JPH10509306A

JPH10509306A - インターロイキン−１レセプターアンタゴニストの細胞内イソ形態

Info

Publication number: JPH10509306A
Application number: JP8512932A
Authority: JP
Inventors: コロッタ，フランチェスコ; ムツィオ，マルタ; マントバーニ，アルベルト
Original assignee: アプライドリサーチシステムズエーアールエスホールディングナームロゼベノートスハップ
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 1998-09-14
Also published as: NO971624D0; EE03697B1; EE9700090A; DE69534419D1; NO971624L; CA2202470A1; RU2193064C2; BR9509317A; CN100363053C; EP0786002B1; IT1270662B; ATE303439T1; KR970706391A; KR100237936B1; AU701471B2; ITMI942097A0; DE69534419T2; WO1996012022A1; UA65522C2; MX9702616A

Abstract

(57)【要約】 IL−１ａ及びIL−１Ｂの両方に対して活性な新しいインターロイキン−１アンタゴニスト、IL−１アンタゴニストをコードする新しいDNA配列並びに組換えDNA技術によりIL−１アンタゴニストを得るための方法が記載される；IL−１産生由来の病気におけるこのような新しいIL−１アンタゴニストの予防、治療及び診断的使用も記載される。

Description

【発明の詳細な説明】インターロイキン−１レセプターアンタゴニストの細胞内イソ形態発明の分野本発明はバイオテクノロジーの分野にある。IL−１ａ及びIL−１Ｂの両方に対して活性な新しいインターロイキン−１（IL−１）アンタゴニスト、そのIL−１アンタゴニストをコードする新しいDNA配列並びに組換えDNA技術によりIL−１アンタゴニストを得るための方法が記載される。IL−１産生由来の病状におけるこのような新しいIL−１アンタゴニストの予防、治療及び診断的使用も開示される。発明の背景蛋白質IL−１ａ及びIL−１Ｂを各々コードするIL−１ａ及びIL−１Ｂと呼ばれるインターロイキン−１（IL−１）をコードする２つの別個の遺伝子がある。インターロイキンIL−１ａ及びIL−１Ｂは、それらの配列はほとんど類似を示さないが、異なる組織に種々の類似した効果を及ぼし、多くのヒトの病状に、特に生物の免疫性応答及び炎症の過程に作用する多面的サイトカインである。両蛋白質は約17.5kDaの分子量を有し、約31kDaの分子量を有するより大きなサイズの前駆分子として先に合成されている。 IL−１は通常有利な効果を有するが、生物に極めて有害な効果も有する潜在的に炎症性の発熱性のサイトカインである。それらは、例えばエリテマトーデスのような自己免疫病の症状の病因に関係し、特にそれらは例えば慢性関節リウマチにおけるもののような組織に損傷を導くための媒体として含まれる。 IL−１の生物的効果の多くは敗血によっておこる出来事の間に観察され得るものに類似する。現在の研究は、１〜10ng／kgの投与量におけるIL−１の静脈内投与が熱、眠け、食欲不振、全身性筋肉痛、関節痛及び頭痛をおこすことを証明した。 IL−１は多面的生物活性を有し、それらの多くは生物に反対の影響を及ぼすので、IL−１の強力な効果は厳格な生理学的制御下であるべきである。 IL−１合成は、抗炎症性サイトカイン、プロスタグランジン及びグルココルチコイドにより阻害され、多重レベルのIL−１の阻害の存在は、この媒体の厳格な制御の必要性を示す。 IL−１は、レセプターのためのアンタゴニストポリペプチドとして現在までに記載されている唯一のサイトカインである；IL−１ファミリーの今日までの第３の周知の構成物はIL−１レセプターのためのアンタゴニスト（IL−１ra）である。全ての３の構成物（IL−１ａ，IL−１Ｂ，IL−１ra）は細胞表面上の同じレセプター（IL−１Ｒ）に結合し；IL−１Ｒに結合するIL−１ａ及びIL−１Ｂはシグナルを伝達し、他方、IL−raはシグナルを伝達しない。 IL−１ＲＩ及びIL−１ＲIIと呼ばれる２つのタイプのIL−１レセプターがある。IL−１raはIL−１ＲＩと結合し、IL−１ＲIIとよりアフィニティーが少く、いずれのアゴニスト活性もないポリペプチドである。 