoplasmatische Region der IL-12-Rezeptor-beta2-Kette enthält die Box 1 und 2-Motive, die in anderen Mitgliedern der Cytokinrezeptor-Superfamilie vorkommen, sowie drei Tyrosinreste. Eine Phosphorylierung von Tyrosinen ist im Allgemeinen mit einer Signalaussendung durch den Cytokinrezeptor assoziiert; die Anwesenheit dieser Tyrosinreste unterstreicht die Wichtigkeit der IL-12-Rezeptorbeta2-Kette bei der Bildung eines funktionellen IL-12-Rezeptors. Die IL-12-Rezeptor-beta1-Kette enthält in ihrem cytoplasmatischen Schwanz keine Tyrosinreste.
Beispiel 9
Analyse der Bindungstests
Die Ergebnisse der Bindungstests sind in 5 gezeigt.
Wie in den 5A und 5B gezeigt, bindet menschliches IL-12 an die rekombinante IL-12-Rezeptor-beta1- oder -beta2-Kette allein mit einer scheinbaren Affinität von etwa 2–5 nM. Die Bindungsdaten wurden durch ein einseitiges Rezeptormodell beschrieben, das der Komponente mit geringer Affinität des funktionellen IL-12-Rezeptors entspricht, der auf PHA-aktivierten PBMCs vorkommt (Chizzonite R. et al., J. Immunol. 148 (1992), 3117; Desai B. et al., J. Immunol. 148 (1992), 3125).
Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen, wie in 5C gezeigt, wurden bei der Cotransfektion von COS-Zellen mit IL-12-Rezeptor-beta1- und -beta2-Plasmiden sowohl Stellen mit einer hohen als auch einer geringen Affinität für die Bindung von IL-12 erzeugt. In diesem Fall wurden die Bindungsdaten durch ein zweiseitiges Rezeptormodell mit Affinitäten von 50 pM und 5 nM beschrieben.
Beispiel 10
Wirkung von menschlichem IL-12 auf transfizierte Ba/F3-Zelllinien
Die Ergebnisse des Proliferationstests auf die Wirkung von menschlichem IL-12 auf Ba/F3-Zelllinien, welche (1) das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein exprimieren, (2) das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein exprimieren, und (3) das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein und das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein coexprimieren, sind in 6 gezeigt.
Zellen, die mit cDNAs für sowohl das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein als auch das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein transfiziert sind, reagieren auf eine Stimulierung durch menschliches IL-12 durch eine Proliferation in einer dosisabhängigen Weise.
Zusätzlich reagieren Zellen, welche mit cDNAs für das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein transfiziert sind, auf eine Stimulierung durch menschliches IL-12 durch eine Proliferation in einer dosisabhängigen Weise.
Folglich entspricht die isolierte cDNA (Clon Nr. B5-10, SEQ ID NO: 1), die ein Typ 1-Transmembranprotein codiert, einer zweiten Komponente des IL-12-Rezeptors (IL-12R-beta2), der auf normalen menschlichen T-Zellen zu finden ist. Die jeweiligen beta1- und beta2-Ketten allein binden IL-12 nur mit geringer Affinität (Kd = 2–5 nM). Bei der Coexpression von beta1 und beta2 werden zwei Affinitätsstellen mit Kd-Werten von 50 pM und 5 nM beobachtet.
Ba/F3-Zellen, die das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein exprimieren oder das menschliche IL-12-beta1-Rezeptorprotein und das menschliche IL-12-beta2-Rezeptorprotein coexprimieren, sind für menschliches IL-12 empfindlich.
Die Begriffe und Ausdrücke, die verwendet worden sind, werden als beschreibende Begriffe und nicht zur Begrenzung verwendet, und daher besteht nicht die Absicht, durch die Verwendung dieser Begriffe und Ausdrücke irgendwelche Entsprechungen der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon auszuschließen.

Claims

Interleukin-12-(IL-12)-beta2-Rezeptorprotein mit geringer Bindungsaffinität oder ein Fragment davon, das (a) eine Bindungsaffinität für IL-12 von etwa 1 bis etwa 10 nM hat, und (b) wenn es mit einem IL-12-beta1-Rezeptorprotein komplexiert ist, einen Komplex mit einer Bindungsaffinität zu IL-12 von etwa 5 bis etwa 100 pM ausbildet, wobei das IL-12-beta2-Rezeptorprotein durch die Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 1 oder eine Nucleinsäure mit einer Sequenz, die unter stringenten Bedingungen an den komplementären Strang der Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 1 hybridisiert, codiert wird; und das IL-12-beta1-Rezeptorprotein durch die Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 3 oder eine Nucleinsäure mit einer Sequenz, die unter stringenten Bedingungen an den komplementären Strang von Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 3 hybridisiert, codiert wird.
Protein gemäß Anspruch 1, das eine Sequenzhomologie von mindestens 80 % mit dem Polypeptid zeigt, das von der Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 1 codiert wird.
Protein gemäß Anspruch 2, wobei das IL-12-beta2-Rezeptorprotein die SEQ ID NO.: 2 oder allelische Formen oder Varianten davon hat.
Protein, codiert von einer Nucleinsäure, die 2 Untersequenzen umfasst, wobei eine der Untersequenzen ein Fragment eines Interleukin-12-(IL-12)-beta2-Rezeptorproteins wie definiert in einem der vorhergehenden Ansprüche, das löslich ist, codiert und die andere der Untersequenzen alle Domänen der konstanten Region der schweren Kette des Ig außer der ersten Domäne der konstanten Region codiert.
