ES2243942T3 - Isoforma intracelular del antagonista del receptor de la interleuquina. - Google Patents
Isoforma intracelular del antagonista del receptor de la interleuquina.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN NUEVO ANTAGONISTA DE INTERLEUKINA-1 ACTIVO TANTO CONTRA IL-1A COMO IL-1B, UNA NUEVA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA EL ANTAGONISTA IL-1 Y EL METODO PARA OBTENER UN ANTAGONISTA IL-1 MEDIANTE LA TECNICA DE ADN RECOMBINANTE; TAMBIEN SE DESCRIBE EL USO PROFILACTICO, TERAPEUTICO Y DIAGNOSTICO DE DICHO NUEVO ANTAGONISTA DE IL-1 EN PATOLOGIAS DERIVADAS DE LA PRODUCCION DE IL-1.
Description
Isoforma intracelular del antagonista del
receptor de la interleuquina-1.
La presente invención es del campo de la
biotecnología. Se describe un nuevo antagonista de la
interleuquina-1
(IL-1) activo frente a ambas IL-1a e IL-1B, una nueva secuencia de DNA que codifica el antagonista de IL-1 y un método para obtener un antagonista de IL-1 por técnicas de DNA recombinante. Se describen también los usos profilácticos, terapéuticos y diagnósticos de tal antagonista nuevo de IL-1 en patologías que derivan de la producción de IL-1.
(IL-1) activo frente a ambas IL-1a e IL-1B, una nueva secuencia de DNA que codifica el antagonista de IL-1 y un método para obtener un antagonista de IL-1 por técnicas de DNA recombinante. Se describen también los usos profilácticos, terapéuticos y diagnósticos de tal antagonista nuevo de IL-1 en patologías que derivan de la producción de IL-1.
Existen dos genes distintos que codifican la
interleuquina-1 (IL-1), denominados
IL-1a e IL-1B, que codifican la
proteína IL-1a (IL-1\alpha) e
IL-1B (IL-1\beta),
respectivamente.
Las interleuquinas IL-1a e
IL-1B son citoquinas pleiotrópicas que, a pesar de
que sus secuencias muestran una escasa homología, ejercen una
variedad de efectos similares en diferentes tejidos y actúan en
muchas patologías humanas, en particular en la respuesta inmune del
organismo y en procesos inflamatorios.
Ambas proteínas tienen un peso molecular de
aproximadamente 17,5 kDa y son sintetizadas como una molécula
precursora de mayor tamaño que tiene un peso molecular de
aproximadamente 31 kDa.
Las IL-1s son citoquinas
inflamatorias y pirógenas potentes que tienen normalmente efectos
beneficiosos, pero que pueden tener también efectos sumamente malos
para la salud del organismo.
Pueden, por ejemplo, participar en la patogénesis
de síntomas de patologías autoinmunes como el lupus eritematoso y,
en particular, están implicadas como mediadores que provocan daño en
los tejidos, como por ejemplo en la artritis reumatoide.
Muchos de los efectos biológicos de
IL-1 son similares a los que pueden observarse
durante un episodio séptico. Estudios recientes demostraron que la
administración intravenosa de IL-1 en dosis de 1 a
10 ng/kg da lugar a fiebre, somnolencia, anorexia, mialgia
generalizada, artralgia y cefalea.
Puesto que IL-1 tiene actividades
biológicas pleiotrópicas, muchas de las cuales influyen
negativamente en el organismo, los poderosos efectos de
IL-1 deberían estar bajo un estricto control
fisiológico.
La síntesis de IL-1 se inhibe por
citoquinas antiinflamatorias, prostaglandinas y glucocorticoides, y
la existencia de múltiples niveles de inhibición de
IL-1 indica la necesidad de un estricto control de
este mediador.
IL-1 es la única citoquina para
la que se ha descrito hasta el momento un polipéptido antagonista
para el receptor: el tercer componente conocido de la familia de
IL-1 es el antagonista para el receptor de
IL-1 (IL-1ra).
Los tres componentes (IL-1a,
IL-1B, IL-1ra) reconocen y se unen
al mismo receptor en la superficie celular (IL-1R);
la unión de IL-1a e IL-1B a
IL-1R trasmite una señal, mientras que
IL-1ra no lo hace.
Hay dos tipos de receptores de
IL-1, denominados IL-RI e
IL-RII. IL-1ra es un polipéptido que
se une a IL-1RI, y con menos afinidad a
IL-1RII, sin actividad agonista alguna.
La producción de IL-1ra se induce
en diferentes tipos celulares, incluyendo fagocitos mononucleares,
células polimorfonucleares (PMN) y fibroblastos, por IgG,
citoquinas y productos bacterianos.
