UA65522C2

UA65522C2 - Inner cellular isoform of interleukin-1 receptor antagonist

Info

Publication number: UA65522C2
Application number: UA97052129A
Authority: UA
Original assignee: Applied Research Systems
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1995-12-10
Publication date: 2004-04-15
Also published as: NO971624D0; EE03697B1; EE9700090A; DE69534419D1; NO971624L; CA2202470A1; RU2193064C2; BR9509317A; CN100363053C; EP0786002B1; IT1270662B; ATE303439T1; KR970706391A; KR100237936B1; AU701471B2; ITMI942097A0; DE69534419T2; WO1996012022A1; MX9702616A; CN1224707C

Description

Настоящее иизобретениє относится к области биотехнологии. Оно описьмшвает новьй антагонист интерлейкина-1 (І/-1) активньій в отношений как ІІ-іа, так и 1-18, новую последовательность ОМА, кодирующую антагонист ІЇ-1, и способ получения антагониста ІЇ-1 методикой рекомбинантной ОМА. Оно таюке описьшваєт профилактическое, терапевтическое и диагаостическое применение такого нового антагониста 1-1 при патологиях, зависящих от образования ІІ -1.

Предпосьлки к созданию изобретения

Существуют два различньїх гена, кодирующих интерлейкин-1 (І/-1), названньюе ІІ-Іа и І/-18, которье кодируют белок ІІ --Іа и 1-18, соответственно.

Интерлейкиньї ІІ --Іа и І. -18 являются плейотропньїми цитокинами, которье, хотя их последовательности и обнаруживают недостаточную аналогию, оказьвают множество сходньїх воздействий на различнье ткани и влияют на многие патологий человека, в частности на иммунньй ответ организма и на воспалительнье процессь!.

Оба белка имеют молекулярную массу около 17,5кД, и они предварительно синтезируются как молекула предшественника большего размера, имеющая молекулярную массу около З1кД.

І-ТГьо являются сильньми воспалительньми и пирогенньми цитокинами, которье обьчно имеют полезнье зффекть, но могут также иметь зффектьї, вреднье для здоровья организма.

Они могут, например, принимать участие в патогенезе симптомов аутоиммунньїх патологий, подобньх красной волчанке, в частности, они участвуют как медиаторьї в провоцировании поражения тканей, как, например, при ревматоидном артрите.

Многие биологические зффекть! І-ї подобньі тем, которье могут наблюдаться в случає сепсиса.

Последние исследования продемонстрировали, что внутривенное введение ІЇ-1 в дозах от 1 до 1Онг/кг вьізьівает лихорадочное состояние, сонливость, отсутствие аппетита, общую миалгию, артралгию и сильную головную боль.

Так как 1-1 имеет плейотропнье биологические свойства, многие из которьїх отрицательно воздействуют на организм, мощнье зффектиьї ІІ -1 должнь!ї находиться под четким физиологическим контролем.

Синтез ІІ-1 ингибируется противовоспалительньіми цитокинами, простагландинами и глюкокортикоидами, и наличие множества уровней ингибирования 1-1 указьвваєт на необходимость точного регулирования зтого медиатора.

І/-1 является единственньм цитокином, для рецептора которого до настоящего момента описан антагонист-полипептид, третьим известньмм на сегодня компонентом семейства ІЇ/-1 является антагонист рецептора 11 -1 (І -1Тга).

Все три компонента (ІІ-та, 1-18 и ІЇ-1га) распознаются и связьяваются с одним и тем же рецептором на поверхности клетки (ІІ -18); связьвваниеє ІІ-їа й ІІ -18 с І/-1А передаеєт сигнал, а ІЇ-га - нет.

Существуеєт два типа рецепторов 1-1, названньє 1 -1В1 и І -1 ВІ. І--1га является полипептидом, которьй связьіваєт ІІ -1ВІ и обладаєт меньшим сродством к 1-1 ВІ! без какой-либо агонистической активности.

Образование І1ЇІ-1га вьізьівается дО, цитокинами и бактериальньми продуктами в различньїх клеточньх типах, включая мононуклеарнье фагоцитьї, полиморфонуклеарньсе клетки (ПМН) и фибробласть.

До сих пор идентифицировань! и клонированьі две молекулярнье формьї! ІЇІ-1га: 1) секретированньй І! -

Тга (51Ї-1га) содержит классическую лидерную последовательность из 25 аминокислот, дающую зрельй белок из 152 аминокислот; 2) внутриклеточньй І/-їга (ісіЇ-їга) испьїтьшвшаєт недостаток в лидерной последовательности, а зто предопределяет то, что белок остаєтся внутриклеточньм. 5ІЇ-Та и ісі!/-їгта образуются из одного и того же гена. Транскрипть! ісіЇ-їгта берут начало от сайта альтернативной инициации и от сплайсинга первого альтернативного зкзона во внутреннем акцепторном участке сплайсинга, размещенном в первом зкзоне 51Ї-1га. Прогнозируемьсе белки, таким образом, идентичнь! за исключением их МНег-концов, где первье 21 аминокислота 51І-1га замещень! четьрьмя аминокислотами в іс! -Тга.

Зкспрессия транскриптов, кодирующих в5і/-їга и ісіЇ-їга, регулируется по-разному. Биологическая значимость ісіЇ-1га еще не вніяснена.

Подразумеваєтся, что І/-1 принимаєт участие в патогенезе многих болезней, позтому очевидна необходимость иметь доступньіе медикаменть, пригоднье для ограничения вредньїх для здоровья зффектов

І -1.

Краткое описание изобретения

Цель настоящего изобретения - обеспечить антагонист ІІ -1 активньйй в отношении как ІЇІ-Та, таки І -18В8 и их комбинации.

Следующая цель настоящего изобретения - обеспечить ОМА последовательность, кодирующую антагонист 1-1, и способ получения такого нового антагониста методикой рекомбинантной ОМА.

Другая цель настоящего изобретения - обеспечить антагонист в практически очищенной форме, чтобь он бьіл пригоден для применения в фармацевтических композициях, действенньїх против патологий, которье требуют ингибирования ІІ -1.

Дальнейшие цели и преймущества изобретения станут очевидньіми в следующем описаний.

Краткое описание фигур и списка последовательностей

Фигура 1 описьівает последовательность ОМА и последовательность белка для части вне общей, сі! -1 гаї (ЗЕО ІО МО:8 и 5ЕО ІЮ МО:9) в сравнении с тем же для 51 -1га (ісіЇ -1га!; БЕО ІЮ МО:6) и вії -1га (ЗЕО ІЮ МО:4 и ЗЕО ІЮ МО:5), а также описьівает ОМА последовательность и кодируемьй ею белок для общей части ІІ-1га (ЗЕО ІЮ МО:13 и 5ЕО ІЮ МО:14).

Фигура 2 описьівает АВТ-РСВА анализ зкспрессии ісії -1 гаїЇ в различньх типах клеток.

Фигура З описьівает вестерн-блоттинг рекомбинантного ісіЇ!--1 гаї.

Фигура 4 описьіваєт влияния ісі! -Іга!! на индуцированную 1-1 зкспрессию Е-селектина в зндотелиальньмх клетках.

ЗЕО ІЮ МО:1 представляет последовательность олигонуклеотида, названного ІВА5, для применения в

АТ-РСВ.

