ES2533084T3 - Tratamiento del cáncer con anticuerpos monoclonales anti-IL 13 novedosos - Google Patents

Tratamiento del cáncer con anticuerpos monoclonales anti-IL 13 novedosos Download PDF

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Abstract

Una composición farmacéutica para uso en inhibir la proliferación de células cancerosas que comprende un anticuerpo anti-IL-13 humana antagonista que se une específicamente a IL-13 humana, en donde dicho anticuerpo inhibe competitivamente la unión de y/o se une al mismo epítopo que un anticuerpo obtenible del hibridoma 228B/C-1 (PTA-5657), en donde dicha composición farmacéutica se va a administrar con otra forma de tratamiento contra el cáncer.

Description

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(Cold spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. (1988), por Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier, N.Y., (1981)), u otros métodos que conoce el experto en la materia. Otros ejemplos de métodos que se pueden emplear para producir anticuerpo monoclonales incluyen, pero no están limitados a, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kosbor at al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030), y la técnica del hibridoma de EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulinas incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el Acm para uso de esta invención se puede cultivar in vitro o in vivo.
Usando técnicas de hibridoma típicas, un huésped tal como un ratón, un ratón humanizado, un ratón con un sistema inmunitario humano, hámster, conejo, camello o cualquier otro animal huésped apropiado, típicamente se inmuniza con un inmunógeno para inducir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a IL13. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro con el antígeno.
Generalmente, al hacer hibridomas productores de anticuerpos, bien se usan linfocitos de sangre periférica (“PBL”) si se desean células de origen humano, o se usan células de bazo o células de ganglios linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Los linfocitos se fusionan después con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986), pp. 59-103). Las líneas celulares inmortalizadas habitualmente son células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen de roedor, bovino o humano. Típicamente, se emplea una línea de células de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas, no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (“medio HAT”), sustancias que previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son las que se fusionan eficazmente, apoyan expresión estable a alto nivel del anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murinas, que se pueden obtener, por ejemplo, del Centro de Distribución de Células del Salk Institute, San Diego, Calif. y de la Colección Americana de Cultivo Tipo, Manassas, Va. También se pueden usar líneas celulares de mieloma humanas y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1967) pp. 51-63).
Se puede después ensayar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL13 en el medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma. La especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante, por ejemplo, inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA). Tales métodos se conocen en la técnica y están dentro de las capacidades del experto en la materia. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal hacia IL13 se puede, por ejemplo, determinar por un análisis de Scatchard (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)).
Después de identificar las células de hibridoma deseadas, los clones se pueden subclonar por procedimientos de dilución limitante y cultivar por métodos estándar (Goding, anteriormente). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y RPMI-1640. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo por procedimientos de purificación de inmunoglobulinas convencionales tal como, por ejemplo, proteína A-sepharosa, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de exclusión molecular, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
Existen una variedad de métodos en la técnica para la producción de anticuerpos monoclonales y por tanto, la invención no está limitada a su sola producción en hibridomas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden hacer por métodos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente en EE UU No. 4.816.567. En este contexto, el término “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo derivado de un único clon eucariota, de fago, o procariota. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales para uso de la invención se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos,
o tales cadenas de fuentes humanas, humanizadas u otras). Las células de hibridoma de la divulgación sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que después se transforman en células huéspedes tal como células NS0, células de simio COS, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que de otra manera no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huéspedes recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constante de la cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias murinas homólogas (Patente en EE UU No. 4.816.567; Morrison et al., anteriormente) o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de la inmunoglobulina todo o una parte de la
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secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulina. Tal polipéptido no inmunoglobulina se puede sustituir por los dominios constantes de un anticuerpo para uso de la invención, o se puede sustituir por los dominios variables de un sitio de combinación con el antígeno de un anticuerpo para uso de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Los métodos para preparar anticuerpos monovalentes se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, un método implica la expresión recombinante de la cadena ligera de la inmunoglobulina y la cadena pesada modificada. La cadena pesada generalmente se trunca en cualquier punto en la región Fc de modo que se prevenga el entrecruzamiento de cadenas pesadas. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes se sustituyen con otro residuo de aminoácidos o se delecionan de modo que se prevenga el entrecruzamiento.
Se pueden generar fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos por técnicas conocidas. Por ejemplo, se pueden producir fragmentos Fab y F(ab’)2 de la divulgación por corte proteolítico de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab’)2). Los fragmentos F(ab’)2 contienen la región variable, la región constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.
Para algunos usos, incluyendo el uso in vivo de anticuerpos en seres humanos y ensayos de detección in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes partes del anticuerpo derivan de diferentes especies animales, tal como anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; patentes en EE UU Nos. 5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397.
Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos generadas en una especie no humana que se une al antígeno deseado que tiene una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la especie no humana y regiones marco (FR) de una molécula de inmunoglobulina humana. Con frecuencia, residuos marcos en las regiones marco humanas se sustituirán con el correspondiente residuo del anticuerpo donante de CDR para alterar, preferiblemente mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones marco se identifican por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por modelado de las interacciones de los residuos CDR y marco para identificar residuos marco importantes para la unión al antígeno y comparación de secuencias para identificar residuos marco no habituales en posiciones particulares. (Véase, por ejemplo, Queen et al., patente en EE UU No. 5.585.089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)). Se pueden humanizar anticuerpos usando una variedad de métodos conocidos en técnica incluyendo, por ejemplo, injerto de CDR (documento EP 239.400; publicación PCT WO 91/09967; patentes en EE UU Nos. 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), reconstrucción o remodelación de superficie (documentos EP 592.106; EP 519.596; Padian, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al, PNAS 91:969-973 (1994)), e intercambio de cadenas (patente en EE UU No. 5.565.332).
Generalmente un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en él de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos con frecuencia se denominan residuo “importados”, que típicamente se toman de un dominio variable “importado”. La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo los métodos de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988), sustituyendo CDR o secuencias CDR de roedor por las correspondiente secuencias de un anticuerpo humano. Según esto, tales anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quiméricos (patente en EE UU No. 4.816.567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Los anticuerpos humanos se pueden hacer por una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen métodos de presentación en fagos descritos anteriormente usando genotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulinas humanas. Véase también, las patentes en EE UU No. 4.444.887 y 4.716.111; y las publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741. Las técnicas de Cole et al., y Boerder et al., también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss, (1985); y Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95, (1991)).
También se pueden producir anticuerpos monoclonales humanos usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulinas humanas. Por ejemplo, los complejos génicos de inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera humanas se pueden introducir al azar o por recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, la región constante, la región constante y la región de diversidad humanas se pueden introducir en células madre
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También se describen en el presente documento anticuerpos heteroconjugados. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos covalentemente unidos. Se ha propuesto que tales anticuerpos, por ejemplo, dirigen las células del sistema inmunitario a células indeseadas (patente en EE UU No. 4.676.980). Se contempla que los anticuerpos se puedan preparar in vitro usando métodos conocidos en química de proteínas sintética, incluyendo esos que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéster. Los ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los divulgados, por ejemplo, en la patente en EE UU No. 4.676.980.
