KR100237936B1

KR100237936B1 - 인터루킨-1 길항제

Info

Publication number: KR100237936B1
Application number: KR1019970701931A
Authority: KR
Inventors: 프란세스코 코로타; 마르타 뮤지오; 알베르토 몬토바니
Original assignee: 레지날드 쇼트버그 에스. 안토니우스-소도; 어플라이드 리서치 시스템스 에이알에스 홀딩 엔.브이.
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 2000-01-15
Also published as: EE9700090A; NO971624L; NO320494B1; KR970706391A; EP0786002B1; CA2202470A1; HK1002659A1; BR9509317A; CN100363053C; CA2202470C; EE03697B1; IT1270662B; CN1224707C; CN1679919A; JPH10509306A; ITMI942097A0; MX9702616A; WO1996012022A1; EP0786002A1; ES2243942T3

Abstract

IL-1ra와 IL-1B에대한 신규한 인터루킨 길항물질과 IL-1 길항물질을 인코드하는 신규한 DNA 서열 그리고 재조합 DNA 기술에의해 IL-1 길항물질을 수득하는 방법에 대해 상술하고; IL-1 생산으로인한 질병에 대한 신규한 IL-1 길항물질의 예방, 치료, 진단에 이용되는 용도에 대해 상술하고 있다.

Description

인터루킨-1 길항제{INTRACELLULAR ISOFORM OF THE INTERLEUKIN-1 RECEPTOR ANTAGONIST}

단백질 IL-1a와 IL-1B를 각 인코드하는 IL-1a와 IL-1B로 명명된 인터루킨-1(IL-1)을 인코드하는 별개의 두 유전자가 있다.

인터루킨 IL-1a와 IL-1B는 이들의 서열은 비록 유사정도가 약하지만 다양한 사이토킨인데 즉, 많은 다른 조직에 유사한 효과를 발휘하고 많은 인간의 질병 특별하게는 유기체의 면역반응과 염증 반응에 작용한다.

이들 두가지 단백질은 분자량이 17.5KDa이고 약 31KDa 큰 분자량을 가지는 전구물질로 합성된다.

IL-1은 평상시에는 유기체에서 유익한 효과를 가지나 심각한 건강상의 문제를 가지는 강력한 염증유발물질과 발열성 사이토킨이다.

예를들면, 홍반성 낭창과 같은 자가면역 질환 증상 병인과 관계하고 특히, 이것들은 류마티스 관절염과 같은 조직의 파괴를 유도하는 중간물질에 관계하는 것으로 보인다.

IL-1의 많은 생물학적인 효과는 패혈증에서 보이는 것과 유사하다. 최근 연구에서는 1 내지 10ng/kg의 정맥 투여로 발열, 수면, 식욕감퇴, 일반적인 말라리아, 관절통 그리고 두통을 일으키는 것으로 나타났다.

IL-1은 유기체에 나쁜 영향을 주는 많은 생물학적인 활성을 가지기 때문에 IL-1의 강력한 효과는 엄격한 생리학적 컨트롤을 받아야 한다.

IL-1 합성은 항-염증반응 사이토킨, 프로스타글란딘과 글루코콜티코이드에의해 저해될 수 있고 IL-1의 다양한 수준의 저해가 있는 것은 이와 중간물질의 엄격한 제어가 필수적이라는 것을 말한다.

IL-1은 최근까지 설명된 수용체의 길항물질 폴리펩티드에대한 유일한 사이토킨이고; 최근까지 IL-1 종에서 제 3의 공지된 상보물질은 IL-1 수용체(IL-1ra)의 길항물질이다.

이들 세 가지 성분(IL-1a, IL-1B, IL-1ra) 모두 세포면(IL-1R)에서 동일한 수용체를 길항하고 결합하며; IL-1a와 IL-1B는 신호를 전달하는 IL-1R에 결합하지만 IL-1ra는 결합하지는 않는다.

IL-1R1과 IL-1RII로 명명된 두가지 형태의 IL-1 수용체가 있다. IL-1ra은 IL-1RI에 결합하는 단백질이고 어떠한 반발 활성을 가지지 않으며 IL-1RII에는 친화성이 약하다.

IL-1ra는 IgG, 사이토킨과 박테리아 산물에 의해 단핵 식세포, 다핵형 세포(PMN) 그리고 섬유아세포를 포함하는 상이한 세포형에서 유도된다.

