ITMI942097A1 - Antagonista della interleuchina-1 - Google Patents
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Description
Descrizione della Domanda di Brevetto per Invenzione Industriale dal Titolo: Antagonista della interleuchina-1
Campo dell*invenzione
La presente invenzione è nel campo delle biotecnologie. Viene descritto un nuovo antagonista dell'interleuchina 1 (IL-1) attivo sia contro la IL-la e la IL-Ιβ. Viene descritta inoltre una nuova sequenza di DNA che codifica per il nuovo antagonista della IL-1 e un metodo per l'ottenimento dell'antagonista della IL-1 attraverso la tecnica del DNA ricombinante. Infine vengono descritti gli impieghi profilattici, terapeutici e diagnostici del nuovo antagonista della IL-1 in patologie derivanti dalla produzione di IL-1.
Introduzione
Esistono due tipi distinti di geni che codificano per la interleuchina 1 (IL-1) che vengono chiamati IL-la e IL-Ιβ i quali codificano rispettivamente per le proteine IL-Ια e IL-Ιβ.
Le interleuchine IL-la e IL-Ιβ sono delle citochine pleiotropiche che benché abbiano una limitata analogia nella sequenza esercitano una varietà di effetti simili su tessuti differenti e intervengono in numerose patologie umane, in particolare intervengono nella risposta immunitaria dell'organismo e nei processi infiammatori.
Entrambi le proteine hanno un peso molecolare di circa 17.5 kDa e sono prima sintetizzate come molecola precursore di dimensioni maggiori avente un peso molecolare di circa 31 kDa.
Le IL-1 sono delle potenti citochine infiammatorie e pirogene che normalmente hanno effetti benefici ma possono avere effetti molto dannosi per l'organismo.
Possono ad esempio partecipare alla patogenesi delle manifestazioni delle patologie autoimmuni come il lupus eritomatosus ed in particolare sono implicate come mediatori nel provocare danni ai tessuti come ad esempio nella artrite reumatoide.
Molti degli effetti biologici della IL-1 sono simili a quelli osservati durante un evento settico. Recenti studi hanno dimostrato che la somministrazione endovenosa di IL-1 in dosi da 1 a 10 ng/kg produce febbre, sonnolenza, anoressia, mialgia generalizzata, artralgia e cefalea.
Poiché le IL-1 hanno attività biologiche pleiotropiche molte delle quali influenzano negativamente l'organismo ci si dovrebbe aspettare che i potenti effetti della IL-1 siano sotto stretto controllo fisiologico.
La sintesi di IL-1 viene inibita dalle citochine antiinfiammatorie, dalle prostaglandine e dai glucocorticoidi e l'esistenza di livelli multipli di inibizione della IL-1 evidenzia la necessità di uno stretto controllo di questo mediatore .
La IL-1 è l'unica citochina per cui è stato descritto sino ad ora un polipeptide antagonista per il recettore: il terzo componente fino ad oggi noto della famiglia della IL-1 è l'antagonista per il recettore della IL-1 (IL-lra).
Tutte e tre queste componenti (IL-la, IL-Ιβ, IL-lra) riconoscono e si legano allo stesso recettore sulla superficie cellulare (IL-1R); IL-Ια e IL-Ιβ legandosi a IL-1R trasmettono un segnale mentre IL-lra no.
Esistono due tipi di recettori per la IL-1 indicati come IL-1RI e IL-1RII. La IL-lra è un polipeptide che si lega ai IL-1RI, e con meno affinità a IL-1RII, senza alcuna attività agonista.
La produzione di IL-lra viene indotta in differenti tipi cellulari, tra cui fagociti mononucleari, cellule polimorfonucleate (PMN) e fibroblasti, mediante IgG, citochine e prodotti batterici.
Fino ad oggi sono state identificate e clonate due forme molecolari di IL-lra:
1) la IL-lra secreta (sIL-lra) contiene una sequenza leader classica di 25 amino acidi dando luogo a una proteina matura di 152 amino acidi;
2) la IL-lra intracellulare (icIL-lra) manca di una sequenza leader indicando cosi che questa proteina rimane a livello intracellulare .
La sIL-lra e la icIL-lra sono prodotte dallo stesso gene. I trascritti di icIL-lra originano da un sito di inizio alternativo e da una giunzione di un primo esone alternativo con un sito accettore di montaggio interno posto nel primo esone della IL-lra. Le proteine previste sono cosi identiche eccetto che per le loro estremità NH2· cui i primi 21 amino acidi della sIL-lra sono sostituiti con quattro amino acidi nella icIL-lra.
L'espressione dei trascritti che codificano la sIL-lra e la icIL-lra è regolata in modo differente. La significatività biologica della icIL-lra rimane ancora non chiarita.
Considerato che la IL-1 è coinvolta nella patogenesi di numerose malattie è evidente la necessità di avere disponibili medicamenti che possano essere utilizzati per limitare gli effetti dannosi della IL-1.
Sommario dell’invenzione
Oggetto della presente invenzione è di mettere a disposizione un antagonista della IL-1 attivo sia contro la IL-Ια e la IL-Ιβ sia contro una combinazione di entrambi. Ulteriore oggetto della presente invenzione è di mettere a disposizione una sequenza di DNA che codifichi per un antagonista della IL-1 e un metodo di ottenimento del nuovo antagonista attraverso la tecnica del DNA ricombinante.
Infine un ulteriore oggetto della presente invenzione è di mettere a disposizione l'antagonista in forma sostanzialmente purificata in modo da essere adatto per l'uso in composizioni farmaceutiche attive in patologie che richiedono la inibizione della IL-1.
Ulteriori oggetti e vantaggi dell'invenzione saranno evidenziati nella descrizione seguente.
Breve descrizione delle figure e delle sequenze di lista
Figura 1 descrive la sequenza di DNA e la sequenza della proteina, per la parte non in comune, della icIL-lrall (SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8) paragonate a quella della icIL-lra classica (icIL-lral; SEQ ID NO:6) e della sIL-lra (SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5). ed inoltre la sequenza di DNA e la sequenza della proteina da essa codificata per la parte della IL-lra in comune (SEQ ID NO:12 e SEQ ID N0:13).
Figura 2 descrive l'analisi RT-PCR dell'espressione icIL-lrall in tipi cellulari differenti.