IL−１ra産生は、単核貪食細胞、多形核細胞(PMN)及び繊維芽細胞を含む異なる細胞のタイプにおいて、IgG、サイトカイン及びバクテリア産物により誘導される。現在まで、IL−１raの２つの分子の形態が同定され、クローンされている：１）分泌されたIL−１ra(sIL−１ra)は152アミノ酸の成熟蛋白質を与える25アミノ酸の標準的なリーダー配列を含み；２）細胞内IL−１ra（icIL−１ ra）はリーダー配列を欠き、これによりこの蛋白質は細胞内に残る。 sIL−１ra及びicIL−１raは同じ遺伝子から発生する。icIL−１ra転写物は選択的開始部位から、そして第１の選択的エキソンの、sIL−１raの第１のエキソン内に位置した内部スプライスアクセプター部位内へのスプライシングから生ずる。これにより、予測された蛋白質は、sIL−１raの最初の21アミノ酸がicIL− １ra内の４つのアミノ酸により置換されているNH₂端を除いて同一である。 sIL−１ra及びicIL−１raをコードする転写物の発現は異なって制御される。i cIL−１raの生物学的重要性はまだ不明である。 IL−１が多くの病気の病原性に関連していることを考慮すると、IL−１の有害な効果を制限するために役立つ利用できる薬剤を有する必要性が明らかである。発明の概要本発明の目的は、IL−１ａ及びIL−１Ｂの両方に並びにそれらの組合せに対して活性なIL−１アンタゴニストを提供することである。本発明の更なる目的は、IL−１アンタゴニストをコードするDNA配列、及び組換えDNA技術によりこのような新しいアンタゴニストを得るための方法を提供することである。本発明の更なる目的は、IL−１阻害を要求する病理において活性な医薬組成物に用いるのに適するための実質的に精製された形態におけるアンタゴニストを提供することである。本発明の更なる目的及び利点は以下の記載において明らかになるだろう。図面及び配列表の簡単な記載図１は、古典的なsIL−１raのもの（icIL−１raＩ；配列番号：６）と比較したicIL−１raII（配列番号：８及び配列番号：９）の、及びsIL−１ra（配列番号：４及び配列番号：５）の共通でない部分についてのDNA配列及び蛋白質の配列を示し、更に共通なIL−１raの部分（配列番号：13及び配列番号：14）についてのDNA配列及びそのコードされた蛋白質を示す。図２は、異なる細胞タイプにおけるicIL−１raII発現のRT−PCR分析を示す。図３は、組換えicIL−１raIIのウエスタン・ブロット分析を記載する。図４は、内皮細胞におけるＥ−セレクチンのIL−１誘導発現に対するicIL−１ raIIの効果を示す。配列番号：１は、RT−PCRに用いるためのIRA５と命名されたオリゴヌクレオチドの配列を示す。配列番号：２は、RT−PCRに用いるためのＢ−アクチンcDNAのヌクレオチド69 〜70に相当するオリゴヌクレオチドの配列を示す。配列番号：３はRT−PCRに用いるためのヌクレオチド430〜449に相補的な逆方向オリゴヌクレオチドの配列を示す。配列番号：４は共通でない部分についてのsIL−１raをコードするDNA配列を示す。配列番号：５は共通でない部分についてのsIL−１raのアミノ酸配列を示す。配列番号：６は共通でない部分についてのicIL−１raＩの３アミノ酸をコードするDNA配列を示す。配列番号：７は共通でない部分についてのicIL１−raＩの３アミノ酸を示す。配列番号：８は共通でない部分についてのicIL−１raIIをコードするDNA配列を示す。配列番号：９は、共通でないicIL−１raIIのアミノ酸配列を示す。配列番号：10は、共通な部分についてのIL−１raをコードするDNA配列を示す。“Patentin EPO”プログラムに関する問題に関して、その配列の調製のために、最初のアミノ酸Gluのコードを許容するため、更にその配列の内側における停止コドンの形成を避けるために、Ｇヌクレオチドをその配列の最初の部分に加えた。配列番号：11は、共通な部分についてのIL−１raのアミノ酸配列を示す。配列番号：12は、他のIL−１raと共通でないicIL−１raIIフラグメントを表す 21アミノ酸の配列を示す。配列番号：13は、完全なicIL−１raIIをコードするDNA配列を示す。配列番号：14は、完全なicIL−１raIIのアミノ酸配列を示す。発明の記載この新しいIL−１アンタゴニストは、icIL−１raをコードするDNAの枠内に、最初のicIL−１ra特異的エキソンとsIL−１raの最初のエキソンの内部アクセプター部位との間に新しい63塩基対（bp）配列を挿入することにより形成された。 