지금까지 IL-1ra의 두가지 분자형이 확인되었고 클론되었다; 1) 분비된 IL-1ra(sIL-1ra)는 152아미노산을 가지는 완전 단백질을 만드는 25 아미노산의 고유 리더 서열을 포함하고; 2) 세포내 IL-1ra(icIL-1ra)은 리더 서열이 없기 때문에 이단백질은 세포내에 남아 있음을 알 수 있다.

sil-1ra와 icIL-1ra는 동일한 유전자에서 유래된다. icIL-1ra 전사체는 또다른 시작 위치에서 만들어지고 또다른 제 1 액손을 잘라내어 sIL-1ra의 제 1 액손이 위치하는 접목 수용체 부위로 만든다. 따라서 예측한 단백질은 이들의 NH₂단부를 제외하고는 동일한데 이때, sIL-1ra의 제 1 아미노산은 icIL-1ra의 4개 아미노산으로 대채된다.

sIL-1ra와 icIL-1ra를 인코드하는 전사체의 발현은 상이하게 조잘된다. icIL-1ra의 생물학적인 중요성은 아직 밝혀지지 않았다.

IL-1이 많은 질병에 연관된 것을 고려하면, IL-1의 건강에 나쁜 영향을 제한하는데 유익한 약물이 필요하다는 결론을 얻게된다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 IL-1a와 IL-1B에 활성이 있는 IL-1 길항물질과 이들의 복합물질에도 길항활성이 있는 물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한 IL-1 길항물질을 인코드하는 DNA 서열과 재조합 DNA <기술을 사용하여 이와 같은 신규한 길항물질을 만드는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적은 IL-1 저해를 해야하는 질병용 제약학적 조성물에서 이용할 수 있는 정제된 IL-1 길항물질을 제공한다.

본 발명의 목적과 추가 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 이해될 것이다.

본 발명은 생명공학 분야에 관계한다. IL-1a 와 IL-1B에 길항 활성이 있는 신규한 인터루킨-1, IL-1 길항물질을 인코드하는 신규 DNA 서열, 재조합 DNA 기술에의해 IL-1 길항물질을 수득하는 방법에 대해 상술하고 있다. 또한, 이와 같은 신규한 IL-1 길항물질이 IL-1 생산과 관계한 질병의 예방적, 치료요법적 그리고 진단 용도에 대해서도 상술하고 있다.

도 1은 고유의 sIL-1-1ra(icIL-1-1ra; 서열 6;SEQ ID NO;6)과 sIL-1-1ra(서열 4;SEQ ID NO;4 그리고 서열 5;SEQ ID NO;5)의 것과 비교하여 icIL-1raII의 특별한 DNA 서열과 단백질 서열부분(서열 8;SEQ ID NO;8과 서열 9;SEQ ID NO;9)을 나타내고 IL-1ra의 DNA서열과 공통적인 인코드된 단백질(서열 3;SEQ ID NO;3)을 나타낸다.

도 2는 다른 세포형에서 icIL-1raII 발현의 RT-PCR분석을 설명한다.

도 3은 재조합 icIL-1raII의 웨스턴 블랏 분석을 설명한다.

도 4는 내피세포에서 IL-1 유도된 E-셀레틴의 발현에서 icIL-1raII의 효과를 나타낸다.

서열 1(SEQ ID NO;1)는 RT-PCR에 이용된 IRA5이라는 올리고뉴클레오티드의 서열을 나타낸다.

서열 2(SEQ ID NO;2)는 RT-PCR에 이용된 B-액틴 cDNA의 69-70 뉴클레오티드에 상응하는 올리고뉴클레오티드의 서열을 나타낸다.

서열 3(SEQ ID NO;3)는 RT-PCR에 이용된 뉴클레오티드 430-449에 상보적인 역순 올리고뉴클레오티드의 서열을 나타낸다.

서열 4(SEQ ID NO;4)는 공통적인 부분이 아닌 sIL-1ra 부분을 인코드하는 DNA 서열을 나타낸다.

서열 5(SEQ ID NO;5)는 공통적인 부분이 아닌 sIL-1ra 부분을 인코드하는 아미노산 서열을 나타낸다.

서열 6(SEQ ID NO;6)는 공통적인 부분이 아닌 icIL-1rasI 부분의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열 7(SEQ ID NO;7)는 공통적인 부분이 아닌 icIL-1raI 부분의 세 개 아미노산을 나타낸다.

서열 8(SEQ ID NO;8)는 공통적인 부분이 아닌 icIL-1raII 부분을 인코드하는 DNA 서열을 나타낸다.

서열 9(SEQ ID NO;9)는 공통적인 부분이 아닌 icIL-1raII 부분을 인코드하는 아미노산 서열을 나타낸다.