Además, se pueden generar anticuerpos de dominio único hacia IL-13. Los ejemplos de esta tecnología se han descrito en el documento WO9425591 para anticuerpos derivados de Ig de cadena pesada de camélidos, así como en el documento US20030130496 que describe el aislamiento de anticuerpos completamente humanos de dominio único de bibliotecas de fagos.
Identificación de anticuerpos anti-IL13
La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales antagonistas para uso que inhiben y neutralizan la acción de IL13. En particular, los anticuerpos para uso de la presente invención se unen a IL13 e inhiben la activación del complejo del receptor de IL13. Los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen los anticuerpos designados 228B/C-1, 228A-2, 227-26, y 227-43 y se divulgan clones humanizados de 228B/C-1. La presente invención también incluye anticuerpos para uso que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal 228B/C-1.
Los anticuerpos anti-IL13 candidatos se probaron por enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), inmunotransferencia u otras técnicas inmunoquímicas. Los ensayos realizados para caracterizar los anticuerpos individuales incluían; (1) inhibición de la proliferación autocrina por IL13 de líneas celulares de linfoma de Hodgkin HDLM-2 y L-1236; (2) inhibición de la fosforilación de STAT6 inducida por IL13 en células THP-1; y (3) inhibición de la supresión de la expresión de CD14 inducida por IL13 en monocitos humanos primarios; y (4) inhibición del aumento de expresión de CD23 inducido por IL13 en monocitos humanos primarios. Los detalles experimentales se describen en los ejemplos.
Los anticuerpos divulgados en el presente documento incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos policlonales, monoclonales, monovalentes, biespecíficos, heteroconjugados, multiespecíficos, humanos, humanizados o quiméricos; anticuerpos de cadena única, anticuerpos de dominio único, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo anticuerpos anti-Id hacia los anticuerpos para uso de la invención), y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores.
Los anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpos que se unen al antígeno humanos de la presente divulgación e incluyen, pero no están limitados a, Fab, Fab’ y F(ab’)2, Fd, Fv de cadena única (scFv), anticuerpos de cadena única, Fv unidos por disulfuro (sdFv) y anticuerpos de dominio único que comprenden bien un dominio VL o VH. Los fragmentos de anticuerpos que se unen a antígeno, incluyendo los anticuerpos de cadena única, pueden comprender la(s) región(es) variable(s) sola(s) o en combinación con la totalidad o una parte de las siguientes: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. Además se incluyen en la divulgación fragmentos de unión al antígeno que comprenden cualquier combinación de región(es) variable(s) con una región bisagra, dominios CH1, CH2, y CH3. Los anticuerpos para uso de la invención pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. Los anticuerpos pueden ser humanos, de primates no humanos, roedores (por ejemplo, ratón y rata), asno, oveja, conejo, cabra, cobaya, camello, caballo o pollo.
Los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de multiespecificidad mayor. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de IL13
o pueden ser específicos tanto para IL13 como para un epítopo heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o material soporte sólido. Véase, por ejemplo, publicaciones PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al, J. Immunol. 147:60-69 (1991); patentes en EE UU Nos. 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; 5.601.819; Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).
Los anticuerpos para uso de la presente invención se pueden describir o especificar en términos de el/los epítopo(s)
o parte(s) de IL13 que reconocen o se unen específicamente. El/los epítopo(s) o parte(s) del polipéptido se pueden describir específicamente en el presente documento, por ejemplo, por posiciones N-terminales y C-terminales, por tamaño en residuos de aminoácidos contiguos, o enumerados en las tablas y figuras.
Los anticuerpos para uso de la presente invención también se pueden describir o especificar en términos de su reactividad cruzada. Los anticuerpos que se unen a polipéptidos IL13, que tienen la menos el 95%, al menos el 90%, al menos el 85%, al menos el 80%, al menos el 75%, al menos el 70%, al menos el 65%, al menos el 60%, al menos el 55%, y al menos el 50% de identidad (calculada usando métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento) respecto a IL13 también se incluyen en la presente invención.
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Los anticuerpos de la presente divulgación dan reacción cruzada con homólogos de mono de IL13 humana y los epítopos correspondientes de la misma.
La reactividad cruzada descrita anteriormente es con respecto a cualquier polipéptido antigénico o inmunogénico específico único, o combinación(es) de los polipéptidos antigénicos y/o inmunogénicos específicos divulgados en el presente documento.
También se incluyen en la presente divulgación anticuerpos que se unen a polipéptidos codificados por polinucleótidos que hibridan con un polinucleótido que codifica IL13 en condiciones de hibridación rigurosas. Los anticuerpos para uso de la presente invención también se pueden describir o especificar en términos de su afinidad de unión a un polipéptido de la invención. Las afinidades de unión incluyen esas con una constante de disociación en equilibrio o KD desde 10-8 a 10-15 M. La invención también proporciona anticuerpos que inhiben competitivamente la unión de un anticuerpo a un epítopo de la invención determinado por cualquier método conocido en la técnica para determinar unión competitiva, por ejemplo, los inmunoensayos descritos en el presente documento.
El anticuerpo puede inhibir competitivamente la unión al epítopo en al menos el 95%, al menos el 90%, al menos el 85%, al menos el 80%, al menos el 75%, al menos el 70%, al menos el 60%, o al menos el 50%.
Además se describen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos anti-IL13 para uso de la presente invención. Para determinar si un anticuerpo puede competir para la unión al mismo epítopo que el epítopo unido por los anticuerpos anti-IL13 para uso de la presente invención, incluyendo los anticuerpos producidos por los hibridomas depositados con la ATCC, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado, por ejemplo, un ensayo ELISA competitivo. En un ensayo ELISA competitivo ejemplar, la IL13 que recubre los pocillos de una placa de microtitulación se preincuba con o sin anticuerpo competidor candidato y después se añade el anticuerpo anti-IL13 para uso de la invención marcado con biotina. La cantidad de anticuerpo anti-IL13 marcado unido al antígeno IL13 en los pocillos se mide usando un conjugado avidina-peroxidasa y un sustrato adecuado. El anticuerpo se puede marcar con un marcador fluorescente o radioactivo o algún otro marcador detectable y medible. La cantidad de anticuerpo anti-IL13 marcado que se une al antígeno dará una correlación indirecta de la capacidad del anticuerpo competidor candidato (anticuerpo de prueba) para competir por la unión al mismo epítopo, es decir, la mayor afinidad del anticuerpo de prueba por el mismo epítopo, el menor anticuerpo marcado se unirá a los pocillos recubiertos de antígeno. Un anticuerpo competidor candidato se considera un anticuerpo que se une sustancialmente al mismo epítopo o que compite para la unión al mismo epítopo que el anticuerpo anti-IL13 para uso de la invención si el anticuerpo candidato puede bloquear la unión del anticuerpo contra IL13 en al menos el 20%, en al menos el 20-50%, o en al menos el 50% comparado con el control realizado en paralelo en ausencia del anticuerpo competidor candidato. Se entenderá que se pueden realizar variaciones de este ensayo para llegar al mismo valor cuantitativo.