RT−PCR実験により、本発明者らは、新しい転写物が活性化された単球及び繊維芽細胞において、並びに多形核細胞（PMN）において発現されることを見い出した。 COS細胞中の発現は、この新しいアンタゴニストがほとんど細胞内であり、SDS −PAGEにおいて約25kDaの分子量（MW）を有することを示した。新しい組換えアンタゴニストはIL−１阻害活性を示す。本適用において、明瞭さ及び容易さの理由のため、現在知られているicIL−１ raはicIL−１raタイプＩ（icIL−１raＩ）として示され、他方本明細書に記載され本発明の目的である新しいアンタゴニストはicIL−１raタイプII（icIL−１ra II）として定義される。本発明に従う新しいアンタゴニストが予防、治療又は診断の使用のために有利に用いられ得る病理の例は、慢性関節リウマチ、敗血症性ショック、急性骨髄性白血病、ホストに対する移植の免疫反応、後天性免疫不全症候群（AIDS）、潰瘍性大腸炎及び一般的な全ての自己免疫病である。本発明の実施形態は、IL−１阻害を要求する病理を進行させる高い危険を有する人々に、又はセプシスのような病理を既に示す人々に薬理学的に活性な量のic IL−１raIIを投与することである。先に言及されるカテゴリーの例は、外科手術を待つ患者である。活性成分に適合する投与のいずれかの経路が用いられ得るが、特に好ましいのは非経口投与であり、これは短時間で全身的な効果を有することを許容するからである。この理由のため、外科手術の直前、間又は後に静脈内ボーラスの投与が好ましい。投与されるべきicIL−１raIIの投与量は、年齢、体重及び患者の個々の応答に従って医療的処方の基礎による。投与量は0.05〜30mg／kg体重の間であり得、好ましい投与量は0.1〜10mg／kg 体重の間である。非経口投与のための医薬組成物は、活性成分及び適切なビヒクルを含む注入可能形態に調製され得る。非経口投与のためのビヒクルは当該技術で公知であり、例えば、水、塩類溶液、リンガー溶液及びデキストロースを含む。ビヒクルは溶液溶解度及び等張性を維持するためにより少量の賦形剤を含み得る。言及された溶液の調製は、通常のモダリティー（modality）に従って行われ得、好ましくはicIL−１raII成分は１mg／ml〜10mg／mlの間で含まれよう。本発明に従う新しいアンタゴニストが予防、治療、診断目的のために有利に用いられ得る病理の例は、慢性関節リウマチ、敗血症性ショック、急性骨髄性白血病、ホストに対する移植の免疫反応、後天性免疫不全症候群（AIDS）、潰瘍性大腸炎及び一般的な全ての自己免疫病である。本発明は、特定の実施形態を引用して記載されているが、その記載の内容は、請求の範囲の意味及び目的を超えることなく当業者によりもたらされ得る全ての改良及び置換を含む。以下の部分において、本発明を得るためのいくつかの方法が記載されるが、均等な材料及び方法が用いられ得る。以下の実施例は、それゆえ、本発明を純粋に実例で示し、非限定のものである。実施例１ icIL−１raIIのクローニング及びキャラクタリゼーション材料及び方法試薬培養及び細胞の分離のために次の市販の試薬を用いた：臨床的使用のための発熱物質のない塩類溶液及び蒸留水；RPMI1640培地；DMEM培地；Ｍ199培地；Ｌ− グルタミン；Percoll；Ficoll-Hipaque；無菌で収集された胎児ウシ血清；ウシ脳から調製された内皮細胞増殖補足物（ECGS）。全ての試薬はLimulus変形細胞ライゼートアッセイにより確認されるように0.1 25EU／ml未満のエンドトキシンを含んでいる。細胞ヒト循環PMN及び単球をColotta F.，Peri G.，Villa SA.，Mantovani A.，Rap id Killing of actinomycin D treated tumour cells by human mononuclear ce llsに記載されるように等浸透圧（285mOsm）のPercollの不連続（単球について4 6％及びPMNについて62％）勾配に基づく遠心により健康なドナーの末梢血液から分離した。細胞をその界面で塩類溶液で２回洗浄し、媒地中に再懸濁した。染色された細胞遠心された細胞の多形学的実験により測定して、PMN及び単球の回収率は90％より高く、純度は98％より高かった。PMN及び単球のために慣用的に用いられる細胞培養培地は２mM L−グルタミン及び10％FCSを有するRPMI16 40である。ヒト内皮細胞（EC）をへそ静脈から得、文献（Allavena P.，Paganin C.