서열 10(SEQ ID NO;10)는 공통적인 부분 IL-1ra 부분을 인코드하는 DNA 서열을 나타낸다. 서열을 만들기위해 "Patentin EPO" 프로그램에 관련된 문제에 대해서, 제 1 아미노산 Glu를 인코드하기위해 그리고 서열의 내부에 멈춤 코드가 만들어지는 것을 막기위해 G 뉴클레오티드 서열을 서열의 제 1 위치에 첨가한다.

서열 11(SEQ ID NO;11)는 공통적인 IL-1ra 부분의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열 12(SEQ ID NO;12)는 다른 IL-1ras와는 공통적인 부분이 아닌 icIL-1raII 부분을 나타내는 21개 아미노산인코드하는 아미노산 서열을 나타낸다.

서열 13(SEQ ID NO;13)는 완전한 icIL-1raII을 인코드하는 아미노산 서열을 나타낸다.

서열 14(SEQ ID NO;14)는 완전한 icIL-1raII의 아미노산 서열을 나타낸다.

이와 같은 신규한 IL-1 길항물질은 icIL-1ra의 제 1 특정 액손과 sIL-1ra의 제 1 액손의 내부 수용 위치사이에 icIL-1ra의 새로운 63 염기쌍(bp) 서열을 인코드하는 DNA 를 삽입하여 만들어진다.

RT-PCR 실험으로, 이와 같은 신규한 전사체는 활성화된 단세포, 섬유아세포 그리고 다핵형 세포(PMN)에서 발현된다는 것을 알았다.

COS 세포에서 발현에서는 이와 같은 신규의 길항물질은 대부분 세포내에 있고 SDS-PAGE로 분자량이 약 25KDa이라는 것을 알았다.

이와 같은 신규한 재조합 길항물질은 IL-1 저해 활성을 나타낸다.

본 출원에서 명확하고 쉽게 설명하기위해 현재 공지된 icIL-1ra는 icIL-1ra(icIL-1raI)와 같이 나타내는 반면, 본 발명에서 설명하고자 하는 신규한 길항물질은 icIL-1ra typeII(icIL-1raII)로 나타낸다.

본 발명에 따른 신규한 길항물질이 예방, 치료 또는 진단 목적으로 유익하게 이용될 수 있는 예시적인 병으로는 류마티스 관절염, 패혈증 쇼크, 급성 골수단세포 백혈병, 숙주에 저항하는 이식시 면역 반응, 후천성 면역 결핍증(AIDS), 궤양성 대장염 그리고 일반적인 자가면역 질환등이 된다.

본 발명의 구체예는 IL-1의 저해가 필요한 질병의 발생위험이 있거나 이미 <패혈증과 같은 질병이 걸린 사람에게 약리학적 효과량의 icIL-1raII를 투여하는 벙법을 제시한다.

전술한 범주에는 외과적 수술을 기다리는 환자도 포함한다.

활성물질이 양립할 수 있는 투여경로를 이용하나, 단기간내에 전신 효과를 가질 수 있도록 비-경구 투여가 특히 적합하다.

이와 같은 이유로 외과술 바로전, 수술동안에, 또는 수술뒤에 정맥용 거환으로 투여하는 것이 적합하다. 투여될 icIL-1raII량은 환자의 나이, 체중, 개별 반응 등에 따라 의학적인 처방에 기초하여 달라질 수 있다.

비-경구용도의 제약학적 조성물은 활성성분과 적절한 담체로 구성된 주사가능한 형이될 수 있다. 비-경구 투여용 담체는 본 기술 분야에 공지의 것이고 예를 들면, 물, 염용액, 링거액 그리고 덱스트로즈로 구성될 수 있다.

담체에는 용액의 안정성과 등장성을 유지시키기위해 소량의 부형체를 포함할 수 있다.

통상의 방식에 따라 전술한 용액을 만들 수 있는데 적절하게는 1㎎/㎖ 내지 10㎎/㎖ icIL-1raII을 포함한다.

본 발명은 다음의 특정 구체예로 설명되나 청구범위의 요지와 목적을 벗어나<지 않고 본 기술에 숙지의 지식을 가진 자에의해 본 명세성의 변형과 치환등이 가능하낟는 것을 인지할 것이다.

다음은 본 발명을 실행하는 방법을 설명하고 있지만 유사한, 등가의 재료와 방법이 이용될 수도 있다. 따라서 다음의 실시예는 본 발명을 단순히 설명하기위함이지 이에 국한시키고자 함은 아니다.

