ES2255067T3 - Receptores para la interleucina-12 humana. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE DIRIGE A PROTEINAS RECEPTORAS DE IL12, QUE COMPRENDEN UN COMPLEJO DE LA PROTEINA RECEPTORA BETA1 CON LA PROTEINA RECEPTORA BETA2, SIENDO DICHO COMPLEJO CAPAZ DE UNIRSE A LA IL-12 HUMANA CON ALTA AFINIDAD. EL ACIDO NUCLEICO, CUANDO ES EXPRESADO EN CELULAS HUESPED, DA LUGAR A PROTEINAS RECPTORAS IL-12 SUSTANCIALMENTE HOMOGENEAS. ADEMAS, LA INVENCION SE RELACIONA CON ANTICUERPOS CAPACES DE UNIRSE A LAS CELULAS QUE EXPRESAN LAS MOLECULAS DE IL-12.

Description

Receptores para la interleucina-12 humana.

Esta invención se refiere en general a los receptores de la interleucina-12, especialmente a los receptores de la interleucina-12 humana.

La interleucina-12 (IL-12), conocida en un principio como factor de maduración de linfocitos citotóxicos o factor natural estimulador de células asesinas, es una citocina heterodimérica de 75-kDa compuesta de dos subunidades de 40-kDa (p40) y 35-kDa (p35) unidas con un disulfuro, que tiene múltiples actividades biológicas entre las que está incluida la estimulación y proliferación de las células T y NK (Gately, M. K., et al., 1991, J. Immunol., 147:874) (Kobayashi, M., et al., 1989, J. Exp. Med., 170:827), aumento de la actividad lítica de las células NK/LAK (Kobayashi, M., et al., 1989, J. Exp. Med., 170:827; Stern, A.S., et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6808), aumento de la respuesta de las células T citolíticas (Gately, M.K., et al., 1992, Cell. Immunology, 143:127), inducción del gamma interferón por las células T y NK en reposo y activadas (Kobayashi, M. et al., 1989, J. Exp. Med., 170:827; Chan, S. H., et al., 1991, J. Exp. Med., 173:869), y apoyo de las respuestas de las células auxiliares del tipo T_{h}1 (Manetti, R., et al., 1993, J. Exp. Med., 177:1199; Hsieh, C.-S., et al., 1993, Science 260:547).

La actividad biológica de la IL-12 está mediada por la unión de las moléculas de IL-12 a la superficie de la célula o membrana plasmática, a los receptores sobre células T y NK activadas; sin embargo, las contribuciones de las subunidades individuales, p35 y p40, a la unión del receptor y la transducción de la señal siguen sin conocerse. Los estudios con IL-12 marcada han demostrado que esta unión tiene lugar de una manera específica y saturada. La IL-12 suministra una señal a las células diana a través de un receptor que ha sido inicial-mente caracterizado sobre las células T, CD4+ y CD8+ activadas con fitohemaglutinina (PHA) y sobre las células NK CD56+ activadas con IL-2 (Chizzonite, R. et al., 1992, J. Immunol., 148:3117; Desai, B., et al., 1992, J. Immunol., 148:3125).

Un estudio sobre más de 20 líneas celulares humanas pertenecientes a linajes T-, B-, NK- y mielomonocíticos, identificó solamente un único CD4+, una línea celular T humana dependiente de IL-2 (kit 225/K6) que expresa constitutivamente el receptor de la IL-12 y responde al IL-12 (Desai, B., et al., 1992, J. Immunol., 148:3125; Desai, B., et al., 1993, J. Immunol. 150:207A). Las células mononucleares de sangre periférica activadas con PHA recién preparadas (PBMC), y el kit Wh/UI 27.6.96 de la línea celular 225/K6, constituyen dos fuentes convenientes de células para estudiar la bioquímica del receptor funcional de la IL-12; también pueden ser otras.

Experimentos de unión de equilibrio con IL-12 marcada con I^{125} identificaron tres sitios con afinidades de unión para la IL-12 humana de 5-20 pM, 50-200 pM y 2-6 nM en células T sensibles a IL-12 (Chizzonite, R. et al., 1994, Cytokine 6(5):A82a).

Un ADNc que codifica un receptor de IL-12 de baja afinidad, se clonó previamente (Chua, A, et al., 1994, J. Immunology 153:128; Solicitud de Patente Europea nº 0.638.644). En base a una nomenclatura anteriormente propuesta (Stahl y Yancopoulos, 1993, Cell 74:587), la cadena de receptores de la IL-12 humana inicialmente aislada, recibe el nombre de cadena beta 1.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Secuencia de ADN del ADNc del receptor beta 2 de la IL-12 humana (codon de inicio = nucleótido 641; codon de interrupción = nucleótido 3226) (SEQ ID NO:1).

Figura 2: Secuencia de aminoácidos de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana. (restos de aminoácidos subrayados con una sola línea en la secuencia N-terminal = péptido señal; aminoácidos n^{os}. 623-646 = área transmembránica, subrayados con línea doble; 9 sitios potenciales de glicosilación unidos a N en la porción extracelular, están marcados en negritas con letras cursivas y están también sub-rayados; los motivos 1 y 2 del box conservado en el dominio citoplasmático están sombreados [restos de aminoácidos n^{os}. 667-669, 699-704, 786-798]) (SEQ ID NO:2).

Figura 3: Secuencia de ADN del ADNc del receptor beta1 de la IL-12 humana (codon de inicio = nucleótido 65; codon de interrupción = nucleótido 2050) (SEQ ID NO:3).

Figura 4: Secuencia de aminoácidos de la proteína del receptor beta 1 de la IL 12 humana (restos de aminoácidos subrayados de la secuencia N-terminal = secuencia del péptido señal; restos de aminoácidos nos 541 a 571 = área transmembránica marcada - - - - - -; 6 sitios potenciales de glicosilación unidos a N en la porción extracelular están marcados con \text{- - - - - -}; 1 box conservado y 2 motivos en el dominio citoplasmático están marcados con \overline{\text{- - - - - -}} [restos de aminoácidos n^{os}. 577 a 584 y 618 a 629]) (SEQ ID NO:4).

Figura 5A: Análisis de Scatchard de la unión de la IL-12 humana recombinante con células COS transfectadas, que expresan la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana.

Figura 5B: Análisis de Scatchard de la unión de la IL-12 humana recombinante con células COS transfectadas, que expresan la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana.

Figura 5C: Análisis de Scatchard de la unión de la IL-12 humana recombinante con células COS transfectadas, que coex-presan la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana y la proteína del receptor beta 2 de la IL-12
humana.

Figura 6: Análisis de proliferación, en presencia de varias concentraciones de IL-12 humana, de células Ba/F3 establementea transfectadas con ADNc para la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana (- - \blacklozenge - -), con ADNc para la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana (- - \medcirc - -), ó con ADNc para ambas proteínas tanto la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana, como la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana (- - \medbullet - -), mediante la medición de la incorporación de la timidina tritiada.

La presente invención se refiere a una proteína del receptor beta 2 de la interleucina-12 (IL-12) de baja afinidad de unión, o un fragmento de la misma, la cual

(a) tiene una afinidad de unión para la IL-12 desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 nM, y

(b) cuando está complejada con una proteína del receptor beta 1 de la IL-12, forma un complejo que tiene una afinidad de unión para la IL-12 desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 100 pM,

en donde

la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 está codificada por la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO:1 ó un ácido nucleico con una secuencia que híbrida en condiciones restrictivas con la cadena complementaria de la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO:1; y

la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 está codificada por la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO:3 ó un ácido nucleico con una secuencia que hibrida en condiciones restrictivas con la cadena complementaria de la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO:3. En una versión preferida, el ácido nucleico que codifica la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que híbrida en condiciones estrictas con la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO:1 ó el cual comparte por lo menos un 80%, con más preferencia por lo menos aproximadamente un 90%, y con mayor preferencia por lo menos aproximadamente un 95% de la homología de la secuencia con el polipéptido que tiene la SEQ ID NO 1. Especialmente la invención se refiere a la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, que tiene por ejemplo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ó formas alélicas de variantes de la misma.

Además, la invención se refiere a un complejo capaz de unirse a la IL-12 con alta afinidad, comprendiendo la proteína del receptor beta 2 de la interleucina-12 (IL-12), ó un fragmento de la misma como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, complejada con la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 como se define en la reivindicación 1, ó un fragmento de la misma, la cual

(a) tiene una afinidad de unión para la IL-12 desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 nM, y

(b) cuando está complejada con una proteína del receptor beta 2 de la IL-12 forma un complejo que tiene una afinidad de unión a la IL-12 desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 100 pM.

En una versión preferida, el complejo mencionado comprende una proteína del receptor beta 1 de la IL-12 que tiene una secuencia de aminoácidos que es substancialmente homóloga a SEQ ID NO:4 ó la cual está codificada por un ácido nucleico que es substancialmente homólogo a SEQ ID NO:3. En una versión más preferida, el ácido nucleico que codifica la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que híbrida en condiciones estrictas con la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO:3 ó la cual comparte por lo menos un 80%, con más preferencia, por lo menos un 90%, y con la mayor preferencia por lo menos aproximadamente un 95% la homología de la secuencia con el polipéptido que tiene la SEQ ID NO:3. Especialmente, la invención se refiere a la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 que tiene por ejemplo la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 ó formas alélicas o variantes de la misma.

La presente invención se refiere también a las proteínas o complejos de más arriba, los cuales son solubles.