，Mar tin-Padura I.，Peri G.，Gaboli M.，Dejana E.，Marchisio P.C.，Mantovani A.，Molecules and structures involved in the adhesion of natural killer cells to vascular endothelium，J.Exp.Med.，173:439，1991）に詳細に記載されるように培養した。 ECGS（50μｇ／ml）及びHeparin（100μｇ／ml）が補足された10％FCSを有するＭ199培地中に保持された２次〜５次継代における融合細胞を慣用的に用いた。 COS細胞を10％FCSを有するDMEM培地中で培養し、8387繊維芽細胞を10％FCSを有するRPMI1640中で培養した。適切な処理の後、細胞を以下に記載されるようにIL−１ra mRNA又はIL−１ra 蛋白質について検査した。 RT−PCR 全てのRNAを少しの修飾と共にグアニジウムイソチオシアネート法により抽出した。 RT−PCRをColotta F.，Polentarutti N.，Sironi M.，Mantovani A.，J.Biol. Chem.，267:18278，1992に記載されるように行った。要約すると、１μｇの全RNAを2.5mMのランダムなヘキサマー、１mMの各々のデオキシヌクレオチドトリホスフェート、１unit／mlのRNaseインヒビター、及び2 .5unit／mlのモロニーネズミ白血病ウイルストランスクリプターゼ(Perkin Elme r Cetus，Norwalk，CT)を有する逆転写酵素緩衝液(５mM MgCl₂，50mM KCl，10mM Tris-HCl；pH8.3)中で逆転写した。サンプルを25℃で10分間、次に42℃で45分間、インキュベートした。次に、cD NA反応に、icIL−１raＩ又はicIL−１raII及び内部制御としてヒトＢ−アクチンをコードするcDNAを増幅するよう設計された特定の対のプライマーを加えた。２mMのMgCl₂，50mMのKCl，0.2Ｍの各々のデオキシヌクレオチドトリホスフェート、2.5units／100ml Taq ポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）及び４mg／ml の各々の特定のプライマー中で増幅を行った（以下を参照のこと）。95℃，55℃ 及び72℃で各々1.5分間、自動熱サイクラー（Perkin Elmer Cetus）内で増幅（3 0サイクル）を行った。増幅された産物を分子量標準（Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany）と共に１％エチジウムブロミド−染色アガロースゲルを通して走らせた。オリゴヌクレオチドをホスホルアミジト法により合成した。icIL−１raを選択的に増幅するために用いられるオリゴヌクレオチドの配列はHaskill S．et al.，Natl，Acad.，USA，88:3681，1991に記載されるものと同一であった。特に、著者は（本明細書でIRA１として示される）オリゴヌクレオチドGM397及びGM368（IRA４）を用いた。 icIL−１raII増幅のために、著者はicIL−１raII配列に含まれる本明細書に記載される余分のエキソンを特異的に認識するIRA４及びIRA５（配列番号：１）を用いた。Ｂ−アクチン増幅のために、前者のオリゴヌクレオチドはＢ−アクチンcDNAのヌクレオチド60〜79に相当する配列番号：２に報告されている。後者のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド430〜449に相補的である配列番号：３に報告されている、増幅産物をサブクローンして（TA Cloning System，Invitrogen，San Die go，CA）、ジデオキシ鎖ターミネーション法により配列決定した。 COS細胞におけるicIL−１ra産物の発現 icIL−１raＩ及びicIL−１raIIの両方の５′未翻訳領域の32bp、完全なオープン読み枠及び３′未翻訳領域の（停止コドンを含む）６bpを先に翻訳されるようなオリゴヌクレオチドIRA４及びIRA５でのRT−PCRにより得、次にpSF５発現ベクターに連結して戻した。逆転写及び増幅の忠実度はシーケンシングにより確かめられる。正確な方向でcDNAを含むプラスミドをCsCl勾配により精製し、次にSambrook J ．