Vectores y células huéspedes
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona construcciones de vectores que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica los anticuerpos para uso de la presente invención y una célula huésped que comprende tal vector. Se pueden usar las técnicas estándar para clonación y transformación en la preparación de líneas celulares que expresan los anticuerpos para uso de la presente invención.
Se pueden preparar vectores de expresión recombinantes que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica los anticuerpos para uso de la presente invención usando técnicas bien conocidas. Los vectores de expresión incluyen una secuencia de nucleótidos operativamente unida a secuencias de nucleótidos reguladoras transcripcionales o traduccionales adecuadas tales como las derivadas de genes mamíferos, microbianos, víricos o de insecto. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores transcripcionales, operadores, potenciadores, sitios de unión ribosómicos del ARNm y/o otras secuencias apropiadas que controlan el inicio y la terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencias de nucleótidos están “operativamente unidas” cuando la secuencia reguladora funcionalmente se relaciona con la secuencia de nucleótidos para el polipéptido apropiado. Por tanto, una secuencia de nucleótidos promotora está operativamente unida a, por ejemplo, la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo si la secuencia de nucleótidos promotora controla la transcripción de la secuencia de nucleótidos apropiada.
Además, se pueden incorporar secuencias que codifican péptidos señal apropiados que no se asocian naturalmente con las secuencias de la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo en vectores de expresión. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos para un péptido señal (líder secretor) se puede fusionar en el mismo marco de lectura a las secuencias polipeptídicas de modo que el anticuerpo se secrete al espacio periplásmico o en el medio. Un péptido señal que sea funcional en las células huéspedes pretendidas aumenta la secreción extracelular del anticuerpo apropiado. El péptido señal se puede cortar del polipéptido tras la secreción del anticuerpo de la célula. Los ejemplos de tales señales secretoras se conocen bien e incluyen, por ejemplo, los descritos en los documentos US5698435, US5698417 y US6204023.
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Las células huéspedes descritas incluyen, pero no están limitadas a microorganismos tal como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformados con vectores de expresión de ADN bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contienen las secuencias codificantes del anticuerpo; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen las secuencias codificantes del anticuerpo; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, Baculovirus) que contienen las secuencias codificantes del anticuerpo; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen las secuencias codificantes del anticuerpo; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, célula COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que tienen construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia).
El vector puede ser un vector plásmido, un vector fago mono o bicatenario, o un vector vírico de ARN o ADN mono o bicatenario. Tales vectores se pueden introducir en células como polinucleótidos por técnicas bien conocidas para introducir ADN y ARN en células. Los vectores, en el caso de vectores fagos y víricos también se pueden introducir en las células como virus empaquetados o encapsulados por técnicas bien conocidas para la infección y transducción. Los vectores víricos pueden ser competentes para replicación o deficientes para replicación. En el último caso, la propagación vírica generalmente se producirá solo en células huéspedes complementarias. También se pueden emplear sistemas sin células para producir la proteína usando ARN derivados de las presentes construcciones de ADN. Tales vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO 86/05807; publicación PCT WO 89/01036; y la patente en EE UU No. 5.122.464) y el dominio variable del anticuerpo se puede clonar en tal vector para expresión de la cadena pesada o ligera entera.
Los procariotas útiles como células huésped incluyen organismos gram negativos o gran positivos tal como E. coli y
B. subtilis. Los vectores de expresión para uso en células huésped procariotas generalmente comprenden uno o más genes marcadores seleccionables fenotípicos. Un gen marcador seleccionable fenotípico es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a antibiótico o que suministra un requisito autótrofo. Los ejemplos de vectores de expresión útiles para células huésped procariotas incluyen los derivados de plásmidos comercialmente disponibles tal como pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), pGEM1 (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, EE UU), y las series de vectores pET (Novagen, Madison, Wisconsin, EE UU) y pRSET (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, EE UU) (Studier, F.W., J. Mol. Biol. 219: 37 (1991); Schoepfer, R. Gene
124: 83 (1993)). Las secuencias promotoras comúnmente usadas para vectores de expresión en células huésped procariotas recombinantes incluyen T7, (Rosenberg, et al. Gene 56, 125-135 (1987)), β-lactamasa (penicilinasa), sistema promotor de lactosa (Chang et al., Nature 275:615, (1978); y Goeddel et al., Nature 281:544, (1979)), sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, (1980)), y promotor tac (Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)
Las levaduras incluyen las del género Saccharomyces, Pichia, Actinomycetes y Kluyveromyces. Los vectores de levaduras con frecuencia contendrán una secuencia origen de replicación de un plásmido de levadura 2μ, una secuencia autónomamente replicante (ARS), una región promotora, secuencias para la poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción, y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para vectores de levaduras incluyen, entre otras, promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, (1980)) u otras enzimas glucolíticas (Holland et al., Biochem. 17:4900, (1978)) tal como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para uso en levaduras se describen adicionalmente en Fleer et al., Gene, 107:285-195 (1991). Otros promotores y vectores adecuados para levadura y protocolos de transformación de levaduras se conocen bien en la técnica. Los protocolos de transformación de levaduras se conocen bien. Uno de tales protocolos se describe por Hinnen at al., Proc. Natl. Acad. Sci., 75:1929 (1978). El protocolo de Hinnen selecciona transformantes Trp+ en un medio selectivo.
También se pueden emplear sistemas de cultivo de células huésped de mamífero o insecto para expresar anticuerpos recombinantes, por ejemplo, sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas. En un sistema de insecto, se puede usar el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes exógenos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica el anticuerpo se puede clonar individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y colocar bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de la polihedrina).
Se pueden usar células NS0 o de vario de hámster chino (CHO) para la expresión en mamíferos de los anticuerpos para uso de la presente invención. Las secuencias de control transcripcional y traduccional para vectores de expresión de células huésped de mamíferos se pueden cortar de genomas víricos. Las secuencias promotoras y secuencias potenciadoras comúnmente usadas derivan del virus del polioma, adenovirus 2, virus simio 40 (SV40) y citomegalovirus humano (CMV). Se pueden usar secuencias de ADN derivadas del genoma vírico de SV40 para
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incluyendo, pero no limitadas a, una cualquiera o más de las enfermedades, trastornos o afecciones descritas en el presente documento. El tratamiento y/o prevención de enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con la expresión y/o actividad anormal de IL13 incluyen, pero no está limitado a, aliviar síntomas asociados con esas enfermedades, trastornos o afecciones. Los anticuerpos para uso de la invención se pueden proporcionar en composiciones farmacéuticamente aceptables como se sabe en la técnica o se describen en el presente documento.
Los anticuerpos anti-IL13 para uso de la presente invención se pueden usar terapéuticamente en una variedad de enfermedades. Se divulga un método para prevenir o tratar enfermedades mediadas por IL13 en un mamífero. El método comprende administrar una cantidad que previene o trata la enfermedad de un anticuerpo anti-IL13 al mamífero. El anticuerpo anti-IL13 se une a IL13 y regula la expresión de citoquinas y receptores celulares lo que produce niveles de citoquinas característicos de estado de no enfermedad.