Figura 3 descrive la analisi Western blot della icIL-lralI ricombinante .
Figura 4 descrive gli effetti della icIL-lralI sulla espressione di E-selectina indotta da IL-1 in cellule endoteliali .
SEQ ID N0:1 riporta la sequenza di un oligonucleotide denominato IRA5 per la RT-PCR.
SEQ ID N0:2 riporta la sequenza di un oligonucleotide, corrispondente ai nucleotidi 69~70 del cDNA della β-actina, per la RT-PCR.
SEQ ID NO:3 riporta la sequenza di un oligonucleotide , diretto all*indietro complementare ai nucleotidi 430-449 della β-actina, per la RT-PCR.
SEQ ID NO:4 riporta la sequenza di DNA codificante la sIL-lra per la parte non in comune.
SEQ ID NO:5 riporta la sequenza aminoacidica della sIL-lra per la parte non in comune.
SEQ ID NO:6 riporta la sequenza di DNA codificante tre amino acidi della icIL-lral per la parte non in comune.
SEQ ID NO:7 riporta la sequenza di DNA codificante la icIL-lrall per la parte non in comune.
SEQ ID NO:8 riporta la sequenza aminoacidica della icIL-lralI per la parte non in comune.
SEQ ID NO:9 riporta la sequenza di DNA codificante la IL-Ira per la parte in comune. Per questioni connesse al programma "Patentin EPO", per la preparazione delle sequenze è stato inserito un nucleotide G in prima posizione della sequenza per permettere la codifica del primo amino acido Giu ed inoltre per evitare la formazione di un codone stop all'interno della sequenza.
SEQ ID NO:10 riporta la sequenza aminoacidica della IL-lra per la parte in comune.
SEQ ID NO:11 riporta la sequenza aminoacidica di 21 amino acidi che rappresenta un frammento della icIL-lralI non in comune con le altre IL-lra.
SEQ ID NO:12 riporta la sequenza di DNA codificante la icIL-lrall completa.
SEQ ID NO:13 riporta la sequenza aminoacidica della icIL-lrall completa.
Descrizione dell'invenzione
Questa nuovo antagonista della IL-1 è stato ottenuto dall'inserimento nella struttura di lettura del DNA codificante per il IL-lra, di una nuova sequenza di 63 coppie di basi tra il primo esone specifico per la icIL-lra e il sito accettore interno del primo esone della sIL-lra.
Mediante esperimenti con RT-PCR, gli inventori hanno trovato che questo nuovo trascritto è espresso in fibroblasti, monociti attivati e polimorfonucleati (PMN).
Il DNA corrispondente al nuovo antagonista della IL-1 è stato ottenuto mediante RT-PCR.
Il nuovo antagonista può essere ottenuto attraverso la tecnica del DNA ricombinante per espressione di una coltura cellulare trasfettata o trasformata con DNA esogeno comprendente DNA codificante per detto antagonista o con un vettore di espressione comprendente tale DNA. Il trasferimento del DNA esogeno può essere effettuato secondo le tecniche descritte in Svoboda, et al., Transfection of chicken fibroblasts with a single exposure to DNA from virogenic mammalian cells, J. Gen Virol. 21:47-55. 1973 e in Shih C., et al., Passage of phenotypes of chemically transformed cells via transfection of DNA and chromatin, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 76:5714-5718. 1979·
L'espressione in cellule COS ha rivelato che questa nuovo antagonista è principalmente intracellulare e ha un peso molecolare di circa 25 kDa in SDS-PAQE.
Il nuovo antagonista ricombinante ha dimostrato di avere attività inibitoria della IL-1.
Nel seguente testo per chiarezza e semplicità la icIL-lra fino ad oggi nota verrà definita come icIL-lra del tipo I (icIL-lral) mentre il nuovo antagonista qui descritto e oggetto dell'invenzione, verrà definito come icIL-lra del tipo II (icIL-lrall) .
Nella parte seguente saranno descritti alcuni metodi di ottenimento dell'invenzione benché possano essere usati metodi e materiali equivalenti. Gli esempi seguenti sono quindi puramente illustrativi e non devono essere intesi in alcun modo limitativi dell 'invenzione.
ESEMPIO 1
Clonazione e caratterizzazione di icIL-lralI
MATERIALI E METODI
Reagenti
Nella coltura e nella separazione delle cellule sono stati usati i seguenti reagenti commercialmente disponibili: acqua distillata e acqua salina apirogeni per uso clinico, mezzo di coltura RPMI 1640; mezzo di coltura DMEM; mezzo di coltura M199; L-glutammina ; Percoli; Ficoll-Hlpaque ; siero fetale bovino raccolto asetticamente ; supplemento di crescita cellule endoteliali (ECGS), preparato da cervello bovino; Eparina.
Tutti i reagenti contenevano meno di 0,125 EU/ml di endotossina come verificato dal saggio di U sato di amebocite di Limulus .
Cellule
PMN e monociti umani in circolo sono stati separati da sangue periferico di donatori sani per centrifugazione su un gradiente discontinuo (46/K per i monociti e 62% per i PMN) di Percoli isoosmotico (285 mOsm) come descritto in Colotta F., Peri G., Villa SA., Mantovani A., Rapid killing of actinomycin D treated tumor celle by human mononuclear cells. J. Immunol. 132:936> 1984. Le cellule sono state recuperate all'interfaccia, lavate due volte in soluzione salina e risospese nel mezzo di coltura.
Il recupero dei PMN e dei monociti era maggiore del 30% e la purezza maggiore del 38% come stimato dall'esame morfologico di cellule colorate citocentrifugate. Il mezzo di coltura cellulare normalmente usato per i PMN e i monociti era l'RPMI 1640 con L-glutammina 2mM e 10% FCS.
Le cellule endoteliali umane (EC) sono state ottenute da vene ombelicali e poste in coltura come descritto in dettaglio nella letteratura (Allavena P., Paganin C., Martin-Padura I., Peri G., Gaboli M., Dejana E., Marchisio P.C., Mantovani A., Molecules and structures involved in thè adhesion of naturai killer cells to vascular endothelium, J.Exp.Med., 173:439» 1991)·
Sono state usate normalmente cellule confluenti al loro secondo-quinto passaggio mantenute nel mezzo di coltura M199 con 10% FCS addizionato con ECGS (50 pg/ml) e eparina (100 pg/ml).