et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989に記載されるようなカルシウム沈殿法によりCOS細胞内に移入した。２日後、培養上清及び音波処理した細胞ライゼートを以下に詳説されるような ELISA又はイムノブロッティングにより検査した。（移入されていない）空のプラスミドを対照として用いた。免疫反応性IL−１raの同定 sIL−１ra及びicIL−１raの両方を同定する市販のELISAテスト(Amersham，Buc kinamshire，UK)を用いた。ウエスタンブロット分析のために、２のウサギ及び１のヤギのポリクローナル抗血清を用いた。 COS細胞ライゼートサンプル及び上清を12.5％SDS−PAGE電気泳動にかけ、次にニトロセルロースフィルター(Stratagene，La Jolla，CA，USA）上にブロッティングした。第１及び第２抗体でのインキュベーションを、標準的プロトコルに従って行った。第１抗体は抗IL−１raウサギポリクローナル抗体である。第２抗体は西洋ワサビベルオキシダーゼ（Amersham）に結合したヤギ抗ウサギイムノグロブリン画分である。免疫反応性蛋白質画分バンドを製造元の説明に従う化学発光ベースの手順（ECL．Detection，Amersham）により表した。 EC上のＥ−セレクチンのII−１−誘導性発現 96ウエルプレート（Falcon）内で培養された融合ECを、特定のELISAアッセイ（Amersham）によりアッセイされるような25〜100ngの組換えIL−1ra（icIL−１ raＩ又はicIL−１raIIのいずれか）に相当する量の移入されたCOS細胞ライゼート（先を参照）と共に30分間、インキュベートした。対照として、擬似移入された細胞から得られた等量のCOSライゼートを平行して用いた。次にECを0.1〜１ng／mlのヒト組換えIL−ＩＢに６時間、露出した。Ｅ−セレクチン発現の検出を、第１抗体としての抗−Ｅ−セレクチンモノクローナル抗体BBIG−Ｅ２、及び第２抗体としての西洋ワサビペルオキシダーゼに接合されたウサギ抗マウスIg抗血清で、接着EC上でのELISAアッセイで行った。サンプルのO.D.を、405波長における分光光度計（Flow）でプレートを検出することにより決定した。結果 icIL−１raIIの同定 RT−PCRによりicIL−１raの全コーディング配列（図１）を得るために、（図１にIRA１及びIRA４として示される）特定のオリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。ヒトPMNからの増幅産物をサブクローニングして配列決定した。先に知られているicIL−１raの配列に加えて、本発明者は、その配列が、icIL −１ra配列のヌクレオチド132と133との間の63bpの余分な配列を顕著に除いて公開されているicIL−１raコーディング配列と同一であるいくつかのクローンを単離した。記載されるicIL−１raのエキソン−イントロン境界において、その余分な配列はicIL−１raの最初のリーダのないエキソンとsIL−１raの最初のエキソンの内部アクセプター部位との間に挿入されている（図１）。その予測されるアミノ酸配列を図１示す。その新しい蛋白質（以後、icIL−１ raタイプIIと呼ぶ）は、昔からのicIL−１ra（icIL−１raタイプＩ）と共通のNH₂ 末端における最初の３つのアミノ酸、次の21アミノ酸の新しい配列を有する。その２つの蛋白質の残りは同一である。奇妙なことに、sIL−１raの最初のエキソンの内部アクセプター部位との連結は、sIL−１ra及びicIL−１raＩ両方について、そしてicIL−１raIIについて、同じアミノ酸残基、即ちグルタミン酸を常に作り出した（図１）。挿入されたアミノ酸余分配列の最も著しい特徴は、その６つが保存されている７のグリシン残基の存在である。グリシン残基はグルタミン酸残基により両側に隣接している。icIL−１raIIは180アミノ酸からなる。 icIL−１raIIの全親水性パターンは、icIL−１raＩのそれに類似し、にもかかわらずNH₂末端において疎水性リーダーペプチドを欠如する。 icIL−１raIIの発現 icIL−１raII転写物を同定するために、RT−PCR分析を、33bpの予想される増幅産物と共に一対の特別にデザインされたオリゴヌクレオチド（IRA５及びIRA４、図１）と共に行った。図２に示すように、icIL−１raIIをコードする転写物はPMA−、IL−１−及びT NF−活性化繊維芽細胞中で検出され得た。うすいが検出可能なバンドがLPS処理した単球において明らかであった。