실시예 1

icIL-1raII의 클로닝과 특징

재료와 방법

시약

다음의 상업적으로 이용할 수 있는 시약들을 세포의 배양과 분리에 사용된다; 임상적 용도의 발열물질 없는 염과 증류수, RPMI 1640 배지; DMEM 배지; L-글루타민; 퍼콜; 피콜-하이파크; 멸균 수집된 태아 송아지 혈청; 소의 뇌로부터 준비된 내피세포 성장 보조제(ECGS); 헤파린.

모든 시약은 Limulus amebocyte 용혈 검사로 체크하였을 때 모든 시약에는 내독소가 0.125EU/㎖이하를 포함한다.

세포

건강한 기증자의 말초혈액으로부터 사람 순환 PMN과 단세포들을 Colotta F., Peri G., Villa SA., Mantovani Aa., Rapid Killing of actionmycin D treated tumor cells by human mononuclear cells. J. Immunol. 132:936, 1984.에서 상술한 <것과 같이 등장액(285 mOsm)의 불연속농도차(46% 단세포, 62% PMN)를 이용한 원심분리에의해 분리될 수 있다. 세포는 중간층으로부터 분리하여, 염으로 2회 세척하고 배지에서 재현탁시킨다.

회수된 PMN과 단세포들은 착색된 세포원심분리된 세포의 모양검사로 평가하였을 때 90%이상이고 순도는 98%이상 이었다. PMN과 단세포에서 일상적으로 사용된 세포 배양 배지는 2mM L-글루타민과 10% FCS가 보충된 RPMI 1640이다.

탯줄 정맥으로부터 사람 내피 세포(EC)을 얻고 Allavena P., Paganin C., Martin-Padura I., Peri G., Gaboli M., Dejana E., Marchisio P.C., Mantovani A., Molecules and structures involved in the adhesion of natural killer cells to vascular endothelium, J. Exp. Med., 173:439, 1991 문한에 기술된 것과 같이 배양하였다.

ECGS(50㎍/㎖) 와 헤파린(100㎍/㎖)이 보충된 10% FCS와 M199배지에 유지시킨 2nd-5th 통로의 합체 세포를 이용하였다.

COS 세포를 10% FCS가 보충된 DMEM 배지에 배양하고 8387 섬유아세포는 10% FCS가 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.

적절한 처리후에 하기에서 상술하는 것과 같은 방법으로 세포로부터 IL-1ra mRNA 또는 IL-1ra 단백질을 검사하였다.

RT-PCR

약간 수정한 구아니디움 이소티오시아네이트 방법을 이용하여 총 RNA를 추출하였다.

RT-PCR은 Colotta F., Polentarutti N., Sironi M., Mantovani A., J. Biol. Chem., 267;18278, 1992에서 상술한 것과 같이 실행한다.

간략하면, 2.5mM 헥사머(기준없음), 1mM 각 데옥시뉴클레오티드 트리포스테이트, 1 unit/㎖ RNase 저해물질 그리고 2.5units/㎖ 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 전사효소(perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT)와 역전사효소 완충액(5mM 염화마그네슘, 50mM 염화칼륨, 10mM 트리스-HCl;pH 8.3)에서 역전사시킨다.

샘플은 10분간 25℃에서 배양시키고 이어서 42℃에서 45분간 배양시킨다. 그다음 icIL-1raI 또는 icIL-1raII를 인코드하는 cDNA를 증폭시키기도록 만든 특정 쌍의 프라이머를 cDNA 반응에 첨가하고 내부 컨트롤로써 사람 B-액틴을 첨가한다.

자동화된 열 순환기(Perkin Elmer Cetus)에서 95℃, 55℃, 72℃에서 각 1.5분간 2mM 염화마그네슘, 50mM 염화칼륨, 0.2M 각 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 2.5units/100㎖ Taq 중합효소(Perkin Elmer Cetus)에서 증폭반응을 실행하였다.

증폭된 생성물은 분자량 표준물질과 함께 1% 에티디움-브로마이드-착색된 아가로스 겔에서 전기영동시킨다(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany).

포스포로아미다이트 방법을 이용하여 올리고뉴클레오티드를 합성한다. icIL-1ra를 선택적으로 증폭시키기위해 이용되는 올리고뉴클레오티드 서열은 Haskill S. et al., Natl. Acad, USA, 88:3681, 1991에서 상술하는 것과 동일하다.

특히, 저자는 올리고뉴클레오티드 GM397(여기에서는 IRA 1)와 GM368(IRA 4)를 이용하였다.

icIL-1raII 증폭을 위해 저자는 IRA 4와 IRA 5(서열 1;SEQ ID NO;1)을 이용하였는데 이는 icIL-1raII 서욜에 포함된 여기에서 상술하고 있는 엑스트라 액손을 특이적으로 인지하는 것이다.