ЗЕО ІЮ МО:2 представляєт последовательность олигонуклеотида, соответствующую нуклеотидам 69-70

В-актина СОМА, для применения в АТ-РСВ.

ЗЕО 10 МО:З представляєт последовательность обратного олигонуклеотида, комплементарного нуклеотидам 430-449, для применения в ВТ-РСВ.

ЗЕО ІЮ МО:4 представляет ОМА последовательность, кодирующую 51Ї-1га, для части вне общей.

ЗЕО ІЮ МО:5 представляет аминокислотную последовательность вії! --1га для части вне общей.

ЗЕО ІО МО:6 представляєт ОМА последовательность, кодирующую три аминокислоть ісіЇ - 1гаї, для части вне общей.

ЗЕО ІЮ МО:7 представляет три аминокислоть ісіЇ--1га! для части вне общей.

ЗЕО ІЮ МО:8 представляет ОМА последовательность, кодирующую ісії --1гаїІ, для части вне общей.

ЗЕО ІЮ МО:9 представляет аминокислотную последовательность сі! --1гаїЇ для части вне общей.

ЗЕО ІЮ МО:10 представляєет ОМА последовательность ІЇІ-1га, для общей части. Что касается вопросов, относящихся к программе "Раїепіїп ЕРО", для получения последовательностей (3 нуклеотид присоединяют в первом положений последовательности для того, чтобь! обеспечить кодирование первой аминокислоть! Сі и с тем, чтобьії избежать образования терминирующего ко дона на внутренней стороне последовательности.

ЗЕО ІЮ МО:11 представляет аминокислотную последовательность ІЇ-1га для общей части.

ЗЕО ІЮ МО:12 представляєт последовательность из 21 аминокислоть!, которая представляет фрагмент іс! -1гаїЇ не общий с другими ІІ -1га.

ЗЕО ІЮ МО:13 представляет ОМА последовательность, кодирующую полньіїй ісії! - 1 гаї.

ЗЕО ІЮ МО:14 представляет аминокислотную последовательность полного ісіЇ -1 гаї).

Описание изобретения

Зтот новьій антагонист І/-1 получен путем инсерции в рамку ОМА, кодирующей |ісіЇ-Тга, новой последовательности из 63 пар оснований (бр) между первьм ісіїЇ-1Іга специфичньм зкзоном и внутренним акцепторнь!м участком первого зкзона вії -1га.

Путем АТ-РСА зкспериментов авторьї зтого изобретения обнаружили, что зтот новьій транскрипт зкспрессируется в активированньїх моноцитах и фибробластах и в полиморфонуклеарньх клетках (ПМН).

Зкспрессия в клетках СО5 показала, что зтот новьій антагонист является в найбольшей степени внутриклеточньїм и имеет молекулярную массу (ММ) приблизительно 25кД по 505-РАСЕ.

Новьй рекомбинантньй антагонист обнаруживает способность инги-бировать1Б-1.

В настоящей заявке, для ясности и простоть, известньїй в настоящее время ісіЇ-1га обозначен как ісіІ-1га типа І (ісі!-ТгаЇ), в то время как новьй антагонист, описанньй здесь и являющийся предметом настоящего изобретения, определен как ісі!-1га типа І! (іс!і -1гаї).

Примерами патологий, при которьїх новьій антагонист в соответствии с настоящим изобретением может бьіть с успехом использован для профилактики, терапиий или диагностики, являются ревматоидньй артрит, септический шок, острьій миеломоноцитарньй лейкоз, иимунологическая реакция трансплантат против хозяина, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), язвенньй колит и все аутоиммуннье заболевания вообще.

Воплощением изобретения является введение фармакологически активного количества |ісії!-ІгаіЇ людям, имеющим вьісокий риск развития патологий, требующих ингибирования ІЇ/-1, или людям, у которьїх уже проявляются патологии подобнье сепсису.

Примером вьішеуказанной категории являются пациентьї, окидающие хирургической операции.

Любой путь введения, совместимьй с действующим началом, может бьїть использован, но особенно предпочтительньм является парентеральноеє введениєе, так как позволяет получить за короткое время системнье зффекть!.

По зтой причине предпочтительно введение внутривенного болюса непосредственно до, во время или после хирургической операции. Дозу ісіїЇ-1гай, которая должна бьть введена, подбирают на основе медицинеких показаний в соответствий с возрастом, массой и индивидуальной реакцией пациента.

Дозировка может бьїть между 0,05 и Зомг/кг массь! тела, а предпочтительная дозировка - между 0,1 и 1Т1Омг/кг массь! тела.

Фармацевтическая композиция для парентерального применения может бьіть приготовлена в форме для вливания, содержащей действующее начало и подходящий носитель. Носители для парентерального введения хорошо известньі на практике и содержат, например, воду, солевой раствор, раствор Рингера и декстрозу.

Носитель может содержать меньшие количества наполнителей для того, чтобьї обеспечить стабильность и изотоничность раствора.

Приготовление указанньїх растворов может бьіть осуществлено в соответствии с обьічньіми приемами, а предпочтительное содержание ісіІ-1гаїЇ должно бьіть между мг/мл и 1Омг/мл.

Кроме того, примерами патологий, при которьх новьй антагонист в соответствий с настоящим изобретением может бьть с успехом применен в целях профилактики, терапиий и диагностики, являются ревматоидньій артрит, септический шок, острьиій миеломоноцитарньй лейкоз, иммунологическая реакция трансплантат против хозяина, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), язвенньй колит и все аутоиммунньсе заболевания вообще.

Настоящее изобретение описано со ссьілкой на специфические его воплощения, но содержание описания охватьнвваєт все модификации и замещения, которье могут бьіть произведень! специалистом в зтой области, не вніходя за рамки содержания и целей пунктов формуль! изобретения.

В следующей части будут описаньі некоторье способьї осуществления изобретения, хотя могут бьть использованьй и зквивалентнье материальй и способь. Позтому следующие примерь являются чисто иллюстративньми и не ограничивающими изобретения.

Пример 1

Клонирование и характеризация сії -1 гаї!

Материаль и способь!

Реагенть

Для культивирования и отделения клеток используют следующие коммерчески доступнье реагенть!: апирогенньій солевой раствор и дистиллированную воду для клинического применения; среду АРМІ 1640; среду ОМЕМ; среду М199; І-глутамин; РегсоїІ, Рісоії-Нірадие; взятую в асептических условиях сьіворотку телячьих змбрионов; ростовую добавку зндотелиальньїх клеток (ЕСО5), полученную из бьчьего мозга; гепарин.

Все реагентьь содержат менее 0,125ЕШ/мл зндотоксина, что проверено способом анализа с использованием лизата амебоцитов І ітшив.

Клетки

ПМН и моноцить! человека, циркулирующие в кровеносной системе, вьіделяют из периферической крови здоровьїх доноров центрифугированиєм в ступенчатом (4695 для моноцитов и 6295 для ПМН) градиенте изоосмотиче-ского (285 тО5т) РегсоїЇ, как описано Союйа Е., Регі с., МіМа 5А., Мапіомапі А., Варіа кіШпа ої асіїпітусіп О (геаїеа ШшШтоиг сеї Бу питап топописієаг сеїІв. 9. Іттипої. 132:936, 1984. Клетки вьіделяют на границе раздела, дваждь! промьівают в солевом растворе и ресуспендируют в среде.