Cellule COS sono state coltivate nel mezzo di coltura DMEM con 10% FCS e fibroblasti 8387 nel mezzo di coltura RPMI 1640 con 10% FCS.
Dopo il trattamento appropriato, le cellule sono state esaminate per il mRNA della IL-lra o per la proteina IL-lra come descritto in seguito.
RT-PCR
L'RNA totale è stato estratto con il metodo guanidino isotiocianato con piccole modifiche.
La RT-PCR è stata realizzata come descritto in Colotta F., Polentarutti N., Sironi M., Mantovani A., J.Biol.Chem. 267:18278, 1992.
Brevemente, 1 pg di RNA totale è stato retrotrascritto in un tampone da trascrittasi inversa (MgC^ 5mM, KC1 50mM, tris-HCl lOmM, pH 8,3)· con esameri presi a caso 2,5mM, ogni deossinucleotide trifosfato ImM, inibitore della RNasi 1 unità/ml, e trascrittasi di virus di leucemia murine secondo Moloney 2,5 unità/ml (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT).
I campioni sono stati incubati per 10 min a 25’C e in seguito per 45 min a 42<e>C. Quindi, la reazione del cDNA è stata aumentata con una coppia di primers specifici designati per amplificare i cDNA che codificano la icIL-lral o la icIL-lralI e, come controllo interno, la β-actina umana.
L'amplificazione è stata eseguita in MgC^ 2mM, KC1 50mM, 0,2M ogni deossinucleotide trifosfato, Taq DNA polimerasi (Perkin Elmer Cetus) 2,5 unità/ΙΟΟμΙ e 4ng/pl di ciascun primer specifico (vedi sotto). L'amplificazione (30 cicli) è stata eseguita in un ciclizzatore termico automatico (Perkin Elmer Cetus) a 95<*>C. a 55‘C e a 72<*>C per 1,5 minuti ciascuno.
I prodotti amplificati sono stati fatti correre su gel di agaroso colorato con bromuro di etidio all'ljt utilizzando degli standard per il peso molecolare (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germania).
Gli oligonucleotidi sono stati sintetizzati con il metodo della fosforamidite. Le sequenze degli oligonucleotidi usati per amplificare selettivamente la icIL-lra erano identiche a quelle descritte in Haskill S. et al., Proc. Nati. Acad. USA 88:3681, 1991.
In particolare abbiamo usato degli oligonucleotidi GM397 (qui indicati come IRA 1) e GM368 (IRA 4).
Per l'amplificazione di icIL-lralI gli autori hanno usato IRA 4 e IRA 5 (SEQ ID N0:1), che riconoscono specificamente l'esone extra qui descritto incluso nella sequenza icIL-lralI.
Per l'amplificazione della (S-actina, è stato utilizzato 1'oligonucleotide in avanti la cui sequenza è riportata in SEQ ID NO:2, corrispondente ai nucleotidi 60-79 del cDNA della β-actina.
L'oligonucleotide diretto nel senso opposto (all'indietro) è riportato in SEQ ID NO:3. complementare ai nucleotidi 430-449 della (J-actina. I prodotti dell’amplificazione sono stati subclonati (TA Cloning System, Invitrogen, San Diego, CA) e sequenziati con il metodo della terminazione a catena dideossi.
Espressione dei prodotti icIL-lra in cellule COS
I DNA contenenti 32 coppie di basi della regione 5' non tradotta, il completo schema di lettura aperta e 6 coppie di basi (tra cui il codone stop) della regione 3' non tradotta sia della icIL-lral che della icIL-lralI sono stati ottenuti mediante RT-PCR con oligonucleotidi IRA 4 e IRA 5 come descritto precedentemente e quindi inseriti nel vettore di espressione pSG5- L'accuratezza della trascrizione inversa e dell'amplificazione è stata verificata con il sequenziamento.
I plasmidi contenenti il DNA nell'orientamento corretto sono stati purificati su gradiente di CsCl e quindi trasfettati in cellule COS con il metodo del precipitato di calcio come descritto in Sambrook J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989· Dopo due giorni, i supernatanti delle colture e i lisati delle cellule sonicate sono stati esaminati per ELISA o immunoblotting come descritto in seguito. Un plasmide "vuoto" (non trasfettato) è stato usato come controllo.
Identificazione della IL-lra immunoreattiva
E' stato utilizzato un test ELISA commerciale (Amersham, Buckingamshire , UK) che identifica sia la sIL-lra sia la icILIra. Per l'analisi Western blot sono stati utilizzati antisieri policlonali di due conigli e di una capra.
I campioni dei lisati delle cellule COS e i supernatanti sono stati fatti correre su elettroforesi 12,5 % SDS-PAGE e quindi sottoposti alla tecnica blotting su filtro di nitrocellulosa (Stratagene, La Jolla, CA, USA).
L'incubazione con anticorpi primari e secondari è stata eseguita secondo i protocolli standard. L'anticorpo primario era un anticorpo policlonale di coniglio anti-IL-lra. L'anticorpo secondario era una frazione immunoglobulinica anti-coniglio di capra, legata a una perossidasi di rafano (Amersham). Le bande della proteina immunoreattiva erano rilevate con una procedura basata sulla chemioluminescenza (ECL Detection, Amersham) seguendo le istruzioni del produttore.
Espressione di selectina-E su EC indotta da IL-1
EC confluenti coltivate in 96 piastre a pozzetto (Falcon) sono state incubate per 30 minuti con una quantità di lisati di cellule COS trasfettate (vedi sopra) corrispondente a una quantità da 25 a 100 ng di IL-lra ricombinante (sia icIL-lral sia icIL-lralI) come stabilito con un test ELISA specifico (Amersham).
Come controllo, è stata usata in parallelo una uguale quantità di lisati COS ottenuti da cellule "mock" transfettate. In seguito, le EC sono state esposte per 6 ore a 0,1-1 ng/ol di IL-Ιβ ricombinante umana. La misurazione dell'espressione della selectina-E è stata eseguita con un test ELISA su EC aderenti con un anticorpo monoclonale BB1G-E2 anti-selectina-E come anticorpo primario e un antisiero Ig anti-topo di coniglio coniugato con perossidasi di rafano come Ab secondario. 0.0. dei campioni è stato determinato leggendo le piastre con uno spettrofotometro (Flow) a lunghezza d'onda 405 nm.