Un aspecto de la presente invención es una proteína o complejo codificado por un ácido nucleico que comprende dos subsecuencias, en donde una de dichas subsecuencias codifica una proteína soluble como se ha definido más arriba, y la otra de dichas subsecuencias codifica todos los dominios de la región constante de la cadena pesada de la Ig humana distintos del primer dominio de dicha región constante. La invención incluye también proteínas que codifican un primer y un segundo ácido nucleico, en donde el primer ácido nucleico comprende dos subsecuencias, en donde una de dichas subsecuencias codifica un fragmento soluble de una proteína del receptor beta 2 de la IL-12 mencionada más arriba y la otra de dichas subsecuencias codifica todos los dominios de la región constante de la cadena pesada de la Ig humana distintos del primer dominio de dicha región constante, y el segundo ácido nucleico comprende dos subsecuencias en donde una de dichas subsecuencias codifica un fragmento soluble de una proteína del receptor beta 1 de la IL-12 y la otra de dichas subsecuencias codifica todos los dominios de la región constante de la cadena pesada de la Ig humana distintos del primer dominio de dicha región constante.

El término "proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana" se refiere a (1) la proteína de SEQ ID NO:2, ó (2) cualquier proteína o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es substancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2 y la cual tiene las siguientes propiedades:

1) La proteína o polipéptido tiene una baja afinidad de unión para la IL-12 humana, y

2) La proteína o polipéptido cuando está complejada con la proteína del receptor beta 1 humano, forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión para la IL-12 humana.

El término "proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana" se refiere a (1) la proteína de SEQ ID NO:4, ó (2) a cualquier proteína o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es substancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:4 y la cual tiene las siguientes propiedades:

1) La proteína o polipéptido tiene una baja afinidad de unión para la IL-12 humana, y

2) La proteína o polipéptido cuando está complejada con la proteína del receptor beta 2 humano, forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión para la IL-12 humana.

Como se emplean aquí, los términos "proteína del receptor beta 2 de la IL-12" y "proteína del receptor beta 1 de la IL-12" incluyen las proteínas modificadas deliberadamente, como por ejemplo mediante mutagénesis dirigida al sitio o accidentalmente por medio de mutaciones. Los términos incluyen también las variantes que pueden prepararse a partir de los grupos funcionales que se encuentran como cadenas laterales sobre los radicales o los grupos terminales N- y C-, por medios ya conocidos en la técnica y se incluyen en la invención siempre que permanezcan farmacéuticamente aceptables, es decir, siempre que no destruyan la actividad de la proteína y no comuniquen propiedades tóxicas a las composiciones que las contengan. Estas variantes pueden incluir por ejemplo, cadenas laterales de polietilenglicol que pueden enmascarar sitios antigénicos y extender la residencia de las proteínas en los fluidos corporales. Otras variantes incluyen los ésteres alifáticos de grupos carboxílicos, amidas de grupos carboxílicos mediante la reacción con amoníaco o con aminas primarias o secundarias, derivados N-acílicos de grupos amino libres de radicales de aminoácidos formados con grupos acilo (p. ej., grupos alcanoilo o aroil carbocíclico) o derivados O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo los radicales serilo o treonilo) formados con grupos
acilo.

El término "substancialmente homólogos" que puede referirse a secuencias tanto de ácido nucleico como secuencias de aminoácidos, significa que una secuencia objetivo particular, por ejemplo una secuencia mutante, varía a partir de la secuencia de referencia mediante una o más substituciones, deleciones o adiciones, pero el efecto neto de las mismas no da como resultado una disimilitud funcional adversa entre la referencia y las secuencias objetivo. Para la finalidad de la presente invención, las secuencias que tienen más del 80%, con más preferencia más del 90% de homología, y todavía con mayor preferencia más del 95% de homología, propiedades biológicas equivalentes y características de expresión equivalentes, se consideran substancialmente homólogas. Para la finalidad de determinar la homología, debe descartarse la rotura de la secuencia madura. La secuencia que tienen menos grados de homología, bioactividad comparable, y características de expresión equivalentes, se consideran substancialmente equivalentes. En general, las secuencias de ADN homólogas pueden identificarse mediante hibridación cruzada en condiciones de hibridación altamente restrictivas.

"Un fragmento de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12" significa cualquier proteína o polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una porción o fragmento de una proteína del receptor beta 2 de la IL-12, y la cual (a) tiene una baja afinidad de unión para la IL-12, y (2) cuando se compleja con una proteína del receptor beta 1 de la IL-12, se forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión para la IL-12.

"Un fragmento de la proteína del receptor beta 1 de la IL-12" significa cualquier proteína o polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una porción o fragmento de proteína del receptor beta 1 de la IL-12, y la cual cuando se compleja con una proteína del receptor beta 2 de la IL-12, forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión para la IL-12.

Un "fragmento soluble" se refiere a un fragmento de la proteína del receptor de la IL-12 que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente en todo o en parte a la región extracelular de la proteína y la cual conserva la actividad de unión de la IL-12 de la proteína intacta del receptor de la IL-12. Por ejemplo, un fragmento soluble de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 es un fragmento de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente en todo o en parte a la región extracelular de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana.

De acuerdo con la invención, un "complejo" que comprenda la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 ó un fragmento de la misma, complejada con la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 ó un fragmento de la misma, puede ser expresado sobre la superficie de la célula de la célula hospedadora. Cuando se expresa sobre la superficie de la célula de la célula hospedadora, el complejo tiene una alta afinidad de unión para IL-12, mientras que la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 y la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 solas tiene cada una baja afinidad de unión para la IL-12.

De acuerdo con esta invención, la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 puede expresarse sobre la superficie de una célula hospedadora.

De acuerdo con esta invención, no solamente puede obtenerse la proteína del receptor beta 2 de la IL-12, sino también fragmentos de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12, la cual (1) tiene una baja afinidad de unión para la IL-12 y (2) la cual cuando se forma el complejo con una proteína del receptor beta 1 de la IL-12, forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión. Los fragmentos de proteína del receptor beta 2 de la IL-12 pueden obtenerse mediante medios convencionales, tales como (i) degradación proteolítica de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, (ii) síntesis química mediante métodos técnicos rutinarios, ó (iii) métodos recombinantes estándar.

Para la finalidad de la presente invención, una proteína del receptor de la IL-12 humana, la cual tiene una alta afinidad de unión para la IL-12 humana, es una proteína que se une a la IL-12 humana con una afinidad de unión desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 100 pM. Para los propósitos de la presente invención, la proteína del receptor de la IL-12 humana la cual tiene una baja afinidad de unión para la IL-12 humana, es una proteína que se une a la IL-12 humana con una afinidad de unión desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 nM. La afinidad de unión de una proteína para la IL-12 puede determinarse por medios convencionales, tales como describe R. Chizzonite et al., 1992, en J. Immunol., 148:3117 y como se explica en el ejemplo 5.

Fragmentos de proteína del receptor beta 2 de la IL-12 pueden también medirse para saber la afinidad de unión para la IL-12 por medios convencionales, tal como describe R. Chizzonite et al., 1992, en J. Immunol., 148:3117 y como se explica en el ejemplo 5. Los fragmentos de proteína del receptor beta 2 de la IL-12 pueden medirse para saber la afinidad de unión para la IL-12 bien sea sola o formando complejo con la proteína del receptor beta 1 de la IL-12, ó un fragmento de la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 el cual cuando se compleja con una proteína del receptor beta 2 de la IL-12 forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión.

La presente invención se refiere también a los ácidos nucleicos, p. ej., ADN, ADNc, ARN, ARNm, etc., que codifican las proteínas mencionadas, por ejemplo, un complejo capaz de unirse a la IL-12 humana con una alta afinidad, comprendiendo el complejo la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, o un fragmento de la misma, y la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana, o un fragmento de la misma. De preferencia, estos ácidos nucleicos codifican la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana tal como un ácido nucleico que tiene la SEQ ID NO:1 y/o la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 tal como un ácido nucleico que tiene la SEQ ID NO:3. La presente invención se refiere también a los vectores recombinantes que comprenden un ácido nucleico anterior, a los vectores de expresión, y especialmente a los vectores de expresión en donde el ácido nucleico anterior está unido operablemente a las secuencias de control reconocidas por una célula hospedadora. La invención incluye células hospedadoras eucarióticas y procarióticas transformadas con uno o más de los vectores anteriores y especialmente células hospedadoras en donde las proteínas o complejos se expresan sobre la superficie de las células hospedadoras y células hospedadoras en donde estas células proliferan en presencia de IL-12. Dichas células hospedadoras arriba mencionadas pueden ser transformadas con un primer vector que contiene un ácido nucleico que codifica la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 como se ha definido más arriba y un segundo vector que contiene un ácido nucleico que codifica la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 como se ha definido más arriba o con un vector único que contiene un ácido nucleico que codifica la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 y un ácido nucleico que codifica la proteína del receptor beta 1 de la IL-12.