Hasta el momento se han identificado y clonado
dos formas moleculares de IL-1ra: 1) la
IL-1ra secretada (sIL-1ra) contiene
una secuencia líder clásica de 25 aminoácidos que proporciona una
proteína madura de 152 aminoácidos; 2) la IL-1ra
intracelular (icIL-1ra) no tiene una secuencia
líder, lo que hace predecir que esta proteína se mantiene
intracelular. Haskill et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1991,
88: 3681-85 describe las dos formas del
antagonista del receptor de IL-1.
sIL-1ra e
icIL-1ra se generan a partir del mismo gen. Los
productos de transcripción de icIL-1ra se originan a
partir de un sitio de iniciación alternativo y del corte y empalme
de un primer exón alternativo en un sitio aceptor de corte y
empalme interno localizado en el primer exón de
sIL-1ra. Las proteínas previstas son, por tanto,
idénticas excepto en sus extremos NH_{2}, donde los primeros 21
aminoácidos de sIL-1ra están sustituidos por 4
aminoácidos en icIL-1ra.
La expresión de productos de transcripción que
codifican sIL-1ra e icIL-1ra está
regulada de diferente manera. La importancia biológica de
icIL-1ra no está clara todavía.
\newpage
Teniendo en cuenta que IL-1 está
implicada en la patogénesis de muchas enfermedades, resulta evidente
la necesidad de tener medicamentos disponibles útiles para limitar
los efectos malos para la salud de IL-1.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar un antagonista de IL-1 activo frente a
ambas IL-1a e IL-1B y frente a una
combinación de las mismas.
Un objetivo más de la presente invención es
proporcionar una secuencia de DNA que codifique un antagonista de
IL-1 y un método para obtener tal antagonista nuevo
por la técnica de DNA recombinante.
Otro objetivo más de la presente invención es
proporcionar el antagonista en forma sustancialmente purificada, con
objeto de que sea adecuado para usar en composiciones farmacéuticas
activas en patologías que requieren la inhibición de
IL-1.
Otros objetivos y ventajas de la invención
resultarán evidentes en la siguiente descripción.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona una proteína sustancialmente pura que tiene actividad
antagonista frente a, al menos, una entre la
interleuquina-1\alpha y la
interleuquina-\beta, y que comprende la secuencia
de aminoácidos de la SEC ID No. 12. La proteína puede comprender la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID No. 14.
En un segundo aspecto, la presente invención
proporciona DNA aislado que codifica una proteína que tiene la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID No. 14. El DNA puede tener la
secuencia de la SEC ID No. 13.
La invención proporciona también un vector que
comprende el DNA del segundo aspecto y una célula hospedante
transfectada con el DNA del segundo aspecto. La célula hospedante
puede ser de origen mamífero.
La invención proporciona también un procedimiento
para obtener un antagonista de IL-1 que
comprende:
- a.
- cultivar una célula hospedante conforme a la invención; y
- b.
- recoger y aislar la proteína purificada.
La invención proporciona también (i) la proteína
del primer aspecto de la invención para usar en medicina, y (ii) el
uso de una proteína del primer aspecto de la invención en la
preparación de un compuesto farmacéutico para usar en el
tratamiento profiláctico y/o terapéutico de artritis reumatoide,
choque séptico, leucemia mielomonocítica aguda, reacción
inmunológica de un trasplante frente al hospedante, síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA) o colitis ulcerosa.
La Figura 1 describe la secuencia de DNA y la
secuencia de la proteína, para la porción que no es común, de
icIL-1raII (SEC ID No. 8 y SEC ID No. 9) comparada
con las de la sIL-1ra clásica
(icIL-1raI; SEC ID No. 6) y de la
sIL-1ra (SEC ID No. 4 y SEC ID No. 5), y describe
además la secuencia de DNA y la proteína codificada para la porción
de IL-1ra en común (SEC ID No. 13 y SEC ID No.
14).
La Figura 2 describe el análisis de
RT-PCR de la expresión de icIL-1raII
en diferentes tipos celulares.
La Figura 3 describe el análisis de transferencia
Western de la icIL-1raII recombinante.
La figura 4 describe los efectos de
icIL-1raII en la expresión inducida por
IL-1 de E-selectina en células
endoteliales.
La SEC ID No. 1 presenta la secuencia de un
oligonucleótido denominado IRA5 para usar en
RT-PCR.
La SEC ID No. 2 presenta la secuencia de un
oligonucleótido, correspondiente a los nucleótidos
60-79 del cDNA de la B-actina, para
usar en RT-PCR.
La SEC ID No. 3 presenta la secuencia de un
oligonucleótido inverso, complementario a los nucleótidos
430-449, para usar en RT-PCR.
La SEC ID No. 4 presenta la secuencia de DNA que
codifica sIL-1ra para la porción que no es
común.