La cantidad del anticuerpo que será eficaz en el tratamiento, inhibición y prevención de una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad anormal de IL13 se puede determinar por técnicas clínicas estándar. El anticuerpo se puede administrar en pautas de tratamiento consistentes con la enfermedad, por ejemplo, una dosis única o unas pocas a lo largo de uno a varios días para aliviar un estado de enfermedad o dosis periódicas durante un periodo extendido de tiempo para prevenir alergia o asma. Además, se pueden emplear opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar intervalos de dosis óptimos. La dosis precisa que se va a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración, y de la seriedad de la enfermedad o trastorno, y se debe decidir según el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces se pueden extrapolar de curvas de dosis y respuesta derivadas de sistemas de prueba in vitro o modelos animales.
Para los anticuerpos, la dosis que se va a administrar a un paciente es típicamente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. Preferiblemente, la dosis que se va a administrar a un paciente está entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg del peso corporal del paciente, más preferiblemente de 1 mg/kg a 10 mg/kg del peso corporal del paciente. Generalmente, los anticuerpos humanos tienen una semivida más larga en el cuerpo humano que los anticuerpos de otras especies debido a la respuesta inmunitaria a los polipéptidos exógenos. Por tanto, con frecuencia son posibles dosis menores de anticuerpos humanos y administración menos frecuente. Además, la dosis y frecuencia de administración de los anticuerpos para uso de la invención se puede reducir aumentado la captación y penetración en el tejido (por ejemplo, en el cerebro) de los anticuerpos por modificaciones tales como, por ejemplo, lipidación.
Los anticuerpos para uso de esta invención se pueden utilizar ventajosamente en combinación con otros anticuerpos monoclonales o quiméricos, o con linfoquinas o factores de crecimiento hematopoyéticos (tales como, por ejemplo, IL-2, IL-3, IL-7, IFN, GCSF, GMCSF, Flt3, IL21) y oligonucleótidos que contienen CpG sin metilar, por ejemplo, que sirven para aumentar el número o actividad de las células efectoras que interaccionan con los anticuerpos.
Los anticuerpos para uso de la invención se pueden administrar solos o en combinación con otros tipos de tratamientos, tal como quimioterapia o radioterapia.
En un aspecto preferido, el anticuerpo está sustancialmente purificado (por ejemplo, sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios indeseados).
El anticuerpo anti-IL13 se puede administrar al mamífero de cualquier manera aceptable. Los métodos de introducción incluyen, pero no están limitados a, vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, inhalación y oral. Los anticuerpos o composiciones se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección embolada, por absorción a través de recubrimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal o intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable que los anticuerpos o composiciones terapéuticos para uso de la invención se vayan a introducir en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluyendo inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular se puede facilitar por un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito de Ommaya.
También se puede emplear administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente aerosolizante. El anticuerpo también se puede administrar en los pulmones de un paciente en la forma de una composición de polvo seco (véase, por ejemplo, la patente en EE UU No. 6.514.496).
En una forma de realización específica, puede ser deseable que los anticuerpos o composiciones terapéuticos para uso de la invención se vayan a administrar localmente al área en necesidad de tratamiento; esto se puede lograr, por ejemplo, y no a modo de limitación, por infusión local, aplicación tópica, por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio, o por medio de implante, dicho implante es de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tal como membranas sialásticas, o fibras. Preferiblemente, cuando un anticuerpo para uso de la invención, se va a administrar, se debe tener cuidado para usar materiales a los que no se absorbe la proteína.
En otra forma de realización, el anticuerpo se puede administrar en una vesícula, en particular un liposoma (véase, Langer, Science 249:1527-1633 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,
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C. Purificación de MTIL13/Fc
MT-IL13/Fc se purificó con una columna de afinidad de híper-D proteína A (Invitrogen) equilibrada con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de aplicar el sobrenadante de cultivo celular a la columna, la resina se lavó con más de 20 volúmenes de columna de PBS. A continuación, la resina se lavó con tampón SCC (citrato de sodio 0,05 M, cloruro de sodio 0,5 M, pH 6,0) para eliminar las proteínas sin unir. Las proteínas de fusión de IL13 se eluyeron después (citrato de sodio 0,05 M, cloruro de sodio 0,15 M, pH 3,0) y se dializaron en PBS.
Las fracciones de la columna de afinidad que contenían MT-IL13/Fc se analizaron por SDS-PAGE. La pureza de las proteínas se analizó por tinción con azul de Coomassie y la identidad de las proteínas por inmunotransferencia usando anticuerpos anti-IgG (Fc) humana de cabra (Sigma) y anticuerpo anti-IL13 humana de cabra (R&D Systems) como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 2:
Generación de anticuerpos monoclonales anti-IL13
Se inyectaron ratones A/J macho (Harlan, Indianápolis, IN), de 8-12 semanas de edad, por vía subcutánea con 20 μg de MT-IL13/Fc en adyuvante de Freund incompleto (Difco Laboratories, Detroit, MI) en 200 μl de PBS pH 7,4. A intervalos de dos semanas los ratones se inyectaron dos veces por vía subcutánea con 20 μg de MT-IL13/Fc en adyuvante de Freund incompleto. A continuación, dos semanas después y tres días antes del sacrificio, los ratones se inyectaron de nuevo por vía intraperitoneal con 20 μg del mismo inmunógeno en PBS. Se usaron células del bazo aisladas de uno o más ratones inmunizados con el antígeno para la fusión. También se usaron procedimientos similares de inmunización y fusión con IL13 humana expresada en E. coli (R&D Systems) como inmunógeno.
En la fusión que produjo la generación del Acm anti-IL13 228B/C-1, se combinaron 26,4x106 células de bazo y 58,8x106 células de bazo de os ratones inmunizados. Para cada fusión, se prepararon suspensiones de células individuales del bazo de ratones inmunizados y se usaron para la fusión con células de mieloma Sp2/0. Se fusionaron Sp2/0 y células del bazo en una proporción 1:1 en un medio que contenía polietilenglicol (M.W. 1450) al 50% (Kodak, Rochester, NY) y dimetilsulfóxido al 5% (Sigma). Las células se ajustaron después a una concentración de 1,5 x 106 células de bazo por 250 μl de la suspensión en medio DMEM (Invitrogen, CA), suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 unidades/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, hipoxantina 0,1 mM, aminopterina 0,4 μM y timidina 16 μM. Se añadieron doscientos cincuenta microlitros de suspensión celular a cada pocillo de aproximadamente cincuenta placas de microcultivo de 96 pocillos. Después de aproximadamente diez días de cultivo los sobrenadantes se retiraron para cribar para reactividad con MT-IL13/Fc en ELISA.