Como se emplea en la presente, "ácido nucleico" se refiere a un polímero de ácidos nucleicos, en forma de un fragmento separado o como componente de la construcción de un ácido nucleico más grande, el cual ha sido derivado a partir de un ácido nucleico aislado por lo menos una vez en forma substancialmente pura, es decir, libre de contaminación de materiales endógenos y en una cantidad o concentración que permita la identificación, manipulación y recuperación de la secuencia y las secuencias componentes del nucleótido mediante métodos bioquímicos estándar, por ejemplo, empleando un vector clónico. Tales secuencias se proporcionan de preferencia en forma de un ADN ó un ADNc con un marco de lectura abierta no interrumpido por secuencias internas no traducidas, o intrones, los cuales están típicamente presentes en los genes eucarióticos. Sin embargo, será evidente que también podría emplearse el ADN genómico que contiene las secuencias pertinentes. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes en 5' ó 3' a partir del marco de lectura abierta, en donde el mismo no interfiere con la manipulación o la expresión de las regiones que codifican.

"Vector de expresión" es un elemento genético capaz de replicación bajo su propio control, tal como un plásmido, fago o cósmido, al cual puede unirse otro segmento de ácido nucleico de forma que se produzca la replicación del segmento unido. Comprende una unidad transcripcional que comprende un montaje de (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores y potenciadores, (2) una secuencia estructural o codificadora que se transcribe en ARNm y se traduce en proteína, y (3) las apropiadas secuencias de iniciación y terminación de la transcripción.

"Clon" es un grupo de moléculas de ADN idénticas derivadas de una longitud original de secuencias de ADN y producidas por una bacteria o un virus empleando técnicas de ingeniería genética, a menudo implicando plásmidos.

Además, la invención se refiere a una proteína recombinante, purificada, que comprende dos diferentes cadenas de polipéptidos (una proteína heterodimérica) la cual puede prepararse por métodos ya conocidos. Las dos diferentes cadenas polipeptídicas están cada una codificadas por un diferente polinucleótido quimérico el cual tiene dos subsecuencias de ácido nucleico fusionadas en el marco de lectura. La primera subsecuencia de ácido nucleico del primer polinucleótido quimérico, situado en su extremo 5' es una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica un fragmento soluble de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12. La segunda subsecuencia de ácidos nucleicos del primer polinucleótido quimérico, situado en su extremo 3', es una secuencia aislada de ácidos nucleicos que codifican todos los dominios de una cadena pesada de Ig humana (de preferencia IgG), excepto el primer dominio de la región constante. La primera subsecuencia de ácidos nucleicos del segundo polinucleótido quimérico, situado en su extremo 5', es una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica un fragmento soluble de la proteína del receptor beta 1 de la IL-12. La segunda subsecuencia de ácidos nucleicos del segundo polinucleótido quimérico situado en su extremo 3', es una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica todos los dominios de una cadena pesada de Ig humana (de preferencia IgG) excepto el primer dominio de la región constante.

Los materiales de partida para las proteínas recombinantes purificadas de la invención pueden obtenerse por métodos ya conocidos en la técnica. En particular, sobre la base de la secuencia de ADN que codifica la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana descrita en la figura 1 y de las secuencias de ácido nucleico ya conocidas para ciertos receptores, aquellas secuencias parciales de ácido nucleico que codifican un fragmento soluble de proteína del receptor beta 2 de la IL-12, pueden ser determinadas y modificadas por ingeniería genética a partir de la secuencia de ADN que codifica la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 descrita en la figura 1 empleando métodos ya conocidos (ver Sambrook et al., "Molecular Cloning" ("Clonado Molecular")), 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). De manera similar, sobre la base de la secuencia de ADN que codifica la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana descrita en la figura 3 y de las ya conocidas secuencias de ADN para ciertos receptores, aquellas secuencias parciales de ADN que codifican un fragmento soluble de proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana pueden determinarse y modificarse por ingeniería genética a partir de la secuencia de ADN que codifica la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana descrito en la figura 3 empleando métodos ya conocidos, ver Sambrook et al., "Molecular Cloning" ("Clonado molecular"), 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Fuentes para las secuencias de ADN aisladas que codifican dominios constantes de inmunoglobulinas constantes son ya conocidas en la técnica y están descritas por ejemplo, por Ellison et al., Nucl. Acid. Res. 10, 4071-4079 (1982) para IgG_{1} ó Huck et al., Nucl, Acid. Res. 14, 1779-1789 (1986) para IgG_{3}.

La secuencia de ADN aislada que codifica el fragmento soluble de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, puede fusionarse en el marco de lectura, mediante métodos ya conocidos [Sambrook et al., "Molecular Cloning" ("Clonado molecular"), 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], con la secuencia aislada de ADN que codifica todos los dominios de una cadena pesada de Ig humana (de preferencia IgG) excepto el primer dominio de la región constante. El polinucleótido quimérico resultante tiene situado en su extremo 5' la secuencia aislada de ADN que codifica el fragmento soluble de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana y en su extremo 3' la secuencia aislada de ADN que codifica todos los dominios de la cadena pesada de Ig humana excepto el primer dominio de la región constante.

Similarmente, la secuencia aislada de ADN que codifica el fragmento soluble de la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana puede ser fusionado en el marco de lectura, mediante métodos ya conocidos [Sambrook et al., "Molecular Cloning" ("Clonado molecular"), 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], con la secuencia aislada de ADN que codifica todos los dominios de una cadena pesada de Ig humana (de preferencia IgG) excepto el primer dominio de la región constante. El polinucleótido quimérico resultante tiene localizado en su extremo 5' la secuencia aislada de ADN que codifica el fragmento soluble de la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana y en su extremo 3' la secuencia aislada de ADN que codifica todos los dominios de la cadena pesada de Ig humana excepto el primer dominio de la región constante.

Los polinucleótidos quiméricos pueden integrarse a continuación empleando métodos ya conocidos [Sambrook et al., "Molecular Cloning" ("Clonado molecular"), 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], en vectores de expresión adecuados para la expresión en una célula mamífera no humana, tal como la célula CHO. Con el fin de obtener la proteína homodimérica de la invención, el polinucleótido quimérico que tenía localizado en su extremo 5' la secuencia aislada de ADN que codifica el fragmento soluble de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, se integra en un vector de expresión adecuado. Con el fin de obtener la proteína heterodimérica de la invención, el polinucleótido quimérico que tenía situada en su extremo 5' la secuencia aislada de ADN que codifica el fragmento soluble de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, y el polinucleótido quimérico que tenía situada en su extremo 5' la secuencia aislada de ADN que codifica el fragmento soluble de la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana son integrados en un único vector de expresión adecuado, o dos vectores de expresión adecuados separados.

De preferencia, el (los) polinucleótido(s) quimérico(s) es/son cotransfectado(s) juntamente con un marcador seleccionado, por ejemplo, la neomicina, higromicina, dihidrofolato reductasa (dhfr) o hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (hgpt) empleando métodos que ya son conocidos en la técnica. La secuencia de ADN establemente incorporada en el cromosoma puede ampliarse posteriormente. Un marcador de selección adecuado es por ejemplo, el dhfr. Las células de mamíferos, por ejemplo, las células CHO, que no contienen ningún gen intacto dhfr, se incuban por ello con cantidades crecientes de metotrexato después de que la transfección ha sido efectuada. De esta manera, pueden obtenerse líneas celulares que contienen un número mayor de la secuencia de ADN deseada que las células no amplificadas.

El sistema de expresión del baculovirus puede también emplearse para la expresión de proteínas recombinantes en células de insectos. Modificaciones postranslacionales efectuadas por las células de insectos son muy similares a las que tienen lugar en células de mamíferos. Para la producción de un baculovirus recombinante que expresa la proteína deseada, se emplea un vector de transferencia. Un vector de transferencia es un plásmido que contiene el (los) polinucleótido(s) quimérico(s) bajo el control de un fuerte promotor, por ejemplo el gen polihedron, rodeado por ambos lados por secuencias virales. El vector de transferencia se transfecta a continuación en células de insectos juntamente con la secuencia de ADN de los baculovirus de tipo salvaje. Los virus recombinantes que resultan en las células mediante la recombinación homóloga pueden a continuación ser identificados y aislados de acuerdo con métodos ya conocidos. Cuando se emplea el sistema de expresión del baculovirus, las secuencias de ADN que codifican la parte de inmunoglobulina tienen que ser en forma de ADNc.

La proteína recombinante expresada puede purificarse por ejemplo mediante métodos ya conocidos. Por ejemplo, la cromatografía de afinidad de la proteína G puede emplearse para purificar la proteína homodimérica de la invención. La cromatografía de columna o cualquier otro método que permita la diferenciación entre proteínas homodiméricas y proteínas heterodimérica, puede emplearse para purificar la proteína heterodimérica de la invención.

Expresión de la proteína del receptor de la IL-12 humana con una alta afinidad de unión con la IL-12 humana:

El ADNc de células en las que se sabe que se encuentra el receptor de la IL-12, se incorpora por métodos convencionales en una bacteria hospedadora para establecer una biblioteca de ADNc. Células PBMC activadas con PHA y células de la línea celular del Kit 225/K6, son ejemplos de fuentes de células para el ADNc. El ARN de las células se extrae, se caracteriza, y se transcribe en ADNc monocatenario mediante métodos convencionales. El ADNc monocatenario se convierte en ADNc de doble cadena mediante métodos convencionales. El ADNc de doble cadena se incorpora mediante técnicas convencionales en un vector de expresión tal como el pEF-BOS. El plásmido ADN del vector de expresión se incorpora a continuación en un anfitrión bacteriano mediante métodos convencionales para formar una biblioteca de recombinantes.