La SEC ID No. 5 presenta la secuencia de
aminoácidos de sIL-1ra para la porción que no es
común.
La SEC ID No. 6 presenta la secuencia de DNA que
codifica tres aminoácidos de icIL-1raI para la
porción que no es común.
La SEC ID No. 7 presenta los tres aminoácidos de
icIL-1raI para la porción que no es común.
La SEC ID No. 8 presenta la secuencia de DNA que
codifica icIL-1raII para la porción que no es
común.
La SEC ID No. 9 presenta la secuencia de
aminoácidos de icIL-1raII para la porción que no es
común.
La SEC ID No. 10 presenta la secuencia de DNA que
codifica IL-1ra para la porción en común. Con
respecto a las cuestiones relacionadas con el programa "Patentin
EPO", para la preparación de las secuencias se añadió un
nucleótido G en la primera posición de la secuencia, para permitir
la codificación del primer aminoácido Glu y, además, para evitar la
formación de un codón de terminación en el lado interno de la
secuencia.
La SEC ID No. 11 presenta la secuencia de
aminoácidos de IL-1ra para la porción en común.
La SEC ID No. 12 presenta la secuencia de 21
aminoácidos que representan un fragmento de
icIL-1raII que no es común con las otras
IL-1ras.
La SEC ID No. 13 presenta la secuencia de DNA que
codifica la icIL-1raII completa.
La SEC ID No. 14 presenta la secuencia de
aminoácidos de la icIL-1raII completa.
El nuevo antagonista de IL-1 de
la invención se generó insertando en el marco de lectura del DNA que
codifica la icIL-1ra una nueva secuencia de 63 pares
de bases (pb) entre el primer exón específico de
icIL-1ra y el sitio aceptor interno del primer exón
de sIL-1ra.
Mediante experimentos de RT-PCR,
los presentes inventores encontraron que este nuevo producto de
transcripción se expresa en monocitos y fibroblastos activados y en
células polimorfonucleares (PMN).
La expresión en células COS reveló que este nuevo
antagonista es mayormente intracelular y tiene un peso molecular
(PM) de aproximadamente 25 kDa en SDS-PAGE.
El nuevo antagonista recombinante muestra
actividad inhibidora de IL-1.
En la presente solicitud, por razones de claridad
y facilidad, la icIL-1ra conocida actualmente se
indica como icIL-1ra de tipo I
(icIL-1raI), mientras que el nuevo antagonista de la
presente invención se define como icIL-1ra de tipo
II (icIL-1raII).
Ejemplos de patologías en las que el nuevo
antagonista conforme a la invención puede utilizarse de manera
ventajosa para uso profiláctico, terapéutico o diagnóstico son
artritis reumatoide, choque séptico, leucemia mielomonocítica aguda,
reacción inmunológica de un trasplante frente al hospedante,
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), colitis ulcerosa y
todas las enfermedades autoinmunes en general.
Una cantidad farmacológicamente activa de
icIL-1raII puede administrarse a personas que tienen
un alto riesgo de desarrollar patologías que requieren la
inhibición de IL-1, o a personas que ya presentan
patologías como la sepsis.
Un ejemplo de la categoría anteriormente citada
son pacientes que esperan una operación quirúrgica.
Puede usarse cualquier vía de administración
compatible con el agente activo, pero se prefiere particularmente la
administración parenteral porque permite, en tiempos cortos,
efectos sistémicos.
Por esta razón, es preferible la administración
de una inyección intravenosa en una sola vez justo antes, durante o
después de la operación quirúrgica. La dosis de
icIL-1raII a administrarse depende en base a las
prescripciones médicas conforme a la edad, peso y la respuesta
individual del paciente.
La dosificación puede estar entre 0,05 y 30 mg/kg
de peso corporal, y la dosis preferida es entre 0,1 y 10 mg/kg de
peso corporal.
La composición farmacéutica para uso parenteral
puede prepararse en forma inyectable, comprendiendo el agente activo
y un vehículo adecuado. Los vehículos para administración
parenteral son bien conocidos en la técnica y comprenden, por
ejemplo, agua, solución salina, solución Ringer y dextrosa.
El vehículo puede contener cantidades más
pequeñas de excipientes, con objeto de mantener la estabilidad e
isotonicidad de la solución.
La preparación de las citadas soluciones puede
llevarse a cabo conforme a las modalidades normales y,
preferiblemente, el contenido de icIL-1raII estará
comprendido entre 1 mg/ml y 10 mg/ml.
La presente invención se ha descrito con
referencia a realizaciones específicas, pero el contenido de la
descripción comprende todas las modificaciones y sustituciones que
puedan producirse por una persona experta en la técnica sin
sobrepasar el significado y propósito de las reivindicaciones.