Процент вьделяємьх ПМН и моноцитов превьшаєт 9095, а чистота - 9895, что определяют морфологическим изучением окрашенньїх центрифугированньїх в цитоцентрифуге клеток. Для ПМН и моноцитов обьічно применяют среду для культивирования клеток ВРМІ 1640 с 2мМ І -глутамина и 10956ЕС5.

Зндотелиальнье клетки человека (ЕС) получают из пупочньїх вен и культивируют, как подробно описано в литературе (АІамепа Р., Радапіп С, Мапйіп-Радига І., Регі С., Сабоїї М., Оєвдапа Е., Магспівіо Р.С., Мапіомапі А.,

Моїесшіе5 апа вігисішге5 іпмоїмей іп Ше аддезіоп ої пашга! Кіег сеї ю мавсшаг епдоїеїййт, У. Ехр. Меад., 173:439, 1991).

Обьічно применяют конфлюзнтньсе клетки 2-го-5-го пассажей, поддерживаємьсе в среде М199 с 1095 ЕС5 с добавлением ЕСО5 (50мкг/мл) и гепарина (10Омкг/мл).

Клетки СО5 культивируют в среде ОМЕМ с 1095 ЕС5, а клетки фибробластов 8387 - в среде АРМІ1640 с 1095 ЕС5.

После соответствующей обработки клетки исследуют на тАМА ІІ -1га или белок ІЇ-1га, как описано ниже. вАТ-РСсВ

Тотальную АМА зкстрагируют способом с использованием изотио-цианата гуанидина с незначительньіми модификациями.

АТ-РСВ проводят как описано Соіойца Р., РоІепіагийці М., бігопі М., Мапіомапі А., у). Віої. Спет,. 267:18278, 1992.

Коротко говоря, проводят обратную транкрипцию імкг тотальной ВМА в обратно транскриптазном буффе (БмМ Масі», 50мМ КСІ, 10мММ трис-НСЇ; рН 8,3) с 2,5ММ случайньїх гексамеров, 1мММ каждого дезокси- нуклеотидтрифосфата, Тед/мл ингибитора АМазь и 2,5ед/мл транскриптазьі вируса лейкоза мьішей тоіопеу (Реїкіп ЕІтег Сейз, Могмаїк, СТ).

Образцьі инкубируют в течение 1Омин. при 25"С, а затем в течение 45мин. при 42"С. Потом в реакцию сСОМА добавляют специфичную пару прай-меров, разработанньїх для амплификации СОМАв», кодирующих сі! -

Тга! или ісіІ -1гаїІ, а также В-актин человека в качестве внутреннего контроля.

Амплификацию проводят в 2мМ МаосСі», 50мМ КСІ, 0,2М каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 2,Бединиць!/100мл полимеразь! Тад (РеїКкіп ЕІтег Сефв) и 4мг/мл каждого специфичного праймера (см. ниже).

Амплификацию (30 циклов) ведут в автоматизированном термальном циклере (Реїкіп ЕІтег Сей5) при 9570, при 557С и при 7570 по 1,5мин. для каждого условия.

Амплифицированньсе продукть! проводят через агарозньй гель, окрашенньй 195 бромидом зтидия вместе с стандартами молекулярной массь (Воепгіпдег Маппнєїт, Мапппєїт, Септапу).

Олигонуклеотидьії синтезируют фосфороамидитньм способом. Последовательности нуклеотидов, применяемьсе для селективной амплификации ісіЇ-1га идентичньї описанньїм НаФкії 5. єї аї., Май! Асад., О5А, 88:3681,1991.

В частности, авторьї используют олигонуклеотидь! (4М397 (описань! здесь как ІВА 1) и 2М368 (ІВА 4).

Для амплификации ісіЇ-1га! авторьї используют ІНА 4 и ІННА 5 (5ЕО ІЮ МО), которне специфично распознают дополнительньй зкзон, которьй, как описано здесь, входит в последовательность ісіЇ! -1 гаї.

Для амплификации В-актина описан "прямой" олигонуклеотид в 5ЕБЕО І МО:2, соответствующий нуклеотидам 60-79 СсОМА В-актина. "Обратньй" олигонуклеотид, комплементарньй нуклеотидам 430-449, представлен 5ЕО ІЮО МОЗ.

Продуктьї амплификации субклонируют (ТА Сіопіпд бЗузієт, Іпмйгодеп, Зап Оіедо, СА) и секвенируют способом терминации дидезоксицепи.

Зкспрессия продуктов ісіЇ-1га в клетках СО5 сОМАв5, содержащие 32 парь оснований 5'-нетранслируемого участка, полную открьтую рамку считьівания и 6 пар оснований (включающих стоп-кодон) 3--нетранслируемого участка как ісі!-1гаї, так и ісіЇ- 1га!ї, получают АТ-РСВ с олигонуклеотидами ІВА 4 и ІВА 5, как подробно описано вьіше, и затем лигируют в зкспрессирующий вектор реЕ5. Достоверность обратной транскрипций и амплификации проверяют секвенированием.

Плазмидь, содержащие сСОМА в корректной ориентации, очищают в градиенте СеСі, а затем трансфицируют ими клетки СО5 способом осаждения кальция, как описано Затрбгоок .). єї аї., Соїй бргіпд

Нарюог І арогаюгу Ргезз, 1989.

Через два дня супернатанть культурь и лизать! обработанньїх ультразвуком клеток исследуют ЕЇГІ5А или иммуноблоттингом, как подробно описано ниже. Пустую (нетрансфицированную) плазмиду используют в качестве контроля.

Идентификация иммунореактивного ІЇ-1га

Используют коммерческий тест ЕГІЗА (АтегзПпат, ВисКтатвевпіге, ОК), которьій идентифицирует как 51 -

Тга, так и ісі!-Тга. Для вестерн-блоттинга (анализа У/езієтп Біої) используют поликлональнье антисьіворотки двух кроликов и одной козь.

Образцьі лизатов и супернатантьь клеток СО5 подвергают злектрофорезу 12.595 505-РАСЕ, а затем блоттингу на нитроцеллюлозном фильтре (5ігагадепе, І а доПа, СА, ОБА).

Инкубацию с первичньмми и вторичньми антителами осуществляют согласно стандартньмм методикам.

Первичньсе антитела представлень! по-ликлональньїми антителами кролика против ІЇ-1га.

Вторичнье антитела представлень фракцией козьего иммуноглобулина против кролика, связанной с пероксидазой хрена (Атегепат). Бзндьї фракции иммунореактивного белка обнаруживают способом на основе хеми-люминесценции (ЕСІ! Оеєїесіоп, АтегеПпат), осуществляеємьм согласно рекомендациям производителя.

Индуцируемая 11 -1 зкспрессия Е-селектина на ЕС

Конфлюзнтньсе ЕС, культивированньсе в 96-луночньїх планшетах (РаїЇсоп), инкубируют в течение 30 минут с количеством лизата трансфицированньхх клеток СО5 (см. вьіше), которое соответствует 25 до 10Онг рекомбинантного ІЇІ-1га (ісі! -1гаїЇ или ісі!-1га!), что определяют специфическим анализом ЕГІЗА (Атегзпат).