RISULTATI
Identificazione della icIL-lralI
Sono stati ideati dei primer oligonucleotidi specifici (indicati come IRA 1 e IRA 4 nella Fig.l) per ottenere l'intera sequenza codificante di icIL-lra (Fig.l) mediante RT-PCR. Prodotti amplificati da PMN sono stati subclonati e sequenziali.
In aggiunta alla sequenza precedentemente conosciuta di icIL-lra, gli inventori hanno isolato diversi cloni le cui sequenze erano identiche alla sequenza codificante la icIL-lra già pubblicata, con la rilevante eccezione di una sequenza extra di 63 coppie di basi tra i nucleotidi 132 e 133 della sequenza di icIL-lra. Definiti i limiti esone-introne della icIL-lra, la sequenza extra è inserita tra il primo esone , mancante di sequenza leader, di icIL-lra e il sito accettore interno del primo esone di sIL-lra (Fig.l).
La sequenza amminoacidica prevista è mostrata in Fig.l. La nuova proteina (d'ora in poi indicata con icIL-lra del tipo II) ha i primi tre amino acidi all'estremità NH2 in comune con la icIL-lra classica (icIL-lra del tipo I), seguiti da una nuova sequenza di 21 amino acidi. Il resto delle due proteine risulta identico.
Curiosamente, la giunzione con il sito accettore interno del primo esone di sIL-lra generava sempre, sia per la sIL-lra, che per la iclL-lral e per la icIL-lralI, lo stesso residuo aminoacidico , cioè l'acido glutammico {Fig.l).
La caratteristica maggiormente sorprendente della sequenza aminoacidica extra inserita risulta nella presenza di sette residui di glieina, di cui sei sono consecutivi. I residui di glieina sono fiancheggiati da entrambi i lati da residui di acido glutammico.
La icIL-lralI consiste in 180 amino acidi. Lo schema idrofilico completo di icIL-lralI è simile a quello di iclL-lral, ancora mancante di un peptide leader idrofobico all'estremità NH2.
Espressione di icIL-lralI
Per identificare i trascritti di icIL-lralI, è stata eseguita l'analisi RT-PCR con una coppia di oligonucleotidi specificatamente ideati (IRA 5 e IRA 4, Fig.l) con un prodotto amplificato atteso di 533 coppie di basi.
Come mostrato in Fig.2, i trascritti codificanti la icIL-lrall erano rilevabili in fibroblasti attivati con PMA, IL-1 e TNF. Una banda debole ma ugualmente rilevabile era evidente in monociti trattati con LPS.
Anche i PMN, sia non trattati che attivati (Fig.2) mostravano una banda molto debole della dimensione attesa.
La specificità dei prodotti amplificati indicati in Fig.2 era confermata dal subclonaggio e dal sequenziamento.
Espressione di icIL-lral! ricombinante
Cellule COS sono state trasfettate con la sequenza DNA codificante la icIL-lralI e, per confronto, con quella codificante la icIL-lral. Quindi, i lisati cellulari e i supernatanti sono stati esaminati per Western blot.
Gli antisieri policlonali usati in questi esperimenti riconoscevano ugualmente bene sia la icIL-lralI che la icIL-lral (Fig.3). La maggior parte, se non tutta, di icIL-lralI e icIL-lral è stata trovata nei lisati cellulari.
La icIL-lral ricombinante migrava come una banda predominante di 22 kDa, mentre la icIL-lralI mostrava una massa di circa 25 kDa.
Inibizione dell’attività della IL-Ιβ con la icIL-lralI ricombinante
La icIL-lralI ricombinante è stata esaminata per l'attività inibente la IL-1. Per questo scopo gli autori hanno scelto l'espressione indotta da IL-1 della selectina-E sulle cellule endoteliali, poiché questo saggio risulta sensibile (induzione misurabile a 100 pg/ml di IL-1 o inferiore) e rapido (6 ore di incubazione con IL-1).
I lisati di cellule COS transfettate "mock" non hanno significativamente ridotto l'attività della IL-1.
La icIL-lralI non ha mostrato una attività agonista.
Come mostrato in Fig.4, la icIL-lralI ricombinante inibiva l'attività della IL-1 in maniera dose-dipendente.
Questi dati forniscono l'evidenza che la icIL-lralI è un inibitore della IL-1.
DISCUSSIONE
Gli inventori descrivono una nuova forma molecolare di icIL-Ira. La nuova molecola è prodotta per inserimento di 63 coppie di basi tra il primo esone, mancante della sequenza leader, di icIL-lra e il sito accettore interno del primo esone di sIL-lra.
Poiché la proteina risultante è parzialmente identica alla icIL-lra classica, con l'eccezione di una sequenza extra di 21 amino acidi localizzati all'estremità NH2 della molecola, gli inventori suggeriscono di chiamare questa nuova forma la IL-Ira del tipo II, riferendosi alla icIL-lra classica come la icIL-lra del tipo I.
Esperimenti di RT-PCR hanno dimostrato che i trascritti di icIL-lralI sono inducibili in monociti e fibroblasti. La icIL-lrall ricombinante espressa in cellule COS aveva un peso molecolare apparente di circa 25 kDa e una attività inibitoria della IL-1 paragonabile a quella esercitata dalla icIL-lral espressa sotto le stesse condizioni sperimentali.
I trascritti codificanti la icIL-lral e la sIL-lra sono prodotti dallo stesso gene per mezzo di un montaggio differenziale. La icIL-lral è prodotta con un inizio alternativo della trascrizione di un esone inserito nel sito accettore interno del primo esone contenente la sequenza leader di sIL-lra.
I risultati ottenuti dagli inventori suggeriscono un nuovo elemento nella organizzazione del gene IL-lra, in cui un esone extra è localizzato tra il primo esone, rispettivamente, della icIL-lra classica e della sIL-lra. L'uso di questo nuovo esone genera un polipeptide che, mancando ancora di un peptide segnale, differisce dalla icIL-lral nella sua estremità N terminale per l'inserimento di 21 amino acidi, pur mantenendo la capacità inibitoria contro la IL-1.