B-액틴 증폭을 위해서는 B-액틴 cDNA의 뉴클레오티드 60-79에 상응하는 전방 뉴클레오티드는 서열 2(SEQ ID NO;2)이다. 뉴클레오티드 430-449에 상보적인 후방 뉴클레오티드는 서열 3(SEQ ID NO;3)이다. 증폭 생성물은 서브클론하고(TA Cloning ystem, Invitrogen, San Diego, CA) 다이데옥시 사슬 종료 방법을 사용하여 서열화한다.

COS세포에서 icIL-1ra 생성물의 발현

icIL-1ra와 icIL-1raII의 5'-해독안된 부분, 완전한 리딩 프레임과 3'-해독안된 부분의 6bp(멈춤코드 포함)를 포함하는 cDNAs는 전술한 것과 같이 올리고뉴클레오티드 IRA 4와 IRA 5를 이용한 RT-PCR로 만들 수 있고 pSF5 발현 벡터내에서 뒤에서 연결시킨다. 서열화에의해 역전사와 증폭반응의 정확성을 증명할 수 있다.

정확한 방향의 cDNA를 포함하는 플라스미드는 CsCl 농도차에서 정제하고 Sambrook J. et al., Cold Spring Harboe Laboratory Press, 1989에서 상술하고 있는 것과 같은 칼슘 침전방법을 이용하여 COS세포로 옮길 수 있다.

이틀후에 하기에서 상술하고 있는 ELISA 또는 면역블랏팅 방법을 이용하여 배양 상층액과 초음파 분쇄된 세포 용해물을 검사한다. 컨트롤로서는 비어있는 플라스미드(전이안된)를 이용한다.

면역활성 icIL-1ra의 확인

sIL-1ra와 icIL-1ra를 모두 확인할 수 있는 통상의 ELISA 테스트(Amersham, Buckinamshire, UK)를 이용한다. 웨스턴 블랏 분석을 위해서는 두 마리 토끼와 한 마리 염소의 다클론 항-혈청을 이용한다.

COS 세포 용해물 샘플과 상층액은 12.5% SDS-PAGE 전기영동을 하고 니트로-셀룰로오즈 필터(Stratagene, La Jolla, CA, USA.)위에 블랏한다.

표준방법에 따라 1차, 2차 항체 배양을 실행한다. 1차 항체는 항-IL-1ra 토끼 다클론 항체이다.

2차 항체는 양고추냉이 과산화효소(Amersham)가 연결된 염소 항-토끼 면역글로블린 부분이 된다. 면역활성 단백질 부분 밴드는 제조업자의 지시에따라 화학 발광물질 과정(ECL Dection, Amersham)에의해 볼 수 있다.

EC에서 E-세레틴의 IL-1-유도된 발현

특이적인 ELISA검사(Amersham)으로 측정된 25 내지 100ng 재조합 IL-1ra(icIL-1ra 또는 icIL-1raII)에 상응하는 형질감염된 COS 세포 용해질(전술한)과 96웰 플레이트(Falcon)에서 배양된 융합 EC를 30분간 배양시킨다.

가상 형질감염된 세포로부터 수득한 동량의 COS 용해질을 컨트롤로 사용한다. 그다음, EC는 0.1-1 ng/㎖ 사람 재조합 IL-1B에 6시간동안 노출시킨다. E-세레틴 발현의 감지는 ELISA 검사로 이루어지는데 이는 제 1 항체로써 항-E-세레틴 단클론항체 BB1G-E2를, 제 2 항제로는 양고추냉이 과산화효소 결합된 토끼 항-쥐 Ig항혈청을 이용하여 EC의 흡착성을 검사하는 것이다. 샘플의 O.D.는 분광광도계(Flow)를 이용하여 405㎜ 파장에서 플레이트를 감지하여 결정할 수 있<다.

결과

icIL-1raII의 확인

icIL-1ra(도 1)의 전체 코딩 서열을 얻기위해 RT-PCR을 이용하여 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 만든다(도 1에서 IRA 1 과 IRA 4로 지정). 사람 PMN으로부터 증폭된 산물을 서브클론하고 서열화한다.

icIL-1ra의 이미 공지된 서열에 추가하여, 본 발명자는 icIL-1ra 서열의 뉴클레오티드 132와 133사이의 엑스트라 서열 63bp를 제외한 icIL-1ra 코딩 서열과 동일한 서열을 가지는 다수의 클론을 분리하였다. icIL-1ra의 전술한 액손-인트론 경계가 있다면, 엑스트라 서열은 icIL-1ra의 제 1 리더-액손과 sIL-1ra의 제 1 액손의 내부 수용체 부위사이에 삽입한다(도 1).