В качестве контроля параллельно используют равное количество лиза-та СО5, полученного из "обманно" трансфицированньїх клеток. Затем ЕС обрабатьвают в течение 6 часов 0,1-Інг/мл рекомбинантного 11-18 человека. Детекцию зкспрессии Е-селектина осуществляют анализом БЕ І5А на адгезионньх ЕС с моноклональньм антителом ВВ1С2-Е2 против Е-селектина в качестве первичного антитела и антисьівороткой кроликов против мьішиного Ід, коньюгированной с пероксидазой хрена, в качестве вторичного антитела. О.О. (оптическую плотность) образцов определяют детекцией планшетов на спектрофотометре (Ріом/) при длине волнь 405.

Результать

Идентификация сії -11гаї!

Специфические олигонуклеотиднье праймерь! разрабатьввают (указань! как ІВА 1 и ІВА 4 на фиг.1) для получения полной кодирующей последовательности ісіІ-1га (Фиг.1) с помощью АТ-РСА. Амплифицирован- нье продуктьі из ПМН человека субклонируют и секвенируют.

Дополнительно к ранее известной последовательности ісіЇ-іга изобретатель вьіделяет ряд клонов, последовательности которьїх идентичньї опубликованной кодирующей последовательности ісі!-їга при важном исключений, которое составляет дополнительная последовательность из 63 пар оснований между нуклеотидами 132 и 133 последовательности ісіЇ-1Іга. С помощью описанньйх зкзон-интронньх связей ісі!-1га дополнительную последовательность вводят между первьім безлидерньм зкзоном ісіЇ-їга и внутренним акцепторнь!м сайтом первого зкзона 51!-- 1Тга (Фиг.1).

На Фиг.1 представлена рассчитанная аминокислотная последовательность. Новьій белок (далее назьіваємьій ісіЇ-1га типа ІІ) имеет первье три аминокислоть! на МНо-конце как у классического ісі!-1га (ісі! - 1Тга типа І), за которими следует новая последовательность из 21 аминокислотьі. Остальньсе части у двух белков идентичнь.

Любопьтно, что связьтвание с внутренним акцепторньім сайтом первого зкзона 5іЇ-1га всегда даєт как у 5ІЇ-Тга, так и у ісіЇ-Тгаї и ісіЇ-Тгаїї, остаток одной и той же аминокислотьї, например глутаминовой кислоть! (Фиг.1).

Найиболее удивительной характеристикой вставленной аминокислотной дополнительной последовательности является наличие семи остатков оглицина, шесть из которьїх являются последовательньми. Остатки глицина фланкировань! с обеих сторон остатками глутаминовой кислоть!. ІСІ! -

Іга!І состоит из 180 аминокислот.

В целом гидрофильньй образец ісії! -1гаїЇ близок к таковому ісіЇ!-1гаї, но не имеет гидрофобного лидерного пептида на МНе-конце.

Зкспрессия сії -гаїї

Для идентификации транскриптов ісіЇ-1га!! проводят анализ АТ-РСА с парой специфически созданньх олигонуклеотидов (ІВА 5 и ІВА 4, Фиг.1) с ожидаємьм амплифицированньм продуктом из 33 пар оснований.

Как показано на Фиг.2, транскриптьї, кодирующие ісіїЇ-їгай, определяют в РМА-, ІІ/-1- и ТМЕ- активированньїх фибробластах. Слабьй, но поддающийся определению бзнд отмечен в моноцитах, обработанньх І РБ.

ПМН, как обработаннье, так и необработаннье, (Фиг.2) также имеют очень слабьй бзнд ожидаемого размера.

Специфичность амшшфицированньх продуктов, показанная на Фиг.2, подтверждают субклонированием и секвенированием.

Зкспрессия рекомбинантного ісії -1 гаї!

Клетки СО5 трансфицируют последовательностью ОМА, кодирующей ісі!-1гаїї, и, для сравнения, последовательностью, кодирующей ісі!-Тгам. Затем клеточнье лизать! и супернатанть! исследуют вестрен- блоттингом.

Поликлональньсе антисьіворотки, используемье в зтих зкспериментах, одинаково хорошо распознают

Іс! -1 гаї! и іс! -1гаї! (Фиг.3). Большинство, если не все, ісі!-1 гаї и ісіЇ-1гаІ обнаруживают в клеточньх лизатах.

Рекомбинантньй ісіЇ-1га!І мигрируєет как предоминантньій бзнд 22кД, тогда как ісіЇ-1ІгаїЇ имеет массу приблизительно 25кКД.

Ингибирование активности ІІ -18 рекомбинантнь/м ісії -1 гаї!

Рекомбинантньїй ісіЇ-1гаіЇ исследуют на активность ингибирования 1І-1. Для зтой цели авторь! виібирают индуцированную 1-1 зкспрессию Е-селектина на зндотелиальньїх клетках, поскольку зтот анализ является чувствительньі!м (определяемая индукция 1ООпг/мл ІІ -1 или менеєе) и бьістрь/м (6 часов инкубации с ЇЇ -1).

Лизать! "обманно" трансфицированньїхх клеток СО5 не приводят к значительному снижению активности ЇЇ -

Ісі.-ТгаіЇ не обладаєт агонистической активностью.

Как показано на фиг.4, рекомбинантньїй ісіІ-тТаїЇ ингибирует доза-зависимь!м образом активность ІІ -1.

Зти данньсе доказьівают, что ісі!-1гаїЇ действительно является ингибитором ІІ -1.

Обсуждение

Изобретатели описьввают новую молекулярную форму ісіЇ-Іга. Новую молекулу получают инсерцией 63 пар оснований между первьім безлидерньм зкзоном ісі!/-їгта и внутренним акцепторньм сайтом первого зкзона вії! -1га.

Поскольку полученньй белок частично идентичен классическому ісі!/-їта, за исключением дополнительной последовательности из 21 аминокислотьї, расположенной на МНо-конце молекульі, изобретатели предполагают назвать зту новую форму ісіЇ-їгта типа Ї, считая классическую последовательность ІсіЇ -1га как ісіІ -1га типа І.

Зкспериментьі с использованием НАТ-РСА показьмшвают, что транскрипть! ісіЇ-Тгаї! индуцируются в моноцитах и фибробластах. Рекомбинантньй ісіЇ!-1Тгаїї, зкспрессирующийся в клетках СО5, имеет среднюю мол. массу приблизительно 25кД и активность ингибирования 1-1, сравнимую с активностью, проявляемой іс -1ТгаІ при зкспрессии в тех же зкспериментальньмх условиях.

Транскрипть!, кодирующие ісіЇ-їга и 5іІЇ-їга, получают с одного и того же гена, используя различньй сплайсинг. ісіЇ-їїта получают с помощью альтернативного начала транскрипции зкзона, введенного во внутренний акцепторньй сайт первого зкзона, содержащего лидерную последовательность 511 -1га.

Результатьі, полученнье изобретателями, предполагают новую организацию гена ІЇ-1Іга, при которой дополнительньй зкзон расположен между первьім зкзоном классического ісі!-1Іга и 5іЇ-1га, соответственно.

При использований зтого нового зкзона получают полипептидную молекулу, которая при отсутствий сигнального пептида отличаєтся по М-концу от ісіЇ-Ігаі инсерцией 21 аминокислотьі, сохраняя при зтом способность ингибировать ІІ--1.