La biblioteca de ADNc se explora por métodos de exploración de expresión convencionales, como describe Hara y Mijayima, 1992, EMBO, 11:1875, para los ADNc que cuando se expresan con los ADNc para la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana, dan origen a un receptor de la IL-12 de alta afinidad humana. Un pequeño número de clones de la biblioteca se hacen crecer en agrupaciones. El ADN se extrae de las agrupaciones de clones mediante métodos convencionales. El ADN extraído de las agrupaciones de clones se transfecta a continuación mediante métodos convencionales, junto con una pequeña cantidad de ADN de un plásmido que contiene el ADNc que codifica la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana, en células hospedadoras no humanas. Las células hospedadoras no humanas son de preferencia de mamíferos, tal como una célula COS. A continuación se añade IL-12 humana recombinante marcada, a las células hospedadoras no humanas previamente transfectadas como se describe más arriba y se determina la señal de unión de la agrupación. Este proceso se repite para cada agrupación. Las agrupaciones que muestran una señal de unión positiva para la IL-12 pueden ser descompuestas a continuación en agrupaciones más pequeñas y vueltas a ensayar de la manera anterior hasta que se selecciona un único clon que muestra una señal de unión positiva.

El ADN plasmídico del clon seleccionado se secuencia en las dos cadenas empleando métodos convencionales tales como un secuenciador ABI de ADN, automático, juntamente con una ADN polimerasa termostable y didesoxinucleótidos marcados con un colorante, como terminadores. Los alineamientos de la secuencia de aminoácidos pueden tener lugar como se describe por M. O. Dayhoff et al., en Methods Enzymology ("Métodos de Enzimología") 91:524 (1983) con la mutación de la matriz de datos, una penalización por ruptura de 6 y 100 ciclos aleatorios.

El ADN del clon seleccionado se cotransfecta a continuación, mediante métodos convencionales con ADN de un plásmido que contiene ADNc que codifica la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana en una célula hospedadora no human, de preferencia una célula de mamífero no humana tal como una célula COS o una célula Ba/F3.

Alternativamente, mediante métodos recombinantes convencionales, puede modificarse un plásmido por ingeniería genética, el cual contiene unidades de transcripción (promotor, ADNc, y regiones poliA) tanto para la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana como para la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana. El ADN del plásmido es transfectado mediante métodos convencionales en una célula hospedadora no humana, de preferencia una célula de mamífero no humana tal como una célula COS ó una célula Ba/F3.

De acuerdo con esta invención, puede aislarse el ADN que codifica la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, o un fragmento de la misma, el cual fragmento (1) tiene una baja afinidad de unión para la IL-12 humana y (2) cuando se compleja con la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana, forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión para la IL-12 humana.

Una secuencia aislada de ácidos nucleicos se refiere a un polímero de un ácido nucleico en forma de un segmento separado o de un componente de una construcción más grande de ácido nucleico, la cual ha sido derivada de un ácido nucleico aislado por lo menos una vez en forma substancialmente pura, es decir, libre de materiales endógenos de contaminación y en una cantidad o concentración que permita la identificación, manipulación, y recuperación de la secuencia y su componente de secuencias de nucleótidos mediante métodos bioquímicos estándar, por ejemplo, empleando un vector de clonación. Dichas secuencias, p. ej., ADN están de preferencia provistas en forma de un marco abierto de lectura no interrumpido por secuencias internas no traducidas, o intrones, los cuales están típicamente presentes en los genes eucarióticos. El ADN genómico que contiene las secuencias pertinentes podría también emplearse como una fuente de secuencias de codificación. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes en 5' ó 3' del marco abierto de lectura, en donde el mismo no interfiere con la manipulación o expresión de las regiones de codificación.

De acuerdo con esta invención, una célula de mamífero que tiene la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana o el complejo expresado sobre su superficie y el cual prolifera en respuesta a la IL-12 humana, es de utilidad para la determinación de la bioactividad IL-12. Por ejemplo, dichas células son útiles para la determinación tanto si un compuesto dado inhibe la actividad biológica de la IL-12 humana, como si es un agonista de la IL-12.

Además, a través de la capacidad de expresar la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana sobre una superficie celular de un mamífero no humano, podemos también expresar fragmentos de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, y puede determinar si estos fragmentos cuando se complejan con la subunidad beta 1 ó un fragmento activo del mismo, tiene las mismas propiedades y alta afinidad de unión para la IL-12 que el complejo intacto.

El ADN aislado que codifica la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, puede emplearse para obtener una proteína recombinante purificada la cual es soluble y la cual se une a la IL-12 con la misma afinidad que la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana. El ADN aislado que codifica la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana puede también emplearse para obtener una proteína recombinante purificada, la cual es soluble y la cual se une a la IL-12 con la misma afinidad que el complejo del receptor de la IL-12 humana recombinante de la proteína del receptor beta 1 con la proteína del receptor beta 2 [ver por ejemplo, Charnow, S. M. et al., Trends in Biotechnology "Tendencias en Biotecnología"), vol. 14 52-60 (1996)].

Estas proteínas recombinantes purificadas que se unen a la IL-12 humana, son útiles para la prevención o tratamiento de las condiciones patológicas causadas por un exceso o inapropiada actividad de células que poseen receptores de la IL-12, mediante la inhibición de la unión de la IL-12 a dichas células. Las condiciones patológicas causadas por un exceso de actividad de las células que poseen receptores de la IL-12 incluyen las disfunciones autoinmunológicas, tales como la artritis reumatoide sin limitación, enfermedad inflamatoria del intestino y la esclerosis múltiple.

Una proteína recombinante purificada, la cual es soluble, y la cual se une a la IL-12 con la misma afinidad que la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana es la fusión de un fragmento soluble de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana y una cadena pesada de Ig humana (tal como la IgG, IgM ó IgE, de preferencia la IgG) que tiene todos los dominios excepto el primer dominio de la región constante. Esta proteína recombinante que es homodimérica, se codifica mediante un polinucleótido quimérico el cual tiene 2 subsecuencias de ADN fusionadas en el marco de lectura. La primera subsecuencia de ADN en el extremo 5' del polinucleótido quimérico es una secuencia de ADN aislada que codifica un fragmento soluble de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana. La segunda subsecuencia de ADN, situada en el extremo 3' del polinucleótido quimérico, es una secuencia de ADN aislada que codifica todos los dominios de una cadena Ig pesada humana (de preferencia IgG) excepto el primer dominio de la región constante. La proteína recombinante deseada puede generarse por transfección del polinucleótido quimérico en una célula de mamífero no humano tal como una célula de ovario de hamster chino (CHO). La proteína recombinante expresada puede purificarse, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad de la proteína G.

Una proteína recombinante, purificada, la cual es soluble y la cual se une a la IL-12 con la misma afinidad que el complejo receptor de la IL-12 humana recombinante del receptor beta 1 con el receptor beta 2, se codifica mediante dos polinucleótidos quiméricos que tienen cada uno dos subsecuencias de ADN fusionadas en el marco de lectura. La primera subsecuencia de ADN del primer polinucleótido quimérico situado en el extremo 5' es una secuencia de ADN aislada que codifica un fragmento soluble de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana. La segunda subsecuencia de ADN del primer polinucleótido quimérico, situada en el extremo 3', es una secuencia aislada de ADN que codifica todos los dominios de una cadena pesada de Ig humana (por ejemplo IgG, IgM, IgE, de preferencia IgG) excepto el primer dominio de la región constante. La primera subsecuencia de ADN del segundo polinucleótido quimérico, situado en el extremo 5' es una secuencia aislada de ADN que codifica un fragmento soluble de la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana. La segunda subsecuencia de ADN del segundo polinucleótido quimérico, situado en el extremo 3', es una secuencia aislada de ADN que codifica todos los dominios de una cadena pesada de Ig humana (por ejemplo, IgG, IgM. IgE, de preferencia IgG)excepto el primer dominio de la región constante. La proteína recombinante deseada puede ser generada mediante cotransfección de dos polinucleótidos quiméricos en una célula de mamífero no humano, tal como una célula CHO. La proteína expresada puede purificarse por ejemplo, por cualquier método que permita la diferenciación de proteínas homodiméricas de proteínas he terodiméricas tales como por ejemplo, cromatografía de columna.

Además, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una proteína mencionada más arriba que comprende la expresión de un ácido nucleico mencionado más arriba en una célula hospedadora apropiada.

Las proteínas recombinantes, purificadas, son útiles para la prevención o tratamiento de condiciones patológicas causadas por un exceso o inapropiada actividad de células que poseen receptores de la IL-12, inhibiendo la unión de la IL-12 a dichas células.

"Purificadas" como se utiliza para definir la pureza de una proteína recombinante codificada por las secuencias de ADN combinadas descritas más arriba, o composiciones proteínicas de las mismas, significa que la proteína o composición proteínica está substancialmente libre de otras proteínas de origen natural o endógeno y contiene menos de aproximadamente 1% en peso de residuos contaminantes de proteína de los procesos de producción. Tales composiciones, sin embargo, pueden contener otras proteínas añadidas como estabilizadores, limpiadores, excipientes o coterapéuticos. Una proteína se purifica si se detecta por ejemplo, una banda única de proteína en un gel de poliacrilamida al teñir con plata.

Las proteínas recombinantes purificadas descritas más arriba pueden administrarse en tratamientos clínicos de disfunciones autoinmunológicas, tales como artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino y esclerosis múltiple, sin limitación.

Las proteínas recombinantes purificadas descritas más arriba pueden emplearse en combinación con otros antagonistas de citocinas tales como los anticuerpos al receptor de la IL-2, el receptor del TNF soluble (factor de necrosis tumoral), el antagonista de la IL-1, y similares, para tratar o prevenir los transtornos o condiciones de más arriba.