L'utilizzo di un montaggio alternativo per generare molecole di IL-lra differenti sembra essere altamente regolato. I trascritti di icIL-lralI sono stati indotti da IL-1, TNF e phorbol esteri in fibroblasti e da LPS in monociti. Nei fibroblasti, è stato trovato che i phorbol esteri inducevano selettivamente i trascritti di icIL-lra, mentre IL-1 e TNF inducevano i mRNA sia di sIL-lra che di icIL-lra. Nei monociti, la IL-13, che aumentava i trascritti sia di sIL-lra che di icIL-lral, era incapace di indurre la icIL-lralI.
Infine, i PMN, in cui la sIL-lra e la icIL-lra sono costitutivamente espresse e inducibili, esprimevano pochi trascritti, come evidenziato con la RT-PCR. Complessivamente, questi dati indicano che i meccanismi di induzione dei montaggi differenziali che generano le tre forme di IL-lra sono differenzialmente regolati in risposta a segnali esterni.
La sequenza aminoacidica della sequenza extra qui descrìtta risulta sorprendente in quanto essa contiene sette residui di gllcina, di cui sei sono consecutivi.
Le sequenze ricche in glieina sono presenti in molecole con differenti attività biologiche, tra cui il recettore della clearance natriuretica striale, il gene homeobox H0X11, i filamenti di cheratina intermedi e le proteine nucleari coinvolti nel legame del centromero o nel montaggio dell'RNA. A parte i residui di glicine, comunque, non era evidente nessuna omologia ovvia tra queste proteine e la icIL-lralI nella sequenza aminoacidica che fiancheggia le zone ricche in glicine.
Il sistema IL-1 mostra uno straordinario livello di complessità, che consiste di due agonisti, due recettori, dei quali uno è un inibitore della IL-1, e un antagonista del recettore, del quale, con riferimento ai risultati ottenuti, potrebbero esistere almeno tre differenti forme molecolari. Sebbene la significatività biologica delle forme intracellulari della IL-lra deve ancora essere ben stabilita, i dati qui riportati indicano che con un montaggio alternativo possono essere prodotte due forme differenti di icIL-lra in risposta a stimoli esterni selezionati, con differenti estremità N-terminali.
L'esistenza di livelli multipli e complessi di controllo della IL-1 evidenzia l'assoluta necessità di uno stretto controllo fisiologico del potenziale infiammatorio di questa citochina.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1
La sequenza di DNA e la sequenza della proteina prevista di IcIL-lrall paragonate alla icIL-lra classica (icIL-lral) e alla sIL-lra.
La parte superiore della figura 1 mostra le sequenze di DNA e della proteina rappresentate specificamente in sIL-lra, icIL-lral e icIL-lralI. La parte inferiore della figura 1 mostra la sequenza in comune tra le tre forme di IL-Ira.
Le sequenze intere per ogni molecola sono così prodotte dalla giunzione di ogni porzione specifica con la sequenza comune. Per maggior chiarezza, la sequenza di DNA della icIL-lra inizia dal nucleotide 91 della sequenza non tradotta 5’ già nota e pubblicata, e sono riportate solo 6 coppie di basi della sequenza non tradotta 3'·
La sequenza icIL-lra comune inizia con il sito accettore interno localizzato nel primo esone della sIL-lra, corrispondente al nucleotide 133 della sequenza completa icIL-lral e al nucleotide 88 della sequenza sIL-lra completa.
Le frecce indicano gli oligonucleotidi in avanti (IRA 1 e IRA 5) e indietro (IRA k) usati per l'analisi RT-PCR, come descritto nel testo. L'oligonucleotide IRA 5 riconosce solo il DNA di icIL-lrall. L'asterisco indica il codone stop.
Fig.2
Analisi RT-PCR dell’espressione lcIL-lralI in tipi cellulari differenti.
Gli RNA da fibroblasti 8387 (riquadro A), monociti (riquadro B) e PMN (riquadro C) sono stati retrotrascritti. Ogni reazione di sintesi di DNA è stata poi divisa in due campioni, uno dei quali amplificato con oligonucleotidi IRA 5 (in avanti) e IRA 4 (indietro) per la misurazione dei trascritti icIL-lrall, e l'altro con oligonucleotidi specifici per la β-actina (vedi la sezione Materiali e Metodi).
I prodotti amplificati sono stati poi esaminati su un gel di agaroso colorato con bromuro di etidio. I prodotti amplificati corrispondenti alla β-actina sono riportati sulla sinistra dello standard e i prodotti amplificati corrispondenti alla icIL-lralI (sulla destra) sono indicati con una freccia. La specificità di queste bande è stata confermata dal subclonaggio e dal sequenziamento.
Fig-3
Analisi Western blot della icIL-lralI ricombinante
I lisati cellulari da cellule COS trasfettate con DNA codificanti la icIL-lral (2) o la icIL-lralI (3) o con un vettore "vuoto" non presentante il DNA (1) sono stati esaminati per immunoblotting con un anticorpo policlonale di coniglio anti-IL-lra. Sono indicati gli standard dei pesi molecolari.
Fig.4
Effetti della icIL-lralI sulla espressione di E-selectina indotta da IL-1 in cellule endoteliali.
Cellule endoteliali sono state trattate con 0,1 o 1 ng/ml di IL-Ιβ umana, in presenza o assenza di 25-IOO ng/ml di icIL-lralI o quantità equivalenti di lisati di cellule COS ottenuti da cellule transfettate con un vettore vuoto (mock), come spiegato in dettaglio nella parte materiali e metodi.
Dopo 6 ore di incubazione le cellule endoteliali sono state esaminate per la espressione della E-selectina tramite un test ELISA realizzato su cellule aderenti.
I dati riportati sono percentuali della espressione di E-selectina indotta da IL-1 nei confronti del controllo.
Esempi di patologie in cui il nuovo antagonista secondo l'invenzione può essere vantaggiosamente utilizzato a scopo profilattico, terapeutico o diagnostico sono artrite reumatoide, shock settico, leucemia mielocitica acuta, reazione immunologica del trapianto contro l’ospite, sindrome da immunodeficienza acquisita, colite ulcerosa e in genere in tutte le malattie autoimmuni.
Una forma di realizzazione dell'invenzione è la somministrazione di una quantità farmacologicamente attiva di icIL-lralI a individui che presentano rischio elevato di sviluppare patologie che richiedano la inibizione della IL-1 oppure le abbiano già sviluppate come ad esempio la sepsi.