更に、未処理又は活性化のいずれかのPMN（図２）は、予想される大きさの極めてうすいバンドを示した。図２に示される増幅産物の特異性を、サブクローニング及びシーケンシングにより確認した。組換え体icIL−１raIIの発現 COS細胞に、icIL−１raIIをコードするDNA配列を、比較としてicIL−１raＩをコードするものを移入した。次に、細胞ライゼート及び上清をウエスタン・ブロットにより検査した。これらの実験に用いられるポリクローナル抗血清はicIL−１raII及びicIL−１ raＩを等しく十分に認識した（図３）。icIL−１raII及びicIL−１raＩの全てではないがほとんどは、細胞ライゼート内で見い出された。組換えicIL−１raＩは22kDaの支配的なバンドとしてマイグレートし、他方icI L−１raIIは約25kDaの量を示した。組換えicIL−１raIIによるIL−１Ｂ活性の阻害組換えicIL−１raIIをIL−１阻害活性性について検査した。この目的のために、著者らは内皮細胞上のＥ−セレクチンのIL−１−誘導発現を選択した。なぜならこのアッセイは、センシティブ(100pg／ml IL−１以下の検出可能な誘導)及び迅速（IL−１と共に６時間のインキュベーション）だからである。凝似移入されたCOS細胞のライゼートはIL−１活性を大きく削減しなかった。 icIL−１raIIはアゴニスト活性を有さなかった。図４に示すように、組換えicIL−１raIIは、投与量依存様式でIL−１活性を阻害した。これらのデータは、icIL−１raIIが本当にIL−１のインヒビターであることを証明する。議論本発明は、icIL−１raの新しい分子形態を記載する。その新しい分子は、icIL −１raのリーダのないエキソンとsIL−１raの最初のエキソンの内部アクセプター部位との間の63bpの挿入により作られる。結果として生ずる蛋白質はその分子のNH₂末端に位置した21アミノ酸の余分な配列を除いて昔からのicIL−１raと部分的に同一であるので、本発明者らは、IL −１raタイプIIとしてこの新しい形態をいい、icIL−１raのタイプＩとしてもとのicIL−１raをいうことを提案する。 RT−PCR実験はicIL−１raII転写物が単球及び繊維芽細胞において誘導可能であることを証明した。COS細胞内で発現された組換えicIL−１raIIは約25kDaの明らかな分子量を有し、同じ実験条件下で発現されるicIL−１raＩにより行われるのに相当するIL−１の阻害活性を有していた。 icIL−１ra及びsIL−１raをコードする転写物は異なるスプライシングの利用の手段により同じ遺伝子から生成される。icIL−１ra は、sIL−１raのリーダー配列を含む第１のエキソンの内部アクセプター部位内に挿入されるエキソンの転写の他の開始により生成される。本発明者らにより得られた結果は、余分な領域が昔からのicIL−１raとsIL− １raとの各々の第１のエキソンの間に位置しているIL−１ra遺伝子の新しい構成を提案する。この新しいエキソンの使用は、なおシグナルペプチドを欠如し、21 アミノ酸の挿入によりそのＮ末端においてicIL−１raＩから異なり、なおIL−１に対する阻害能力を保持するポリペプチド分子を生成する。異なるIL−１ra分子を生成するための異なるスプライシングの使用は、高度に制御されるようである。icIL−１raII転写物は繊維芽細胞内のIL−１，TNF及びホルボールエステルにより誘導され、単球においてLPSにより誘導される。繊維芽細胞において、ホルボールエステルはicIL−１ra転写物を選択的に誘導することが見い出されており、他方IL−１及びTNFはsIL−１ra及びicIL−１ra mRNAの両方を誘導する。単球において、sIL−１ra及びicIL−１raＩの両方の転写物を増大させるIL−13はicIL−１raIIを誘導しなかった。最後に、sIL−１ra及びicIL−１raが構造的に発現され、誘導可能であるPMNは、RT−PCRにより指摘されるように極めて少い転写物を発現した。全体のこれらのデータはIL−１raの３つの形態を生成する異なるスプライシングを示すメカニズムが外部のシグナルに応答して異なって制御されることを示す。本明細書に記載される余分な配列のアミノ酸配列は、その６つが保存されている７つのグリシンを含むことに驚かされる。グリシンリッチな配列は、心房性ナトリウムクリアランスレセプター、HOX11 ホームボックス遺伝子、中間フィラメントケラチン及びセントロメア結合又はRNAスプライシングに関連する核蛋白質を含む異なる生物活性を有する分子中に存在する。