En la siguiente parte se describirán algunos
métodos para obtener la invención, aunque pueden usarse materiales y
métodos equivalentes. Los siguientes ejemplos son, por tanto,
puramente ilustrativos y no limitantes de la invención.
Los siguientes reactivos comercialmente
disponibles se usaron para el cultivo y separación de las células:
solución salina libre de pirógeno y agua destilada para uso
clínico; medio RPMI 1640; medio DMEM; medio M199;
L-glutamina; Percoll;
Ficoll-Hipaque; suero fetal de ternera recogido
asépticamente; suplemento de crecimiento de células endoteliales
(ECGS), preparado a partir de cerebro bovino; Heparina.
Todos los reactivos contenían menos de 0,125
EU/ml de endotoxina, tal como se comprobó mediante el ensayo de
productos de lisis de amebocitos de Limulus.
Los monocitos y PMN circulantes humanos se
separaron de la sangre periférica de donantes sanos por
centrifugación en un gradiente discontinuo (46% para los monocitos y
62% para PMN) de Percoll isoosmótico (285 mOsm), tal como se
describe en Colotta F., Peri G., Villa SA., Mantovani A., Rapid
killing of actinomycin D treated tumor cells by human mononuclear
cells. J. Immunol. 132:936, 1984. Las células se recuperaron de la
interfase, se lavaron dos veces en solución salina y se
resuspendieron en el medio.
La recuperación de PMN y monocitos fue mayor del
90%, y la pureza mayor del 98%, tal como se evaluó mediante examen
morfológico de células citocentrifugadas teñidas. El medio de
cultivo celular usado de manera rutinaria para los PMN y monocitos
era RPMI 1640 con L-glutamina 2 mM y FCS al 10%.
Las células endoteliales (EC) humanas se
obtuvieron de venas umbilicales, y se cultivaron como se describe
con detalle en la bibliografía (Allavena P., Paganin C.,
Martín-Padura I., Peri G., Gaboli M., Dejana E.,
Marchisio PC., Mantovani A., Molecules and structures involved in
the adhesion of natural killer cells to vascular endothelium, J.
Exp. Med., 173:439, 1991).
Las células confluentes en el 2º-5º paso de
incubación, mantenidas en medio M199 con FCS al 10% suplementado con
ECGS (50 \mug/ml) y Heparina (100 \mug/ml) se usaron de manera
rutinaria.
Las células COS se cultivaron en medio DMEM con
FCS al 10% y las células fibroblásticas 8387 en medio RPMI 1640 con
FCS al 10%.
Después del tratamiento apropiado, las células se
examinaron con respecto al mRNA de IL-1ra o la
proteína IL-1ra como se describe más abajo.
El RNA total se extrajo mediante el método del
isotiocianato de guanidinio con modificaciones de poca
importancia.
La RT-PCR se realizó como se
describe en Colotta F., Polentarutti N., Sironi M., Mantovani A., J.
Biol. Chem., 267:18278, 1992.
En términos breves, 1 \mug del RNA total se
sometió a transcripción inversa en tampón de la transcriptasa
inversa (MgCl_{2} 5 mM, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM;
pH 8,3) con hexámeros aleatorios 2,5 mM, 1 mM de cada
desoxinucleótido trifosfato, 1 unidad/ml de inhibidor de RNasa, y
2,5 unidades/ml de transcriptasa del virus de la leucemia murina de
Maloney (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT).
Las muestras se incubaron durante 10 min a 25ºC y
seguidamente a 42ºC durante 45 min. A continuación, se añadió la
reacción de cDNA con un par de cebadores específicos diseñados para
amplificar los cDNAs que codifican icIL-1raI o
icIL-1raII y, como control interno,
B-actina humana.
La amplificación se llevó a cabo en MgCl_{2} 2
mM, KCl 50 mM, 0,2 M de cada desoxinucleótido trifosfato, 2,5
unidades/100 ml de polimerasa Taq (Perkin Elmer Cetus) y 4 mg/ml de
cada cebador específico (véase más abajo). La amplificación (30
ciclos) se llevó a cabo en un ciclador térmico automatizado (Perkin
Elmer Cetus) a 95ºC, a 55ºC y a 72ºC durante 1,5 min a cada
temperatura.
Los productos amplificados se pasaron a través de
un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio al 1% junto con los
estándares de peso molecular (Boehringer Mannheim, Mannheim,
Alemania).
Los oligonucleótidos se sintetizaron mediante el
método de la fosforamidita. Las secuencias de los oligonucleótidos
usados para amplificar selectivamente icIL-1ra eran
idénticas a las descritas en Haskill S., et al., Natl. Acad.,
USA, 88:3681, 1991.
En particular, los autores usaron los
oligonucleótidos GM397 (indicado aquí como IRA 1) y GM368 (IRA
4).