Adicionalmente la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen una proteína mencionada más arriba y un soporte farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden contener una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más antagonistas de citocinas.

Además, la invención se refiere al empleo de una proteína mencionada más arriba para la preparación de un medicamento. Estos compuestos son especialmente útiles para el tratamiento de la disfunción autoinmunológica.

Los márgenes de dosis para la administración de proteína recombinantes, purificadas, descritas más arriba pueden determinarse por los normalmente expertos en la técnica sin necesidad de una previa experimentación. En general, las dosificaciones apropiadas son aquellas que son lo bastante grandes para producir el efecto deseado, por ejemplo, el bloqueo de la unión de la IL-12 endógena con su receptor natural. La dosificación no debe ser tan grande como para producir efectos colaterales adversos tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas, y similares. Generalmente, la dosificación variará con la edad, condición, sexo y extensión de la enfermedad en el paciente, contraindicaciones, si es que existe alguna, tolerancia inmunológica y otras variables parecidas, para ser ajustadas por el médico del individuo. Las proteínas recombinantes, purificadas, descritas más arriba, pueden ser administradas parenteralmente por inyección o mediante perfusión gradual durante un tiempo. Pueden administrarse por vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o subcutánea.

Los márgenes de las dosis para la administración de proteínas del receptor de la IL-12 y fragmentos de las mismas pueden determinarse por los normalmente expertos en la técnica sin necesidad de una previa experimentación. En general, las dosificaciones apropiadas son aquellas lo suficientemente grandes para producir el efecto deseado, por ejemplo, el bloqueo de la unión de la IL-12 endógena con su receptor natural. La dosificación no debe ser tan grande como para causar efectos colaterales adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas y similares. Generalmente la dosificación variará con la edad, condición, sexo y extensión de la enfermedad en el paciente, contraindicaciones, si es que existe alguna, tolerancia inmunológica y otras variables parecidas, para ser ajustadas por el médico del individuo. El margen de dosis esperada es aproximadamente de 1 ng/kg/día a aproximadamente 10 mg/kg/ día. Las proteínas del receptor de la IL-12 y fragmentos de las mismas pueden administrarse parenteralmente por inyección o por perfusión gradual durante un tiempo. Pueden administrarse por vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o subcutáneamente.

Las preparaciones para la administración parenteral incluyen las soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son el propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Soportes acuosos incluyen el agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohol/acuosas, incluyendo la solución salina y los medios tamponados. Vehículos parenterales, incluyen la solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactado de Ringer, o aceites fijados. Los vehículos intravenosos incluyen rellenos fluidos y nutrientes, rellenos electrolitos tales como los basados en dextrosa de Ringer y similares. Conservantes y otros aditivos pueden también estar presentes tales como por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Ver, en general, Remington's Pharmaceutical Science ("Ciencia Farmacéutica de Remington") 16ª ed., Mack Eds., 1980.

Ensayos para determinar si un compuesto determinado bloquea la actividad de la IL-12:

Un aspecto de la invención es el empleo, o bien de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, o el complejo de esta invención como agente de exploración para productos farmacéuticos. De acuerdo con esta invención, podemos determinar si un compuesto dado bloquea la actividad de la IL-12 humana o actúa como un agonista de la IL-12.

Una actividad biológica de la IL-12 humana es la estimulación de la proliferación de células T y células NK activadas. La proliferación de células T activadas ocasiona respuestas inmunológicas inducidas por aloantígenos, tales como un rechazo alógrafo (tales como trasplantes de piel, riñones y corazón) y reacción del injerto contra el receptor en pacientes que han recibido transplantes de médula de hueso. Esta actividad biológica se la IL-12 humana está inducida por la unión de las moléculas de IL-12 humana a los receptores de la superficie de la célula sobre las células T activadas.

Un compuesto que bloquea la actividad de la IL-12 humana inhibiría la proliferación de las células T activadas y sería de utilidad para tratar o prevenir respuestas inmunológicas inducidas por aloantígenos.

Con el fin de determinar si un compuesto bloquea la actividad de la IL-12 humana, se proporciona primeramente una pluralidad de células que han expresado sobre su superficie, o bien la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana o un fragmento de la misma, o bien el complejo de la invención, las cuales células proliferan en presencia de la IL-12 humana. La proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana o un fragmento de la misma se une a la IL-12 humana con una baja afinidad de unión, pero cuando está complejada con la proteína del receptor beta 1 humana, forma un complejo que tiene una alta afinidad para la IL-12 humana. El complejo de la invención se une a la IL-12 humana con una alta afinidad de unión y comprende un complejo de proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana (1), ó un fragmento del mismo el cual cuando está complejado con la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión con la IL-12 humana, y (2) la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana o un fragmento de la misma el cual cuando se compleja con la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión con la IL-12 humana. En segundo término, las células se ponen en contacto con la IL-12 humana y el compuesto dado. En tercer lugar, se determina si la presencia del compuesto dado inhibe la proliferación de las células.

Con el fin de determinar si un compuesto es un agonista de la IL-12 humana, se proporciona primeramente una pluralidad de células que han expresado sobre su superficie, o bien la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 ó un fragmento de la misma, o el complejo de la invención, y las cuales células proliferan en presencia de la IL-12 humana. La proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana o un fragmento de la misma se une a la IL-12 humana con una baja afinidad de unión, pero cuando se compleja con la proteína del receptor beta 1 humano forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión para la IL-12 humana. El complejo de la invención se une a la IL-12 humana con una alta afinidad de unión y comprende un complejo de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana (1), ó un fragmento de la misma el cual cuando se compleja con una la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión con la IL-12 humana, y (2) la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana o un fragmento de la misma, el cual cuando se compleja con una proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, forma un complejo que tiene una alta afinidad de unión con la IL-12 humana. En segundo lugar, las células se contactan con la IL-12 humana o el compuesto dado. En tercer lugar se determina si la presencia del compuesto dado estimula la proliferación de las células.

Ejemplos de células capaces de expresar en su superficie el complejo, que las células proliferan en presencia de la IL-12 humana, incluye sin limitación, el PBMC activado con PHA, el kit de células 225/K6, y células Ba/F3 transfectadas con ADNc tanto para la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana como para la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana. Ejemplos de células capaces de expresar sobre su superficie la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana o un fragmento de la misma, las cuales células proliferan en presencia de la IL-12 humana, incluyen sin limitación, células Ba/F3 transfectadas con ADNc para la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana.

Con el fin de determinar si la presencia de un compuesto dado inhibe la proliferación de las células, se puede efectuar el siguiente procedimiento. Las células sensibles a la IL-12 humana, que han expresado sobre su superficie la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana o un fragmento de la misma, o el complejo del receptor de la IL-12 humana de la invención, se plaquean en los pocillos de una placa de microtitulación. A continuación se añade IL-12 humana a algunos pocillos de la placa de microtitulación (pocillos estándar) y se dejan reaccionar con las células. El compuesto que se ensaya se añade o bien antes o bien simultáneamente con la IL-12 a diferentes pocillos de la placa de microtitulación (pocillos de muestra) y se dejan reaccionar con las células. Cualquier disolvente empleado debe ser no tóxico para la célula. La proliferación de las células se mide a continuación por métodos ya conocidos, por ejemplo, marcando las células después del contacto con la IL-12 y el compuesto (como p. ej., por incorporación de timidina tritiada en el ADN de replicación), midiendo la acumulación de metabolitos celulares (como p. ej., el ácido láctico) y similares. La proliferación de las células de los pocillos estándar se compara con la proliferación de las células de los pocillos con las muestras. Si las células de los pocillos con las muestras proliferan significativamente menos que las células de los pocillos estándar, el compuesto bloquea la actividad de la IL-12.

Con el fin de determinar si la presencia del compuesto dado estimula la proliferación de las células, se puede efectuar el siguiente procedimiento. Las células sensibles a la IL-12 humana que han expresado sobre su superficie la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana o un fragmento de la misma, o el complejo del receptor de la IL-12 humana de la invención, se plaquean en los pocillos de una placa de microtitulación. A continuación se añade IL-12 humana a algunos pocillos de la placa de microtitulación (pocillos estándar) y se dejan reaccionar con las células. El compuesto que se ensaya se añade a diferentes pocillos de la placa de microtitulación (pocillos con muestras) y se dejan reaccionar con las células. Cualquier disolvente empleado debe ser no tóxico para la célula. La proliferación de las células se mide a continuación por métodos ya conocidos, por ejemplo, marcando las células después del contacto con el compuesto (como p. ej., por incorporación de timidina tritiada en el ADN de replicación), midiendo la acumulación de metabolitos celulares (como p. ej., el ácido láctico) y similares. La proliferación de las células de los pocillos estándar se compara con la proliferación de las células de los pocillos con las muestras. Si las células de los pocillos con las muestras proliferan significativamente más que las células que no fueron expuestas a la IL-12 humana, el compuesto es un agonista de la IL-12 humana.

En consecuencia, la presente invención se refiere a un método para la exploración de compuestos útiles para la inhibición de la actividad de la IL-12 ó compuestos útiles como agonistas de la actividad IL-12, el cual comprende el contacto de un compuesto del que se sospecha que inhibe la actividad de la IL-12 ó que es un agonista de la actividad de la Il-12, con una proteína mencionada más arriba, seguida por la detección del efecto biológico.