しかしながら、グリシン残基と別に、アミノ酸配列の隣接グリシンーリッチ領域においてこれらの蛋白質とicIL−１raIIとの間の明らかでない相同性が明らかであった。 IL−１システムは、２つのアンタゴニスト、その１つがIL−１のインヒビターである２つのレセプター、得られた結果を考慮して少くとも３つの異なる分子形態が存在し得るレセプターアンタゴニストを含む異常なレベルの複雑さを示す。 IL−１raの細胞内形態の生物学的重要性が明らかに確立されているが、本明細書に報告されるデータは、異なるスプライシングによりicIL−１raの２つの異なる形態が異なるＮ末端での選択された外部の刺激に応答して生成され得ることを示す。 IL−１の制御の多重及び複合レベルの存在は、このサイトカインの炎症の可能性の厳格な生理学的制御についての絶対的必要性を示す。図面の記載図１従来のicIL−１ra（icIL−１raＩ）及びsIL−１raと比較したicIL−１raIIのD NA配列及び予測蛋白質配列図１の上部は、sIL−１ra，icIL−１raＩ及びicIL−１raIIに特に表されるDNA 及び蛋白質配列を示す。図１の下部はIL−１raの３つの形態の中で共通の配列を示す。各々の分子についての全体の配列は、これにより、その共通配列との各々の特定の部分の連結により生成される。明快さのために、icIL−１raのDNA配列は出版されている５′未翻訳のヌクレオチド 91から開始し、３′未翻訳配列の６bpのみが報告される。共通IL−１ra配列は完全なicIL−１raＩ配列のヌクレオチド133に、及び完全なsIL−１ra配列のヌクレオチド88に相当するsIL−１raの最初のエキソン内に位置した内部アクセプター部位で開始する。矢印は、テキストに記載されるようにRT−PCR分析に用いられる正(IRA１及びI RA５)及び逆(IRA４)オリゴヌクレオチドを示す。オリゴヌクレオチドIRA５はicI L−１raII DNAのみを認識する。図２異なる細胞タイプにおけるicIL−１raII発現のRT−PCR分析 8387繊維芽細胞（パネルＡ）、単球（Ｂ）及びPMN（Ｃ）からのRNAを逆転写した。次に各々のDNA合成反応を、２つのサンプルに分け、その１つをicIL−１raI I転写物の検出のためにオリゴヌクレオチドIRA５（正）及びIRA４（逆）で増幅し、他方をＢ−アクチン特異的オリゴヌクレオチドで増幅した（材料及び方法のセクションを参照のこと）。次に増幅した産物をエチジウムブロミド染色したアガロースゲルを通して検査した。Ｂ−アクチンに相当する増幅された産物は、標準対照の左側に報告され、 icIL−１raIIに相当する増幅された産物（右側）は矢印で示される。これらのバンドの特異性をサブクローニング及びシーケンシングにより確認した。図３組換えicIL−１raIIのウエスタン・ブロット分析 icIL−１raＩ（２）もしくはicIL−１raII（３）とコードするDNAで、又はこのようなDNA（１）を含まない空のベクターで形質転換されたCOS細胞からの細胞ライゼートを、抗IL−１raウサギポリクローナル抗体でイムノブロッティングすることにより検査した。分子量標準が示される。図４内皮細胞上のＥ−セレクチンのIL−１誘導性発現に対するicIL−１raIIの効果内皮細胞を、0.1もしくは１ng／mlのヒトIL−１Ｂで処理し、25〜100ng／mlの icIL−１raII、又は材料及び方法のセクションで詳訳されるような空のベクターにより移入された凝似物である細胞から得られた等量のCOS細胞ライゼートで、又はそれなしで処理した。６時間のインキュベーションの後、内皮細胞を、接着細胞上で行われるELISA テストによりＥ−セレクチンについて検査した。報告されるデータは、対照に対するIL−１誘導性Ｅ−セレクチン発現の百分率である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１０月２９日【補正内容】請求の範囲１．インターロイキンａ及びインターロイキンＢからなる群から選択される少くとも１の物質に対してアンタゴニスト活性を有する精製された蛋白質であって、配列番号：12に記載されるアミノ酸配列をそのNH₂末端近くに含むことを特徴とする蛋白質。２．インターロイキンａ及びインターロイキンＢからなる群から選択される少くとも１の物質に対してアンタゴニスト活性を有する精製された蛋白質であって、配列番号：14に記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする蛋白質。３．