Komplex, der fähig ist, mit hoher Affinität an IL-12 zu binden, umfassend ein Interleukin-12-(IL-12)-beta2-Rezeptorprotein oder ein Fragment davon, wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 4, komplexiert mit IL-12-beta1-Rezeptorprotein wie definiert in Anspruch 1 oder einem Fragment davon, das (a) eine Bindungsaffinität für IL-12 von etwa 1 bis etwa 10 nM hat, und (b) wenn es mit einem IL-12-beta2-Rezeptorprotein komplexiert ist, einen Komplex mit einer Bindungsaffinität zu IL-12 von etwa 5 bis etwa 100 pM ausbildet.
Komplex gemäß Anspruch 5, wobei das IL-12-beta1-Rezeptorprotein entweder von der Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 3 oder von einer Nucleinsäure mit einer Sequenz, die unter stringenten Bedingungen an den komplementären Strang der Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 3 hybridisiert, codiert wird.
Komplex gemäß Anspruch 6, wobei das IL-12-beta1-Rezeptorprotein zu dem Polypeptid, das von SEQ ID NO.: 3 codiert wird, eine Sequenzhomologie von mindestens 80 % aufweist.
Komplex gemäß Anspruch 7, wobei das IL-12-beta1-Rezeptorprotein die SEQ ID NO.: 4 oder allelische Formen oder Varianten davon hat.
Protein, codiert von einer ersten und einer zweiten Nucleinsäure, wobei die erste Nucleinsäure zwei Untersequenzen umfasst, wobei eine der Untersequenzen ein Fragment eines Interleukin-12 (IL-12)-beta2-Rezeptorproteins wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 3, das löslich ist, codiert und die andere der Untersequenzen alle Domänen der konstanten Region der schweren Kette des menschlichen Ig außer der ersten Domäne der konstanten Region codiert und die zweite Nucleinsäure zwei Untersequenzen umfasst, wobei eine der Untersequenzen ein Fragment des IL-12-beta1-Rezeptorproteins wie definiert in einem der Ansprüche 6 bis 8, das löslich ist, codiert und die andere der Untersequenzen alle Domänen der konstanten Region der schweren Kette des menschlichen Ig außer der ersten Domäne der konstanten Region codiert.
Protein oder Komplex gemäß eines der Ansprüche 1 bis 9, das/der löslich ist.
Nucleinsäuren, die ein Interleukin-12-(IL-12)-beta2-Rezeptorprotein mit geringer Bindungsaffinität oder ein Fragment davon gemäß Anspruch 1 codieren.
Nucleinsäure gemäß Anspruch 11, wobei die Nucleinsäure menschliches IL-12-beta2-Rezeptorprotein mit der SEQ ID NO.: 1 codiert.
Vektor, umfassend eine Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 11 bis 12.
Expressionsvektor, umfassend eine Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 11 bis 12, die funktionell mit Kontrollsequenzen verknüpft ist, die von einer Wirtszelle erkannt werden.
Wirtszelle, die mit einer Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14 transformiert ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 15, wobei das Protein oder der Komplex auf ihrer Oberfläche exprimiert ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 16, wobei die Wirtszelle bei Anwesenheit von IL-12 proliferiert.
Wirtszelle, transformiert mit einem ersten Vektor, umfassend eine Nucleinsäure, die das wie in Anspruch 1 definierte Protein codiert, und einem zweiten Vektor, umfassend eine Nucleinsäure, die das wie in Anspruch 6 oder 7 definierte IL-12-beta1-Rezeptorprotein codiert, oder mit einem einzelnen Vektor, umfassend eine Nucleinsäure, die das wie in Anspruch 1 definierte Protein codiert, und eine Nucleinsäure, die das wie in Anspruch 6 oder 7 definierte IL-12-beta1-Rezeptorprotein codiert.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins oder eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend die Expression einer Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 11 bis 12 und gegebenenfalls der Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 3 oder einer Nucleinsäure mit einer Sequenz, die unter stringenten Bedingungen an den komplementären Strang von Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO.: 3 bindet, in einer geeigneten Wirtszelle.
Arzneimittel, umfassend ein Protein oder einen Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 oder erhalten durch das Verfahren gemäß Anspruch 19 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Arzneimittel gemäß Anspruch 20, das ferner eine therapeutisch wirksame Menge von einem oder mehreren Cytokin-Antagonisten umfasst.
Protein oder Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 oder wie erhalten durch das Verfahren gemäß Anspruch 19 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung eines Proteins oder Komplexes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 oder wie erhalten durch das Verfahren gemäß Anspruch 19 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Autoimmundysfunktion.
Verfahren zum Durchmustern von Verbindungen, die nützlich sind zur Hemmung von IL-12-Aktivität, umfassend (a) das Inkontaktbringen einer Verbindung, von der vermutet wird, dass sie IL-12-Aktivität hemmt, mit einem Protein oder einem Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 oder wie erhalten durch das Verfahren gemäß Anspruch 19, und (b) den Nachweis der hemmenden Wirkung.
Verfahren zum Durchmustern von Verbindungen, die nützlich sind als Agonisten von IL-12, umfassend (a) das Inkontaktbringen einer Verbindung, von der vermutet wird, dass sie ein IL-12-Agonist ist, mit einem Protein oder einen Komplex gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 oder wie erhalten durch das Verfahren gemäß Anspruch 19, und (b) den Nachweis einer Agonist-Wirkung.