Los siguientes ejemplos se exponen a vía de ilustración, no como una limitación.

Ejemplos Materiales y métodos 1. Proteínas, plásmidos y cepas

IL-12 humana recombinante (U. Gubler et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88:4143) se obtuvo como se ha descrito anteriormente.

La IL-2 humana recombinante (H.W. Lahm et al., 1985, J. Chromatog, 326:357) se obtuvo como se ha descrito anteriormente.

El plásmido pEF-BOS se basa en un pUC 119 de espina dorsal y contiene el factor de estiramiento 1 alfa promotor para conducir la expresión de genes insertados al sitio BstXI (S. Mizushima and S. Nagata, Nucl. Acids Res., 1990, 18:5322).

El ADNc del receptor beta 1 de la IL-12 humana en el plásmido pEF-BOS se obtuvo como se describe en A. Chua et al., 1994, J. Immunology 153:128 y en la publicación de la solicitud de patente europea nº 0638644.

El electrocompetente E. coli DH-10B (S. Grant et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:4645) se obtuvo de Bethesda Research Laboratory (Bethesda, Maryland).

2. Marcado de la IL-2 humana con I^{125}

Se marca la IL-12 humana recombinante con I^{125} como sigue. Se disuelve Iodogen en cloroformo. Alícuotas de 0,05 mg de Iodogen se secan en 12 x 150 mm tubos de vidrio de borosilicato. Para el marcado por radio, 1,0 mCi de Na[I^{125}] se añadió al tubo de vidrio de borosilicato revestido de Iodogen, el cual contenía también 0,05 ml de tampón de Tris-yodinación (25 mM de Tris-HCl pH 7,5, 0,4 M de NaCl y 1 mM de EDTA) para formar una solución de I^{125}. La solución de I^{125} se activó incubando durante 6 minutos a temperatura ambiente. La solución de I^{125} activada se transfirió a un tubo que contenía 0,05 a 0,1 ml de IL-2 humana recombinante (31,5 mg) en tampón de Tris-yodación. La mezcla resultante de la solución de I^{125} activada y la IL-12 humana recombinante se incubó durante 6 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, se añadieron 0,05 ml de tampón stop de Iodogen (10 mg/ml de tirosina, 10% de glicerina en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS), pH 7,40), y se dejó reaccionar durante 3 minutos. La mezcla resultante se diluyó a continuación con 1,0 ml de tampón de Tris-yodación que contenía 0,25% de albúmina de suero bovino (BSA) y se aplicó a una columna desaladora de cromatografía Bio-Gel P10DG. La columna se eluyó con tampón de Tris-yodación que contenía 0,25% de BSA. Fracciones de 1 ml que contenían el pico eluido se combinaron con cantidades de IL-12 humana recombinante marcada. Las fracciones combinadas se diluyeron a 1x10^{8} cpm/ml con 1% de BSA en tampón Tris de yodación. La incorporación de I^{125} en la IL-12 recombinante humana se monitorizó mediante precipitación con ácido tricloroacético (TCA). El TCA precipitable radiactivamente (10% concentración final de TCA) estuvo típicamente en un exceso del 95% de la radiactividad total. La actividad radioespecífica de la IL-12 humana recombinante fue típicamente de 1000 a 2000 cpm/fmoles.

Ejemplo 1 Preparación de linfoblastos activados con PHA humana

Células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron de la sangre recogida de dadores sanos como se describe en Gately et al., J. Natl. Cancer Inst. 69, 1245 (1982). La sangre se recogió en jeringas heparinizadas, se diluyó con igual volumen de solución de sal equilibrada de Hank y se formó una capa sobre medio de separación de linfocitos (LSM® obtenido de Organon Teknika Corporation, Durham, North Carolina) en tubos. Los tubos fueron centrifugados a 2000 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células PBMC recogidas se sedimentaron por centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos a través de una almohadilla de 15 ml de 20% de sucrosa en solución de sal equilibrada de Hank. El sedimento de células PBMC se resuspendió en medio de cultivo de tejido (mezcla 1:1 de RPMI 1640 y medio de Eagle modificado por Dulbecco, suplementado con 0,1 mM de amino-ácidos no esenciales, 60 mg/ml de arginina HCl, 10 mM de tampón Hepes, 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, 0,05 mM de 2-mercaptoetanol, y 1 mg/ml de dextrosa) (TCM) más 5% de suero humano y se lavó dos veces con TCM.

Las células PBMC se activaron a continuación para formar los linfoblastos. En particular, se cultivaron 0,5-1x10^{6} células/ml en TCM más 5% de suero humano más 0,1% (v/v) PHA-P (Difco, Detroit, MI) durante 3 días a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2}.

Después de tres días, los cultivos de células se diluyeron 1:1 en volumen en TCM más 5% de suero humano y 50 U/ml de IL-2 humana recombinante para dar 95% de células T. Estas células se utilizaron para la preparación de una biblioteca de ADNc.

Ejemplo 2 Extracción y caracterización del ARN

Células PBMC aisladas como en el ejemplo 1, activadas con PHA durante 2-3 días, se recogieron y se extrajo el ARN total empleando isotiocianato de guanidina/fenol como describen P. Chomczynski y N. Sacchi, en Anal. Biochem., 162:156, 1987. Se aisló el poliA+ ARN a partir del ARN total mediante una adsorción masiva a perlas de látex oligo dT como se describe (K. Kuribayashi et al., Nucl. Acids Res. Symposium Series 19:61, 1988). El rendimiento en peso de esta purificación fue de aproximadamente 4% de poliA+ ARN.

Ejemplo 3 Biblioteca de ADNc

A partir de los anteriores poliA+ ARN, se estableció una biblioteca de ADNc en el vector de expresión mamífero pEF-BOS como sigue.

3 mg de poliA+ ARN se transcribieron inversamente en ADNc monocatenario empleando RNasaH menos transcriptasa inversa en presencia de a-P^{32}-dCTP, El ADNc monocatenario resultante se convirtió en ADNc de doble cadena terminado romo como describe U. Gubler y A. Chua, en Essential Molecular Biology ("Biología Molecular Básica"), volumen II, T.A. Brown, editor pp. 39-56, IRL Press 1991. Se ligaron empalmes BstXI (A. Aruffo y B. Seed, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 84, 8573, 1987) al ADNc de doble cadena resultante.

Moléculas de ADNc con un tamaño mayor de 800 pares de bases (bp) fueron seleccionadas mediante cromatografía de exclusión por tamaño, como sigue. Se rellenó una columna Sephacryl SF 500 (0,8 x 29 cm) por gravedad en 10 mM de Tris-HCl pH 7,8 - 1 mM de EDTA - 100 mM de acetato de Na. El ADNc radiactivo con los empalmes BstXI añadidos se aplicó a la columna y se recogieron fracciones de 0,5 ml. La distribución por tamaños del ADNc radiactivo se determinó efectuando una electroforesis sobre un pequeño alícuota de cada fracción sobre un gel con 1% de agarosa, secando el gel y visualizando el tamaño por exposición del gel en una película de rayos X. Las moléculas de ADNc mayores de 800 bp fueron seleccionadas por su tamaño, de esta manera.

Las moléculas de ADNc seleccionadas se reunieron y se concentraron mediante precipitación con etanol. Las moléculas de ADNc seleccionadas reunidas y concentradas fueron ligadas a continuación al plásmido pEF-BOS como sigue. El plásmido había sido sometido a restricción con BstXI y purificado con dos geles de agarosa 1% consecutivos. 300 ng del ADN del plásmido restringido y purificado, se ligaron a 30 ng de ADNc de tamaño seleccionado en 60 ml de tampón de ligación (50 mM de Tris-HCl pH 7,8-10 mM de Mg Cl_{2} - 10 mM de DTT - 1 mM de rATP - 25 mg/ml de BSA) a 15ºC durante la noche.

Al día siguiente, el plásmido ligado con el ADNc seleccionado por tamaño, se extrajo con fenol, se añadieron 6 mg de glicógeno mussel al extracto resultante, y los ácidos nucleicos fueron precipitados con etanol. El precipitado resultante se disolvió en agua y los ácidos nucleicos se precipitaron de nuevo con etanol, seguido de un lavado con 80% de etanol. Se centrifugó y se formó un sedimento de ácidos nucleicos precipitados y lavados. El sedimento se disolvió en 6 ml de agua. Alícuotas de 1 ml del sedimento disuelto se electroporaron a continuación en una cepa DH-10B de E. coli. Después de la electroporación de 5 alícuotas paralelos, se generó una biblioteca de aproximadamente 10 millones de recombinantes.

Ejemplo 4 Exploración de la expresión para ADNcs que codifican receptores de IL-12 de alta afinidad

La biblioteca se exploró de acuerdo con el método general de exploración de la expresión descrito por Hara y Miyajima, 1992, EMBO, 11:1875.

Se hicieron crecer grupos de aproximadamente 100 clones de E. coli a partir de la biblioteca anterior y se extrajo el ADN del plásmido de los grupos mediante métodos convencionales. Se plaquearon 2 x 10^{5} células COS por cada pocillo de 35 mm de cultivo. Las células COS se transfectaron con un cocktail de transfección empleando la técnica estándar del dextrano DEAE descrita en "Molecular Cloning, a Laboratory Manual" ("Clonación Molecular, un Manual de Laboratorio") 2ª edición, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ("Molecular Cloning") ("Clonación Molecular"). El cocktail de transfección contenía (1) 1 mg del ADN del plásmido extraído de los grupos de clones de E. Coli derivados de la librería de más arriba, y (2) 0,1 mg del ADN del plásmido pEF-BOS que contenía el ADNc del receptor beta 1 de la IL-12 humana.