Para la amplificación de
icIL-1raII, los autores usaron IRA 4 e IRA 5 (SEC ID
No. 1), que reconoce específicamente el exón extra descrito aquí,
incluido en la secuencia de icIL-1raII.
Para la amplificación de
B-actina, el oligonucleótido directo se presenta en
la SEC ID No. 2, correspondiente a los nucleótidos
60-79 del cDNA de la B-actina. El
oligonucleótido inverso se presenta en la SEC ID No. 3,
complementario a los nucleótidos 430-449. Los
productos de amplificación se subclonaron (TA Cloning System,
Invitrogen, San Diego, CA) y secuenciaron mediante el método
didesoxi de terminación de la cadena.
Los cDNAs que contenían 32 pb de la región 5' no
traducida, el marco de lectura abierto completo y 6 pb (incluyendo
el codón de terminación) de la región 3' no traducida de ambas
icIL-1raI e icIL-1raII, se
obtuvieron por RT-PCR con los oligonucleótidos IRA 4
e IRA 5 como se ha detallado anteriormente, y seguidamente se
ligaron otra vez en el vector de expresión pSF5. La fidelidad de la
transcripción inversa y la amplificación se verificó por
secuencia-
ción.
ción.
Los plásmidos que contenían el cDNA en la
orientación correcta se purificaron en un gradiente de CsCl y
seguidamente se utilizaron para transfectar células COS por el
método del precipitado de calcio, tal como se describe en Sambrook
J., et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
Después de dos días, los sobrenadantes de los
cultivos y los productos de lisis de las células sonicadas se
examinaron por ELISA o inmunotransferencia, tal como se detalla más
abajo. Se usó un plásmido vacío (no transfectado) como control.
Se usó un ensayo ELISA comercial (Amersham,
Buckinghamshire, UK) que identifica ambas sIL-1ra e
icIL-1ra. Para el análisis de transferencia Western,
se usaron antisueros policlonales de dos conejos y de una
cabra.
Las muestras de los productos de lisis de las
células COS y los sobrenadantes se sometieron a una electroforesis
SDS-PAGE al 12,5% y seguidamente se transfirieron a
un filtro de nitrocelulosa (Stratagene, La Jolla, CA, USA).
La incubación con los anticuerpos primarios y
secundarios se llevó a cabo conforme a protocolos estándar. El
anticuerpo primario era anticuerpo policlonal de conejo
anti-IL-1ra.
El anticuerpo secundario era una fracción de
cabra anti-inmunoglobulina de conejo, unida a
peroxidasa de rábano (Amersham). Las bandas de las fracciones de
proteína inmunorreactiva se revelaron por un procedimiento basado en
la quimioluminiscencia (ECL Detection, Amersham), conforme a las
instrucciones del fabricante.
Las EC confluentes cultivadas en placas de 96
pocillos (Falcon) se incubaron durante 30 minutos con una cantidad
de productos de lisis de las células COS transfectadas (véase más
arriba), correspondiente a 25 a 100 ng de IL-1ra
recombínate (bien icIL-1raI o
icIL-1raII), tal como se evaluó mediante un ensayo
ELISA específico (Amersham).
Como control, se usó paralelamente una cantidad
igual de productos de lisis de COS obtenidos de células sometidas a
una transfección simulada. A continuación, las EC se expusieron
durante 6 horas a 0,1-1 ng/ml de
IL-1B recombinante humano. La detección de la
expresión de E-selectina se realizó con un ensayo
ELISA sobre EC adherentes, con el anticuerpo monoclonal
anti-E-selectina
BB1G-E2 como anticuerpo primario y un antisuero de
conejo anti-Ig de ratón conjugado con peroxidasa de
rábano como anticuerpo secundario. La OD de las muestras se
determinó detectando las placas con un espectrofotómetro (Flow) a
una longitud de onda de 405 nm.
Se diseñaron cebadores oligonucleotídicos
específicos (indicados como IRA 1 e IRA 4 en la Fig. 1) con objeto
de obtener la secuencia codificante completa de
icIL-1ra (Fig. 1) por RT-PCR. Los
productos amplificados de PMN humanas se subclonaron y
secuenciaron.
Además de la secuencia previamente conocida de
icIL-1ra, los inventores aislaron varios clones
cuyas secuencias eran idénticas a la secuencia codificante de
icIL-1ra publicada, con la notable excepción de una
secuencia extra de 63 pb entre los nucleótidos 132 y 133 de la
secuencia de icIL-1ra. Dados los límites
exón-intrón descritos de icIL-1ra,
la secuencia extra está insertada entre el primer exón sin
secuencia líder de icIL-1ra y el sitio aceptor
interno del primer exón de sIL-1ra (Fig. 1).