Un esempio della categoria sopra citata sono quei pazienti che devono subire un intervento chirurgico.
Può essere utilizzata una qualunque via di somministrazione compatibile con il principio attivo ma particolarmente preferita è la somministrazione per via parenterale in quanto permette di avere in tempi brevi degli effetti sistemici.
Per questo motivo è preferita la somministrazione di un bolo endovenoso appena prima, durante o dopo l'intervento chirurgico. La dose di icIL-lralI da somministrare varierà sulla base delle prescrizioni del medico in funzione dell'età, del peso e della risposta individuale del paziente.
Il dosaggio potrà essere compreso fra 0,05 e 30 mg/kg di peso corporeo e la dose preferita sarà compresa fra 0,1 e 10 mg/kg di peso corporeo.
La composizione farmaceutica ad uso parenterale potrà essere formulata in forma iniettabile comprendendo il principio attivo e un adeguato veicolo. Veicoli per la somministrazione parenterale sono ben noti nel campo e comprendono ad esempio acqua, soluzione salina, soluzione Ringer, destrosio.
Il veicolo potrà contenere quantità minori di eccipienti per mantenere la stabilità e isotonicità delle soluzioni.
La preparazione delle soluzioni citate potrà avvenire con le modalità usuali e preferibilmente il contenuto di icIL-lralI sarà compreso fra 1 mg/ml e 10 mg/ml.
Altri esempi di patologie su cui il nuovo antagonista secondo l'invenzione può essere vantaggiosamente utilizzato a scopo profilattico, terapeutico o diagnostico sono artrite reumatoide, shock settico, leucemia mielocitica acuta, reazione immunologiea del trapianto contro l'ospite, sindrome da immunodeficienza acquisita, colite ulcerosa e in genere in tutte le malattie autoimmuni .
La presente invenzione è stata descritta con riferimento a realizzazioni specifiche ma il contenuto della descrizione intende comprendere tutte quelle modifiche e sostituzioni che e sono essere fatte da una persona esperta del settore senza per questo uscire dallo spirito e dallo scopo delle seguenti rivendicazioni .
Claims (4)
- RIVENDICAZIONI 1. Una proteina purificata avente attività antagonista contro almeno una delle sostanze scelte nel gruppo formato da interleuchina a e interleuchina β, o suoi frammenti, caratterizzata dal fatto di contenere la sequenza aminoacidica riportata in SEQ ID NO:11.
- 2. Una proteina purificata avente attività antagonista contro almeno una delle sostanze scelte nel gruppo formato da interleuchina a e interleuchina β, o suoi frammenti, caratterizzata dal fatto di avere la sequenza aminoacidica riportata in SEQ ID NO:13.
- 3. Una proteina purificata come descritta nella rivendicazione 2, caratterizzata dal fatto di essere ottenuta mediante la tecnica del DNA ricombinante.
- 4. Sequenza di DNA isolata che codifica per un antagonista della IL-1 avente la sequenza aminoacidica descritta nella rivendicazione 2. 5· Sequenza di DNA isolata secondo la rivendicazione 4, caratterizzata dal fatto di avere la sequenza riportata in SEQ ID NO:12. 6. Sequenza di DNA isolata che ibridizza con la sonda avente la sequenza riportata in SEQ ID NO: 1. 7- Vettore comprendente la sequenza di DNA codificante per la proteina descritta nella rivendicazione 2. 8. Coltura cellulare trasfettata o trasformata con DNA esogeno comprendente DNA codificante per la proteina descritta nella rivendicazione 2 o con un vettore secondo la rivendicazione 7· 9· Coltura cellulare secondo la rivendicazione 8, caratterizzata dal fatto di essere ottenuta da cellule di mammifero. 10. Processo per l'ottenimento di un antagonista della IL-1 mediante la tecnica del DNA ricombinante comprendente: a) coltivazione di cellule ospiti copme descritte nelle rivendicazioni 8 e 9 contenenti una sequenza di DNA in grado di produrre la proteina descritta nella rivendicazione 2; b) raccolta e isolamento della proteina codificata. 11. Processo per l'ottenimento di un antagonista della IL-1 mediante la tecnica del DNA ricombinante, caratterizzato dal fatto che la sequenza di DNA è quella riportata in SEQ ID NO:12. 12. Impiego di una proteina purificata avente la sequenza descritta nella rivendicazione 2 in campo medico. 13. Impiego di una proteina purificata avente la sequenza descritta nella rivendicazione 2 per la preparazione di composizioni farmaceutiche attive in patologie che richiedono la inibizione della IL-1. 14. Impiego secondo la rivendicazione 13, caratterizzato dal fatto che la patologia è scelta nel gruppo delle patologie autoimmuni. 15. Impiego secondo la rivendicazione l4, caratterizzato dal fatto che la patologia è scelta nel gruppo consistente di artrite reumatoide, shock settico, leucemia mielocitica acuta, reazione immunologica del trapianto contro l'ospite, sindrome da immunodeficienza acquisita, colite ulcerosa. LISTA DELLE SEQUENZE (1) INFORMAZIONI GENERALI: (i) TITOLARE: (A) NOME: Applied Research Systems ARS Holding NV (B) VIA: 6 John B. Gorsiraweg (C) CITTA': Curac ao (D) PROVINCIA: (E) NAZIONE: Antille Olandesi (F) CODICE POSTALE: (G) TELEFONO: (H) FAX: (ii) TITOLO DELL'INVENZIONE: Antagonista della Interleuchina-1 (ili) NUMERO DI SEQUENZE: 13 (iv) FORMA LEGGIBILE AL COMPUTER: (A) MEZZO: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatibile (C) SISTEMA: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versione #1.25 (EPO) (2) INFORMAZIONI PER LA SEQ ID NO: 1: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (A) LUNGHEZZA: 25 coppie di basi (B) TIPO: acido nucleico (C) CATENA: singola (D) TOPOLOGIA: lineare (ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA (iii) IPOTETICA: No (ix) CARATTERISTICHE: (D) ALTRE INFORMAZIONI: oligonucleotide denominato IRA5 utilizzato nella RT-PCR (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 1: CTGACTTGTA TGAAGAAGGA GGTGG (2) INFORMAZIONI PER LA SEQ ID NO: 