관심을 끄는 것은 sIL-1ra의 제 1 액손의 내부 수용 부위와의 결합이 항상 sIL-1ra와 icIL-1raI 그리고 icIL-1raII의 동일한 아미노산 부분, 글루타민산에서 발생되는 것을 알 수 있다(도 1).

삽입된 아미노산 엑스트라 서열에서 가장 두드러진 특징은 7개 글리신 잔기인데 이중 6개가 연속된다는 것이다. 글리신 잔기는 양쪽 글루타민산 잔기사이에 있다는 것이다. icIL-1raII는 180개 아미노산으로 구성된다.

icIL-1raII의 전체적인 친수성 정도는 icIL-1raI와 유사하나 NH₂단부에서 소수성 리더 서열이 부족하다.

icIL-1raII의 발현

icIL-1raII 전사체를 확인하기위해, 33bp의 기대 증폭된 산물과 특이적으로 고안된 한쌍의 올리고뉴클레오티드(IRA 5와 IRA 4; 도 1)를 사용하여 실행한다.

도 2에서 볼 수 있는 것과 같이, icIL-1raII을 인코드하는 전사체를 PMA-, IL-1- 그리고 TNF- 활성화된 섬유아세포에서 감지할 수 있다. LPS-처리된 단세포에서는 희미하지만 감지가능한 밴드가 나타난다.

또한, 처리안된 또는 활성화된(도 2)의 PMN에서는 예상된 크기의 매우 희미한 밴드를 볼 수 있다.

도 2에서 나타난 것과 같이 증폭된 산물의 특이성은 서브클로닝과 서열화에의해 확인할 수 있다.

재조합 icIL-1raII의 발현

icIL-1raII을 인코드하는 DNA서열을 COS 세포에 형질 감염시키고 icIL-1raI을 인코드하는 것과 비교한다. 그다음, 웨스턴 블랏을 이용하여 세포 용해질과 상층액을 검사한다.

이들 실험에서 시용된 다클론 항혈청은 icIL-1raII와 icIL-1raI응 동일하게 인지한다(도 3). 모두다는 아니지만, 세포 용해질에서 대부분 icIL-1raII와 icIL-1raI가 발견된다.

재조합 icIL-1raI은 주요 밴드가 22KDa이고 반면, icIL-1raII은 약 25KDa인 것으로 나타났다.

재조합 icIL-1raII에의한 IL-1B 활성 저해

IL-1 저해 활성에 대해 재조합 icIL-1raII을 검사하였다. 이를 위해 발명자는 내피세포에서 IL-1 유도된 E-세레틴을 이용하였는데 그이유는 감응성(100pg/㎖ IL-1 또는 그이하에서 유도를 감지할 수 있음)과 신속함(IL-1과 6시간 배양) 때문이다.

가상 형질감염된 COS 세포의 용해질에서는 IL-1활성이 눈에 띄게 감소되지는 않았다.

icIL-1raII은 길항 활성을 가지지 않는다.

도 4에서 볼 수 있는 것과 같이, 재조합 icIL-1raII은 약량에따라 IL-1활성을 저해하였다.

이들 데이터에서 icIL-1raII가 또한 IL-1의 저해물질이라는 증거를 제공한다.

토론

본 발명자는 신규한 icIL-1raI 분자형을 설명한다. 이와 같은 신규한 분자는 icIL-1ra의 제 1 리더-액손과 sIL-1ra의 제 1 액손 내부 수용 부위사이에 63bp를 삽입하여 만들 수 있다.

생성된 단백질이 분자의 NH₂단부에 위치하는 21개 아미노산의 엑스트라 서열을 제외하고는 고유 icIL-1ra와 부분적으로 동일하기 때문에 발명자는 고유의 icIL-1ra 서열이 icIL-1ra 타입 I이기 때문에 이와 같은 신규한 분자형은 IL-1ra 타입 II라고 주장한다.

RT-PCR 실험에서 icIL-1raII 전사체는 단세포와 섬유아세포에서 유도될 수 있다는 것을 설명한다. COS 세포에서 발현된 재조합 icIL-1raII은 분자량이 약 25KDa이고 동일한 실험조건에서 발현된 icIL-1raI에의해 발휘되는 것과 필적할만한 IL-1 활성 저해물질이다.