La secuencia de aminoácidos deducida se muestra
en la Fig. 1. La nueva proteína (denominada en lo sucesivo como
icIL-1ra de tipo II) tiene los primeros tres
aminoácidos del extremo NH_{2} en común con la
icIL-1ra clásica (icIL-1ra de tipo
I), seguidos de una nueva secuencia de 21 aminoácidos. El resto de
las dos proteínas es idéntico.
Curiosamente, la unión con el sitio aceptor
interno del primer exón de sIL-1ra siempre generaba,
para ambas sIL-1ra e icIL-1raI, y
para icIL-1raII, el mismo resto de aminoácido, esto
es, ácido glutámico (Fig. 1).
La característica más sorprendente de la
secuencia extra de aminoácidos insertada es la presencia de siete
restos de glicina, seis de los cuales son consecutivos. Los restos
de glicina están flanqueados en ambos lados por restos de ácido
glutámico. icIL-1raII consiste en 180
aminoácidos.
El patrón hidrófilo global de
icIL-1raII es similar al de
icIL-1raI, aun faltándole un péptido líder
hidrófobo en el extremo NH_{2}-terminal.
Para identificar los productos de transcripción
de icIL-1raII, el análisis de
RT-PCR se realizó con un par de oligonucleótidos
específicamente diseñados (IRA 5 e IRA 4, Fig. 1), con un producto
amplificado esperado de 33 pb.
Como se muestra en la Fig. 2, los productos de
transcripción que codificaban icIL-1raII resultaron
detectables en fibroblastos activados con PMA, IL-1
y TNF. En monocitos tratados con LPS, resultó evidente una banda
tenue pero detectable.
También las PMN, bien sin tratar o activadas
(Fig. 2) mostraron una banda muy tenue del tamaño esperado.
La especificidad de los productos amplificados
indicados en la Fig. 2 se confirmó por subclonación y
secuenciación.
Se transfectaron células COS con la secuencia de
DNA que codifica icIL-1raII y, a modo de
comparación, con la que codifica icIL-1raI. A
continuación, los productos de lisis de las células y los
sobrenadantes se examinaron por transferencia Western.
El antisuero policlonal usado en estos
experimentos reconocía igualmente bien a icIL-1raII
e icIL-1raI (Fig. 3). La mayoría, si no todas, de
las icIL-1raII e icIL-1raI se
encontraron en los productos de lisis de las células.
La icIL-1raI recombinante migró
como una banda predominante de 22 kDa, mientras que la
icIL-1raII mostró una masa de aproximadamente 25
kDa.
La icIL-1raII recombinante se
examinó con respecto a la actividad inhibidora de
IL-1. Con este propósito los autores eligieron la
expresión inducida por IL-1 de
E-selectina en células endoteliales, porque este
ensayo es sensible (inducción detectable con 100 pg/ml de
IL-1, o menos) y rápido (6 horas de incubación con
IL-1).
Los productos de lisis de las células COS
sometidas a una transfección simulada no redujeron
significativamente la actividad de IL-1.
icIL-1raII no tenía actividad
agonista.
Como se muestra en la Fig. 4, la
icIL-1raII recombinante inhibía la actividad de
IL-1 de un modo dependiente de la dosis.
Estos datos proporcionan evidencia de que
icIL-1raII es, en efecto, un inhibidor de
IL-1.
Los inventores describen una nueva forma
molecular de icIL-1ra. La nueva molécula se genera
por la inserción de 63 pb entre el primer exón sin secuencia líder
de icIL-1ra y el sitio aceptor interno del primer
exón de sIL-1ra.
Puesto que la proteína resultante es parcialmente
idéntica a la icIL-1ra clásica, con la excepción de
una secuencia extra de 21 aminoácidos localizada en el extremo
NH_{2}-terminal de la molécula, los inventores
sugieren denominar esta nueva forma como IL-1ra de
tipo II, refiriéndose a la secuencia de icIL-1ra
clásica como icIL-1ra de tipo I.
Los experimentos de RT-PCR
demostraron que los productos de transcripción de
icIL-1raII son inducibles en monocitos y
fibroblastos. La icIL-1raII recombinante expresada
en células COS tenía un PM aparente de aproximadamente 25 kDa y una
actividad inhibidora de IL-1 comparable a la
ejercida por icIL-1raI expresada en las mismas
condiciones experimentales.
Los productos de transcripción que codifican
icIL-1ra y sIL-1ra se generan a
partir del mismo gen, por medio del uso de un corte y empalme
diferencial. icIL-1ra se genera por un comienzo
alternativo de la transcripción de un exón insertado en un sitio
aceptor interno del primer exón que contiene la secuencia líder de
sIL-1ra.