Se recubrieron pocillos de placas de microprueba Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) añadiendo MTIl13/Fc purificada (0,1 μg/ml) durante la noche a temperatura ambiente. Después de eliminar la solución de recubrimiento golpeando la placa, se añadieron 200 μl de un tampón de bloqueo/dilución (PBS que contenía seroalbúmina bovina al 2% y TWEEN® 20 al 0,05%) a cada pocillo durante una hora para bloquear los sitios no específicos. Una hora después, los pocillos se lavaron con tampón PBST (PBS que contenía TWEEN® 20 al 0,05%). Se recogieron cincuenta microlitros de sobrenadante de cultivo de cada pocillo de fusión, se mezclaron con 50 μl de tampón de bloqueo/dilución y después se añadieron a los pocillos individuales de placas de microprueba. Después de una hora de incubación, los pocillos se lavaron con PBST. Los anticuerpos murinos unidos se detectaron después por reacción con anti-IgG de ratón (específico de Fc) de cabra conjugado a HRP (Jackson ImmunoResearch Lab, West Grove, PA) y diluido 1:2.000 con el tampón de bloqueo/dilución. Se añadió solución de sustrato de peroxidasa que contenía 3,3,5,5 tetrametil bencidina al 0,1% (Sigma, St. Louis, MO) y peróxido de hidrógeno al 0,003% (Sigma) a los pocillo para desarrollo de color durante 30 minutos. La reacción se terminó por la adición de 50 μl de H2SO4 2 M. Se midió la DO450 de la mezcla de reacción con un lector de ELISA Bio Tek (Bio Tek Instruments, Winooski, VM).
Los sobrenadantes de cultivo de los pocillos positivos del cribado de MT-IL13/Fc se probaron después para unión negativa a una proteína de fusión irrelevante de Fγ1. Los pocillos positivos finales se seleccionaron después para clonación de células únicas por dilución limitante. Los sobrenadantes de cultivo de anticuerpos monoclonales se volvieron a probar para confirmar su reactividad por ELISA. Los hibridomas seleccionados se hicieron crecer en botellas de agitación y el sobrenadante de los cultivos gastados se recogió para purificación de anticuerpos por cromatografía de afinidad en proteína A.
Los anticuerpos purificados se probaron en cuatro ensayos: i) reactividad cruzada con MT-IL13/Fc expresada en células 293T e IL13 de ratón expresada en E. coli; ii) Inhibición de proliferación autocrina de IL13 de células HDLM-2 y L-1236; iii) Inhibición de fosforilación de STAT6 inducida por IL13; y iv) Inhibición de expresión de CD14 y CD23 regulada por IL13 en monocitos humanos.
Se obtuvieron setenta y tres Acm anti-IL13 de las fusiones realizadas en MT-IL13/Fc y ratones inmunizados con IL13. Treinta y nueve de estos Acm se purificaron para su caracterización por ELISA y ensayos celulares. Trece de
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estos 39 Acm inhibieron la proliferación autocrina inducida por IL13 de células HDLM-2 y L-1236 (véase la descripción del ensayo y los resultados en el ejemplo 5). Se encontró que cuatro de estos Acm eran muy fuertemente reactivos con IL13 humana en ELISA y eran neutralizantes contra IL13 en ensayos celulares funcionales. Estos Acm se designaron 228B/C-1, 228A-4, 227-26 y 227-43. Estos anticuerpos se generaron todos usando la MT-IL13/Fc glucosilada como inmunógeno.
Ejemplo 3.
Reactividad de anticuerpos monoclonales anti-IL13 con IL13 humana y de ratón en ELISA
Se probó la reactividad de varios anticuerpos monoclonales anti-IL13 por ELISA. Se recubrieron diferentes pocillos de placas de microprueba de 96 pocillos bien con IL13 humana no glucosilada expresada en E. coli (R&D Systems), MT-IL13/Fc glucosilada expresada en células 293T, o IL13 de ratón expresada en E. coli (R&D Systems) mediante la adición de 100 μl de proteína IL13 a 0,1 μg/ml en PBS. Después de incubación durante la noche a temperatura ambiente, los pocillos se trataron con PBSTB (PBST que contenía BSA al 2%) para saturar los sitios de unión restantes. Los pocillos se lavaron después con PBST.
Se añadieron cien microlitros de Acm anti-IL13 diluidos en serie dos veces (de 0,5 μg/ml (3,33 nM) a 0,5 ng/ml (0,00033 nM)) a los pocillos durante 1 hora a temperatura ambiente. También se ensayó un Acm anti-IL13 JES-5A2 de (BD Biosciences-Pharmingen, San Diego, CA) como un control positivo. Este anticuerpo se generó usando IL13 humana expresada en E. coli como inmunógeno. Se usó un Acm anti-gp120 de VIH-1 coincidente en isotipo como control negativo irrelevante. Los pocillos se lavaron después con PBST. Se detectó el anticuerpo unido por incubación con anti-IgG (Fc) de ratón de cabra-HRP diluido (Jackson ImmunoResearch) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió después solución de sustrato de peroxidasa para desarrollo de color como se ha descrito anteriormente. La DO450 se midió usando un lector de ELISA.
La figura 1 muestra la unión dependiente de la dosis de los Acm anti-IL13 228B/C-1, 228A-4, 227-26 y 227-43, y el control negativo en ELISA. Entre estos Acm, 228B/C-1 mostró la reactividad más fuerte. La figura 2 muestra la unión dependiente de la dosis de los Acm anti-IL13 a MT-IL13/Fc en ELISA. 228B/C-1 y 228A-4 mostraron la reactividad más fuerte con MT-IL13/Fc, mientras que 227-26 y 227-43 mostraron reactividad moderada.
Las figuras 1 y 2 muestran que 228B/C-1 tiene la mayor afinidad por IL13 humana tanto glucosilada con sin glucosilar entre todos los Acm anti-IL13 probados. Todos estos Acm anti-IL13 no dieron reacción cruzada con IL13 de ratón en ELISA (datos no mostrados).
Ejemplo 4
Falta de competición en la unión de 228B/C-1HRP a IL13 humana por JES10-5A2
Para abordar si JES10-5A2 y 228B/C-1 se unen al mismo epítopo en IL13 humana, se usó un ELISA competitivo para examinar el efecto de JES10-5A2 en la unión de 228B/C-1-HRP a IL13 humana expresada en E. coli. Cada pocillo de placas de microprueba de 96 pocillos se incubó con 100 μl de proteína IL13 a 0,1 μg/ml en PBS. Después de una incubación durante la noche a temperatura ambiente, los pocillos se trataron con PBSTB (PBST que contenía BSA al 2%) para saturar los sitios de unión restantes. Los pocillos se lavaron después con PBST. Se mezclaron cincuenta microlitros de 228B/C-1 y JES10-5A2 diluidos en serie dos veces (de una concentración final de 20 μg/ml a 9,76 ng/ml) con 50 μl de 228B/C-1-HRP pretitulado (a dilución 1:6.400). Las mezclas se añadieron después a los pocillos y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió después solución de sustrato de peroxidasa para desarrollo de color como se ha descrito anteriormente. La DO450 se midió usando un lector de ELISA.