동일한 유전자로부터 상이한 접목(splicing)수단을 이용하여 icIL-1ra와 sIL-1ra의 코딩하는 전사체를 만들 수 있다. icIL-1ra은 액손에서 또다른 전사 개시부위를 sIL-1ra 리더 서열을 포함하는 제 1 액손의 내부 수용 부위에 삽입하여 만들어 진다.

수득된 결과는 새로운 구성 IL-1ra 유전자를 제시하는데 이는 엑스트라 액손이 고유 icIL-1ra와 sIL-1ra 사이에 각 제 1 액손에 위치하는 구성이 된다. 이와 같은 새로운 액손을 이용하여 21 아미노산을 N-단부에 삽입하여 icIL-1raI과는 한 개의 펩티드가 부족하나 IL-1에대한 저해활성은 유지하는 폴리펩티드 분자를 만들 수 있다.

또다른 접목을 이용하여 상이한 IL-1ra 분자를 만드는데 있어 제어를 더 잘 할 수 있는 것으로 나타났다. icIL-1raII 전사체는 섬유아 세포에서 IL-1, TNF와 포르볼 에스테르에의해 그리고 단세포에서 LPS에의해 유도된다. 섬유아세포에서 포르볼 에스테르는 icIL-1ra 전사체를 유도하는데 선택성이 있고 반면에 IL-1과 TNF는 sIL-1ra와 icIL-1ra mRNAs 모두에서 유도한다. 단세포에서는 sIL-1ra와 icIL-1raI의 전사체를 증가시키는 IL-13은 icIL-1raII를 유도하지는 못했다.

마지막으로, sIL-1ra와 icIL-1ra를 근본적으로 발현하고 유도하는 PMN은 RT-PCR에서 지적한 것과 같이 극소수의 전사체를 발현시킨다. 전반적으로, 이들 데이터에서는 세가지 유형의 IL-1ra를 만들기위해 상이한 접목을 유도하는 기작은 외부 신호에 반응하여 차등적으로 조잘되는 것을 나타낸다.

여기에서 설명하는 엑스트라 아미노산 서열은 7개의 글리신 잔기를 포함하는데 이들중 6개가 연속된다는 것이 놀라운 점이다.

글리신이 풍부한 서열을 가지는 분자는 실 나트륨이노성 제거 수용체, HOX11 호모 박스 유전자, 중심절 결합 또는 RNA 접목에 연관된 중간 필라멘트 케라틴과 핵 단백질을 포함하는 상이한 생물학적 활성을 가진다.

그러나, 글리신 잔기이외에는 글리신이 풍부한 부위에 인접한 아미노산 서열에서 이들 단백질과 icIL-1raII사이에는 유사성이 없는 것을 알 수 있다.

IL-1시스템은 두 개의 길항물질, 두 개의 수용체로 구성된 상당히 복잡한 복합성을 가지는데 이때 하나는 IL-1의 저해물질이고 길항물질 수용체인데 적어도 세가지 상이한 분자형이 있는 것으로 보인다.

세포내 IL-1ra의 생물학적 중요성은 여전히 명백하게 정립되어야 하나, 여기에서 보고된 데이터에서는 상이한 접목을 이용하여 상이한 N-단부를 가지는 두가지 다른 icIL-1ra 분자형이 와부 자극에 반응하여 만들어질 수 있다는 것을 보여주고 있다.

IL-1의 다양하고 복잡한 컨트롤수준의 존재로 이와 같은 사이토킨의 생리적인 염증수반 가능성을 엄격히 조절해야한다는 필요성이 있다.

도면의 설명

도 1

고유 icIL-1ra(icIL-1raI) 와 sIL-1ra와 비교하여 icIL-1raII의 DNA 서열과 예측된 단백질 서열.

도 1의 윗부분은 sIl-1ra, icIL-1raI 그리고 icIL-1raII의 대표적인 DNA와 단백질 서열을 나타낸다. 도 1의 아랫부분은 IL-1ra의 세가지 형에 공통적인 서열을 나타낸다.

각 분자의 전반적인 서열은 공통 서열과 각 특정 부분의 결합에의해 만들어진다. 명확하게하기위해, icIL-1ra의 DNA 서열은 공고된 5'-해독안된 서열의 뉴클레오티드 91에서부터 시작하고 3'-해독안된 서열의 6bp만을 보고한다.

통상의 IL-1ra 서열은 완전한 icIL-1raI 서열의 뉴클레오티드 133과 sIL-1ra 서열의 뉴클레오티드 88에 상응하는 sIL-1ra의 제 1 액손에 위치한 내부 수용 부위에서 시작한다.