Использование альтернативного сплайсинга для создания различньїх молекул ІІ-1га представляется регулируемьмм в вьісокой степени. Транскрипть! ісіЇ-1гаїЇ индуцируют с помощью 1-1, ТМЕ и форболовьх зфиров в фибробластах и с помощью І РБ5 - в моноцитах. Обнаружено, что в фибробластах форболовье зфирь селективно индуцируют транскрипть ісіІ-1Тга, тогда как ІЇ-1 и ТМЕ индуцируют тАМАФ как 51Ї-1га, так и

ІісІЇ-Тга. В моноцитах ІІ -13, увеличивающий транскрипцию как 51Ї--1га, так и ісіІЇ-1гаї, не индуцирует ісії! -1 гаї).

Наконец, ПМН, в которьх 5ІЇ/-Тїгта и ісі/-їїта конститутивно зкспресси-руются и индуцируются, зкспрессируют очень мало транскриптов, как установлено ВТ-РСВА. Более того, зти даннье показьвают, что механизмьі, индуцирующие с помощью различного сплайсинга образование трех форм ІІ-1га, регулируются различньїм образом в ответ на внешние сигналь!.

Аминокислотная последовательность описанной здесь дополнительной последовательности удивительна тем, что она содержит семь остатков глицина, шесть из которьїх расположень!ї последовательно.

Богатье глицином последовательности присутствуют в молекулах с различньми биологическими активностями, включая предсердньй рецептор натрийуретического клиренса, гомеобокс гена НОХІ11, промежуточньсе нити кератинов и ядерньсе белки, участвующие в связьітваний цетромера или сплайсинге АМА.

Однако, за исключением остатков глицина, очевидная гомология аминокислотньїх последовательностей, фланкирующих богатье глицином участки, не обнаружена между зтими белками и ісії -1 гаї.

Система 1-1 демонстрирует необьічайньй уровень сложности, представленньй двумя агонистами, двумя рецепторами, один из которьїх является ингибитором 1ІІ/-1, и антагонистом рецептора, для которого могут существовать, по меньшей мере, три различнье молекулярнье формь, если принять во внимание полученньсе результать!.

Хотя биологическое значение внутриклеточньїх форм ІІ-1га требует четкого установления, приведеннье здесь даннье указьівают, что альтернативньм сплайсингом можно получить две различнье формь! ісії -Іга с различньіїми М-концами в ответ на вьібраннье внешние стимульі.

Наличие множественньх и сложньїх уровней контроля ІІ-1 указьівает на абсолютное требование жесткого физиологического контроля воспалительного потенциала зтого цитокина.

Описание фигур

Фигура 1

Последовательность ОМА и рассчитанная последовательность белка ісіїЇ-1гай в сравнений с классическим ісії!--1 га (ісіІ-1гаї) и 5ІЇ--1Тга.

В верхней части Фигурьі! 1 показаньї последовательности ОМА и белка, специфично представленнье в 5ІЇ-Тга, ісі!-1га! и ісіЇ-1гаїІ. В нижней части Фигурь 1 показана последовательность, общая для трех форм ІЇ-

Тга.

Полнье последовательности каждой молекульй таким образом ополучают связьшванием каждой специфичной части с общей последовательностью. Для ясности, последовательность ОМА |ісіЇ-їга начинается с нуклеотида 91 опубликованной 5'-нетранслируемой последовательности, и описань! только 6 пар оснований 3'-нетранслируемой последовательности.

Общая последовательность ІЇ/-1га начинаєтся с внутреннего акцепторного сайта, расположенного в первом зкзоне 51Ї--1га, соответствующем нуклеотиду 133 полной последовательности сі! -1гаІ и нуклеотиду 88 полной последовательности вії - 1га.

Стрелки указьвают прямой (ІВА 1 и ІВА 5) и обратньй (ІВА 4) олигонуклеотидьі), используемье для анализа АТ-РСВЕ, как описано в тексте. Олигонуклеотид ІВА 5 распознает только ОМА ісії -1аїї.

Фигура 2

Анализ АТ-РСВ зкспрессии сі! -ТаїЇ в клетках различньїх типов

Проводят обратную транскрипцию АМА5 фибробластов 8387 (панель А), моноцитов (В) и ПМН (С).

Продукть! каждой реакции синтеза ОМА затем разделяют на два образца, один из которьїх амплифицируют с олигонуклео-тидами ІВА 5 (прямой) и ІВА 4 (обратньїй) с целью детекции транскриптов ісі!-1гаї!І, а другой амплифицируют с В-актин-специфичньїми олигонуклео-тидами (см. Раздел Материаль и Способьї),

Затем амплифицированнье продуктьії исследуют в агарозном геле, окрашенном бромидом зтидия.

Амплифицированнье продуктьі, соответствующие В-актину, приведеньй слева от стандарта, а амплифицированнье продукть!, соответствующие сі! -Іга!! (справа), указаньії стрелкой. Специфичность зтих бзндов подтверждают субклонированием и секвенированием.

Фигура З

Вестрен-блоттинг рекомбинантного ісОі -1 гаї!

Клеточньсе лизать! из клеток СО5, трансфицированньїх ОМА», которне кодируют ісі!-1гаї (2) или ісіІ-1 гаї (3) или "пустьмм" вектором, которьй не содержит такой ОМА (1), исследуют иммуноблоттингом с поликлональньми антителами кролика против ісіІ-1га. Стандарть! молекулярной массь указань.

Фигура 4

ЗфФфекть ісіІЇ--гаіЇ на индуцированную ЕЇ -1 зкспрессию Е-селектина на зндотелиальньх клетках

Зндотелиальнье клетки обрабатьгоают 0,1 или нг/мл ІЇ-18 человека с или без 25-10Онг/мл ісії! -ІгаїЇ или зквивалентньми количествами лизатов кклеток СОб5, полученньх из клеток, которье "обманно" трансфицировань! с помощью пустого вектора, как подробно описано в разделе Материаль и Способь!.

Через 6 часов инкубации зндотелиальнье клетки исследуют на зкспрессию Е-селектина тестом ЕПІ5А, которьй проводят на адгезионньх клетках.

Приведеннье даннье являются процентами индуцированной 1-1 зкспрессии Е-селектина относительно контроля.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

(1) ГЛАВНАЯ ИНФОРМАЦИЯ: (ї) ЗАЯВИТЕЛЬ: (АХ) НАЗВАНИЕ: АРРІЕО РЕБЕАНСН 5У5ТЕМ5 АН НОЇ ОІМОа М.М. (Б) УЛИЦА: 14, дУОНМ В.