La figura 3 demuestra que JES10-5A2 no compite con la unión de 228B/C-1-HRP a IL13 humana, lo que indica que 228B/C-1 y JES10-5A2 se unen a diferentes sitios en IL13 humana.
Ejemplo 5
Cribado para anticuerpo monoclonales neutralizantes anti-IL13 mediante un ensayo de proliferación autocrina dependiente de IL-13 usando células L-1236 y HDLM-2
L-1236 y HDLM-2 son líneas de células de linfoma de Hodgkin obtenidas de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania). Estas líneas celulares producen IL13 que a su vez activa su proliferación celular de una manera autocrina (Kapp U et al., J. Exp. Med. 189:1939 (1999)). Las células se cultivaron (25.000 células/pocillo) en presencia o ausencia de diferentes Acm anti-IL13 (0,2, 0,02, 0,002 μg/ml) en CO2 al 5% a 37ºC durante 3-5 días. La proliferación celular se midió después bien mediante un ensayo que usa el compuesto de tetrazolio MTS (Promega, Madison, WI) (lecturas a DO450) o mediante la incorporación de3H-timidina (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
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Se esperaba que la adición de un Acm neutralizante anti-IL13 al cultivo de estas líneas celulares inhibiera su proliferación por la unión e inactivación de la IL13 producida por estas células. Los resultados ilustrados en la figura 4 muestran el efecto del Acm anti-IL13 de la presente invención en la proliferación de células L-1235. El Acm 228B/C-1 muestra la mayor potencia de inhibición de la proliferación de células L-1236 de una manera dependiente de la dosis entre los anticuerpos neutralizantes probados. TA1-37 (un Acm anti-IL13 generado usando IL13 humana expresada en E. coli como inmunógeno) no tenía ninguna actividad inhibidora incluso a dosis tan altas como 0,2 μg/ml. Se obtuvieron resultados similares con células HDLM-2.
Ejemplo 6
Ensayo para la expresión de CD14 y CD23 regulada por IL13 en monocitos humanos primarios
IL13 induce la supresión de la expresión de CD14 y el aumento de la expresión de CD23 en monocitos humanos (de Waal Malefyt et al., J. Immunol., 151: 6370 (1993), Chomarat et al., Int. Rev, Immunol., 17: 1 (1998)). Se aislaron leucocitos de sangre periférica (PBL) de sangre completa recién recogida, heparinizada de donantes humanos sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad en Histopaque-1077 (Sigma). Se añadieron PBL (1,5x105) resuspendidos en medio RPMI-1640 (Invitrogen) con suero bovino fetal al 5% a cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos que contenía IL13 recombinante (final 10 ng/ml = 0,813 nM) y un anticuerpo monoclonal anti-IL13 o un anticuerpo irrelevante (diluciones en serie tres veces, de un final 12 μg/ml = 80 nM). La expresión de CD14 o la expresión de CD23 en monocitos se suprimió o aumentó, respectivamente, por la adición de IL13 humana 0,813 nM al medio de incubación. El medio control contenía medio RPMI-1640/SBF sin IL13 recombinante.
Las células se incubaron en CO2 al 5% a 37ºC durante 2 días. Las células se recogieron para tinción con anti-CD14-FITC o anti-CD23-PE (BD Biosciences-Pharmingen). Los niveles de expresión de CD14 y CD23 en la población de monocitos se midieron por citometría de flujo y representaron por la Intensidad de fluorescencia mediana (IFM).
Los efectos de los Acm anti-IL13 en la expresión de CD14 suprimida por IL13 en monocitos humanos se representan en la figura 5. Entre los Acm anti-IL13 probados, 228B/C-1 tenía la mayor potencia en inhibir el efecto de IL13 sobre la expresión de CD14. Se alcanzó la inhibición completa del efecto de IL13 a 0,33 nM. Las actividades inhibidoras de los Acm 227-26 y 228A-4 eran moderadas, mientras que la de JES10-5A2 era débil. El efecto de IL13 no se pudo inhibir por completo por JES10-5A2 incluso a 80 nM.
Los efectos de los Acm anti-IL13 en el aumento de CD23 inducido por IL13 en monocitos humanos se representan en la figura 6. Similar a los resultados en la expresión de CD14 (Fig. 5), 228B/C-1 fue el más potente en inhibir el efecto de IL13 sobre la expresión de CD23 entre los Acm anti-IL13 probados. La inhibición completa por 228B/C-1 se alcanzó a 0,33 nM. La potencia inhibidora de JES10-5A2 era débil.
Basado en los resultados presentados en las figuras 5 y 6, la inhibición completa de IL13 por 228B/C-1 se puede alcanzar a una proporción molar estequiométrica de 1:2 (Acm:IL13), y, por tanto, 228B/C-1 es un Acm neutralizante de afinidad muy alta contra IL13 humana.
Ejemplo 7
Ensayo de fosforilación de STAT6 inducida por IL13 en células THP-1
IL13 puede activar la línea de células mieloides THP-1 (ATCC, Manassas, VA) para inducir fosforilación de STAT6 que es un paso crítico en la ruta de transducción de señales de IL13 (Murata T et al., Int. Immunol. 10: 1103-1110 (1998). Los Acm anti-IL13 se probaron para la inhibición de IL13 en este ensayo.
Se mantuvieron células THP-1 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal al 5%. El día de los experimentos, las células se lavaron e incubaron en DMEM sin suero a 37ºC en CO2 al 5% durante 2 horas. Se añadieron después 0,3x106 células en 80 μl de medio sin suero a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondeado. Ciento veinte microlitros de medio que contenía IL13 humana (concentración final de 10 ng/ml = 0,813 nM) y Acm anti-IL13 (diluciones en serie de 5 veces, de una concentración final de 0,5 μg/ml = 3,333 nM).Los pocillos de control negativo contenían bien no IL13 o IL13 y un Acm de ratón irrelevante de isotipo coincidente.
Las mezclas se incubaron a 37ºC con CO2 al 5% durante 10 minutos. Las placas se centrifugaron después a 300 x g durante 3 minutos a 4ºC. Después de desechar el sobrenadante, los precipitados celulares se resuspendieron en 100 μl de tampón de muestra no reductor de Laemmli (tampón de carga de SDS-PAGE, BioRad, CA) y después se transfirieron a tubos de microcentrífuga. Los tubos se calentaron a 95ºC durante 5 minutos y después se centrifugaron a 10.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se recogieron y analizaron por SDS-PAGE en gradiente del 4-20%. Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana de PVDF que después se incubó con Acm anti-Stat6 humana de ratón (Y641, fosfoespecífico) (BD Biosciences Pharmingen).