문서에서 상술하고 있는 것과 같이 RT-PCR 분석에 이용된 전방(IRA 1와 IRA 5)과 후방(IRA 4) 올리고뉴클레오티드는 화살표로 나타내었다. 올리고뉴클레오티드 IRA 5는 icIL-1raII DNA만을 인지한다.

도 2

상이한 세포형에서 icIL-1raII 발현의 RT-PCR분석

8387 섬유아세포(판넬 A), 단세포(판넬 B)그리고 PMN(판넬 C)로부터의 RNA를 역전사시킨다. 그다음 각 DNA 합성 반응은 두 개 샘플로 나누는데 하나는 icIL-1raII 전사체를 감지하기위해 올리고뉴클레오티드 IRA 5(전방)과 IRA 4(후방)을 증<폭시키고 다른 하나는 B-악틴 특이적인 올리고뉴클레오티드를 증폭시킨다(see Material and Mehtods Section).

증폭된 생성물은 에티디움 브로마이드 착색한 아가로스 겔을 통하여 검사한다. B-악틴에 상응하는 증폭된 생성물이 기준이되는 것의 좌측에 있고 icIL-1raII에 상응하는 증폭된 산물은 화살표로 나타내었다. 이들 밴드의 특이성은 서브클로닝과 서열화에의해 확인될 수 있다.

도 3

재조합 icIL-1raII의 웨스턴 블랏 분석

icIL-1raI(2) 또는 icIL-1raII(3) 또는 이와같은 DNA를 포함하지 않은 벡터(1)를 COS 세포로부터의 세포 용해질에 형질감염시킨 다음 항-IL-1ra 토끼 다클론 항체로 면역블랏팅시킨다. 분자량 기준도 나타내었다.

도 4

내피세포에서 IL-1-유도된 E-세레틴 발현에서 icIL-1raII의 효과

Material and Methods에서 상술하는 방법에 따라 내피세포는 0.1 또는 1ng/㎖ 사람 IL-1B, 25-100ng/㎖ icIL-1raII 또는 빈벡터로 가상 형질감염시킨 세포로부터 수득한 COS 세포 용해질 동량을 처리하였다.

6시간 배양후에 내피세포는 흡착된 세포에서 ELISA 실행하여 E-세레틴 발현에대해 검사하였다.

보고된 데이터에서는 컨트롤에대한 IL-1 유도된 E-세레틴 발현 백분률이다.

Claims

인터루킨 1-α와 인터루킨 1-β에서 선택된 물질에대한 길항활성을 가지는 정제된 단백질에 있어서, 서열 12(SEQ ID NO;12)의 아미노산으로 구성된 것을 특징으로 하는 정제된 단백질.
인터루킨 1-α와 인터루킨 1-β에서 선택된 물질에대한 길항활성을 가지는 정제된 단백질에 있어서, 서열 14(SEQ ID NO;14)의 아미노산으로 구성된 것을 특징으로 하는 정제된 단백질.
제 2 항에 있어서, 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들어지는 것을 특징으로 하는 정제된 단백질.
제 2 항에 따른 아미노산 서열을 가지는 IL-1 길항물질을 인코드하는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA 서열.
제 4 항에 있어서, 서열 13(SEQ ID NO;13)을 가지는 것을 특징으로 하는 분리된 DNA 서열.
발현벡터에 있어서, 제2항에 따른 단백질을 인코드하는 DNA 서열로 구성되는 벡터로써, 이때 벡터는 pSF5인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제 2 항에 따른 단백질을 인코드하는 DNA가 형질감염된 세포 배양물에 있어서, 세포는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 세포 배양물.
재조합 DNA 기술을 이용하여 IL-1 길항물질을 만드는 방법에 있어서,

a) 제 2 항에 따른 단백질을 생산할 수 있는 DNA를 포함하는 제 8과 9항에 따른 숙주 세포를 배양하고;

b) 인코드된 단백질을 수집하고 분리하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, DNA 서열은 서열 13(SEQ ID NO;13)에서 보고된 것인 것을 특징으로 하는 공정.
제 2 항에 있어서, IL-1 활성을 저해해야 하는 질병 치료용 제약학적 조성물을 만드는데 사용하는 것을 특징으로 하는 정제된 단백질.
제 10 항에 있어서, 질병은 류마티스 관절염, 패혈증 쇼크, 급성 골단세포 백혈병, 이식에서 숙주에 저항하는 면역학적 반응, 후천성 면역결핍증(AIDS), 궤양성 대장염에서 선택되는 자가면역 질환인 것을 특징으로 하는 정제된 단백질.