2: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (A) LUNGHEZZA: 20 coppie di basi (B) TIPO: acido nucleico (C) CATENA: singola (D) TOPOLOGIA: lineare (ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA (iii) IPOTETICA: No (ix) CARATTERISTICHE: (D) ALTRE INFORMAZIONI: oligonucleotide corrispondente alla posizione 60-79 della β-actina, utilizzabile nella RT-PCR (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZE: SEQ ID NO: 2: GCGCTCGTCG TCGACAACGG 20 (2) INFORMAZIONI PER LA SEQ ID NO: 3: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (A) LUNGHEZZA: 21 coppie di basi (B) TIPO: acido nucleico (C) CATENA: singola (D) TOPOLOGIA: lineare (ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA (iii) IPOTETICA: No (ix) CARATTERISTICHE: (D) ALTRE INFORMAZIONI: oligonucleotide all'indietro complementare alle posizioni 430-449 della β-actina utilizzabili nella RT-PCR (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 3: GATAGACAAC GTACATGGCT G 21 (2) INFORMAZIONI PER LA SEQ ID NO: 4: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (A) LUNGHEZZA: 87 coppie di basi (B) TIPO: acido nucleico (C) CATENA: singoia (D) TOPOLOGIA: lineare (ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA (iii) IPOTETICA: No (ix) CARATTERISTICHE: (D) ALTRE INFORMAZIONI: Sequenza di sIL-lra non in comune (ix) CARATTERISTICHE: (A) RIFERIMENTO: CDS (B) POSIZIONE: 24..86 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 4: GAATTCCGGG CTGCAGTCAC AGA ATG GAA ATC TGC AGA GGC CTC CGC AGT 50 Met Giu Ile Cys Arg Gly Leu Arg Ser 1 5 CAC CTA ATC ACT CTC CTC CTC TTC CTG TTC CAT TCA G 87 His Leu Ile Thr Leu Leu Leu Phe Leu Phe His Ser 10 15 20 (2) INFORMAZIONI PER LA SEQ ID NO: 5= (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (A) LUNGHEZZA: 21 amino acidi (B) TIPO: amino acido (D) TOPOLOGIA: lineare (ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 5: Met Giu Ile Cys Arg Gly Leu Arg Ser His Leu Ile Thr Leu Leu Leu 1 5 10 15 Phe Leu Phe His Ser 20 (2) INFORMAZIONI PER LA SEQ ID NO: 6: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (A) LUNGHEZZA: 42 coppie di basi (B) TIPO: acido nucleico (C) CATENA: singola (D) TOPOLOGIA: lineare (ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA (iii) IPOTETICA: No (ix) CARATTERISTICHE: (D) ALTRE INFORMAZIONI: Sequenza della IL-Ira intracellulare di tipo I non in comume <ix) CARATTERISTICHE: (A) RIFERIMENTO: CDS (B) POSIZIONE: 33--4l (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 6: CAGAAGACCT CCTGTCCTAT GAGGCCCTCC CC ATQ GCT ITA G 42 Met Ala Leu 1 (2) INFORMAZIONI PER LA SEQ ID NO: 7: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (A) LUNGHEZZA: 105 coppie di basi (B) TIPO: acido nucleico (C) CATENA: singola (D) TOPOLOGIA: lineare (ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA (iii) IPOTETICA: No (ix) CARATTERISTICHE: (D) ALTRE INFORMAZIONI: Sequenza della IL-lra intracellulare di tipo II non in comune (ix) CARATTERISTICHE: (A) RIFERIMENTO: CDS (B) POSIZIONE: 33-.104 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 7: CAGAAGACCT CCTGTCCTAT GAGGCCCTCC CC ATG GCT TTA GCT GAC TTG TAT 53 Met Ala Leu Ala Asp Leu Tyr 1 5 GAA GAA GGA GGT GGA GGA GGA GGA GAA GGT GAA GAC AAT GCT GAC TCA 101 Giu Giu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Giu Gly Giu Asp Asn Ala Asp Ser 10 15 20 AAG G 105 Lys (2) INFORMAZIONI PER LA SEQ ID NO: 8: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (A) LUNGHEZZA: 24 amino acidi (B) TIPO: amino acido (D) TOPOLOGIA: lineare (ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 8: Met Ala Leu Ala Asp Leu Tyr Giu Giu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Giu 1 5 10 15 Gly Giu Asp Asn Ala Asp Ser Lys 20 (2) INFORMAZIONI PER LA SEQ ID NO: 9: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (A) LUNGHEZZA: 4γ4 coppie di basi (B) TIPO: acido nucleico (C) CATENA: singola (D) TOPOLOGIA: lineare (ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA (iii) IPOTETICA: No (ix) CARATTERISTICHE: (D) ALTRE INFORMAZIONI: Sequenza della IL-lra comune; è stato aggiunto un nucleotide G in prima posizione, per problemi riguardanti il programma della sequenza di lista, in modo da permettere che anche il primo amino acido Giu venisse codificato, ed inoltre per evitare la formazione di un codone stop all'interno della sequenza. (ix) CARATTERISTICHE: (A) RIFERIMENTO: CDS (B) POSIZIONE: 1..468 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 9: GAG ACG ATC TGC CGA CCC TCT GGG AGA AAA TCC AGC AAG ATG CAA GCC 48 Giu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gin Ala 1 5 IO 15 TTC AGA ATC TGG GAT GTT AAC CAG AAG ACC TTC TAT CTG AGO AAC AAC 96 Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gin Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn 20 25 30 CAA CTA GTT GCT GGA TAC TTG CAA GGA CCA AAT GTC AAT ITA GAA GAA 144 Gin Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gin Gly Pro Asn Val Asn Leu Giu Giu 35 40 45 AAG ATA GAT GTG GTA CCC ATT GAG CCT CAT GCT CTG TTC TTG GGA ATC 192 Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Giu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile 50 55 60 CAT GGA GGG AAG ATG TGC CTG TCC TOT GTC AAG TCT GCT GAT GAG ACC 240 His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Giu Thr 65 70 75 80 AGA CTC CAG CTG GAG GCA GTT AAC ATC ACT GAC CTG AGC GAG AAC AGA 288 Arg Leu Gin Leu Giu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Giu Asn Arg 85 90 95 AAG CAG GAC AAG CGC TTC GCC TTC ATC CGC TCA GAC ACT GGC CCC ACC 336 Lys Gin Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr 100 105 H O ACC AGT TTT GAG TCT GCC GCC TGC CCC GCT TGG TTC CTC TGC ACA GCG 384 Thr Ser Phe Giu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala 115 120 125 ATG GAA GCT GAC CAG CCC GTC AGC CTC ACC AAT ATG CCT GAC GAA GGC 432 Met Giu Ala Asp Gin Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Giu Gly 130 