組換えDNA技術により得られることを特徴とする請求項２に記載の精製された蛋白質。４．請求項２に記載のアミノ酸配列を有するIL−１アンタゴニストをコードする単離されたDNA配列。５．配列番号：13に記載される配列を有することを特徴とする請求項４に記載の単離されたDNA配列。６．配列番号：１に記載される配列を有するプローブと、該プローブが配列番号：８に記載のDNA配列とハイブリダイズする条件と実質的に等しい条件下で、ハイブリダイズする単離されたDNA配列。７．請求項２に記載の蛋白質をコードするDNA配列を含むベクター。８．請求項２に記載の蛋白質をコードするDNAが移入された細胞培養物。９．哺乳動物細胞から得られることを特徴とする請求項２に記載の細胞培養物。 10．組換えDNA技術によりIL−１アンタゴニストを得るための方法であって、ａ）請求項２に記載の蛋白質を産生することができるDNA配列を含む請求項８又は９に記載の宿主細胞を培養するステップと、ｂ）そのコードされた蛋白質を収集して単離するステップと、を含むことを特徴とする方法。 11．前記DNA配列が配列番号：13に記載されるものであることを特徴とする請求項10に記載の方法。 12．医療的使用のための請求項２に記載の配列を有する精製された蛋白質の使用。 13．IL−１阻害を必要とする病気に活性な医薬組成物の調製のための請求項２に記載の配列を有する精製された蛋白質の使用。 14．前記病気が自己免疫病の群から選択されることを特徴とする請求項13に記載の使用。 15．前記病気が、慢性関節リウマチ、敗血症性ショック、急性骨髄性白血病、ホストに対する移植の免疫反応、後天性免疫不全症候群（AIDS）、潰瘍性大腸炎からなる群から選択されることを特徴とする請求項14に記載の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＤＺＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＶＣ０７Ｋ 5/083 ＡＢＢ 14/54 ＡＣＣＣ１２Ｎ 5/10 ＡＢＧ (72)発明者マントバーニ，アルベルトイタリア国，イ−20146 ミラン，ラルゴブラジリア，４

Claims

【特許請求の範囲】１．インターロイキンａ及びインターロイキンＢからなる群から選択される少くとも１の物質に対してアンタゴニスト活性を有する精製された蛋白質であって、配列番号：12に記載されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする蛋白質。２．インターロイキンａ及びインターロイキンＢ、又はそれらのフラグメントからなる群から選択される少くとも１の物質に対してアンタゴニスト活性を有する精製された蛋白質であって、配列番号：14に記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする蛋白質。３．組換えDNA技術により得られることを特徴とする請求項２に記載の精製された蛋白質。４．請求項２に記載のアミノ酸配列を有するIL−１アンタゴニストをコードする単離されたDNA配列。５．配列番号：13に記載されることを特徴とする請求項４に記載の単離された DNA配列。６．配列番号：１に記載される配列を有するプローブとハイブリダイズする単離されたDNA配列。７．請求項２に記載の蛋白質をコードするDNA配列を含むベクター。８．請求項２に記載の蛋白質をコードするDNAが移入された細胞培養物。９．哺乳動物細胞から得られることを特徴とする請求項２に記載の細胞培養物。 10．組換えDNA技術によりIL−１アンタゴニストを得るための方法であって、ａ）請求項２に記載の蛋白質を産生することができるDNA配列を含む請求項８又は９に記載の宿主細胞を培養するステップと、ｂ）そのコードされた蛋白質を収集して単離するステップと、を含むことを特徴とする方法。 11．DNA配列が配列番号：13に記載されるものであることを特徴とする組換えD NA技術によりIL−１アンタゴニストを得る方法。 12．医療的使用のための請求項２に記載の蛋白質を有する精製された蛋白質の使用。 13．IL−１阻害を必要とする病気に活性な医薬組成物の調製のための請求項２に記載の配列を有する精製された蛋白質の使用。 14．前記病気が自己免疫病の群から選択されることを特徴とする請求項13に記載の使用。 15．前記病気が、慢性関節リウマチ、敗血症性ショック、急性骨髄性白血病、ホストに対する移植の免疫反応、後天性免疫不全症候群（AIDS）、潰瘍性大腸炎からなる群から選択されることを特徴とする請求項14に記載の使用。