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El anticuerpo unido se detectó por anticuerpos de cabra anti-IgG (Fc) de ratón conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Las proteínas inmunorreactivas se identificaron en película, usando detección de quimioluminiscencia aumentada (Supersignal West Pico Chemiluminiscent Substrate, Pierce). La figura 7 muestra los resultados del efecto de los Acm anti-IL13 sobre la fosforilación de Stat6 inducida por IL13 en células THP-1. Stat6 se fosforila en células THP-1 tratadas con IL13 humana 0,813 nM. Se encontró inhibición dependiente de la dosis de la fosforilación de Stat6 cuando las células se trataron con los Acm 228B/C-1, 228A-4, 227-26, 227-43 y JES10-5A2. El Acm 228B/C-1 es el anticuerpo neutralizante más potente entre los Acm anti-IL13 ensayados. La inhibición completa por 228B/C-1 se alcanzó a una concentración entre 0,667 nM y 0,133 nM. La proporción estequiométrica molar aproximada entre 228B/C-1 e IL13 para la inhibición completa era 1:2. Es consistente con los datos mostrados en las figuras 5 y 6.
Ejemplo 8
Clonación molecular de los genes de la cadena pesada y ligera que codifican anticuerpos monoclonales anti-IL13
Se aisló ARN total de células de hibridoma usando un kit de QIAGEN (Valencia, CA). Se llevó a cabo la reacción de transcripción inversa (ADNc de primera hebra) como sigue: se mezclaron 1-1,5 mg de ARN total con 1 ml de dNTP 10 mM, 50 ng de hexámeros aleatorios, y agua sin RNasa en un volumen final de 12 ml.
La mezcla de reacción se incubó a 65ºC durante 5 minutos y se colocó en hielo inmediatamente durante 1 minuto. Después de una breve centrifugación, se añadieron los siguientes reactivos: 4 ml de tampón de primera hebra 5X (Tris-HCl 250 mM, pH 8,3, KCl 375 mM, MgCl2 15 mM), 2 ml de DTT 0,1 mM, y 1 ml de inhibidor de RNasa RNaseOUT (40 U/ml). Después de mezclar, la reacción se incubó a temperatura ambiente durante 2 minutos. Se añadió entonces un mililitro de Superscript II RT (50 U/ml) a la mezcla para incubación a 25ºC durante 10 minutos seguido por 50 minutos a 42ºC. Después de una breve centrifugación, la reacción se incubó durante 15 minutos a 70ºC para inactivar la transcriptasa inversa. Se añadió después un microlitro de RNasa H (2 U/ml) y la reacción se incubó durante 20 minutos a 37ºC para destruir el ARN.
Para amplificar las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, se usó un método descrito por O'Brien y Jones (O'Brien S. y Jones T., "Humanizing antibodies by CDR grafting", Antibody Engineering, Springer Lab manual, Eds. Kontermann y Duble, S (2001)). Brevemente, se seleccionaron cebadores 5’ de la región del péptido señal (11 conjuntos para la cadena ligera y 12 conjuntos de cebadores degenerados para la cadena pesada) y los cebadores 3’ se seleccionaron de la región constante de la cadena ligera o pesada. Los cebadores 5’ y 3’ (1,5 ml de 10 mM) se mezclaron con 5 ml de tampón de PCR 10X (Tris-HCl 250 mM, pH 8,8, MgSO4 20 mM, KCl 100 mM, (NH4)2SO4 100 mM, Triton X-100 al 1%, BSA sin nucleasa 1 mg/ml), 1 ml de ADNc preparado previamente, 1 ml de Turbo pfu (Stratagene) y agua para ajustar el volumen total de la reacción a 50 ml. La PCR se realizó como sigue: 1 ciclo a 94ºC durante 4 minutos; 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, a 53ºC durante 30 segundos, y a 72ºC durante 45 segundos; y 1 ciclo a 72ºC durante 7 minutos. Las mezclas de reacción se resolvieron en un gel de agarosa al 1%.
El fragmento de ADN amplificado se purificó y clonó en un vector pcDNA3.1. La clonación se llevó a cabo usando el kit de clonación TOPO de Invitrogen según el protocolo sugerido por el fabricante (Invitrogen). Se usaron de quince a veinte colonias de E. coli transformada para la purificación del plásmido. Los plásmidos se secuenciaron usando un cebador T7. Las secuencias predominantes para las cadenas pesada y ligera se clonaron en un vector de expresión de Fab M13 por mutagénesis de hibridación (Glaser S. et al. Antibody Engineering (Oxford University Press, Nueva York (1995)), Near RI, BioTechniques 12: 08 (1992)). Las propiedades de unión del Fab expresado se confirmaron por ELISA. La figura 8 representa las secuencias de aminoácidos de VH y VL para 228B/C-1.
Ejemplo 9
Mapeo de epítopos
El Acm anti-IL13 228B/C-1 se une a un epítopo conformacional y se une a IL13 de macaco cangrejero con la misma alta afinidad que lo hace a IL13 humana. Sin embargo, 228B/C no se une a IL13 murina. Así, la estrategia imaginada para el mapeo de epítopos era intercambiar pequeñas porciones de la IL13 de mono con la correspondiente secuencia de IL13 de ratón. Se sintetizaron oligonucleótidos solapantes. Se realizaron dos rondas de PCR para ensamblar las construcciones híbridas de IL13 de modo que parte de la IL13 de mono se sustituyó por la secuencia correspondiente de la IL13 de ratón. Las regiones codificantes de IL13 amplificadas por PCR finales se clonaron en el vector pcDNA3.1 en el mismo marco de lectura que una etiqueta V5 usando un kit de clonación TOPO (Invitrogen). Se confirmó por secuenciación que todas las regiones amplificadas por PCR contenían solo las mutaciones de intercambio de dominios deseadas y no mutaciones indeseadas adicionales en los vectores de expresión.
Se identificó el epítopo de unión del Acm anti-IL13 como un péptido 8-mero desde el aminoácido #49 al 56, ESLINVSG (SEQ ID NO: 18). Este epítopo se localiza en la hélice B y bucle BC en IL13 humana. Cuando el péptido epítopo derivado de IL13 de macaco se usó para intercambiar la secuencia correspondiente en IL13 murina, la
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molécula de IL13 híbrida resultante se puede unir a 228B/C con afinidad similar a la de IL13 de macaco original, que valida además que la unión de Acm 228B/C a IL13 de macaco o humana en este péptido entre los residuos #49-56. La comparación de secuencias entre IL13 de humana, de macaco y murina revela que solo tres residuos Ile52, Val54 y Gly56 en IL13 no están conservados, lo que sugiere que los residuos críticos para la interacción de IL13 y el Acm anti-IL13 a través de este péptido 8-mero está determinada por uno o combinación de algunos de estos tres residuos.
Este epítopo se confirmó adicionalmente por análisis de manchas de péptidos. Se barrió el péptido IL13 humano entero con una serie de péptidos 12-meros solapantes sintetizados a través de SPOT en membrana de celulosa. El único péptido reactivo con Acm anti-IL3 se identificó como un péptido 12-mero de aminoácidos #44-56, YCAALESLINVS (SEQ ID NO: 19), que es solapante con la región identificada a través de los experimentos de intercambio de dominios.
Ejemplo 10
Ensayo de ADCC para el Acm anti-IL13
Se aislaron PBMC de muestras de sangre heparinizada reciente por técnicas de centrifugación estándar usando Ficoll-paque (50 ml de capa leucocítica da ~300 x 106 PBMC). Las PBMC se estimularon (20 x 106 PBMC) con IL-2 (10 U/ml) en RPMI1640/SFT al 10% durante 24 horas a 37ºC, CO2 al 5%.