СОВАБІВАМЕС

(В) ГОРОД: СОВАСАО (Г) СТРАНА: МЕТНЕВІ АО5 АМТІ ГГ ЕБ (Д) ПОЧТОВЬЙИ КОД (21ІР): НЕТ (ЕХ) ТЕЛЕФОН: 599-9639300 (Ж) ТЕЛЕФАКС: 599-9614129 (и) ЗАГОЛОВОК ИЗОБРЕТЕНИЯ: АНТАГОНИСТ ИНТЕРЛЕЙКИНА-1 (її) число

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 14

ЧУ КОМПЬЮТЕРНАЯ ЧИТАЕМАЯ ФОРМА: (АУТНИ НОСИТЕЛЯ: Флоппи диск (лискета) (Б КОМПБЮТЕР: ТАМ РОС совместимьйй (В ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РСЕ-ПОВЛМУ-БОХ (Г/ ПРОГРАМНОВОБЕСПЕЧЕНИВ: Раїсотів Кеівазе Я.О,

Метвіоп Я.Ю (ЕРО) (У ИНФОРМАЦИЯ ОБЕО ТО МОХ: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

ГАРДЛИНА: 25 пар оснований (БУ ТИП: нукленновая кислота. (ВУ КОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ МОЛЕКУЛЬ: одна (г) ТОПОЛОГИЯ: ливейная

ПО ТИ МОЛЕКУЛЬР СГИЧА,

ПО) ГИПОТЕТИЧеСКАЯ : НЕТ

ФО АНТИСМБІСЛОВАЯ: НЕТ й) ПРИЗНАК: (А) НАЗВАНИБЛКОД: птівс-признак (Б. ПОЛОЖЕНИЕ: 1.25 (В) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ заметках "ВТ-РСВ, опигонуклеотид, названньй КА" (їх ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: БО ТОЮ МО:

СТаАСТТОТА ТО АСААОСА. (ИНФОРМАЦИЯ ОББО ШУМ: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (ДЗ ДЛИНА: 2 пар оснований (Б) ТИП: нукленновая кислота (ВУ КОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ. МОЛЕКУЛЬ: одна (ГУ ТОПОЛОГИЯ: линейная (а) ТИП МОЛЕКУЛВІ: сОМА. би) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ : НЕТ.

У АНТИСМБІСЛОВАЯ: НЕТ

ПО ПРИЗНАК: (А) НАЗВАНИВБ/КОД: пиве-признак (Б ПОЛОЖЕНИК: 1.20

(ВІ ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ /1зметках "ВГ-РСЕ олигонуклеотид, соответствующий 50-79 В-актина"

КІ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗО 10 МО: 2:

ОаСтОостСа ТССАСАЛСс

ФО ИНФОРМАЦИЯ 052010 МО: ї() ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ; (А) ДЛИНА: 21 пара вснований (БУТИ: нукленновах кислота (ВУКОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ МОЛЕКУЛЬ!: одна (ПП ТОПОЛОГИЯ: линейная 3) ТН МОЛЕКУЛЬСООМА (й) ГИПОТЕТИЧВСКАЯ: НЕТ (т АНТИСМБІСЛОВАЯ: НЕТ

ПЕ ПРИЗНАК:

ГАУ НАЗВАНИЕ/КО Д: ппівс-признак (БУПОЛОЖЕНИВ: 1.21 (ВІДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ узаметкаєт "ЕТ-РСВ. обратньй олигонуклеотид, комплементарньй 430-449" (хх) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5БО ЦО МО: 3:

САТАСАСААС СТАСАТООСТ б

ОЗ) ИНФОРМАЦИЯ ОЗЕО ТО МО: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 87 пар основанняи (БУТИП: нукленновая кислота (В) КОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ МОЛЕКУЛЬ одна

ПІТОПОЛОГИЯ: лпинейвах (0 ТИП МОЛЕКУЛЬС: сОМА би) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ НЕТ (м) АНТИСМБІСЛОВАЯ: НЕТ (й) ПРИЗНАК: (АУНАЗВАНИВЕКОД: СОВ (В ПОЛОЖЕНИЕ: 24.86 (й) ПРИЗНАК: (А) НАЗВАНИВЛКО ДІ: тізс-признак

(Б ПОЛОЖЕНИВ: 1.87 (В) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ заметках "Последовательность

ЗП -1та необіщая" (х) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗО ТО МО: КЕ

СААТТССОСС СТОСАСТСАС АСА АТС САД АТС ТОС АбА бос сто СОС Аст БТ

Мек лій Тїе Сув Ака піу пез дхо ех 1 8

САС ОСТА АТС ОАСТ ОСТ СТО СТ тТто Сто ТТ САТ Тс 5 87

Ніш це) ІТе Тнх ей Без опву Рпе бец ре ів бех то 15 20 (З ИНФОРМАНИЯ 0550 1 МОКУ; (ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А ДЛИНА;: 21 аминокислота (Б ТИП: аминокислота (ПУТОПОЛОГИ Я: линейная

О) ТИП МОЛЕКУЛЬС белок (їх) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5БОТО МО: 5:

Мес біц 12 Суз вка б1у ев оАХЗ сек чів Беш їів ТИЖ беМ пе цем ї З щ о : вва цей пе Нів щех і 29

ОС) ИНФОРМАЦИЯ ОБО ТО МОЄ: (БХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСНЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:

ГА) ДЛИНА: 43 пар оснований (Б) ТИЙ: нукленновая кислота (В) КОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ МОЛЕКУЛЬ: одна (ГУ ТОПОЛОГНЯ: лицейнаях а) ТИП МОЛЕКУЛЬНОСОМА (й ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: НЕТ

У) АНТИСМБІСЛОВАЯ: НЕТ

Ох ПРИЗНАК: (А) НАЗВАНИ КОД СО (Б ПОЛОЖЕНИ В: 3541 0) ПРИЗНАК:

(А) НАЗВАНИВКОД: тізс-признак (Б) ПОЛОЖЕНИЕ: 1.42 (В)ДРУГАЯ ИНФОРМАПИЯ Узаметках "Последовательность виутриклеточного П.-Іга типа Її необтая" (З) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТВЕЛЬНОСТИ: БО МО: 6:

СВСАМСАССТ ССТОТОСТАТ ОАСОСССТОС Со дтб бСтТ тТА б 42

Мет Аза без . ії (З ИНФОРМАЦИЯ О5БЕО1О МО: (І) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: З амичокислоть (Б) ТИП: аминокислота. (ГУТОПОЛОГИЯ: лянейная (0) ТИ МОЛЕКУЛЬЄ белок

КВ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: БЕО ТО МО: 7;

МеЕАЇв ей 1 (2 ИНФОРМАЦИЯ О5Б6О1О МОВ: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 105 пар оснований (Е)ТИП: нукленноввя кислота (В) КОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ МОЛЕКУЛЬ: одна (Г)ТОПОЛОГИЯ: ливнейная

ПО ТИНИ МОЛЕКУЛЬСООМА а) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: НЕТ (у АНТИСМБІСЛОВАЯ: НЕТ йх) ПРИЗНАК: (А)НАЗВАНИБЖКОДСОВ (БПОЛОЖЕНИЕ: 33..104

ОО ПРИЗНАК: (А) НАЗВАНИБЕЖКОД: тівс-признак (Б) ПОЛОЖЕНИЕ: 1..105 (В) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ /заметкає "Последевательность внутриклеточного П.-їса типа ПП необщая" (ООпПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: БЕО ТО МО: В:

САСАЛАСАССТ ССТОТОСТАТ САПОСССТСВ СС АТО ОСТ ттТА ОСТ САС ОТТО тат 53

Мес Ма пезц ліва Аеропей тТУух і З

САВ ПАА БСА СОТ ОСА ОСА ОСА ОбА САД ССТ бАВ САС ДАТ ОСТ САС ОТОА 00201 ів ЗІ О1у піу бі бі біу 0б1іу Фіз 5іУ біб Вер Азп о Ата деробах їй 15 20 ду п т05 пу