3 días después de la transfección, los pocillos de las células COS se incubaron con 10 pM de IL-12 recombinante humana marcada (actividad específica = 1000-2000 cpm/fmoles) durante 90 minutos a temperatura ambiente. La IL-12 recombinante humana marcada se retiró, y la monocapa de células COS se lavó durante una hora tres veces con tampón de unión (RPMI 1640, 5% de suero fetal bovino (FBS), 25 mM de HEPES pH 7) para seleccionar además células COS que expresan alta afinidad solamente con los receptores de IL-12 (la unión del ligando IL-12 con los sitios de baja afinidad se redujo además a causa de los sitios de baja afinidad que tienen una velocidad de disociación más alta). En consecuencia, las monocapas de células fueron lisadas y contadas en un contador gamma. Después de explorar 440 grupos (que representan aproximadamente 44.000 clones), un grupo mostró consistentemente una señal de unión positiva (300 cpm sobre 100 cpm de fondo). A partir de este grupo, se aisló a continuación un único clon mediante una sib-selección. Este clon único (B5-10) contenía un inserto de ADNc de 3 kb que fue completamente secuenciado.

El inserto de ADNc del clon B5-10 fue incompleto, teniendo en cuenta la región de codificación de la proteínas puesto que no contenía un codon de interrupción en el marco de lectura. La biblioteca de ADNc del ejemplo 3 fue explorada de nuevo mediante técnicas de hibridación de ADN convencionales con el inserto de ADNc del clon B5-10, como se describe en Molecular Cloning ("Clonación Molecular") y por Grunstein y Hogness, 1975, Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 72:3961. Se aislaron así, clones adicionales, y a continuación se secuenciaron parcialmente. La secuencia de nucleótidos de un clon (nº 3) se encontró que (i) se solapa con el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos del clon B5-10, (ii) se extiende más allá de la secuencia de nucleótidos del clon B5-10, y (iii) contiene un codon de interrupción en el marco de lectura.

Esta secuencia compuesta de ADN se muestra en la figura 1 (SEQ ID NO:1). La secuencia de aminoácidos deducida para la proteína del receptor codificada se muestra en la figura 2. En base a la nomenclatura de Stahl y Yancopolous previamente sugerida, 1993, Cell 74:587, llamamos a esta cadena del receptor de la IL-2 humana nuevamente aislada, cadena beta 2.

Ejemplo 5 Ensayos de unión

Se transfectaron células COS (4-5x10^{7}) mediante electroporación empleando un BioRad Gene Pulser (250 mF, 250 voltios) con, o bien (1) 25 mg del ADN del plásmido B5-10 que expresa la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana recombinante, o bien (2) 25 mg del ADN del plásmido pEF-BOS que expresa la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana recombinante, ó bien (3) una mezcla de 12,5 mg del ADN del plásmido B5-10 que expresa la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana recombinante y 12,5 mg del ADN del plásmido pEF-BOS que expresa la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana recombinante. Las células electroporadas se plaquearon en una placa de cultivo de 600 cm^{2}, se recogieron después de 72 horas mediante raspado, se lavaron y se resuspendieron en tampón de unión.

Las células se ensayaron para determinar las afinidades de los receptores de la IL-12 para la IL-12 humana. En particular, se efectuó una unión de equilibrio de la IL-12 humana recombinante con las células y se analizó como describe R. Chizzonite et al., 1992, J. Immunol., 148:3117. Las células electroporadas (8x10^{4}) se incubaron con concentraciones crecientes de IL-12 humana recombinante marcada con I^{125} a temperatura ambiente durante 2 horas. Las incubaciones se efectuaron por duplicado o triplicado.

La radiactividad unida a la célula se separó de la I^{125}IL-12 marcada libre, por centrifugación de la mezcla de células electroporadas y la IL-12 humana recombinante marcada con I^{125} a través de 0,1 ml de una mezcla de aceites (mezcla 1:2 de Thomas Silicone Fluid 6428-R15 {A.H. Thomas} y Silicone Oil AR 200 {Gallard-Schlessinger}) a 4ºC durante 90 segundos a 10.000 x g para formar un sedimento de células en un tubo. El sedimento de células se retiró desde la parte superior del tubo en el cual se formó, y la radiactividad unida a la célula se determinó en un contador
gamma.

Los datos de unión al receptor se analizaron y las afinidades se calcularon de acuerdo con Scatchard empleando el método descrito por McPherson, J., 1985, Pharmacol. Methods, 14:213.

Ejemplo 6 Producción de la línea celular sensible a la IL-12

Células Ba/F3 del tipo salvaje, una célula pro-B de ratón dependiente de IL-3 (Palacios, R. et al., 1985, Cell ("Célula") 41:727) y células Ba/F3 que expresan la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana (Chua, A., et al., 1994, Immunology 153:128), se cotransfectaron con (1) 80 mg de ADN del plásmido pEF-BOS que expresa la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana recombinante y (2) 8 mg de un plásmido que expresa un gen de resistencia a la higromicina (Giordano, T.J., et al., 1990, Gene 88:285) mediante electroporación empleando un BioRad Gene Pulser (960 mF, 400 voltios).

Todas las células fueron resuspendidas a una densidad de 2 x 10^{5} células viables/ml en un medio de crecimiento de RPMI 1640, 10% de FBS, glutamina (2 mM), penicilina G (100 U/ml), estreptomicina (100 mg/ml) y 10% de medio condicionado de la línea celular WEHI-3 (ATCC nº TIB 68, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland). La línea celular WEHI-3 es una fuente de IL-3. Las células resuspendidas se incubaron a continuación a 37º con 5% de CO_{2} durante 120 horas.

Las células se seleccionaron por su capacidad para crecer en (1) el medio de crecimiento de más arriba en presencia de 1 mg/ml de hiogromicina ó (2) una IL-12 que contiene el medio de crecimiento RPMI 1640, 10% de FBS, glutamina (2 mM), penicilina G (100 U/ml), estreptomicina (100 mg/ml), y varias concentraciones (10, 50 ó 250 ng/ml) de IL-12 humana.

Las células Ba/F3 que expresan la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana transfectadas con ADN del plásmido pEF-BOS que expresa la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana recombinante se hicieron crecer en el medio de crecimiento que contenía la IL-12, demostrando que la coexpresión de la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana y la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, confería sensibilidad a la IL-12 humana, a las células Ba/F3.

Adicionalmente, las células Ba/F3 que expresan la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, crecen en el medio de crecimiento que contiene IL-12, demostrando que la expresión de la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana confería sensibilidad a la IL-12 humana, a las células Ba/F3.

Ejemplo 7 Efecto de la IL-12 humana sobre las líneas celulares Ba/F3 transfectadas

Células Ba/F3 (1) que expresan la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana, (2) que expresan la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, ó (3) que coexpresan la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana y la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, se cultivaron en el medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS, 100 U/ml de penicilina G, 100 mg/ml de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina a 2 x 10^{4} células/pocillo en microplacas Costar 3596 de fondo plano, durante 24 horas. A continuación, se añadieron varias diluciones de IL-12 humana como muestra la figura 6, a las microplacas y las células se incubaron durante 42 horas a 37ºC en una atmósfera humidificada de 5% de CO_{2} en aire. A continuación, se añadieron a cada pocillo, 50 ml de H^{3}-timidina y 10 mCi/ml en medio de cultivo. Los cultivos fueron además incubados durante 6 horas a 37ºC. Seguidamente se recogieron los contenidos de los cultivos sobre filtros de fibra de vidrio por medio de un cosechador de células. Se midió la incorporación de H^{3}-timidina empleando un contador de centelleo líquido. Todas las muestras se ensayaron por cuadruplicado.

Ejemplo 8 Análisis secuencial de los clones de ADNc del receptor de la IL-2, y proteína del receptor de la IL-12 codificada

La proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, compuesta de 862 aminoácidos y un peso molecular calculado de 97231, tenía las siguientes características: péptido señal N-terminal, dominio extracelular, dominio transmembránico y cola citoplasmática. El péptido señal N-terminal hidrofóbico clásico se pronostica que tiene 23 aminoácidos de longitud. La escisión del péptido señal tiene lugar la mayor parte de las veces después de los aminoácidos Ala, Ser, Gly, Cys, Thr, Gln (von Heijne, G., 1986, Nucl. Acids Research, 14:4683). Para el receptor de la IL-12, la escisión podría tener lugar después de Ala23 en la secuencia mostrada en la figura 2, dejando una proteína madura de 839 aminoácidos en la escisión en Ala23. El dominio extracelular del receptor se pronostica que abarca la región desde el terminal C del péptido señal hasta el aminoácido nº 622 en la secuencia mostrada en la figura 2. El análisis de la hidrofibicidad muestra que el área desde el aminoácido nº 623 al 646 es hidrofóbica, como sería de esperar para una región transmembránica de anclaje. Los residuos cargados de interrupción de la transferencia, pueden encontrarse en el terminal N así como en el terminal C de esta área transmembránica pronosticada. El dominio extra-celular del receptor tiene una longitud de 599 aminoácidos y contiene 9 sitios pronosticados de glicosilación unidos al N. La porción citoplasmática tiene 215 aminoácidos de longitud (residuos aminoácidos 647
a 862).