135 140 CT C ATG CT C ACC AAA TTC TAC TTC CAG GAG GAC GAG TACT AC 474 Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gin Giu Asp Giu 145 150 155 (2) INFORMAZIONI PER LA SEQ ID NO: 10: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (A) LUNGHEZZA: 156 amino acidi (B) TIPO: amino acido (D) TOPOLOGIA: lineare (ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ix) CARATTERISTICHE: (D) ALTRE INFORMAZIONI: Sequenza aminoacidica della IL-lra comune (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 10: Giu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gin Ala 1 5 10 15 Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gin Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn 20 25 30 Gin Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gin Gly Pro Asn Val Asn Leu Giu Giu 35 40 45 Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Giu Pro Hia Ala Leu Phe Leu Gly Ile 50 55 60 His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Giu Thr 65 70 75 80 Arg Leu Gin Leu Giu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Giu Asn Arg 85 90 95 Lys Gin Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr 100 105 n o Thr Ser Phe Giu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala 115 120 125 Met Giu Ala Asp Gin Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Giu Gly 130 135 140 Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gin Giu Asp Giu 145 150 155 (2) INFORMAZIONI PER LA SEQ ID NO: 11: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (A) LUNGHEZZA: 24 amino acidi (B) TIPO: amino acido (C) CATENA: singola (D) TOPOLOGIA: lineare (ii) TIPO DI MOLECOLA: peptide (iii) IPOTETICA: No (v) TIPO DI FRAMMENTO: interno (ix) CARATTERISTICHE: (D) ALTRE INFORMAZIONI: Una porzione della icIL-lra di tipo II non in comune (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 11: Ala Asp Leu Tyr Giu Giu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Giu Gly Giu Asp 1 5 10 15 Asn Ala Asp Ser Lys 20 (2) INFORMAZIONI PER LA SEQ ID NO: 12: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: (A) LUNGHEZZA: 579 coppie di basi (B) TIPO: acido nucleico (C) CATENA: singola (D) TOPOLOGIA: lineare (ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA (iii) IPOTETICA: No (ix) CARATTERISTICHE: (D) ALTRE INFORMAZIONI: Sequenza di DNA codificante e della IL-lra intracellulare di tipo II completa da essa codificata (ix) CARATTERISTICHE: (A) RIFERIMENTO: CDS (B) POSIZIONE: 34.-573 (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 12: CAGAAGGACC TCCTGTCCTA TGAGGCCCTC CCC ATG GCT ITA GCT GAC TTG TAT 54 Met Ala Leu Ala Asp Leu Tyr 1 5 GAA GAA GGA GGT GGA GGA GGA GGA GAA GGT GAA GAC AAT GCT GAC TCA 102 Giu Giu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Giu Gly Giu Asp Asn Ala Asp Ser 10 15 20 AAG GAG ACG ATC TGC CGA CCC TCT GGG AGA AAA TCC AGC AAG ATG CAA 150 Lys Giu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gin 25 30 35 GCC TTC AGA ATC TGG GAT GTT AAC CAG AAG ACC TTC TAT CTG AGG AAC 198 Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gin Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn 40 45 50 55 AAC CAA CTA GTT GCT GGA TAC TTG CAA GGA CCA AAT GTC AAT ITA GAA 246 Asn Gin Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gin Gly Pro Asn Val Asn Leu Giu 60 65 70 GAA AAG ATA GAT GTG GTA CCC ATT GAG CCT CAT GCT CTG TTC TTG GGA 294 Giu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Giu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly 75 80 85 ATC CAT GGA GGG AAG ATG TGC CTG TCC TGT GTC AAG TCT GGT GAT GAG 342 Ile Hls Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Giu 90 95 100 ACC AGA CTC CAG CTG GAG GCA GTT AAC ATC ACT GAC CTG AGC GAG AAC 390 Thr Arg Leu Gin Leu Giu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Giu Asn 105 no 115 AGA AAG CAG GAC AAG CGC TTC GCC TTC ATC CGC TCA GAC AGT GGC CCC 438 Arg Lys Gin Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro 120 125 130 135 ACC ACC AGT TTT GAG TCT GCC GCC TGC CCC GGT TGG TTC CTC TGC ACA 486 Thr Thr Ser Phe Giu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr 140 145 150 GCG ATG GAA GCT GAC CAG CCC GTC AGC CTC ACC AAT ATG CCT GAC GAA 534 Ala Met Giu Ala Asp Gin Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Giu 155 160 165 GGC GTC ATG GTC ACC AAA TTC TAC TTC CAG GAG GAC GAG TAGTAC 579 Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gin Giu Asp Giu 170 175 180 (2) INFORMAZIONI PER LA SEQ ID NO: 13: (i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA: {A) LUNGHEZZA: 180 amino acidi (B) TIPO: amino acido (D) TOPOLOGIA: lineare (ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina (ix) CARATTERISTICHE: (D) ALTRE INFORMAZIONI: Sequenza della icIL-lra di tipo II completa (xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 13: Met Ala Leu Ala Asp Leu Tyr Giu Giu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Giu 1 5 10 15 Gly Giu Asp Asn Ala Asp Ser Lys Giu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly 20 25 30 Arg Lys Ser Ser Lys Met Gin Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gin 35 40 45 Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gin Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gin 50 55 60 Gly Pro Asn Val Asn Leu Giu Giu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Giu 65 70 75 80 Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Het Cys Leu Ser 85 90 95 Cys Val Lys Ser Gly Asp Giu Thr Arg Leu Gin Leu Giu Ala Val Asn 100 105 110 Ile Thr Asp Leu Ser Giu Asn Arg Lys Gin Asp Lys Arg Phe Ala Phe 115 120 125 Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Giu Ser Ala Ala Cys 130 135 140 Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Giu Ala Asp Gin Pro Val Ser 145 150 155 160 Leu Thr Asn Met Pro Asp Giu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe 165 170 175
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