ОХИНФОРМАЦИЯ ОО 5БО ПО МОЮ: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (АЗДЛИНА: 24 аминокислоть (Б) ТИ: аминокислота (г) ТОПОЛОГИЯ: пинейная 00 ТИН МОЛЕКУЛЬ: белок (їх ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗВО І МО: 9:

Мек діа бйец Аіз зр о цез ТУЖ сф Зі біу щіу ЗІіу Зіу Ху оіу і ї З 16 15 піу біо Аве Ап Авіа Ар обек буз за (2) ИНФОРМАЦИЯ О5БО 1 МОЛ: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (АДЛИНА: 474 парьї оснований (Б) ТИП: нукленновзя кислота (В) КОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ. МОЛЕКУЛЬ: одна (ПТОПОЛОГИЯ: пинейная

ОТИТ МОЛЕКУЛЬКСОЮМА

(й) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ НЕТ

ПУАНТИСМЬІСЛОВАЯ: НЕТ (й) НРИЗНАК: (А) НАЗВАНИВ/КОД: СІВ (Б) ПОЛОЖЕНИ ЕЕ: 1458 (ОО) ПРИЗНАК: 27 (А) НАЗВАНИЕ/КОД:; ниве-спризнак (Б) ПОЛОЖЕНИЕ: 1474 (В) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ: Ваметках «Общая ТП -1га посла б бьрі присосдинен в первом положений по причине програмного обеспечения, так «го первбій кодон колируєт СЛо й так что возникновениє терминирующего кодова во внутреннем регноне носл. исключастся"

(хй ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗВО І МО: Ю;

ЗА ОВС АТС ТаС Сод ССО ТТ ОО БА ААА ТОС АОС АЛЛО АТО САА БОС аВ іа тах сів Сув Аку ро бегобій ДЕФ цув бек бех Був Мес ціп Аа 1 в 10 13

ЖТС АСА ВТС ТОО САТ ТТ ААС САС ВАС АСС ТТС ТАТ СТО АОС АВС ВАС зе вне Акщ їїМа о тЕр Авро Заї Ав іп Ппуз Таж Ре Тук во Ака ав Ап 29 25 30

САЛА ОСТА СТУ ОСТ ОСА ТАС ОТТО СА ОСА ССА ААТ ОСТ АВТ ТТА САА ЗдА і42

Сіп без Уаї 314 біу Тут це біп П1іу Ро двпоуаї двпобец ЯМ 01 жа 85

ВАБ АТА САТ ОТО СТА ССС АТТ СД ССТ САТ ОСТ СТО тТТС ттО ПОД ОАто 152 чув ї18 Авб Уаї Уві ко Ії бій то Нів Аза пед св ов СІК ІїВ 5О 55 50

САТ ОСА Боб ААС АТО ТОС Сто ТСС тот ОТО ААб ТОТ оОбтТ ЗАТ САб дСс 24

Чі зі С1іу бує Меб Сує дец бах Су Уаї був бек ту Авропім Тис 58 70 75 8

АОА СТИ САС СТО САСООСА сТТ ВАС АТС АСТООдС СТО ОС СМ: ДАСОАПА 288

Ага йеи оБіп Пец сі) АТ Уаії Ап о ЇЗе ТНК АБороцеч дес біс АВпПодКа

85 зо 35

ААБОСМРОАС Ада СОС Отто СС ТТ АТО СОС ТСА САС АТ Осо ССС Со 136

Був 'бзіп аБр МУЗ Ак Ре Ада пе Ї12 Аха Бех Авробек біу Рто ТБЕ 199 103 115

АСС дотТ ТІТ ЗАб тот бос бсоотосС ссс ост тост сто ТосСоАСА осо 038

Тих бек Бе біц Бек Аіа Аза Суд Бко З1У Тр оРпе цем СУ Тк діа 115 150 125

АТО БАХА ОСТ БАС ОСА СОС Ото дес СТО АСС ДАТ АТО ССТ САС САА СОС 432 мес бі Аїа Авробіп Рхо Маї Зек пев Тв дяп Мес бго вв ос у 30 135 їй

ЗТ АТО ТИ АСО АЛ; ТТ ТАС ТТ САС АС АС ва ТАСТАС «74

Уаї Мес Маї Тит цув Зпе Тук Рпе сіб 14 АвробУй т45 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ЗБОЮ МО: 0) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:; (А)ДЛИНА: 156 аминокислої (Б) ТИЙ: аминокислота

ОЗ ТОПОЛОГ НЯ: линейная й) ТИП МОЛЕКУЛЬ: белок

ХО ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: БО ТЕМО:

Зі те Її Сув Ако Рто бет сіу ахуд цуз Зек Бесг цув Меє біподів 1 8 їй І

Рпе Ака ї1е тер о Авв Уаі ЗБлозіп бує ТПпс о впе Тут цей дхя зва АВл 20 25 30

Сіп де; уві Аїа біу Тук оїву біпо спі Рко Авпоуаї давл бен бій ПО 15 40 15

Бу Тіз авр Уаї Маї хто І1їе сіб Рхо чів Аза цем РП Пво 5Ту 118 5О ЗЕ о нів піу піу буї Меє Суб цей бах Сув уві вуз 5вкг опіу Авробів ТП 70 75 о

АжЧобец) біп о бац біз Аіа Маї Ава 12 твЕ Авробеи; бег біб АБпозге 5 зо 5 пу стіп АД був Аг Зпе А1з ВБе ї16 Ак Бех Авровет о сіу го те по вже 1

ТвЕ бек Ре 010 5ек Аза діа Сув рко С1У ТЕр пе цен Сув Дн А1а 120 фе,

Мес бім Ата Авр бій Рго Уві Вед їеч Трх АвпоМет Рко дав сій у 130 135 140 а

Чаї Меє уаї Тс уз Рне тук Ре біп сії Авр 1 145 150 155

ОЗ ИНФОРМАЦИЯ О БО ЦО МОУ

() ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 21 аминокислота (Б) ТИЙ: аминокислота (В) КОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ. МОЛЕКУЛЬ:

ТУТОПОЛОГИЯ: зливнейная б) ТИП МОЛЕКУЛЬІ: пептид бі) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ с: НЕТ

ПМ АНТИСМБІСЛОВАЯ: НЕТ (У) ТИЙ ФРАГМЕНТА; М-концевой (й) ПРИЗНАК: (АХНАЗВАНИВ/КОД: Пептид (Б) ПОЛОЖЕНИЕ: 21 (В) ДРУГАЯ ИНФОРМАЦИЯ Узаметкає "Часть внутриклеточного

П.-Іга вне обтей" (хх) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ББО ТО МО: 1:

Аїза Аворопей Тут бій 01 бір 01у біу сіу піу бі піу піу бій дер 1 5 10 15 деп Аїа АвробБек Був

С) ИНФОРМАЦНЯ О5ЕО ТО МОЗ; () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А)ДЛИНА: 579 пар оснований (БІ ТИП: нукленновая кислота, (В) КОЛИЧЕСТВО НИТЕЙ МОЛЕКУЛЬ: одна (ГГТОПОЛОГИЯ: дивнейная (9 ТИП МОЛЕКУЛЬ єОМА (0) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ : НЕТ

ПУ АНТИСМЬІСЛОВАЯ: НЕТ (ХУ ПРИЗНАК: Я (АХ НАЗВАНИБВ/КОДІ СО (Б ПОЛОЖЕНИЕВ: 34573 й ПРИЗНАК: (АХ) НАЗВАНИВ/КОД: пнес-признак