Los resultados obtenidos por los inventores
sugieren una nueva organización del gen IL-1ra, en
la que un exón extra se localiza entre el primer exón de,
respectivamente, la icIL-1ra y
sIL-1ra clásicas. El uso de este nuevo exón genera
una molécula polipeptídica que, aun faltándole un péptido señal,
difiere de icIL-1raI en su extremo
N-terminal por la inserción de 21 aminoácidos,
mientras que retiene la capacidad inhibidora frente a
IL-1.
El uso de un corte y empalme alternativo para
generar moléculas de IL-1ra diferentes se ha visto
que está altamente regulado. Los productos de transcripción de
icIL-1raII se indujeron por IL-1,
TNF y ésteres de forbol en fibroblastos, y por LPS en monocitos. En
los fibroblastos, se encontró que los ésteres de forbol inducían
selectivamente los productos de transcripción de
icIL-1ra, mientras que IL-1 y TNF
inducían ambos mRNAs de sIL-1ra e
icIL-1ra. En los monocitos, IL-13,
que aumentaba ambos productos de transcripción de
sIL-1ra e icIL-1raI, no consiguió
inducir icIL-1raII.
Finalmente, las PMN, en las que
sIL-1ra e icIL-1ra se expresan e
inducen constitutivamente, expresaron muy pocos productos de
transcripción, tal como se advirtió por RT-PCR. En
términos generales, estos datos indican que los mecanismos que
inducen el corte y empalme diferencial que genera las tres formas
de IL-1ra se regulan de manera diferente en
respuesta a señales externas.
La secuencia de aminoácidos de la secuencia extra
descrita aquí es sorprendente en cuanto a que contiene siete restos
de glicina, seis de los cuales son consecutivos.
Las secuencias ricas en glicina están presentes
en moléculas con diferentes actividades biológicas, incluyendo el
receptor de aclaración natriurética atrial, el gen homeobox HOX11,
los filamentos intermedios queratinas y proteínas nucleares
implicadas en la unión del centrómero o el corte y empalme de
RNA.
Aparte de los restos de glicina, sin embargo, no
resultó evidente una homología obvia entre estas proteínas e
icIL-1raII en la secuencia de aminoácidos que
flanquea las regiones ricas en glicina.
El sistema IL-1 muestra un
extraordinario nivel de complejidad, que consiste en dos agonistas,
dos receptores, uno de los cuales es un inhibidor de
IL-1, y un antagonista del receptor, para el que
podrían existir al menos tres formas moleculares diferentes,
teniendo en cuenta los resultados obtenidos.
Aunque la importancia biológica de las formas
intracelulares de IL-1ra queda por establecerse
claramente, los datos presentados aquí indican que, mediante el
corte y empalme alternativo, pueden generarse dos formas diferentes
de icIL-1ra en respuesta a estímulos externos
seleccionados, con extremos N-terminales
diferentes.
La existencia de niveles de control múltiples y
complejos de IL-1 indica el absoluto requerimiento
de un control fisiológico estricto del potencial inflamatorio de
esta citoquina.
Figura
1
La parte superior de la Figura 1 muestra las
secuencias de DNA y proteína representadas específicamente en
sIL-1ra, icIL-1raI e
icIL-1raII. La parte inferior de la Figura 1
muestra la secuencia en común entre las tres formas de
IL-1ra.
\newpage
Las secuencias enteras para cada molécula se
generan, por tanto, por la unión de cada porción específica con la
secuencia en común. Por claridad, la secuencia de DNA de
icIL-1ra comienza desde el nucleótido 91 de la
secuencia 5' no traducida publicada, y sólo se presentan 6 pb de la
secuencia 3' no traducida.
La secuencia en común de IL-1ra
comienza con el sitio aceptor interno localizado en el primer exón
de sIL-1ra, correspondiente al nucleótido 133 de la
secuencia de icIL-1raI completa y al nucleótido 88
de la secuencia de sIL-1ra completa.
Las flechas indican los oligonucleótidos directos
(IRA 1 e IRA 5) e inverso (IRA 4) usados para el análisis de
RT-PCR, como se describe en el texto. El
oligonucleótido IRA 5 reconoce sólo el DNA de
icIL-1raII.
Figura
2
Los RNAs de fibroblastos 8387 (panel A),
monocitos (B) y PMN (C) se sometieron a transcripción inversa. Cada
reacción de síntesis de DNA se dividió seguidamente en dos muestras,
una de las cuales se amplificó con los oligonucleótidos IRA 5
(directo) e IRA 4 (inverso) para la detección de los productos de
transcripción de icIL-1raII, y la otra se amplificó
con oligonucleótidos específicos de B-actina (véase
la sección de Materiales y Métodos).