Otros análisis de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 2 muestra que la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana es un miembro de la superfamilia de receptores de la citocina, en virtud de los motivos de secuencia [Cys 132 - - - Cys143TW] y [W305SKWS]. Comparando la secuencia mostrada en la figura 2 con todos los miembros de la superfamilia aplicando el programa ALIGN muestra que la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana tiene la homología más alta con el gp130. La región citoplasmática de la cadena beta 2 del receptor de la IL-12 contiene los motivos 1 y 2 del box encontrados en otros miembros de la superfamilia de receptores de citocina, así como tres residuos de tirosina. La fosforilación de las tirosinas se asocia normalmente con la señalización del receptor de la citocina; la presencia de estos residuos de tirosina infravalora la importancia de la cadena beta 2 del receptor de la IL-12 en la formación de un receptor funcional de la IL-12. La cadena beta1 del receptor de la IL-2 no contiene ningún residuo de tirosina en su cola citoplasmática.

Ejemplo 9 Análisis de los ensayos de unión

Los resultados de los ensayos de unión se muestran en la figura 5.

Como se muestra en las figuras 5A y 5B, la IL-12 humana se une al receptor beta 1 ó beta 2 de la IL-12 recombinante, sólo con una afinidad aparente de aproximadamente 2-5 nM. Los datos de unión están descritos por un modelo de receptor de sitio único, correspondiente al componente de baja afinidad del receptor de IL-12 funcional encontrado en las células PBMC activadas con PHA (R. Chizzonite et al., 1992, J. Immunol., 148:3117; B. Desai et al., 1992, J. Immunol., 148:3125).

En contraste con estos resultados como se muestra en la figura 5C, tanto los sitios de unión a la IL-12 de alta como de baja afinidad se generaron por cotransfección de células COS con plásmidos beta 1 y beta 2 del receptor de IL-12. En este caso, los datos de unión fueron descritos por un modelo de sitio de dos receptores, con afinidades de 50 pM y 5 nM.

Ejemplo 10 Efecto de la IL-12 humana sobre las líneas celulares Ba/F3 transfectadas

Los resultados del ensayo de proliferación para el efecto de la IL-12 humana sobre las células Ba/F3 (1) que expresan la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana, (2) que expresan la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, y (3) que coexpresan la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana, se muestran en la figura 6.

Las células que están transfectadas con ADNc tanto para la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana como para la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, responden a la estimulación mediante la IL-12 humana mediante la proliferación de manera dependiente de la dosis.

Adicionalmente, las células que están transfectadas con ADNc para la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, responden a la estimulación mediante la IL-12 humana mediante la proliferación de una manera dependiente de la dosis.

En consecuencia el ADNc aislado (clon nº B5-10, SEQ ID NO:1) que codifica una proteína transmembránica tipo I, representa un segundo componente del receptor de la IL-12 (IL-12R beta 2) que se encuentra en las células T humanas normales. Las cadenas beta 1 y beta 2 se unen individualmente cada una con la IL-12 solamente con baja afinidad
(Kd = 2-5 nM). Después de la coexpresión de beta 1 y beta 2, se observan dos sitios de afinidad, con valores de Kd de 50 pM y 5 nM.

Las células Ba/F3 que expresan la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana o coexpresan la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 humana y la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, son sensibles a la IL-12 humana.

Los términos y expresiones que han sido empleados se utilizan como términos de descripción y no de limitación, y no existe ninguna intención al emplear estos términos y expresiones, de excluir cualquier equivalente de características mostradas y descritas o porciones de las mismas.

Claims (25)

1. Una proteína del receptor beta 2 de la interleucina-12 (IL-12) de baja afinidad de unión, o un fragmento de la misma, la cual

(a)

tiene una afinidad de unión para la IL-12 desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 nM, y

(b)

cuando se compleja con la proteína del receptor beta 1 de la IL-12, forma un complejo que tiene una afinidad de unión con la IL-12 desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 100 pM,

en donde

la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 está codificada por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO:1 ó un ácido nucleico que tiene una secuencia que hibrida en condiciones restrictivas con la cadena complementaria de la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO:1; y

la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 está codificada por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO:3 ó un ácido nucleico que tiene una secuencia que hibrida en condiciones restrictivas con la cadena complementaria de la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO:3.

2. La proteína de la reivindicación 1, la cual comparte por lo menos el 80% de la secuencia homólogamente con el polipéptido el cual está codificado mediante la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO:1.

3. La proteína de la reivindicación 2, en donde la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 tiene la SEQ ID NO:2 ó formas alélicas o variantes de la misma.

4. Una proteína codificada por un ácido nucleico el cual comprende dos subsecuencias, en donde una de dichas subsecuencias codifica un fragmento de una proteína del receptor beta 2 de una interleucina-12 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, la cual es soluble, y la otra de dichas subsecuencia codifica todos los dominios de la región constante de la cadena pesada de Ig distintos del primer dominio de dicha región
constante.

5. Un complejo capaz de unirse con la IL-12 con una alta afinidad, que comprende la proteína del receptor beta 2 de la interleucina-12 (IL-12) ó un fragmento de la misma como se define en una cualquiera de las reivindicaciones
1 - 4, complejado con la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 como se define en la reivindicación 1, ó un fragmento de la misma, el cual

(a)

tiene una afinidad de unión para la IL-12 desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 nM, y

(b)

cuando se compleja con la proteína del receptor beta 2 de la IL-12, forma un complejo que tiene una afinidad de unión con la IL-12 desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 100 pM.

6. El complejo de la reivindicación 5, en donde la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 está codificada o bien por la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO:3 ó bien por un ácido nucleico que tiene una secuencia que hibrida en condiciones restrictivas con la cadena complementaria de la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO:3.

7. El complejo de la reivindicación 6, en donde la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 comparte por lo menos el 80% de la secuencia homólogamente con el polipéptido el cual está codificado por SEQ ID NO:3.

8. El complejo de la reivindicación 7, en donde la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 tiene la SEQ ID NO:4 ó formas alélicas o variantes de la misma.

9. Una proteína codificada por un primer y un segundo ácido nucleico, en donde el primer ácido nucleico comprende dos subsecuencias, en donde una de dichas subsecuencias codifica un fragmento de una proteína del receptor beta 2 de la interleucina-12 (IL-12) como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el cual es soluble, y la otra de dichas subsecuencias codifica todos los dominios de la región constante de la cadena pesada de la IG humana distintos del primer dominio de dicha región constante, y el segundo ácido nucleico comprende dos subsecuencias en donde una de dichas subsecuencias codifica un fragmento de la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, el cual es soluble, y la otra de dichas subsecuencias codifica todos los dominios de la región constante de la cadena pesada de la Ig humana distintos del primer dominio de dicha región constante.

10. Una proteína o complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, la cual es soluble.

11. Ácidos nucleicos que codifican una proteína del receptor beta 2 de la interleucina-12 (IL-12) de baja afinidad de unión, o un fragmento de la misma, de acuerdo con la reivindicación 1.

12. El ácido nucleico de la reivindicación 11, en donde el ácido nucleico codifica la proteína del receptor beta 2 de la IL-12 humana, que tiene la SEQ ID NO:1.

13. Un vector que comprende un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12.

14. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 11 - 12 operablemente empalmado con las secuencias de control reconocidas por la célula hospedadora.

15. Una célula hospedadora transformada con un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

16. La célula hospedadora de la reivindicación 15, en donde la proteína o el complejo se expresa sobre su superficie.

17. La célula hospedadora de la reivindicación 17, en donde la célula hospedadora prolifera en presencia de la
IL-12.

18. Una célula hospedadora transformada con un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína definida en la reivindicación 1, y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 como se ha definido en la reivindicación 6 ó 7 ó con un vector único que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína definida en la reivindicación 1 y un ácido nucleico que codifica la proteína del receptor beta 1 de la IL-12 como se ha definido en la reivindicación 6 ó 7.

19. Un procedimiento para la preparación de una proteína o complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, la cual comprende la expresión de un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12 y opcionalmente la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO:3 ó un ácido nucleico que tiene una secuencia que hibrida en condiciones restrictivas con la cadena complementaria de la secuencia del ácido nucleico SEQ ID NO:3 en una célula hospedadora adecuada.

20. Una composición farmacéutica que comprende una proteína o complejo como se ha reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, ó como se ha obtenido por el procedimiento de la reivindicación 19, y un soporte farmacéuticamente aceptable.

21. La composición farmacéutica de la reivindicación 20, la cual comprende además una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más antagonistas de citocinas.

22. Una proteína o complejo como se ha reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, ó como se ha obtenido mediante el procedimiento de la reivindicación 19, para su empleo en medicina.

23. El empleo de una proteína o complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, ó como se ha obtenido mediante el procedimiento de la reivindicación 19, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una disfunción autoinmunológica.

24. Un método para la exploración de compuestos útiles para la inhibición de la actividad de la IL-12, el cual comprende,

(a) puesta en contacto de un compuesto del que se sospecha que inhibe la actividad de la IL-12, con una proteína o complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, ó como se obtiene mediante el procedimiento de la reivindicación 19, y

(b) detección del efecto de inhibición.

25. Un método para la exploración de compuestos útiles como agonistas de la IL-12, el cual comprende

(a) puesta en contacto de un compuesto del que se sospecha que es un agonista de la IL-12, con una proteína o complejo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, ó como se obtiene mediante el procedimiento de la reivindicación 19, y

(b) detección de un efecto agonista.