ТБУПОЛОЖЕННЕ: 1,579 (В) ДРУГАЯ НАИФОРМАЦИЯ Узаметках "Внутриклеточньй

ПЦога тина ЛИ

(хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5БО ТО МО: 13;

САСААССАСЄС ТОСТОТССТА ТОАОССССТС ССС АТО ОСТ ТТА ОСТ ОбАС ОТТО ТАТО 54

Мес А1їа Пец Аза Авш ей ТУК 1 5

САЛА ОРА ОСА СОТ СА ОА ОСА ОСА САЛА СОТ бАА САС ААТ ОСТ САС ТСА 102 біш біз сіу сіу біу біу біу б1у бій б1іУу бін АвбоАва Дів Аворозег

То ї5 20

ААб СДС АСС АТО ТС СбА ССС ОТСТ бо АЗА АДА ТОП ОВОС АП АТО СВА 150 пу Піч Тит Ії Суз дху Бгто бек Піу Аку Мув Зах Бех був Меб біп 39, | 15

ОСС ТТ АСА АТС ТОП ЗАТ ОСТТ ВАС САС АВО АС ТТ ТАТ СТО Воп Адо 1938 іа Ре Ака Ї18 тТжр Азр Маії Авп Зіп буя Тв ра тут це) Ак Ап «0 ав Зо 55

АДЛИ САА СТА СТТ СТ ОбА ТАС ОТТО СА ОБОВ ССА ААТ СТО ВАТ ТІА ОАА 545 двпобіп ви чаї а1а біу Тух цей біп пі Рко два Уаї Ап пем 1 во 65 то

САА АВО АТА ОДАТ СТО СТА ССС АТТ САС ССТ САТ ОСТ СТО ТС ТО ббА 0254

Сі ция їІ)е двроУаї Маї Рко 112 біб Бгто Ні Аів Беб Ре Пеш С1у 75 во 85

АТС СГ бсА Об ААб АТО ТОС СТО ТСС ОТОТ ОТО ААО ТОТ ПОТ САТ ПА 345

ІчІ1е Нів піу бї1у пуб Меб Сув бем Бех Суз Маї Туз Зек бьу Авр бі зо 95 | ї09

ВССОАБА СТО СА СТО ЗАВ ОСА ЗТ ААС АТС АСТОСАС СТО АОС ПАС АОС 330

ТНЕ АтЯ цей бій рев) бій Аїа Уаї Аза ї1ї8е Тпгодво Без дес бій Ап 105 ' 110 55

АСА АМІУ САС САС ОААС СОС ТТ БОС ОТ АТС СОС ОТСА ПАС АСТ Сас: сс 438

Ага пу б1п Дер бух Ака вде Аа те Х14 Ага бек дя вв у бго 120 128 130 І 115

АС ВСС о АСТ ОТТТ ОАЄ ТСР ОСС осС тТоС сос сот тс тт сте Тбо АСА 485

Тпж ТЕ Бех Бе біц Бех АІа А1а Сук Рро б1у Тер Рпе йем сув Тв 149 Щ 145 ї5в

ССб АТО сАА ОСТ САС САС СОС ОТО АОС СТО АСС ДАТ ОАТО ОСТ Оде ОДА 534

Кіз Меє біз Аїа Авр біп Рго Уаї Бек це Те Ап Меб Рго Дер 01 155 166 ї85

СОС СТ АТС ОТО АССОААА ТТ ТАС ОТТО САД ОДО ПАС ДО ТАСТАЄ 57 піу Уаї Мес Уві Тк Пув Ре Тук Ріпа сій бій АБр 21

І70 175 ї80

СТ ИНФОРМАНИЯ О5БО ТО МОНУ: (д) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (3 ДЛИНА: 180 аминокислот (Б) ТИЦ: амикокислота (3 ТОПОЛОГ НЯ; линейная (ПО ТИП МОЛЕКУЛЬГ белок (хй ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО 10 МО: 14:

Мес Аіа бец Аза Авробец Тут О1їш біб 01у сьу піу сіу сту сту БІ 1 5 | хо 15 буу Сі: Аєр двп дія Авр Бек цув З: Так Її Суб Аго ко бег ЩІу 0 23 30

Ахо цу Бек бек цув Меб біп Ата Ре Акуч пе Тхр Азр чаї дей піп 43 «а 45

Був ТВж рре Ту гей йсо Авлодвп о бій бво уаї АТз біу тТух ей біх 5О 5 50

Сіу вто дви Таї Авп це) бі а1іц Ббуз їїе Авроуаї уаї ко Ге п 70 75 во

РКО Ні Аїа ей) Ре цез Б1у Т1е нів бі біу цув Мек Суб цес Бег 85 з з5

Суз Маії Зуз беїк 01у Аяр віх ТЕ дра пем бій цем біз Ата Заї Авп 190 таз 110

Ії Так одвропей бек біб АдбпоАку Пух бій Абр о цув Ага рве Аїя вне 115 128 125

Їїе йгя бек Авр о Бах Сіу Рко Трх ТНу бек Рре бу Зек діа Віа сСув 130 35 146 рго Сім Тер о РБе пе Сув ТНж діа Меп бій Аїа дир бій рко Уві дек 145 " 150 155 ї155 їеш Тік о Ави Ме: РЕо Аво біо сїу уаї Мебє уві ТБХх бує РНе Тук ВДЕ 185 то 175

Сів оба АвросїТо

ІВО

Claims

1. Рекомбинантньй ополипептид со свойствами антагониста рецептора П-1, характеризующийся вьіІведенной аминокислотной последовательностью, представленной в 5ЕО ІЮ МО: 14, молекулярной массой, определяемой в 505-ПАА геле, около 25 КО и ингибирующей активностью, сопоставимой с оактивностью внутриклеточной формь антагониста рецептора интерлейкина -1 (1сЦ -1га).

2. Вьіделенная ДНК, кодирующая полипептид по п. | и имеющая последовательность, представленную в 5БЕО ІЮ МО: 13.

3. Зкспрессирующий вектор р5Е5, содержащий ДНК по п. 2, кодирующую полипептид по п.

1.

4. Линия клеток СО5, трансформированная вектором по п. 3, - продуцент полипептида, охарактеризованного в п. 1.

5. Способ получения полипептида, охарактеризованного в п. 1, методом рекомбинантньх ДНК, отличающийся тем, что указанньій способ включаєт культивированиєе клеток СОБ5, трансформированньх вектором по п. 3, с последующим сбором и вьіделением кодируеємого полипептида.

б. Фармацевтическая композиция, применяємая при патологиях, при которьїх требуется ингибированиє П/-1, вьюфбранньх из группьї, включающей аутоиммуннье заболевания, септический шок, отторжениє трансплантата и СПидД, содержащая терапевтически зффективное количество полипептида, охарактеризованного в п. І, и фармацевтически приемлемьій носитель.

7. Композиция по п. 6, отличающаяся тем, что патология вьібрана из группьі аутоиммунньх патологий.

8. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что патология вьібрана из группь, состоящей из ревматоидного артрита, септического шока, острого миеломоноцитарного лейкоза, иммунной реакции "трансплантат против хозяина", синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) и язвенного колита.