Los productos amplificados se examinaron
seguidamente a través de un gel de agarosa teñido con bromuro de
etidio. Los productos amplificados correspondientes a la
B-actina se presentan en la parte izquierda del
marcador estándar, y los productos amplificados correspondientes a
icIL-1raII (a la derecha) se indican con una
flecha. La especificidad de estas bandas se confirmó por
subclonación y secuenciación.
Figura
3
Los productos de lisis de las células COS
transfectadas con los DNAs que codifican icIL-1raI
(2) ó icIL-1raII (3) o con un vector vacío que no
contiene tal DNA(1), se examinaron por inmunotransferencia
con un anticuerpo policlonal de conejo
anti-IL-1ra. Se indican los
estándares de peso molecular.
Figura
4
Las células endoteliales se trataron con 0,1 ó 1
ng/ml de IL-1B humana, con o sin
25-100 ng/ml de icIL-1raII, o
cantidades equivalentes de los productos de lisis de células COS
obtenidos de las células que fueron sometidas a una transfección
simulada por medio de un vector vacío, tal como se explica en
detalle en la sección de Materiales y Métodos.
Después de 6 horas de incubación, las células
endoteliales se examinaron con respecto a la expresión de
E-selectina mediante un ensayo ELISA realizado sobre
células adherentes.
Los datos presentados son porcentajes de la
expresión de E-selectina inducida por
IL-1 en el control.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 14 JOHN B. GORSIRAWEG
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: CURACAO
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ANTILLAS HOLANDESAS
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): NINGUNO
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 599-9639300
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 599-9614129
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTAGONISTA DE LA INTERLEUQUINA-1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (epo).
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No. 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..25
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Oligonucleótido para RT-PCR denominado IRA5"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGACTTGTA TGAAGAAAGGA GGTGG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No. 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..20
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Oligonucleótido para RT-PCR correspondiente a 60-79 de B-actina"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCTCGTCG TCGACAACGG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No. 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Oligonucleótido inverso para RT-PCR complementario a 430-449"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATAGACAAC GTACATGGCT G
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No. 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 87 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 24..86
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..87
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Secuencia de sIL-1ra que no es común"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No. 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Ile Cys Arg Gly Leu Arg Ser His Leu
Ile Thr Leu Leu Leu}
\sac{Phe Leu Phe His Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No. 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 33..41
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..42
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Secuencia de IL-1ra intracelular de tipo I que no es común"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No. 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Ala Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No. 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 105 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 33..104
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..105
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/nota= "Secuencia de IL-1ra intracelular de tipo II que no es común"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No. 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Ala Leu Ala Asp Leu Tyr Glu Glu Gly Gly
Gly Gly Gly Gly Glu}
\sac{Gly Glu Asp Asn Ala Asp Ser Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No. 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 474 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..468
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..474
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Sec. en común de IL-1ra; se añadió un nucleótido G en la primera posición por razones del software, de tal forma que el primer codón codifica un resto Glu y de tal forma que se evita la creación de un codón de terminación en la región interna de la sec."
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No. 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 156 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No. 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Una porción de IL-1ra intracelular de tipo II que no es común"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Asp Leu Tyr Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly
Gly Gly Gly Glu Asp}
\sac{Asn Ala Asp Ser Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No. 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 579 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 34..573
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..579
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/nota= "IL-1ra intracelular de tipo II"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID No. 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 180 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No. 14:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Una proteína sustancialmente pura que tiene
actividad antagonista frente a, al menos, una entre la
interleuquina-1\alpha y la
interleuquina-1\beta y que comprende la secuencia
de aminoácidos de la SEC ID No. 12.
2. Una proteína tal como se reivindica en la
reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID No. 14.
3. DNA aislado que codifica una proteína que
tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No. 14.
4. DNA aislado tal como se reivindica en la
reivindicación 3, que tiene la secuencia de la SEC ID No. 13.
5. Un vector que comprende el DNA tal como se
reivindica en la reivindicación 3 o la reivindicación 4.
6. Una célula hospedante transfectada con el
vector reivindicado en la reivindicación 5.
7. Una célula hospedante tal como se reivindica
en la reivindicación 6 que es de origen mamífero.
8. Un procedimiento para obtener un antagonista
de IL-1 que comprende:
- a.
- cultivar una célula hospedante tal como se reivindica en la reivindicación 6 o la reivindicación 7; y
- b.
- recoger y aislar la proteína purificada.
9. Una proteína tal como se reivindica en la
reivindicación 2 para usar en medicina.
10. El uso de una proteína tal como se reivindica
en la reivindicación 2 en la preparación de un compuesto
farmacéutico para usar en el tratamiento profiláctico y/o
terapéutico de artritis reumatoide, choque séptico, leucemia
mielomonocítica aguda, reacción inmunológica de un trasplante
frente al hospedante, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA)
o colitis ulcerosa.
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