Después de 24 horas, células diana HDLM-2 o L-1236 (líneas de células de linfoma de Hodgkin) (2x106 células) se marcaron incubando con 400 μCi de 51Cr (cromato de sodio) durante la noche a 37ºC. Las células marcadas con 51Cr se lavaron 4x y se resuspendieron en RPMI1640/SFT al 5%. Las células marcadas se repartieron después en alícuotas en placas de 96 pocillos con fondo en U (pocillos duplicado). Las PBMC estimuladas con IL-2 se añaden después a diferente proporción E:D (por ejemplo 80:1, 20:1).
Los Acm anti-IL13 que se van a probar se diluyen en serie y se reparten en alícuotas en los pocillos de modo que la concentración final de Acm está entre, por ejemplo, 0, 0,5, 5, 50 μg/ml. Después de la incubación, las placas se centrifugan a 900 rpm durante 3 minutos. El sobrenadante de cada pocillo se recoge y la cantidad de radioactividad se cuenta. Se calcula el porcentaje de lisis celular según la siguiente ecuación:
% de lisis celular = (cpmprueba -cpmespont)/(cpmmax -cpmespont) x 100%
[Para información adicional sobre ADCC, véase, por ejemplo, L. M. Weiner et at, Cancer Res., 48:2568-2573 (1988);
P. Hersey et al, Cancer Res., 46:6083-6090 (1988); y C. J. Hansik et al, Proc. Natl, Acad. Sci., 83:7893-97 (1986)].
Ejemplo 11
Ensayo de citotoxicidad mediada por complemento
Células tumorales (5 x 104 en 50 μl de medio de cultivo DMEM), suero humano normal (dilución 1:1 en 50 μl de medio), y varias concentraciones de Acm anti-IL13 humanizado (IgG1) (en 100 μl de medio) se pueden incubar en placas de 96 pocillos de fondo plano durante 2 horas a 37ºC en CO2 al 5%. Se puede usar un anticuerpo irrelevante de isotipo coincidente como control negativo. Se añade un reactivo de proliferación celular WST-1 (15 μl; Roche Diagnostics, Basilea, Suiza) y se incuba durante 5 horas a 37ºC. La densidad óptica de la reacción de color se lee a 450 nm con un lector de placas de ELISA. Porcentaje de inhibición de CMC por el Acm anti-IL13 = 100 x (DOs/a -DOs)/(DOns -DOs); DOs/a = DO para pocillos tratados con suero y anticuerpo; DOs = densidad óptica para pocillos tratados con suero; DOns = DO para pocillo tratados sin suero ni anticuerpo.
Depósitos
Los siguientes cultivos se han depositado con la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209 EE UU (ATCC):
Hibridoma
ATTC NO. Fecha del depósito
Anti-IL13 228B/C-1
PTA-5657 20 de noviembre, 2003
Anti-IL13 228A-4
PTA-5656 20 de noviembre, 2003
Anti-IL13 227-26
PTA-5654 20 de noviembre, 2003
Anti-IL13 227-43
PTA-5655 20 de noviembre, 2003
Este depósito se hizo según lo estipulado en el Tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional de Depósitos de Microorganismos con el Fin de Procedimientos de Patente y las regulaciones bajo el mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable durante 30 años desde la fecha del depósito. El
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organismo estará disponible de la ATCC en los términos del Tratado de Budapest, que asegura la disponibilidad permanente y no restringida de la progenie del cultivo al público tras la concesión de la pertinente patente en EE UU.
El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si el cultivo en depósito muere o se pierde o destruye cuando
5 se cultiva en condiciones adecuadas, se sustituirá rápidamente tras la notificación con una muestra viable del mismo cultivo. La disponibilidad de la cepa depositada no se debe interpretar como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos garantizados bajo la autoridad de cualquier gobierno según sus leyes de patente.
La especificación escrita anterior se considera que es suficiente para permitir al experto en la materia practicar la 10 invención. La presente invención se ilustra por las formas de realización depositadas.
Además, la presente divulgación describe los siguientes puntos:
1. Un método de tratar una neoplasia que expresa y/o se une a IL13 que comprende administrar una cantidad
15 eficaz de un anticuerpo anti-IL13 o un fragmento de unión del mismo, en donde dicho anticuerpo o fragmento se une específicamente y con alta afinidad a IL13 humana tanto glucosilada como sin glucosilar, y neutraliza la actividad de IL13 humana en una proporción molar aproximada de 1:2 (Acm:IL13).
2. El método del punto 1, en donde el anticuerpo es 228B/C y está producido por el hibridoma designado PTA20 5657.
3.
El método del punto 1, en donde el anticuerpo se une al mismo epítopo que el anticuerpo del punto 2.
4.
El método del punto 1, en donde el anticuerpo es 228A-4 y está producido por el hibridoma designado PTA
25 5656; 227-26 y producido por el hibridoma designado PTA-5654; o 227-43 y producido por el hibridoma designado PTA-5655.
5. El método del punto 1, en donde el anticuerpo se administra por inhalación, sistémicamente, inyección
embolada o infusión continua. 30
6. El método del punto 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de dominio único o un anticuerpo humanizado.
7.
El método del punto 1, en donde el anticuerpo es un fragmento, tal como fragmentos Fv, Fab, y F(ab’)2, 35 anticuerpos de cadena única tal como scFv y varias combinaciones de cadena.
8. El método del punto 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de dominio único.
9.
El método del punto 1, en donde el anticuerpo comprende además un soporte, diluyente, excipiente o 40 estabilizante fisiológicamente aceptable.
10. El método del punto 1, en donde dicho trastorno neoplásico se selecciona del grupo que consiste en linfoma de Hodgkin, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de células
45 renales, carcinoma de células escamosas, carcinoma de Kaposi asociado al sida, y cáncer cerebral.
11. El método del punto 1, en donde el anticuerpo media la destrucción por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo y/o citotoxicidad mediada por complemento.
50 12. El método del punto 1, en donde el anticuerpo comprende al menos una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la fórmula: FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3CDRL3-FRL4, en donde FRL1 consiste en cualquier de SEQ ID NO: 20-25; CDRL1 consiste en cualquiera de SEQ ID NO: 99-103; FRL2 consiste en SEQ ID NO: 29; CDRL2 consiste en cualquiera de SEQ ID NO: 104114; FRL3 consiste en cualquiera de SEQ ID NO: 30-56; CDRL3 consiste en cualquiera de SEQ ID NO: 115
55 116; y FRL4 consiste en SEQ ID NO: 57-59.
13. El método del punto 1, en donde el anticuerpo comprende al menos una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7, 93, 95, 97, 142, 144, y 150.
60 14. El método del punto 12, en donde la región variable de la cadena ligera comprende además una región constante.
15. El método del punto 13, en donde la región variable de la cadena ligera comprende además una región
constante. 65

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